KR20080003351A - 캔디다 항원에 대한 항체 - Google Patents

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플라비아 데 베르나르디스
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Abstract

본 발명은 도메인 항체를 제공한다. 특히, 본 도메인 항체 (dAb)는 캔디다 spp.의 병원성을 인지하고, 캔디다증에 대한 수동적 보호성을 제공한다.

Description

캔디다 항원에 대한 항체 {ANTIBODIES AGAINST CANDIDA ANTIGENS}
본 발명은 도메인 항체에 관한 것이다. 특히, 이는 캔디다 spp.의 병원성을 인지하여 캔디다증에 대한 수동적 보호성을 제공하는 도메인 항체에 관한 것이다.
수동적 백신화 즉, 항체 또는 항원-반응성 항체 단편의 치료학적 또는 예방학적 사용은 감염원이 출몰하고 재출몰하고, 항-미생물 내성 위협이 증가되고, 신규한 약물 및 예방 백신이 적은 시기에 감염성 질환을 제어하는데 있어서 상당히 매력적인 수단이다. 수동적 백신화는 쇠약한 숙주에서 질환을 초래하는 면역 기능장애에 의존하는 기회감염원을 제어하는데 특히 매력적이다. 면역 능력의 부재 또는 저하는 숙주의 항미생물제와의 필요한 협동작업을 무효화시키며, 이는 특히 보호성 백신을 생성시키는 것을 어렵게 한다. 캔디다 알비칸스는 수동적 백신화가 특히 유리한 것으로 여겨지는 기회감염원에 속한다. 면역저하 숙주 특히, AIDS 피검체 및 골수 이식한 호중구감소성 헤모패틱(hemopathic) 환자에서 주요 점막성 및 전신성 병원균이다. 또한, 이는 질염 및 기타 점막피부성 병리에서의 중요한 병원균이다. 실제로, 가임기의 모든 정상적 여성의 3/4이 적어도 한번은 급성 질염을 걸린 경험이 있으며, 더욱 중요하게는 이들중 약 5%는 만성 재발로 인해 고통받고 있는 것으로 산정되었다. 만성 질염은 항진균제로는 거의 치료하기 어려우며, 캔디다가 반복된 치료하에 항미생물제-내성이 될 수 있다는 임상적 증거와 우려가 증가되고 있다.
C. 알비칸스는 본질적으로, 일부 규정된 병원성을 갖는 세포외 병원균이다. 감염의 실험 동물 모델로의 연구에 의해 정확한 특이성 및 아이소타입의 항체가 실제로 심각한 점막성 및 전신성의 실험적 감염에 대해 보호할 수 있음이 입증되었다. 특히, 진균의 추정되는 만노단백질 부착부 (mannoprotein adhesin: MP65) 및 분비성 아스파르트산 프로테아제 (SAP2)의 병원성에 주목하여 연구하였으며, 특이적 폴리클로날, 모노클로날 항체 및 이들에 대한 펩티드 단편에 의한 유효한 면역보호에 대한 근거에 대해 연구되었다.
인간의 점막 캔디다증의 면역치료에 있어서, 최근들어 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 입수가능한 인간화된 항체 또는 인간 항체의 생성이 중요한 논점이다. 특히, 파아지 발현 라이브러리는 비교적 큰 양 및 용이한 표준화로 소정의 특이성을 갖는 인간 단일 가변 단편 (scFv) 또는 단일 도메인 항체 (dAb)의 선택 및 생성을 가능하게 한다.
치료학적 항-캔디다 scFv 항체는 종래에 생성되었다 (Magliani, W., et al., 1995 Nat. Biotechnol. 15: 155-158).
그러나, 당해분야에서 캔디다 spp. 감염의 치료에 효과적인 대안적인 항-캔디다 항체가 여전히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명자들은 캔디다 spp. 감염의 치료 특히, 질염의 치료에 효과적인 것으로 입증된 다수의 단일 도메인 항체 (dAb)를 생성시켰다. 이러한 단일 도메인 항체는 특정 캔디다 spp. 변원성 인자에 결합하고/거나 이의 작용성을 억제하는 것으 로 입증되었다.
이와 같이, 본 발명의 제 1 양태는 캔디다 spp.로부터의 분비성 아스파르트산 프로테아제 (Sap)에 결합하고/거나 이의 작용을 억제할 수 있는 단일 도메인 항체 (dAb)를 제공한다.
본원에 기술된 본 발명에 있어서, 본원에 제공된 서열 목록에서 ADR4-X로 나타낸 이러한 아미노산 서열은 Sap2 결합 dAb 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명에 따른 하나 이상의 dAb (dAb)에 의해 결합되는 분비성 아스파르트산 프로테아제는 Sap1, Sap2, Sap3, Sap4, Sap5와 Sap6, Sap 7, Sap8, Sap9 및 Sap 10 분비성 아스파르트산 프로테아제를 포함한다. 본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, dAb는 Sap2 결합 dAb (Sap2 결합 dAb)이다.
본원에 제공된 서열 목록에 ADR4-2로 나타낸 SEQ ID NO 14 내지 ADR4-23으로 나타낸 SEQ ID NO 35로 제시된 하나 이상의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열로 이루어진 Sap2 결합 dAb가 바람직하다.
본 발명의 상기 양태의 가장 바람직한 양태에서, dAb는 본원에 제공된 서열 목록에 ADR4-6으로 나타낸 SEQ ID NO 18 내지 ADR4-13으로 나타낸 SEQ ID NO 25로 제시된 하나 이상의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열로 이루어진 Sap2 결합 dAb가 바람직하다.
유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 5 x 10-1 내지 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 본원에 규정된 하나 이상의 SAP에 결합한다.
더욱 유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 100μM 이상 내지 1μM의 해리상수 (Kd)로 Sap2에 결합한다.
임의의 종의 캔디다 감염은 본 발명에 따른 하나 이상의 dAb를 사용하여 치료될 수 있다. 본 발명의 dAb를 사용하여 치료하기에 적합한 캔디다 spp. 감염은 하기로 이루어진 군의 감염을 포함한다: 캔디다 시페리 (Candida ciferrii), 캔디다 파마타 (Candida famata), 캔디다 람비카 (Candida lambica), 캔디다 리폴리티카 (Candida lipolytica), 캔디다 노르베겐시스 (Candida norvegensis), 캔디다 루고사 (Candida rugosa), 캔디다 비스와나티 (Candida viswanathii), 캔디다 제일라노이데스 (Candida zeylanoides), 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata), 캔디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 캔디다 크루세이 (Candida krusei), 캔디다 루시타니애 (Candida lusitaniae), 캔디다 케피르 (Candida kefyr), 캔디다 구일리에르몬디 (Candida guilliermondii) 및 캔디다 두블리니엔시스 (Candida dubliniensis).
본 발명에 따른 치료에 바람직한 캔디다 spp.는 하기로 이루어진 군을 포함한다: 캔디다 알비칸스, 캔디다 트로피칼리스, 캔디다 글라브라타, 캔디다 퍼라프실로시스, 캔디다 크루세이 및 캔디다 루시타니애.
본 발명의 상기 양태의 대부분의 바람직한 구체예에서, 캔디다 종은 캔디다 알비칸스이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 캔디다 spp.로부터의 분비성 아스파르트산 프로 테아제 (Sap)에 결합하고/거나 이의 작용성을 억제시킬 수 있으며, 본원에 제공된 하나 이상의 Sap dAb와 80%의 동일성을 나타내는 단일 도메인 항체 (dAb)를 제공한다.
본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, dAb는 본원에 제공된 하나 이상의 Sap2 dAb와 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 또는 99%의 동일성을 나타낸다.
본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 dAb는 5 x 10-1 및 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 본원에 규정된 하나 이상의 Sap 단백질에 결합할 수 있다.
더욱 유리하게는, 본 발명의 상기 양태에 따른 dAb는 100μM 내지 1pM의 해리 상수 (Kd) 및/또는 5 x 10-1 내지 1 x 10-7s-1의 Koff 속도 상수로 Sap2에 결합할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP)에 결합하고/거나 이의 작용성을 억제할 수 있는 단일 도메인 항체 (dAb)를 제공한다.
본 발명에 있어서, ADR3-X로 나타낸 이들 서열은 만노단백질 부착부 (MP) 결합 dAb (MP dAB)의 서열을 나타낸다.
본 발명의 상기 양태에 있어서, 유리하게는, dAb는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID NO 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3- 7, ADR3-8, ADR3-9로서 본원에 제공된 서열목록에 기재된 하나 이상의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 MP65 결합 dAb이다.
본 발명의 상기 양태에 있어서, 유리하게는 dAb는 각각 SEQ ID No 5, 6 및 10을 나타낸 ADR3-1, ADR3-2 및 ADR3-6으로서 본원에 제공된 서열목록에 기재된 하나 이상의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 MP65 결합 dAb이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 5 x 10-1 내지 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 MP에 결합할 수 있다.
더욱 유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 100μM 이상 내지 1pM의 해리상수 (Kd)로 MP65에 결합할 수 있다.
임의의 종의 캔디다 감염은 본 발명에 따라 하나 이상의 dAb를 사용하여 치료될 수 있다. 본 발명에 따른 치료에 바람직한 캔디다 spp.는 하기로 구성된 군을 포함한다: 캔디다 알비칸스, 캔디다 트로피칼리스, 캔디다 글라브라타, 캔디다 파라프실로시스, 캔디다 크루세이 및 캔디다 루시타니애. 본 발명의 상기 양태의 가장 바람직한 구체예에서, 캔디다 종은 캔디다 알비칸스이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO 5, 6 및 10을 각각 나타낸 ADR3-1, ADR3-2 및 ADR3-6으로서 확인된 dAb와 80% 동일성을 나타내며, 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP)에 결합하고/거나 이의 작용성을 억제할 수 있는 단일 도메인 항체 (dAb)를 제공한다.
본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO 5, 6 및 10을 각각 나타낸 ADR3-1, ADR3-2 및 ADR3-6으로서 확인된 이들 dAb중 하나 이상과 82, 84, 86, 88, 90, 92, 96, 98 또는 99%의 동일성을 나타낸다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 dAb 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, 약제 조성물은 바람직하게는, MP65 및 Sap2 결합 dAb를 포함하며, 바람직하게는 이들로 구성된다.
본 발명의 상기 양태의 대안적인 구체예에서, 약제 조성물은 MP65 및 Sap2의 작용성을 억제하는 하나 이상의 dAb를 포함하며, 바람직하게는 이들로 구성된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물 또는 하나 이상의 dAb를 환자에 투여하는 것을 포함하여 환자의 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 캔디다 spp. 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 dAb를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 SAP2 및/또는 MP65 dAb를 환자에 투여하여 환자의 아졸 내성 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 치료하는 방법으로서, 캔디다가 하기로 구성된 군중의 하나 이상의 제제에 내성이 있는 방법을 제공한다: 이트라코나졸, 플루코나졸 및 보리코나졸.
추가의 양태에서, 본 발명은 SAP2 및/또는 MP65 dAb를 환자에 투여하여 환자의 이미다졸 내성 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 치료하는 방법으로서, 캔디다 spp. 감염이 하기로 구성된 군중의 하나 이상의 제제에 대해 내성이 있는 방법을 제공한다: 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 술코나졸 및 티오코나졸.
본 발명의 상기 양태에 있어서, Sap2 또는 MP65 'dAb'는 본원에 기술된 Sap2 및/또는 MP65에 결합하고/거나 이들의 작용을 억제할 수 있는 본원에 기술된 바와 같은 단일 도메인 항체이다.
본원에 기술된 본 발명의 방법 및 약제에 있어서, 본원에 기술된 하나 이상의 dAb/dAb로 치료하기 위한 바람직한 캔디다 spp.는 하기로 구성된 군에서 이러한 캔디다 spp. 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 캔디다 알비칸스, 캔디다 트로피칼리스, 캔디다 글라브라타, 캔디다 파라프실로시스, 캔디다 크루세이 및 캔디다 루시타니애.
당업자에게 캔디다 spp. 감염이 전신, 질, 피부, 경구, 점막, 기관지 및 폐 감염일 수 있음이 자명하다. 또한, 효모 감염은 조갑진균증 (손톱 및 발톱 감염), 구강 캔디다증, 식도 캔디다증 또는 외음부질염으로서 분명하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 dAb/dAb는 질 또는 전신성 캔디다 spp. 감염의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
본원에 기술된 본 발명의 방법 및 약제를 사용하여, 본 발명에 따른 dAb/dAb를 투여함으로써 환자에서 효과적인 캔디다 spp. 감염 치료가 진균 감염의 가속화된 제거를 유도한다; 바람직하게는, dAb로의 처리 개시 후 21일 내지 28일에 감염의 치료/회복.
본 발명자들은 본 발명에 따른 방법, dAb 및 조성물을 사용한 캔디다 spp.의 치료가 감염부위 또는 침윤된 영역에서 캔디다 spp.의 완전한 (100%) 박멸을 초래 하지 않을 수 있음을 고려하고 있다. 또한, 본 발명자들은 침윤된 영역에서 일부 잔여 캔디다 spp.가 피검체에 유익할 수 있음을 고려하고 있다. 본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 dAb 또는 이의 조성물로의 치료는 캔디다 spp. 수준을 공생 수준으로 감소시킨다 (정상적인 건강한 개체에서 발견되는 IE 수준).
본 발명자들은 본 발명에 따른 dAB 및 조성물이 면역저하된 환자의 예방 및/또는 치료에 특히 유용한 것으로 간주한다.
이와 같이 추가의 양태에서, 본 발명은 면역저하된 개체에 의해 나타난 하나 이상의 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 dAb 또는 조성물의 용도를 제공한다.
특히 캔디다증에 걸릴 위험성이 있는 개체로는 AIDS 또는 HIV-감염된 환자를 포함하는 면역저하된 환자를 포함한다. 기타 위험한 요소로는 과립구감소증, 골수 이식, 화학요법의 유형/기간, 이식편대숙주병, 화학요법 관련 점막염의 정도, 캔디다의 집락형성, 광범위한 항생제의 사용, 혈액투석 및/또는 질소 혈증, 중앙 혈관 카테터, 헤로인 남용, 중병, 과영양, 위천공의 재발 또는 지속, 수술전, 고형-기관 이식, 및 신생아를 포함한다.
상기 기재된 환자 군중 하나 이상에서 본 발명에 따른 하나 이상의 dAb로 캔디다 spp 감염을 치료하는 것이 본원에서 계획된다.
본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, 면역저하된 환자는 AID, HIV 감염 및 효모 감염으로 이루어진 군중의 하나 이상의 질환으로부터 고통받고 있다.
본 발명에 따른 dAb를 투여하는 방법은 본 발명의 상세한 설명에 기술되어 있다. 바람직하게는, dAb는 국소 및/또는 전신 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, 캔디다증에 걸린 환자를 치료하기 위해 dAb를 포함하는 약제 조성물을 투여하는 것은 시간에 따른 연속 주입, 또는 단일 투여 또는 알약 투여를 포함한다. 또한, 단일 투여 또는 알약 복용 후, 이차 알약이 투여되거나, 연속 주입식 투여가 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, dAb는 인간 가변 도메인이거나, 인간 프레임워크 영역 (FW), 및 본원에 기술된 하나 이상의 Sap 및/또는 MP 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 이종성 CDR을 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역은 [the Kabat database of Sequences of Proteins of Immunological Interest]에 정의된 바와 같은 면역글로불린 가변 도메인의 영역이다.
바람직한 인간 프레임워크 영역은 생식세포 유전자 분절 (segment) DP47 및 DPK9에 의해 엔코딩된다. 유리하게는, VH 또는 VL 도메인의 FW1, FW2 및 FW3는 DP47 또는 DPK9로부터의 FW1, FW2 또는 FW3의 서열을 갖는다. 인간 프레임워크는 선택적으로, 본 발명의 dAb에 사용된 인간 프레임워크에서 약 5개 이하의 아미노산 또는 약 10개 이하의 아미노산이 집합적으로 변화된 변이부를 선택적으로 함유할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 환자의 전신성 캔디다 spp. 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법으로서,
(i) Sap 및/또는 MP 단백질에 결합하는 항체,
(ii) Sap 및/또는 MP 단백질에 결합하는 항체의 단편,
(iii) Sap 및/또는 MP 단백질에 결합하는 dA중 하나 이상을 이러한 치료가 필요한 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
최종 양태에서, 본 발명은 환자의 전신성 캔디다 spp. 감염의 예방 및/또는 치료하기기 위한 방법으로서,
(i) Sap 및/또는 MP 단백질의 작용성을 억제하는 항체,
(ii) Sap 및/또는 MP 단백질의 작용성을 억제하는 항체의 단편,
(iii) Sap 및/또는 MP 단백질의 작용성을 억제하는 dAb중 하나 이상을 이러한 치료가 필요한 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, 바람직하게는 항체 또는 이의 단편은 모노-특이적이다. 유리하게는, Sap는 Sap2이며, MP 단백질은 MP65이다.
본 발명의 추가적 양태에서, 다중 결합 형태의 dAb가 사용될 수 있으며, 여기서 dAb는 직접적으로 또는 적합한 링커 (예를 들어, dAb간의 아미드 결합과 같은 화학 결합 형태에 의해 직접적으로) 또는 링커로 서로 컨쥬게이팅되거나 융합된다. 적합한 링커는 당해분야에 공지되어 있으며, 단순 사슬의 아미노산 예컨대, Ala-Ala-Ala, Gly4Ser 또는 이들의 다중체 예컨대, (Gly4Ser)5, 또는 화학적 결합에 기초한 이러한 N-히드록실숙신이미드 또는 말레이미드 링크일 수 있다.
또한, 다량체 dAb는 동종성 즉, 하나의 dAb 종 또는 이종성 즉, 하나 초과의 dAb 종 소위, 이종 다합체일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 dAb는 이량체 형태로 될 수 있으며, 이는 동종성 즉, SAP dAb 또는 이종성 즉, SAP dAb와 MP dAb일 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 의료 기기에 의한 진균 감염 또는 집락형성의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 예를 들어, 질환의 치료시 카테터 또는 캐뉼라 예를 들어, 혈관 캐뉼라, 중심 정맥 카테터, 요로 카테터, 복막투석 카테터 및 투석 카테터의 사용은 특히, 효모 예컨대, 캔디다 종으로부터의 진균 감염 위험성이 있다. 캔디다 종은 항진균제에 대해 종종 고도로 내성인 의료 기기상에 생필름 (biofilm)을 생성시킬 수 있으며, 종종 기기의 제거가 요구된다. 본 발명에 따른 도메인 항체는 플라스틱의 진균 감염물을 제거하거나 처리하는 것으로 입증되었다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미 노산 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3- 2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3- 7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3- 2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438), 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438), 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438), 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb는 Sap 또는 MP에 결합하며, 여기서 dAb는 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상 인 CDR3 서열을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 dAb의 혈청 반감기는 반감기 연장부에 의해 증가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 반감기 연장부는 PEG이다.
도면의 간단한 설명
도 1: dAb로 질내 처리된 래트에서 C. 알비칸스로의 질 감염 (백색 삼각형: ADR4-6 + SA40; X: ADR3-2 + SA40; 흑색 사각형: SA40 (대조군); 흑색 원: SA40 + 플루코나졸; 흑색 삼각형: SA40 + 펩스타틴).
도 2: 항-SAP2 dAb ADR4-6 (삼각형) 또는 ADR4-13 (마름모)로 질내 처리된 래트에서 C. 알비칸스로의 질 감염. 대조군은 dAb Hel4 (원형)와 관련이 없거나 비처리되며, 단지 C. 알비칸스 (사각형)로만 자극시켰다.
도 3: 항-mp65 도메인으로 질내 처리된 래트에서 C. 알비칸스로의 질내 감염 (흑색 삼각형 ADR3-1; 원형 ADR3-2; 백색 삼각형 ADR3-6; 마름모 Hel4; 흑색 사각형 SA40 (대조군)).
도 4: C. 알비칸스의 플루코나졸-내성 균주 (AIDS 68) 및 항-SAP2 dAb; AIDS68 + ADR4-6 (마름모); AIDS68 + ADR4-13 (삼각형); AIDS68 (사각형); AID68 + 플루코나졸 (원형)로의 질 감염.
도 5: 자극 후 (1, 24, 48시간) dAb로 질내 처리한 래트에서 C. 알비칸스 SA40으로 질 감염 (흑색 사각형: SA40 진균 자극; 마름모: ADR4-6; 백색 사각형: ADR3-6 dAb; 삼각형: ADR4-6 및 ADR3-6, dAb; 원형: 플루코나졸).
도 6: 이종이량체 dAb로 처리된 C. 알비칸스 감염 (원형 ADR3-6/ADR4-6; 마 름모 ADR4-6/ADR3-6; 사각형 SA40 (대조군); 사각형 이종이량체 dAb VH-VL (대조군)).
정의
면역글로불린 : 이는 두개의 β 시이트 및 보통 보존된 이황화 결합을 보유하는, 항체 분자의 면역글로불린 폴드 특성을 갖는 폴리펩티드 과를 의미한다. 면역글로불린 상과의 일원은 면역계에서의 광범위한 역할(예를 들어, 항체, T 세포 수용체 분자 등)을 포함하는 생체내에서의 세포 및 비세포 상호작용의 다양한 양태, 및 세포 부착 (예를 들어, ICAM 분자) 및 세포내 신호전달 (예를 들어, 수용체 분자, 예를 들어 PDGF 수용체)에 수반된다. 본 발명은 결합 도메인을 지니는 모든 면역글로불린 상과 분자에 적용가능하다. 바람직하게는, 본 발명은 항체를 의미한다.
도메인 : 도메인은 단백질의 나머지와는 독립적인 삼차 구조를 보유하는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 분비 기능 특성을 담당하고, 많은 경우에서 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 기타 단백질로 첨가되거나, 제거되거나 이동될 수 있다.
용어 '단일 항체 가변 도메인' ( dAb )은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를 들어 하나 이상의 루프가 추가의 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 N-말단 또는 C-말단이 트렁케이션되거나 N-말단 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 일부의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 또한, 용어 dAb는 하나 이상의 초가변성 루프 및/또는 CDR이 동일하거나 상이한 기원으로부터 유래될 수 있는 제 2의 가변 도메인으로부터의 루프 및/또는 CDR로 대체된 단일 항체 가변 도메인을 이러한 용어의 범위내에 포함한다.
라이브러리 : 용어 라이브러리는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 지니는 일원으로 구성된다. 이러한 맥락에서, 라이브러리는 레퍼토리와 유의하다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성을 책임진다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물의 형태를 취하거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 일원을 함유한다. 유리하게는, 핵산이 발현 벡터로 통합되어, 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현을 가능케 한다. 따라서, 한 바람직한 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있으며, 각각의 유기체는 상응하는 폴리펩티드 일원을 생성시키기 위해 발현될 수 있는 핵산 형태로 라이브러리의 단일 일원을 함유하는 하나 이상의 발현 벡터 복사체를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이체의 광범위한 레퍼토리를 엔코딩하는 잠재성을 지닌다.
항체 : 천연적으로 항체를 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되거나; 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스펙토 마(transfectoma), 효모 또는 박테리아로부터 분리된, 항체 (예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 폐쇄 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody), dAb).
항원 : 본 발명에 따른 리간드에 의해 결합되는 분자. 통상적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체내에서 항체 반응을 일으킬 수 있다. 이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 분자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 dAb는 특정 항원에 대한 특이성을 표적으로 하기 위해 선택된다. 통상적인 항체 및 이의 단편의 경우, 가변 루프 (L1, L2, L3 및 H1, H2, H3)로 규정된 항체 결합 부위가 항원에 결합될 수 있다.
에피토프 : 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 통상적으로 결합된 구조의 단위. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위를 규정하고, 따라서 항체의 특이성 표적을 의미한다. 단일 도메인 항체의 경우, 에피토프는 분리시 가변 도메인에 의해 결합된 구조의 단위를 의미한다.
유니버셜 프레임워크(universal framework) : 케이뱃(Kabat)의 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services]에 의해 정의된 서열에 보존된 항체의 영역 또는 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. MoI. Biol. 196:910- 917]에 정의된 인간 생식세포 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열. 본 발명은 고변 이 영역 단독에서의 변이를 통한 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진, 단일 프레임워크, 또는 상기 프레임워크의 세트의 용도를 제공한다.
실질적으로 동일한 : 제 1 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열에 대해 충분한 수의 동일하거나 동등한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 함유하여, 제 1 및 제 2 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 동일한 활성을 지니는 것을 의미한다. 이러한 항체의 경우, 제 2 항체는 동일한 결합 특이성을 지니고, 동일물의 50% 이상의 친화성을 지닌다.
전신성 캔디다증 : 본 출원에서 용어 전신성 캔디다증이 사용되었으나, 이는 용어 "침습성 캔디다증", "파종성 캔디다증" 및 "캔디다혈증"과 동일어이다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학용어 (예를 들어, 세포 배양, 분자유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기술 및 생화학)는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 표준 기술이 분자, 유전학 및 생화학 방법 (참조: 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.) 및 화학적 방법에 대해 사용된다.
(A) 캔디다 spp . 감염
효모 감염은 일반적으로, 진균 종 소위, 캔디다 알비칸스의 과다성장으로부터 초래된다. 이들은 피부, 손톱 및 발톱 아래 또는 입, 질, 기관지 및 폐의 점막에 발생할 수 있다.
질 효모 감염은 질염의 유형이다. 효모 감염의 특징적 증상은 외부 및 내부 생식기의 가려움증이며, 이는 종종 짙고/거나 굳을 수 있는 (커티지 치즈 (cottage cheese) 같이) 백색 분비물을 수반한다. 중증의 감염은 조직의 염증을 초래하여,이어서 불게 부풀어 오르고, 심지어 핀-포인트 (pin-point) 출혈을 초래한다.
임의의 종의 캔디다 감염은 본 발명에 따른 하나 이상의 dAb를 사용하여 치료될 수 있다. 본 발명에 따라 치료하기에 바람직한 캔디다 spp.는 하기로 구성된 군을 포함한다: 캔디다 알비칸스, 캔디다 트로피칼리스, 캔디다 글라브라타, 캔디다 파라프실로시스 , 캔디다 크루세이 및 캔디다 루시타니애 . 본 발명의 상기 양태의 가장 바람직한 구체예에서, 캔디다 종은 캔디다 알키칸스이다.
현행 치료법
캔디다에 의해 초래된 효모 감염을 치료하기 위해 입수가능한 처방전이 필요없는 약물로는 클로트리마졸 (Gyne-Lotrimin®, Mycelex®), 미코나졸 (Monistat®) 및 부토코나졸 (Femstat®)을 포함한다.
처방 약물로는 경구용인 플루코나졸 (Diflucan®), 니스타틴 (Mycostatin®), 질 정제, 테르코나졸 (Terazol®) 질 크림, 및 부토코나졸 (Gynazole®) 질 크림을 포함한다. 항진균 크림이 또한, 가려움증을 완화시키기 위해 음문 (외부 생식기)에 국소적으로 도포될 수 있다.
질염
질염의 질의 염증이다.
질염의 3가지의 일반적 원인은 호르몬 불균형, 자극 및 감염이다. 감염성 질염은 가임기 여성에서 가장 일반적으로, 일반적으로 감염의 세가지 유형중 하나에 의해 초래된다: 세균성 질염 (BV), 캔디다 spp. 감염에 의해 초래된 캔디다증 (예를 들어, 캔디다 알비칸스 감염) 또는 트리코모나스증.
(B) 본 발명에 따른 캔디다 spp . 독성 인자 결합 dAb
제1 양태에서, 본 발명은 캔디다 spp.로부터의 분비성 아스파르트산 프로테아제 (Sap)에 결합하고/거나 이의 작용성을 억제할 수 있는 단일 도메인 항체 (dAb)를제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP)에 결합하고/거나 이의 작용성을 억제할 수 있는 단일 도메인 항체 (dAb)를 제공한다.
(Bi) 캔디다 spp . 병원성 인자
(i) SAP
10개 SAP 유전자 패밀리에 의해 엔코딩된 분비된 아스파르틸 프로테아제 (Sap)는 캔디다 패밀리의 병원성 요소의 주요 독성 결정인자이다. C. 알비칸스의 Sap가 가장 많이 연구되었다. C. 알비칸스의 모든 10개의 SAP 유전자는 성숙 효소보다 약 60개 아미노산이 더 긴 사전전구효소 (preproenzyme)을 엔코딩하며, 이는 분비 경로를 통해 이송될 때 프로세싱된다. 성숙 효소는 30 내지 50 kDa의 크기를 가지며, 3차원 구조의 유지시 포함된 활성 부위의 2개의 보존된 아스파르테이트 잔기 및 보존된 시스테인 잔기를 포함하는 모든 아스파르틸 프로테이나아제에 대한 전형적인 서열 모티프를 함유한다. 대부분의 Sap 단백질은 추정되는 N-글리코실화 부위를 함유한다. 현재, C. 알비칸스 프로테이나아제의 주요 역할은 세포에 영양을 제공하고, 침투 및 침습을 보조하고, 면역 반응을 회피하는 것이다 (Naglik, J., R. 2003 Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67.3.400-428).
(ii) 만노단백질 부착물
병원성 캔디다 종에 의한 숙주 조직의 성공적인 집락 형성 및 감염은 이들 유기체가 점막 표면으로 부착하는 능력에 의존적이다. 다양한 종은 이들의 부착 능력이 다양하며, 부착과 독성 사이에 명백한 상호관계가 있다. 가장 병원성 종인 캔디다 알비칸스의 상피 세포로의 부착 메카니즘은 자세히 연구되었으며, 효모 표면상으로의 특이적 결합 분자 (부착물)와 상피 세포 표면상의 상보적인 수용체 분자간의 렉틴-유사 상호작용과 관련된 것으로 여겨진다. 현재의 정보들은 효모 표면상의 원섬유에 위치한 만노단백질의 단백질 부분이 부착물로서 작용하며, 상피세포상의 글리코시드 수용체와 상호작용함을 시사한다.
(Bii) 본 발명에 따른 Sap 결합 dAb
본 발명에 따른 하나 이상의 dAb에 의해 결합하기 위한 분비성 아스파르트산 프로테아제는 Sap1, Sap2, Sap3, Sap4, Sap5와 Sap6, Sap8, Sap9 및 SaplO 분비성 아스파르트산 프로테아제를 포함한다. 본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, dAb는 Sap2 결합 dAb (Sap2 결합 dAb)이다. 바람직하게는, 이는 본원에 제공된 서열목록에 기재된 SEQ ID NO 14를 나타내는 ADR4-2 내지 SEQ ID NO 35를 나타내는 ADR4-23의 하나 이상의 서열을 포함하는 바람직하게는, 이들로 이루어진 Sap2 결합 dAb이다. 본원에 기술된 본 발명에 있어서, ADR4-X로 나타낸 이들 아미노산은 Sap2 아미노산 서열을 나타낸다.
유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 5 x 10-1 내지 1 x 10-7s-1의 Koff 속도 상수로 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 Sap에 결합할 수 있다.
더욱 유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 100μM 이상 내지 1μM의 해리상수 (Kd)로 Sap2에 결합할 수 있다.
(Biii) 본 발명에 따른 MP 결합 dAb
본 발명에 있어서, 본원에 제공된 서열 목록에서 ADR3-X로 나타낸 이들 서열은 만노단백질 부착부 (MP) 결합 dAb (dAb)이다.
본 발명에 있어서, 유리하게는 dAb는 본원에 제공된 서열 목록에 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13로 나타내고, ADR3-1, ADR3-1, ADR3-3, ADR3-4, ADR3- 5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8, ADR3-9로 명명된 하나 이상의 서열을 포함하며, 바람직하게는 이들로 구성된 MP65 결합 dAb이다.
본 발명의 상기 양태에 있어서, 더욱 유리하게는, dAb는 본원에 제공된 서열 목록에 각각 SEQ ID NO 5, 6 및 10으로 나타내고, ADR3-1, ADR3-2 및 ADR3-6으로 명명된 하나 이상의 서열을 포함하며, 바람직하게는 이들로 구성된 MP65 결합 dAb이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 5 x 10-1 내지 1 x 10-7s-1의 Koff 속도 상수로 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 MP에 결합할 수 있다.
더욱 유리하게는, 본 발명에 따른 dAb는 100μM 이상 내지 1μM의 해리상수 (Kd)로 MP65에 결합할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP)와 결합하고/거나 이의 작용성을 억제할 수 있으며, 각각 SEQ ID NO 5, 6 및 10으로 나타내고, ADR3-1, ADR3-2 및 ADR3-6으로 명명된 dAb와 80% 동일성을 나타내는 단일 도메인 항체 (dAb)를 제공한다.
본 발명의 상기 양태의 바람직한 구체예에서, dAb는 SEQ ID NO 5, 6 및 10으로 나타내고, ADR3-1, ADR3-2 및 ADR3-6으로 명명된 하나 이상의 dAb에 대해 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 또는 99% 동일성을 나타낸다.
아미노산 서열 동일성 계산
본원에 기술된 서열과 유사하거나 상동성인 서열 (예를 들어, 약 70% 이상의 서열 동일성)이 또한 본 발명의 일부를 이룬다. 몇몇 구체예에서, 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 동일성은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 대안적으로, 핵산 분절이 선택적 하이브리드화 조건 (예를 들어, 매우 높은 엄격한 하이브리드화 조건)하에서 상보적인 가닥에 하이브리드화되는 경우에 실질적인 동일성이 존재한다. 핵산은 전체 세포 또는 세포 용해질에 존재하거나 부분적으로 정제되거나 충분히 순수한 형태로 존재할 수 있다.
두 개의 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성" (이러한 용어들은 본원에서 상호 교환하여 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 서열중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있거나, 비상동성 서열이 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 한 바람직한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 100% 길이의 참조 서열이다. 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 비교된다. 제 1 서열의 위치가 제 2 서열 내의 상응하는 위치와 같은 아미노산 잔기 또는 누클레오티드에 의해 차지되는 경우, 분자들은 상기 위치에서 동일하다 (본원에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동일하다). 두 개의 서열 사이의 동일성 %는 두 개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한, 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
유리하게는, 디폴트 값에 대해 설정된 파라미터를 지닌 BLAST 알고리즘 (버전 2.0)이 서열 정렬을 위해 사용된다. BLAST 알고리즘은 미연방정부(".gov")의 국립보건원("nih")의 국립 생물학 기술정보센터(".ncbi")의 월드 와이드 웹 사이트("www")에 "/Blast/" 디렉토리에 "blast_help.html" 파일로 상세하게 기술되어 있다. 검색 파라미터는 하기와 같이 정의되고, 규정된 디폴트 파라미터에 대해 유리하게 설정된다.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx로 사용되는 학습 검색 알고리즘이다; 이들 프로그램은 몇가지 기능 강화와 함께 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8] (상기 기술된 "blast_help.html" 파일 참조)의 통계 방법을 이용한 이들의 발견에 의의를 둔다. BLAST 프로그램은 서열 유사성 검색을 위해, 예를 들어 질의 서열에 대한 상동성을 확인하기 위해 맞추어진다. 상기 프로그램은 일반적으로 모티프-양식 검색에는 유용하지 않다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에서의 기본적인 문제를 검토하려면, 문헌[Altschul et al. (1994)]를 참조하라.
국립 생물학 기술정보센터 웹 사이트에서 이용가능한 5개의 BLAST 프로그램은 하기의 작업을 수행한다:
"blastp"은 단백질 서열 데이터베이스에 대해 아미노산 질의 서열을 비교한다;
"blastn"은 누클레오티드 서열 데이터베이스에 대해 누클레오티드 질의 서열을 비교한다;
"blastx"는 단백질 서열 데이터베이스에 대해 누클레오티드 질의 서열(둘 모두의 가닥)의 6개 프레임의 개념적 번역 생성물을 비교한다;
"tblastn"은 모든 6개의 판독 프레임에서 동적으로 번역된 누클레오티드 서열 데이터베이스에 대해 단백질 질의 서열을 비교한다 (둘 모두의 가닥);
"tblastx"는 누크레오티드 서열 데이터베이스의 6개 프레임 번역에 대해 누클레오티드 질의 서열의 6개 프레임 번역을 비교한다.
BLAST는 하기의 검색 파라미터를 사용한다:
HISTOGRAM은 각각의 검색에 대한 스코어의 막대그래프를 나타낸다; 디폴트는 '예'이다 (참조: BLAST 매뉴얼 내의 파라미터 H).
DESCRIPTIONS은 특정된 수로 보고되는 매칭 (matching) 서열의 짧은 디스크립션 (description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100개의 디스크립션이다 (매뉴얼 페이지의 파라미터 V 참조). 또한, EXPECT 및 CUTOFF를 참조하라.
ALIGNMENTS는 높은 스코어 분절쌍 (HSP)이 보고되는 특정된 수로 데이터베이스 서열을 제한한다; 디폴트 한계는 50이다. 이보다 더 많은 데이터베이스 서열이 보고를 위한 통계적 유의 분계점을 만족시키는 경우 (하기 EXPECT 및 CUTOFF 참조), 가장 높은 통계 유의성에 기인된 매치만이 보고된다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 B 참조).
EXPECT는 데이터베이스 서열에 대한 매치를 보고하기 위한 통계적 유의 분계점이다; 디폴트 값은 10이고, 이로써 10 매치는 문헌[Karlin and Altschul (1990)]의 추계학 모델에 따라 단지 우연에 의해 발견되는 것으로 예상된다. 매치에 기인한 통계적 유의성이 EXPECT 분계점보다 높은 경우, 매치는 보고되지 않을 것이다. 보다 낮은 EXPECT 분계점은 더욱 엄격해지고, 이는 보고되는 우연적인 매치수를 보다 적게 만든다. 분수값도 허용된다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 E 참조).
CUTOFF는 높은 스코어의 분절쌍을 보고하기 위한 컷오프 스코어이다. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)로부터 계산된다. HSP는 이들에 기인된 통계 유의성이 최소한 CUTOFF 값과 동일한 스코어를 지니는 단독 HSP에 기인되는 것과 같이 높은 경우에만 데이터베이스 서열에 대해 보고된다. 보다 높은 CUTOFF 값은 더욱 엄격해지고, 이는 보고되는 우연적인 매치수를 보다 적게 만든다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 S 참조). 통상적으로, 유의 분계점은 EXPECT를 이용하여 더욱 직관적으로 다루어질 수 있다.
MATRIX는 BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX에 대한 교대 스코어 매트릭스를 특정한다. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62이다 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89(22): 10915-9). 유효한 교대 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 대해서는 교대 스코어 매트릭스를 이용할수 없다; BLASTN 요청에서의 MATRIX 지시어를 특정하는 것은 오류 반응을 일으킨다.
STRAND는 TBLASTN 검색을 바로 데이터베이스 서열의 상단 또는 하단 가닥으로 제한하거나; BLASTN, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 바로 질의 서열의 상단 또는 하단 가닥상의 리딩 프레임으로 제한한다.
FILTER는 문헌[Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163]의 SEG 프로그램에 의해 결정되는 낮은 구성적 복잡성, 또는 문헌[Claverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201]의 XNU 프로그램에 의해 결정되거나, BLASTN에 대해서는 타투소프(Tatusov) 및 리프만(Lipman)의 DUST 프로그램 (NCBI의 월드 와이드 웹 사이트 참조)에 의해 결정되는 짧은 주기의 내부 반복으로 구성된 분절을 지니는 질의 서열의 분절을 마스킹(masking)한다. 필터링은 blast 산출로부터 통계적으로는 유의하나 생물학적으로는 괌심을 끌지 않는 보고를 배제하여 (예를 들어, 통상적인 산성, 염기성 또는 프롤린 풍부 영역에 대한 적중), 데이터베이스 서열에 대한 특이적 매칭에 이용가능한 질의 서열의 생물학적으로 보다 관심을 끄는 영역을 남길 수 있다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 누클레오티드 서열 내에서 문자 "N" (예를 들어, "N"이 13회 반복됨)을 이용하여 대체되고, 단백질 서열에서 문자 "X" (예를 들어, "X"가 9회 반복됨)를 이용하여 대체된다.
필터링은 질의 서열 (또는 이의 번역 생성물)에만 적용되고, 데이터베이스 서열에는 적용되지 않는다. 디폴트 필터링은 BLASTN에 대해서는 DUST이고, 기타 프로그램에 대해서는 SEG이다.
SWISS-PROT 내의 서열에 적용되는 경우 SEG, XNU 또는 둘 모두에 의해 마스킹되어 아무것도 나타나지 않는 것은 특별한 것이 아니므로, 필터링은 항상 결과를 산출하는 것으로 예상되어선 안된다. 더욱이, 몇몇 경우에, 서열은 이의 전체에서 마스킹되는데, 이는 필터링되지 않은 질의 서열에 대해 보고된 임의의 매치의 통계적 유의성이 의심되는 것을 나타낸다.
NCBI-gi는 NCBI gi 인식자 뿐만 아니라 수탁정보 및/또는 유전자좌 명칭이 산출물에 나타나게 한다.
가장 바람직하게는, 서열 비교는 상기 기술된 NCBI 월드 와이드 웹 사이트에서 "/BLAST" 디렉토리 내에 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 이용하여 수행된다.
(C) 본 발명에 따른 dAb 의 제조
본 발명의 따라 본원에 기재된 결합 리간드 (예를 들어, dAb)는 scFv, "파아지" 항체 및 기타 고안된 항체 분자를 제조하기 위해 항체 공학 분야에서 사용되는 기존에 확립된 기술에 따라 제조될 수 있다. 항체를 제조하기 위한 기술은, 예를 들어 하기의 리뷰 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다: [Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol.l2:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carter, et al. (1995) J. Hernatother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D . (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. (1997) Inumunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immuaother. 45,128-130].
가변 도메인의 선택에 사용되는 기술은 당 분야에 공지된 라이브러리 및 선택 과정을 이용한다. 인간 B 세포로부터 수거된 재배열된 V 유전자를 사용하는 천연 라이브러리 (Marks et al (1991) J. MoI. Biol, 222: 581; Vaughan et al (1996) Mature Biotech., 14: 309)가 당 분야에 널리 공지되어 있다. 합성 라이브러리 (Hoogenbooxn & Winter (1992) J. MoI. Biol, 227: 381; Barbas et al. (1992) Proc. Natl Acad. ScL USA, 89: 4457; Nissim et al (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. MoI Biol, 248: 97)가 보통 PCR을 이용하는 면역글로불린 V 유전자의 클로닝에 의해 제조된다. PCR 과정에서의 오류는 높은 정도의 무작위화를 발생시킬 수 있다. VH 및/또는 VL 라이브러리는 표적 항원 또는 에피토프에 대해 별도로 선택될 수 있다.
라이브러리 벡터 시스템
본 발명에 사용하기에 적합한 다양한 선택 시스템이 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 시스템의 예는 하기에 기술되어 있다.
박테리오파아지 람다 발현 시스템이 기존에 기술된 바와 같이 박테리오파아지 플라크 또는 용해소원의 콜로니, 또는 둘 모두로서 직접적으로 스크리닝될 수 있고 (Huse et al. (1989J Science, 246: 1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A., 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc. Natl Acad. Sd. U.S.A., 88: 2432), 본 발명에 사용된다. 이러한 발현 시스템이 106개 이하의 상이한 구성원의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있으나, 이들은 보다 많은 수(106개 구성원 초과)의 스크리닝에는 적합하지 않다.
라이브러리의 작제하는데 특히 사용되는 것은 핵산이 이의 발현물인 폴리펩티드로 연결될 수 있는 선택 전시 시스템이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 선택 전시 시스템은 적절한 전시 수단에 의해 일반 및/또는 표적 리간드에 의해 라이브러리의 개별적 구성원의 선택을 가능케 하는 시스템이다.
큰 라이브러리의 요망되는 구성원을 분리시키기 위한 선택 프로토콜은 당 분야에 공지되어 있고, 이는 파아지 전시 기술로 대표된다. 다양한 펩티드 서열이 섬유상 박테리오파아지의 표면에 전시되는 이러한 시스템 (Scott and Smith (1990) Science, 249: 386)은 시험관내 선택을 위한 항체 단편 (및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열)의 라이브러리 및 표적 항원에 결합하는 특이적 항체 단편의 증폭 (McCafferty et al., WO 92/01047)을 유도하기에 유용한 것으로 증명되었다. VH 및 VL 영역을 엔코딩하는 누클레오티드 서열은, 이들을 대장균(E. coli)의 원형질막 주위공간으로 향하게 하여, 그 결과 생성된 항체 단편이 통상적으로 박테리오파아지 코트 단백질 (예를 들어, pⅢ 또는 pVIII)로의 융합물로서 박테리오파아지의 표면에 전시되도록 하는 선도 신호를 엔코딩하는 유전자 단편에 연결된다. 대안적으로, 항체 단편은 람다 파아지 캡시드 (파아지바디(phagebodi))에서 외부적으로 전시된다. 파아지 기재 전시 시스템의 이점은 이들이 생물학적 시스템이므로, 선택된 라이브러리 구성원이 박테리아 세포에서 선택된 라이브러리 구성원을 함유하는 파아지를 성장시킴으로써 간단하게 증폭될 수 있다는 점이다. 더욱이, 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 엔코딩하는 누클레오티드 서열이 파아지 또는 파아지미드 벡터에 함유되므로, 서열분석, 발현 및 이후의 유전적 조작이 비교적 간단하다.
박테리오파아지 항체 전시 라이브러리 및 람다 파아지 발현 라이브러리의 작제를 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) supra; Baxbas et al. (1992) supra; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol, 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313, 본원에 참조로서 포함되어 있음).
특히 유리한 한 방법은 파아지-라이브러리를 사용하는 것이다 (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudlxary et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al (1990) supra; Clackson et al (1991) Nature, 352: 624; Marks et al (1991) J MoI. Biol, 222: 581; Chiswell et al (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al (1992) J Biol. Chem., 267). 박테리오파아지 코트 단백질에 전시되는 scFv 라이브러리의 다양한 구체예가 기술되어 있다. 파아지 전시 방법의 정련이 본원에 참조로서 포함된 WO96/06213 및 WO92/01047 (Medical Research Council et al.) 및 WO97/08320 (Morphosys)에 기술된 바와 같이 공지되어 있다.
폴리펩티드의 라이브러리를 생성하기 위한 기타 시스템은 라이브러리 구성원의 시험관내 합성을 위한 세포 비함유 효소 기구의 사용을 포함한다. 한 방법에서, RNA 분자는 표적 리간드에 대한 대안적 범위의 선택 및 PCR 증폭에 의해 선택된다 (Tuerk and Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818). 유사한 기술이 소정의 인간 전사 인자에 결합하는 DNA 서열을 확인하기 위해 사용될 수 있다 (Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry and Joyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258 and WO92/14843). 유사한 방식에서, 다수의 라이브러리를 생성시키기 위한 방법으로서 폴리펩티드를 합성하기 위해 시험관내 번역이 사용될 수 있다. 일반적으로 안정화된 폴리솜(polysome) 복합체를 포함하는 이러한 방법이 WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058 및 WO92/02536에 추가로 기술되어 있다. 파아지 기재가 아닌 대안적 전시 시스템, 예를 들어 WO95/22625 및 WO95/11922 (Affymax)에 기술된 것은 선택을 위한 폴리펩티드를 전시하기 위해 폴리솜을 이용한다.
또 다른 추가 범주의 기술은 유전자와 이의 유전 생성물의 결합을 가능케 하는 인공 구획내에서의 레퍼토리의 선택을 포함한다. 예를 들어, 요망되는 유전자 생성물을 엔코딩하는 핵산 서열이 유중수 에멀젼에 의해 형성된 마이크로캡슐에서 선택될 수 있는 선택 시스템이 WO99/02671, WO00/40712 및 문헌[Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6]에 기술되어 있다. 요망되는 활성을 지니는 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전 성분이 마이크로캡슐 내로 구획으로 나누어진 후, 마이크로캡슐 내에서 이들의 각각의 유전자 생성물 (RNA 또는 단백질)을 생성시키기 위해 전사되고/되거나 번역된다. 요망되는 활성을 지니는 유전자 생성물을 생성하는 유전 성분은 이후 분류된다. 이러한 방법은 다양한 방법에 의해 요망되는 활성을 검출함으로써 관심 유전자 생성물을 선택한다.
라이브러리 작제
선택을 위한 라이브러리는 당 분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 상기 나열된 기술을 이용하여 작제될 수 있거나, 상업적 공급원으로부터 구입될 수 있다. 본 발명에 유용한 라이브러리는, 예를 들어 WO99/20749에 기술되어 있다. 일단 벡터 시스템이 선택되고, 관심 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 라이브러리 벡터 내로 클로닝되면, 이는 발현 전에 돌연변이 유발을 수행함으로서 클로닝된 분자 내에서 다양성을 생성시킬 수 있고; 대안적으로, 엔코딩된 단백질은 돌연변이 유발 및 추가 범위의 선택이 수행되기 전에 상기 기술된 바와 같이 발현되고 선택될 수 있다. 구조적으로 최적화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열의 돌연변이 유발은 표준 분자 방법에 의해 수행된다. 물론, 중합효소 연쇄반응, 또는 PCR(Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol, 155: 335, 본원에 참조로서 포함됨)이 사용된다. 관심 표적 서열을 증폭시키기 위한 열안정적인 DNA 의존성 DNA 중합효소에 의해 촉매된 다중 사이클의 DNA 복제를 이용하는 PCR은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 항체 라이브러리의 작제는 본원에 참조로서 인용된 문헌[Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55]에 논의되어 있다.
PCR은 주형 DNA (1 fg 이상; 보다 유용하게는 1-1000 ng) 및 25 pmol 이상의 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 수행되고; 프라이머 풀이 각각의 서열이 상기 풀의 분자의 소량의 분획만에 의해 나타내어지는 바와 같이 매우 이종이고, 양이 이후의 증폭 사이클에서 제한이 되는 경우에 보다 많은 양의 프라이머를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 통상적인 반응 혼합물은 2μl의 DNA, 25 pmol의 올리고누클레오티드 프라이머, 2.5 μl의 1OX PCR 완충용액 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 μl의 1.25 μM dNTP, 0.15 μl (또는 2.5 유닛)의 Taq DNA 중합효소 (Perkin Elmer, Foster City, CA) 및 전체 부피가 25μl가 되게 하는 탈이온화된 물을 포함한다. 미네랄 오일이 입혀지고, 프로그램화된 열 사이클러를 이용하여 PCR이 수행된다. PCR 사이클의 각각의 단계의 길이 및 온도, 뿐만 아니라 사이클의 수는 효과에 대한 엄격한 요구조건에 따라 조정된다. 어닐링 온도 및 시간은 주형에 대해 어닐링되는 것으로 예상되는 프라이머의 효능 및 용인되는 미스매치의 정도 둘 모두에 의해 결정되고; 명백하게는, 핵산 분자가 동시에 증폭되고 돌연변이 유발되는 경우 최소한 첫번째 순환의 합성에서 미스매치가 요구된다. 프라이머 어닐링 조건의 엄격함을 최적화시키기 위한 능력은 당업자의 지식 범위 내에 해당된다. 30℃ 내지 72℃ 사이의 어닐링 온도가 사용된다. 주형 분자의 최초 변성은 일반적으로 4분 동안 92℃ 내지 99℃에서 발생한 후, 변성 (15초 내지 1분 동안 94-99℃), 어닐링 (상기 논의된 바와 같은 온도; 1-2분) 및 신장 (증폭되는 생성물의 길이에 따라 1-5분 동안 72℃)으로 구성된 20-40회의 사이클로 발생한다. 최종 신장은 일반적으로 72℃에서 4분이고, 4℃에서 한계가 없는 (0 내지 24시간) 단계가 후속될 수 있다.
i. 주쇄 형태의 선택
면역글로불린 상과의 구성원은 모두 이들의 폴리펩티드 사슬에 대한 유사한 폴드를 공유한다. 예를 들어, 항체가 이들의 주요 서열과 관련하여 매우 다양하지만, 서열 및 결정학적 구조의 비교는 예상과는 반대로 제한된 수의 주쇄 형태, 또는 정준 구조를 채택한 항체의 6개의 항원 결합 루프중 5개 (H1, H2, L1, L2, L3)를 나타낸다 (Chothia and Lesk (1987) J. MoI. 3iol, 196: 901; Chothia et al (1989) Nature, 342: 877). 따라서, 루프 길이 및 중요 잔기의 분석은 인간 항체의 대부분에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주쇄 형태의 예상을 가능케 한다 (Chothia et al. (1992) J MoI. Biol, 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBOJ., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. MoI. Biol, 264: 220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조와 관련하여 보다 다양하지만 (D 분절의 사용에 기인함), 이는 또한 루프 및 항체 프레임워크 내의 중요 위치에서 특정 잔기 또는 잔기의 유형의 길이 및 존재에 따른 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주쇄 형태를 형성한다 (Martin et al (1996) J. Mol Biol, 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
본 발명의 dAb는 라이브러리 형태로 제공된 이들 자체일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, dAb 및/또는 도메인의 라이브러리는 특정 루프 길이 및 중요 잔기가 일원의 주쇄 형태가 공지되는 것이 보장되게 선택되도록 고안된다. 유리하게는, 이들은 상기 논의된 바와 같이 비기능적인 우연을 최소화하기 위한 천연에서 발견되는 면역글로불린 상과 분자의 실제 형태이다. 생식세포 V 유전자 분절은 항체 또는 T 세포 수용체 라이브러리를 작제하기에 적절한 기본 프레임워크로 작용하며; 기타 서열이 또한 사용될 수 있다. 기능에 영향을 미치지 않는 적은 수의 작용 구성원이 변경된 주쇄 형태를 지닐 수 있도록 매우 낮은 빈도로 변이가 발생할 수 있다.
리간드에 의해 엔코딩된 상이한 주쇄 형태의 수를 측정하고, 리간드 서열에 기초한 주쇄 형태를 예측하고, 정준 구조에 영향을 미치지 않는 다양성을 위한 잔기를 선택하기 위해 정준 구조 이론이 또한 사용된다. 인간 Vκ 도메인에서, L1 루프가 4개의 정준 구조중 하나를 채택할 수 있고, L2 루프가 단일 정준 구조를 지닐 수 있고, 인간 Vκ 도메인의 90%가 L3 루프에 대해 4개 또는 5개의 정준 구조중 하나를 채택한다는 것이 공지되어 있으므로 (Tomlinson et al. (1995) supra); Vκ 도메인 단독에서, 상이한 정준 구조가 매우 다양한 주쇄 형태를 생성시키기 위해 조합될 수 있다. Vλ 도메인이 L1, L2 및 L3 루프에 대해 다양한 범위의 정준 구조를 엔코딩하고, Vκ 및 Vλ 도메인이 H1 및 H2 루프에 대해 여러 정준 구조를 엔코딩할 수 있는 임의의 VH 도메인과 함께 쌍을 이룰 수 있고, 이들 5개의 루프에 대해 관찰된 정준 구조 조합의 수가 매우 크다는 것이 제공되어 있다. 이는 주쇄 형태에서의 다양성의 생성이 광범위한 결합 특이성의 생성에 필수적일 수 있음을 의미한다. 그러나, 단일한 공지된 주쇄 형태에 기초하여 항체 라이브러리를 작제하는 경우, 예상과는 반대로 주쇄 형태의 다양성이 모든 항원을 실질적으로 표적으로 하는 충분한 다양성을 생성시키는데 필요하지 않음이 발견되었다. 더욱 놀랍게는, 단일 주쇄 형태는 공통 구조를 필요로 하지 않으며, 단일한 천연 발생 형태가 전체 라이브러리에 대한 기초로 사용될 수 있다. 따라서, 한 바람직한 양태에서, 본 발명의 dAb는 단일한 공지된 주쇄 형태를 지닌다.
선택되는 단일한 주쇄 형태는 바람직하게는 당해 면역글로불린 상과 유형의 분자중 평범한 것이다. 형태는 현저한 수의 천연 발생 분자가 이를 채택하는 것으로 관찰되는 경우에 평범한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각각의 결합 루프에 대한 다양한 주쇄 형태의 천연 발생은 별개인 것을 간주되고, 천연 발생 가변 도메인은 상이한 루프에 대한 주쇄 형태의 요망되는 조합을 지니도록 선택된다. 어떠한 것도 가능하지 않은 경우, 가장 근접한 동등물이 선택될 수 있다. 상이한 루프에 대한 주쇄 형태의 요망되는 조합은 요망되는 주쇄 형태를 엔코딩하는 생식세포 유전자 분절을 선택함으로써 생성되는 것이 바람직하다. 선택된 생식세포 유전자 분절이 종종 천연으로 발현되는 것이 더욱 바람직하고, 매우 빈번히 모든 천연 생식세포 유전자 분절이 발현되는 것이 가장 바람직하다.
dAb 또는 이의 라이브러리의 고안에서, 6개의 항원 결합 루프의 각각에 대한 상이한 주쇄 형태의 발생은 별개적인 것으로 간주될 수 있다. H1, H2, L1, L2 및 L3에 대해, 천연 발생 분자의 항원 결합 루프중 20% 내지 100%에 의해 채택되는 소정의 형태가 선택된다. 통상적으로, 이의 관찰된 발생률은 35% 초과 (즉, 35% 내지 100%)이고, 이상적으로는 50% 초과 또는 65% 초과이다. 방대한 대부분의 H3 루프는 정준 구조를 지니지 않으므로, 정준 구조를 나타내지 않는 루프들중에서 평범한 것의 주쇄 형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 각각의 루프에 대해, 천연 레퍼토리에서 가장 빈번히 관찰되는 형태가 선택된다. 인간 항체에서, 각각의 루프에 대해 가장 인기있는 정준 구조 (CS)는 하기와 같다: H1-CS1 (발현된 레퍼토리의 79%), H2-CS3 (46%), VK의 L1-CS 2 (39%), L2-CS1 (100%), Vκ의 L3-CS1 (36%) (계산은 70:30의 κ:λ 비로 추정, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 48: 133). 정준 구조를 지니는 H3 루프에 대해, 잔기 94에서 잔기 101의 염교(salt bridge)를 지니는 7개의 잔기의 CDR3 길이 (Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 통상적인 듯 하다. 상기 배열을 형성하기 위해 필요한 H3 길이 및 중요 잔기를 지니는 EMBL 데이터 라이브러리 내에 16개 이상의 인간 항체 서열 및 항체 모델링에 대한 기초로 사용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크에서의 두개 이상의 결정학적 구조(2cgr 및 ltet)가 존재한다. 상기 형태의 정준 구조에서 가장 빈번하게 발현되는 생식세포 유전자 분절은 VH 분절 3-23 (DP-47), JH 분절 JH4b, Vκ 분절 02/012 (DPK9) 및 Jκ 분절 Jκ1이다. VH 분절 DP45 및 DP38이 또한 적합하다. 따라서, 이들 분절은 작제물에 기초하여 요망되는 단일 주쇄 형태를 지닌 라이브러리와 조합하여 사용될 수 있다.
대안적으로, 분리시 결합 루프의 각각에 대해 천연 발생된 상이한 주쇄 형태에 기초하여 단일 주쇄 형태를 선택하는 것 대신에, 천연 발생된 주쇄 형태의 조합물이 단일 주쇄 형태를 선택하기 위한 기준으로 사용될 수 있다. 항체의 경우, 예를 들어, 임의의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 6개의 항원 결합 루프에 대한 정준 구조 조합물의 천연 발생이 결정될 수 있다. 여기서, 선택된 형태는 천연 발생 항체에서 평범한 것이 바람직하고, 천연 레퍼토르에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 인간 항체에서, 예를 들어, 5개 항원 결합 루프인 H1, H2, L1, L2 및 L3의 천연 조합이 고려되는 경우, 정준 구조의 가장 빈번한 조합이 결정되고, 단일 주쇄 형태를 선택하기 위한 기준으로서 H3 루프에 대한 가장 인기있는 형태와 조합된다.
ii. 정준 서열의 다양성
선택된 여러 공지된 주쇄 형태 또는 바람직하게는 단일의 공지된 주쇄 형태를 지니는, 본 발명에 따른 dAb 또는 라이브러리는 구조 및/또는 기능적 다양성을 지니는 레퍼토리를 생성시키기 위해 분자의 결합 부위를 다양화시킴으로써 작제될 수 있다. 이는 변이체가 광범위한 활성을 제공할 수 있도록 이들의 구조 및/또는 기능에서 충분한 다양성을 지니도록 생성된다는 것을 의미한다.
요망되는 다양성은 통상적으로 하나 이상의 위치에서 선택된 분자를 다양화시킴으로써 생성된다. 변형되는 위치는 무작위적으로 선택될 수 있거나, 바람직하게는 선택된다. 이후, 변이는 존재하는 아미노산이 천연 또는 합성의 임의의 아미노산 또는 이의 유사체에 의해 대체되는 동안 무작위화에 의해 매우 다양한 수의 변이체를 생성시키거나, 존재하는 아미노산을 하나 이상의 정의된 서브셋의 아미노산으로 대체하여 보다 제한된 수의 변이체를 생성시킴으로써 달성될 수 있다.
상기 다양성을 도입시키기 위해 다양한 방법이 보고되어 있다. 오류 빈발(Error-prone) PCR (Hawkins et al. (1992) J. MoI. Biol, 226: 889), 화학적 돌연변이 유발 (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) 또는 박테리아 돌연변이 균주 (Low et al (1996) J. MoI. Biol, 260: 359)가 상기 분자를 엔코딩하는 유전자로 무작위적 돌연변이를 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이화시키기 위한 방법은 또한 당 분야에 널리 공지되어 있고, PCR을 사용하거나 사용하지 않고 미스매칭된 올리고누클레오티드 또는 축퇴된 올리고누클레오티드를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 여러 합성 항체 라이브러리가 항원 결합 루프에 대해 돌연변이를 표적화시킴으로써 생성되었다. 인간 테타누스 톡소이드 결합 Fab의 H3 영역이 다양한 신규한 결합 특이성을 생성시키기 위해 무작위화되었다 (Barbas et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA, 89: 4457). 무작위 또는 반-무작위 H3 및 L3 영역이 돌연변이화되지 않은 프레임워크 영역을 지니는 다수의 라이브러리를 생성시키기 위해 생식세포 V 유전자 분절에 첨부되었다 (Hoogenboom & Winter (1992) J. MoI Biol, 227: 381; Barbas et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al (1994) EMBO J, 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBOJ., 13: 3245; De Kruif et al (1995) J MoI Biol, 248: 97). 이러한 다양성이 기타 항원 결합 루프중 일부 또는 전부를 포함하도록 확장되었다 (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra).
루프 무작위화는 H3 단독에 대해 잠재적으로 약 1015개 초과의 구조 및 기타 5개 루프에 대해 유사하게 많은 변이를 생성시킬 수 있으므로, 이는 현재의 형질전환 기술을 이용하거나 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성시키는 세포 결핍 시스템을 이용하여 실행 불가능하다. 예를 들어, 지금까지 작제된 가장 큰 라이브러리중 하나로, 상기 고안의 라이브러리에 대한 잠재적 다양성중 단지 소량인 6 x 1010개의 상이한 항체가 생성되었다 (Griffiths et al. (1994) supra).
바람직한 구체예에서, 분자의 요망되는 기능을 생성시키거나 변형시키는데 직접적으로 관련된 잔기들만이 다양화된다. 많은 분자에 대해, 상기 기능은 표적으로의 결합이 될 것이며, 따라서 다양성은 표적 결합 부위에 집중되어야 하는 반면, 분자의 전체 패킹에 중요한 분자를 변화시키거나 선택된 주쇄 형태를 유지시키는 것은 피해야 한다.
항체 도메인에 적용됨에 따른 정준 서열의 다양화
dAb의 경우, 표적에 대한 결합 부위는 가장 빈번하게는 항원 결합 부위이다. 따라서, 바람직하게는 항원 결합 부위 내의 잔기만이 변형된다. 이들 잔기는 인간 항체 레퍼토리에서 극도록 다양하고, 고-분해 항체/항원 복합체 내에서 접촉을 이루는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, L2는 천연 발생 항체에서 위치 50 및 53이 다양한 것으로 공지되어 있고, 항원과 접촉을 이루는 것으로 관찰된다. 대조적으로, 통상적인 방법은 문헌[Kabat et al. (1991, supra)]에 정의된 바와 같이 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR1) 내의 모든 잔기를 다양화시켰고, 7개의 잔기를 본 발명에 따라 사용하기 위한 라이브러리에서 다양화된 2개와 비교하였다. 이는 다양한 항원 결합 특이성을 유도하기 위해 필요한 작용 다양성에 대한 현저한 개선을 나타낸다.
사실상, 항체 다양성은 나이브(naive) 1차 레퍼토리를 생성하기 위한 생식세포 V, D 및 J 유전자의 체세포성 재조합 (생식세포 및 접합부 다양성으로도 언급됨) 및 생성된 재배열된 V 유전자의 체세포성 과변이의 두개의 과정의 결과이다. 인간 항체 서열의 분석은 1차 레퍼토리에서의 다양성이 항원 결합 부위의 중심에 초점이 되는 반면, 체세포성 과변이는 1차 레퍼토리에서 고도로 보존된 항원 결합 부위의 주위의 영역에 대해 다양하게 분포된 것으로 나타난다 (참조: Tomlinson et al. (1996) J. MoI. Biol, 256: 813). 이러한 상보성은 서열 공간을 검색하기 위한 효과적인 방법으로 발달될 수 있고, 비록 항체에서만 명백하게 독특히지만 이는 기타 폴리펩티드 레퍼토리에도 용이하게 적용될 수 있다. 다양화된 잔기들은 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 잔기의 서브셋이다. 표적 결합 부위 내의 다양한 (오버래핑되는 것을 포함함) 잔기의 서브셋은 요망시 선택 동안 여러 단계에서 다양화된다.
항체 레퍼토리의 경우, 최초 '나이브' 레퍼토리는 항원 결합 부위 내의 전체가 아닌 몇몇 잔기가 다양화되는 경우 생성될 수 있다. 본원에서 사용되는 맥락과 같이, 용어 "나이브"는 미리 결정된 표적을 지니지 않는 항체 분자를 의미한다. 이러한 분자는 면역계가 아직 광범위한 항원 자극에 의해 공격되지 않은 태아 및 신생아 개체의 경우와 같이 면역 다양성을 경험하지 않은 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩된 것과 유사하다. 이후, 이러한 레퍼토리는 광범위한 항원 또는 에피토프에 대해 선택된다. 요망되는 경우, 추가의 다양성이 최초 레퍼토리에서 다양화된 영역 외부에 도입될 수 있다. 이러한 성숙한 레퍼토리는 변형된 기능, 특이성 또는 친화성에 대해 선택될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 라이브러리의 작제에서, 선택된 위치의 다양화는 통상적으로 다수의 가능한 아미노산 (모든 20 또는 이의 서브셋)이 상기 위치에 포함될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 특성화하는 코딩 서열을 변환시킴으로써 핵산 수준에서 달성된다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 다능한 코돈은 모든 아미노산 뿐만 아니라 TAG 정지 코돈을 엔코딩하는 NNK이다. NNK 코돈은 바람직하게는 필요한 다양성을 도입시키기 위해 사용된다. 추가의 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 야기시키는 NNN 코돈을 포함하는 동일한 목적을 달성하는 기타 코돈이 또한 사용된다.
인간 항체의 항원 결합 부위에서의 측쇄 다양성의 특징은 특정 아미노산 잔기를 선호하는 현저한 경향이다. 각각의 VH, VK 및 Vλ 영역에서의 10개의 가장 다양한 위치의 아미노산 조성이 합계되는 경우, 측쇄 다양성의 76% 초과가 세린 (24%), 티로신 (14%), 아스파라긴 (11%), 글리신 (9%), 알라닌 (7%), 아스파테이트 (6%) 및 트레오닌 (6%)의 7개의 상이한 잔기만으로부터 발생한다. 이러한 주쇄 가요성을 제공할 수 있는 친수성 잔기 및 작은 잔기로의 경향은 광범위한 항원 또는 에피토프에 결합하는 경향이 있는 표면의 진화를 반영하는 듯 하며, 1차 레퍼토리 내의 항체에서 요구되는 복잡성을 설명하는데 도움이 될 수 있다.
아미노산의 상기 분포를 모방하는 것이 바람직하므로, 다양화되는 위치에서의 아미노산의 분포는 바람직하게는 항체의 항원 결합 부위에서 관찰되는 것을 모방한다. 다양한 표적 항원에 대한 특정 폴리펩티드 (반드시 항체 폴리펩티드는 아님)의 선택을 허용하는 아미노산 치환에서의 상기 경향은 임의의 폴리펩티드 레퍼토리에 대해 용이하게 적용된다. 다양화되는 위치에서의 아미노산 분포를 경향화시키는 다양한 방법 (트리-누클레오티드 돌연변이 유발의 사용을 포함함, 참조 WO97/08320)이 존재하고, 이중 바람직한 방법은 합성의 용이함으로 인해 통상적인 축퇴성 코돈의 사용이다. 천연 아미노산 용도를 이용한 축퇴성 코돈 (각각의 위치에서 동일한 비의 단일, 이중, 삼중 및 사중 축퇴를 지님)의 모든 조합에 의해 엔코딩된 아미노산 프로파일을 비교함으로써, 대부분의 전형적인 코돈을 계산하는 것이 가능하다. IUPAC 명명법을 이용한 코돈 (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C 및 (AGT)(AGC)(CT) - 즉, DVT, DVC 및 DVY 각각이 요망되는 아미노산 프로파일에 가장 근접한 것들이다: 이들은 22% 세린 및 11% 티로신, 아라파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파테이트, 트레오닌 및 시스테인을 엔코딩한다. 따라서, 바람직하게는 라이브러리는 각각의 다양화된 위치에서 DVT, DVC 또는 DVY 코돈을 이용하여 작제된다.
D. 본 발명에 따른 dAb 의 특징화
본 발명에 따른 dAb의 이의 특정 항원 (캔디다 spp. 독성 인자) 또는 에피토프에 대한 결합은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 시험될 수 있고, 이는 ELISA를 포함한다. 본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 결합은 모노클로날 파아지 ELISA를 이용하여 시험된다.
파아지 ELISA는 임의의 적절한 과정에 따라 수행될 수 있고; 한 예시적 프로토콜이 하기 기술된다.
각각의 순회에서 생성된 파아지 집단의 선택은 "폴리클로날" 파아지 항체를 확인하기 위해, 선택된 항원 또는 에피토프에 대한 결합이 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 이후, 상기 집단으로부터의 단일 감염된 박테리아 콜로니로부터의 파아지가 "모노클로날" 파아지 항체임을 확인하기 위해 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 항원 또는 에피토프에 대한 결합에서 가용성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 또한 요망되고, 이는 또한 예를 들어 C- 또는 N-말단 태그에 대한 시약을 이용하는 ELISA에 의해 수행될 수 있다 (참조: Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, 참조로서 본원에 인용되어 있음).
선택된 파아지 모노클로날 항체의 다양성은 또한 PCR 생성물의 젤 전기영동 (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), 프로빙 (Tomlinson et al., 1992) J. MoI. Biol. 227, 776) 또는 벡터 DNA의 서열분석에 의해 측정될 수 있다.
E. 본 발명에 따른 dAb를 사용한 캔디다 spp . 감염의 치료
본 발명의 방법에 따라 선택된 dAb가 생체내 치료학적 및 예방학적으로 적용, 시험관내 및 생체내 진단 적용, 시험관내 검정 및 시약 적용 등에 사용될 수 있다. 예를 들어, dAb는 당업자에 공지된 방법에 따른 항체 기재 검정 기법 예컨대, ELISA 기법에 사용될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 dAb는 진단, 예방 및 치료 과정에 사용된다. 본 발명에 따라 선택된 단일 도메인-이펙터 그룹 항체 (dAb)는 웨스턴 검정 및 표준 면역조직화학 공정에 의한 동일계 단백질 검출에 진단학적으로 사용되며; 이러한 분야에 사용하기 위해, 선택된 레퍼토리의 항체는 당해분야에 공지된 기법에 따라 라벨링될 수 있다. 또한, 이러한 항체 폴리펩티드는 크로마토그래피 지지체 예컨대, 수지와 복합되는 경우 친화성 크로마토그래피 공정에서 예비로 사용될 수 있다. 모든 이러한 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
90 내지 95% 이상의 동질성의 실질적으로 순수한 dAb가 포유동물에 대한 투여에 바람직하고, 98 내지 99% 또는 이 이상의 동질성이 약제 용도, 특히 포유동물이 인간인 경우에 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 요망되는 동질성으로 정제된 후, 리간드는 진단학적으로 및/또는 치료학적(체외적으로를 포함함)으로 사용될 수 있거나, 검정 과정, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용될 수 있다 (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).
본 발명의 dAb는 개체에서 캔디다 spp 감염 특히, 캔디다 알비칸스 감염을 예방, 억제 또는 치료에 있어서 전형적으로 사용될 것이다.
본 발명에서, 용어 "예방"은 질병의 유발 전에 보호적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. "억제"는 질병 유발 후 질병의 증상 출현 전에 조성물의 투여를 의미한다. "치료"는 질병 증상이 명백해진 후의 보호적 조성물의 투여를 포함한다.
캔디다 spp. 감염에 대해 보호하거나 치료하는데 있어서 dAb를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 동물 모델 시스템이 이용가능하며, 이는 당업자에게 친숙할 것이다. 사용된 일부 모델 시스템의 상세한 내용은 실시예에 제공된다. 캔디다 spp. 감염은 전신, 점막, 기관지, 폐, 손톱 밑, 경구 또는 질에서 발생할 수 있다. 본원에 기술된 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 dAb는 질 또는 전신성 캔디다 spp. 감염 특히, 질 또는 전신성 캔디다 알비칸스 감염의 치료에 사용된다.
본원에 기술된 dAb는 생체내 혈청 반감기를 연장시키기 위해 포맷화될 수 있다. 증가된 생체내 반감기는 면역글로불린, 특히 항체, 가장 특히 소규모의 항체 단편, 예를 들어 dAb의 생체내 적용에 유용하다. 임상 적용을 심각하게 제한할 수 있는 이러한 단편 (Fvs, 이황화 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터 신속하게 제거된다.
dAb는 항체의 더 큰 항원-결합 단편 또는 더 큰 유체역학적 크기를 갖는 항체 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로서 포맷화됨)로서 포맷화될 수 있다. dAb는 또한, 폴리알킬렌글리콜 그룹 (예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 그룹, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜), 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린-결합부, 항체 Fc 영역의 부착 또는 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 더 큰 유체역학적 크기를 갖도록 포맷화될 수 있다. 일부 구체예에서, dAb는 페길화된다. 바람직하게는, 페길화된 dAb는 페길화되지 않은 동일한 dAb와 실질적으로 동일한 친화도 또는 접착도로 SAP 및 MP에 결합한다. 예를 들어, dAb는 약 1000개 이하, 바람직하게는 약 100개 이하, 더욱 바람직하게는 약 10개 이하의 인자에 의해 비페길화된 형태의 dAb의 접착도와 상이한 접착도, 또는 비페길화된 형태에 비해 실질적으로 변화되지 않은 친화도를 갖는 접착도로 SAP 및 MP에 결합하는 dAb를 포함하는 페길화된 dAb일 수 있다. 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb, 이를 제조하기에 적합한 방법, 증가된 생체내 반감기의 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb 단량체 및 다량체, 적합한 PEG, 바람직한 유체역학적 크기의 PEG, 및 바람직한 유체역학적 크기의 페길화된 단일 가변 도메인 및 dAb 단량체 및 다량체에 있어서, 2003년 6월 30일자로 출원된 PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)를 참조하라. 상기에 언급된 부분을 포함하는 PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)의 전체 교시는 본원에 참조로서 포함되어 있다.
본 발명의 dAb (예를 들어, dAb 단량체 및 다량체)의 유체역학적 크기는 당해분야에 널리 공지된 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 겔 크로마토그래피가 dAb의 유체역학적 크기를 측정하는데 이용될 수 있다 dAb의 유체역학적 크기를 측정하는데 적합한 겔 여과 매트릭스 예컨대, 가교된 아가로스 매트릭스는 널리 공지되어 있으며 용이하게 입수가능하다.
dAb 포맷의 크기 (예를 들어, dAb에 부착된 PEG 부분의 크기)는 요망되는 적용에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, dAb가 순환계에 존재하고 말초 조직으로 진입하도록 하는 경우, 혈류로부터의 혈관외유출을 촉진하기 위해 리간드의 유체역학적 크기를 낮게 유지시키는 것이 바람직하다. 대안적으로, dAb를 보다 장기간 동안 전신 순환에 유지시키는 것이 요망되는 경우, 리간드의 크기는, 예를 들어 Ig 유사 단백질로 포맷화시키거나 30 내지 60 kDa의 PEG 부분의 첨가 (예를 들어, 선형 또는 분지형 PEG 30 내지40 kDa PEG 예컨대, 두개의 20kDa PEG 부분 첨가)에 의해 증가될 수 있다. dAb 포맷의 크기는 생체내에서 목적하는 혈청 반감기를 달성하고, 예를 들어, 독소에 대한 노출을 제어하고/거나 독소에 대한 부작용을 감소시키기 위해 조절될 수 있다.
dAb의 유체역학적 크기 및 이의 혈청 반감기는 또한 dAb를 본원에 기술된 바와 같이 생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)에 컨쥬게이션시키거나 연결시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, dAb는 항-혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 어피바디 또는 항-신생아 Fc 수용체 어피바디에 컨쥬게이션되거나 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 리간드에 사용하기에 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 2005/077042A2에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:
· SEQ ID NO:1 (WO 2005/077042A2에 기술됨, 이 서열은 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있음);
· WO 2005/077042A2 내의 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이로 구성된 알부민 단편 또는 변이체;
· 하기의 (a) 내지 (l)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체: (a) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 54 내지 61; (b) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 76 내지 89; (c) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 92 내지 100; (d) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 170 내지 176; (e) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 247 내지 252; (f) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 266 내지 277; (g) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 280 내지 288; (h) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 362 내지 368; (i) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 439 내지 447; (j) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 462 내지 475; (k) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 478 내지 486; 및 (l) WO 2005/077042A2의 SEQ ID NO:1의 아미노산 560 내지 566.
본 발명에 따른 dAb 조성물에 사용하기에 적합한 알부민, 및 이의 단편 및 유사체의 추가의 예는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 WO 03/076567 A2에 기술되어 있다. 특히, 하기의 알부민, 또는 이의 단편 또는 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다:
· WO 03/076567A2, 예를 들어 도 3에 기술된 인간 혈청 알부민 (이 서열 정보는 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있음);
· 66,500의 화학식 분자량을 지니는 585개의 아미노산의 단일한 글리코실화되지 않은 폴리펩티드 사슬로 구성된 인간 혈청 알부민 (HA) (참조: Meloun, et al., FEBS Letters 58:136 (1975); Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol Chem. 261:6747 (1986));
· 문헌[Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)]에 기술된 알부민의 다형 변이체 또는 유사체 또는 단편;
· EP 322094에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어 HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369) 및 HA(1-419) 및 1-369와 1-419 사이의 단편;
· EP 399666에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어 HA(1-177) 및 HA(1-200) 및 HA(1-X) 사이의 단편, 여기서 X는 178 내지 199중 임의의 수임.
(하나 이상의) 반감기 연장 부분 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이들의 단편 및 유사체)이 본 발명의 dAb에 사용되는 경우, 이는 임의의 적절한 방법, 예를 들어 dAb로의 직접 융합, 예를 들어 융합 단백질을 엔코딩하는 단일 누클레오티드 작제물을 이용함으로써 컨쥬게이션될 수 있고, 여기서 융합 단백질은 세포 표면 표적 결합 부분에 N-말단 또는 C-말단으로 위치된 반감기 연장 부분을 지닌 단일 폴리펩티드 사슬로서 엔코딩된다. 대안적으로, 컨쥬게이션은 dAb 사이의 펩티드 링커, 예를 들어 WO 03/076567 A2 또는 WO 2004/003019에 기술된 펩티드 링커를 이용함으로써 달성될 수 있다 (상기 링커는 본 발명에 사용하기 위한 예를 제공하기 위해 본원에 참조로서 포함되어 있다).
통상적으로 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 생체내에서 자연적으로 발생하고, 유기체(예를 들어, 인간)로부터 원치 않는 물질을 제거하는 내인성 메커니즘에 의해 의한 분해 또는 제거에 내성을 지닌 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 세포외 기질로부터의 단백질, 혈액에서 발견되는 단백질, 혈액뇌장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 집중된 단백질, 스트레스 단백질, 질병 특이적 단백질, 또는 Fc 운반체와 관련된 단백질로부터 선택될 수 있다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적절한 폴리펩티드는, 예를 들어 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약제 융합 단백질(참조: 내용이 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 제 5,977,307호), 뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체(예를 들어, 가용성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF 1) 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, α1-항트립신 및 HNF 1α를 포함한다. 혈청 반감기를 향상시키는 적절한 폴리펩티드는 또한 알파-1 당단백질(오로소뮤코이드; AAG), 알파-1 항키모트립신(ACT), 알파-1 마이크로글로불린(단백질 HC; AIM), 항트롬빈 III (AT III), 아포지질단백질 A-1 (Apo A-1), 아포지질단백질 B (Apo B), 세룰로플라스민 (Cp), 보체 성분 C3 (C3), 보체 성분 C4 (C4), C1 에스테라아제 억제제 (C1 INH), C-반응 단백질 (CRP), 페리틴 (FER), 헤모펙신 (HPX), 지질단백질(a) (Lp(a)), 만노오스 결합 단백질 (MBP), 미오글로빈 (Myo), 전알부민 (트랜스티레틴; PAL), 레티놀 결합 단백질 (RBP) 및 류마티스 인자 (RF)을 포함한다.
세포외 기질로부터의 적절한 단백질은, 예를 들어 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴을 포함한다. 콜라겐은 세포외 기질의 주요 단백질이다. 신체의 상이한 부분에서 발견된 약 15개 유형의 콜라겐 분자가 공지되어 있고, 예를 들어 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부 기관에서 발견된 타입 I 콜라겐(신체 콜라겐의 90%에 해당) 또는 연골, 척추 디스크, 척삭 및 안구의 유리체액에서 발견된 타입 II 콜라겐이 있다.
혈액으로부터의 적절한 단백질은, 예를 들어 혈장 단백질 (예를 들어, 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 (예를 들어, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 합토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린 및 β-2-소글로불린), 효소 및 효소 억제제 (예를 들어, 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-항트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역계의 단백질, 예를 들어 면역글로불린 단백질 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 면역글로불린 경쇄 (카파/람다)), 운반체 단백질 (예를 들어, 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린), 디펜신 (예를 들어, 베타-디펜신 1, 호중구 디펜신 1, 호중구 디펜신 2 및 호중구 디펜신 3) 등을 포함한다.
혈액뇌장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 적절한 단백질은, 예를 들어 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 운반체 등을 포함한다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키는 적절한 폴리펩티드는 또한 신장에 집중된 단백질 (예를 들어, 폴리시스틴, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 운반체 K1, 하이만 항원(Heymann's antigen)), 간에 집중된 항원 (예를 들어, 알코올 데히드로게나아제, G250), 폐에 집중된 단백질 (예를 들어, IgA에 결합하는 분비 성분), 심장에 집중된 단백질 (예를 들어, 확장심근병증과 관련된 HSP 27), 피부에 집중된 단백질 (예를 들어, 케라틴), 골특이적 단백질, 예를 들어 골원성 활성을 나타내는 단백질(예를 들어, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8)의 형질전환 성장 인자 β 상과의 서브셋인 형태형성 단백질 (BMP), 종양 특이적 단백질 (예를 들어, 영양막 항원, 헤르셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신 (예를 들어, 간 및 비장에서 발견될 수 있는 카텝신 B))을 포함한다.
적절한 질병 특이적 단백질은, 예를 들어 활성화된 T 세포에서만 발현되는 항원, 예를 들어 LAG-3 (림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드 (OPGL; 참조: Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (활성화된 T 세포에서 발현되고, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-I (HTLV-I)-생성 세포에서 특이적으로 상향 조절되는 TNF 수용체과의 일원; 참조 Immunol. 165 (1):263-70 (2000))을 포함한다. 적절한 질병 특이적 단백질은 또한, 예를 들어 메탈로프로테아제 (관절염/암과 관련), 예를 들어 CG6512 드로소필라, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤린 ftsH; 및 혈관신생 성장 인자, 예를 들어 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 관 내피세포 성장 인자/관 투과성 인자 (VEGF/VPF), 형질전환 성장 인자-α (TGFα), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 안지오제닌, 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈소판에 의해 유래된 내피 성장 인자 (PD-ECGF), 태반 성장 인자 (P1GF), 미드카인 혈소판에 의해 유래된 성장 인자-BB (PDGF) 및 프랙탈카인을 포함한다.
생체내 혈청 반감기를 향상시키기에 적절한 폴리펩티드는 또한 스트레스 단백질, 예를 들어 열충격 단백질(HSP)을 포함한다. HSP는 일반적으로 세포내에서 발견된다. 이들이 세포외에서 발견되는 경우, 이는 세포가 사멸되었고, 이의 내용물이 유출된 것을 나타낸다. 이러한 프로그램화되지 않은 세포 사멸(괴사)은 외상, 질병 또는 손상의 결과로서 세포외 HSP가 면역계로부터의 반응을 촉발시키는 경우 발생한다. 세포외 HSP에 대한 결합은 질병 부위로 본 발명의 조성물을 국소화시킨다.
Fc 운반체와 관련된 적절한 단백질은, 예를 들어 브람벨(Brambell) 수용체(FcRB로도 공지됨)를 포함한다. 이러한 Fc 수용체는 두가지 기능을 지니는데, 이러한 기능 둘 모두는 전달에 잠재적으로 유용하다. 기능은 (1) 태반을 통한 엄마로부터 아이로의 IgG의 운반 및 (2) IgG를 분해로부터 보호하여 이의 혈청 반감기를 연장시키는 것이다. 상기 수용체는 엔도솜으로부터 IgG를 재순환시키는 것으로 생각된다 (참조: Holliger et al., Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)).
약동학적 분석 및 dAb 반감기의 측정 방법은 당업자에게 친숙할 것이다. 이에 대한 상세한 설명은 t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하영역(AUC)와 같은 약동학 파라미터를 기재하는 문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Reference is also made to "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]에서 발견될 수 있다.
일반적으로, dAb는 약리학적으로 적절한 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 통상적으로, 이러한 담체는 수용액 또는 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 염수 및/또는 완충 배지를 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거의 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 현탁액 내에 폴리펩티드 복합체를 지속시키는 것이 필요한 경우, 적절한 생리학적으로 허용되는 애쥬번트가 증점제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충물 및 전해질 보충물, 예를 들어 링거 덱스트로오스에 기초한 것을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 비활성 가스가 또한 존재할 수 있다 (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
본 발명의 dAb는 별도로 투여되는 조성물 또는 기타 작용제와 함께 투여되는 조성물로 사용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료 약물, 예를 들어 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄, 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제 조성물은 본 발명의 dAb와 함께 다양한 세포독소 또는 기타 작용제의 "칵테일(cocktail)", 또는 다양한 특이성을 지니는 본 발명에 따른 dAb의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 공지된 것중 임의의 것일 수 있다. 면역 요법을 제한하지 않는 것을 포함하는 치료를 위해, 본 발명의 선택된 dAb 및 조성물은 표준 기술에 따라 임의의 환자에 투여될 수 있다. 투여는 비경구, 정맥내, 근내, 복막내, 경피, 폐경로를 통해, 또는 적절하게는 카테터를 이용한 직접 주입을 포함하는 임의의 적절한 방식일 수 있다. 투여량 및 빈도는 임상의에 의해 고려되는 환자의 연령, 성별 및 상태, 기타 약물의 동반 투여, 카운터인디케이션(counterindication) 및 기타 파라미터에 의존될 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본원에 기술된 치료학적 조성물은 국소적 또는 전신적으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 캔디다증으로부터 고통받는 환자를 치료하기 위한 dAb를 포함하는 약제조성물의 투여는 일정 기간에 걸친 연속 주입, 또는 단일 투약 또는 알약 복욕을 포함한다. 또한, 단일 투약 또는 알약 복용 후, 이차 알약이 복용될 수 있거나 연속 주입으로 투여될 수 있다.
본 발명의 dAb는 보관을 위해 동결건조될 수 있고, 사용전에 적절한 담체에 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 동결건조법 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 당업자는 동결건조법 및 재구성이 항체 활성 손실의 다양한 정도를 야기할 수 있으며 (예를 들어, 통상적인 면역글로불린인 IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성 손실을 지니는 경향이 있음), 이를 보충하기 위해 사용 수준이 상향 조절될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 dAb 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처리를 위해 투여될 수 있다. 특정 치료 적용에서, 선택된 세포의 집단의 적어도 부분적인 억제, 서프레션, 조절, 사멸, 또는 기타 측정가능한 파라미터를 달성하기에 적절한 양은 "치료적 유효량"으로 정의된다. 이러한 용량을 달성하기에 요구되는 양은 질병의 중중도 및 환자의 면역계의 일반 상태에 좌우될 것이나, 일반적으로 체중 ㎏ 당 0.005 내지 5.0 mg의 선택된 dAb의 범위이고, 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량의 용량이 더욱 일반적으로 사용된다. 예방 적용을 위해, dAb 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 또한 유사하거나 약간 낮은 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 dAb 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 포유동물의 선택 표적 세포 집단의 변화, 비활성화, 사멸 또는 제거를 돕기 위한 예방적 및 치료 환경에 이용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 dAb는 세포의 이종 집합물로부터 표적 세포 집단을 사멸시키거나, 고갈시키거나, 달리 효과적으로 제거하기 위해 체외에서 또는 시험관내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물의 혈액이 tjsxorehls 항체, 세포 표면 수용체 또는 이의 결합 단백질과 체외에서 조합될 수 있고, 이에의해 표준 기술에 따라 포유동물로 복귀시키기 위해 요망되지 않는 세포가 혈액으로부터 사멸되거나 달리 제거된다.
본 발명은 단지 예시의 목적으로 하기 실시예에 추가로 설명된다.
실시예 1: 재료 및 방법
미생물 및 성장 조건
본 연구에 걸쳐, 공통된 실험 효모 캔디다 알비칸을 사용하였다. 그러나, 본 발명은 기타 효모 예컨대, 트로피칼리스, 글라브트라타, 크루세이, 노르베겐시스 또는 인콘스피쿠아를 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
캔디다 알비칸스 균주 SA40 및 AIDS68을 본 연구에 사용하였다. SA40은 플루코나졸 및 기타 트리아졸 약물에 완전히 민감하나, 균주 AIDS 68은 플루코나졸 내성체로서 AIDS 환자로부터 분리하였다 (즉, NCLLS 방법에 의해 규정된 바와 같이 MIC > 64㎍/ml). 두 균주는 효모-펩톤-덱스트로스 (YPD: 1% 효모 추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 글루코오스, 모두 w/v) 또는 효모 질소 기반 (YBN; 2% 글루코오스, 아미노산 및 암모늄 설페이트 부재의 0.17% 효모 질소 기반, 0.5% 암모늄 설페이트, w/v) 또는 윈즈(Winge)(0.3% 효모 추출물, 0.2% 글루코오스) 또는 SDB (1% 박토-펩톤, 2% 덱스트로스) 배지에 28℃에서 일정하게 성장시켰다. 모든 배지를 2% 아가로 고형화시켰다.
정지상 세포를 물중에 2 x 108 세포/ml로 희석시키고, 미디엄 199, 리스 스파이더 및 혈청 플레이트 (Medium 199, Lee's, spider and serum plates)에 1 x 106 세포로 스폿팅시키고, 이를 37℃에서 7일 동안 인큐베이션시켰다. 고형 배지 199 (M199 약 n°31100-019, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)를 종래에 기술된 바와 같이 150mM 트리스 (pH7)로 완충시켰다 (Sharkey, L.L., et al., 1999. J Bacteriol 181:5273-9). 고형 스파이더, 혈청 및 개질된 리스 배지를 종래에 기술된 바와 같이 제조하였다 (Liu, H., J., et al., 1994. Science 266:1723-6).
미생물-튜브 형성을 108 세포/ml의 밀도에서 사전 가온시킨 브로쓰로 정지상 세포를 인큐베이션시킨 후 M199 즉, 개질된 리스 스파이더 및 혈청 배지중에 37℃에서 평가하였다. 네거티브 대조군을 동일한 배지에서 28℃에서 인큐베이션시켰 다.
모든 화학물질 및 항생제는 로쉐 디아그노스틱 (Roche Diagnostic: Perkin Elmer Roche, Branchburg NJ) 및 시그마-알드리히 (Sigma-Aldrich: Milano, Italy)로부터 입수하였다. 미생물 분말 (M199 제외)은 벡턴 디킨슨 (Becton Dickinson & Co., Sparks, MD)로부터 입수하였다.
재조합 단백질의 생성
플라스미드 pRLV126 및 pRLV130을 문헌 [La Valle, R., S. et al., 2000. Infect Immun 68:6777-84; Sandini, S., et al., 2002. Med Mycol 40:471-8]에 상세히 기술된 바와 같이 에놀라아제 및 MP65의 분자 클로닝에 사용하였다.
대장균에서 성숙한 형태의 CaMP65를 클로닝하기 위해, CaMP65의 분비된 N-말단 서열로부터 정지 코돈에 걸친 1200bp DNA 단편을 Ca69 및 Ca65 올리고누클레오티드를 사용하여 증폭하였다 (표 1. BamHI 및 HindIII로의 분해 후 PCR 생성물을 pDS56-RBSII의 상응하는 부위로 클로닝하여 pRLV148을 제공하였다).
프로테이나아제 SAP2 코딩 서열의 분자 클로닝에 있어서, 전장 SAP2 cd를 Ca70 및 Ca71 올리고누클레오티드를 사용하여 증폭시켰다. BamHI 및 PstI로의 부분적 분해 후, SAP2 성숙 형태를 pDS56-RBSII의 상응하는 부위로 클로닝시켜 pRLV 143을 제공하였다.
표 1:
Figure 112007074617512-PCT00001
사용전, pRLV143 및 pRLV148의 모든 DNA 삽입물을 서열분석하여 공지된 유전자와의 상동성을 확인하였다. 소수개의 차이가 관찰되었으나, 이들 어느 것도 코딩화된 생성물에 아미노산 변화에 영향을 주지 않는다.
재조합 C. 알비칸스 단백질의 발현 및 정제
재조합 단백질의 발현을 lac 억제제-생성 pUHA1 플라스미드를 수반하는 대장균 M15에서 수득하였다 (Hochuli, et al., 1988. J Chromatogr., 444:293-302). 카나마이신 및 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 1mM의 최종 농도의 이소프로필-β-D-티오-갈락토피라노시드 (IPTG; BOEHRINGER)를 O.D.600에서 0.7인 배양물에 첨가하고, 추가로 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 유입을 수행하였다. 재조합 6xhis-태깅된 단백질을 제조업자의 지시에 따라 니켈-킬레이트 친화성 크로마토그래피로 정제하였다 (Qiagen; 변성 조건). 정제된 폴리펩티드를 함유하는 분획 물을 풀링시키고, 무수 에탄올 3 volume으로 침전시키고, 물중에 재현탁시키고, -20℃에서 저장하였다.
재조합 C. 알비칸스 단백질의 재폴딩
8M 우레아중에 용해시킨 정제된 단백질을 4℃에서 PBS중의 우레아 농도를 감소시키면서 (4M, 2M, 1M, 0.5M) 우레아에 대해 투석하고, 샘플을 각각의 우레아 농도에서 6h 동안 인튜베이션시키고, PBS (Sigma-Aldrich) (10mM 인산염 완충제; 2.7mM KCl; 137mM NaCl; pH 7.4)에 대해 최종으로 투석하여 재폴딩시켰다.
파아지 전시 dAb 라이브러리의 생성
dAb 파아지 라이브러리는, 단백질을 공지된 분자 구조의 항원과 접촉가능하게 하는 것으로 공지되어 있으며 성숙한 인간 레퍼토리에서 자연스럽게 다양화되는 위치에서, 다양한 아미노산 측쇄를 생성시키기 위한 DNA 누클레오티드 다양화에 의해 혼입된 다양한 부분을 갖는 VH (V3-23 [로커스] DP47 [V 베이스 유입] 및 JH4b) 및 VL (012/02 [로커스] DPκ9 [V 베이스 유입] 및 Jκ1)에 있어서 단일 인간 항체 프레임워크에 기초한다. dAb 가변 도메인은, fd-파아지 게놈에 기초하며, 따라서 선택 과정 동안 사용된 감염성 파아지 입자를 생성시키는데 필요한 모든 파아지 유전자를 함유하는 파아지 벡터 pDOM4로 클로닝시켰다.
파아지 전시에 의한 dAb 선택
4℃에서 밤새 면역튜브를 코팅하는데 사용되는 BupH 카보네이트-비카보네이트 (0.2M 카보네이트-비카보네이트 완충제, pH 9.4) (Perbio, UK)중에 10㎍/ml의 두 항원의 맥시소프 이뮤노TM 튜브 이뮤노튜브 (Maxisorp ImmunoTM Tubes immunotubes: Nunc) 4ml에서 수동적으로 피복된 MP65 및 SAP2에 대한 선택을 수행하였다. 그 후, 이뮤노튜브를 1시간 동안 실온에서 2% 스킴-밀크 분말을 함유하는 PBS (PBSM)로 차단하였다. 총 1ml의 2% PBSM중의 각 dAb 라이브러리로부터의 약 1 x 1011 파아지를 50rpm으로 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 항원 피복된 튜브에서 인큐베이션시켰다. 1회차 선택 동안 0.1% 트윈-20 (Sigma-Aldrich) (PBST)로 보충한 PBS로 10회 세척하고, PBS로 10회 세척 한 후 (2회차 및 3회차 선택에서는 각각 20회 세척), 결합된 파아지를 실온에서 10분 동안 50rpm으로 회전시키면서 0.1mM CaCl2 (Sigma-Aldrich)가 보충된 1mg/ml 트립신 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 500㎕ PBS로 용출시켰다. 용출된 파아지를 함유하는 트립신 용액을 회수하고, 250㎕를 사용하여 37℃에서 30분 동안 대수기 대장균 TG1 세포 1.75ml로 감염시키는데 사용하였다. 라이브러리 플레이팅 및 대수 계대희석 (파아지 역가에 있어서)을 15㎍/ml 테트라시클린 (Sigma-Aldrich)로 보충한 2xTYE-아가 플에이트 (1 리터 물중의 15g 박토-아가, 8g NaCl, 10g 트립톤, 5g 효모 추출물)에서 수행하였다. 후속 회차의 선택에 있어서는, 20% 글리세롤 (Sigma-Aldrich)이 보충된 2ml 2xTY (1리터 물중의 16g 트립톤, 10g 효모 추출물 및 5g NaCl) 배지로 스크랩핑함으로써 성장 플레이트로부터 세포를 회수하고, 이중 50㎕를 파아지 증폭을 위해 37℃에서 2xTYE-Tet 50ml로 접종시키는데 사용하였다.
목적하는 수의 선택 회차 후 (전형적으로 2회 내지 3회차), 목적하는 선택 수득물로부터 20㎍의 정제된 (QIAgen Midiprep) dAb 파아지 DNA를 NEB3 완충제 (1㎍/ml BSA, 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, pH7.9, 25℃)중의 SalI 및 NotI (NEB) 제한 효소로 분해함으로써 풍부 dAb 유전자를 회수하였다. 절제된 dAb 유전자를 TBE (Sigma-Aldrich )(44.5mM Tris-보레이트 및 1mM EDTA, pH 8.3)중의 1% 아가로스 (Sigma-Aldrich) 겔상에서 150V에서 1시간 동안 전기영동시켰다. 전기영동 후, dAb 유전자를 절제시키고, QIAgen 겔 정제 키트 (QIAgen)를 사용하여 정제하였다. 그 후, 정제되고 분해된 dAb 유전자 100 나노그램을 결찰 완충제 (50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM ATP, 10mM 디티오트레이톨, 25㎍/ml BSA, pH7.5, 25℃)중에서 T4 DNA 리가아제 (New England Biolabs)를 사용하여 400ng의 SalI/NotI 분해된 가용성 발현 벡터와 실온하에 1시간 동안 결찰시켰다. 3 마이크로리터의 결찰 생성물을 사용하여 50㎕의 전기반응성 대장균 HB2151 (200Ω, 25μFd, 2.5kV, 0.2cm 캡 큐벳)을 형질전환시키고, 목적하는 양의 형질전환된 세포를 5% 글루코오스 및 50㎍/ml 카르베니실린 (Sigma-Aldrich)으로 보충된 아가 플레이트상에 플레이팅시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
ELISA에 의한 특이적 dAb 결합제 스크리닝
신선한 대장균 HB2151 클론을 ELISA에 의해 MP65 및 SAP2 결합 dAb에 대해 검정하였다. 개별적 클론을 96-웰 미세적정 플레이트 (Corning)에서 50㎍/ml 카르베니실린, 0.1% 글루코오스를 함유하는 200㎕의 2xTY중에서 37℃하에 6시간 동안 250rpm으로 쉐이킹하면서 성장시키고, IPTG로 최종 농도 1mM이 되게 하고, 밤새 30 ℃/250rpm에서 연속하여 인큐베이션시켜 가용성 dAb를 발현시켰다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 870xg에서 원심분리하고, 상청액을 하기와 같이 ELISA에 의해 검정하였다 (특별히 언급되지 않는 한, 모든 부피는 50㎕/웰임). 96 웰 ELISA 플레이트 (Nunc Maxisorp)를 BupH 카보네이트-비카보네이트 완충제중의 1㎍/ml MP65 또는 SAP2로 4℃에서 밤새 코팅시킨 후, PBST중에 침지시켜 3회 세척하였다. 그 후, 플레이트를 2% (v/v) 트윈-20이 보충된 200㎕/웰 PBS로 실온에서 1시간 동안 차단한 후, PBST로 3회 세척하였다. 그 후, 밤새 배양물로부터 25 마이크로리터의 상청액을 PBST중에 1:1로 희석하고, 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. PBST로 3회 세척한 후, 결합된 SAP2 특이적 dAb를 PBST중의 단백질-A 양고추냉이 퍼옥시다아제 컨쥬게이트와의 1:2000 희석비로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. MP65에 대해 선택된 dAb는 PBST중의 마우스 9E10 항체 (항-myc, Sigma-Aldrich, Cat No M5546)를 1:2000 희석비로 사용하여 1시간 동안 실온에서 검출하고, PBST로 3회 세척하고, 1:2000의 희석비로 PBST중의 항-마우스 Fc-특이적 양고추냉이 퍼옥시다아제 컨쥬게이트 (Sigma-Aldrich, Cat No A0168)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 적합한 검출 리간드와 인큐베이션시킨 후, 양 SAP2 및 MP65 분석물을 PBST로 3회 세척하고, PBS로 3회 세척하였다. 그 후, 50㎕/웰의 TMB 기질 (SureBlue, KPL, MD. USA)을 첨가함으로써 모든 플레이트를 발달시켰다. 대조군 웰과 비교하여 충분한 신호가 나타날 때까지 반응이 수분에 걸쳐 진행되게 한 후, 100㎕/웰 1M HCl을 첨가하여 반응을 중단하였다. 빅토르2 미세적정 플레이트 리더 (Perkin Elmer)에서 흡광도는 450nm이다.
dAb 단백질의 발현 및 정제
각각 가용성 dAb ELISA 파지티브 클론에 상응하는 개별적인 신선한 클론을 50㎍/ml 카르베니실린 및 5% 글루코오스가 보충된 2xTY 5ml에 접종시키고, 250rpm으로 쉐이킹하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이 배양물 5밀리리터를 사용하여 신선한 사전가온된 배지 (50㎍/ml 카르베니실린 및 0.1% 글루코오스가 보충된2xTY) 500ml를 접종시키고, IPTG를 최종 농도 1mM이 되게 첨가하여 배양이 유도되는 경우 OD600이 0.8이 될 때까지 250rpm으로 쉐이킹하면서 30℃에서 인큐베이션시키고, 밤새 30℃에서 250rpm으로 쉐이킹하면서 인큐베이션시켰다. 그 후, 세포를 10분 동안 3450xg로 원심분리하여 펠렛화시키고, 생성된 정화된 상청액을 0.45㎛ 멸균 필터를 통해 여과시켰다. 그 후, 50 밀리리터의 이러한 상청액을 VL dAb에 있어서는 단백질-L-세파로오스 (Sigma-Aldrich) 또는 VH dAb에 있어서는 단백질-A 스트림라인 (Amersham Pharmacia) 200㎕와 실온에서 1시간 동안 50rpm으로 회전시켜 혼합하였다. 수지를 220xg에서 1분 동안 원심분리하여 회수한 후, PBS중에 1ml의 0.5M NaCl로 2회 및 96 웰 페이퍼-필터 플레이트 (Whatman)에서 1ml의 PBS로 2회 세척한 후, dAb를 210㎕의 0.1M 글리신 (pH2.0)으로 용출시키고, 40㎕의 1M Tris-HCl (pH8.0)을 첨가하여 중화시켰다. dAb의 순도를 MES 완충제 (Novex gel system, Invitrogen) 중에서 진행하는 12% NuPAGE Bis-Tris 겔을 사용하여 환원 조건하에 수행된 SDS-PAGE에 의해 측정하였다. 겔을 코사시에 블루 (Coomassie blue: Simply Blue Safestain, Invitrogen)으로 염색하였다. dAb 샘플 농도를 280nm 흡광도에서 측정하였다.
내피세포 또는 플라스틱으로의 부착 검정
진균 세포를 YPD 아가 슬랜트 (2.0% wt/vol 글루코오스, 1.0% wt/vol 효모 추출물, 2.0 wt/vol 박토 펩톤 (Difco, Detroit, Mich))에서 28℃에서 성장시켰다. 이러한 유기체의 싱글렛 현탁물을 로트론센의 공정을 변형시켜 제조하였다 (Rotronsen, D., et al. 1986. Rev Infect Dis,; 8:73-85). 간단하게는, 세포를 YBD 브로쓰 (pH 5.0) (0.2% wt/vol 효모 추출물, 2.0% wt/vol BSA 및 2.0% wt/vol 덱스트로스 (Difco, Detroit, Mich))중 회전 드럼에서 24시간 동안 28℃하에 성장시켰다. 원심분리에 의해 수집한 후, C. 알비칸스 세포를 생리 용액 (0.85% NaCl)으로 3회 세척하였다. 아생포자를 토마 카메라 (Thoma camera)로 계수하고, 칼슘 및 마그네슘 (Hyclone, Logan, Utah)로 행크 평형염중에 목적으로 농도 (108 세포/ml)로 조절하였다.
인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 재프 등의 방법을 변형시켜 준비하였다 (Jaffe, et al., 1989. J.Immunol. 15; 143:3961-6). 간단하게는, 제대 정맥으로부터 0.5 mg/ml 콜라게나아제 H 분해에 의해 HUVEC를 수득하였다 (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany). 세포를 50% 미디엄-199 (Medium-199) 즉, 20% 소태 혈청 (Hyclone, Logan, Utah), 50ng/ml 헤파린 (Sigma) 및 50㎍/ml ECGF (Becton Dickinson)이 보충된 50% D-미니멈 이센셜 미디엄 (D-Minimum Essential Medium) (EuroClone, Yorkshire, United Kingdom)에서 일정하게 성장시켰다.
캔디다균 부착 연구에 있어서, 세포를 0.5% 박토 젤라틴 (Difco, Detroit, Mich)이 피복된 12-웰 조직 배양 플레이트 (Corning Incorporated, Corning, NY, USA)에서 컨플루언시하게 성장시켰다. 모든 인큐베이션은 95% 공기, 5% CO2 대기하에 37℃에서 습하게 하였다.
플라스틱으로의 부착에 있어서, 상기와 같이 성장한 진균 세포를 물로 2회 세척하고, 변형된 리 또는 M199 액체 배지에서 1.5 x 103 세포/ml로 현탁시켰다. 1.5 x 103 세포를 6-웰 폴리스티렌 플레이트에서 37℃하에 3시간 동안 인큐베이션시켰다 (Corning Incorporated, Corning, NY). 광범위하게 세척한 후, 1ml의 사보우라우드 덱스트로스 아가를 각각의 웰에 붓고, 고형화시켰다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 콜론을 계수하고, 결과는 접종물의 %로서 나타내었다. 사보우라우드 덱스트로스 아가 플레이트에서 직접적으로 배양물의 분취물을 플레이팅시킴으로써 각 세포 현탁물의 접종 크기를 확인하였다.
ELISA
결합을 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 측정하였다. 간단하게는, 폴리스티렌 미세적정 플레이트 (Dynatech, PBI, Milan, Italy)를 100㎕의 0.05M 탄산나트륨 (pH9.6)중에 용해된 200ng의 항원으로 4℃에서 밤새 피복시켰다. 소태 혈청 알부민-포스페이트-완충염 (PBS) 차단 용액중에 세척한 후, 면역화된 동물로부터의 복수의 PBS-0.05% 트윈 20중의 2배 희석물 100㎕를 희석시키고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
비면역화된 마우스로부터의 풀링된 혈청 (1:2로 희석)을 네거티브 대조군으로 사용하였다. 400㎕의 PBS-트윈 20으로 3회 세척 후, 이차 항체로 사용된 항-마 우스 다가 알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이트 (Sigma)의 PBS중의 1:1,000 희석물을 1시간동안 37℃에서 웰에 첨가하고, 반응을 기질로서 니트로페닐 포스페이트 디소듐 (Sigma)을 사용하여 발생시켰다. 역가는 네거티브 대조군의 시도(示度)중 2회 이상 최적의 시도를 제공하는 마우스 혈청의 가장 높은 희석물로서 규정한다. 면역블롯팅에 있어서, IPTG-유도된 M15 (pUHA1, pDS56/RBSH6xhis-ca) 세포로부터의 정제된 재조합 단백질을 ㎕당 약 1㎍의 단백질로 샘플 완충액중에 재현탁시키고, 10분 동안 끓이고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE (5 내지 15% 폴리아크릴아미드 구배))으로 처리하였다. 전기영동시킨 물질을 25mM Tris, 192mM 글리신, 0.1% SDS 및 20% 메탄올을 함유하는 완충액중에 니트로셀룰로오스 필터상으로 전기블롯팅시켰다. 필터를 단일 실험에 상세히 설명된 바와 같이 복수와 함께 인큐베이션시켰다. 모든 경우에, 복수의 니트로셀룰로오스로의 비특이적 결합은 필터를 인산염-완충된 염수 (PBS)중의 1% 소태혈청 알부민과 2시간 동안 실온에서 차단함으로써 예방하였다. PBS-트윈 20으로 광범위하게 세척한 후, 결합된 항체를 이차 항체로서 사용된 항-마우스 다가 알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이크 (Sigma)의 PBS중의 1:1000 희석으로 검출하였다.
프로테이나아제 효소 검정
본 검정은 로스 (Ross) 등에 의해 기술된 바와 같이 본질적으로 천연의 고도로 정제된 SAP2 제조물에 의한 소태 혈청 알부민 분해에 기초한다. 간단하게는, 각각의 검정물은 50mM 나트륨 시트레이트 pH3.2 및 0.15 효소 용액 (100ug/ml)중에 0.6ml의 1% (w/v) BSA (Sigma Chem. Co., Detroit, MI)를 함유하였다. 37℃에서 30분 후, 0.4ml의 10% (w/v) 트리클로로아세트산을 첨가하였다. 튜브를 30분 동안 얼음에서 보관한 후, 10분 동안 원심분리하였다 (1600xg). 상청액의 흡광도는 280nm였다. 대조군은 효소 비함유 시트레이트 완충물중의 1% BSA이다. 효소 1 유닛을 분당 1의 델타 OD로 촉매하였다. 본 발명자들의 정제된 SAP2 제조물로의 검정은 1㎍의 검출 한도 및 0.1-0.4의 델타 OD 범위에 걸친 효소 농도에 비례하였다.
래트의 질 감염
난소적출된 암컷 위스타르 래트 (80-100g, Charles River Breeding Laboratories, Calco, Italy)를 본 연구 전반에 사용하였다. 모든 래트를 에스트라디올 벤조에이트의 주입에 의해 거짓 발정 상태로 유지시켰다 (Amsa Farmaceutici srl, Rome, Italy). 처음 에스트라디올 투약 후 6일에, 동물에 0.1ml의 염수중의 107 효모 세포를 질내 접종시켰다. 각각의 동물로부터 취재된 10㎕의 샘플 (위생용 플라스틱 루프, Disponoic, PBI, Milan, Italy)을 종래에 기술된 바와 같이 클로르암페니콜 (50㎍/ml)을 함유하는 사보우라우드 아가 플레이트상에서 배양함으로써 질분비물중의 세포수를 계수하였다 (De Bernardis, et al. 1999. J Infect Dis. 179:201-8). 1 CFU 이상이 질 세척물중에 검출되는 경우, 즉 103 CFU/ml 이상인 경우, 래트를 감염된 것으로 간주하였다. 또한, 다른 질 샘플을 현미경 실험을 위해 과요오드산-쉬프-반 기에손 방법 (periodic acid-Schiff-van Gieson method)에 의해 염색하였다.
실시예 2: 결과
1. dAb 생성, 스크리닝 및 특징화
파아지 전시에 의한 dAb 선택 전에 재폴링된 재조합 C. 알비칸스 단백질의 작용성에 대해 시험하였다. SAP2를 프로테이나아제 효소 검정법으로 시험하였으며, 이는 올바르게 폴딩된 구조를 나타내는 우수한 작용성을 보여주었다. MP65를 SAP2에서와 동일한 방법을 이용하여 재폴딩시키고, 다만 작용성은 로버스트 검정의 결여로 인해 시험하지 않았다. 1 x 1010 독특한 dAb 보다 큰 혼합된 크기를 갖는 4개의 파아지 라이브러리를 사용하여 각각의 선택 순회차에 사용된 1 x 1011 이상의 개별 파아지를 선택하였다 (라이브러리 다양성의 10배 이상의 과잉대표성을 나타냄). 3회차 선택 후, 파아지 생산 역가가 5 log 초가로 증가되었다. 두 MP65 특이적 및 SAP2 특이적 dAb를, ELISA에 의해 수동적으로 흡착된 항원에 결합하기 위해 발현된 dAb를 함유하는 박테리아 배양 상청액을 스크리닝함으로써 3회차 선택 수득물로부터 분리하였다. 10개의 독특한 MP65 특이적 결합제 (3 VH 및 7 VK) 및 27개의 독특한 SAP2 특이적 결합제 (22 VH 및 5 VK)를 확인하였다. 각각의 항원에 대한 각 dAb의 억제 활성을 측정하기 위해, 수 밀리그램의 정제된 dAb를 스크리닝을 위한 각 독특한 파지티브 클론으로 생성하였다.
2. dAb 결합 및 작용성
면역효소법 (상기 참조)에 의한 적합한 스크리닝 후 SAP2 또는 MP65에 대해 선택된 VH 및 Vk 서브라이브러리를 포함하는 두개의 상이한 파아지 발현 라이브러리로부터의 클론을 추가적으로 작용적으로 스크리닝하였다. SAP2의 경우, 천연 단 백질 제조물의 효소 활성을 억제하는 dAb 능력을 평가하고, MP65에 있어서는, 각각의 dAb 결합제를 플라스틱으로의 캔디다 부착 억제에 대해 시험하였다. 이들 일차 검정의 말기에, 제한된 수의 각각의 dAb 패밀리를 재조합 단백질로의 이들의 강한 결합과 부착 및 효소 활성의 기능적 억제 능력에 기초하여 선택하였다. 그러나, 모든 dAb가 두 결합 및 작용 검정에서 작용할 것이라는 것이 예견되었다.
예를 들어, 표 2는 아스파르트산 프로테아제 펩스타틴 A의 원형 억제제와 비교하여 산성 조건하에 BSA 분해를 억제하는 각각의 선택된 단일 SAP2 결합제의 능력을 보여준다.
표 2
Figure 112007074617512-PCT00002
가장 강한 펩스타틴-관련 dAb ADR4-13 및 ADR4-6을 선택하고, 추가의 연구를 위해 정제하였다. MP65 결합제의 경우, dAb ADR3-1, ADR3-2 및 ADR3-6을 플라스틱으로의 부착 억제 능력에 기초하여 선택하였다.
3. 래트 질염 모델에서 dAb 활성
상기 기술된 바와 같이 선택된 dAb를 전염성 질병원성 캔디다 균주에 의해 자극된 래트 질강으로부터 진균 제거를 가속화시키는 이들의 능력에 대해 분석하였다. 대조군은 무관한 dAb을 사용하고, 네거티브 군으로서 항-에놀라아제 항체를 사용하고, 파지티브 군으로서는 항진균제 플루코나졸 및 펩스타틴 A (원형 Sap 억제제)을 사용하였다.
결과 해석은 두개의 주요 기준에 기초한다: 1. 초기 처리 동안 즉, 질내 자극으로부터 3-6일동안 가속화된 제거; 2. 자극 후 21일에 감염의 치료 (< 1 CFU/질 분비물 ul). 모수적 (스튜던트 t 시험) 및 비모수적 (만-위트니 U 시험) 통계치에 의해 차이를 평가하였다. 두 유형의 실험을 수행하였는데 (3회 반복), 하나는 예방적 유형이며, 다른 하나는 치료적 유형이다. 이전 실험에서, 단일 dAb (단백질로서 20ug) 투여를 질내 캔디다 자극 전 30분에 질내 제공하고, 후에 동일한 양의 dAb를 자극 후 1, 24 및 48시간에 제공하였다.
4. dAb 예방 활성
항-MP65 dAb (ADR3-2) 또는 항-SAP2 dAb (ADR4-6) (도 1)로 사전 처리하거나, 플루코나졸 또는 펩스타틴으로 처리한 초기 실험에서, 양 dAb는 항균제 및 펩스타틴의 동력과 실질적으로 동일한 동력으로 질로부터의 캔디다 제거를 가속화시 키는 것으로 나타났다 (도 1). 모든 처리는 21일째에 감염을 해소시키는 것으로 보여졌으나, 모든 대조군 (비처리된) 래트는 28일째에도 여전히 감염된 상태였다. 후속 실험은 각각의 단일 dAb의 활성을 분석적으로 시험하고, dAb가 치료학적 활성 즉, 자극 후 제공되는 경우 치료학적 활성을 나타내는지를 평가하기 위한 것이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 두 항-SAP2 dAb (ADR4-6 또는 ADR4-13)는 진균의 더욱 신속한 초기 제거 및 감염의 예상보다 빠른 제거 (12일)에 의해 예증되는 바와 같이, 대조군 즉, 비처리된 또는 무관한 dAb 처리된 래트와 비교하여 진균 자극에 대한 높은 예방적 보호를 제공한다. 두 dAb를 비교할 경우, 이들 사이에는 통계학적 유의차가 없다. 예를 들어, 도 2에 예시된 실험에서, 14일째에 두 dAb가 제공된 동물에서 질 캔디다 CFU간의 경계의 통계학적 유의차 (P = 0.048; 스튜던트 t 시험)가 존재하였으나, 추가적인 실험에서는 나타나지 않았다.
3개의 선택된 항-MP65 dAb는 또한, 래트 질염 모델에서 현저하게 활성적이었으며, 일반적으로 유사한 행동 및 질로부터의 진균 제거를 가속화시키는 능력을 갖는다. dAb ADR3-2로 사전처리된 래트가 21일째에 감염되었지만, 후속 관찰시 (28일) 이들은 다른 두개의 항-MP65 dAb로 사전처리된 모든 다른 래트와 유사하게 회복되었다 (도 3).
또한, dAb 작용 (SAP2 활성 억제)의 추정 메카니즘으로부터 예상되는 바와 같이, 두 ADR4-6 및 ADR4-13은 플루코나졸-내성 캔디다 균주 AIDS 68에 의해 초래된 감염에 대해 매우 유효하였으며, 진균 제거의 강한 가속화 및 감염의 조기 치료 효과를 갖는다 (도 4).
dAb 치료학적 활성
캔디다 자극 후 투여되는 경우의 dAb의 치료 능력을 평가하기 위해 추가의 실험을 수행하였다. 따라서, 각각의 dAb를 감염 후 1, 24 및 48시간에 투여하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 이러한 치료는 또한, 비처리된 또는 무관한 dAb 처리된 래트와 비교하여 질로부터의 진균 제거의 가속화를 제공한다. 어떤 dAb가 사용되던지 상응하는 dAb 사전처리에 의해 달성된 것보다 제거 속도가 열등한 것으로 보여지나, 대조군 보다 먼저 단지 28일에 감염의 완전한 치유가 달성되었다. 이러한 치료학적 방법에서, 항-SAP2와 항-MP65 dAb간에 통계학적 유의차는 관찰되지 않았으나, 플루코나졸은 시험된 모든 시도에서 질 CFU 수치를 감소하는데 현저하게 더욱 활성적이었다. 또한, 항-SAP2와 항-MP65의 혼합물로의 처리는 뚜렷한 이점이 없었다. 그럼에도 불구하고, 모든 처리된 래트는 28일에 감염이 치료되었다.
캔디다 감염의 전신 제어
C. 알비칸의 전신성 감염을 제어하는 항-SAP2 및 항-MP65 dAb의 능력을 표준 방법을 사용하여 평가하였다.
간단하게는, 미정맥을 통해 마우스당 1 X 106 세포 (0.2ml 염수)를 주입하여 마우스를 C. 알비칸으로 감염시켰다. 항-SAP2 또는 항-MP65 dAb를 종래 기재된 바와 같이 투여하였다. 대조군 동물과 비교하여 생존율을 측정하였다.
또한, 가능한 감염전에 유효량을 투여함으로써 약한 피검체에서 dAb를 사용하여 진균 감염에 대한 수동적인 보호성을 제공하는데 사용될 수 있음이 추정된다. 유효량은 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
마우스에 1mg/kg 또는 2.5mg/kg의 항-SAP2 또는 항-MP65 dAb를 투여한 후, 미정맥을 통해 마우스당 1 X 106 세포 (0.2ml 염수중)를 주입하여 C. 알비칸을 투여하였다. 대조군과 비교하여 진균 감염율 및 생존율을 측정하였다. 두 항-SAP2 및 MP65 dAb가 대조군과 비교하여 진균 감염에 대해 마우스를 보호함이 관찰되었다.
실시예 3 이종이량체 작제:
dAb ADR3-6 및 ADR4-6을 엔코딩하는 DNA를 양 방향으로 발현 벡터 pDOM5D-5U로 연속적으로 클로닝시켜 두개의 별도의 작제물 (ADR3-6/ADR4-6 및 ADR4-6/ADR3-6)을 생성시켰다. 이러한 벡터는 pDOM5를 기재로 하며 (파아지 발현 코딩 없는 단량체 생성을 위해 실시예에 기술된 pDOM4와 같음), dAb 클로닝 부위 사이에 놓인 링커를 함유하였다.
단백질 발현:
단백질-A를 사용하여 단량체 dAb에 대해 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 단백질 정제를 코마시에 염색으로 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.
생체내 검정:
그룹당 5마리의 난소적출된 암컷 위스타르 래트 (80-100g, 찰스 리버 브리딩 라보라토리스, Calco, Italy)를 사용하였다. 동물의 간수 및 전반적인 보살핌은 다른 문헌에 기술된 바와 같다 (De Bernardis, F., et al. J.Infect.Dis. 161, 1276-1283 (1990)). 모든 래트에 매 2일마다 50mg의 에스트라디올 벤조에이트 (Amsa Farmaceutici srl, Rome, Italy)를 피하내 주입하여 모든 래트가 가짜 발정 상태가 되게 하였다. 첫번재 에스트라디올 투여 후 6일에, 래트에 0.1ml 염수 용액중의 107 캔디다 알비칸 세포 (균주 SA-40)로 질내 자극 전 30분에 각각의 이량체 분자 20㎍ (0.1ml 염수중)을 모든 래트에 질내 투여하였다. 질 분비물중의 세포수를, 각각의 동물에서 취해진 10㎕의 샘플 (위생용 플라스틱 루프, Disponoic, PBI, Milan, Italy)을 클로르암페니콜 (50㎍/ml)을 함유하는 사보우라우드 아가 플레이트상에서 배양함으로써 계수하였다. 래트는 질 세척물중에 1 CFU 이상 즉, > 103 CFU/ml가 검출되는 경우 감염된 것으로 간주하였다.
결과
두 이종이량체는 캔디다 제거를 가속화시킬 수 있다 (도 6). 이종이량체 ADR3-6/ADR4-6은 ~10일까지 검출가능한 한계 미만으로 감염을 제거하였다. 이종이량체 ADR4-6/ADR3-6은 15일까지 감염을 제거하였다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 상기 문헌에 인용된 참조는 본원에 참조로서 인용되었다. 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구체예와 관련하여 기술되어 있지만, 청구되는 발명은 이러한 특정 구체예로 과도하게 제한되지 안항야 함이 이해될 것이다. 실제로, 당해 분야 및 관련 분야의 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형이 하기 청구 범위내에 속한다.
실시예 4 페길화된 모노특이적 및 이종이량체 dAb 포맷의 생성
최종 dAb 프레임워크 4 아미노산 (전형적으로, VH dAb에 있어서는 세린 및 VK dAb에 있어서는 아르기닌)을 엔코딩하는 코돈을 시스테인 (... TGC... 코돈)으로 변화시키기 위해, 발현 벡터 pDOM5에 클로닝된 개별 dAb를 엔코딩하는 DNA 서열을 PCR로 변형시켰다. 두개의 정지 코돈 (...TAATAA...)은 TGC 코돈의 옆 3'에 포함되었다. 유사한 방법을 이용하여 이종이량체 작제물의 3' dAb로 시스테인을 유입시켰다.
단백질 발현:
변이된 단량체 작제물의 발현 및 정제는 VH 클론에 있어서는 단백질-A 및 VK 클론에 있어서는 단백질-L을 사용하여 단량체 dAb에 대해 기술된 것과 같이 수행하였다. 변이된 이량체 작제물의 발현 및 정제는 단백질-A를 사용하여 단백질 dAb에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다. 두 변이된 단량체 및 이량체 작제물에 있어서, 단백질 순도는 코마시에 염색으로 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
페길화:
두 단량체 형태 및 이량체 형태의 dAb를 표준 말레이미드 링커 화학요법으로 페길화시켰다. PEG를 천연의 또는 dAb에 결합된 시스테인 또는 리신에 결합시켰다. 시스테인 또는 리신이 첨가되는 경우, dAb의 프레임워크내에 또는 dAb의 N 또는 C 말단에 첨가된다.
페길화되면, dAb를 정제하고, 표준 SEC 정제 기법을 이용하여 사용전에 분리하였다.
결과:
단량체 및 이량체 작제물의 페길화된 버젼을, 상기 기술된 뮤린 전신 모델과 유사한 프로토콜을 사용하여 Balb/c 마우스에서 전신 C. 알비칸 감염의 제어 효율에 대해 평가하였다. 1mg/kg의 페길화된 dAb 단백질 또는 플루코나졸을 8마리 군에 감염 후 2h, 6h 및 24h에 투여하였다. 이중의 특이적 이종이량체 작제물 ADR4-6/ADR3-6-PEG가 가장 효과적인 활성을 나타내었다. 이 분자는 이의 구성원 단량체 또는 플루코나졸 보다 더욱 효과적이었다.
Figure 112007074617512-PCT00003
SEQUENCE LISTING SEQ ID No. 1 GGGGGATCCATGTTTTTAAAGAATATTTTCATTG SEQ ID No.2 CCTAAGCTTAGGTCAAGGCAGAAATACTGGAAGCAG SEQ ID No. 3 CCCGGATCCCTGTTCATGTTGTTACC SEQ ID No. 4 GGGCTGCAGGTGCTTAGTTAGAGTAA ADR3-1 SEQ ID No. 5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPDYSMTWVRQAPGKGLEWVSLISNSGKTTMYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVNRILQEFDYWGQGTLVTVSS ADR3-2 SEQ ID No. 6 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISAALAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIGRRPDTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR3-3 SEQ ID No. 7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKKLAWYQQKPGKAPKLLIYNASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRRFPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR3-4 SEQ ID No. 8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKQLNWYQQKPGKAPKLLIYKASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMRVLPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR3-5 SEQ ID No. 9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKHLAWYQQKPGKAPKLLIYGASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRRKPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR3-6 SEQ ID No. 10 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKQLNWYQQKPGKAPKLLIYKASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRRFPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR3-7 SEQ ID No. 11 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFPSYSMVWVRQAPGKGLEWVSLISKAGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVNRILQEFDYWGQGTLVTVSS ADR3-8 SEQ ID No. 12 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKHSLQWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVKRRPGTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR3-9 SEQ ID No. 13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIKKQLNWYQQKPGKAPKLLIYKASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQMRVLPITFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR4-2 SEQ ID No. 14 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIFIALKWYQQKPGKAPKLLIYNASVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQQSRKPQTFGQGTKVEIKRAAAEQKLISEED ADR4-3 SEQ ID No. 15 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAQYRMAWVRQAPGKGLEWVSQINAQGTQTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWVGGARYTFDYWGQGTLVTVSS ADR4-4 SEQ ID No. 16 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLDYQMSWVRQAPGKGLEWVSGISRSGNKTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWAGLNRHDFDYWGQGTLVTVSS ADR4-5 SEQ ID No. 17 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDRISSEFMGWVRQAPGKGLEWVSAIYKPNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRARRTESTYQLRYWGQGTLVTVSS ADR4-6 SEQ ID No. 18 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRVSNYDLTWVRQAPGKGLEWVSTISATNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVTWWLLRHNDNLGFWGQGTLVTVSS ADR4-7 SEQ ID No. 19 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSVTYQNMAWVRQAPGKGLEWVSTITVPNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGLGEVLRDGNANVQFWGQGTLVTVSS ADR4-8 SEQ ID No. 20 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSYKVMGWVRQAPGKGLEWVSAINRENGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGFARRGAPHSASVEFWGQGTLVTVSS ADR4-9 SEQ ID No. 21 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVRLSHQVMGWVRQAPGKGLEWVSAIRSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGWRSAKSQMHYWGQGTLVTVSS ADR4-10 SEQ ID No. 22 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVSVSAYTMSWVRQAPGKGLEWVSAILKKNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGRPSVTFGGPGKRYDYHFQYWGQGTLVTVSS ADR4-11 SEQ ID No. 23 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVIFTDQTMGWVRQAPGKGLEWVSAIKTRDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFLRPNASRGSAREAQIHSWGQGTLVTVSS ADR4-12 SEQ ID No. 24 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDTVSSKAMAWVRQAPGKGLEWVSGIFIPNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAKQRAVLSRWGSSTEFGSWGQGTLVTVSS ADR4-13 SEQ ID No. 25 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISYKNMAWVRQAPGKGLEWVSAIKAANGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGSQKKRTYTFDFWGQGTLVTVSS ADR4-14 SEQ ID No. 26 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDLYSMKWVRQAPGKGLEWVSGISANGMITWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWAAFDYRGQGTLVTVSS ADR4-15 SEQ ID No. 27 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAVYTMDWVRQAPGKGLEWVSSIRPMGHQTRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNGEIFDYWGQGTLVTVSS ADR4-16 SEQ ID No. 28 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFREYVMDWVRQAPGKGLEWVSGITGNGVSTRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSESPGMAIFDYWGQGTLVTVSS ADR4-17 SEQ ID No. 29 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRVYMMAWVRQAPGKGLEWVSKISSQGISTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQARLGHQSFDYWGQGTLVTVSS ADR4-18 SEQ ID No. 30 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYSMSWVRQAPGKGLEWVSGILAGGGATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLLLFDYWGQGTLVTVSS ADR4-19 SEQ ID No. 31 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYLMLWVRQAPGKGLEWVSAIGASGSSTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKGMRLKQFDYWGQGTLVTVSS ADR4-20 SEQ ID No. 32 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYLMLWVRQAPGKGLEWVSAIGASGSSTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQARLGHQSFDYWGQGTLVTVSS ADR4-21 SEQ ID No. 33 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGLYSMSWVRQAPGKGLEWVSGILAGGGATSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKGLLLFDYWGQGTLVTVSS ADR4-22 SEQ ID No. 34 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQSYSMMWVRQAPGKGLEWVSRISSRGLETYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRSRFQPRSFDYWGQGTLVTVSS ADR4-23 SEQ ID No. 35 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRMYSMRWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWGAFDYWGQGTLVTVSS

Claims (74)

  1. 캔디다 spp.로부터의 분비성 아스파르트산 프로테아제 (Sap)에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  2. 제 1항에 있어서, Sap2에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  3. 제 2항에 있어서, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35을 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23으로 이루어진 군의 서열을 포함하는, 바람직하게는, 이러한 서열로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb).
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, SEQ ID No 18을 나타내는 ADR4-6 또는 SEQ ID NO 25을 나타내는 ADR4-13의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb).
  5. 제 1항 내지 제 4항중의 어느 한 항에 있어서, dAb가 본원에 정의된 바와 같은 Sap에 5 x 10-1 내지 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  6. 제 1항에 있어서, 100μM 이상 내지 1pM의 해리상수 (Kd)로 Sap에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  7. 제 4항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, Sap2에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  8. 캔디다 spp.로부터의 분비성 아스파르트산 프로테아제 (Sap)에 결합하며, SEQ ID No 18을 나타내는 ADR4-6 또는 SEQ ID No 25을 나타내는 ADR4-13의 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 단일 도메인 항체 (dAb).
  9. 캔디다 spp.로부터의 분비성 아스파르트산 프로테아제 (Sap)의 작용성을 억제하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  10. 제 9항에 있어서, Sap2의 작용성을 억제하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  11. 제 10항에 있어서, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35을 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4- 21, ADR4-22, ADR4-23로 이루어진 군의 서열을 포함하는, 바람직하게는, 이러한 서열로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb).
  12. 제 1항 내지 제 11항중의 어느 한 항에 있어서, SEQ ID No 18을 나타내는 ADR4-6 또는 SEQ ID NO 25을 나타내는 ADR4-13의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb).
  13. 캔디다 spp.로부터의 분비성 아스파르트산 프로테아제 (Sap)의 작용성을 억제하며, SEQ ID No 18을 나타내는 ADR4-6 또는 SEQ ID No 25을 나타내는 ADR4-13의 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 단일 도메인 항체 (dAb).
  14. 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP: mannoprotein adhesin)에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  15. 제 14항에 있어서, MP65에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  16. 제 15항에 있어서, 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID NO 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8, ADR3-9로 이루어진 군의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이러한 서열을 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb).
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, dAb가 5 x 10-1 및 1 x 10-7 s-1의 Koff 속도 상수로 MP에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  18. 제 15항 내지 제 17항중의 어느 한 항에 있어서, 100μM 이상 내지 1pM의 해리상수 (Kd)로 MP에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  19. 제 18항에 있어서, MP65에 결합하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  20. 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP)에 결합하며, 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID NO 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8, ADR3-9로 이루어진 군의 dAb와의 동일성이 80% 이상인 단일 도메인 항체 (dAb).
  21. 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP)의 작용성을 억제하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  22. 제 21항에 있어서, MP65의 작용성을 억제하는 단일 도메인 항체 (dAb).
  23. 제 22항에 있어서, 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID NO 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8, ADR3-9로 이루어진 군의 서열을 포함하는 바람직하게는, 이러한 서열로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb).
  24. 캔디다 spp.로부터의 만노단백질 부착부 (MP)의 작용성을 억제하며, 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID NO 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8, ADR3-9로 이루어진 군의 dAb와의 동일성이 80% 이상인 단일 도메인 항체 (dAb).
  25. 제 1항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 dAb 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 하나 이상의 MP65 및 Sap2 결합 dAb를 포함하는 약제 조성물.
  27. 제 25항에 있어서, MP65의 작용성을 억제하는 하나 이상의 dAb 및 Sap2의 작용성을 억제하는 하나 이상의 dAb를 포함하는 약제 조성물.
  28. 제 1항 내지 제 27항중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 dAb 또는 이의 조 성물을 환자에 투여하는 것을 포함하여, 환자의 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 치료하는 방법.
  29. 캔디다 spp. 감염의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 따른 dAb 또는 제 25항 내지 제 28항중의 어느 한 항에 따른 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 따른 dAb 또는 제 25항 내지 제 28항중의 어느 한 항에 따른 조성물을 환자에 투여하여, 환자의 아졸 내성 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 치료하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 아졸이 트리아졸인 방법.
  32. 제 1항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 따른 dAb 또는 제 25항 내지 제 28항중의 어느 한 항에 따른 조성물을 환자에 투여하여, 환자의 트리아졸 내성 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 치료하는 방법으로서, 캔디다 spp. 감염이 이트라코나졸, 플루코나졸 및 보리코나졸로 이루어진 군의 하나 이상의 제제에 내성을 띠는 방법.
  33. 제 1항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 따른 dAb 또는 제 25항 내지 제 28항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 환자에 투여하여 제 30항에 따른 이미다졸 내성 캔디다 spp. 감염을 치료하는 방법으로서, 캔디다 spp. 감염이 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 술코나졸 및 티오코나졸로 이루어진 군의 하나 이상의 제제에 내성을 띠는 방법.
  34. 제 1항 내지 제 33항중의 어느 한 항에 있어서, 캔디다 spp. 감염이 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 캔디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata), 캔디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 캔디다 크루세이 (Candida krusei), 캔디다 루시타니애 (Candida lusitaniae)로 이루어진 군의 하나 이상에 의해 발생한 dAb, 방법 또는 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, 캔디다 spp. 감염이 캔디다 알비칸스에 의해 발생한 dAb, 방법 또는 조성물.
  36. 제 1항 내지 제 35항중의 어느 한 항에 있어서, 캔디다 spp. 감염이 전신, 점막, 경구, 손톱 및 발톱 아래, 기관지, 폐, 질 (외음질 포함), 식도 및 구인두로 이루어진 군의 위치중 하나 이상에서 발생한 dAb, 방법 또는 조성물.
  37. 제 36항에 있어서, 캔디다 spp. 감염이 전신 또는 점막에서 발생한 dAb 또는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 캔디다 spp. 감염이 전신에서 발생한 dAb 또는 방법.
  39. 제 29항 내지 제 38항중의 어느 한 항에 있어서, dAb가 전신 투여, 국소 투여, 경구 투여, 비내 투여 및 점막 투여로 이루어진 리스트중의 경로에 의해 피검체에 투여되는 방법 또는 dAb.
  40. 제 39항에 있어서, dAb가 경구 투여에 의해 피검체에 투여되는 방법 또는 용도.
  41. 제 40항에 있어서, dAb가 전신 투여에 의해 피검체에 투여되는 방법 또는 용도.
  42. 면역 저하 환자와 관련된 하나 이상의 질환을 예방하고/거나 치료하기 위한 약제의 제조시 제 1항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 따른 dAb 또는 제 25항 내지 제 28항중의 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  43. 제 42항에 있어서, 면역 저하 환자가 HIV 감염,AID 및 효모 감염으로 이루어진 군의 하나 이상의 질환에 걸린 환자인 용도.
  44. 제 42항 또는 제 43항에 있어서, dAb 또는 이의 조성물이 단일 투여량 형태로 환자에 투여되는 용도.
  45. 제 44항에 있어서, dAb 또는 이의 조성물이 단일 투여량 형태로 환자에 투여된 후, 다중 투여량 형태로 투여되는 용도.
  46. 환자의 전신성 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 치료하기 위한 방법으로서,
    (i) Sap 및/또는 MP 단백질에 결합하는 항체,
    (ii) Sap 및/또는 MP 단백질에 결합하는 항체의 단편,
    (iii) Sap 및/또는 MP 단백질에 결합하는 dAb중 하나 이상을 이러한 치료가 필요한 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 환자의 전신성 캔디다 spp.를 예방하고/거나 치료하기 위한 방법으로서,
    (i) Sap 및/또는 MP 단백질의 작용성을 억제하는 항체,
    (ii) Sap 및/또는 MP 단백질의 작용성을 억제하는 항체의 단편,
    (iii) Sap 및/또는 MP 단백질의 작용성을 억제하는 dAb중 하나 이상을 이러한 치료가 필요한 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  48. 제 46항 또는 제 47항에 있어서, dAb가 전신 투여되는 방법.
  49. 제 46항 내지 제 48항중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 비특이적인 방법.
  50. 제 46항 내지 제 49항중의 어느 한 항에 있어서, Sap가 Sap2인 방법.
  51. 제 46항 내지 제 49항중의 어느 한 항에 있어서, MP 단백질이 MP65인 방법.
  52. 제 14항 내지 제 24항중의 어느 한 항에 따른 dAb에 연결된 제 1항 내지 제 13항중의 어느 한 항에 따른 dAb를 포함하는 다량체 dAb를 포함하는 조성물.
  53. 제 52항에 있어서, 다량체 dAb가 이량체인 조성물.
  54. 제 52항 또는 제 53항에 있어서, dAb가 직접적으로 연결된 조성물.
  55. 제 52항 또는 제 53항에 있어서, dAb가 링커에 의해 연결된 조성물.
  56. 제 52항 내지 제 55항중의 어느 한 항에 따른 다량체 dAb 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제 조성물.
  57. 제 1항 내지 제 28항 또는 제 52항 내지 제 55항중의 어느 한 항에 따른 하 나 이상의 dAb 또는 이의 조성물로 의료 기기의 캔디다 spp. 감염을 예방하고/거나 처리하기 위한 방법.
  58. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열을 갖는 dAb.
  59. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는 dAb.
  60. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  61. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4- 19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는 dAb.
  62. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  63. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타 내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  64. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID NO 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 동일하거나 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23의 아미노산 서열 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산 위치 에서 상이한 아미노산 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  65. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열을 갖는 dAb.
  66. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는 dAb.
  67. Sap 또는 MP에 결합하며, 각각 SEQ ID No 14 내지 SEQ ID No 35를 나타내는 ADR4-2, ADR4-3, ADR4-4, ADR4-5, ADR4-6, ADR4-7, ADR4-8, ADR4-9, ADR4-10, ADR4-11, ADR4-12, ADR4-13, ADR4-14, ADR4-15, ADR4-16, ADR4-17, ADR4-18, ADR4-19, ADR4-21, ADR4-22, ADR4-23 또는 각각 SEQ ID No 5 내지 SEQ ID No 13을 나타내는 ADR3-1, ADR3-2, ADR3-3, ADR3-4, ADR3-5, ADR3-6, ADR3-7, ADR3-8 및 ADR3-9의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  68. Sap 또는 MP에 결합하며, DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438), 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438), 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열을 갖는 dAb.
  69. Sap 또는 MP에 결합하며, DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438), 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  70. Sap 또는 MP에 결합하며, DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  71. Sap 또는 MP에 결합하며, DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR1 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR1 서열, DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR2 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR2 서열, 및 DOM16-39 (SEQ ID NO:345), DOM16-39-87 (SEQ ID NO:420), DOM16-39-100 (SEQ ID NO:423), DOM16-39-107 (SEQ ID NO:430), DOM16-39-109 (SEQ ID NO:432), DOM16-39-115 (SEQ ID NO:438) 및 DOM16-39-200 (SEQ ID NO:441)의 CDR3 서열과의 동일성이 50% 이상인 CDR3 서열을 갖는 dAb.
  72. dAb, 약제 조성물 또는 조성물이 선택적으로 반감기 연장부를 포함하는, 제 1항 내지 제 24항, 제 29항 또는 제 58항 내지 제 71항중의 어느 한 항에 따른 dAb, 제25항 내지 제 27항 또는 제 56항중의 어느 한 항에 따른 약제 조성물, 또는 제 52항 내지 제 55항중의 어느 한 항에 따른 조성물.
  73. 제 71항에 있어서, 반감기 연장부가 PEG인 dAb, 약제 조성물 또는 조성물.
  74. 제 71항에 있어서, 반감기 연장부가 혈청 알부민에 결합된 dAb, 약제 조성물 또는 조성물.
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