CN105601751A - 一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组蛋白Vo，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：loop1-(linker？a)n1-loop2-(linker？b)n2-loop3-(linker？b)n3-loop4-(linker？a)n4-loop1-(linker？a)n5-loop2-(linker？b)n6-loop3-(linker？b)n7-loop4。本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。本发明的重组蛋白Vo可用于诊断试剂、预防或治疗性药物的制备，具有良好的抗E.coli？K1感染的免疫保护效果。

Description

一种重组蛋白Vo及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术制药领域，涉及一种重组脑膜炎大肠杆菌K1疫苗蛋白Vo，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
细菌性脑膜炎是新生儿的常见感染性疾病，是新生儿死亡及远期致残的主要原因。世界卫生组织数据显示，新生儿细菌性脑膜炎发生率位于新生儿感染性疾病的前5位，其死亡率高达40％。由于早产儿的增多及其它原因，我国新生儿细菌性脑膜炎发病率逐渐上升，其已成为新生儿住院三大病因之一。随着抗生素耐药性的泛滥，新生儿细菌性脑膜炎的疗效和预后更加不容乐观。资料显示约有1％-40％的新生儿细菌性脑膜炎患者死亡，仅30％的患者能够治愈。患者治愈后通常出现神经系统后遗症，如脑积水、癫痫、智能低下等，为家庭和社会造成严重的负担。
大肠杆菌K1(E.coliK1)是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体，约超过80％病例的由该菌感染所致。外膜蛋白A(outermembraneA，OmpA)是E.coliK1的关键致病因子，在E.coliK1引发的新生儿脑膜炎中发挥重要作用(KimK.S.2008.NatRevMicrobiol6：625-634.)。研究发现，E.coliK1引起新生儿脑膜炎必须通过以下4个病理过程：①E.coliK1感染宿主并定植新生儿肠道或泌尿道；②E.coliK1从感染定植部位入血并在血液中繁殖，引起新生儿菌血症；③E.coliK1突破新生儿血脑屏障，进入中枢神经系统；④E.coliK1在颅内释放促炎因子和毒素，引起白细胞的浸润和血脑屏障通透性增加，最终引发新生儿脑膜炎等感染性疾病。在整个新生儿脑膜炎的发病过程中，E.coliK1能抵抗血液免疫系统的杀伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染是决定细菌感染的关键因素，而外膜蛋白A(outermembraneproteinA，OmpA)在此细菌致病的关键过程中都发挥决定性的作用(KrishnanS.，andN.V.Prasadarao.2012.FEBSJ.)，所以OmpA可以作为脑膜炎大肠杆菌疫苗的重要候选疫苗分子。
OmpA为I型跨膜蛋白，其全长346个氨基酸，主要由2个domain组成，N端1-198氨基酸为典型的beta-barrel的跨膜结构，C端domain为肽聚糖结合结构域。重组表达的全长OmpA蛋白因为含有跨膜结构难溶于水，不能作为疫苗分子。OmpA的N端结构域是其主要功能结构域，其暴露在胞外的loop1，loop2，loop3，loop4是其介导OmpA相关病理生理过程的关键结构域。此外，通过AntiJen，Bepipred和Epitome等表位软件预测发现OmpA的loop1，loop2，loop3，loop4具有很多的B细胞表位和T细胞表位。目前尚没有基于OmpA蛋白制备抗体的报道。
发明内容
针对脑膜炎大肠杆菌的严重危害，本发明提供一种脑膜炎大肠杆菌K1的重组蛋白Vo，该重组蛋白由脑膜炎大肠杆菌K1OmpA的有效成分构成，其可应用于制备脑膜炎大肠杆菌的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种重组蛋白Vo，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：
loop1-(linkera)n1-loop2-(linkerb)n2-loop3-(linkerb)n3-loop4-(linkera)n4-loop1-(linkera)n5-loop2-(linkerb)n6-loop3-(linkerb)n7-loop4；
其中，所述连接肽linkera选自GlySerGlyGlySer，GlyGlySerGlyGly，TyrAlaProValAspVal中的一个，优选为GlySerGlyGlySer；
所述连接肽linkerb选自GlySerGlyGlySerGly，GlyGlySerGlyGly，TyrAlaProValAspVal中的一个，优选为GlySerGlyGlySerGly；
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7各自独立地选自1、2、3或4，优选为1；
优选地，所述loop1的氨基酸序列为SEQIDNO：3；
优选地，所述loop2的氨基酸序列为SEQIDNO：4。
优选地，所述loop3的氨基酸序列为SEQIDNO：5；
优选地，所述loop4的氨基酸序列为SEQIDNO：6。
在根据本发明的一个实施方案中，所述重组蛋白Vo的氨基酸序列为SEQIDNO：2；优选地，编码所述重组蛋白Vo的核苷酸序列为SEQIDNO：1。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码上述重组蛋白Vo的核苷酸序列形成。
在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体；优选为pGex-6P-2。
进一步地，本发明提供了上述重组蛋白Vo的制备方法，所述方法包括：
1)构建如上所述的表达载体；
2)将步骤1)得到的表达载体转化至宿主菌，得到含有表达载体的宿主菌；
3)诱导步骤2)得到的含有表达载体的宿主菌表达重组蛋白Vo；
4)提取并纯化得到重组蛋白Vo。
在根据本发明的一个实施方案中，所述宿主菌选自大肠杆菌XL1-blue、BL21或HMS174菌株中的一种，优选为大肠杆菌XL1-blue菌株。
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue菌株。
进一步地，本发明提供了上述重组蛋白Vo在制备用于诊断、预防或治疗脑膜炎大肠杆菌K1的药物中的应用。
在根据本发明的一个实施方案中，所述药物为用于诊断脑膜炎大肠杆菌K1的试剂盒。
在根据本发明的一个实施方案中，所述药物为用于预防或治疗脑膜炎大肠杆菌K1的亚单位疫苗。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
1)用于表达重组蛋白Vo的表达质粒可在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达。
2)选择pGEX载体系列时，重组蛋白Vo以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的重组蛋白Vo的纯度大于95％。
3)Vo重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫保护效果。
利用本发明的重组蛋白Vo制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组蛋白疫苗具有良好的抗E.coliK1感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
附图说明
图1：重组蛋白Vo的结构组成示意图。A为OmpA分子的结构示意图。B为重组蛋白Vo的结构示意图。
图2为重组质粒pGex-6P-2-Vo的双酶切鉴定结果。其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2&3：重组表达质粒pGEX-6p-2-Vo经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约500bp。
图3为蛋白Vo诱导鉴定结果；其中，泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd；泳道2：结合诱导表达的超声上清的GST填料；泳道3：经PP酶酶切后的上清；泳道4：经PP酶酶切后的GST填料。
图4为纯化后的蛋白VoSDS-PAGE电泳结果；其中，泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd；泳道2：纯化的Vo蛋白。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1基因的合成和亚克隆
1.按照图1的设计思路，设计含有Loop1、Loop2、Loop3、Loop4和蛋白连接子的重组蛋白Vo，编码Vo的DNA的合成和序列与pGEX-6p-2的连接由上海生工生物工程有限公司合成。
2.重组质粒的转化
从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞(上海超研生物科技有限公司)，第一管加入pGEX-6P-2质粒(GEHealthcareLifeSciences)，作阳性对照；第二管加入1ulVo合成质粒；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μlLB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。
各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μl上清，再重悬菌体，取200μl涂布于，Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2.双酶切鉴定
取37℃摇床培养过夜的阳性质粒，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamHI(Takara公司)和Xhol(Takara公司)进行酶切，37℃水浴半小时。体系如下：
灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含EB(上海俊晟生物科技有限公司)0.5ug/ml，将上述酶切反应体系中各加入1μl6×Loadingbuffer，通过凝胶80V电泳20min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约4000bp为表达载体pGEX-6P-2部分，小片段约500bp，为插入的编码Vo的片段(图2)。
实施例2重组融合蛋白Vo在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
1.Vo诱导表达
1)取过夜培养的pGEX-6P-2-Vo/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp+抗性的LB培养基中，180rpm37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。
2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mLlysisbuffer(20mMPB，pH7.2，250mMNacl)混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心15min，分离上清和沉淀。
2.处理上清
取GlutathioneSepharose4B20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入GlutathioneSepharose4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的GlutathioneSepharose4B加入20μL2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。
3.处理沉淀
在沉淀中加入500μLPBS重悬菌体，取80μL重悬菌液加入20μL5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。
4.SDS-PAGE电泳
将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，PGEX-6P-2-Vo/XL-1blue在30℃为可溶性蛋白(图3)。
实施例3Vo抗原的制备
1.放大培养获取蛋白
取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-Vo/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm37℃培养5～6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时，加入80μLIPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加20mLlysisbuffer(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的GlutathioneSepharose4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。
2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取目的蛋白Vo
向余下约800μL已结合蛋白的GlutathioneSepharose4B中加入800μLPBS和120μLPreScissionprotease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μLPBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的Vo蛋白分子量在15-25kDa之间，与预期蛋白分子量大小相符合，见图4。
实施例4大肠杆菌K1感染小鼠模型的构建
1.大肠杆菌K1菌液的制备
取冻存的大肠杆菌K1菌株RS218(ATCC700973)，采用LB营养琼脂平板复苏，37℃需氧培养过夜。挑取单个菌落接种20mLLB液体培养基，37℃需氧180rpm振荡培养15h后，取0.2mL接种于20mLLB液体培养基中，37℃需氧230rpm振荡培养6h。6000g离心收集菌体，生理盐水洗涤两次后用生理盐水重悬浮菌体。采用分光光度计测定菌液的OD600值，并按照1OD＝1.0×109CFU/ml将其换算成细菌浓度。
2.感染剂量的确定
采用生理盐水将实施例1获得的E.coliK1菌液调节至五种不同浓度，将实验动物6～8周德雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每只小鼠通过腹腔注射E.coliK1菌液250μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。动物的分组和感染情况如表1所示。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。
表1：E.coliK1菌感染剂量的确定
组 腹腔注射 剂量(CFU) 数量 浓度(CFU/ml) 注射剂量(μl)
1 E.coli K1 1.0×108 10 4.0×108 250
2 E.coli K1 0.5×108 10 2.0×108 250
3 E.coli K1 1.0×107 10 4.0×107 250
4 E.coli K1 1.0×106 10 4.0×106 250
5 生理盐水 - 10 - 250
采用不同浓度的E.coliK1菌株ATCC700973感染BALB/c小鼠时，经过7天的观察，结果发现：感染量为1.0×106CFU时小鼠死亡率为0，；感染量为1.0×107CFU时小鼠死亡率为20％，感染量为0.5×108CFU时小鼠死亡率为80％，感染量达到1.0×108CFU时小鼠死亡率100％。确定小鼠感染的优选剂量为0.5×108CFU。
实施例5动物的免疫
1)首次免疫，用PBS稀释Vo抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；
2)第二次免疫，第7天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；
3)第三次免疫，第14天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上。
实施例6：抗体的检测
第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2a体液应答水平。
1.制备液体
1)包被液的配制：称取Na2CO31.6g，NaHCO32.9g，溶于1LddH2O，用PH计将pH调至9.6；
2)封闭液的配制：1g牛血清V，溶于100mL抗体稀释液(1∶100)；
3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1LddH2O，再加入500μLTween20，再用PH计将pH调至7.4；
4)洗涤液的制备：同抗体稀释液
5)显色液(TMB)，为天根公司产品；
6)终止液(2MH2SO4)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mLddH2O中。
2.ELISA检测Vo重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
1)用包被液将纯化后的Vo重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；
2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；
3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；
4)将血清进行1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000等倍比稀释；
5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤3遍，空干；
6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1∶5000，制成抗体工作液；
7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱40min，洗涤三遍，空干；
8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；
9)加入终止液(2MH2SO4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
10)结果判断：A样品/A阴性值≥2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1∶1000倍稀释)。
结果：检测Vo蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1∶16000；免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的Vo重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。
实施例8：Vo重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价
Vo末次免疫后10～14天，采用与实施例5相同的方法，用生理盐水将准备E.coliK1菌液并调节浓度至2.0×108CFU/mL，用腹腔注射菌液250μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。
表2Vo重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果
表2显示：阴性对照组和空白对照组的存活率分别为15％和20％，重组融合蛋白Vo加Al(OH)3佐剂组的存活率为80％。因此，本发明的Vo重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对E.coliK1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防E.coliK1的感染。
通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染E.coliK1菌、确定预后等。
本领域技术人员可以将本发明Vo重组蛋白用于其他任何适用的用途。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种重组蛋白Vo，其特征在于，所述重组蛋白Vo由脑膜炎大肠杆菌K1的外膜蛋白A(OmpA)的膜外片段通过连接肽融合而成；所述重组蛋白Vo具有以下通式：
loop1-(linkera)n1-loop2-(linkerb)n2-loop3-(linkerb)n3-loop4-(linkera)n4-loop1-(linkera)n5-loop2-(linkerb)n6-loop3-(linkerb)n7-loop4；
其中，所述连接肽linkera选自GlySerGlyGlySer，GlyGlySerGlyGly，TyrAlaProValAspVal中的一个，优选为GlySerGlyGlySer；
所述连接肽linkerb选自GlySerGlyGlySerGly，GlyGlySerGlyGly，TyrAlaProValAspVal中的一个，优选为GlySerGlyGlySerGly；
n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7各自独立地选自1、2、3或4，优选为1；
优选地，所述loop1的氨基酸序列为SEQIDNO：3；
优选地，所述loop2的氨基酸序列为SEQIDNO：4。
优选地，所述loop3的氨基酸序列为SEQIDNO：5；
优选地，所述loop4的氨基酸序列为SEQIDNO：6。
2.如权利要求1所述的重组蛋白Vo，其特征在于，所述重组蛋白Vo的氨基酸序列为SEQIDNO：2；优选地，编码所述重组蛋白Vo的核苷酸序列为SEQIDNO：1。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码权利要求1～2中任一项所述的重组蛋白Vo的核苷酸序列形成。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述骨架质粒选自pGex系列载体、pET系列载体或pQE系列载体；优选为pGex-6P-2。
5.一种如权利要求1或2所述的重组蛋白Vo的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)构建如权利要求3或4所述的表达载体；
2)将步骤1)得到的表达载体转化至宿主菌，得到含有表达载体的宿主菌；
3)诱导步骤2)得到的含有表达载体的宿主菌表达重组蛋白Vo；
4)提取并纯化得到重组蛋白Vo。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主菌选自大肠杆菌XL1-blue、BL21或HMS174菌株中的一种，优选为大肠杆菌XL1-blue菌株。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue菌株。
8.如权利要求1或2所述的重组蛋白Vo在制备用于诊断、预防或治疗脑膜炎大肠杆菌K1的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为用于诊断脑膜炎大肠杆菌K1的试剂盒。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为用于预防或治疗脑膜炎大肠杆菌K1的亚单位疫苗。
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