RS58190B2 - Antitela koja specifično vezuju staphylococcus aureus alfa toksin i postupci njihove primene - Google Patents

Antitela koja specifično vezuju staphylococcus aureus alfa toksin i postupci njihove primene

Info

Publication number
RS58190B2
RS58190B2 RS20181450A RSP20181450A RS58190B2 RS 58190 B2 RS58190 B2 RS 58190B2 RS 20181450 A RS20181450 A RS 20181450A RS P20181450 A RSP20181450 A RS P20181450A RS 58190 B2 RS58190 B2 RS 58190B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
alpha toxin
seq
antigen
antibodies
Prior art date
Application number
RS20181450A
Other languages
English (en)
Inventor
Bret Sellman
Christine Tkaczyk
Lei Hua
Partha Chowdhury
Reena Varkey
Melissa Damschroder
Li Peng
Vaheh Oganesyan
Jamese Johnson Hilliard
Original Assignee
Medimmune Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46639171&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58190(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Medimmune Llc filed Critical Medimmune Llc
Publication of RS58190B1 publication Critical patent/RS58190B1/sr
Publication of RS58190B2 publication Critical patent/RS58190B2/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Micrococcaceae (F); Staphylococcaceae (F), e.g. Staphylococcus (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/709—Toxin induced
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Description

Opis
Oblast
[0001] Tehnologija se delimično odnosi na antitela, i u nekim otelotvorenjima, na antitela koja se specifično vezuju Staphylococcus aureus alfa toksin.
Pozadina
[0002] Staphylococcus aureus je gram-pozitivna, fakultativno aerobna, cocci bakterija koja formira grumene, koja obično kolonizuje nos i kožu zdravih ljudi. Oko 20-30% stanovništva je kolonizovano od strane S. aureus u svakom trenutku. Staphylococcus aureus bakterije, ponekad se nazivaju i „staph“, „Staph aureus“, ili „S. aureus“, se smatraju oportunističkim patogenima koji uzrokuju manje infekcije (npr., bubuljice, čireve) i sistemske infekcije.
[0003] Mukozalne i epidermalne barijere (koža) obično štite od S. aureus infekcije. Prekidanje ovih prirodnih barijera kao rezultat povreda (npr., opekotine, traume, hirurške procedure i slično) dramatično povećava rizik od infekcije. Bolesti koje kompromituju imuni sistem (npr., dijabetes, završne faze bolesti bubrega, rak i slično) takođe povećavaju rizik od infekcije. Oportunističke S. aureus infekcije mogu postati ozbiljne, uzrokujući različite bolesti ili stanja, neograničavajući primeri uključuju bakteremiju, celulitis, infekcije očnih kapaka, trovanje hranom, zglobne infekcije, kožne infekcije, sindrom krastave kože, sindrom toksičnog šoka, pneumoniju, osteomielitis, endokarditis, meningitis i formiranje apscesa.
[0004] S. aureus takođe može izazvati infekcije i bolesti kod životinja. Na primer, S. aureus često je povezan sa goveđim mastitisom.
[0005] S. aureus eksprimira niz faktora virulencije, uključujući kapsularne polisaharide i proteinske toksine. Jedan faktor virulencije često povezan sa S. aureus infekcijom, koji je glavni citotoksični agens, je alfatoksin (poznat i kao alfa-hemolizin ili Hla), porezni i hemolitički eksoprotein koji proizvodi najpatogeniji soj S. aureus. Toksin formira heptamerne pore u membranama osetljivih ćelija kao što su bele krvne ćelije, trombociti, eritrociti, monociti periferne krvi, makrofagi, keratinociti, fibroblasti i endotelne ćelije.
Formiranje pora alfa toksina često dovodi do disfunkcije ćelije ili lize.
[0006] Ragle B. i dr. (2009) Infecation and Immunity 77(1), 2712-2718 obelodanjuje monoklonska antitela 7b8 i 1A9 usmerena na S. aureus alfa-hemolizin. WO 2009/029831 otkriva identične antibiotike kao Ragle B. i dr. (supra) i dalje objašnjava da se antitela mogu koristiti u kombinovanim terapijama sa npr. antibioticima.
Kratak sažetak obelodanjenja
[0007] U izvesnim otelotvorenjima, pruženo je prečišćeno ili izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, gde se antitelo ili fragment imunospecifično vezuju za Staphylococcus aureus alfa toksin polipeptid. Izrazi „alfa toksin polipeptid“, „alfa toksin monomer“ i „oligomeri alfa toksina (npr., heptamer)“ se ovde nazivaju „AT“, „AT monomer“ i „AT oligomer“. Izraz „varijabilni teški lanac“ se naziva „VH“. Izraz „varijabilni lak lanac“ se naziva „VL“.
[0008] Predmetni pronalazak pruža izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, imunospecifično se vezuje za polipeptid Staphylococcus aureus alfa toksin, i uključuje:
(a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: ili 69;
(b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70;
(c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71;
(d) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1;
(e) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ,; i
(f) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68.
[0009] U nekim otelotvorenjima izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 57 i varijabilnim domenom lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58,.
[0010] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža VH i VL od antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta koji odgovaraju aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 57 i 58.
[0011] U nekim otelotvorenjima izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine:
(a) konstanta afiniteta (KD) za alfa toksin od oko 13 nM ili manje;
(b) vezivanje za monomere alfa toksina, ali ne inhibira vezivanje alfa toksina na alfa toksin receptor; (c) inhibira formiranje oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%; (d) smanjenje citolitičke aktivnost alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% (npr., kao što je utvrđeno pomoću testova ćelijske lize, dodavanja hemolize);
(e) smanjuje infiltraciju ćelija i proupalno oslobađanje citokina (npr., u životinjskom modelu upale pluća).
[0012] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža sastav koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment opisan gore.
[0013] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža sastav koja sadrži dodatni agens, gde je dodatni agens antibiotik. U nekim otelotvorenjima antibiotik je vankomicin.
[0014] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža komplet, koji sadrži:
(a) antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 ili sastav prema patentnom zahtevu 5 ili 6;
(b) instrukcije za upotrebu sastava ili uputstva za dobijanje instrukcija za upotrebu sastava.
[0015] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment ili sastav opisan gore za sprečavanje, tretman ili upravljanje upalom pluća kod pacijenta.
[0016] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment, ili sastav kao što je prethodno opisano, za sprečavanje, tretman ili upravljanje kožnom infekcijom kod pacijenta. U nekim otelotvorenjima stanje kožne infekcije je dermonekroza.
[0017] U nekim otelotvorenjima predmetni pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment ili sastav koji je opisan gore za sprečavanje, tretman ili upravljanje upalom pluća ili stanjem kožne infekcije kod pacijenta inhibiranjem formiranja Staphylococcus aureus oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%.
[0018] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je opisano iznad, koji se imunospecifično vezuje za fragment Staphylococcus aureus alfa toksina od SEQ ID NO: 39.
[0019] U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je opisano iznad, koji se imunospecifično vezuje za fragment Staphylococcus aureus alfa toksina koji sadrži aminokiseline 261-272 od SEQ ID NO: 39 i/ili aminokiseline 173-201 SEQ ID NO: 39.
U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je opisano iznad, koji se imunospecifično vezuje za fragment Staphylococcus aureus alfa toksina koji sadrži aminokiseline 261-272 od SEQ ID NO: 39 i aminokiseline 173-201 SEQ ID NO: 39
U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je opisano iznad, koji sprečava formiranje heptamera alfa toksina, i gde je navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment u dodiru sa ostacima na položajima T261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 i R200 od SEQ ID NO: 39.
U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je opisano iznad, za sprečavanje, tretman ili upravljanje upalom pluća ili stanjem kožne infekcije kod pacijenta inhibiranjem formiranja oligomera alfa toksina.
U nekim otelotvorenjima ovaj pronalazak pruža antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao što je opisano iznad, koje sadrži varijantu Fc regiona, gde izolovano antitelo sadrži sledeće sekvence
[0020] Ovde obelodanjeni postupci za sprečavanje, tretman ili upravljanje S. aureus infekcijom mogu biti povezani sa tretmanom na dijalizi, operacijom visokog rizika, upalom pluća, ventilatorsk-povezanom upalom pluća (VAP) ili ponovnom infekcijom nakon prethodnog puštanja iz bolnice, usled prethodnog lečenja ili operacije koja obuhvata primena sastava koji uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se imunospecifično vezuje za a Staphylococcus aureus alfa toksin polipeptida, pacijentu kom je to potrebno.
[0021] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se imunospecifično vezuju za Staphylococcus aureus polipeptid alfa toksina koji je ovde opisan, može se davati pacijentu kom je to potrebno, u količini koja je efikasna da smanji lizu ćelija. U određenim otelotvorenjima, postupak sprečava stanja povezana sa Staphylococcus aureus infekcijom. U nekim otelotvorenjima, ćelija je eritrocit iz krvi ili pluća.
[0022] Određena otelotvorenja su dalje opisana u sledećem opisu, primerima, zahtevima i crtežima.
Kratak opis crteža
[0023] Crteži ilustruju predmetna otelotvorenja i nisu ograničavajući. Zbog jasnosti i jednostavnosti ilustracije, crteži nisu napravljeni u razmeri i, u nekim slučajevima, različiti aspekti mogu biti prikazani preuveličanim ili uvećanim, kako bi se olakšalo razumevanje određenih otelotvorenja.
Slike 1A i 1B grafički ilustruju procenat inhibicije lize crvenih krvnih zrnaca anti-alfa toksin antitela. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 3.
Slike 2A i 2B grafički ilustruju procenat inhibicije lize ćelija A549 i THP-1 putem anti-alfa toksin antitela. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 3.
Slike 3A i 3B ilustruju rezultate pasivne imunizacije sa inhibitornim anti-S. aureus alfa toksin monoklonskim antitelima u modelu dermonekroze. Grupe od 5 BALB/c miševa pasivno su imunizovane sa 5 mg/kg inhibitornih monoklonska antitela, i zatim inficirane sa S. aureus Wood i veličina lezija se prati 6 dana. Slika 3A prikazuje fotografije veličine lezije 6 dana posle infekcije. Slika 3B grafički ilustruje smanjenje veličine lezije tokom vremena infekcije. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 4.
Slike 4-7 grafički ilustruju preživljavanje miševa pasivno imunizovanih sa različitim monoklonskim antitelima opisanim ovde u modelu upale pluća. Slika 4 ilustruje rezultate C57BL/6J miševa pasivno imunizovanih sa 5, 15 i 45 mg/kg prečišćenim 12B8.19, 24 sata pre infekcije sa S. aureus USA300 (3 x 108 cfu).
Slika 5 ilustruje rezultate C57BL/6J miševa pasivno imunizovanih sa 5, 15 i 45 mg/kg prečišćenim 2A3.1, 24 sata pre infekcije sa S. aureus USA300 (3 x 108 cfu).
Slika 6 ilustruje rezultate C57BL/6J miševa pasivno imunizovanih sa 5, 15 i 45 mg/kg prečišćenim 28F6.1, 24 sata pre infekcije sa S. aureus USA300 (3 x 108 cfu).
Slika 7 ilustruje rezultate C57BL/6J miševa pasivno imunizovanih sa 5, 15 i 45 mg/kg prečišćenim 10A7.5, 24 sata pre infekcije sa S. aureus USA300 (3 x 108 cfu). Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 5.
Slike 8A i 8B grafički prikazuju distribuciju bakterija u plućima (Slika 8A) i bubregu (Slika 8B) kod miševa pasivno imunizovanih sa potpuno ljudskom verzijom monoklonskog antitela 2A3.1 (npr., 2A3hu) ili kontrolom izotipa (R347). C57BL/6J miševi su pasivno imunizovani sa 2A3hu (15mg/kg) 24h pre infekcije sa USA300. Takođe su prikupljeni uzorci za merenje nivoa citokina i za histopatološku analizu. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 5.
Slika 9 grafički ilustruje smanjenje proizvodnje upalnog citokina nakon pasivne imunizacije sa monoklonskim antitelom 2A3hu. Zaokruženi rezultati su od vremenske tačke na 24 sata. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 6.
Na Slici 10 prikazane su reprezentativne fotografije plućne histologije kod miševa tretiranih kontrolom R347 (pogledati gornje i donje fotografije levo od Slike 10) ili tretirane sa 2A3hu (pogledati gornje i donje fotografije desno od Slike 10). Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 6.
Slika 11 grafički ilustruje da anti-AT (S. aureus alfa toksin) monoklonska antitela koja su ovde opisana ne inhibiraju vezivanje prirodnog alfa toksina (nAT) za receptore prisutne na zečjim duhovima eritrocita. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 8.
Slika 12 je reprezentativan western blot koji ilustruje inhibiciju formiranja heptamera antitelima opisanim ovde. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 8.
Slike 13A i 13B ilustruju reprezentativni western blot koji potvrđuje inhibiciju oligomerizacije anti-AT monoklonskim antitelima opisanim ovde, i dalje ilustruje da inhibicija može biti titrirana. Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 8.
Slike 14-16 grafički ilustruju potencijal potpuno ljudskih anti-AT antitela u testovima inhibicije lize ćelija. Potpuno ljudske verzije anti-AT IgG antitela pokazuju potencijal sličan odgovarajućim himernim anti-AT IgG antitelima. Inhibitorna aktivnost potpuno ljudskih IgG antitela upoređena je sa himernim IgG antitelima u lizi RBC (crvene krvne ćelije) (Slika 14), lizi A549 ćelija (Slika 15) i lizi THP-1 ćelija (Slika 16). Detalji i rezultati eksperimenta su opisani u Primeru 9.
Slike 17A i 17B grafički ilustruju smanjenje veličine lezije tokom vremena infekcije nakon pasivne imunizacije sa inhibitornim anti-S. aureus alfa toksin monoklonskim antitelima QD20, QD37, LC10, QD33, 2A3 i kontrolnog R347 u modelu dermonekroze. Grupe od 5 BALB/c miševa pasivno su imunizovane sa 1 mg/kg (Slika 17A) i 0,5 mg/kg (Slika 17B) prikazanih inhibitornih monoklonskih antitela, i zatim inficiranih sa S. aureus Wood i veličina lezija se prati 6 dana.
Slika 18 grafički ilustruje preživljavanje miševa pasivno imunizovanih sa monoklonskim antitelima QD20, QD37, LC10, QD33, 2A3 i kontrolom R347 u modelu upale pluća. Miševi su pasivno imunizovani sa 5 mg/kg prečišćenog monoklonskog antitela od 24 sata pre infekcije S. aureus USA300 (~ 2 x 10<8>cfu).
Slika 19 grafički prikazuje ELISA karakterizaciju vezivanja LC10 YTE na alfa toksin i LukF-PV. Bakterijski lizat koji sadrži His-označeni alfa toksin ili LukF-PV obložen je na površini 96-komorica. LC10 YTE ili mišje anti-His monoklonsko antitelo su dodati u obložene komorice i inkubiran 1 sat. Nivoi eksprimiranja alfa toksina i LukF-PV su slični kao što pokazuju signali vezivanja anti-His monoklonskog antiteloa, dok se LC10 YTE značajno vezuje samo za alfa toksin, a ne LukF-PV. Slika 20 prikazuje poravnanja sekvenci alfa toksina i LukF-PV proteina. Alfa toksin deli 25% identičnosti aminokiselinske sekvence sa LukF-PV (UniProtKB/TrEMBL pristupni broj B1Q018). Brojanje aminokiselina zasnovano je na zrelim proteinama. Usaglašavanje je izvršeno korišćenjem postupka Clustal W. Segment aa 248-277 je označen podvlačenjem.
Slika 21 prikazuje nacrtani prikaz struktura alfa toksina. A) Nacrtani prikaz modelirane strukture rastvorljivog monomera alfa toksina. Modelirana strukture monomera alfa toksina izgrađena je pomoću Maestro 9,1 (Schrodinger Inc) koristeći kristalnu strukturu LukF-PV kao šablon (Protein Data Bank unos 1PVL) (Pedelacq, Maveyraud i dr.1999). B) Nacrtani prikaz kristalne strukture protomera alfa toksina iz heksamera (Protein Data Bank unos 7AHL) (Song, Hobaugh i dr.1996). aa 101-110 su prikazane plavom, aa 224-231 narandžastom i aa 248-277 crvenom bojom.
Slika 22 je dijagram trake LC10 YTE Fab-α-toksin kompleksa. Molekul alfa-toksina označava traka u gornjem delu dijagrama. Teški lanac je označen tamno obojenom trakom u donjem delu dijagrama, i laki lanac je označen trakom u boji u donjem delu dijagrama.
Slika 23 predstavlja nacrtani prikaz heptamerskih i monomernih stanja molekula α-toksina. a.
Heptamerini sastav molekula α-toksina pečurkastog oblka koji stvara pore na površini ćelije domaćina. Sivi i crni regioni odgovaraju LC10 YTE dodirnim ostacima koji su zaštićeni u modelu. Dodirni ostaci koji su prisutni u zaštićenim položajima su konzistentno LC10 blokiranje formiranja heptamera. b. Nadređene strukture molekula α-toksina pre (svetlo siva) i nakon (tamno siva) formiranja pora.
Slika 24 grafički predstavlja efikasnost lečenja LC10 u mišjem modelu dermonekroze. Grupe od 5 Balb/C miševa pasivno imunizovane sa 15 mg/kg LC10, ili R347 Balb/C miševa, inficirane su intranazalno sa 2 x 108 S. aureus Wood. (A) 1 sat, (B) 3 sata ili (C) 6 sata posle infekcije miševi su zatim tretirani sa 5, 15 ili 45 mg/kg LC10, i veličine lezija su nadgledane tokom 6 dana. Grupe od 5 kojima je primenjeno 15 mg/kg LC10 ili R34724 sata pre bakterijskog izazova uključene su kao kontrole.
Slika 25 grafički predstavlja efikasnost lečenja LC10 u mišjem modelu upale pluća. Grupe od 10 C57BL/6 miševa pasivno su imunizovane sa 15 mg/kg LC10 ili R34724 sata pre intranazalnog izazova sa 2 x 108 S. aureus USA300. Grupe od 10 C57BL/6 miševa inficirane su intranazalno sa 2 x 108 S. aureus USA300. (A) 1 sat, (B) 3 sat ili (C) 6 sati posle infekcije miševi su zatim tretirani sa 5, 15 ili 45 mg/kg LC10, i preživljavanje je nadgledano 7 dana. Grupe od 10 kojima je primenjeno 15 mg/kg LC10 ili R34724 sata pre bakterijskog izazova uključene su kao kontrole.
Slika 26 grafički predstavlja efikasnost lečenja LC10 u mišjem modelu upale pluća. Grupe od 10 C57BL/6 miševa inficirane su intradermalno sa 2 x 108 S. aureus USA300. Nakon jednog sata posle infekcije, životinje su dobile jedno intraperitonealno injektiranje LC-10 na (A) 15 mg/kg (B) 45 mg/kg. Kohortna grupa životinja primila subkutani vankomicin (VAN) 1 sat posle infekcije. Dodatni VAN tretmani su dati BID x 12 tokom ukupno 6 tretmana. Kontrolna grupa od 10 miševa tretirana je sa 15 mg/kg R3471 sat posle infekcije. Preživljavanje je nadgledano 7 dana.
Slika 27 je grafički prikaz analize sinergije izobolograma, gde je N> 1: antagonizam, N = 1: aditivni efekat, N <1: sinergija.
Detaljan opis
[0024] Ovde su pružena antitela, uključujući ljudske, humanizovane i/ili himerne oblike, kao i njihovi fragmenti, derivati/konjugati i sastavi koji se vezuju za Staphylococcus aureus alfa toksin. Takva antitela mogu biti korisna za detektovanje i/ili vizuelizaciju alfa toksina i stoga mogu biti korisna u testovima i postupcima dijagnostike. Ovde opisana antitela takođe utiču na formiranje heptamera alfa toksina, čime se inhibira formiranje kompleksa za formiranje aktivnih pora, i stoga mogu biti korisna za terapeutske i profilaktičke postupke.
[0025] Staphylococcus aureus je sveobuhvatni patogen, i ponekad i etiološki agens različitih stanja, u rasponu od blagog do smrtonosnog. S. aureus proizvodi veliki broj ekstracelularnih i ćelijskih proteina, od kojih su mnogi uključeni u patogenezu, kao što su alfa-toksin, beta-toksin, gama-toksin, delta-toksin, leukocidin, toksin sindroma toksičnog šoka (TSST), enterotoksini, koagulaza, protein A, fibrinogen, protein vezujući fibronektin i slično. Alfa-toksin (npr., kodiran hla genom) je jedan od virulentnih faktora Staphylococcus aureus i proizvodi se od strane većine patogenih S. aureus sojeva.
[0026] S. aureus infekcije su relativno teške za tretman, i invazivna oboljenja i relapse mogu se javiti nakon tretmana antibioticima. Pored toga, sojevi S. aureus otporni na meticilin su postali sve prisutniji u bolničkim okruženjima (npr., HA-MRSA ili povezani sa zdravstvenom zaštitom) i nebolničkim okruženjima (npr., CA-MRSA ili povezana sa zajednicom), što dodatno komplikuje tretman S. aureus infekcije. U mnogim slučajevima, sojevi S. aureus otporni na meticilin takođe su otporni na jedan ili više drugih antibiotika uključujući aminoglikozide, tetracikline, hloramfenikol, makrolide i linkozamide.
[0027] Alfa toksin je toksin koji formira pore i ima citolitičke, hemolitičke, dermonekrotične i smrtonosne aktivnosti kod ljudi, kao i kod životinja. Staphylococcal alfa toksin se luči kao jednolačnani polipeptid rastvorljiv u vodi, koji sadrži 293 aminokiseline, što je približno 34 kilodaltona (kDa). Bez ograničavanja teorijom, veruje se da postoje dve postupka interakcije alfa toksina/ciljane ćelije; (i) alfa toksin se vezuje za specifične receptore visokog afiniteta (ADAM 10) na površini ćelija ljudskih trombocita, monocita, endotelnih ćelija, belih krvnih ćelija, alveolarnih plućnih ćelija, makrofaga, keratinocita, fibroblasta, zečjih eritrocita i drugih ćelija (pogledati npr. VWilke i dr., Proc. Natl. Acad. Sci.107:13473-13478 (2010)), ili (ii) alfa toksin interakuje ne-specifično adsorpcijom lipidnih dvosloja. U bilo kom režimu interakcije toksina/ćelija, sedam monomera alfa toksina se oligomerizuju kako bi se formirao heptamerički transmembranski kanal od 1-2 nm u prečniku. Kasniji odliv kalijuma i nukleotida, i priliv natrijuma i kalcijuma, dovode do osmotske lize i/ili više sekundarnih dejstava, uključujući proizvodnju eikozanoida, sekretorne procese, kontraktilnu disfunkciju, apoptozu i oslobađanje citokina. Smatra se da poremećaj ćelijskih aktivnosti i liza ćelija od alfa toksina doprinose stanjima i bolestima povezanim sa S. aureus infekcijom.
[0028] Neograničavajući primeri nekih uobičajenih uslova uzrokovanih S. aureus infekcijom uključuje opekotine, celulitis, dermonekrozu, infekcije očnih kapaka, trovanje hranom, infekcije zglobova, upala pluća, kožne infekcije, infekcije hirurške rane, sindrom krastave kože i sindrom toksičnog šoka. Pored toga, čest je patogen u stranim telesnim infekcijama, kao što su intravaskularne linije, pismejkeri, veštački ventili srca i zglobni implanti. Neki od stanja ili bolesti izazvani od strane S. aureus su dalje opisani. Neka ili sva stanja i bolesti opisani u nastavku mogu uključivati direktno delovanje alfa toksina kao komponente infekcije ili posrednika stanja ili bolesti, ili neki ili svi uslovi mogu uključivati indirektno ili sekundarno delovanje alfa toksina (npr. primarni virulentni faktor uzrokuje glavni simptom ili većinu simptoma povezanih sa stanjima, i alfa toksin deluje kako bi dalje napredovala bolest kroz poremećaj ćelijske funkcije i aktivnosti lizne ćelije).
Opekotine
[0029] Povrede opekotina su često sterilne na početku. Međutim, umerene i teške opekotine uglavnom kompromituju fizičke i imune barijere za infekcije (npr., ožiljci, pukotine ili ljuštenje kože), što dovodi do gubitka tečnosti i elektrolita, i rezultuje lokalnom ili opštom fiziološkom disfunkcijom. Dodir ugrožene kože sa održivim bakterijama ponekad može dovesti do mešovite kolonizacije na mestu povrede. Infekcija može biti ograničena na neodržive ostatke na površini opekotine („eshara“), ili kolonizacija može napredovati u punu infekciju kože i napasti održivo zdravo ispod eshara. Ozbiljnije infekcije mogu stići ispod kože, ući u limfni sistem i/ili cirkulaciju krvi, i razviti u septihemiju. S. aureus se obično nalazi među patogenima koji kolonizuju infekcije rane. S. aureus mogu uništiti tkivo granulacije, i proizvoditi tešku septihemiju.
Infekcije kože i mekanih tkiva
Celulitis
[0030] Celulitis je akutna infekcija kože koja često počinje kao površinska infekcija koja se može širiti ispod kožnog sloja. Celulitis najčešće uzrokuje mešovita infekcija S. aureus u spoju sa S. pyogenes. Celulitis može dovesti do sistemske infekcije. Celulitis je ponekad jedan aspekt sinergijske bakterijske gangrene.
Sinergijska bakterijska gangrena je obično uzrokovana mešavinom S. aureus i mikroerofilne streptokoke. Sinergijska bakterijska gangrena uzrokuje nekrozu i tretman je ograničen na pobuđivanje nekrotičnog tkiva. Stanje je često fatalno.
Dermonekroza
[0031] Dermonekroza je infekcija kože i potkožnih tkiva, lako se širi preko fascialne ravni unutar potkožnog tkiva. Stanje izaziva da gornji i/ili donji slojevi kože postanu nekrotični, i mogu se širiti na tkiva ispod i u okoline.
Nekrotizujući fascitis
[0032] Nekrotizujući fascitis se naziva „bolest koja jede meso“ ili „sindrom bakterije koja jede meso“.
Nekrotizujući fascitis može biti uzrokovan polimikrobnom infekcijom (npr., tip I, uzrokovan mešovitom bakterijskom infekcijom) ili monomikrobnom infekcijom (npr., tip II, uzrokovan jednim patogenim sojem bakterija). Mnoge vrste bakterija mogu uzrokovati nekrotizujući fascitis, njihovi neograničavajući primeri uključuju; Streptokoke grupe A (npr., Streptococcus pyrogenes), Staphylococcus aureus, Vibrio vulnificus, Clostridium perfringens, i Bacteroides fragilis. Pojedinci sa depresivnim ili kompromitovanim imunim sistemima češće pate od dermonekroze (npr., nekrotizujući fascitis).
[0033] Istorijski, streptokoke Grupe A se dijagnostikuju kao uzrok većine slučajeva dermonekrotičnih infekcija tipa II. Međutim, od 2001, meticilin-otporan Staphylococcus aureus (MRSA) je sa sve većom učestalošću primećen kao uzrok monomikobijalnog nekrotizujućeg fascitisa. Infekcija počinje lokalno, ponekad na mestu traume, koja može biti ozbiljna (kao što je rezultat hirurške intervencije), manja, ili čak i neočigledna. Pacijenti se obično žale na intenzivan bol koji može izgledati preterano s obzirom na spoljni izgled kože. Sa progresijom bolesti, tkivo postaje otečeno, često u roku od nekoliko sati. Dijareja i povraćanje su takođe uobičajeni simptomi.
[0034] Znak upale možda nije očigledan u ranim stadijumima infekcije, ako su bakterije duboko unutar tkiva. Ako bakterije nisu duboko, znaci upale, kao što su crvenilo i otečena ili vruća koža, pokazuju se vrlo brzo. Boja kože može napredovati do ljubičaste, i plikovi se mogu formirati, uz naknadnu nekrozu (npr., smrt) potkožnih tkiva. Pacijenti sa nekrotiziranim fascitisom obično imaju groznicu i izgledaju veoma bolesno. Stopa smrtnosti je zabeležena čak 73 procenta, ako se ne leči. Bez odgovarajuće medicinske pomoći, infekcija napreduje brzo i na kraju vodi do smrti.
Upala pluća
[0035] S. aureus je takođe dijagnostikovan kao uzrok stafilokokne upale pluća. Stafilokokna upala pluća izaziva zapaljenje i oticanje pluća, što uzrokuje da se tečnosti sakuplja u plućima. Sakupljanje tečnosti u plućima može sprečiti ulazak kiseonika u krvotok. Pacijenti sa gripom su pod rizikom za razvoj bakterijske upale pluća. Staphylococcus aureus je najčešći uzročnik bakterijske upale pluća kod onih koji već boluju od gripa. Uobičajeni simptomi stafilokokne upale pluća uključuju kašalj, teškoće disanja i groznicu. Dodatni simptomi uključuju zamor, žutu ili krvavu sluz, i bol u grudima koji se pogoršava kad se diše. S. aureus otporan na meticilin (MRSA) se sve više dijagnostikuje kao soj identifikovan u stafilokoknoj upali plića.
Infekcije hirurške rane
[0036] Hirurške rane često prodiru duboko u telo. Infekcija takvih rana predstavlja veliku opasnost za pacijenta, ako rana postane zaražena. S. aureus je često uzročnik infekcija u hirurškim ranama. S. aureus je neuobičajeno uspešan u napadanju hirurških rana, ušivene rane mogu biti inficirane sa daleko manje S. aureus ćelije nego što je neophodno da bi izazvale infekcije u normalnoj koži. Invazija na hiruršku ranu može dovesti do ozbiljne S. aureus septihemije. Invazija krvnog toka od strane S. aureus može dovesti do rasejavanja i infekcije unutrašnjih organa, naročito srčanih kanala i kostiju, što izaziva sistemske bolesti, kao što su endokarditis i osteomielitis.
Sindrom krastave kože
[0037] S. aureus verovatno je glavni uzročnik, ako ne i jedini uzročnik, „sindroma krastave kože“, koji se takođe naziva „stafilokokni sindrom krastave kože“, „toksična epidermalna nekroza“, „lokalizovani bullous impetigo“, „Riterova bolest“ i „Lajelova bolest“. Sindrom krastave kože se često javlja kod starije dece, obično kod epidemija uzrokovanih cvetanjem S. aureus sojeva koji proizvode epidermolitičke egzotoksine (npr., ekfoliatin A i B, koji se ponekad naziva toksin krastave kože), koji uzrokuju odvajanje u epidermalnom sloju. Jedan od egzotoksina je kodiran bakterijskim hromozomom, i drugi kodiran plazmidom. Eksotoksini su proteaze koje cepaju desmoglein-1, koji obično drži zajedno granulosum i spinosum slojeve kože.
[0038] Bakterije mogu inicijalno zaraziti samo manju leziju, međutim, toksin uništava međućelijske veze, širi epidermalne slojeve i dozvoljava infekciji da prodre u spoljašnji sloj kože, što dovodi do dekvamacije koja simbolizuje bolest. Uništavanje spoljašnjeg sloja kože generalno otkriva normalnu kožu ispod, ali tečnost koja je izgubljena u procesu može izazvati ozbiljne povrede kod male dece, ako se ne tretira kako treba.
Sindrom toksičnog šoka
[0039] Sindrom toksičnog šoka (TSS) je uzrokovan sojevima S. aureus koji proizvode takozvani „toksin sindrom toksičnog šok“. Bolest može biti uzrokovana S. aureus infekcijom na bilo kojoj mestu, ali se često pogrešno posmatra kao bolest isključivo kod žena koje koriste tampone. Bolest uključuje toksemiju i septihemiju, i može biti fatalna.
[0040] Simptomi sindroma toksičnog šoka variraju u zavisnosti od osnovnog uzroka. TSS nastao usled infekcije bakterijama Staphylococcus aureus obično se manifestuje kod inače zdravih osoba sa visokom temperaturom, praćen niskim krvnim pritiskom, slabostima i konfuzijom, koji mogu brzo napredovati u stupor, komu i višestruko otkazivanje organa. Karakteristični osip, često viđen rano u toku bolesti, podseća na opekotine od sunca, i može obuhvatiti bilo koji region tela, uključujući usne, usta, oči, dlanove i đonove. Kod pacijenata koji prežive početni napad infekcije, osip otpada, ili se ljušti, nakon 10-14 dana.
[0041] Kao što je već napomenuto, zbog povećanja sojeva S. aureus rezistentnih na više lekova, sve veći broj antibiotika koji se obično koristi za tretman S. aureus infekcije, više ne kontrolišu i eliminišu infekciju Staphylococcus aureus rezistentnih na meticilin i više lekova. Antitela protiv ovde opisanog S. aureus alfa toksina mogu pomoći u smanjenju težine infekcije, i takođe mogu pomoći u čišćenju, sprečavanju (profilaktički) ili smanjenju patogenih S. aureus kod zaraženog domaćina.
Antitela
[0042] Kad se ovde koristi, izrazi „antitelo“, „antitela“ (takođe poznata kao imunoglobulini) i „antigenvezujući fragmenti“ obuhvataju monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela), poliklonska antitela, multispecifična antitela formirana od najmanje dva različita fragmenta vezana za epitop (npr., bispecifična antitela), ljudska antitela, humanizovana antitela, kamilja antitela, himerna antitela, jednolančane Fv (scFv), jednolančana antitela, jednodomenska antitela, domenska antitela, Fab fragmente, F(ab')2 fragmente, fragmente antitela koji pokazuju željenu biološku aktivnost (npr., antigen-vezujući deo), disulfidno vezani Fv (dsFv) i anti-idiotipična (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id antitela za ovde navedena antitela), intratela i fragmente vezani za epitop bilo čega od gore navedenog. Konkretno, antitela uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne fragmente molekula imunoglobulina, tj., molekule koji sadrže najmanje jedno mesto za vezivanje antigena. Molekuli imunoglobulina mogu biti od bilo kog izotipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgI), subizotipa (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili alotipa (npr., Gm, npr., G1m (f, z, i ili x), G2m (n), G3m (g, b ili c), Am, Em i Km (1, 2 ili 3)). Antitela mogu biti izvedene od bilo kog sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, majmune, svinje, konje, zečeve, pse, mačke, miševe i slično, ili druge životinje kao što su ptice (npr., kokoške).
[0043] Prirodna antitela su uglavnom heterotetramerni glikoproteini od oko 150,000 daltona, sastavljena od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem pomoću jedne kovalentne disulfidne veze, dok je broj disulfidnih veza različit između teških lanaca različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac ima i pravilno razmaknute unutrašnje disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH), praćen brojnim konstantnim domenima (CH). Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen (CL) na drugom kraju. Konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, i varijabilni domen lakog lanca poravnat je sa varijabilnom domenom teškog lanca. Laki lanci su klasifikovani kao lambda lanci ili kapa lanci na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog regiona lakog lanca. Varijabilni domen kapa lakog lanca mogu se ovde označiti kao VK.
[0044] Antitela koja su ovde navedena obuhvataju antitela pune dužinu ili netaknuta antitela, fragmente antitela, antitela sa prirodnim sekvencom ili varijante aminokiselina, ljudska, humanizovana, posttranslatorno modifikovana, himerna ili fuziona antitela, imunokonjugate i njihove funkcionalne fragmente. Antitela mogu biti modifikovana u Fc regionu, i određene modifikacije mogu pružiti željene efektorske funkcije ili polu-život u serumu.
[0045] Takođe su razmatrana antitela koja imaju jednu ili više bioloških karakteristika (npr., potenciju, afinitet alfa toksina, efektorsku funkcija, afinitet vezivanja ortologa, neutralizaciju, inhibiciju formiranja heptamera alfa toksina i slično) predmetnih anti-alfa toksin antitela i fragmenata. Anti-alfa toksin antitela i fragmenti mogu se koristiti za dijagnostikovanje i/ili tretman i/ili ublažavanje i/ili sprečavanje jednog ili više simptoma Staphylococcus aureus povezane bolesti kod sisara, kao što je gore opisano.
[0046] Ovde je pružen sastav koji sadrži anti-alfa toksin antitelo ili fragment i nosač. Za potrebe lečenja S. aureus-povezane bolest, sastavi se mogu davati pacijentu kom je potreban takav tretman, gde sastav može da sadrži jedno ili više anti-alfa toksin antitela i/ili njihove fragmente. Takođe su pružene formulacije koje sadrže anti-alfa toksin antitelo ili njegov fragment kao što je ovde predstavljeno, i nosač. Formulacija može biti profilaktička ili terapeutska formulacija koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0047] Ovde pruženi postupci su korisni za tretman bolest/stanje povezanih sa Staphylococcus aureus i/ili povezanih sa alfa toksinom i/ili sprečavanje i/ili ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti ili stanja kod sisara, i obuhvataju davanje sisaru terapeutski efikasne količine anti-alfa toksin antitela ili fragmenta.
Profilaktički ili terapeutski sastavi antitela mogu se primeniti kratkoročno (akutno) ili hronično, ili intermitentno, prema uputstvima lekara.
[0048] Ovde su predmeti proizvodnje koji sadrže najmanje anti-alfa toksin antitelo ili fragment, kao što je u sterilnom obliku doze i/ili u kompletu. Komplet koji sadrži anti-alfa toksin antitelo ili fragment može se koristiti, na primer, za testove ubijanja S. aureus ćelija, za prečišćavanje ili imunoprecipitaciju alfa toksina iz ćelija. Na primer, za izolaciju i prečišćavanje alfa toksina, komplet može sadržati anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je povezan sa perlama (npr., sefarozne perle). Komplet može sadržati antitelo za detektovanje i kvantifikovanje S. aureus i/ili alfa toksina in vitro, npr. u ELISA ili Western blotu. Takvo antitelo korisno za detektovanje može biti opremljeno oznakom kao što je fluorescentna ili radiooznaka.
Terminologija
[0049] Treba shvatiti da postupak koji je ovde dat nije ograničena na specifične sastave ili korake procesa, jer se to može razlikovati. Treba voditi računa da, kad se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju oblike množine, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.
[0050] Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji specifično vezuje polipeptid alfa toksina (npr., alfa toksin monomer, koji ovde se ovde označava kao „anti-alfa toksin antitelo ili fragment“ u obliku množine, i kao „anti-alfa toksin antitela i fragmenti“ u obliku množine). Polipeptidi alfa toksina se ponekad nazivaju alfa hemolizinom. Alfa toksin formira pore u ćelijskim membranama nakon oligomerizacije u heptamer, gde se oligomerizovani polipeptidi ponekad nazivaju kolektivno kao „alfa toksin pora“ ili „heptamer alfa toksina“.
[0051] Aminokiseline se često ovde pominju opšte poznatim troslovnim simbolima ili jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nukleotidi, isto tako, često se pominju opšte prihvaćenim jednoslovnim kodovima.
[0052] Numerisanje aminokiselina u varijabilnom domenu, regionu za određivanje komplementarnosti (CDR) i okvirnim regionima (FR), antitela prati, ako nije drugačije naznačeno, Kabata definicije kako je navedeno u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991). Koristeći ovaj sistem numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili umetanju u FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključivati pojedine umetke aminokiselina (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 od H2 i umetnuti ostatke (npr., ostatke 82a, 82b i 82c itd. prema Kabatu) nakon ostatka FR teškog lanca. Numeracija ostataka prema Kabatu može se odrediti za dato antitelo poravnanjem regiona homologije sekvence antitela sa „standardnom“ Kabat numerisanom sekvencom. Maksimalno poravnanje okvirnih ostataka često zahteva unošenje ostataka „odstojnika“ u sistem numeracije, koji se koriste za region Fv. Pored toga, identičnog određenih pojedinačnih ostataka na bilo kom Kabat broju mesta može da varira od lanca antitela do lanca antitela zbog divergencije među vrstama, ili alelne divergencije.
Anti-alfa toksin antitela i fragmenti
[0053] Ovde su obelodanjeni anti-alfa toksin antitelo ili fragmenti koji su izolovani i/ili prečišćeni i/ili bez pirogena. Izraz „prečišćeni“ kad se ovde koristi, odnosi se na molekul od interesa, koji je identifikovan i odvojen i/ili se obnavlja iz komponente svoje prirodne sredine. Prema tome, pruženo antitelo je prečišćeno antitelo koje je odvojeno od jedne ili više komponenti svoje prirodne sredine. Izraz „izolovano antitelo“ kad se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje je u suštini bez drugih molekula antitela koji imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za alfa toksin je u suštini bez antitela koja specifično vezuju antigene, osim alfa toksina). Molekul bi-ili multi-specifičnog antitela je izolovano antitelo kada je u suštini bez drugih molekula antitela. Prema tome, pružena antitela su izolovana antitela kad su odvojena od antitela sa različitom specifičnošću. Izolovano antitelo može biti monoklonsko antitelo. Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu S. aureus alfa toksin, međutim, može imati unakrsnu reaktivnost prema drugim srodnim antigenima, npr., od drugih vrsta (npr., homolozi Staphylococcus vrste). Izolovano antitelo kakvo je dato može biti u suštini bez jednog ili više drugih ćelijskih materijala. Ovde je obelodanjena kombinacija „izolovanih“ monoklonskih antitela, i ona se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i kombinovana su u definisanom sastavu. Postupci proizvodnje i prečišćavanja/izolacije anti-alfa toksin antitela ili fragmenta su ovde detaljnije opisani.
[0054] Predstavljena izolovana antitela sadrže ovde opisane aminokiselinske sekvence antitela, koje mogu biti kodirane bilo kojim pogodnim polinukleotidom. Izolovana antitela ponekad su pružena u formulisanom obliku. Ovde obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragmenat vezuju S. aureus alfa toksin i time delimično ili suštinski menjaju bar jednu biološku aktivnost alfa toksina, na primer, oligomerizaciju u aktivni heptamer kompleks.
[0055] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment često se imunospecifično vezuju za jedan ili više epitopa specifičnih za protein alfa toksina, peptid, podjedinicu, fragment, porciju, oligomer ili bilo koje njihove
1
kombinacije, i generalno se ne vezuju specifično za druge polipeptide. Izraz „oligomeri“ ili „oligomeri alfa toksina“ odnosi se na udruživanje monomera alfa toksina (npr., 2 monomera, 3 monomera, 4 monomera, 5 monomera, 6 monomera ili 7 monomera) kako bi se formirala funkcionalna pora (npr., 7 alfa toksin monomera). Epitop može obuhvatati najmanje jedan region vezivanja antitela koji sadrži najmanje jedan deo proteina alfa toksina. Izraz „epitop“, kad se ovde koristi, odnosi se na determinant proteina sposoban za vezivanje za antitelo. Epitopi uglavnom uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline i/ili bočni lanci šećera, i uglavnom imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične hemijske karakteristike (npr., napon, polaritet, baznost, kiselost, hidrofobnost i slično). Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju u tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za drugi, gubi u prisustvu denaturisanih rastvarača. Prepoznat epitop može uticati na stvaranje aktivnog heptamera (npr., inhibira oligomerizaciju monomera alfa toksina u aktivni heptamer kompleks),
[0056] Epitop može biti sastavljen od najmanje jednog dela proteina alfa toksina, koji je uključen u stvaranje kompleksa heptamera alfa toksina. Navedeni epitop može sadržati bilo koju kombinaciju najmanje jedne aminokiselinske sekvence od najmanje 3 aminokiselinska ostatka u čitavom specifičnom delu neprekidnih aminokiselina proteina alfa toksina. Epitop može biti najmanje 4 aminokiselinska ostatka, najmanje 5 aminokiselinskih ostataka, najmanje 6 aminokiselinskih ostataka, najmanje 7 aminokiselinskih ostataka, najmanje 8 aminokiselinskih ostataka, najmanje 9 aminokiselinskih ostataka, najmanje 10 aminokiselinskih ostataka, najmanje 11 aminokiselinskih ostataka, najmanje 12 aminokiselinskih ostataka, najmanje 13 aminokiselinskih ostataka, najmanje 14 aminokiselinskih ostataka ili najmanje 15 aminokiselinskih ostataka u čitavom specifičnom delu neprekidnih aminokiselina protein alfa toksina. Epitop može sadržati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 neprekidnih ili prekidanih aminokiselinskih ostataka. Ostaci aminokiselina koji se nalaze u epitopu mogu biti uključeni u formiranje kompleksa heptamera alfa toksina. Dodirni ostaci mogu sadržati T261, T263, N264, K266 i K271. Dodirni ostaci mogu da sadrže N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 i R200 od SEQ ID NO: 39. Dodirni ostaci mogu da sadrže N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 i K271 od SEQ ID NO: 39. Deo alfa toksina u dodiru sa antitelom ili njegov antigen-vezujući fragment mogu sadržati aminokiseline 261-272 od SEQ ID NO: 39. Deo alfa toksina u dodiru sa antitelom ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen može sadržati aminokiseline 248-277 SEQ ID NO: 39. Deo alfa toksina u dodiru sa antitelo ili fragmentom koji se vezuje za antigen može sadržati aminokiseline 173-201 i 261-272 od SEQ ID NO: 39.
[0057] Stog, izolovano/prečišćeno anti-alfa toksin antitelo i fragmenti imunospecifično se mogu vezati za molekul koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 39 i/ili molekul koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 40. Anti-alfa toksin antitela i fragmenti mogu se takođe povezati sa alfa toksin homolozima ili ortolozima različitih vrsta ili varijantama aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 39, gde se histidin na položaju 35 zamenjuje leucinom ili se zamenjuje drugim aminokiselinama koje odgovaraju H35 mutacijama koje su poznate stručnjacima u oblasti.
Varijabilni regioni
[0058] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment može se dobiti od roditeljskog antitela. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu biti obuhvaćeni unutar roditeljskog antitela. Kad se ovde koristi, izraz „roditeljsko antitelo“ odnosi se na antitelo koje je kodirano aminokiselinskom sekvencom koja se koristi za pripremu varijante ili derivata, definisane ovde. Roditeljski polipeptid može sadržati prirodnu sekvencu antitela (tj., prirodno se pojavljuje, uključujući prirodnu alelnu varijantu) ili sekvencu antitela sa unapred postojećim aminokiselinskim modifikacijama (kao što su drugi umetci, brisanja i/ili supstitucije) prirodne sekvence. Nadređeno antitelo može biti humanizovano antitelo ili ljudsko antitelo. Anti-alfa toksin antitela i fragmenti mogu biti varijante roditeljskog antitela. Kad se ovde koristi, izraz „varijanta“ odnosi se na anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od „roditeljskog“ anti-alfa toksin antitela ili fragmenta aminokiselinske sekvence na osnovu umetanja, brisanja i/ili supstitucije jednog ili više aminokiselinskih ostataka u roditeljskoj sekvenci antitela.
[0059] Antigen-vezujući deo antitela sadrži jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., alfa toksin). Pokazano je da funkcija vezivanja antigena antitela može biti izvedena fragmentima celokupnog antitela. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih pojmom „antigen-vezujući deo“ antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2 fragment, dvovalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom na zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment, koji se sastoji od VH domena; i (vi) izolovan region za određivanje komplementarnosti (CDR). Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, često kodirana posebnim genom, mogu se povezati, koristeći rekombinantne postupke, sintetičkim veznikom koji im omogućava da budu napravljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kom su VL i VH regioni se sastoje od monovalentnih molekula (poznatih kao jednolančani Fv (scFv). Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena izrazima „antitelo i „antigen-vezujući deo“ antitela. Ovi fragmenti antitela mogu se dobiti korišćenjem poznatih tehnika, i fragmenti mogu biti ispitani za vezivnu aktivnost na isti način kao i netaknuta antitela. Antigen-vezujući delovi mogu se dobiti tehnikom rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem netaknutih imunoglobulina.
[0060] Anti-alfa toksin antitela i fragmenti koji su ovde prikazani sadrže najmanje jedan antigen-vezujući domen. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment može sadržati VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment može sadržati VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment može sadržati VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62 i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Pogledati Primer 11, Tabelu 7 za prikazivanje VH i VL sekvenci kao što je ovde predstavljeno, koje mogu biti prisutne u bilo kojoj kombinaciji kako bi se formiralo anti-alfa toksin antitelo ili fragment, ili prisutne u kombinaciji kako bi se formiralo monoklonsko antitelo kao što je ovde obelodanjeno. VH može biti odabran od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. VL može biti odabran od SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Određene VH i VL nukleotidne sekvence su prikazane u Primeru 11, Tabeli 8.
[0061] Ovde su obelodanjena izolovana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji uključuju VH i VL, gde VH i VL imaju aminokiselinske sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 20 i 19; SEQ ID NO; 22 i 21; SEQ ID NO: 24 i 23; SEQ ID NO: 26 i 25; SEQ ID NO: 28 i 27; SEQ ID NO: 41 i 42; SEQ ID NO: 43 i 44; SEQ ID NO: 45 i 46; SEQ ID NO: 47 i 48; SEQ ID NO: 47 i 48; SEQ ID NO: 49 i 50; SEQ ID NO: 51 i 52; SEQ ID NO: 51 i 52; SEQ ID NO: 53 i 54; SEQ ID NO: 55 i 56; SEQ ID NO: 57 i 58; SEQ ID NO: 59 i 60; SEQ ID NO: 61 i 58; SEQ ID NO: 62 i 58; SEQ ID NO: 62 i 63; SEQ ID NO: 79 i 63.
[0062] Tabele 1-7 iz Primera 11 pružaju varijabilne regione teškog lanca (VH), varijabilne regione lakog lanca (VL) i regione za određivanje komplementarnosti (CDR) za određena antitela i fragmente prikazane ovde. Anti-alfa toksin antitela i fragmenti mogu sadržati VH i/ili VL koji imaju određeni procenat koji se identifikuje sa najmanje jednom od VH i/ili VL sekvenci opisanih u Tabeli 7. Kad se ovde koristi, izraz „procenat (%) identičnosti sekvence“ takođe uključujući i „homologiju“, definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u kandidat sekvenci koji su identični sa aminokiselinskim ostacima ili nukleotidima u referentnim sekvencama, kao što je roditeljska sekvenca antitela, nakon poravnanja sekvenci i uvođenja razmaka, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne uzima u obzir bilo kakve konzervativne supstitucija kao deo identičnosti sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za upoređivanje može se proizvesti, osim ručno, pomoću lokalnih homolognih algoritama poznatih u struci, ili pomoću računarskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin).
[0063] Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje može sadržati VH aminokiselinsku sekvencu koja sadrži najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identičnosti ili sadrži 100% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu uključivati VH aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnu ili 100% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu sadržati 1-10 konzervativnih supstitucija u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu sadržati VH aminokiselinsku sekvencu sa datim procentom koji se identifikuje sa SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62 da ima jednu ili više karakteristika (opisanih detaljnije u nastavku) odabranih iz grupe koja se sastoji od:
(a) konstanta afiniteta (KD) za alfa toksin od oko 13 nM ili manje;
(b) vezivanje za monomere alfa toksina, ali ne inhibira vezivanje alfa toksina na alfa toksin receptor;
(c) inhibira formiranje oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%; (d) smanjenje citolitičke aktivnost alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% (npr., kao što je utvrđeno pomoću testova ćelijske lize, dodavanja hemolize);
(e) smanjuje infiltraciju ćelija i proupalno oslobađanje citokina (npr., u životinjskom modelu upale pluća).
[0064] Ovde obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu vezati antigen (npr., alfa toksin) sa afinitetom koji karakteriše konstanta disociacije (KD) u rasponu od oko 0,01 nM do oko 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30nM ili 40 nM.
[0065] Ovde obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu sadržati VL aminokiselinsku sekvencu najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identičnu ili u100% identične aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu uključivati VL aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identična ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu sadržati 1-10 konzervativne supstitucije u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu sadržati VL aminokiselinsku sekvencu sa datim procentom koji se identifikuje sa SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63, i ima jednu ili više karakteristika (opisane detaljnije u nastavku) odabrane iz grupe koja se sastoji od:
(a) konstanta afiniteta (KD) za alfa toksin od oko 13 nM ili manje;
(b) vezivanje za monomere alfa toksina, ali ne inhibira vezivanje alfa toksina na alfa toksin receptor;
(c) inhibira formiranje oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%;
(d) smanjenje citolitičke aktivnost alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% (npr., kao što je utvrđeno pomoću testova ćelijske lize, dodavanja hemolize);
(e) smanjuje infiltraciju ćelija i proupalno oslobađanje citokina (npr., u životinjskom modelu upale pluća).
[0066] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., alfa toksin) sa afinitetom koji karakteriše konstanta disociacije (KD) u rasponu od oko 0,01 nM do oko 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30nM ili 40 nM.
[0067] Ovde je obelodanjeno antitelo ili fragment antitela koje se može imunospecifično vezati za alfa toksin i sadrži varijabilni domen teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62, i sadrži varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63, gde antitelo ima aktivnost inhibiranja vezivanja jednog ili više monomera alfa toksina npr. inhibira oligomerizaciju).
Regioni za određivanje komplementarnosti
[0068] Dok varijabilni domen (VH i VL) sadrži antigen-vezujući region, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Koncentrisana je u segmentima koji se zovu regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), kako u varijabilnim domenima lakog lanca (VL ili VK) tako i u varijabilnim domenima teškog lanca (VH). Konzervisaniji delovi varijabilnih domena nazivaju su okvirni regioni (FR). Svaki varijabilni domena prirodnih teških i lakih lanaca čine četiri FR, u velikoj meri usvajaju konfiguraciju β-lista, povezani sa tri CDR, koje formiraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima formiraju deo, strukturu beta-lista. CDR u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću FR, i sa CDR iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (pogledati, Kabat i dr., supra). Tri CDR teškog lanca su označene sa VH-CDR1, VH CDR2 i VH-CDR-3, i tri CDR lakog lanca su označene sa VL-CDR1, VL-CDR2 i VI-CDR3. Ovde se koristi Kabatov sistem numerisanja. Kao takav, VH-CDR1 počinje približno na aminokiselini 31 (tj., oko 9 ostataka nakon prvog ostatka cisteina), uključuje približno 5-7 aminokiselina i završava se na sledećem serinskom ostatku. VH-CDR2 počinje na petnaestom ostatku nakon kraja CDR-H1, uključuje približno 16-19 aminokiselina, i završava se na sledećem ostanku glicina. VH-CDR3 počinje na otprilike tridesetom aminokiselinskom ostatku nakon završetka VH-CDR2; uključuje približno 13-15 aminokiselina; i završava u sekvenci M-D-V. VL-CDR1 počinje otprilike na ostatku 24 (tj., nakon ostatka cisteina); uključuje otprilike 10-15 ostataka; i završava sa sekvencom Y-V-S. VL-CDR2 počinje na otprilike šesnaestom ostatku nakon završetka VL-CDR,1 i uključuje približno 7
1
ostataka. VL-CDR3 počinje na približno trideset trećem ostatku nakon završetka VH-CDR2; sadrži otprilike 7-11 ostataka i završava se u sekvenci TI-L. Imajte na umu da se CDR znatno razlikuju od antitela do antitela (i po definiciji, neće pokazati homologiju sa Kabat konsenzus sekvencama).
[0069] Predmetna anti-alfa toksin antitela i fragmenti sadrže najmanje jedan antigen-vezujući domen koji uključuje najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR1, CDR2 ili CDR3). Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje sadrži VH koji uključuje bar jedan VH CDR (npr., CDR-H1, CDR-H2 ili CDR-H3). Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje sadrži VL koji uključuje bar jedan VL CDR (npr., CDR-L1, CDR-L2 ili CDR-L3).
[0070] Ovde su obelodanjena izolovana antitela ili fragmenti vezani za antigen koji se imunospecifično vezuju za Staphylococcus aureus polipeptid alfa toksina, i uključuju: (a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 7, 10, 13 ili 69; (b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 ili 75; i (c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78.
[0071] Ovde je obelodanjeno neizolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH CDR1, VH CDR2 i VH CDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence identične sa, ili koje sadrže supstitucije 1, 2 ili 3 aminokiselinskih ostataka u svakom CDR u odnosu na SEQ ID NO: 7, 8 i 9; SEQ ID NO: 10, 11 i 12; SEQ ID NO: 13, 14 i 15; SEQ ID NO: 7, 17 i 18; SEQ ID NO: 7, 8 i 16; SEQ ID NO: 7, 8 i 65; SEQ ID NO: 7, 8 i 66; SEQ ID NO 7, 8 i 67; SEQ ID NO: 7, 8 i 78; SEQ ID NO: 69, 70 i 71; SEQ ID NO: 7, 8 i 72; SEQ ID NO: 69, 75 i 71; SEQ ID NO: 69, 75 i 76; ili SEQ ID NO: 69, 70 i 71.
[0072] Ovde je obelodanjeno neizolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se imunospecifično vezuje za Staphylococcus aureus polipeptid alfa toksina i uključuje: (a) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 1 ili 4; (b) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 2, 5, 73 ili 77; i (c) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74.
[0073] Ovde je obelodanjeno neizolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence identične sa, ili koje sadrže 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u svakom CDR u odnosu na SEQ ID NO: 1, 2 i 3; SEQ ID NO: 4, 5 i 6; SEQ ID NO: 1, 2 i 64; SEQ ID NO: 1, 2 i 68; SEQ ID NO: 1, 73 i 74; ili SEQ ID NO: 1, 77 i 74.
[0074] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se imunospecifično vezuje za Staphylococcus aureus polipeptida alfa toksina i sadrži VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence identične sa, ili sadrže 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u svakom CDR u odnosu na :, (a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7, 10, 13 ili 69; (b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 ili 75; (c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78; (d) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili 4; (e) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, 5, 73 ili 77; i (f) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74.
[0075] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3 koji sadrže aminokiselinske sekvence identične sa, ili sadrže 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u svakom CDR u odnosu na SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2 i 3; SEQ ID NO: 10, 11, 12, 1, 2 i 3; SEQ ID NO: 13, 14, 15, 4, 5 i 6; SEQ ID NO: 7, 17, 18, 1, 2 i 3; SEQ ID NO: 7, 8, 16, 1, 2 i 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1, 2 i 64; SEQ ID NO; 7, 8, 66, 1, 2 i 64; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 i 68; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 i 64; SEQ ID NO: 7, 8, 78, 1, 2 i 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1, 2 i 68; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 i 68; SEQ ID NO: 7, 8, 72, 1, 73 i 74; SEQ ID NO: 69, 75, 71, 1, 2 i 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 2 i 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 77 i 74; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 77 i 74,
[0076] Ovde je obelodanjen sastav koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji (i) uključuje domen VH lanca koji sadrži tri CDR i domen VL lanca koji sadrži tri CDR; i (ii) imunospecifično se vezuje za polipeptid Staphylococcus aureus alfa toksina, gde tri CDR domena VH lanca uključuju (a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7, 10, 13 ili 69; (b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 ili 75; i (c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78. VH CDR1, VH CDR2 i VH CDR3 mogu odgovarati SEQ ID NO: 7, 8 i 9; SEQ ID NO: 10, 11 i 12; SEQ ID NO: 13, 14 i 15; SEQ ID NO: 7, 17 i 18; SEQ ID NO: 7, 8 i 16; SEQ ID NO: 7, 8 i 65; SEQ ID NO: 7, 8 i 66; SEQ ID NO 7, 8 i 67; SEQ ID NO: 7, 8 i 78; SEQ ID NO: 69, 70 i 71; SEQ ID NO: 7, 8 i 72; SEQ ID NO: 69, 75 i 71; SEQ ID NO: 69, 75 i 76; ili SEQ ID NO: 69, 70 i 71.
[0077] Ovde je obelodanjen sastav koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji (i) uključuje domen VH lanca koji sadrži tri CDR i domen VL lanca koji sadrži tri CDR; i (ii) imunospecifično se vezuje za polipeptid Staphylococcus aureus alfa toksina, gde tri CDR domena VL lanca uključuju (a) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili 4; (b) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, 5, 73 ili 77; i (c) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74. VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3 mogu odgovarati SEQ ID NO: 1, 2 i 3; SEQ ID NO: 4, 5 i 6; SEQ ID NO: 1, 2 i 64; SEQ ID NO: 1, 2 i 68; SEQ ID NO: 1, 73 i 74; ili SEQ ID NO: 1, 77 i 74.
[0078] Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje imunospecifično vezuje S. aureus alfa toksin i sadrži (a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 7, 10, 13 ili 69; (b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 ili 75; i (c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78; (d) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili 4; (e) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, 5, 73 ili 77; i (f) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74 i ima jednu ili više karakteristika (opisanih detaljnije u nastavku) odabranih iz grupe koju čine:
(a) konstanta afiniteta (KD) za alfa toksin od oko 13 nM ili manje;
(b) se vezuje za monomere alfa toksina, ali ne inhibira vezivanje alfa toksina na receptor alfa toksina;
(c) inhibira stvaranje oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%;
(d) smanjenje citolitičke aktivnost alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%; (npr., kao što je utvrđeno pomoću testova ćelijske lize, dodavanja hemolize);
(e) smanjuje infiltraciju ćelija i proupalno oslobađanje citokina (npr., u životinjskom modelu upale pluća).
[0079] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje antigen (npr., alfa toksin) sa afinitetom koje karakteriše konstanta disociacije (KD) u rasponu od oko 0,01 nM do oko 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30nM ili 40 nM.
[0080] Primer 11, Tabele 1-7 pružaju sekvence za VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3 za antitela iz ovog pronalaska. Tabela 9 daje sažetak VH i VL CDR. Ovi regioni se mogu kombinovati u različitim kombinacijama, jer se svaki CDR region može samostalno odabrati za dato antitelo. Tabela 7 ilustruje različite sekvence koje se mogu odabrati za svaku oblast. VL CDR3 sekvence mogu biti prisutne u bilo kojoj kombinaciji kako bi se formiralo prisutno anti-alfa toksin antitelo ili fragment. VH CDR1 može biti odabran od SEQ ID NO: 7, 10, 13 ili 69, VH CDR2 je odabran od SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 ili 75 i VH CDR3 je odabran od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78 kao što je prikazano u Tabeli 9. VL CDR1 može biti odabran od SEQ ID NO: 1 ili 4, VL CDR2 je odabran od SEQ ID NO: 2, 5, 73 ili 77 i VL CDR3 je odabran od SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74 kao što je prikazano u Tabeli 9.
[0081] VH CDR3 i VL CDR3 domeni igraju ulogu u vezivnoj specifičnosti/afinitetu antitela za antigen. (Prema tome, anti-alfa toksin antitelo ili fragment ili njegov antigen-vezujući fragment može sadržati VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment može sadržati VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74. Preostali delovi anti-alfa toksin antitela i fragmenata (npr. CDR1, CDR2, VH, VL, i slično) mogu obuhvatati specifične sekvence koje su ovde obelodanjene, ili poznate sekvence koje omogućavaju da se anti-alfa toksin antitela i fragmenti imunospecifično vezuju za S. aureus alfa toksin.
1
[0082] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji imunospecifično vezuje alfa toksin i sadrži VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78, gde antitelo ili antigen vezujući fragment inhibiraju oligomerizaciju alfa toksina.
[0083] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji imunospecifično vezuje alfa toksin i sadrži VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74, gde antitelo ili antigen vezujući fragment inhibiraju oligomerizaciju alfa toksina.
[0084] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji imunospecifično vezuje alfa toksin i sadrži VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78, gde antitelo ili antigen vezujući fragment smanjuje ili inhibira oslobađanje citokina.
[0085] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji imunospecifično vezuje alfa toksin i sadrži VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74, gde antitelo ili antigen vezujući fragment smanjuju ili inhibiraju oslobađanje citokina.
[0086] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji imunospecifično vezuje alfa toksin i sadrži VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 ili 78, gde antitelo ili antigen-vezujući fragment ublažava ili eliminiše dermonekrozu.
[0087] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji imunospecifično vezuje alfa toksin i sadrži VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskog ostatka u odnosu na SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 ili 74, gde antitelo ili antigen-vezujući fragment ublažava ili eliminiše dermonekrozu.
[0088] Anti-alfa toksin antitela i fragmenti često sadrže jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje su u suštini iste kao i aminokiselinska sekvenca koja je ovde opisana. Amino-kiselinske sekvence koje su u suštini iste obuhvataju sekvence koje sadrže konzervativne aminokiselinske supstitucije, kao i brisanja i/ili umetanja aminokiselina. Konzervativna supstitucija aminokiselina odnosi se na zamenu prve aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima hemijska i/ili fizička svojstva (npr. napon, struktura, polarnost, hidrofobnost/hidrofilnost) koja su slični onima od prve aminokiseline. Konzervativne supstitucije uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom u sledećim grupama: lizin (K), arginin (R) i histidin (H); aspartat (D) i glutamat (E); asparagin (N), glutamin (K), serin (S), treonin (T), tirozin (Y), K, R, H, D i E; alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (F), triptofan (V), metionin (M), cistein (C) i glicin (G); F, W i Y; C, S i T.
Okvirni regioni
[0089] Svi varijabilni domeni teških i lakih lanaca obuhvataju četiri okvirna regiona (uopšteno FR1, FR2, FR3, FR4 ili alternativno FW1, FW2, FW3, FW4), koji su konzervisaniji delovi varijabilnog domena. Četiri okvirna regioni teškog lanca ovde su označeni kao VH-FW1, VH-FW2, VH-FW3 i VH-FW4, i četiri okvirna regiona lakog lanca su ovde označeni kao VL-FVI, VL-FW2, VL-FW3 i VH-FW4. Ovde se koristi Kabat sistem numeracije, i kao takav, VH-FW1 počinje na položaju 1 i završava otprilike na aminokiselini 30, VH-FW2 je približno od aminokiseline 36 do 49, VH-FW3 je približno od aminokiseline 66 do 94 i VH-FW4 je približno aminokiselina od 103 do 113. VL-FW1 počinje sa aminokiselinom 1 i završava na približno aminokiselini 23, VL-FW2 je približno od aminokiseline 35 do 49, VL-FW3 je približno od aminokiseline 57 do 88 i VL-FW4 je približno od aminokiseline 98 do 107. Okvirni regioni mogu sadržati supstitucije u skladu sa Kabat sistemom numeracije, npr. umetanje na 106A u VL-FW1. Pored prirodnih supstitucija, jedna ili više izmena (npr., supstitucija) FR ostataka takođe može biti uvedene u anti-alfa toksin antitelo ili fragment. Ove izmene mogu rezultovati poboljšanjem ili optimizacijom vezivnog afiniteta antitela za antialfa toksin. Neograničavajući primeri ostataka okvirnog regiona koji mogu biti modifikovani uključuju one koji direktno ne-kovalentno vezuju antigen, interakuju sa/utiču na konformaciju CDR i/ili učestvuju u VL-VH interfejsu.
[0090] Okvirni region može sadržati jednu ili više aminokiselinskih promena u svrhu „germlininga“. Na primer, aminokiselinske sekvence odabranih teških i lakih lanaca antitela se upoređuju sa germlinijskim aminokiselinskim sekvencama teškog i lakog lanca, i gde se određeni okvirni ostaci odabranih lanaca VL i/ili
1
VH razlikuju od germlinijske konfiguracije (npr. kao rezultat somatske mutacije imunoglobulinskih gena koji se koriste za pripremu biblioteke faga), možda bi bilo poželjno da se „mutiraju u nazad“ izmenjeni okvirni ostaci odabranih antitela do germlinijske konfiguracije (tj., izmeniti okvirne aminokiselinske sekvence odabranih antitela, tako da su isti kao i aminokiselinske sekvence germlinijskih okvira). Ovakva „mutacija u nazad“ (ili „germlining“) okvirnih ostataka može se postići standardnim postupcima molekularne biologije za uvođenje specifičnih mutacija (npr., mutageneza usmerena na mesto, mutageneza posredovana sa PCR i slično). Okvirni ostaci varijabilnih lakih i/ili teških lanaca mogu biti mutirani. Ovde je obelodanjen varijabilni teški lanac izolovanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen koji je mutiran u nazad. Ovde je obelodanjen varijabilni teški lanac izolovanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen koji sadrži najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri ili više mutacija u nazad.
[0091] Ovde su obelodanjena VH anti-alfa toksin antitela ili fragmenti koji mogu sadržati FR1, FR2, FR3 i/ili FR4 koji ima identičnost aminokiselinske sekvence sa odgovarajućim okvirnim regionima (tj., FR1 antitela X u poređenju sa FR1 antitela Y) unutar SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61, ili 62 koji je od oko 65% do oko 100%. Ovde su obelodanjeni anti-alfa toksin antitelo ili fragmenti koji sadrže VH FR aminokiselinsku sekvencu (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identičnu ili 100% identičnu sa odgovarajućim FR od VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje sadrži VH FR aminokiselinsku sekvencu (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) najmanje 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnu ili 100% identičnu sa odgovarajućim FR od VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62.
[0092] Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje može sadržati VH FR (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u odnosu na, odgovarajući FR od VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. Posebno FR1, FR2, FR3 ili FR4 VH mogu svaki imati aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u odnosu na odgovarajuće FR1, FR2, FR3 ili FR4 od VH od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62.
[0093] Ovde je obelodanjen VL anti-alfa toksin antitela ili fragmenta koji se mogu sastojati od FR1, FR2, FR3 i/ili FR4 koji ima identičnost aminokiselinske sekvence sa odgovarajućim okvirnim regionima (tj., FR1 antitela X u odnosu na FR1 antitela Y) unutar FR od VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63 (npr. od oko 65% do oko 100% identičnosti sekvence. Ovde je obelodanjeno antialfa toksin antitelo ili fragment koje sadrži VL FR aminokiselinsku sekvencu (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identičnu ili 100% identičnu sa odgovarajućim FR od VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje sadrži VL FR aminokiselinsku sekvencu (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) najmanje 90 97, 98%, 99% identičnu ili 100% identičnu sa odgovarajućim FR od VL SEQ ID NO: 19, 21, 91, 92%, 93%, 94%, 95% 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63.
[0094] Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje sadrži VL FR (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u odnosu na odgovarajuće FR od VL od SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Posebno FR1, FR2, FR3 ili FR4 VL može svaki imati aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u odnosu na odgovarajuće FR1, FR2, FR3 ili FR4 od VH od SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63.
[0095] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji imunospecifično vezuje alfa toksin i sadrži VH FR (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u odnosu na odgovarajući FR od VH od SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62 i/ili VL FR (FR1, FR2, FR3 i/ili FR4) koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je identična sa, ili sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u odnosu na odgovarajuću FR od VL od SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63, gde antitelo ima jednu ili više karakteristika (opisano je detaljnije u nastavku) odabranu iz grupe koju čine:
(a) konstanta afiniteta (KD) za alfa toksin od oko 13 nM ili manje;
(b) vezivanje za monomere alfa toksina, ali ne inhibira vezivanje alfa toksina na alfa toksin receptor; .
1
(c) inhibira stvaranje oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%;
(d) smanjenje citolitičke aktivnost alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%; (npr., kao što je utvrđeno pomoću testova ćelijske lize, dodavanja hemolize);
(e) smanjuje infiltraciju ćelija i proupalno oslobađanje citokina (npr., u životinjskom modelu upale pluća).
[0096] Ovde je obelodanjeno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje antigen (npr., alfa toksin) sa afinitetom koje karakteriše konstanta disociacije (KD) u rasponu od oko 0,01 nM do oko 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30nM ili 40 nM.
Nukleotidne sekvence koje kodiraju anti-alfa toksin antitela i fragmente
[0097] Pored aminokiselinskih sekvenci opisanih iznad, dalje su pružene nukleotidne sekvence koje odgovaraju aminokiselinskim sekvencama i kodiraju za ovde obelodanjena ljudska, humanizovana i/ili himerna antitela. Ovde su obelodanjeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je ovde opisan, ili njegove fragmenti. Ovo uključuje, ali se ne ograničava na, nukleotidne sekvence koje kodiraju gore navedene aminokiselinske sekvence. Nukleotidne sekvence su date u Primeru 11, Tabela 8. Stoga, takođe su pružene polinukleotidne sekvence koje kodiraju VH i VL okružne regione uključujući CDR i FR opisanih ovde antitela, kao i vektori eksprimiranja za njihovo efikasno eksprimiranje u ćelijama (npr., ćelijama sisara). Postupci izrade anti-alfa toksin antitela ili fragmenta koristeći polinukleotide su detaljnije opisani u nastavku.
[0098] Uključeni su i polinukleotidi koji se hibridizuju pod strogim ili nižim uslovima strogosti hibridizacije, npr., kao što je ovde definisano, na polinukleotide koji kodiraju anti-alfa toksin antitelo ili fragment. Izraz „strogost“ kad se ovde koristi odnosi se na eksperimentalne uslove (npr., temperatura i koncentracija soli) eksperimenta hibridizacije za označavanje stepena homologije između dve nukleinske kiseline; što je veća strogost, veći je procenat homologija između dve nukleinske kiseline.
[0099] Strogi uslovi hibridizacije obuhvataju, ali nisu ograničeni na, hibridizaciju do filter-vezane DNK u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45 stepeni Celzijusa, nakon čega sledi jedno ili više pranja u 0,2X SSC/0,1% SDS na oko 50- 65 stepeni Celzijusa, visoko strogi uslovi kao što je hibridizacija do filtervezane DNK u 6X SSC na oko 45 stepeni Celzijusa, nakon čega sledi jedno ili više pranja u 0,1X SSC/0,2% SDS na oko 65 stepeni Celzijusa, ili bilo koji drugi strogi uslovi hibridizacije.
[0100] Ovde je obelodanjena nukleinska kiselina ili njen fragment koji može kodirati anti-alfa toksin antitelo ili fragment i hibridizovati u strogim uslovima do nukleinske kiseline uključujući nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63.
[0101] Ovde je obelodanjena polinukleotidna sekvenca koja može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan nukleotidnoj sekvenci koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Ovde je obelodanjena polinukleotidna sekvenca koja može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ili 38. Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje uključuje nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje oko 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63.
[0102] Ovde je obelodanjena polinukleotidna sekvenca koja može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan sa VH nukleotidnom sekvencom koja kodira VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62. Ovde je obelodanjena polinukleotidna sekvenca koja može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan nukleotidnoj sekvenca VH od SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36 ili 38. Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je kodirano pomoću VH-kodirajuće nukleotidne sekvence koja sadrži najmanje oko 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti nukleotidne sekvenci koje kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 ili 62.
1
[0103] Ovde je obelodanjena polinukleotidna sekvenca koja može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment koji je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan sa VL nukleotidnom sekvencom koja kodira VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63. Ovde je obelodanjena polinukleotidna sekvenca koja može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan sa VL nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35 ili 37. Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je kodiran sa VL-kodirajućom nukleotidnom sekvencom koja sadrži najmanje 90%, 91%, 92%, 9394%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa nukleotidnom sekvencom koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 ili 63.
[0104] Ovde je obelodanjena polinukleotidna sekvenca koja može sadržati nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan VH aminokiselinskoj sekvenci i nukleotidnoj sekvenci koja kodira anti-alfa toksin antitelo ili fragment najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičan VL aminokiselinskoj sekvenci, gde su VH i VL sekvence predstavljene sa SEQ ID NO: 20 i 19; SEQ ID NO; 22 i 21; SEQ ID NO: 24 i 23; SEQ ID NO: 26 i 25; SEQ ID NO: 28 i 27; SEQ ID NO: 41 i 42; SEQ ID NO: 43 i 44; SEQ ID NO: 45 i 46; SEQ ID NO: 47 i 48; SEQ ID NO: 47 i 48; SEQ ID NO: 49 i 50; SEQ ID NO: 51 i 52; SEQ ID NO: 51 i 52; SEQ ID NO: 53 i 54; SEQ ID NO: 55 i 56; SEQ ID NO: 57 i 58; SEQ ID NO: 59 i 60; SEQ ID NO: 61 i 58; SEQ ID NO: 62 i 58; SEQ ID NO: 62 i 63; SEQ ID NO: 79 i 63.
[0105] U suštini identične sekvence mogu biti polimorfne sekvence, tj., alternativne sekvence ili aleli u populaciji. Alelna razlika može biti mala kao jedan bazni par. Značajno identične sekvence mogu takođe sadržati mutagenizovane sekvence, uključujući sekvence koje sadrže tihe mutacije. Mutacija može sadržati jednu ili više promena ostataka, uklanjanje jednog ili više ostataka, ili ubacivanje jednog ili više dodatnih ostataka.
[0106] Mogu se dobiti polinukleotidi, i nukleotidna sekvenca polinukleotida je određena bilo kojim postupkom poznatim u struci. Na primer, ako je nukleotidna sekvenca antitela poznata, polinukleotid koji kodira antitelo može se sastaviti od hemijski sintetisanih oligonukleotida, koji ukratko uključuju sintezu preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo, kalemljenje i ligiranje onih oligonukleotida, i zatim amplifikaciju ligiranih oligonukleotida pomoću PCR.
[0107] Polinukleotid koji kodira antitelo može se takođe generisati iz nukleinske kiseline iz odgovarajućeg izvora. Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira određeno antitelo nije dostupan, ali je poznata sekvenca molekula antitela, nukleinska kiselina koja kodira imunoglobulin može biti hemijski sintetisana ili dobijena iz odgovarajućeg izvora (npr., cDNK biblioteke antitela ili cDNK biblioteke generisane iz, ili nukleinske kiseline, ponekad polyA+RNK, izolovane iz bilo kog tkiva ili ćelija koji eksprimiraju antitelo, kao što su ćelije hibridoma odabrane da eksprimiraju antitelo) pomoću PCR amplifikacije pomoću sintetičkih prajmera hibridizabilnih do 3' i 5' krajeva sekvence ili kloniranjem pomoću oligonukleotidne sonde specifične za određenu sekvencu gena za identifikaciju, na primer, cDNK klon iz cDNK biblioteke koja kodira antitelo. Amplifikovane nukleinske kiseline koje generišu PCR mogu zatim biti klonirane u vektore koji se mogu replikovati, koristeći bilo koji postupak poznat u struci.
[0108] Kada se odredi nukleotidna sekvenca i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca antitela, nukleotidna sekvenca antitela može se manipulisati korišćenjem postupaka poznatih u struci za manipulaciju nukleotidnih sekvenci, npr., rekombinantne DNK tehnike, mutageneza usmerena na mesto, PCR i slično, kako bi se generisala antitela koja imaju drugu aminokiselinsku sekvencu, na primer, kako bi se stvorile aminokiselinske supstitucije, brisanja i/ili umetanja.
[0109] Kad se ovde koristi, izraz „strogi uslovi“ odnosi se na uslove za hibridizaciju i pranje. Postupci optimizacije uslova temperature reakcije hibridizacije su poznati stručnjacima. Vodeni i ne-vodeni postupci su opisane u referencama i mogu se koristiti. Neograničavajući primeri strogih uslova hibridizacije su hibridizacija u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45 stepeni Celzijusa, nakon čega sledi jedno ili više pranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS na 50 stepeni Celzijusa. Još jedan primer strogih uslova hibridizacije su hibridizacija u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45 stepeni Celzijusa, nakon čega sledi jedno ili više pranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS na 55 stepeni Celzijusa. Još jedan primer strogih uslova hibridizacije je hibridizacija u 6X natrijum hlorid/natrijum citratu (SSC) na oko 45 stepeni Celzijusa, nakon čega sledi jedno ili više pranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS na 60 stepeni Celzijusa. Često su strogi uslovi hibridizacije hibridizacija u 6X natrijum hloridu/natrijum citratu (SSC) na oko 45 stepeni Celzijusa, nakon
1
čega sledi jedno ili više pranja u 0,2X SSC, 0,1% SDS na 65 stepeni Celzijusa. Češće, uslovi strogosti su 0,5M natrijum fosfat, 7% SDS na 65 stepeni Celzijusa, i zatim jedno ili više pranja na 0,2X SSC, 1% SDS na 65 stepeni Celzijusa. Stroge temperature hibridizacije takođe mogu biti izmenjene (tj., snižene) dodavanjem određenih organskih rastvarača, na primer formamida. Organski rastvarači, poput formamida, smanjuju termičku stabilnost dvostrukih polinukleotida, tako da se hibridizacija može izvoditi na nižim temperaturama, dok se i dalje održavaju strogi uslovi i produžava rok upotrebe nukleinskih kiselina koje mogu biti toplotno labilne.
[0110] Kad se ovde koristi, izraz „hibridizacija“ ili njene gramatičke varijacije, odnosi se na vezivanje prvog molekula nukleinske kiseline na drugi molekul nukleinske kiseline u uslovima niske, srednje ili visoke strogosti, ili pod uslovima sinteze nukleinskih kiselina. Hibridizacija može uključivati primere u kojima se prvi molekul nukleinske kiseline vezuje za drugi molekul nukleinske kiseline, gde su prvi i drugi molekuli nukleinske kiseline komplementarni. Kad se ovde koristi, „specifično hibridizuje“ se odnosi na poželjnu hibridizaciju prajmera u uslovima sinteze nukleinske kiseline, do molekula nukleinske kiseline koji ima sekvencu komplementarnu prajmeru upoređenu sa hibridizacijom do molekula nukleinske kiseline koji nema komplementarnu sekvencu. Na primer, specifična hibridizacija uključuje hibridizaciju prajmera u ciljanu sekvencu nukleinske kiseline koja je komplementarna prajmeru.
[0111] Prajmeri mogu uključivati nukleotidnu subsekvencu koja može biti komplementarna sa čvrstom fazom sekvence hibridizacije nukleinske kiseline ili u suštini komplementarna sa čvrstom fazom sekvencom hibridizacije prajmera nukleinske kiseline (npr. oko 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više od 99% identična sa prajmer komplementom sekvence hibridizacije kada je poravnat). Prajmer može sadržati nukleotidnu subsekvencu koja nije komplementarna ili nije značajno komplementarna sa čvrstom fazon sekvence hibridizacije nukleinske kiseline (na primer, na 3' ili 5' kraju nukleotidne subsekvence u prajmeru komplementarnom ili suštinski komplementarnom čvrstoj fazi sekvence hibridizacije prajmera).
[0112] Prajmer može da sadrži modifikaciju kao što su inozini, abazna mesta, zaključane nukleinske kiseline, veznici malih žljebova, dupleks stabilizatori (npr. akridin, spermidin), Tm modifikatori ili bilo koji modifikator koji menja svojstva vezivanja prajmera ili sondi.
[0113] Prajmer može da sadrži detektabilni molekul ili entitet (npr., fluorofor, radioizotop, kolorimetrijski agens, česticu, enzim i slično). Kada je poželjno, nukleinska kiselina može biti modifikovana tako da uključuje detektabilnu oznaku pomoću bilo kog postupka poznatog stručnjacima. Oznaka se može uključiti kao deo sinteze, ili se dodati pre upotrebe prajmera u bilo kom od opisanih postupaka. Unošenje oznake se može izvesti u tečnoj fazi, ili u čvrstoj fazi. Detektabilna oznaka može biti korisna za detektovanje meta. Detektibilna oznaka može biti korisna za kvantifikovanje ciljane nukleinske kiseline (npr. određivanje broja kopija određene sekvence ili vrste nukleinske kiseline). Svaka detektibilna oznaka pogodna za detektovanje interakcije ili biološke aktivnosti u sistemu može se na odgovarajući način odabrati i iskoristiti od strane stručnjaka. Primeri detektabilnih oznaka su fluorescentne oznake kao što su fluorescein, rodinin i druge (npr., Anantha, i dr., Biochemistry (1998) 37:27092714; and Qu & Chaires, Methods Enzymol. (2000) 321:353369); radioaktivni izotopi (npr.1251, 1311, 35S, 31P, 32P, 33P, 14C, 3H, 7Be, 28Mg, 57Co, 65Zn, 67Cu, 68Ge, 82Sr, 83Rb, 95Tc, 96Tc, 103Pd, 109Cd, i 127Xe); oznake za raspršivanje svetlosti (npr., U.S. Patent No.6,214,560, i komercijalno dostupni od strane Genicon Sciences Corporation, California); hemiluminiscentne oznake i enzimski supstrati (npr., dioksetani i akridinium estri), enzimske ili proteinske oznake (npr., zeleni fluorescentni protein (GFP) ili njegova obojena varijanta, luciferaza, peroksidaza); druge hromogene oznake ili boje (npr., cijanin) i drugi kofaktori ili biomolekuli kao što su digoksigenin, strepdavidin, biotin (npr., članovi vezujućeg para kao što su biotin i avidin), delovi za hvatanje afiniteta, i slično. Primer može biti označen sa sličnom grupom za uzimanje afiniteta. Takođe uključene u detektabilne oznake su one oznake korisne za masovnu modifikaciju za detektovanje sa masenom spektrometrijom (npr., matrično-potpomognuta laserska desorpciona jonizacija (MALDI) masena spektrometrija i elektrosprej (ES) masena spektrometrija).
[0114] Primer može se odnositi i na polinukleotidnu sekvencu koja se hibridizuje na subsekvencu ciljane nukleinske kiseline ili drugog prajmera i olakšava detektovanje prajmera, ciljane nukleinske kiseline ili oboje, kao i, na primer sa molekularnim svetionicima. Izraz „molekularni svetionik“, kad se ovde koristi, odnosi se na detektabilni molekul, gde se detektabilna svojstva molekula mogu detektovati samo pod određenim specifičnim uslovima, čime se omogućava funkcionisanje kao specifičan i informativni signal. Neograničavajući primeri detektabilnih svojstava su, optička svojstva, električna svojstva, magnetska svojstva, hemijska svojstva i vreme ili brzina kroz otvaranje poznate veličine.
2
[0115] Molekularni svetionik može biti jednolančani oligonukleotid sposoban za formiranje strukture matične petlje, gde sekvenca petlje može biti komplementarna sekvenci ciljane nukleinske kiseline koja je od interesa i koja je okružena kratkim komplementarnim kracima koji mogu formirati stablo. Oligonukleotid se može označiti na jednom kraju sa fluoroforom, i na drugom kraju sa molekulom za gašenje. U konformaciji matične petlje, energija iz pobuđenog fluorofora prenosi se u molekul za gašenje pomoću dalekosežne dipoldipol spojnice slične onoj koja se vidi u prenosu energije fluorescentne rezonance, ili FRET, i oslobađa se kao toplota umesto svetlosti. Kada se sekvenca petlje hibridizuje sa specifičnom ciljanom sekvencom, dva kraja molekula su odvojena, i energija iz pobuđenog fluorofora emituje se kao svetlost, stvarajući detektabilni signal. Molekularni svetionici nude dodatnu prednost jer je uklanjanje viška sonde nepotrebno zbog prirodne nehidrogenizovane sonde. Sonde molekularnog signala mogu biti dizajnirane da diskriminišu ili tolerišu neusklađenost između petlje i ciljanih sekvenci modulacijom relativnih jačina hibridizacije petlje i formiranja stabla. Kao što je ovde pomenuto, izraz „neusaglašeni nukleotid“ ili „neusklađenost“ odnosi se na nukleotid koji nije komplementaran ciljanoj sekvenci na tom položaju ili položajima. Sonda može imati najmanje jednu neusklađenost, ali može imati i 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 ili više neusaglašenih nukleotida.
Biološke karakteristike anti-alfa toksin antitela i fragmenata
[0116] Antitelo može imati jednu ili više karakteristika identičnih ili sličnih antitelima koja su ovde opisana, i često poseduje jednu ili više bioloških karakteristika koje ga izdvajaju od drugih antitela koja se vezuju za isti antigen, alfa toksin. Kad se ovde koristi, „biološke karakteristike“ antitela se odnose na bilo koju ili više biohemijskih, vezivnih i funkcionalnih karakteristika, koje se mogu koristiti za odabir antitela za terapijske, istraživačke i dijagnostičke upotrebe. Na primer, anti-alfa toksin antitela i fragmenti mogu biti isti ili različiti u odnosu na vezivanje epitopa, ciljanje, afinitet, neutralizaciju i inhibiciju oligomerizacije ili formiranja kompleksa pora heptamera, npr.
[0117] Biohemijske karakteristike anti-alfa toksin antitela ili fragmenta uključuju, ali nisu ograničene na, izoelektričnu tačku (pl) i temperaturu topljenja (Tm). Karakteristične karakteristike anti-alfa toksin antitela ili fragmenta uključuju, ali se ne ograničavaju na specifičnost vezivanja; konstanta disociacije (Kd) ili njena inverzna konstanta asocijacije (Ka) ili njene komponente konili koffstope; epitop na koji se vezuje; sposobnost razdvajanja različitih oblika i/ili sastava od alfa toksina (npr., rekombinantni, nativni, acetilovani) i sposobnost vezivanja rastvorljivog i/ili imobilizovanog antigena. Ovde predstavljene funkcionalne karakteristike antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, inhibiciju vezivanja alfa toksin receptora, inhibiciju oligomerizacije alfa toksina, inhibiciju eksprimiranja gena izazvanih kaskadnim reakcijama koje se odražavaju na eksprimiranje ili aktivnost alfa toksina, iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju alfa toksin, inhibiciju rasta ćelija koji eksprimiraju alfa toksin, inhibiciju lokalizacije alfa toksina i zaštitu u jednoj ili više od S. aureus, alfa toksin ili S. aureus i bolesti ili poremećaji vezani za alfa toksin. Ovde su opisane osobine anti-alfa toksin antitela i fragmenata i postupci za modifikovanje i fino podešavanje ovih karakteristika. Postupci merenja karakteristika antitela poznati su u struci, od kojih su neke detaljnije opisane u nastavku.
Karakteristike vezivanja
[0118] Kao što je prethodno opisano, anti-alfa toksin antitelo ili fragment imunospecifično vezuju najmanje jedan specifični epitop ili antigene determinante proteina, peptida, podjedinica, fragmenta, dela ili bilo koje njihove kombinacije isključivo ili poželjno u odnosu na druge polipeptide. Izraz „epitop“ ili „antigenska determinanta“, kad se ovde koristi, odnosi se na determinant proteina sposoban za vezivanje za antitelo, gde se izraz „vezivanje“ ovde često odnosi na specifično vezivanje. Ove determinante proteina ili epitopa često uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline ili lanci bočnih šećera, koji često imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i često imaju specifične karakteristike punjenja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za drugi, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Izraz „diskontinuirani epitop“, kad se ovde koristi, odnosi se na konformacioni epitop na proteinskom antigenu formiran od najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci proteina.
[0119] Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje se imunospecifično vezuje za Staphylococcus aureus alfa toksin i njegovi antigenski fragmenti povezani sa oligomerizacijom alfa toksina. Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje se imunospecifično vezuje za alfa toksin, ili najmanje bilo koja tri susedne aminokiselina SEQ ID NO: 39 ili 40. Ovde je obelodanjen epitop koji sadrži najmanje 4 aminokiselinska ostatka, najmanje 5 aminokiselinskih ostataka, najmanje 6 aminokiselinskih ostataka, najmanje 7 aminokiselinskih ostataka, najmanje 8 aminokiselinskih ostataka ili najmanje 9 aminokiselinskih ostataka za celokupan specifičan deo susednih aminokiselina proteina alfa toksina. Ovde su obelodanjeni ostaci koji sadrže T261, T263, N264, K266 i K271. U nastavku su prikazani ostaci koji sadrže N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 i R200 od SEQ ID NO: 39. Ovde su obelodanjeni dodirni ostaci koji sadrže N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 i K271 SEQ ID NO: 39. Deo alfa toksina u dodiru sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom može sadržati aminokiseline 261-272 SEQ ID NO: 39, aminokiseline 248-277 SEQ ID NO: 39 ili aminokiseline 173-201 i 261-272 SEQ ID NO: 39.
[0120] Ovde su obelodanjena anti-alfa toksin antitela ili njihovi fragmenti koji su povezani sa oligomerizacijom alfa toksina, koji imunospecifično vezuju polipeptid alfa toksina ili njegov antigenski fragment, koji ima najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95% identičnosti ili 100% identičnosti, sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 39 ili 40. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment se ponekad može imunospecifično vezati za polipeptid alfa toksina ili njegov antigenski fragment, 94%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti ili 100% identičnosti, sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 39 ili 40.
[0121] Ovde su obelodanjeni anti-alfa toksin antitelo ili fragmenti koji mogu vezati epitop koji je konzervisan u različitim vrstama. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu vezati S. aureus alfa toksin i homologe ili ortologe alfa toksina iz drugih bakterijskih vrsta, i njihove antigenske fragmente. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment se mogu vezati za jedan ili više ortologa i ili izoforma alfa toksina. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment se mogu vezati za alfa toksin i njegove antigenske fragmente povezane sa oligomerizacijom alfa toksina iz jedne ili više vrsta bakterija koja poseduje homologe ili ortologe alfa toksina. Anti-alfa toksin antitela ili fragmenti mogu da se vezuju epitopom unutar Staphylococcus ili drugih blisko povezanih bakterija preko alfa toksin homologa i/ili izoformi i/ili konformacionih varijanti i/ili podtipova.
[0122] Interakcije između antigena i antitela često su iste kao i kod drugih nekovalentnih protein-protein interakcija. Generalno postoje četiri vrste vezujućih interakcija između antigena i antitela: (i) vodonične veze, (ii) disperzione sile, (iii) elektrostatičke sile između Luisovih kiselina i Luisovih baza, i (iv) hidrofobne interakcije. Hidrofobne interakcije su značajna pokretačka snaga za antitelo-antigen interakcije i zasnivaju se na odbacivanju vode od strane nepolarnih grupa, umesto na privlačenje molekula. Međutim, određene fizičke sile takođe doprinose antigen-antitelo vezivanju, na primer, uklopljeni ili komplementarni oblici epitopa sa različitim mestima vezivanja antitela. Drugi materijali i antigeni mogu reagovati sa antitelom, čime se nadmeću za dostupno antitelo.
[0123] Merenje afinitetne konstante i specifičnosti vezivanja između antigena i antitela često je element u određivanju efikasnosti terapeutskih, dijagnostičkih i istraživačkih postupaka koristeći anti-alfa toksin antitela i fragmente. „afinitet vezivanja“ se uglavnom odnosi na jačinu ukupnog broja nekovalentnih interakcija između jednog vezujućeg mesta molekula (npr., antitelo) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigen). Osim ako nije drugačije naznačeno, kad se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ odnosi se na inherentni afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr., antitela i antigena). Afinitet molekula X za svog partnera Y može se generalno predstaviti konstantom ravnotežne disociacije (Kd), koja se računa kao koff/kon odnos. Afinitet se može izmeriti uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane i prikazane ovde (npr., BiaCore postupci). Antitela sa niskim afinitetom uglavnom se spajaju antigenom, i teže da se lako disociraju, dok antitela sa visokim afinitetom uglavnom vezuju antigen brže, i imaju tendenciju da ostanu vezana duže. Različiti postupci za merenje vezivanja afiniteta su poznati u struci, od kojih se bilo koji može koristiti za potrebe ove tehnologije.
[0124] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment ponekad ima afinitet vezivanja za epitop alfa toksina koji se karakteriše konstantom disociacije (Kd) od 1×10<-2>M ili manje, 1×10<-3>M ili manje, 1×10<-4>M ili manje, 1×10<-5>M ili manje, 1×10<-6>M ili manje, 1×10<-7>M ili manje, 1×10<-8>M ili manje, 1×10<-9>M ili manje, 1×10<-10>M ili manje, 1×10<-11>M ili manje, 1×10<-12>M ili manje, 1×10<-13>M ili manje, 1×10<-14>M ili manje or 1×10<-15>M ili manje. Na primer, Kdmože biti od 1×10<-15>M do 1×10<-2>M, od 1×10<-14>M do 1×10<-10>M, od 1×10<-9>M do 1×10<-5>M i od 1×10<-4>M do 1×10<-2>M.
[0125] Ovde su obelodanjena anti-alfa toksin antitela i fragmenti koji su visoko afinitetno antitelo. Pod „visoko afinitetnim antitelom“ se misli na antitelo koje se vezuje za epitop alfa toksina sa afinitetom manjim od 10<-8>M (npr., 10<-9>M, 10<-10>M, i slično).
[0126] Ovde su obelodanjeni anti-alfa toksin antitelo ili fragment koji su opisani kao afinitet vezivanja specifične molarnosti ili bolje. „Ili bolje“, kada se ovde koristi, odnosi se na jače vezivanje, koje predstavlja manja numerička vrednost Kd. Na primer, antitelo koje ima afinitet za antigen od „0,6 nM ili bolji“, afinitet antitela za antigen je <0,6 nM, tj., 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM i slično, ili bilo koja vrednost manja od 0,6 nM.
[0127] Afinitet anti-alfa toksin antitela ili fragmenta može se opisati u smislu konstante asocijacije (Ka), koji se računa kao kon/koff odnos. U ovom slučaju postojeća anti-alfa toksin antitela i fragmenti imaju afinitet vezivanja za epitop alfa toksina koji uključuje konstantu asocijacije (Ka) od 1×10<2>M<-1>ili više, 1×10<3>M<-1>ili više, 1×10M<-1>ili više, 1×10<5>M<-1>ili više, 1×10<6>M<-1>ili više , 1×10<7>M<-1>ili više, 1×10<8>M<-1>ili više , 1×10<9>M<-1>ili više , 1×10<10>M<-1>ili više 1×10<11>M<-1>ili više 1×10<12>M<-1>ili više, 1×10<13>M<-1>ili više, 1×10<14>M<-1>ili više or 1×10<15>M<-1>ili više. Na primer, Kamože biti od 1×10<2>M<-1>do 1×10<7>M<-1>, od 1×10<7>M<-1>do 1×10<10>M<-1>, i od 1×10<10>M<-1>do 1×10<15>M<-1>.
[0128] U određenim otelotvorenjima stopa kojom se anti-alfa toksin antitelo ili fragment može disocirati od epitopa alfa toksina može biti relevantna. U nekim otelotvorenjima, anti-alfa toksin antitelo ili fragment se mogu vezati za alfa toksin sa koffod manje od 10<-3>s<-1>, manje od 5x10<-3>s<-1>, manje od 10<-4>s<-1>, manje od 5x10<-4>s<-1>, ili manje od 10<-5>s<-1>. Stopa pri kojoj se anti-alfa toksin antitela i fragmenti vezuju sa epitopom alfa toksina može biti relevantnija od vrednosti Kdili Ka. U ovom slučaju postojeća anti-alfa toksin antitela i fragmenti se vezuju za alfa toksin sa stopom konod barem 10<-4>M<-1>s<-1>, barem 5 x 10<-4>M<-1>s<-1>, barem 10<5>M<-1>s<-1>, barem 5 x10<5>M<-1>s<-1>, barem 106 M<-1>s<-1>, barem 5 x 10<6>M<-1>s<-1>, barem 10<7>M<-1>s<-1>.
[0129] Određivanje afiniteta vezivanja može se izmeriti korišćenjem specifičnih tehnika koje su dalje opisane u odeljku Primera, pogledati Primer 1 i postupke poznate u struci. Jedan primer takvog postupka uključuje merenje konstante razdruživanja „Kd“ radiooznačenim testom vezivanja antigena (RIA) izvedenog sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena kao što je opisano u sledećem testu koji meri rastvor koji vezuje afinitet Faba za antigen ujednačavajući Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) označenog antigena u prisustvu serije titracija neoznačenog antigena, i zatim hvatanjem vezanih antigena sa pločom obloženom anti-Fab antitelom. kako bi se uspostavili uslovi za test, mikrotitarske ploče (Dynex) su prekrivene preko noći sa 5 μg/ml antitela za hvatanje anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (H 9,6), i zatim su blokirane sa 2% (w/v) goveđeg serum albumina u PBS u trajanju od dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23 stepeni Celzijusa). U ne-adsorbentnoj ploči (Nunc # 269620), 100 pM ili 26 pM [125I]-antigen se mešaju sa serijskim razblaženjima Fab od interesa. Fab od interesa se onda inkubira preko noći; međutim, inkubacija se može nastaviti duži vremenski period (npr., 65 sati) kako bi se osiguralo postizanje ravnoteže. Posle toga smeše se prenose na ploču za hvatanje za inkubaciju na sobnoj temperaturi (npr., tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja, i ploča se ispira osam puta sa 0,1% Tween-20 u PBS. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 μl/izvorište od scintilanta (MicroScint-20; Packard), i ploče se računaju na Topcount gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Faba koje daju manje ili jednako od 20% maksimalnog vezivanja su odabrane za upotrebu u kompetetivnim testovima vezivanja.
[0130] U drugom slučaju, Kdvrednost se može meriti pomoću ispitivanja površinske plazmonske rezonance, koja se može izvršiti, na primer, koristeći BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) na 25 stepeni Celzijusa sa imobilizovanim antigen CM5 čipovima na ∼10 jedinica za odgovor (RU). Ukratko, na primeru takvog postupka, aktivirani su karboksimetilovani dekstran biosenzor čipovi (CM5, BIAcore Inc.) sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) po uputstvima dobavljača. Antigen se razblažuje sa 110 mM natrijum acetata, pH 4,8, u 5 μg/microliteru (~0,2 uM) pre injektiranja sa brzinom protoka od 5 μl/min, kako bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) spojenog proteina. Nakon injekcije antigena, IM etanolamin se injektira u bloka nereagovanih grupa. Za merenja kinetike, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) se injektira u PBS sa 0,05% Tween 20 (PBST) na 25 stepeni Celzijusa pri protoku od približno 25 μl/min. Stopa asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) izračunavaju se pomoću jednostavnog modela vezivanja Langmuir (BIAcore Evaluation Software verzija 3,2), istovremeno prilagođavajući asocijaciju i dispanzioni senzor.
[0131] Ako on-stopa prelazi 10<6>M-1 s-1 pomoću testa površinske plazmonske rezonance iznad, onda se onstopa može odrediti korišćenjem fluorescentne tehnike gašenja, na primer, onom koja meri porast ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuđivanje = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm band-pass) na 25 stepeni Celzijusa od 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen sa stop-flow (Aviv
2
Instruments) ili 8000-series SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa crvenom kivetom za mešanje. „On-stopa“ ili „stopa udruživanja“ ili „ stopa asocijacije“ ili „kon“ u skladu sa ovom tehnologijom takođe se može odrediti sa istom gore opisanom tehnikom površinske plazmonske rezonance korišćenjem BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey), kao što je gore opisano.
[0132] Postupci i reagensi pogodni za određivanje vezivnih karakteristika izolovanog antitela ili njegovog fragmenta vezujućeg antigena ili njegovog izmenjenog/mutiranog derivata (koji su razmatrani u nastavku), su poznati u struci i/ili su dostupni na tržištu. Oprema i softver dizajnirani za takve kinetičke analize su komercijalno dostupni (npr. Instrumenti Biacore® A100 i Biacore® 2000; Biacore International AB, Uppsala, Švedska).
[0133] Ovde je obuhvaćena analiza vezivanja koja se može izvesti kao analiza direktnog vezivanja ili kao analiza kompetetivnog vezivanja. Vezivanje se može detektovati pomoću standardnih ELISA ili standardnih analiza protočne citometrije. U direktnom testu vezivanja, kandidat antitelo se testira za vezivanje za alfa toksin antigen. Testiranje kompetetivnog vezivanja, s druge strane, procenjuje sposobnost kandidat antitela da se nadmeće sa poznatim anti-alfa toksin antitelom ili fragmentom ili drugim jedinjenjem koja se vezuje za alfa toksin (npr., receptor, inhibitor). Uopšteno, bilo koji postupak koji dozvoljava vezivanje antitela sa alfa toksinom koji se može detektovati obuhvaćen je rasponom postojeće tehnologije za detektovanje i merenje karakteristika vezivanja antitela. Ovi postupci se takođe mogu koristiti za skrining panela antitela kako bi se pronašla ona koja pružaju željenu karakteristiku.
[0134] Ovde prikazano izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se imunospecifično vezuje za alfa toksin, i ima jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja se sastoji od:
(a) konstanta afiniteta (KD) za alfa toksin od oko 13 nM ili manje;
(b) se vezuje za monomere alfa toksina, ali ne inhibira vezivanje alfa toksina na alfa toksin receptor;
(c) inhibira formiranje oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%;
(d) smanjuje alfa toksin citolitičku aktivnost za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% (npr., kao što je utvrđeno pomoću testova ćelijske lize, dodavanja hemolize);
(e) smanjuje infiltraciju ćelija i proupalno oslobađanje citokina (npr., u životinjskom modelu upale pluća).
[0135] Ovde su obelodanjena izolovana antitela ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuju antigen (npr., alfa toksin) sa afinitetom koji karakteriše konstanta disociacije (KD) u rasponu od oko 0,01 nM do oko 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30nM ili 40 nM.
Funkcionalne karakteristike
[0136] Ovde su obelodanjeni anti-alfa toksin antitelo ili fragment koji menjaju biološka svojstva ćelija koje eksprimiraju alfa toksin i/ili alfa toksin. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment može neutralisati biološku aktivnost alfa toksina vezivanjem za polipeptid i inhibiranjem sakupljanja monomera alfa toksina u transmembransku poru (npr. heptamer alfa toksina). Testovi neutralizacije se mogu izvesti korišćenjem postupaka poznatih u struci korišćenjem, u nekim okolnostima, komercijalno dostupnih reagensa.
Neutralizacija alfa toksina često se meri sa IC50 od 1×10<-6>M ili manje, 1×10<-7>M ili manje, 1×10<-8>M ili manje, 1×10<-9>M ili manje, 1×10<-10>M ili manje i 1×10<-11>M ili manje. Neutralizacija se može dogoditi kada su antitelo ili antigen vezujući fragment koji se imunospecifično vezuje za S. aureus alfa toksin u koncentraciji kao što je opisano u Primerima 3-6. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu neutralisati sposobnost alfa toksina da oligomerizuje i formira transmembransku poru. Izraz „inhibitorna koncentracija 50%“ (skraćeno kao „IC50“) predstavlja koncentraciju inhibitora (npr., anti-alfa toksin antitelo ili fragment koji su ovde pruženi) koji je potreban za 50% inhibiciju date aktivnosti inhibitornih meta molekula (npr. oligomeri alfa toksinazacija formiraju heptamer kompleks transmembranskih pora). Niža vrednost IC50 generalno odgovara potentnijim inhibitorima.
[0137] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment može inhibirati jednu ili više bioloških aktivnosti alfa toksina. Izraz „inhibicija“ kad se ovde koristi, odnosi se na bilo koji statistički značajno smanjenje biološke aktivnosti, uključujući potpunu blokadu aktivnosti. Na primer, „inhibicija“ može se odnositi na smanjenje od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% u biološkoj aktivnosti. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu inhibirati jednu ili više bioloških aktivnosti alfa toksina za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0138] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu iscrpeti alfa toksin koji se luči patogenom S. aureus. Antialfa toksin antitelo ili fragment mogu postići najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100% iscrpljivanja alfa toksina koji se izlučuje S. aureus. U slučajevima cerziaina, praktično sav detektabilno izlučeni alfa toksin je iscrpljen iz ćelija inficiranih sa S. aureus.
[0139] Ovde je obelodanjeno anti-alfa toksin antitelo ili fragment koji može inhibirati in vitro stimulisanu aktivnost alfa toksina (npr., vezivanje receptora, oligomerizacija) i/ili proliferaciju ćelija koje eksprimiraju ili luče alfa toksin. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment ponekad inhibiraju in vitro aktivnost alfa toksina, S. aureus patogenost za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50% ili najmanje oko 75%. Postupci za merenje proliferacije ćelija, patogenosti i aktivnosti alfa hemolizina poznati su u struci.
[0140] Ovde su obelodanjeni anti-alfa toksin antitelo ili fragment koji mogu inhibirati eksprimiranje jednog ili više inducibilnih gena koji direktno ili indirektno reaguju na okruženje stvoreno od strane S. aureus infekcije i/ili alfa toksin eksprimiranja i funkcije. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu inhibirati eksprimiranje jednog ili više inducibilnih gena koji direktno ili indirektno reaguju na okruženje stvoreno od strane S. aureus infekcije i/ili alfa toksina za najmanje 20%, za najmanje 30%, za najmanje 40%, za najmanje 50%, za najmanje 60%, za najmanje 70%, za najmanje 80%, za najmanje 90%, za najmanje 100%, za najmanje 120%, za najmanje 140%, za najmanje 160%, za najmanje 180% ili za najmanje 200%.
Proizvodnja anti-alfa toksin antitela i fragmenata
[0141] Sledi opis primerne tehnike za proizvodnju antitela. Alfa toksin antigen koji se koristi za proizvodnju antitela može biti peptidni fragment koji, na primer, uključuje region alfa toksin peptidne sekvence uključene u oligomerizaciju. Anti-alfa toksin antitela mogu se generisati koristeći matični S. aureus alfa toksin koji sadrži SEQ ID NO: 39 ili mutant alfa toksin koji sadrži SEQ ID NO: 40, varijantu ili njegov antigenski fragment. S. aureus ćelije koje eksprimiraju i luče alfa toksin takođe se mogu koristiti za stvaranje antitela. Primeri nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci alfa toksina dostupni su na primer kako su navedene u Tabeli 10. Alfa toksin se može dobiti rekombinantno u izolovanom obliku od bakterijskih ili eukariotskih ćelija koristeći standardan postupak rekombinantne DNK. Alfa toksin se može eksprimirati kao označeni (npr., oznaka epitopa) ili drugi fuzioni protein (npr., GST fuzija) kako bi se olakšala izolacija, kao i identifikacija u različitim testovima. Antitela ili vezujući proteini koji se vezuju za različite oznake i fuzionu sekvencu su dostupni kako je detaljno razrađeno u nastavku. Mogu se koristiti i drugi oblici alfa toksina koji su korisni za stvaranje antitela.
[0142] Različiti polipeptidi oznake i njihova odgovarajuća antitela su poznati u struci. Primeri uključuju polihistidin (poly-his) ili poli-histidin-glicin (poly-his-gli) oznake; grip HA polipeptid oznaku i njena antitela 12CA5; c- myc oznaku i antitela 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10; i herpes simpleks virus glikoprotein D (gD) oznake i njenog antitelo. FLAG-peptid se prepoznaje od strane anti-FLAG M2 monoklonskog antitela. Prečišćavanje proteina koji sadrži FLAG peptid može se obaviti pomoću imunoafinitetne hromatografije koristeći matricu afiniteta koja sadrži anti-FLAG M2 monoklonsko antitelo kovalentno vezano za agarozu. Ostale polipeptid oznake uključuju KT3 epitop peptid; α-tubulin epitop peptid; i T7 gen 10 protein peptid oznaku.
[0143] Poliklonska antitela za antigen od interesa mogu se proizvoditi različitim postupcima poznatim u struci. Na primer, polipeptid alfa toksina ili njegov imunogeni fragment mogu se primenjivati različitim domaćim životinjama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, zečeve, miševe, pacove i slično, kako bi indukovali proizvodnju sera koje sadrže poliklonska antitela specifična za antigen. Različiti adjuvanti se mogu koristiti za povećanje imunog odgovora u zavisnosti od vrste domaćina i uključuju, ali nisu ograničeni na, Frojndove (potpune i nepotpune) mineralne gelove kao što su aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronski polioli, polianoni, peptidi, uljane emulzije, hemocijanini, dinitrofenol i potencijalno korisni ljudski adjuvanti kao što su be-se-že (bacil Kalmet-Gerina) i Corynebacterium parvum. Takvi adjuvanti su takođe poznati u struci.
[0144] Poliklonska antitela mogu se uzgajati kod životinja putem multiple subkutane (sc) ili intraperitonealne (ip) injekcije relevantnog antigena i adjuvanta. Može biti korisno konjugovati relevantni antigen (naročito kada se koriste sintetički peptidi) za protein koji je imunogen u vrstama koje treba imunizovati. Na primer, antigen može biti konjugovan na ključaonica limpet hemocijanin (KLH), serumski albumin, goveđi tiroglobulin ili inhibitor trizina soje, koristeći bifunkcionalni ili derivatizujući agens (reaktivna grupa), npr., aktiviran estar (konjugacija preko ostataka cisteina ili lizina), glutaraldehida,
2
sukcinskog anhidrida, SOCI2 ili R1N=C=NR, gde su R i R1 različite alkilne grupe. Konjugati takođe mogu biti napravljeni u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao fuzioni proteini.
[0145] Tipično su životinje imunizovane protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombinovanjem odgovarajuće koncentracije antigena ili konjugata sa adjuvantom i injektiranjem rastvora na više mesta. Imunizacije se takođe mogu izvesti kao što je opisano u Primeru 1 (generisanje imunizacije/hibridoma).
[0146] Monoklonska antitela se mogu pripremiti koristeći širok spektar tehnika poznatih u struci, uključujući upotrebu tehnologija hibridoma, rekombinantnih tehnologija i tehnologija prikaza faga ili njihovih kombinacija. Izraz „monoklonsko antitelo“, kad se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno od populacije u suštinski homogenih ili izolovanih antitela, npr., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična osim za moguće prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jednog antigenskog mesta ili više antigenskih mesta u slučaju multispecifičnih dizajniranih antitela. Osim toga, za razliku od sastava poliklonskih antitela koji uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv iste determinante antigena. Pored njihove specifičnosti, monoklonska antitela su pogodna po tome što se mogu sintetisati nekontaminirana drugim antitelima. Modifikator „monoklonski“ ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Sledi opis reprezentativnih postupaka za proizvodnju monoklonskih antitela koji nije namenjena ograničavanju, i može se koristiti za proizvodnju, na primer, monoklonskih sisarskih, himernih, humanizovanih, ljudskih, domenskih, dijatela, vakcitela, linearnih i multispecifičnih antitela.
[0147] Postupci za proizvodnju i skrining za specifična antitela korišćenjem tehnologije hibridoma su rutinski i poznati u struci. U postupku hibridoma, miševi ili druge odgovarajuće životinje domaćini, kao što je hrčak, imunizuju se kako je opisano u prethodnom tekstu kako bi se izrodili limfociti koji proizvode, ili mogu da proizvode antitela koja će se specifično vezati za antigen koji se koristi za imunizaciju.
Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. Nakon imunizacije, limfociti su izolovani i zatim spojeni sa ćelijskom linijom mijeloma koristeći pogodan fuzioni agens ili fuzionu supstancu, kao što je polietilen glikol, kako bi se formirala hibridoma ćelija. Odabrane ćelije mijeloma mogu biti one koje efikasno fuzionišu, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela na visokom nivou od strane odabranih ćelija za proizvodnju antitela, i osetljive su na selektivni medijum koji bira protiv nefuzionisanih roditeljskih ćelija. U jednom aspektu, ćelijske linije mijeloma su mišje linije mijeloma, poput onih izvedenih iz tumora MOPC-21 i MPC-11 miševa dostupnih od Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, i SP-2 i derivati npr., X63-Ag8-653 ćelije koje su dostupne od strane American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Ljudske mijeloma i mišje-ljudske heteromijeloma ćelijske linije takođe su opisane za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela.
[0148] Kada se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti subklonirani ograničavajućim procedurama rastvaranja i mogu se uzgajati standardnim postupcima. Pogodni medijumi za kulturu za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 medijum. Pored toga, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao asciti tumori u životinjama npr., pomoću i.p. injektiranja ćelija u miševe.
[0149] Monoklonska antitela koja se luče od strane subklonova su odgovarajuće odvojena od medijuma kulture, ascitne tečnosti ili seruma, konvencionalnim procedurama prečišćavanja antitela kao što je, na primer, afinitetna hromatografija (npr., upotrebom proteina A ili protein G-Sefaroze) ili hromatografije jonske razmene, afinitetnih oznaka, hromatografije hidroksilapatita, elektroforeze gela, dijalize i slično. Primeri postupaka prečišćavanja su detaljnije opisani u nastavku.
Rekombinantne DNK tehnike
[0150] Postupci za proizvodnju i skrining za specifična antitela korišćenjem rekombinantne DNK tehnologije su rutinski i poznati su u struci. DNK koja kodira monoklonska antitela može se lako izolovati i/ili sekvencionirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance muških antitela). Jednom izolovana, DNK se može staviti u vektore eksprimiranja, koji se onda transfektuju u ćelije domaćina kao što su E. coli ćelije, simijanske COS ćelije, ćelije kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode antitelo protein, kako bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Kao što je opisano u daljem tekstu za antitela koja generiše prikaz faga i humanizaciju antitela, DNK ili genetski materijal za rekombinantna antitela može se dobiti od drugih izvora osim hibridoma, kako bi se proizvelo anti-alfa toksin antitelo ili fragment.
2
[0151] Rekombinantno eksprimiranje antitela ili njegove varijante često zahteva izgradnju vektora eksprimiranja koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo. Ovde su navedeni vektori, koji se mogu replicirati, koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira molekul antitela, teški ili laki lanac antitela, varijabilni domen teškog ili lakog lanca antitela ili njegovog dela, ili CDR teškog ili lakog lanca, operativno povezan sa promoter. Takvi vektori mogu uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela i varijabilni domen antitela može biti kloniran u takav vektor za eksprimiranje celokupnog teškog, celokupnog lakog lanca ili i teškog i lakog lanca.
[0152] Kada se vektor eksprimiranja prenese u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama, transfekovane ćelije potom se kultivišu konvencionalnim tehnikama kako bi se proizvelo antitelo. Prema tome, ovde su navedene ćelije domaćinstva koje sadrže polinukleotid koji kodira izolovano antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, ili njegove fragmente, ili njegov težak ili laki lanac ili njegov deo, ili jednolančano antitelo, operativno povezano sa heterolognim promoterom. Za eksprimiranje dvolančanih antitela, vektori koji kodiraju teške i lake lance mogu biti ko-eksprimirani u ćeliji domaćinu za eksprimiranje celokupnog molekula imunoglobulina, kako je detaljno opisano u nastavku.
[0153] Ćelijske linije sisara koje su dostupne kao domaćini za eksprimiranje rekombinantnih antitela poznate su u struci, i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije koje su dostupne of American Type Culture Collection (ATCC), uključujući, ali ne ograničavajući se na, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega beba hrčaka (BHK), ćelija bubrega majmuna (COS), ćelija ljudske hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), ljudske epitelne bubrežne 293 ćelije, i niz drugih ćelijskih linija. Različite ćelije domaćina imaju karakteristične i specifične mehanizme za post-translacijsku obradu i modifikaciju proteina i proizvoda gena. Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu se odabrati kako bi se osigurala pravilna modifikacija i obrada antitela ili njegovog eksprimiranog dela. U tom cilju, mogu se koristiti eukariotske ćelije domaćini koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog proizvoda. Takve sisarske ćelije domaćini uključuju, ali nisu ograničene na CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, NS0 (mišja ćelijska linija mijeloma, koja ne endogeno proizvodi bilo koji funkcionalni lanac imunoglobulina), SP20, CRL7O3O i HsS78Bst ćelije. Ljudske ćelijske linije koje razvijaju imortalizujući ljudske limfocite mogu se koristiti za rekombinantno proizvodnju monoklonskih antitela. Ljudska ćelijska linija PER.C6. (Crucell, Netherlands) se može koristiti za rekombinantnu proizvodnju monoklonskih antitela.
[0154] Dodatne ćelijske linije koje se mogu koristiti kao domaćini za eksprimiranje rekombinantnih antitela obuhvataju, ali nisu ograničene na, ćelije insekata (npr., Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) ili ćelije kvasca (npr., S. cerevisiae, Pichia, US7326681; itd.), biljne ćelija (US20080066200); i kokošije ćelije.
[0155] Antitela koja su ovde obelodanjena mogu se eksprimirati u ćelijskoj liniji sa stabilnim eksprimiranjem antitela. Stabilno eksprimiranje može se koristiti za dugoročnu, proizvodnju rekombinantnih proteina visokog prinosa. Na primer, mogu se generisati ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju molekul antitela. Ćelije domaćini mogu se transformisati pomoću odgovarajućeg injektirano vektora koji sadrži kontrolne elemente eksprimiranja (npr., promoter, pojačivač, terminatore transkripcije, lokacije poliadenilacije i slično) i selektivni markerski gen. Nakon uvođenja strane DNK, ćelijama se može dozvoliti da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu, i zatim se prebacuju na selektivni medijum. Selektabilni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpor selekciji i dozvoljava ćelijama koje stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome da rastu i formiraju fokuse koje se mogu klonirati i proširiti u ćelijske linije. Postupci za proizvodnju stabilnih ćelijskih linija sa visokim prinosom su poznati u struci, i reagensi su uglavnom dostupni komercijalno.
[0156] Ovde obelodanjena antitela mogu biti eksprimirana u ćelijskoj liniji sa tranzijentnim eksprimiranjem antitela. Tranzijentna transfekcija je proces u kom se nukleinska kiselina koja se unosi u ćeliju ne integriršeu genome ili hromozomsku DNK te ćelije. Nukleinska kiselina se često održava kao ekstrahromosomski element, npr., kao epizom, u ćeliji. Transakcioni procesi nukleinske kiseline epizoma nisu pogođeni, i proizveden je protein kog kodira nukleinska kiselina epizoma.
[0157] Ćelijska linija, koja može biti stabilna ili tranzijentno transfekovana, održava se u medijumu ćelijske kulture i pod uslovima poznatim u struci koji rezultuju eksprimiranjem i proizvodnjom monoklonskih antitela. Medijum ćelijske kulture sisara može biti baziran na komercijalno dostupnim medijskim formulacijama, uključujući, na primer, DMEM ili Ham's F12. Medijum ćelijske kulture se može modifikovati kako bi se podržalo povećanje rasta ćelija i eksprimiranja bioloških proteina. Kad se ovde koristi, pojmovi „medijum ćelijske kulture“, „medijum za kulturu“ i „formulacija medijuma“ odnose se na
2
nutritivni rastvor za održavanje, rast, propagaciju ili širenje ćelija u veštačkom in vitro okruženju van višećelijskog organizma ili tkiva. Medijum ćelijske kulture može biti optimizovan za specifičnu upotrebu ćelijske kulture, uključujući, na primer, medijum za rast ćelijske kulture koji je formulisan da promoviše ćelijski rast ili medijum za proizvodnju ćelijske kulture koji je formulisan da promoviše proizvodnju rekombinantnog proteina. Izrazi nutrijent, sastojak i komponenta se ovde koriste međusobno zamenjivo kako bi se odnosili na sastojke koji čine sredinu ćelijske kulture.
[0158] Ćelijske linije mogu da se održavaju korišćenjem serije hranjenja. Kad se ovde koristi, „postupak serije hranjenja“ se odnosi na postupak kojim se serijski hranjena ćelijska kultura dobija sa dodatnim hranjivim materijama nakon što se prvo inkubira bazalnim medijumom. Na primer, postupak serije hranjenja može sadržati dodavanje dodatnog medijuma prema određenom rasporedu hranjenja u datom vremenskom periodu. Tako se „serijski hranjena ćelijska kultura“ odnosi na ćelijsku kulturu u kojoj se ćelije, tipično sisarske, i medijum kulture najpre stavljaju u posudu za kultivaciju, i dodatni hranljivi sastojci se dodaju kulturi tokom kultivacije, kontinuirano ili sa diskretnim povećanjima, sa ili bez periodičnog prikupljanja ćelije i/ili proizvoda pre terminacije kulture.
[0159] Korišćeni medijuma ćelijske kulture i hranljivi sastojci sadržani u njima su poznati u struci. Medijum ćelijske kulture može sadržati bazalni medijum i najmanje jedan hidrolizat, npr., hidrolizat na osnovu soje, hidrolizat na osnovu kvasca ili kombinacija dva tipa hidrolizata koji rezultuju modifikovanim bazalnim medijumom. Dodatni nutrijenti mogu ponekad da sadrže samo bazalni medijum, kao što je koncentrovani bazalni medijum, ili mogu uključiti samo hidrolizate ili koncentrovane hidrolizate. Pogodni bazalni medijumi uključuju, ali se ne ograničavaju na Dulbekov modifikovan Iglov medijum (DMEM), DME/F12, minimalni esencijalni medijum (MEM), Iglov bazalni medijum (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, αminimalni esencijalni medijum (a-MEM), Glazgovljev Glasgow's minimalni esencijalni medijum(G-MEM), PF CHO (pogledati, npr., CHO medijum bez proteina (Sigma) ili EX-CELL™ 325 PF CHO medijum bez seruma za CHO ćelije bez proteina (SAFC Bioscience) i Iskovljev modifikovani Dulbekov medijum. Drugi primeri bazalnih medijuma koji se mogu koristiti u ovoj tehnologiji uključuju BME Bazalni medijum;
Dulbekov modifikovani Iglov Medium (DMEM, prah) (Gibco-Invitrogen (# 31600). Bazalni medijum može biti bez seruma, što znači da medijum ne sadrži serum (npr., fetalni goveđi seruma (FBS), seruma konja, seruma koza ili bilo koji drugi životinjski serum poznat u struci) ili medijum bez životinjskih proteina ili hemijski definisanih medijuma.
[0160] Bazalni medijum se može modifikovati kako bi se uklonile određene ne-hranljive komponente koje se nalaze u standardnom bazalnom mediju, kao što su razni neorganski i organski puferi, surfaktanti i natrijum hlorid. Uklanjanje takvih komponenti iz bazalnog ćelijskog medijuma omogućava povećanu koncentraciju preostalih nutritivnih komponenti i može poboljšati ukupni rast ćelija i eksprimiranje proteina. Pored toga, izostavljene komponente mogu biti dodate natrag u medijum za kulturu ćelija koji sadrži modifikovan bazalni ćelijski medijum u skladu sa zahtevima uslova ćelijske kulture. Medijum ćelijske kulture sadrži modifikovan bazalni ćelijski medijum i najmanje jedno od sledećeg: hranljive materije, izvor gvožđa, rekombinantni faktor rasta; pufer; surfaktant; regulator osmolarnosti; izvor energije; i ne-životinjski hidrolizati. Osim toga, modifikovani bazalni ćelijski medijum može opciono da sadrži aminokiseline, vitamine ili kombinaciju aminokiselina i vitamina. Modifikovani bazalni medijum dalje sadrži glutamin, npr., L-glutamin i/ili metotreksat.
[0161] Proizvodnja antitela se može izvesti u velikoj količini pomoću procesora bioreaktora korišćenjem serije hranjenja, serije, perfuzije ili kontinuiranih postupaka hranjenja bioreaktora poznatih u struci. Veliki bioreaktori imaju najmanje 1000 litara kapaciteta, ponekad oko 1,000 do 100,000 litara kapaciteta. Ovi bioreaktori mogu koristiti agitator pokretale za distribuciju kiseonika i hranljivih materija. Bioreaktori male razmere se uglavnom odnose na kultivisanje ćelija u ne više od otprilike 100 litara volumetrijskog kapaciteta, i mogu se kretati od oko 1 litra do oko 100 litara. Alternativno, bioreaktori za jednokratnu upotrebu (SUB) mogu biti korišćeni za kultivaciju velikih razmera ili malih razmera.
[0162] Temperatura, pH, agitacija, aeracija i gustina inokuluma mogu se razlikovati u zavisnosti od korišćenih ćelija domaćina i rekombinantnog proteina koji se eksprimira. Na primer, ćelijska kultura rekombinantnih proteina može se održavati na temperaturi od 30 do 45 stepeni Celzijusa. pH medijuma kulture se može pratiti tokom procesa kulture tako da pH ostaje na optimalnom nivou, koji može biti za određene ćelije domaćina, u rasponu pH od 6,0 do 8,0. Za takve postupke agitacije kulture može se koristiti mešanje predvođeno impelorom. Brzina rotacije impelora može biti skoro 50 do 200 cm/sek, ali se mogu koristiti drugi sistema podizanja ili mešanja/aeracije poznati u struci, u zavisnosti od vrste kultivisane ćelije domaćina. Dovoljna aeracija je pružena da održi koncentraciju rastvorenog kiseonika od približno 20% do
2
80% zasićenja vazduha u kulturi, opet, u zavisnosti od odabrane kultivisane ćelije domaćina. Alternativno, bioreaktor može direktno ubrizgati vazduh ili kiseonik u medijum za kulturu. Postoje i drugi postupci za snabdevanje kiseonikom, uključujući sisteme aeracije bez mehurića, koje koriste aeratorne membrane od šupljih vlakana.
Tehnike prikazivanja faga
[0163] Monoklonska antitela ili fragmenti antitela mogu biti izolovani iz biblioteka faga antitela generisanih korišćenjem tehnika kao što je poznato u struci. U takvim postupcima mogu se izolovati anti-alfa toksin antitelo ili fragment pomoću skrininga biblioteke rekombinantnih kombinatornih antitela, ponekad biblioteke prikaza scFv faga, pripremljene korišćenjem ljudskih VL i VH cDNK koje su pripremljene iz mRNK izvedene iz ljudskih limfocita. Metodologije za pripremu i skrining takvih biblioteka su poznate u struci.
Prečišćavanje i izolacija antitela
[0164] Jednom kada je molekul antitela proizveden rekombinacijom ili eksprimiranjem hibridoma, može se prečistiti bilo kojim postupkom koji je poznat u struci za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer, hromatografijom (npr., jonska razmena, afinitet, naročito afinitet za specifične antigene Protein A ili Protein G, i hromatografijom kolone za veličinu), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivosti ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Dalje, antitela predmetne tehnologije ili njihovi fragmenata mogu biti fuzionisana sa gore opisanim heterolognim polipeptidnim sekvencama (ovde označene kao „oznake“), ili drugačije poznata u struci kako bi olakšala prečišćavanje.
Humanizovana antitela
[0165] Antitela predmetne tehnologije su humanizovana antitela koja se generišu korišćenjem postupci poznatih u struci. humanizovana antitela mogu biti himerna antitela. Himerna antitela su antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste, ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je drugi deo lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost. Himerna antitela od interesa ovde uključuju „primatizovana“ antitela koja sadrže sekvence vezivanja antigena sa varijabilnim domenom izvedenim iz primata koji nije čovek (npr., majmuni starog sveta, kao što su babun, rezus ili cinomolgus majmun) i sekvence ljudskog konstantnog regiona.
Ljudska antitela
[0166] Kao alternativa humanizaciji, ljudska antitela se mogu generisati koristeći postupke poznate u struci. Ljudska antitela izbegavaju neke od problema povezanih sa antitelima koja imaju mišje ili pacovske varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih proteina iz miševa ili pacova može dovesti do brzog čišćenja antitela, ili može dovesti do stvaranja imunog odgovora prema antitelu od strane pacijenta. Kako bi se izbeglo korišćenje antitela od miševa ili pacova, potpuno ljudska antitela mogu se generisati kroz uvođenje lokusa funkcionalnog ljudskog antitela u glodara, drugog sisara ili životinju, tako da glodar, drugi sisar ili životinja proizvode potpuno ljudska antitela.
[0167] Na primer, sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr., miševi) koji su sposobni, nakon imunizacije, da proizvedu potpuni repertoar ljudskih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna brisanja gena regiona spajanja teškog lanca antitela (JH) u himernim i germlinijskim mutiranim miševima dovodi do potpune inhibicije proizvodnje endogenih antitela. Prenos ljudskog germlinijskog imunoglobulinskog niza gena u takve germlinijski mutirane miševe dovešće do stvaranja ljudskih antitela nakon izazivanja antigena. U praksi, upotreba XenoMouse® linima iševa koje su projektovane tako da sadrže do 1000 mikroskopskih konfiguracionih fragmenata lokusa ljudsog teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca. XenoMouse® linije dostupne su od Amgen, Inc. (California, Kalifornija).
[0168] U struci su poznati proizvodnja XenoMouse® linija miševa i antitela proizvedenih kod tih miševa. U suštini, XenoMouse® linije miševa imunizovane su antigenom od interesa (npr., alfa toksin), limfne ćelije (kao što su B-ćelije) se obnavljaju od hiper-imunizovanih miševa, i obrađeni limfociti su spojeni sa ćelijskom linijom mijeloidnog tipa za pripremu imortalizovanih hibridoma ćelijskih linija koristeći gore opisane tehnike poznate u struci. Ove ćelijske linije hibridoma su skriningovane i odabrane kako bi se identifikovale hibridomske ćelijske linije koje su proizvele antitela specifična za antigen od interesa.
2
[0169] U alternativnom pristupu, pristupu minilokusa, egzogeni Ig lokus se imitira kroz uključivanje delova (pojedinačnih gena) iz Ig lokusa. Tako, jedan ili više VH gena, jedan ili više DH gena, jedan ili više JH gena, mu konstantni region i obično drugi konstantni region (npr., gama konstantna oblast) formiraju se u konstrukt za umetanje u životinju.
[0170] Generisanje ljudskih antitela od miševa u kojima su, posredstvom mikroćelijske fuzije, uvedeni veliki delovi hromozoma, ili čitavi hromozomi, poznato je u struci. Pored toga, generisani su KM™-miševi, koji su rezultat ukrštanja Kirinovih Tc miševa sa Medarexovim minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi poseduju ljudske IgH transhromozome Kirin miševa i transgenu kapa lance Genpharm miševa.
[0171] Ljudska antitela takođe mogu biti izvedena in vitro postupcima. Pogodni primeri uključuju, ali nisu ograničeni na prikaz faga (Medlmmune (ranije CAT), Morphosis, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Simphogen, Alexion (ranije Proliferon), Affimed) prikaza ribozoma (Medlmmune (ranije CAT)) i slično. Tehnologija prikaza faga može se koristiti za proizvodnju ljudskih antitela i fragmenata antitela in vitro, od repertoara gena varijabilnog (V) domena imunoglobulina od neimunizovanih donora. Prema ovoj tehnici, geni V domena antitela su klonirani unutar okvira u bilo veliki ili mali oblažući protein gena vlaknastog bakteriofaga, kao što su M13 ili fd, i prikazani su kao funkcionalni fragmenti antitela na površini čestice faga. Zbog toga što vlaknasta čestica sadrži jednolančanu DNK kopiju gena faga, izbori zasnovani na funkcionalnim svojstvima antitela takođe rezultuju odabirom gena koji kodira antitelo koje pokazuje te osobine. Dakle, fag imitira neke od osobina B-ćelije. Prikaz faga se može izvesti u različitim formatima. Za prikaz faga može se koristiti nekoliko izvora segmenta V-gena. Raznoliki niz ant-ioksazolonskih antitela izolovan je iz male slučajne kombinatorne biblioteke V gena izvedenih iz slezina imunizovanih miševa. Može se konstruisati repertoar V gena od neimunizovanih ljudskih donora, i antitela različitim nizom antigena (uključujući samo-antigene) mogu se izolovati u suštini u skladu s tehnikama poznatim u struci. Kao što je već rečeno, ljudska antitela mogu takođe biti generisana od strane in vitro aktiviranih B ćelija.
[0172] Geni imunoglobulina podležu različitim modifikacijama tokom sazrevanja imunog odgovora, uključujući rekombinaciju između segmenata V, D i J, promenu izotipova i hipermutaciju u varijabilnim regionima. Rekombinacija i somatska hipermutacija su osnova za generisanje raznovrsnosti antitela i afiniteta sazrevanja, ali takođe mogu generisati slabosti sekvence koje mogu otežati komercijalnu proizvodnju takvih imunoglobulina kao terapeutskih agensa, ili povećati rizik imunogenosti antitela.
Generalno, mutacije u CDR regionima verovatno će doprineti poboljšanom afinitetu i funkciji, dok mutacije u okvirnim regionima mogu povećati rizik od imunogenosti. Taj rizik se može smanjiti vraćanjem okvirnih mutacija do germlinije uz istovremeno osiguravanje da nema negativnog efekta na aktivnost antitela. Procesi diversifikacije mogu takođe generisati neke strukturne slabosti, ili ove strukturne slabosti mogu postojati u germlinijskim sekvencama koje doprinose varijabilnim domenima teškog i lakog lanca. Bez obzira na izvor, može biti poželjno ukloniti potencijalne strukturne slabosti koje mogu dovesti do nestabilnosti, agregacije, heterogenosti proizvoda ili povećane imunogenosti. Primeri nepoželjnih slabosti uključuju neuparene cisteine (što može dovesti do stvaranja disulfidnih veza, ili formiranja varijabilnih sulfhidril adukta), N-povezanih mesta glikozilacije (što rezultuje heterogenom strukturom i aktivnošću), kao i mesta deamidacije (npr., NG, NS), izomerizacie (DG), oksidacije (izloženi metionin) i mesta za hidrolizu (DP).
[0173] Shodno tome, u cilju smanjenja rizika od imunogenosti i poboljšanja farmaceutskih svojstava antitela opisanih u Primeru 11, Tabele 1-8, može biti poželjno da se okvirna sekvenca vrati u germiliniju, CDR vrati u germiliniju i/ili ukloni strukturna slabost. Tako, kada se određeno antitelo razlikuje od svoje odgovarajuće germlinijske sekvence na nivou aminokiseline, sekvenca antitela može se mutirati natrag do germlinijske sekvence. Takve korektivne mutacije mogu se pojaviti na jednom, dve, tri ili više položaja ili kombinacija bilo koje mutirane pozicije, koristeći standardne tehnike molekularne biologije.
[0174] Dodatni pristup uključuje Veloclmmune® tehnologiju (Regeneron Pharmaceuticals). Velocimmune® tehnologija se može koristiti za generisanje potpuno ljudskih monoklonskih antitela za meta od terapeutskog interesa i podrazumeva stvaranje transgenog miša koji ima genome koji obuhvataju ljudske varijabilne regione teškog i lakog lanca koji su operativno povezani sa endogenim konstantnim lokusom miša, tako da miš proizvodi antitelo koje sadrži ljudski varijabilni region i konstantni region miša kao odgovoru na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela se izoluje i operativno povezuje sa DNK koja kodira konstantne regione ljudskog teškog i lakog lanca. DNK se zatim eksprimira u ćeliji sposobnoj za eksprimiranje potpuno ljudskog antitela. Pogledati, na primer, U.S. Pat. No.
6,596,541.
ragmen an e a
[0175] Predmetna antitela uključuju fragmente antitela ili antitela koja sadrže ove fragmente. Fragment antitela obuhvata deo antitela pune dužine, koji je uglavnom njegov antigen-vezujući ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab ', F(ab')2, Fd i Fv fragmente. Dijatela; linearna antitela, molekuli jednolančanih antitela; i multispecifična antitela su antitela formirana od ovih fragmenata antitela.
[0176] Tradicionalno, ovi fragmenti su izvedeni putem proteolitičke digestije netaknutih antitela korišćenjem tehnika poznatih u struci. Međutim, ovi fragmenti se sada mogu direktno proizvesti rekombinantnim ćelijama domaćina. Fab, Fv i scFv fragmenti antitela mogu se svi eksprimirati i izlučiti iz E. coli, omogućavajući tako lako proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Fragmenti antitela mogu biti izolovani iz biblioteka faga antitela o kojima se govori iznad. Alternativno, Fab'-SH fragmenti takođe mogu biti direktno dobijeni od E. coli i hemijski spojeni da formiraju F(ab')2 fragmente. Prema drugom pristupu, F(ab')2 fragmenti mogu biti izolovani direktno iz rekombinantne kulture ćelije domaćina. Poznate su druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Antitelo koje se može odabrati može biti jednolančani Fv fragment (scFv). Antitelo poželjno može da ne bude Fab fragment. Fv i scFv su jedine vrste sa netaknutim mestima kombinovanja koja su lišena konstantnih regiona, stoga su pogodna za smanjenje nespecifičnog vezivanje tokom in vivo primene. scFv fuzioni proteini mogu biti konstruisani kako bi se dobila fuzija efektorskog proteina na bilo koji amino ili karboksi terminus od scFv.
[0177] Predmetna antitela mogu biti domenska antitela, npr., antitela koja sadrže male funkcionalne jedinice vezivanja antitela, koje odgovaraju varijabilnim regionima teških (VH) ili lakih (VL) lanaca ljudskih antitela. Primeri domenskih antitela uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su dostupni od Domantisa, koji su specifični za terapeutske ciljeve. Komercijalno dostupne biblioteke domenskih antitela mogu se koristiti za identifikaciju anti-alfa toksin antitela. Anti-alfa toksin antitela i fragmenti mogu sadržati jedinicu za vezivanje funkcionalnosti alfa toksina, i jedinicu za vezivanje funkcionalnosti Fc gama receptora.
[0178] Predmetna antitela mogu biti linearna antitela. Linearna antitela sadrže par tandem Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji formiraju par antigen-vezujućih regiona. Linijska antitela mogu biti bispecifična ili monospecifična.
Određene modifikacije aminokiselinske sekvence
[0179] Osim gore opisanih ljudskih, humanizovanih i/ili himernih antitela, predmetna tehnologija obuhvata i dodatne modifikacije i njihove varijante i njihove fragmente anti-alfa toksin antitela ili fragmenta koji sadrži jedan ili više od sledećeg: supstituciju aminokiselinskog ostatka i/ili polipeptida, dodavanje i/ili brisanje varijabilnog lakog (VL) domena i/ili varijabilnog teškog (VH) domena i/ili Fc regiona, i post translatorne modifikacije. Uključeni u ove modifikacije su konjugati antitela, gde je antitelo kovalentno vezano za deo. Delovi pogodni za vezivanje na antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine, peptide, lekove, oznake i citotoksine. Ove promene antitela mogu biti izvedene kako bi se izmenile ili fino podesile karakteristike (npr., biohemijske, vezujuće i/ili funkcionalne) antitela tako da budu pogodna za tretman i/ili dijagnozu bolesti povezanih sa S. aureus i/ili alfa toksinima. Postupci formiranja konjugata, čineći aminokiselinske i/ili polipeptidne promene i post-translacijske modifikacije, poznati su u struci, od kojih su neki detaljnije opisani u nastavku. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i supstitucije može se napraviti tako da se stigne do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt ima željene karakteristike.
[0180] Promene aminokiseline u antitela rezultuju sekvencama koje su manje od 100% identične sa sekvencom antitela ili sekvencom ovde opisanog roditeljskog antitela. U ovom kontekstu, antitela mogu imati od 25% do oko 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog domena teškog ili lakog lanca antitela anti-alfa toksina ili fragmenta, kao što je ovde opisano. Prema tome, modifikovano antitelo može imati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom ili varijabilnim domenom teškog ili lakog lanca anti-alfa toksin antitela ili fragmenta, kao što je ovde opisano. Promenjeno antitelo može imati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencu CDR1, CDR2 ili CDR3 teškog ili lakog lanca anti-alfa toksin antitela ili fragmenta kao što je ovde opisano. Promenjeno antitelo može ponekad imati aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti ili sličnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvenca teškog ili lakog lanca FR1, FR2, FR3 ili FR4 antialfa toksin antitela ili fragmenta, kao što je ovde opisano.
[0181] Promenjena antitela mogu biti generisana jednom ili više aminokiselinskih promena (npr., supstitucije, brisanja i/ili umetanja) uvedenih u jednom ili više varijabilnih regiona antitela. Promene
1
aminokiselina mogu se uvesti u okvirne regione. Jedna ili više promena ostataka okvirnog regiona može rezultovati poboljšanjem afiniteta vezivanja antitela za antigen. Ovo može biti posebno tačno kada se ove promene izvrše nad humanizovanim antitelima gde okvirni region može biti od različite vrste u odnosu na CDR region. Primeri ostataka okvirnog regiona koji se modifikuju uključuju one koji direktno ne-kovalentno vezuju antigen, komuniciraju sa/utiču na konformaciju CDR, i/ili učestvuju u VL-VH interfejsu. Od oko jedan do pet okvirnih ostataka se mogu izmeniti. Ponekad ovo može biti dovoljno da se dobiju mutant antitela pogodna za upotrebu u pretkliničkim ispitivanjima, čak i kada nijedan od hipervarijabilnih ostataka regiona nije promenjen. Međutim, normalno je da će izmenjeno antitelo obuhvatiti dodatnu izmenu hipervarijabilnog regiona. Ostaci hipervariabilnog regiona se mogu slučajno menjati, naročito kada je početni afinitet vezivanja anti-alfa toksin antitela ili fragmenta za antigen iz druge vrste sisara takav da se takva nasumično proizvedena antitela mogu lako ispitati.
[0182] Jedna korisna procedura za stvaranje izmenjenih antitela naziva se „mutageneza skeniranja alanina“. U ovom postupku jedan ili više hipervariabilnih ostataka regiona zamenjuju se alaninom ili ostacima polialanina, kako bi se izmenila interakcija aminokiselina sa alfa toksinom. Ovi hipervariabilni ostaci regiona koji pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim prečišćavaju uvođenjem dodatnih ili drugih mutacija na ili za lokacije supstitucije. Tako, iako je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacije per se ne mora se unapred odrediti. Ala-mutanti proizvedeni na ovaj način ispituju se za svoju biološku aktivnost, kao što je ovde opisano.
[0183] Varijanta supstitucije može uključivati zamenu jednog ili više hipervariabilnih regiona ostataka roditeljskog antitela (npr., humanizovano ili ljudsko antitelo). Uopšteno govoreći, rezultujuća varijanta odabrana za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz kog se generiše. Pogodan način za stvaranje takvih supstitucionih varijanti podrazumeva sazrevanje afiniteta pomoću faga. Ukratko, nekoliko mesta hipervariabilnih regiona (npr., 6-7 mesta) mutiraju da generišu sve moguće supstitucije aminokiselina na svakom mestu. Tako nastali mutanti antitela prikazani su monovalentno od filamentoznih čestica faga kao fuzije do proizvoda gena III od M13 upakovanog unutar svake čestice. Fagno prikazanim mutantima se ispituje biološka aktivnost (npr., afinitet vezivanja), kao što je ovde opisano.
[0184] Mutacije u sekvencama antitela mogu uključivati supstitucije, brisanja, uključujući interna brisanja, dodatke, uključujući dodatke koji daju fuzione proteine ili konzervativne supstitucije aminokiselinskog ostatka unutar i/ili u susedno od aminokiselinske sekvence, ali to rezultuje „tihim“ promenama, po tome što promena proizvodi funkcionalno ekvivalentno anti-alfa toksin antitelo ili fragment. Konzervativne aminokiselinske supstitucije se mogu napraviti na osnovu sličnosti u polaritetu, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatskoj prirodi uključenih ostataka. Na primer, nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin, leucin, izolevcin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin; polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline uključuju arginin, lizin i histidin; i negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Pored toga, glicin i prolin su ostaci koji mogu uticati na orijentaciju lanca. Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati razmenu člana jedne od ovih klasa za člana druge klase. Pored toga, po želji, neklasične aminokiseline ili analozi hemijskih aminokiselina mogu biti uvedeni kao supstitucija ili dodatak u sekvencu antitela. Neklasične aminokiseline uključuju, ali nisu ograničene na, D-izomere uobičajenih aminokiselina, alfa-amino izobutrijske kiseline, 4-aminobutirne kiseline, Abu, 2-amino masne kiseline, gama-Abu, epsilon-Ahx, 6-amino heksanojska kiselina, Aib, 2-amino izobuterna kiselina, 3-amino propionska kiselina, ornitin, norleucin, norvalin, hidroksiprolin, sarkozin, citrulin, cisteinska kiselina, t-butilglicin, t-butilalanin, fenilglicin, cikloheksilalanin, beta-alanin, fluoro-aminokiseline, dizajnerske aminokiseline kao što su beta-metil aminokiseline, C-alfa-metil aminokiseline, N-alfa-metil aminokiseline i analozi aminokiselina uopšte.
[0185] Svaki ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje pravilne konformacije anti-alfa toksin antitela ili fragmenta takođe može biti supstituisan, generalno sa serinom, kako bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula i sprečilo nenormalno umrežavanje. Nasuprot tome, cisteinske veze se mogu dodati antitelu radi poboljšanja njegove stabilnosti (naročito tamo gde je antitelo fragment antitela, kao što je Fv fragment).
[0186] Antitelo može biti modifikovano tako da proizvodi proteine fuzije; tj., antitelo ili njegov fragment, spojen sa heterolognim proteinom, polipeptidom ili peptidom. Protein koji je spojen sa delom antitela može biti enzimska komponenta Terapije enzimskog proleka usmerena na antitelo (ADEPT). Primeri drugih proteina ili polipeptida koji se mogu projektovati kao fuzioni protein sa antitelom uključuju, ali se ne
2
ograničavaju na, toksine kao što su ricin, abrin, ribonukleaza, DNaza I, stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein vinobojke, gelonin, difterija toksin, Pseudomonas ekotoksin i Pseudomonas endotoksin. Enzimatski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti mogu uključivati difterijin A lanac, nevezujuće aktivne fragmente difterijskog toksina, egzotoksin A lanac (od Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, Phytolaca americana proteini (PAPI, PAPII i PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, krotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restocin, fenomein, enomicin i trikotecene.
[0187] Dodatni fuzioni proteini mogu se generisati pomoću poznatih tehnika genskog premeštanja, preslaganje motiva, premeštanja eksona i/ili premeštanja kodon (zajedno se nazivaju „premeštanje DNK“). DNK premeštanje se može koristiti za promenu karakteristika antitela ili njegovih fragmenata (npr., antitelo ili njegov fragment sa većim afinitetima i nižim stopama disociacije). Antitelo može dalje biti imunoglobulinski fuzioni protein vezujući domen, kako je poznato u struci.
Varijanta Fc regija
[0188] Predmetni pronalazak takođe uključuje vezujuće članove pronalaska, i naročito antitela iz ovog pronalaska, koja imaju modifikovane IgG konstantne domene. Antitela ljudske IgG klase, koja imaju funkcionalne karakteristike kao što su dugačak polu-život u serumu i sposobnost posredovanja različitih efektorskih funkcija, mogu se koristiti u antitelima i njihovim fragmentima koji su ovde obelodanjeni (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)).Antitelo ljudske IgG klase se dodatno klasifikuje na sledeće 4 podklase: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Do sada je sproveden veliki broj studija za ADCC i CDC kao efektorske funkcije IgG klase antitela, i prijavljeno je da među antitelima ljudske IgG klase, IgG1 podklasa ima najveću ADCC aktivnost i CDC aktivnost kod ljudi (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).
[0189] „Citotoksičnost zavisna od antitela i posredovana ćelijama“ i „ADCC“ odnose se na reakcije posredovane ćelijama, u kojima nespecifične citotoksične ćelije (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezana antitela na ciljanoj ćeliji, i kasnije izazivaju lizu ciljane ćelije. Takve ćelije mogu biti ljudske ćelije. Bez želje da se ograniči na bilo koji određeni mehanizam delovanja, ove citotoksične ćelije koje posreduju ADCC generalno eksprimiraju Fc receptore (FcRs). Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju FciRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII, FcγRIII i/ili FcγRIV. Eksprimiranje FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirano u Ravetch i Kinet, Annu. Rev.
Immunol., 9:457-92 (1991). Kako bi se procenila ADCC aktivnost molekula, može se izvršiti in vitro ADCC test, kao što je opisano u U.S. Patent No.5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je onaj opisan u Clynes i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998).
[0190] „Citotoksičnost zavisna od komplemenata“ ili se odnosi na sposobnost molekula da inicira aktivaciju komplementa i lizira cilj u prisustvu komplementa. Put aktivacije komplementa inicira se vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za molekul (npr. antitelo) kompleksirano sa kognatnim antigenom. Za procenu aktivacije komplementa, može se izvršiti CDC est, npr., kao što je opisano u Gazzano-Santaro i dr., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
[0191] Eksprimiranje ADCC aktivnosti i CDC aktivnost antitela ljudske IgG1 podklase obično uključuje vezivanje Fc regiona antitela na receptor za antitelo (u daljem tekstu „FcγR“) koji postoji na površini efektorskih ćelija kao što su ćelije ubice, ćelije prirodne ubice ili aktivirani makrofagi. Razne komponente komplementa mogu biti vezane. Što se tiče vezivanja, predloženo je da su važni nekoliko aminokiselinskih ostataka u zglobnom regionu i drugom domenu C regiona (u daljem tekstu „Cγ2 domen“) antitela (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) i da je takođe važan lanac šećera u domenu Cγ2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).
[0192] „Efektorske ćelije“ su leukociti koji eksprimiraju jedan ili više FcR i izvršavaju efektorske funkcije. Ćelije eksprimiraju najmanje FcγRI, FCγRII, FcγRIII i/ili FcγRIV, i sprovode ADCC efektorsku funkciju. Primeri ljudskih leukocita koji posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile.
Izrazi „Fc receptor“ ili „FcR“ se koriste da opišu receptor koji se vezuje za Fc region antitela. FcR može biti prirodni ljudski FcR. Štaviše, FcR može biti onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcγRIV potklase, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivirajući receptor“) i FcγRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju po svojim citoplazmatskim domenima. Aktiviranje receptora FcγRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na osnovu tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibirajući FcγRIIB receptor sadrži imunoreceptorne motive inhibicije zasnovane na tirozinu (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu.
(pogledati, Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcRs su opisani kod Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel i dr., Immunomethods, 4:25-34 (1994); i de Haas i dr., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući i one koji se identifikuju u budućnosti, ovde su obuhvaćeni izrazom „FcR“. Izraz takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenošenje majčinskih IgG na fetus (Guyer i dr., Immunol., 117:587 (1976) and Kim i dr., J. Immunol., 24:249 (1994)).
[0193] Ovde su obelodanjeni anti-alfa toksin antitelo ili fragment koji mogu obuhvatati izmenjeni Fc region (ovde se ovde nazivaju i „varijanta Fc regiona“) u kom je izvršena jedna ili više izmena u Fc regionu kako bi se promenila funkcionalna i/ili farmakokinetičkih osobina antitela. Takve promene mogu rezultovati smanjenjem ili povećanjem Clq vezivanja i citotoksičnosti zavisne od komplemenata (CDC) ili FcgammaR vezivanja, za IgG. Predmetna tehnologija obuhvata antitela opisana ovde sa varijantama Fc regiona gde su izvršene promene kako bi se promenila efektorska funkcija, pružajući željeni efekat. Prema tome, anti-alfa toksin antitelo ili fragment mogu sadržati varijante Fc regiona (tj., Fc regioni koji su izmenjeni kao što je opisano ispod). Anti-alfa toksin antitela i fragmenti koji se ovde nalaze u varijantni Fc regiona takođe se ovde nazivaju „antitela Fc varijante“. Kad se ovde koristi, prirodno se odnosi na neizmenjenu roditeljsku sekvencu, i antitelo koje sadrži prirodni Fc region ovde se naziva „prirodno Fc antitelo“. Varijanta Fc regiona može pokazati sličan nivo indukovanja efektorske funkcije u poređenju sa prirodnim Fc regionom. Varijanta Fc regiona može pokazati veće indukovanje efektorske funkcije u poređenju sa prirodnim Fc. U određenim aspektima, varijanta Fc region pokazuje manje indukovanje efektorske funkcije u poređenju sa prirodnim Fc. Primeri varijanti Fc regiona su ovde detaljno opisani. Postupci merenja efektorske funkcije poznati su u struci.
[0194] Efektorska funkcija antitela može se modifikovati kroz promene u regionu Fc, uključujući, ali bez ograničavanja na, supstitucije aminokiselina, umetke aminokiselina, brisanja aminokiselina i promene posttranslacijskim modifikacija Fc aminokiselina (npr., glikozilacija). Postupci koji su opisani u nastavku mogu se koristiti za promenu efektorske funkcije izolovanog antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisano, što rezultuje antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom koji imaju određene osobine pogodne za profilaksu ili tretman određene Staphylococcal aureus-povezane bolesti ili stanja.
[0195] Ovde su obelodanjene Fc varijante antitela koja se mogu pripremiti izmenjenim vezivnim svojstvima za Fc ligand (npr., Fc receptor, C1q) u odnosu na prirodno Fc antitelo. Primeri vezivnih svojstava uključuju, ali nisu ograničeni na, specifičnost vezivanja, konstantu disociacije ravnoteže (Kd), stope disociacije i asocijacije (koff i kon, respektivno), afinitet vezivanja i/ili avidnost. U struci je poznato da se konstanta disociacije ravnoteže (Kd) definiše kao koff/kon. U određenim aspektima, antitelo koje sadrži varijantu Fc regiona sa niskim Kdmože biti poželjnije od antitela sa visokim Kd. Međutim, u nekim slučajevima vrednost, kon ili koff mogu biti više relevantni od vrednosti Kd. Može se utvrditi koji kinetički parametar je važniji za datu primenu antitela.
[0196] Antitela Fc varijante mogu da dovedu do promene afiniteta vezivanja za jedan ili više Fc receptora uključujući, ali nisu ograničeni na, FcRn, FcgammaRI (CD64) uključujući izoforme FcgammaRIA, FcgammaRIB i FcgammaRIC; FcgammaRII (CD32 uključujući izoforme FcgammaRIIA, FcgammaRIIB i FcgammaRIIC); i FcgammaRIII (CD16, uključujući izoforme FcgammaRIIIA i FcgammaRIIIB) u poređenju sa prirodnim Fc antitelima.
[0197] Ovde je obelodanjeno antitelo Fc varijante koje je poboljšalo vezivanje za jedan ili više Fc liganda u odnosu na prirodno Fc antitelo. Antitelo Fc varijante može pokazati povećan ili smanjen afinitet za Fc ligand koji je najmanje 2 puta, ili najmanje 3 puta, ili najmanje 5 puta, ili najmanje 7 puta, ili najmanje 10 puta, ili najmanje 20 puta, ili najmanje 30 puta, ili najmanje 40 puta, ili najmanje 50 puta, ili najmanje 60 puta, ili najmanje 70 puta, ili najmanje 80 puta, ili najmanje 90 puta, ili najmanje 100 puta, ili najmanje 200 puta, ili is između 2 puta i 10 puta, ili između 5 puta i 50 puta, ili između 25 puta i 100 puta, ili između 75 puta i 200 puta, ili između 100 i 200 puta, viši ili niži od prirodnog Fc antitela. Antitela Fc varijante mogu pokazati afinitete za Fc ligand koji je najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 40%, najmanje 30%, najmanje 20%, najmanje 10%, ili najmanje 5% viši ili niži od prirodnog Fc antitela. Antitelo Fc varijante može imati povećan afinitet za Fc ligand. Antitelo Fc varijante može ponekad imati smanjen afinitet za Fc ligand.
4
[0198] Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja imaju poboljšano vezivanje za Fc receptor FcgammaRIIIA. Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja imaju poboljšano vezivanje za Fc receptor FcgammaRIIB. U određenim otelotvorenjima, antitelo Fc varijante ima pojačano vezivanje za Fc receptore FcgammaRIIIA i FcgammaRIIB. Ovde su obeodanjena antitela Fc varijante koja imaju poboljšano vezivanje za FcgammaRIIIA i koja nemaju istovremeno povećanje vezivanja FcgammaRIIB receptora u poređenju sa prirodnim Fc antitelima. Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja imaju smanjeno vezivanje za Fc receptor FcgammaRIIIA. Antitelo Fc varijante može ponekad imati smanjeno vezivanje za Fc receptor FcgammaRIIB. Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja pokazuju izmenjen afinitet za FcgammaRIIIA i/ili FcgammaRIIB koji imaju poboljšano vezivanje za Fc receptor FcRn. Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja pokazuju izmenjen afinitet za FcgammaRIIIA i/ili FcgammaRIIB koji su izmenili vezivanje za C1q u odnosu na prirodno Fc antitelo.
[0199] Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja pokazuju afinitete za FcgammaRIIIA receptor koji su najmanje 2 puta, ili najmanje 3 puta, ili najmanje 5 puta, ili najmanje 7 puta, ili a least 10 puta, ili najmanje 20 puta, ili najmanje 30 puta, ili najmanje 40 puta, ili najmanje 50 puta, ili najmanje 60 puta, ili najmanje 70 puta, ili najmanje 80 puta, ili najmanje 90 puta, ili najmanje 100 puta, ili najmanje 200 puta, ili are između 2 puta i 10 puta, ili između 5 puta i 50 puta, ili između 25 puta i 100 puta, ili između 75 puta i 200 puta, ili između 100 i 200 puta, viši ili niži od prirodnog Fc antitela. Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja pokazuju afinitete za FcgammaRIIIA koji su najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 40%, najmanje 30%, najmanje 20%, najmanje 10%, ili najmanje 5% viši ili niži od prirodnog Fc antitela.
[0200] Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja pokazuju afinitete za FcgammaRIIB receptor koji su najmanje 2 puta, ili najmanje 3 puta, ili najmanje 5 puta, ili najmanje 7 puta, ili a least 10 puta, ili najmanje 20 puta, ili najmanje 30 puta, ili najmanje 40 puta, ili najmanje 50 puta, ili najmanje 60 puta, ili najmanje 70 puta, ili najmanje 80 puta, ili najmanje 90 puta, ili najmanje 100 puta, ili najmanje 200 puta, ili are između 2 puta i 10 puta, ili između 5 puta i 50 puta, ili između 25 puta i 100 puta, ili između 75 puta i 200 puta, ili između 100 i 200 puta, viši ili niži od prirodnog Fc antitela. Antitela Fc varijante takođe mogu pokazati afinitete za FcgammaRIIB koji su najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 40%, najmanje 30%, najmanje 20%, najmanje 10%, ili najmanje 5% viši ili niži od prirodnog Fc antitela.
[0201] Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja pokazuju povećanje ili smanjenje afiniteta za C1q u odnosu na prirodno Fc antitelo. Antitela Fc varijante mogu pokazati afinitete za C1q receptor koji su 2 puta, ili najmanje 3 puta, ili najmanje 5 puta, ili najmanje 7 puta, ili najmanje 10 puta, ili najmanje 20 puta, ili najmanje 30 puta, ili najmanje 40 puta, ili najmanje 50 puta, ili najmanje 60 puta, ili najmanje 70 puta, ili najmanje 80 puta, ili najmanje 90 puta, ili najmanje 100 puta, ili najmanje 200 puta, ili are između 2 puta i 10 puta, ili između 5 puta i 50 puta, ili između 25 puta i 100 puta, ili između 75 puta i 200 puta, ili između 100 i 200 puta, viši ili niži od prirodnog Fc antitela. Antitela Fc varijante takođe mogu pokazati afinitete za C1q koji su najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, najmanje 40%, najmanje 30%, najmanje 20%, najmanje 10%, ili najmanje 5% viši ili niži od prirodnog Fc antitela. Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja pokazuje izmenjen afinitet za Ciq koji imaju pojačano vezivanje za Fc receptor FcRn. U konkretnom slučaju antitelo Fc varijante koje pokazuje izmenjen afinitet za C1q može imati izmenjeno vezivanje za FcgammaRIIIA i/ili FcgammaRIIB u odnosu na prirodno Fc antitelo.
[0203] Razmatra se da su antitela Fc varijante karakterisana in vitro funkcionalnim analizama za određivanje jedne ili više FcgammaR posredovanih efektorskih ćelijskih funkcija. Ovde su obelodanjena antitela Fc varijante koja imaju slična svojstva vezivanja i efektorske ćelijske funkcije u in vivo modelima (kao što su oni opisani i obelodanjeni ovde) kao oni u in vitro baziranim testovima. Predmetna tehnologija ne isključuje antitela Fc varijante koja ne pokazuju željeni fenotip in vitro ali pokazuju željeni fenotip in vivo.
[0203] Polu-život u serumu proteina koji sadrži Fc regione može se povećati povećanjem afiniteta vezivanja za Fc region za FcRn. Izraz „polu-život antitela“, kad se ovde koristi, znači farmakokinetičko svojstvo antitela koje je mera srednjeg vremena preživljavanja molekula antitela nakon njihove primene. Polu-život antitela se može eksprimirati kao vreme potrebno za eliminaciju 50 procenata poznate količine imunoglobulina iz tela pacijenta (ili drugog sisara) ili njegovog specifičnog odeljka, na primer, kao što je mereno u serumu, tj., polu-život u cirkulaciji, ili u drugim tkivima. Polu-život može varirati od jednog imunoglobulina ili klase imunoglobulina do drugog. Generalno, porast polu-života antitela rezultuje povećanjem srednjeg vremena boravka (MRT) u opticaju za antitelo koje se primenjuje.
[0204] Povećanje polu-života omogućava smanjenje količine leka koji se daje pacijentu, kao i smanjenje učestalosti primene. Povećanje polu-života takođe može biti korisno, na primer, za sprečavanje Staphylococcal aureus-povezane bolesti ili stanja, kao i za sprečavanje ponovnog nastanka infekcije koja se često javlja kada je pacijent pušten iz bolnice. Lako bi se povećao polu-život antitela u serumu, u antitelo (naročito fragment antitela) može se uključiti epitop vezivanja receptora spasioca, kako je poznato u struci. Kad se ovde koristi, izraz „epitop vezivanja receptora spasioca“ se odnosi na epitop Fc regiona molekula IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji je odgovoran za povećanje in vivo polu-života IgG molekula u serumu. Antitela sa povećanim polu-životom mogu se takođe generisati modifikacijom aminokiselinskog ostatka identifikovanih kao interakcije između Fc i FcRn receptora. Pored toga, polu-život antitela ili fragmenta anti-alfa toksina može se povećati konjugacijom na PEG ili albumin pomoću tehnika koje se široko koriste u struci. Antitela koje sadrže regione Fc varijanti od anti-alfa toksin antitela mogu imati povišen poluživot od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40% oko 45%, oko 50%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 100%, oko 125%, oko 150% ili više u odnosu na antitelo koje sadrži prirodni Fc region. Antitela koja sadrže varijante regiona Fc mogu imati povećan polu-život od oko 2 puta, oko 3 puta, oko 4 puta, oko 5 puta, oko 10 puta, oko 20 puta, oko 50 puta ili više ili je između 2 puta i 10 ili između 5 puta i 25 puta, ili između 15 i 50 puta, u poređenju sa antitelom koji sadrži prirodni Fc region.
[0205] Prikazana tehnologija pruža Fc varijante, gde Fc region sadrži modifikaciju (npr., aminokiselinske supstitucije, umetke aminokiselina, brisanja aminokiselina) u jednom ili više položaja odabranih iz grupe koja se sastoji od 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 i 443. Opciono, Fc region može sadržati ne-prirodni aminokiselinski ostatak na dodatnim i/ili alternativnim položajima poznatim u struci.
[0206] Ovde je obelodanjena Fc varijanta, gde Fc region sadrži najmanje jednu supstituciju odabranu iz grupe koja se sastoji od 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 2341, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 2351, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 2401, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R.243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y i 434W kao što je navedeno u EU indeksu, kao što je navedeno u Kabatu.
Opciono, Fc region može sadržati dodatne i/ili alternativne ne-prirodne aminokiselinske ostatke poznate u struci.
[0207] Ovde je obelodanjeno antitelo Fc varijante, gde Fc region sadrži najmanje jednu modifikaciju (npr. aminokiselinske supstitucije, umetanja aminokiselina, brisanja aminokiselina) na jednom ili više položaja odabranih iz grupe koja se sastoji od 234, 235 i 331. Ne-prirodne aminokiseline mogu biti odabrane iz grupe koju čine 234F, 235F, 235Y i 331S. Ovde je data Fc varijanta, gde Fc region sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja se ne pojavljuje prirodno na jednom ili više položaja odabranih iz grupe koja se sastoji od 239, 330 i 332. Aminokiseline koje se ne pojavljuju prirodno mogu se odabrati iz grupa koja se sastoji od 239D, 330L i 332E.
[0208] Ovde je obelodanjeno antitelo Fc varijante, gde Fc region sadrži najmanje jednu ne-prirodnu aminokiselinu na jednom ili više položaja odabranih iz grupe koja se sastoji od 252, 254 i 256. Mogu se odabrati ne-prirodne aminokiseline iz grupe koja se sastoji od 252Y, 254T i 256E, kako je opisano u U.S. Patent No.7,083,784,.
[0209] Ovde je obelodanjeno anti-stafilokokni alfa toksin antitelo koje ima region Fc varijante koji povećava poluživot antitela u serumu, gde antitelo ima sledeće sekvence teškog lanca i laka lanca:
Teški lanac: LC10-IgG1-YTE
[0210] Funkcije efektora izazvane IgG antitelima mogu snažno zavisiti od ugljovodonične grupe povezane sa Fc regionom proteina. Tako se glikozilacija regiona Fc može modifikovati kako bi se povećala ili smanjila efektorska funkcija. Shodno tome, Fc regioni od anti-alfa toksin antitela i fragmenata koji su ovde navedeni, mogu sadržati izmenjenu glikozilaciju aminokiselinskih ostataka. Promenjena glikozilacija aminokiselinskih ostataka može rezultovati sniženom efektorskom funkcijom. Promenjena glikozilacija aminokiselinskih ostataka može dovesti do povećane efektorske funkcije. Fc region može imati smanjenu fukozilaciju. Fc region može biti afukozilovan.
[0211] Fc varijante ovde mogu biti kombinovane sa drugim poznatim Fc varijantama, kako je poznato u struci. Mogu se uvesti i druge modifikacije i/ili supstitucije i/ili dodaci i/ili brisanja Fc domena.
Glikozilacija
[0212] Pored sposobnosti glikozilacije da menja efektorsku funkciju antitela, modifikovana glikozilacija u varijabilnom regionu može da promeni afinitet antitela za ciljani antigen. Glikozilacijski uzorak u varijabilnom regionu prisutnih antitela može se modifikovati. Na primer, može se napraviti aglikozilovano antitelo (tj., antitelo nema glikozilaciju). Glikozilacija se može promeniti da, na primer, poveća afinitet antitela za ciljani antigen. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, promenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može se napraviti jedna ili više supstitucija aminokiselina, što rezultuje eliminacijom jednog ili više mesta glikozilacije okvira varijabilnog regiona, čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela za antigen. Jedna ili više aminokiselinskih supstitucija se takođe mogu napraviti, što rezultuje eliminacijom mesta glikozilacije prisutnog u Fc regionu (npr., Asparagin 297 IgG). Pored toga, aglikozilovana antitela mogu biti proizvedena u bakterijskim ćelijama kojima nedostaju potrebni mehanizmi za glikozilaciju.
Konjugati antitela
[0213] Ovde obelodanjena antitela mogu biti konjugovana ili kovalentno vezana za supstancu korišćenjem postupaka poznatih u struci. Prikačena supstanca može biti detektibilna oznaka (takođe ovde označena kao reporter molekul) ili čvrsta podloga. Pogodne supstance za vezivanje na antitela uključuju, ali nisu ograničene na, aminokiselinu, peptid, protein, polisaharid, nukleozid, nukleotid, oligonukleotid, nukleinsku kiselinu, hapten, lek, hormon, i lipid, lipidni sklop, sintetički polimer, polimernu mikročesticu, biološku ćeliju, virus, fluorofor, hromofor, boje, toksin, hapten, enzim, antitelo, fragment antitela, radioizotop, čvrste matrice, polučvrste matrice i njihove kombinacije. Postupci konjugacije ili kovalentno vezivanje druge supstance za antitelo su poznate u struci.
Dijagnostički postupci upotrebe
[0214] Alfa toksin je faktor virulencije koji se obično nalazi samo kod patogenih vrsta S. aureus. Alfa toksin se ponekad vezuje za receptor ćelijske površine kao deo formiranja aktivnih kompleksa. Međutim, oligomerizacija i formiranje transmembranske pore (npr., heptamer alfa toksina) može nastati u odsustvu vezivanja za određeni receptor. Akcija oligomerizovanog alfa toksina u ćelijskoj disfunkciji i lizi (npr., formiranje transmembranske pore) olakšava kolonizaciju invazivne S. aureus bakterije. Antitela opisana ovde inhibiraju sakupljanje ili oligomerizaciju monomera alfa toksina u transmembranske pore prepoznavanjem regiona na molekulu alfa toksina, koji je direktno ili indirektno uključen u interakciju monomer - monomera alfa toksina.
[0215] Mogu se koristiti anti-alfa toksin antitela i fragmenti i sastavi ovde predstavljeni in vivo i/ili in vitro za dijagnostiku S. aureus sojeva koji proizvode alfa toksin i/ili stanja/bolesti povezane sa alfa toksinom. Ovo se može postići, na primer, dovođenjem u dodir uzorka koji će biti testiran, opciono zajedno sa kontrolnim uzorkom, sa antitelom pod uslovima koji omogućavaju stvaranje kompleksa između antitela i alfa toksina. Tada se detektuje formiranje kompleksa (npr., koristeći ELISA). Kada se koristi kontrolni uzorak zajedno sa uzorkom za ispitivanje, kompleks se detektuje u oba uzorka, i bilo koja statistički značajna razlika u formiranju kompleksa između uzoraka ukazuje na prisustvo S. aureus, alfa toksina ili i S. aureus i alfa toksina u test uzorku.
[0216] Ova tehnologija pruža postupak određivanja prisustva S. aureus sojeva koji proizvode alfa toksin i/ili alfa toksina u uzorku za koji se sumnja da sadrži S. aureus i/ili druge bakterije koje proizvode homolog alfa toksina, gde postupak obuhvata izlaganje uzorka anti-alfa toksin antitelu ili fragmentu, i određivanje vezivanja antitela za alfa toksin, u uzorku gde je vezivanje antitela na alfa toksin u uzorku indikativno za prisustvo S. aureus i/ili alfa toksina u uzorku. Uzorak može biti biološki uzorak. U određenim aspektima, biološki uzorak je od sisara koji doživljava ili se sumnja da doživljava S. aureus-povezanu bolest/poremećaj.
[0217] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment se može koristiti za detektovanje rasta S. aureus i/ili prekomernog eksprimiranje alfa toksina koristeći in vivo dijagnostički test. Anti-alfa toksin antitelo ili fragment se mogu dodati u uzorak u kom antitelo vezuje alfa toksin, kako bi se detektovali, i označeno je detektabilnom oznakom (npr., radioaktivni izotop ili fluorescentna oznaka), i pacijent se eksterno skenira za lokalizaciju oznake.
[0218] FISH analize, kao što je INFORM™ (prodaje se od strane od Ventana, Arizona) ili PATHVISION™ (Vysis, Illinois), mogu se izvoditi na fiksiranom, parafinski obrađenom tkivu, kako bi se utvrdila količina (ukoliko je ima) prevelikog eksprimiranja alfa toksina u uzorku tkiva.
[0219] Anti-alfa toksin antitela i fragmenti mogu se koristiti u postupku detektovanja alfa toksina u uzorcima tkiva, krvi ili serumu (npr., rastvorljiv alfa toksin). Postupak može obuhvatiti dovođenje u dodir uzorka testa tkiva, krvi ili seruma od sisara, za kog se sumnja da ima poremećaj posredovan S. aureus alfa toksinom, sa anti-alfa toksin antitelom, ili fragmentom koji je ovde prikazan, i detektovanje povećanja alfa toksina u test uzorku u odnosu na kontrolni uzorak krvi ili seruma od normalnog sisara. Postupci detektovanja su korisni kao postupci dijagnostike a S. aureus i/ili poremećaja posredovanih alfa toksinom povezanih sa povećanjem alfa toksina u tkivu, krvi ili serumu sisara.
Terapeutski postupci upotrebe
[0220] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment se može primenjivati za prevenciju i/ili tretman stanja posredovanog alfa toksinom. Ovde su predstavljeni postupci sprečavanja, lečenja, održavanja, poboljšanja i/ili inhibiranja bolesti ili poremećaja posredovane alfa toksinom, gde postupci obuhvataju primenu anti-alfa toksin antitela i fragmenti koji su ovde navedeni.
Patogeni poremećaji posredovani sa Staphylococcus aureus alfa toksinom
[0221] Ovde su obelodanjeni načini primene i upotrebe sastava i antitela, koji su ovde prikazani, za tretman i sprečavanje širokog spektra patogenih stanja/bolesti posredovanih sa Staphylococcus aureus, uključujući i hronične i akutne bolesti, kao što su, ali bez ograničavanja na bakteremiju, opekotine, celulitis, dermonekrozu, infekcije očnim kapaka, trovanje hranom, zglobne infekcije, neonatalni konjunktivitis, osteomielitis, upala pluća, infekcije kože, infekcije hirurških rana, sindrom krastave kože, endokarditis, meningitis, formiranje apscesa i sindrom toksičnog šoka.
[0222] I CA-MRSA i HA-MRSA su otporni na tradicionalne anti-stafilokokne beta-laktamske antibiotike, kao što je cefaleksin. CA-MRSA ima veći spektar antimikrobne osetljivosti, uključujući i sulfa lekove (poput ko-trimoksazola/trimetoprim-sulfametoksazola), tetraciklinima (kao što su doksiciklin i minociklin) i klindamicina, ali trenutno se veruje da je vankomicin najpogodniji lek za tretman CA-MRSA, prema Henry Ford Hospital Study. HA-MRSA je otporan čak i na ove antibiotike, i često je podložan samo vankomicinu.
Noviji lekovi, kao što je linezolid (koji pripadaju novijoj klasi oksazolidinona) i daptomicin, efikasni su protiv CA-MRSA i HA-MRSA.
[0223] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment iz ovog pronalaska, mogu se koristiti u kombinaciji sa antibiotikom koji odgovara, na primer, beta-laktam antibioticima (kao što je cefaleksin), sulfa lekovima (kao ko-trimoksazol/trimetoprim-sulfametoksazol), tetraciklinima (kao doksiciklin i minociklin), klindamicinu, vankomicinu, linezolidu, daptomicinu, teikoplaninu, kinupristin/dalfopristinu (sinercid) ili tigeciklinu.
Farmaceutske formulacije
[0224] Anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je ovde pružen mogu se formulisati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem kao farmaceutski (terapeutski) sastavi, i može se primenjivati različitim postupcima poznatim u struci. Ruta i/ili režim primene mogu se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata. Kad se ovde koriste, farmaceutske formulacije koje sadrže anti-alfa toksin antitelo ili fragment se nazivaju formulacije ove tehnologije. Izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava jedan ili više netoksičnih materijala koji ne ometaju efikasnost biološke aktivnosti aktivnih sastojaka. Takvi sastavi mogu rutinski sadržati soli, agense za puferovanje, konzervanse, kompatibilne nosače i opciono druge terapeutske agense. Takvi farmaceutski prihvatljivi sastavi takođe mogu rutinski sadržati kompatibilne čvrste ili tečne punioce, razblaživače ili materije za inkapsulaciju koji su pogodne za primenu kod ljudi. Izraz „nosač“ označava organski ili neorganski sastojak, prirodni ili sintetički, sa kojim se aktivni sastojak kombinuje da olakša primenu. Komponente farmaceutskih sastava takođe mogu biti kombinovane sa antitelima predmetne+ tehnologije i međusobno, na takav način da ne postoji interakcija koja bi značajno umanjila željenu farmaceutsku efikasnost.
[0225] Terapeutski sastavi postojeće tehnologije mogu se formulisati za određenu dozu. Režimi doziranja se mogu prilagoditi kako bi se obezbedio optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, jedan bolus može biti primenjen, nekoliko podeljenih doza mogu da se primeni tokom vremena, ili doza može biti srazmerno smanjena ili povećana, kao što je pokazano potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne sastave u obliku jedinične doze za lakšu primenu i uniformnost doziranja. Jedinični dozni oblik, kad se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za jedinične doze za pacijente koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu kako bi proizvela željeni terapeutski efekat u saradnji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za jedinične dozne oblike diktiraju i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika anti-alfa toksin antitela ili fragmenta, i određenog terapijskog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja koja su inherentna u struci mešanja takvog anti-alfa toksin antitela ili fragment za tretman osetljivosti kod pojedinaca.
[0226] Terapeutski sastav predmetne tehnologije može se formulisati za određene načine primene, kao što su oralni, nazalni, plućni, topikalni (uključujući bukalni i sublingvalni), rektalni, vaginalni i/ili parenteralni putevi primene. Formulacije se mogu pogodno predstaviti u jediničnom doznom obliku, i mogu se pripremiti bilo kojim postupcima poznatim u farmaciji. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa nosećim materijalom za proizvodnju jediničnog doznog oblika variraće u zavisnosti od pacijenta koji se leči, i od posebnog načina primene. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa nosećim materijalom za proizvodnju jediničnog doznog oblika će generalno biti ona količina sastava koja proizvodi terapeutski efekat.
Terapeutski efikasne doze
[0227] Formulacija antitela koja je ovde opisana može se davati pri odgovarajućoj dozi o režimu doziranja, i takva doza i režim doziranja mogu zavisiti od bolesti ili stanja koji se tretiraju. Terapeutski efikasna doza može se identifikovati određivanjem da li dozni režim i doziranje dovode do terapeutskog efekta ili terapeutske krajnje tačke
Predmeti proizvodnje i kompleti
[0228] Ovde je pružen farmaceutski paket ili komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera napunjenih tečnom formulacijom ili liofilizovanom formulacijom. Ovde obelodanjen kontejner napunjen sa tečnom formulacijom je unapred napunjen špric. U specifičnim slučajevima formulacije sadrže anti-alfa toksin antitela i fragmente rekombinantno spojene ili hemijski konjugovane sa drugim delom, uključujući, ali bez ograničavanja na, heterologni protein, heterologni polipeptid, heterologni peptid, veliki molekul, mali molekul, marker sekvencu, dijagnostički ili detektabilni agens, terapeutski deo, deo leka, radioaktivni metalni jon, drugo antitelo i čvrsta supstanca. Ovde se formulacije mogu formulisati u bočicama sa jediničnom dozom kao sterilna tečnost. Formulacija se ovde ponekad isporučuje u unapred napunjenom špricu.
[0229] Ovde su obelodanjeni kompleti koji sadrže anti-alfa toksin antitela i pruženi su i fragmenti koji su korisni u različite svrhe, npr., za istraživanje i dijagnostiku, uključujući i prečišćavanje ili imunoprecipitaciju alfa toksina iz ćelija, detektovanje alfa toksina i slično. Za izolaciju i prečišćavanje alfa toksina, komplet može sadržati anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je povezan sa perlama (npr., sefarozne perle). Mogu se nabaviti kompleti koji sadrže antitela za detektovanje i kvantifikaciju alfa toksina in vitro, npr. u ELISA ili Western blotu. Kao i kod predmeta proizvodnje, komplet sadrži kontejner i oznaku ili uložak za pakovanje na kontejnerom ili povezan sa kontejnerom. Kontejner čuva sastav koja sadrži najmanje jedno anti-alfa toksin antitelo ili fragment, kao što je ovde opisano. Dodatni kontejneri mogu biti uključeni tako da sadrže, npr., razblaživače i pufere, kontrolna antitela. Oznaka ili umetak za pakovanje mogu dati opis sastava, kao i uputstva za nameravane in vitro ili dijagnostičke upotrebe.
[0230] Predmetna tehnologija takođe obuhvata završene upakovane i označene farmaceutske proizvode. Ovaj predmet proizvodnje sadrži odgovarajući jedinični dozni oblik u odgovarajućoj posudi ili kontejneru, kao što je staklena bočica, unapred napunjeni špric ili drugi kontejner koji je hermetički zatvoren. Jedinični dozni oblik može biti pružen kao sterilni slobodni rastvor koji sadrži anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je pogodan za parenteralnu primenu. Jedinični dozni oblik može biti pružen kao sterilni liofilizovani prah koji sadrži anti-alfa toksin antitelo ili fragment koje je pogodan za rekonstituciju.
[0231] Jedinični dozni oblik može biti pogodan za intravenoznu, intramuskularnu, intranazalnu, oralnu, topikalnu ili subkutanu primenu. Dakle, tehnologija obuhvata sterilne rastvore pogodne za svaku rutu primene. Tehnologija dalje obuhvata sterilne liofilizirane praškove koji su pogodni za rekonstituciju.
[0232] Kao i kod svakog farmaceutskog proizvoda, ambalažni materijal i kontejner su dizajnirani da zaštite stabilnost proizvoda tokom skladištenja i isporuke. Dalje, ovde navedeni proizvodi uključuju uputstva za upotrebu ili drugi informacioni materijal koji savetuje lekara, tehničara ili pacijenta o tome kako da na odgovarajući način spreči ili tretira bolest ili poremećaje u pitanju. Drugim rečima, predmet proizvodnje sadrži instrukcije koje ukazuju ili sugerišu režim doziranja, uključujući, ali ne ograničavajući se na stvarne doze, postupke nadgledanja i druge informacije o nadgledanju.
[0233] Konkretno, tehnologija pruža predmet proizvodnje koji sadrži ambalažni materijal, kao što su kutija, bočica, cev, epruveta, kontejner, unapred napunjeni špric, sprej, insuflator, intravenozna (i.v.) vrećica, koverta i slično; i najmanje jedan jedinični oblik doze farmaceutskog agensa se nalazi u ambalažnom materijalu, gde farmaceutski agens sadrži tečnu formulaciju koja sadrži antitelo. Materijal za pakovanje sadrži instrukcije koje ukazuju na to kako se antitelo može koristiti za sprečavanje, tretman i/ili upravljanje jednom ili više simptoma povezanih sa bolestima ili poremećajima.
Primeri
[0234] Primeri koji su navedeni u nastavku ilustruju određena antitela i njihovu upotrebu, i ne ograničavaju tehnologiju.
Primer 1: Materijali i postupci
[0235] U nastavku su dati materijali i postupci koji su korišćeni za Primer 2 do Primera 9 i Primer 11 odo Primera 13.
Kloniranje i eksprimiranje wt S. aureus AT i ne-hemolitićkog mutanta H35L
[0236] Genomska DNK iz Staphylococcus aureus soja ATCC BAA1556 je korišćena za amplifikaciju divljeg tipa gena alfa toksina (AT) sa PCR. Reakcija sadrži napredni prajmer, atatatgagctcgcagattctgatattaatattaaaacc (SEQ ID NO: 41), obrnuti prajmer, atatataagcttaatttgtcatttcttctttttccc (SEQ ID NO: 42) i otprilike 10 ng genomske DNK u 50 μl reakciji koristeći Herculase II polimerazu (Stratagene). Rezultujući fragment je razblažen sa Sac I i Hind III i ligiran u pCold II DNA vektor (TaKaRa), u okviru sa N terminalnom 6 X His oznakom. H35L mutant je generisan mutacijom usmerenom na mesto gena divljeg tipa pomoću QuikChange II XL smernice za usmerenu mutagenezu (Stratagene), prema uputstvima proizvođača. Mutagenski prajmeri koji su korišćeni za mutagenezu bili su gataaagaaaatggcatgctcaaaaaagtattttatagttttatc (SEQ ID NO: 43) i gataaaactataaaatacttttttgagcatgccattttctttatc (SEQ ID NO: 44).
4
[0237] Sekvence od divljeg tipa AT i ATH35Lmutanta su potvrđene automatizovanim sekvenciranjem DNK. Alfa toksin divljeg tipa i H35L mutanta su eksprimirani u E. coli soju BL21.50 ml kultura preko noći koja se uzgaja u LB plus karbenicilin je razblažena 1:10 u kulturi od 500 ml i uzgaja se na 37°C do A600od oko 0,5. Kultura je prebačena na 15°C tokom 30 minuta, i zatim je dodato 1 M IPTG kako bi se postigla konačna koncentracija od oko 100 mM. Kultura je inkubirana još 24 sata na 15°C. Ćelije se sakupljaju centrifugiranjem.
Prečišćavanje rekombinantnog, his-označenog alfa toksina (rAT-his)
[0238] Peleti bakterijskih ćelija su otopljeni na ledu i ponovo suspendovani u Ni-NTA puferu A (20 mM natrijum-fosfat, pH 7,2, 300 mM NaCl). Ćelije su lizirane mikrofluidizacijom (Microfluidics Model M-110P) pri 20,000 psi, i sirovi lizat je razbistren centrifugiranjem na 27000 x g tokom 10 minuta na 4°C. Nakon 0,2 μm-filtracije, supernatant je postavljen na 5 ml Ni-NTA Superflow kolonu (Qiagen) uravnoteženu sa Ni-NTA puferom A. RAT-his je eluiran sa 300 mM i 500 mM imidazol postepenim gradijentom, fragmenti su sakupljeni u cevi koje sadrže EDTA u konačnoj koncentraciji od 1 mM, i dijalizuju se u SP pufer A (50 mM natrijum-fosfat, pH 7,0, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA). Dializati su postavljeni na 5 ml HiTrap SP Sepharose FF kolonu (GE Healthcare) u SP pufer A i rAT-his je eluiran sa postepenim gradijentom do 1 M NaCl. Fragmenti koje sadrže rAT-his su dijalizovani u 1X PBS, pH 7,2 sa 1 mM EDTA i alikvoti su zamrznuti na -80°C.
Prečišćavanje domaćeg alfa toksina iz S. aureus
[0239] Prirodni alfa toksin (nAT) je prečišćen od S. aureus Wood soja. S. aureus Wood je tokom noći gajeno u triptičkoj soji (TSB) na 37°C, uz mešanje (npr. oko 250 obrtaja u minuti). Supernatant kulture se sakuplja centrifugiranjem, pa se dovodi 75% zasićenja čvrstim amonijum sulfatom. Posle mešanja 3 sata na 4°C, talog je uhvaćen centrifugiranjem na 12,000 x g tokom 45 min, resuspendovan u SP puferu A (25 mM natrijum acetat, pH 5,2, 20 mM NaCI, 1 mM EDTA) i dijalizovan protiv SP pufera A preko noći na 4°C sa jednom zamenom. Nerastvoreni materijal je uklonjen centrifugiranjem na 27000 x g tokom 30 minuta na 4°C.
Rastvorljivi dijalizat je filtriran (0,2 μm) i postavljen na 10 ml SP Sepharose FF kolonu (GE Healthcare) uravnoteženu sa SP puferom A. Vezani nAT je eluiran linearnim gradijentom do 300 mM NaCI, praćeno koracima od 0,5 i 1 M NaCl. Fragmenti koje sadrže nAT su grupisani i dijalizovani preko noći u PBS, pH 7,2 sa 1 mM EDTA. Za završnu obradu, dijalizat je postavljen na kolonu visoke rezolucije HiPrep Sephacryl S-200 (GE Healthcare) pri brzini protoka od 1,3 ml/min u 1X PBS, pH 7,2 sa 1 mM EDTA. Fragmenti koje sadrže NAT su grupisani, aliokotirani i zamrznuti na -80°C.
Imunizacije/generisanje hibridoma
[0240] Osmodnevni Veloclmmune miševi primili su 5 krugova potkožnih injekcija rATH35Lna više mesta nakon RIMMS režima imunizacije Kilpatrick i ostali (1997). Miševi su imunizovani u toku od 13 dana u intervalima od 2-3 dana. Za svaki krug imunizacije, miševi su prvo anestezirani sa izofluoranom. Imunogen je emulgovan u potpunom ili nedovršenom Frojndovom adjuvantu i TiterMax Gold adjuvantu, i bilateralno ubrizgan na potiljku vrata, pazuh, list i prepone. Test krvarenja su sakupljena na dan 13, i analizirana su u ELISA antigenu. Miševima je intraperitonealno dato povećanje pred-fuzije i žrtvovani su dana 17. Limfociti limfnih čvorova i splenociti su fuzionisani za mijeloma partner, kako bi stvorili stabilne hibridome.
Neutralizacija hemolitičke aktivnosti
[0241] Pedeset mikrolitara svakog supernatanta kulture hibridoma B ćelija je pomešano sa rekombinantnim alfa toksinom-His (rAT-his, 0,1 μg/ml konačne koncentracije) u 96-komoričnim pločama, nakon čega sledi dodavanje 50 μl 5% zečjih crvenih krvnih ćelija (RBC) u PBS. Kontrolne komorice su sadržale RBC i medijume za kulturu same, sa ili bez AT. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na 37°C, i netaknute ćelije su peletirane centrifugiranjem.50 μl supernatanta je preneto na novu 96-komoričnu ploču i A490je izmeren u spektrofotometru. Neutralizujuća aktivnost izračunata je relativno u odnosu na lizu sa RBC i rAT-his i izračunava sekao: % inhibicije = 100 x [100-(A490nAT+ Ab) /(A490nAT bez Ab)].
[0242] Takođe je testirana inhibicija sa prečišćenim monoklonskim antitelima. Anti-AT monoklonska antitela su dodata u 96-komoričnu ploču na oko 80 μg/mL u PBS i uzorci su serijski razblaženi (dvostruko) u PBS do konačne zapremine od 50 μL. Nezavisni IgG1 (R347) je uključen kao kontrola izotipa. Dvadeset i pet mikrolitara razblaživanja monoklonskih antitela je pomešano sa 25 μL nAT (prirodni alfa toksina) na oko 0,1 μg/mL u 96-komoričnim pločama sa okruglim dnom, praćeno dodavanjem 50 μL 5% RBC. Inhibicija hemolitičke aktivnosti izračunava se kao što je gore navedeno.
Eksprimiranje i prečišćavanje himernih anti-AT monoklonska antitela
[0243] Bistri mišji anti-AT supernatanti (približno 5L @ 30-50 mg/L) su koncentrisani filtracijom tangencijalnog protoka. Koncentrovani supernatanti su zatim propušteni preko pet 5 mL proteina G HiTrap HP kolona u nizu i vezani IgG je eluiran sa 50mM natrijum bikarbonata pH 11,0 i neutralizovan do približno pH 7,0 sa 1M fosfornom kiselinom. Neutralizovani materijal je ubačen u dve kolone HiTrap x FF (GE Healthcare) od 2 mL u nizu. IgG koji je sadržao protok je sakupljen i dijalizovan u PBS pH 7,2.
Neutralizacija A549 lize
[0244] Ćelije A549 su održavane u 5% CO237° C inkubatoru u RMPI dopunjenom sa ne-esencijalnom aminokiselinom, glutaminom i 10% fetalnim goveđim serumom. Ćelije su oprane jednom sa balansiranim Henkovim medijumima, i pokrivene na 10<4>/komorica pod 50 μl u RPMI, 5% FBS i inkubirame na 37°C sa 5% CO2tokom 20 sati. Anti-AT monoklonska antitela su dodata u 96-komoričnu ploču pri 80 μg/mL u RPMI i uzorci su serijski razblaženi (dvostruko) u RPMI. Irelevantan IgG1 (R347) je uključen kao kontrola izotipa. U posebnoj 96-komoričnoj ploči, 30 μl razblaženih antitela je pomešano sa 30 μl nAT (konačna koncentracija, 5 μg/ml). Pedeset mikrolitara iz svake komorice prebačeno je na ploču koja sadrži adherentne A549 ćelije. Uključene su kontrolne komorice sa A549 ćelijama sa ili bez nAT. Ploče su inkubirane na 37°C sa 5% CO2tokom 3 sata, centrifugirane i supernatant od 50 μl je prebačen na novu 96-komoričnu ploču. Liza ćelija je merena kao oslobađanje laktat dehidrogenaze (LDH) pomoću Cytotox 96 kompleta ne-radioaktivne analize (Promega) prema protokolu proizvođača. Pozadinski LDH je oduzeta iz svake komorice i izračunata je inhibicija LDH oslobađanja: % inhibicije = 100 x [100-(A590nAT+ Ab) /(A590nAT bez Ab)].
Neutralizacija THP-1 lize
[0245] THP-1 ćelije su održavane u 5% CO237°C inkubatoru u RPMI medijumu (Invitrogen) dopunjenom sa ne-esencijalnim aminokiselinama (Invitrogen), 2 mM glutaminom (Invitrogen) i 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen). Anti-AT monoklonska antitela su dodata u 96-komoričnu ploču na 80 μg/ml u RPMI, i uzorci su serijski razblaženi (dvostruko) u RPMI do konačne zapremine od 50 μL. Irelevantan IgG1 (R347) je uključen kao kontrola izotipa. Dvadeset i pet mikrolitara razblaživanja monoklonskog antitela je pomešano sa 25 μl prirodnog alfa toksina (nAT) na 1,5 μg/ml konačnog, nakon čega sledi dodavanje 50 μl RMPI ispranih THP-1 ćelija (10<6>ćelije/ml u RPMI sa 10% FBS) u 96-komoričnoj ploči. Kontrolne komorice se sastoje od THP-1 ćelija, samostalnih ili sa nAT. Ploče su inkubirane u 5% CO237° C inkubatoru tokom 3 sata, centrifugirane, i 50 μl supernatanta je preneto na novu 96-komoričnu ploču. Liza ćelija je merena kao oslobađanje laktat dehidrogenaze (LDH) pomoću Cytotox 96 kompleta ne-radioaktivne analize (Promega) prema uputstvima proizvođača. Inhibicija LDH oslobađanja računa se kao što je gore opisano.
Kloniranje anti-AT IgG monoklonska antitela i eksprimiranje kao potpuno ljudska monoklonska antitela
[0246] MRNK od pet klinova hibridoma 2A3, 10A7, 12B8, 25E9 i 28F6 su izolovani pomoću Dinabeads mRNK Direct Kit (Invitrogen). Prvi lanac cDNK sintetisan je pomoću SuperScript III (Invitrogen) reverzne transkriptaze i slučajnih heptamerskih prajmera. Ljudski Ig VL (kapa) i VH su pojačani pomoću PCR koristeći Ig-prajmer (Novagen, katalog # 69830). PCR amplifikovani VL i VH proizvodi su klonirani u TOPO TA vektor (Invitrogen pCR2,1-TOPO) i sekvencirani. VH i VL (kapa) iz svakog hibridoma su ponovo amplifikovani PCR dodavanjem restrikcionih enzimskih mesta za kloniranje u ljudski IgG.kapa.pOE vektor, gde je VL je kloniran na mestu BssHII/BsiVI spojen sa čovekom c-kapa i VH je kloniran na mestu BsrGI/Sall spojen sa konstantnim regionom teškog lanca čoveka IgG-1. Dobijeni pOE plazmidi su verifikovani sekvenciranjem DNK.
Eksprimiranje i prečišćavanje anti-alfa toksina monoklonsko antitelo
[0247] Plazmidna DNK pOE konstrukata je pripremljena korišćenjem Endofree Plasmid Maxi kit (Qiagen). POE plazmidi su transfektovani u 293F suspenzione ćelije koristeći 293fektinski reagens (Invitrogen) u eksprimirajućem medijumu Freestyle 293 (GIBCO).6 i 9 dana posle transfekcije, medijum za kulturu je sakupljen i IgG je prečišćen korišćenjem kolone proteina A-sefaroze (GE Healthcare). IgG koji sadrže vrhove su prikupljeni, dijalizovani u PBS, pH 7,4 i uskladišten na -70°C. Čistoća IgG proteina je potvrđena sa SDS-PAGE.
Mišji model upale pluća.
[0248] Dvadeset i četiri sata pre infekcije, grupe od deset 7-9 nedelja starih C57BL/6J miševa (Harlan) primile su 0,5ml monoklonsko antitelo u koncentracijama naznačenim putem i.p. injekcija. Životinje su zatim anestezirane sa izofluoranom, držane vertikalno i 0,05 ml S. aureus bakterijska suspenzija (1x10<8>CFU do 3x10<8>CFU) u sterilnom PBS inokulisana je u levu i desnu nozdrvu. Životinje su smeštene u kavez u ležećem položaju za oporavak, i posmatrane su dva puta dnevno tokom trajanja ispitivanja. Preživljavanje životinja je praćeno maksimalno 6 dana.
[0249] Alternativno, životinje su eutanizovane pomoću CO2inhalacije 48 sati posle bakterijske infekcije. Pluća i bubrezi uklonjeni su u sterilan PBS, homogenizovani, razređeni i pokriveni za prebrojavanje bakterija. Statistički značaj studija mortaliteta određen je testom log-ranga. Značaj bakterijskog oporavka od organa izračunat je korišćenjem analize varijanse i Dunetovog post-testa.
Mišji model dermonekroze
[0250] Grupe od pet 6-8 nedelja starih ženki BALB/c miševa (Harlan) su obrijane na leđima i date su intraperitonealne injekcije od 0,5ml IgG u koncentraciji koja je naznačena na grafikonu. Dvadeset četiri sata kasnije, miševi su inficirani potkožnom injekcijom 50 μL suspenzije bakterija (1 × 10<8>S. aureus). Životinje su nadgledane dva puta dnevno za znakove infekcije, i veličine apscesa su isto tad merene svaki dan.
Površina lezija izračunata je pomoću formule A = L x V. Statistička značajnost određena je korišćenjem analize varijanse i Dunetovog post-testa.
Analiza vezivanja receptora
[0251] Duhovi crvenih krvnih ćelija pripremljeni su inkubiranjem 5 mL ispranih i upakovanih zečjih crvenih krvnih ćelija (RBC) u 500 mL pufera za lizu (5 mM fosfata, 1 mM EDTA, pH 7,4) o/n na 4°C uz konstantno mešanje. Duhovi su zatim uklonjeni centrifugiranjem na 15000 x g i isprani 3 puta sa puferom za lizu. Zatim su isprani u PBS i resuspendovani u finalnoj zapremini od 3 mL.
[0252] kako bi se procenilo vezivanje nAT na ćelijske membrane, RBC duhovi su razređeni na OD600približno 0,2 u PBS i 50 μL je premazano na 1⁄2-komorica 96-komoričnih ploča (Costar) i inkubirano preko noći na 4°C. Tečnost je zatim uklonjena sa ploča, i komorice su blokirane sa 100 μL 1% BSA u PBS, pH7,4 tokom 2 sata na 4°C i oprane 3 puta sa PBS.20 molarni višak IgG je pomešan sa nAT na 3 μg/mL, i 50 μL je dodato u blokirane ploče. Ploče su inkubirane na 4°C tokom 2 sata i oprane 3 puta sa PBS. Biotin označen zečji anti-AT IgG je dodat u komorice pri 1 mg/mL, i inkubiran je na 4°C u trajanju od 1 sata, opran 3 puta i inkubiran je sa konjugatom streptavidin peroksidaze (1: 30,000, Jackson Immunoresearch). Komorice su isprane 3x, i razvijene su sa Sure Blue Reserve (KPL, Inc.). A450je pročitan korišćenjem čitača ploča (Molecular Devices) i izračunat je % vezanih AT. % AT vezani = 100 x (A450- AT IgG/ A450- AT sam)
Analiza oligomerizacije
[0253] Lipozomi su generisani koristeći Liposofast ekstruder (Avestin, Inc.) i membranu veličine pora od 100 nm. Smeša (5:1:4, molski odnos) fosfatidilholina žumanca jajeta (15 mg, Avanti Polar Lipida), fosfatidilglicerola (2,9 mg, Avanti Polar Lipida) i holesterola (5,8 mg, Avanti Polar Lipida) u hloroformu su sušeni na 40C ispod toka azota. Osušena lipidna folija je zatim rehidrirana sa 3 mL PBS, pH 7,4 (Invitrogen) i inkubirana na 37°C tokom 30 minuta Uzorak je zatim energično mešan dok se ne stvori ujednačena suspenzija, i zatim je prošlo 3 runde odmrzavanja i topljenja korišćenjem kupke izopropanola sa suvim ledom i vode na sobnoj temperaturi. Rastvor je potom prošlo kroz Liposofast ekstruder 21 puta.
[0254] AT (0,5 μg) je pomešan sa prečišćenim IgG, 5 μL RBC duhovima i PBS u finalnoj zapremini od 22 μL i inkubiran na 37°C tokom 45 minuta. Uzorci su zatim solubilisani u 5 μL SDS-PAGE puferu uzorka tokom 5 min na 37°C i 10 μL podvrgnuti SDS-PAGE u 4-12% pripremljenom poliakrilamidnom gelu (Invitrogen). Odvojeni proteini su zatim prebačeni u nitrocelulozu, blokirani 10 minuta sa Blocker Casein u PBS (Thermo Scientific) i ispitivani su sa zečjim anti-AT IgG (2 μg/mL) tokom 2 časa na sobnoj temperaturi uz konstantno mešanje. AT trake su detektovane nakon 1 sata inkubacije sa alkalnom fosfatazom označenim kozjim anti-zečjim 2, i razvijene su pomoću BCIP/NBT sistema supstrata membrane fosfataze (KPL, Inc.).
Merenje kinetičkih stopa i konstanati vezivanja (KD)
[0255] Konstanti kinetičkih stopa (kon, koff) za vezivanje anti-AT IgG antitela na prečišćeni nAT su merene koristeći format testa hvatanja IgG za snimanje na instrumentu BIAcore 3000 (BIAcore, Inc). Ukratko, pacovski anti-mišji-IgG je imobilizovan na CM5 senzorskom čipu prema uputstvima proizvođača. Konačna površinska gustina reagensa za hvatanje na senzorskom čipu je bila oko 2500 jedinica odziva (RU), kako je ovde opisano. Na ovom senzorskom čipu je takođe pripremljena i referentna ćelija protočna površina korišćenjem identičnog protokola imobilizacije i izostavljanja nAT. Anti-AT IgG antitela su pripremljena na 20 nM u instrument puferu (HBS-EP pufer koji sadrži 0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA i
4
0,005% P-20) zajedno sa dvostrukim serijskim razblaženjima nAT . Serijska razblaženja nAT su napravljene u rasponu od oko 0,78 nM do oko 50 nM, u instrument puferu.
[0256] Sekvencijalni pristup je korišćen za kinetička merenja. Svaki anti-AT IgG se prvi put injektira preko površina hvatanja i referentnih površina sa brzinom protoka od 50 μL/min. Kada se vezivanje uhvaćenog IgG stabilizuje, pojedinačna koncentracija nAT proteina je injektirana preko obe površine, brzinom protoka od 50 μL/min. Rezultujuće krive odgovora su korišćene za određivanje podataka o fazama asocijacije. Nakon injektiranja nAT, protok je zatim preusmeren nazad u instrument pufer u trajanju od 10 minuta kako bi se omogućilo sakupljanje podataka faze disociacije praćeno impulsom od 1 minuta od 10mM glicina, pH 1,5, kako bi se regenerisala površina za hvatanje IgG na čipu. Odgovori vezivanja od duplih injekcija svake koncentracije nAT zabeleženi su protiv svih anti-AT IgG.
[0257] Pored toga, nekoliko puferskih injekcija je podeljeno kroz seriju injekcija. odabrane puferske injekcije su korišćene zajedno sa referentnim odgovorom ćelija kako bi se ispravili injekcioni artefakti i/ili nespecifične interakcije vezivanja u sirovim skupovima podataka, obično nazvane „dvostruko referiranje“ (D.G. Myszka, Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit.12 (1999), pp.279-284). Potpuno ispravljeni podaci vezani za globalno uklapanje su bili u skladu sa modelom vezivanja 1:1 (BIAevaluation 4.1 softver, BIAcore, Inc, Uppsala, Švedska) koji je uključivao izraz koji treba ispraviti za masovno transportnoograničeo vezivanje, ako se to detektuje. Ove analize su odredile konstante kinetičke brzine (on, off), iz kojih se KDtada izračunava kao koff/kon.
Merenje nivoa citokina u S. aureus zaraženim plućima
[0258] Sedam do devet nedelja stari C57BL/6J miševi tretirani su sa 2A3.1hu (potpuno ljudski 2A3.1) ili R347 (45 mg/kg) intraperitonealnom injekcijom 24 sata pre intranazalne infekcije sa 1,5 x 10<8>cfu USA300 (BAA-1556, ATCC). Četiri i dvadesetčetiri sata posle infekcije miševi su eutanizovani i pluća su isprana 3 puta sa 1 ml PBS. Bronhoalveolarna lavažna tečnost (BAL) je smeštena na -70°C. Proupalni citokini su kvantifikovani korišćenjem kompleta mišjeg 7 pro-upalnog II citokina (Mesoscale, Gaithersburg, MD) prema uputstvima proizvođača. Nivoi citokina su eksprimirani kao pg/ml.
Kloniranje i eksprimiranje GST fuzionih proteina
[0259] Gene sekvence koje kodiraju AT1-50i AT51-293su amplificirani pomoću PCR iz pColdII AT klona koji je opisan gore. Reakcije sadržale su 10 ng AT-pColdll DNK i 0,1 mg svakog naprednog i reverznog prajmera ( AT1-50-F, atattggatccgcagattctgatattaatattaaaac (SEQ ID NO: 45) i AT1-50-R, atacttctcgagttatttattatgatttttatcatcgataaaac (SEQ ID NO: 46); ili AT51-293-F catagggatccaaactgctagttattagaacgaaag (SEQ ID NO: 47) i AT51-293-R, catagctcgagtcaatttgtcatttcttctttttcccaatc (SEQ ID NO: 48)), i * PCR polimerazu koja se koristi (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. ;Rezultujući PCR fragment je razblažen sa BamHI i Xhol i ligiran u vektor pGek 6P DNK (Stratagene) u ramu sa oznakom N terminalne glutation S transferaze (GST). Sekvence klonova su potvrđene automatizovanim sekvenciranjem DNK. ;;[0260] Eksprimiranje fragmenata izvršeno je sa BL21 (DE3) sojem E. coli kao domaćinom. Nekoliko kolonija odabrano je sa ploče i inokulisano u 100 mL LB 100 μg/ml ampicilina (Sigma Chemical Company) i poraslo je na 37°C. Kulture su tokom noći razblažene 1:100 u 3 x 1L kulture LB 100 μg/ml ampicilina, i uzgajane sa mešanjem pri približno 250 obrtaja u minuti do OD600 od oko 0,8. Eksprimiranje proteina je zatim indukovano dodatkom 1 mM IPTG. Kulture su nastavile inkubaciju 2 sata na 37°C uz mešanje. Bakterijske ćelije se sakupljaju centrifugiranjem i zamrzavaju na -20°C. ;;[0261] Ćelijske pelete su resuspendovane u 100 mL PBS, pH 7,4 (Invitrogen) i lizirane mikrofluidizacijom (Microfluidics Model M-110P) na 20,000 psi, i sirovi lizat je očišćen centrifugiranjem na 27,000 x g tokom 10 minuta na 4°C. Dobijeni supernatant je postavljen na kolonu GSTrap FF (GE Healthcare) i GST-AT1-50i rastvorljivi fragment od GST-AT51-293je prečišćen prema uputstvima proizvođača. Nerastvorni GST-AT51-293fragment je prečišćen iz nerastvornih ćelijskih peleta. Nerastvorni materijal je solubilizovan u toku oko sat vremena na sobnoj temperaturi, uz nežno mešanje, u 3 M gvanidin-HCI u 25 mM natrijum fosfatu, pH 7,4. Solubilizovani materijal je razblažen 7 puta sa puferom za refoldovanje A [25 mM natrijum-fosfat, pH 7,4 sa 2 M gvanidin-HCI]. GST-AT51-293je refoldovan postepenom dijalizom. Jednaka zapreminu pufera za refoldovanje B [25 mM natrijum-fosfata, pH 7,4] dodata je u dijaliznu čašu posle svakih 12 - 15 sati dijalize na 4°C za koncentraciju gvanidina od približno 2, 1, i zatim 0,5 M. GST- AT51-293tada je dijalizovan protiv puferaza refoldovanje B tokom 24 sata. Konačni dijalizat je razblažen centrifugiranjem, i rastvorljivi fragment je prečišćen preko GSTrap kolone kao što je gore opisano. ;Dot blot analiza ;;[0262] Preklapajući peptidi koji obuhvataju aminokiseline od 40 do 293 su hemijski sintetisani (New England Peptide). Sinteza AT1-50je pokušana, ali nije uspela. Alfa toksin (AT), AT peptidi i AT fragmenti (1 μg) primećeni su na nitrocelulozi i blokirani 10 min sa blokator kazeinom u PBS. Blotovi su zatim ispitivani sa 2 μg/mL pojedinačnog IgG tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Blotovi su isprani i inkubirani pomoću alkalne fosfatazom konjugovane kozjeg anti-mišjeg ili kozje anti-zečjeg IgG (1:1000, Caltag Laboratories) u trajanju od 1 sata i razvijene pomoću BCIP/NBT sistema supstrata membrane fosfataze (KPL, Inc.). ;;ELISA karakterizacija vezivanja LC10 YTE na alfa toksin i LukF-PV ;;[0263] Bakterijski lizat koji sadrži His-označeni alfa toksin ili LukF-PV je obložen na površini ploče sa 96 zrna tokom noći na 4°C. Ploče su isprane šest puta sa PBS/0,05% Tween 20 i blokirane sa 10% Superblock blokirajućim puferom (Pierce, Rockford, IL) na 37 C tokom 1 sata. LC10 YTE ili mišje anti-His anti-His monoklonsko antitelo na 2μg/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) je dodat u komorice i inkubiran tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim oprane šest puta sa PBS/0,05% Tween 20. Vezani LC10 YTE ili mišje anti-His monoklonsko antitelo su detektovani korišćenjem anti-ljudskih ili anti-mišjih IgG HRP konjugata (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA), respektivno. ;;Generisanje himernih varijanti između alfa toksina i LukF-PV ;;[0264] Himerne varijante sastavljene od delova alfa toksina i LukF-PV su generisane kako bi se identifikovao region vezivanja LC10 YTE na alfa toksin. DNK konstrukti šest alfa toksin himernih varijanti koji kodiraju LukF-PV regione na aa 1-51, aa 52-110, aa 111-147, aa 148-205, aa 204-241 ili aa 248-293 su generisani sintezom gena. DNK konstrukti koji su kodirani za druge himerne varijante su stvoreni preklapanjem proširenog PCR koristeći pET3d plazmid koji kodira alfa toksin ili LukF-PV (in-house plazmid) kao šablone. Svi DNK konstrukti su zatim klonirani u pET3d bakterijskom vektoru eksprimiranja (EMD Chemicals Inc, Philadelphia, PA) i transformisani u E. coli soju BL21 (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Transformisane ćelije BL21 (DE3) su uzgajane u MagicMedia E.coli eksprimirajućem medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) kako bi eksprimirale varijante proteina koristeći standardne protokole. ;;Karakterizacija karakteristika vezivanja LC10 YTE do himernih varijanti koristeći ProteOn ;[0265] Karakteristike vezivanja LC10 YTE za alfa toksin/LukF-PV himerne varijante su proučavane pomoću instrumenta ProteOn XPR36 (BioRad, Hercules, CA). Standardno aminsko spajanje korišćeno je za imobilizaciju poliklonskog anti-alfa toksin antitela (in-house generisano antitelo) u 10 mM natrijum acetatu [pH 5,0] na površinu GLC biosenzorskog čipa na oko 5000 rezonantnih jedinica (RU) za svaki kanal. Alfa toksin/LukF-PV himerni proteini u supernatantu bakterijskog lizata injektirani su na imobilizovanu GLC površinu tako da se dobije toksični odgovor od oko 200RU. Netransformirani bakterijski lizat supernatant je takođe injektiran pod istim uslovima kao referentni kanal. LC10 YTE uzorci su pripremljeni u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) (pH 7,4), 0,005% Tween-20 i injektirani na 90 μL/min u trajanju od 150 ili 180 sekundi u koncentracijama od 50nM do 3,125nM. Korišćeno je vreme disocijacije od 600 ili 800 sekundi. Nivoi eksprimiranja himernih varijanti takođe su praćeni nakon injektiranja LC10 YTE na sledeći način: poliklonska antitela anti-alfa toksina proticana su na 90 μL/min tokom 150 ili 180 sekundi u koncentracijama koje se uobičajeno kreću od 50 nM do 3,125nM sa vremenom disocijacije od 600 ili 800 sekundi. Površina se dvaput regeneriše injektiranjem glicina (10mM, pH 1,5) na 100 μL/min u trajanju od 30 sekundi. Svi senzorni podaci su obrađeni pomoću softvera ProteOn Manager 3.0.1 ;;Primer 2: Generisanje anti-alfa toksina monoklonskog antitela ;;[0266] Monoklonska anti-alfa toksin antitela (monoklonska antitela) su generisana u Veloclmmune miševima koji su genetski konstruisani da sadrže repertoar antitela sa potpuno ljudskim varijabilnim regionima fuzionisanim na mišji konstantni domen. Dobijena antitela su ljudsko:mišje himere koji se lako pretvaraju u potpuno ljudski IgG genetskim fiksiranjem ljudskog varijabilnog domena iz himernog monoklonskog antitelo sa konstantnim regionima iz kloniranog ljudskog IgG-1. Miševi su imunizovani sa nehemolitičkim AT mutantom (ATH35L), opisanim ovde, i hibridomi su generisani korišćenjem standardnih postupaka. Na početku, otkriveno je više od 1800 supernatanta hibridoma koje sadrže IgG koji je vezao rekombinantni AT (rAT-his) pomoću ELISA antigena. Supernatanti hibridoma koji su pokazivali vezivanje za rAT-his bili su zatim ispitani za aktivnost inhibicijom rAt-his posredovane lize zećjih crvenih krvnih ćelija (RBC) u hemolitičkom testu, gde je skup funkcionalnih monoklonskih antitela smanjen na oko 250. Supernatanti hibridoma su zatim normalizovani za nivo IgG i upoređeni su inhibitorni postupci. Trinaest najpotentnijih rAT-his inhibitora odabran je za ograničeno kloniranje razblaživanja i koriste se za ;;;4 ;eksprimiranje i prečišćavanje IgG u manjim razmerama. Nakon pregleda ovih klonova i kasnije biohemijske i in vivo karakterizacije, kako je opisano u nastavku, VH i VL sekvence su dodatno optimizovane da generišu dodatna antitela, kako je navedeno u Tabeli 7. ;;Primer 3: Inhibicija citolitičke aktivnosti ;;[0267] Inhibitorne aktivnosti 13 prečišćenih anti-AT IgG su upoređene u hemolitičkom testu. Prečišćena anti-AT monoklonska antitela su titrirana u hemolitičkom testu u prisustvu konstantnih količina nAT i zečjih crvenih krvnih ćelija. Svako monoklonsko antitelo je titrirano sa oko 20 μg/mL u prisustvu konstantne količine prirodnog AT (nAT) i zečjih crvenih krvnih ćelija (RBC). Hemoliza je merena oslobađanjem hemoglobina u supernatant. Procenat (%) inhibicije hemolize izračunava se na sledeći način: % inhibicija = 100*[100-(A490nAT+ Ab) /(A490nAT bez Ab)]. Reprezentativni hemolitički testovi koji pokazuju trinaest najpotentnijih rAT-his inhibitora su prikazani na slikama 1A i 1B. Ne-specifična IgG kontrola (R347) uključena je kao negativna kontrola.
[0268] Samo 7 od 13 prečišćenih monoklonskih antitela (monoklonska antitela, 2A3.1, 10A7.5, 11D12.1, 12B8.19, 15B6.3, 25E9.1 i 28F6.1) inhibiralo je nAT posredovanu RBC lizu (pogledati Slike 1A i 1B). Tri antitela (2A3.1, 10A7.5 i 12B8.19) su bili snažni inhibitori i pokazali su oko 80% inhibicije nAT posredovane RBC lize u odnosu 1:1 (mol IgG:mol AT). Ovi rezultati sugerišu da generisana monoklonska antitela mogu inhibirati formiranje pora kod zečjih RBC.
[0269] Ljudski eritrociti ne poseduju veliki broj receptora za AT. Shodno tome, ljudski RBC nisu tako osetljivi kao zečje RBC na nAT posredovanu lizu, i verovatno nisu primarna meta za AT tokom infekcije. Drugi tipovi ćelija (npr. epitelne, limfociti, monociti i makrofagi) su relevantnije mete za efekte nAT tokom infekcije stafilokoka. Aktivnost prečišćenih antitela ispitana je u nAT posredovanoj lizi ljudskih ćelijskih linija, A549 (alveolarna epitelna ćelijska linija) i THP-1 (monocitna ćelijska linija). Monoklonska antitela titrirana su protiv konstantnog nivoa nAT u prisustvu bilo A549 ili THP-1 ćelija. Liza ćelija je kvantifikovana oslobađanjem laktat dehidrogenaze (LDH) i utvrđen je % inhibicije oslobađanja LDH, kako je ovde opisano. Rezultati su grafički prikazani na Slikama 2A i 2B. Monoklonska antitela, koja su inhibirali lizu zečjih RBC, takođe inhibiraju nAT posredovanu lizu kod ljudskih A549 i THP-1 ćelija (pogledati Slike 2A i B, respektivno), izuzev 11D12.1 koji je inhibirao lizu A549 ćelija i nije imao efekta na nAT posredovanu lizu THP-1 ćelija. Potentna anti-AT aktivnost pokazana ovim monoklonskim antitelima naglašava potencijalnu korisnost ovih antitela za inhibiranje AT aktivnosti tokom infekcije, čime se ograničava napredovanje simptoma i bolesti povezanih sa stafilokokom.
Primer 4: Pasivna imunizacija sa anti-AT monoklonskim antitelom smanjuje dermonekrotske lezije
[0270] S. aureus je vodeći uzrok infekcija kože i mekog tkiva (SSTI) kako u bolnici, tako i uobičajeno, i te infekcije se često karakterišu upalom, oštećenjem tkiva i formiranjem gnoja. AT može igrati ulogu u ovim infekcijama koje dovode do hiperupalnog odgovora i oštećenja tkiva, i inhibicija AT funkcije bi onda ograničila sposobnost bakterija da izazovu ozbiljne bolesti. Kako bi se utvrdila korisnost anti-AT monoklonskih antitela u minimizovanju, smanjenju ili eliminaciji efekata S. aureus infekcije, grupe od 5 miševa su injektirane intraperitonealno (IP) sa svakim od 7 inhibitornih monoklonska antitela (npr., oko 5 mg/kg), i kontrola izotipa IgG-1 (R347) kontroliše 24 sata pre subkutane infekcije S. aureus Wood. Veličina dermonekrotskih lezija je merena dnevno tokom 6 dana i dokumentovana fotografijom, kao što je prikazano na Slici 3A (dan 6 prikazan na Slici 3A).5 najsnažnijih in vitro inhibitora nAT funkcije (2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 i 28F6.1), značajno su smanjili veličinu lezije u odnosu na kontrolu R347, i najmanje potentna monoklonska antitela, in vitro (11D12.1 , 15B6,3), nisu imali značajan uticaj na veličinu lezije u odnosu na kontrolu, kao što je prikazano na Slikama 3A i 3B. Slika 3B grafički ilustruje smanjenje veličine lezije tokom vremena.2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 i 28F6.1 su snažni inhibitori AT funkcije in vitro, a takođe pokazuju i snažan profilaktički efekat u mišjem modelu SSTI. Dodatna antitela, LC10, QD20, QD33 i QD37 takođe su testirana u modelu dermonekroze. Ova monoklonska antitela su injektirana iintraperitonealno (IP) u pet miševa po group_at 1 i 0,5 mg/kg 24 sata pre subkutane infekcije S. aureus Wood, kao što je gore opisano. Rezultati su prikazani na Slikama 17A i B.). P-vrednosti su izračunate korišćenjem Dunetovog post-testa. Za 1 mg/kg eksperimente, p-vrednost za kontrolu R347 u odnosu na test Abs je p <0,0001. Za 0,5 mg/kg eksperimente, p-vrednost za kontrolu R347 u odnosu na test Abs je p <0,05.
Primer 5: Pasivna imunizacija sa anti-AT monoklonskim antitelom poboljšava preživljavanje kod mišje upale pluća
4
[0271] Profilaksa sa najpotentnijim anti-AT monoklonskim antitelom je testirana u modelu mišje upale pluća. C57BL/6J miševi su pasivno imunizovani sa oko 5 mg/kg, oko 15 mg/kg i oko 45 mg/kg 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19 ili 28F6.1, dvadeset i četiri sata pre intranazalne infekcija sa S. aureus USA300 (BAA-1556). Preživljavanje je zatim nadgledano 6 dana i upoređivano sa kontrolom izotipa (R347) na 45 mg/kg, kao što je prikazano na Slikama 4-7. Statistička značajnost izračunata je korišćenjem log-rank testa. Slika 4 grafički ilustruje procenat preživljavanja u toku S. aureus infekcije nakon pasivne imunizacije sa različitim količinama 12B.19 monoklonskog antitela. Slika 5 grafički prikazuje procenat preživljavanja u toku S. aureus infekcije nakon pasivne imunizacije sa različitim količinama 2A3.1 monoklonskog antitela. Slika 6 grafički ilustruje procenat preživljavanja u toku S. aureus infekcija nakon pasivne imunizacije sa različitim količinama 28F6.1 monoklonskog antitela. Slika 7 grafički prikazuje procenat preživljavanja u toku S. aureus infekcija nakon pasivne imunizacije sa različitim količinama 10A7.5 monoklonskog antitela.
[0272] Sva prikazana anti-AT antitela rezultovala su značajnim poboljšanjem preživljavanja u odnosu na kontrolu, što dovodi do najmanje 90% preživljavanja u dozi od 45 mg/kg (pogledati Slike 4-7). Veruje se da je alfa toksin ključna determinanta virulencije kod stafilokokne upale pluća. Prikazani rezultati ilustruju da je pasivna primena snažnih inhibitornih monoklonskih antitela validan pristup za prevenciju bolesti. Shodno tome, ovde predstavljena ispitivanja nad životinjama podržavaju ulogu AT u stafilokoknoj bolesti, i pružaju podršku za upotrebu monoklonskih antitela koja inhibiraju AT funkciju kako bi ograničili težinu bolesti, ili čak smrt, koji su povezani sa S. aureus infekcijom.
[0273] Kako bi se dalje opisao uticaj anti-AT monoklonskog antitela na bakterijske brojeve tokom infekcije, potpuno ljudska verzija 2A3.1 monoklonskog antitela (npr., 2A3hu) je isporučeno profilaktički miševima 24 sata pre intranazalne infekcije sa približno 1,3 x 10<8>cfu od S. aureus USA300. Četrdeset osam sati nakon infekcije, miševi su eutanizovani, i njihova pluća i bubreg su sakupljeni i obrađeni za bakterijsko popisivanje (pogledati slike 8A i 8B).4 i 24 sata posle infekcije, miševi su eutanizovani i uzorci su uzeti za merenje proizvodnje citokina (opisano u nastavku, i pogledati Sliku 9) i za histopatološku analizu (opisano u nastavku, i pogledati Sliku 10). P-vrednosti su izračunate korišćenjem Dunetovog post-testa. Reprezentativni rezultati bakterijskog popisivanja su prikazani na Slikama 8A i 8B. Profilaktička primena 2A3hu rezultovala je značajnim smanjenjem broja bakterija i u plućima (pogledati Sliku 8A) i u bubrezima (pogledati Sliku 8B) u odnosu na kontrolu R347, što ukazuje na to da inhibicija AT funkcije može ograničiti progresiju bolesti, poboljšati klirens i ograničiti sistemsko širenje invazivnog organizma.
[0274] Dodatna antitela, LC10, QD20, QD33 i QD37 takođe su testirana u modelu upale pluća. Ova monoklonska antitela su injektirana iintraperitonealno (IP) kod deset miševa po grupi pri 5 mg/kg 24 sata pre intranazalne (IN) infekcije sa približno 2 x 10<8>cfu od S. aureus USA300. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na Slici 18. P-vrednosti su izračunate korišćenjem Dunetovog post-testa. P-vrednost za 2A3 monoklonsko antitelo u odnosu na QD37 je p = 0,0072; p-vrednost za 2A3 monoklonsko antitelo u odnosu na LC10 bila je p = 0,0523; p-vrednost za 2A3 monoklonsko antitelo u odnosu na QD33 bila je p = 0,0521.
Primer 6: Inhibicija AT u modelu upale pluća smanjuje proizvodnju proupalnog citokina
[0275] S. aureus infekcija upale pluća obično je praćena prekomernom proizvodnjom proupalnih citokina za koje se misli da dovode do povećane aktivacije imunih ćelija i infiltracije, što naposletku dovodi do povećane zagušenosti i nekroze tkiva (Bubeck Wardenburg,J.2007). Pokazalo se da S. aureus mutant sa AT brisanjem ima smanjenu virulenciju u odnosu na svog izogenog divljeg tipa S. aureus u modelu muške upale pluća. Dalje je pokazano da aktivna i pasivna imunizacija protiv AT smanjuje eksprimiranje IL-1β, poznatog medijumatora akutne povrede pluća, i štiti miševe od teške upale pluća (Bubeck Wardenburg,J.2007;
Bubeck Wardenburg,J.2008). Ovi rezultati ukazuju na to da inhibiranje AT u toku S. aureus infekcije može smanjiti proizvodnju proupalnih citokina, i na taj način ograničiti prekomernu ćelijsku infiltraciju, gde krajnji rezultat ima manje simptoma upale pluća i poboljšan bakterijski klirens, kao što je gore navedeno.
[0276] Kako bi testirali ovu hipotezu, miševi su pasivno imunizovani sa 2A3hu 24 sata pre intranazalne infekcije sa približno 1,3 x 10<8>cfu od S. aureus USA300. Četiri i dvadeset četiri sata posle infekcije miševi su eutanizovani, i polovina pluća je fiksirana i pripremljena za hematokilin i eozin bojenje i mikroskopski pregled, dok je tečnost bronhoalveolarna lavažna tečnost sakupljena sa druge strane, i obrađena je za određivanje nivoa citokina. Reprezentativni rezultati proizvodnje citokina nakon pasivne imunizacije prikazani su na Slici 9. Slika 10 fotografski ilustruje efikasnost pasivne imunizacije sa ovde opisanim monoklonskim antitelima.
[0277] Četiri sata posle nivoa infekcije citokini su slične kod miševa tretiranih sa R347 i 2A3hu, međutim, 24 časa nakon infekcije, nivoi IL-6, TNF-α, KC i IL-1β su smanjeni kod životinjama tretiranih sa 2A3hu,
4
kao što je prikazano na Slici 9 (pogledati zaokružene rezultate u vremenu od 24 sata), što ukazuje na to da je profilaktička primena 2A3hu rezultovala smanjenjem nivoa detektovanih citokina, u odnosu na kontrolu. Ovi podaci su podržani rezultatima histopatološkog pregleda pluća, u kom su miševi tretirani sa R347 imali istaknutu upalu pluća, nekrozu i alveolitis, zajedno sa prisustvom bakterijskih kolonija (pogledati gornje leve i donje leve odeljke na Slici 10). Nasuprot tome, životinje tretirane sa 2A3hu imale su ograničenu upalu pluća bez vidljivosti nekroze, alveolitisa ili bakterijskih kolonija (pogledati gornje desne i donje desne odeljke na Slici 10). Zaštitni efekat anti-AT monoklonskih antitela u modelu upale pluća povezan je sa smanjenim upalnim odgovorima koji mogu ograničiti oštećenje lokalnih tkiva i promovisati očuvanje bakterija.
Primer 7: Kinetika vezivanja i nadmetanje
[0278] Merenja afiniteta su izvedena korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR), kako bi se dalje karakterisale monoklonska antitela koje su pokazale snažnu inhibitornu aktivnost. Prečišćeni IgG je uhvaćen na senzoru pomoću pacovskog anti-mišjeg IgG, i čip je bio izložen rastvoru različitih koncentracija nAT. Izmerene su konstante brzine asocijacije i disociacije, od kojih su određene konstante vezivanja. Antitela 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 i 12B8.19 su imala slične afinitete sa KDvrednostima 601, 504, 337 i 485 pM respektivno, dok je 28F6.1 pokazao KDvrednost od 13 nM, kako je prikazano u donjoj tabeli. KDje izračunat kao koff/kon.
[0279] Eksperimenti nadmetanja takođe su sprovedeni korišćenjem SPR, čiji rezultati govore da antitela 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 i 12B8.19 verovatno vezuju isti ili sličan epitop.
[0280] IC50i Kdvrednosti su prikazane za monoklonska antitela QD20, LC10, QD33, QD37 i 2A3GL u nastavku
[0281] IC50je izračunat korišćenjem RBC hemolitičkog testa sa S. aureus alfa toksinom na 0,1 mg/ml
Primer 8: Formiranje blokova inhibitornih monoklonskih antitela od SDS-otpornog Heptamera
[0282] Veruje se da S. aureus alfa toksin (AT) lizira ćelije u višestepenom procesu u kom se sekrecioni rastvorljivi monomerni AT molekul vezuje za receptor ćelijske površine, ili ne-specifično adsorbuje na ćelijske membrane, oligomerizuje u heptamernu pred-poru na površini ćelije, i podleže konformacijskoj promeni koja dovodi do formiranja 14-lančanog transmembranskog β-barela koji posreduje kasnijom lizom ciljanih ćelija. Mehanizam inhibicije od strane monoklonskih antitela koja su ovde opisani, dodatno je okarakterisan kako bi se odredilo na kom koraku inhibitorna monoklonska antitela blokiraju AT-funkciju. Ispitivana je sposobnost ovih monoklonska antitela da spreči vezivanje AT na zečje RBC duhove vezane za 96-komoričnu ploču sa kulturom tkiva. ELISA 96-komorične ploče su obložene RBC duhovima i blokirane sa 2% BSA. Duhovi su zatim inkubirani sa nAT /- 20 molarnim viškom anti-AT IgG. Vezivanje nAT je zatim detektovano uz pomoć zečjeg anti-AT IgG, i procenjeno je % vezivanje; % vezivanja = 100 x [100-(A490nAT+ mAb) /(A490nAT bez monoklonskih antitela)]. Na 20 molarnom IgG višku, nije bilo inhibicije vezivanja nAT na zečje RBC membrane, kao što je prikazano na Slici 11, što ukazuje na to da ova inhibitorna monoklonska antitela nisu delovali na koraku vezivanja receptora.
[0283] Pored ćelijskih membrana, pokazalo se da AT i drugi toksini koji formiraju pore lako sastavljaju i formiraju pore u liposomskim membranama. U početku, efekat anti-AT IgG na formiranje AT heptamera
4
testiran je na lipozomima. Nakon inkubacije AT sa 10-kratnim molarnim viškom lipozoma (lipid: AT, wt:wt), u prisustvu IgG, formiranje heptamera ispitano je western blot analizom, kako je prikazano na Slici 12. Uzorci su zatim solubilizovani u SDS-PAGE puferu uzorka na 37C, i formiranje heptamera je detektovano western blot analizom. Prisustvo heptamera otpornog na SDS je jasno vidljivo na vrhu gela prikazanog na Slici 12, u trakama 6 i 7 (npr., mAb9D7.3, i bez kontrolne trake IgG). Sva inhibitorna monoklonska antitela uklonila su formiranje heptamera, dok irrelevantna kontrola izotipa (npr. Traka 6; 9D7,3) nije imala nikakvog efekta. Inhibicija aktivnosti oligomerizacije potvrđena je korišćenjem monoklonskih antitela 2A3.1, 10A7.5 i 12B8.19 u testu oligomerizacije na zečjim RBC duhovima, kako je ilustrovano u reprezentativnim western blotovima prikazanim na Slikama 13A i 13B. AT je inkubiran sa titracijom IgG pre inkubacije sa zečjim duhovima eritrocita i detektovanja formiranja heptamera od strane SDS-PAGE. Monoklonska antitela 2A3.1, 10A7.5 i 12B8.19 efektivno inhibiraju formiranje ATT heptamera čak i pri IgG:toksin (mol:mol) odnosu od 1:1, i efekat inhibicije oligomerizacije je titriran, s obzirom da su nivoi monoklonskog antitela smanjeni (pogledati Slike 13A i 13B, izgled heptamera kod molarnih odnosa 0,5:1 i 0,25:1). Ovi rezultati sugerišu da monoklonska antitela 2A3.1, 10A7.5 i 12B8.19 spriječavaju AT lizu posredovanu korz ćelije putem inhibicije formiranja heptamera otpornog na SDS.
Primer 9: Konverzija u potpuno ljudski IgG
[0284] Potpuno ljudski IgG uključuje varijabilne domene teških (VH) i lakih (VL) lanaca iz himernih monoklonskih antitela koja su ovde opisani, genetski fuzionisane sa konstantnim domenima ljudskog IgG-1. VHi VLiz svakog od himernih monoklonska antitela su klonirani, sekvencirani i fuzionisani sa ljudskim IgG-1 VHi ljudskim kapa konstantnim domenima, respektivno. Rezultujući potpuno ljudski IgG-1 su pokazali da zadržavaju ljudski varijabilni region responzivnim, i da zadržavaju vezujuće osobine monoklonskog antitela od interesa. Potpuno ljudska antitela su eksprimirana, prečišćena i njihova aktivnost je upoređena sa himernim monoklonskim antitelima izolovanim od hibridoma Veloclmmune miševa.
Potpuno ljudska monoklonska antitela su pokazali sličnu potenciju sa prvobitnim himerama u inhibiciji lize RBC, A549 i THP-1 ćelija, sa izuzetkom 25E9.1hu, koja je postao značajno potentniji od originalne 25E9.1 himere. Slike 14-16 grafički ilustruju inhibiciju oslobađanja LDH, karakterističnu za lizu ćelija, u crvenim krvnim ćelijama (RBC, pogledati Sliku 14), A549 ćelijama (pogledati Sliku 15) i THP-1 ćelijama (pogledati Sliku 16). Povećanje potencije ljudskog 25E9.1 monoklonskog antitela (npr., 25E9.1hu) može biti rezultat mešane ćelijske populacije u originalnom hibridomu koji sadrži 2 različita anti-AT IgG molekula, od kojih je samo jedan mogao posedovati aktivnost koja je inhibirala nAT funkciju. Prema tome, izračunavanje molarnosti i merenje aktivnosti za prvobitno monoklonsko antitelo himeru možda neće imati direktnu korelaciju.
Primer 10: Reprezentativne aminokiselinske sekvence i nukleotidne sekvence za antitela koja se specifično vezuju za S. aureus alfa toksin
[0285]
Tabela 1: VL CDR sekvence za monoklonska antitela 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19 i 25E9.1
Tabela 2: VL CDR sekvence za monoklonsko antitelo 28F6.1
Tabela 3: VH CDR sekvence za monoklonsko antitelo 2A3.1
Tabela 4: VH CDR sekvence za monoklonska antitela 10A7.5 i 12B8.19
4
Tabela 5: VH CDR sekvence za monoklonsko antitelo 28F6.1
Tabela 6: VH CDR sekvence za monoklonsko antitelo 25E9.1
Tabela 7: VL i VH aminokiselinske sekvence za anti-alfa toksin monoklonska antitela
1
2
Tabela 8: VL i VH nukleotidne sekvence za anti-alfa toksin monoklonska antitela
4
Tabela 9: VL i VH CDR rezime tabela
Tabela 10: Aminokiselinske sekvence alfa toksina Staphylococcus aureus alfa
Primer 11: Mapiranje regiona vezivanja anti-stafilokoknih alfa-toksin antitela
[0286] Himerne varijante, sastavljene od delova alfa toksina i LukF-PV, konstruisane su da identifikuju fragment alfa toksina na koji se vezuje antitelo koji odgovara monoklonskom antitelu LC10 koje sadrži Fc varijantu (LC10 YTE). LukF-PV je odabran za himernog partnera, jer nije prepoznat od strane LC10 YTE (Slika 19), ali ima visoku strukturnu sličnost (Gouaux, E., M. Hobaugh, i dr. "alpha-Hemolysin, gammahemolysin, and leukocidin from Staphylococcus aureus: distant in sequence but similar in structure." Protein Sci 6(12): 2631-5 (1997); Meesters, C., A. Brack, i dr. "Structural characterization of the alpha-hemolysin monomer from Staphylococcus aureus." Proteins 75(1): 118-26 (2009)) i 25% identičnosti sekvence sa alfa toksinom (Slika 20). Serija himernih varijanti su konstruisane sistemskom zamenom 50 alfa toksin aminokiselina (aa) sa odgovarajućim LukF-PV pandanima. Takođe su zamenjeni kraći regioni unutar odabranih 50 aa segmenata od interesa (Tabela 11). Urađen je ProteOn instrument za analizu afiniteta vezivanja LC10 YTE za ove varijante. Rezultati vezivanja LC10 YTE prema varijantama su rezimirani u Tabeli 11.
Tabela 11: LC10 YTE profili vezivanja za alfa toksin/LukF-PV himerne varijante
[0287] Svi himerni konstrukti mogu se eksprimirati u velikoj razmeri, sa izuzetkom KO_73-81, (Tabela 11). LC10 YTE se nije vezao za varijante koje kodiraju za LukF-PV umesto aa 101-110 alfa toksina (KO_52-110 i KO_101-110) ili aa 224-231 (KO_204-241, KO_204-231 i KO_224-231). Vezivanje LC10 YTE je bilo značajno otežano ili potpuno poremećeno prilikom supstitucije aa 248-277 (KO_248-277) ili njenog većeg segmenta aa 248-293 (KO_248-293), respektivno.
[0288] U određenim slučajevima, očigledan nedostatak vezivanja za LC10 YTE, može se objasniti pojedinačnim alfa toksin/LukF-PV varijantama koje pokazuju pogrešno preklapanje. Sveukupna nemogućnost pravilnog preklapanja takođe može dovesti do očiglednog nedostatka KO 73-81 eksprimiranja. Osim toga, homologija aminokiselinske sekvence između alfa toksina i LukF-PV značajno varira u različitim regionima. Na primer, segment koji odgovara aa 179-193 od alfa toksina deli 67% identičnosti sa LukF-PV, dok cela sekvenca ima 25% identičnosti. Stoga, iako nije bilo efekata na vezivanje LC10 YTE pri zameni regiona visoke homologije sekvenci, ovi regioni mogu potencijalno sadržati dodatne sekvence na koje se vezuju LC10 YTE antitela.
[0289] Rezultati iz gore navedene analize mutageneze ukazuju na to da zamena bilo kog od tri regiona od aa 101-110, aa 224-231 i 248-293 alfa toksina sa LukF-PV ostacima otežava LC10 YTE vezivanje, dok zamena preostalih aa regiona nije imala značajnog uticaja.
[0290] Ova tri regiona predstavljaju dve različite lokacije u trodimenzionalnoj strukturi alfa toksina.
Segmenti koji odgovaraju aa 101-110 i 224-231 su u prostornoj blizini, i lokalizovani sa jedne strane Betasendvič domena, dok se segment koji odgovara aa 248-277 uglavnom nalazi na „Rim“ domenu (Song, L., M. R. Hobaugh, i dr., "Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore." Science 274(5294): 1859-66 (1996)) (Slika 21).
[0291] Segment koji odgovara aa 248-277 pokazao je uticaj na vezivanje i takođe je sadržao ostatke strukturalnog rendgenskog dodira, identifikovane kao da uključuju aa 261-272 (u kojima su T263, N264 i K266 stvarni dodirni ostaci) (Slika 20). Osim toga, kristalna struktura je otkrila još jedan segment koji odgovara aa 173-201, u kom su D183, V187 i N188 stvarni dodirni ostaci (Slika 20). Himerna varijanta koja sadrži ovaj segment (KO_148-205) i dalje pokazuje dobro vezivanje za LC10 YTE. Ovo se verovatno može pripisati visokoj homologiji sekvence ovog regiona (52% identičnosti i 63% sličnosti) između alfa toksina i LukF-PV. Aminokiseline oko dodirnih ostataka (aa 179-193) dele još veću homologiju (67% identičnosti), dok, za razliku od toga, cela sekvenca deli samo 25% identičnosti.
[92 za vezivanje za LC10 YTE. To je dodatno potvrđeno strukturnom analizom strukture LC10 YTE/alfa toksin kompleksa. Strukturna analiza takođe je otkrila određene dodirne ostatke unutar fragmenta 248-277 koji su prisutni u okviru 261-272.
[0293] Kao što je već razmatrano, sprovedeni su eksperimenti sa rentgenskom kristalografijom za određivanje dodirnih ostataka od LC10 YTE monoklonskog antitela. Prečišćeni α-toksin (ostaci od 1 do 293) i LC10 YTE Fab su odvojeno koncentrisani. Skoro ekvimolarne količine ovih proteina pomešane su zajedno, i rastvor je podvrgnut hromatografiji na gel-filtraciji na koloni Sephadex S75 (GE Healthcare). Elutirani vrh sastojao se od oba proteinska molekula vezana jedan za drugog. Dalja koncentracija i kristalizacija dali su kristale koji su difraktovali do 2,5Å.
[0294] Struktura kompleksa rešena je pomoću postupka molekularne supstitucije. Prethodno utvrđena Fab struktura (D25) sa uklonjenim regionima za određivanje komplementarnosti korišćena je kao šablon za LC10 YTE Fab. Kao obrazac molekula α-toksina korišćen je monoer molekula α-toksina izveden iz heptameričnog kompleksa (PDB Id.7AHL) sa nekim skraćivanjem. Niz molekula alfa-toksina koji se koristi za kristalografska istraživanja odgovara onom od SEQ ID NO: 39. Dva kompleksa po asimetričnoj jedinici kompleksa LC10 YTE-α-toksina su identifikovana pomoću Phaser programa iz CCP4 paketa programa. Model strukture dodatno je poboljšan pomoću programa Refmac iz CCP4 paketa programa. Ručna gradnja i poboljšanje iterativnog modela izvedeni su pomoću specifičnog kristalografskog programa „O“.
[0295] Utvrđeno je da su i teški i laki lanci Faba bili u dodiru sa molekulom α-toksina (Slika 22). Konkretno, studije kristalografije utvrdile su dodirne ostatke unutar molekula alfa-toksina koji su odgovarali sledećim, i za teške i lake lance: N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 i R200. Pored toga, određeno je da laki lanac dodire sa T261, T263, N264, K266 i K271. Paratopi su identifikovani kao: LC-W32 (CDR1), K50 (CDR2), Y91, A92, N93, Y94, W95 (CDR3); HC - D33 (CDR1), T53, A54, D56, Y58 (CDR2), D98, Y100, P102, T103, G104, H105, Y106 (CDR3).
[0296] Molekularno modeliranje sa strukturnim podacima iz kristalografske analize pokazalo je da veći deo strukture α-toksina ostane nepromenjen tokom prelaska iz monomernog stanja u heptamerno stanje.
Međutim, pokazano je da je region kritičnog vezivanja (gde su dodirni ostaci identifikovani kao T261, T263, N264, K266 i K271) odgovarao delu molekula α-toksina koji učestvuje u formiranju heptamera. To je kritični region, kompaktno preklopljen kada je molekul α-toksina u monomernom stanju, koji se proteže kao petlja pre umetanja u membranu ćelije domaćina (Slika 23b), i na kraju stvara pečurkastu strukturu nakon stavljanja u heptamerno stanje (Slika 23a). U heptamernom stanju, ovaj region, kako je prikazano na Slici 24a, biće predviđen da bude zaštićen od vezivanja pomoću LC10 YTE molekula antitela.
Primer 12: Terapeutska efikasnost anti-stafilokoknih antitela od alfa toksina
[0297] Rezultati koji su gore razmatrani opisuju efikasnost anti-AT monoklonskih antitela koja se koriste u profilaksi. Kako bi se ispitala mogućnost da ovi monoklonska antitela takođe mogu da funkcionišu terapeutski, efikasnost LC10 testirana je u terapeutskom okruženu, u modelima dermonekroze i upale pluća. U modelu dermonekroze, LC10 je primenjen IV 24 sata pre bakterijskog izazova (profilaksa) i 1, 3 ili 6 sati nakon intradermalne infekcije (terapija). Veličina lezije na životinjama je praćena 6 dana. Profilaksa (-24 sata) i tretman nakon 1 ili 3 sata posle infekcije rezultovali su smanjenjem veličine lezija u odnosu na negativnu kontrolu (R347) (Slika 24). Jaka korist za tretman je izgubljena kada je LC10 isporučen 6 sati posle infekcije u ovom modelu. Ovi rezultati pokazuju da LC10 može funkcionisati kao efikasna terapija kod stafilokokne kože i infekcije mekog tkiva.
[0298] Slični eksperimenti su sprovedeni u modelu upale pluća u kojima je LC10 isporučen miševima (IV), bilo u profilaksi ili u infuziji, od 1, 3 ili 6 sati nakon intranazalne infekcije. Kao što se očekivalo, profilaktička primena monoklonskog antitela rezultovala je potpunim preživljavanjem. (Slika 25). Iako potpuno preživljavanje nije bilo rezultat kada je LC10 primenjivan 1, 3 ili 6 časova nakon infekcije, postojali su pozitivni efekti na vreme smrti u odnosu na negativnu kontrolu, kada je LC10 korišćen u lečenju 1 sat posle infekcije na najvišoj LC10 dozi. S obzirom na zahtev modela prema visokoj dozi infekcije i brzom nastanku smrti, ova poboljšanja preživljavanja ukazuju na to da može doći do terapijskog poboljšanja tokom infekcije kod čoveka.
Primer 13: Efikasnost vankomicina u kombinaciji sa anti-alfa toksin monoklonskim antitelom LC-10
[0299] Studije su preduzete kako bi se procenio potencijal anti-alfa toksin monoklonskog antitela LC 10 za primenu u dodatnoj terapiji sa vankomicinom u modelu muške upale pluća upoređivanjem monoklonskog anti-alfa toksin antitela i monoterapije vankomicinom na kombinovanu terapiju.
[0300] Sedam nedelja stare ženke C57BL/6J miševa inficirane su intranazalno sa 2e8 cfu (LD100) Staphylococcus aureus USA300 otpornog na meticilin. Vankomicin i LC-10 su pojedinačno titrirani kako bi se odredile optimalne i sub-efikasne doze. Za evaluaciju monoklonskog antitela u monoterapiji ili dualnoj terapiji sa vankomicinom, miševi su tretirani jedan sat nakon infekcije, sa jednom intraperitonealnom dozom LC-10, ili R347 antitelom negativne kontrole (15 mg/kg). Vankomicin tretman u mono ili dvostrukoj terapiji započet je 1 čas posle infekcije, i dvaput dnevno je primenjen subkutano tokom 3 dana. Procenat opstanka za sve tretirane grupe utvrđen je na kraju sedam dana. Krive preživljavanja su analizirane su koristeći Mandel-Cox log-rank test.
[0301] Tretman sa vankomicinom na 200 ili 40 mg/kg/dan rezultovao je opstankom od 90% i 43%, respektivno. Monoterapijа nakon infekcije sa LC-10 sa 45 ili 15 mg/kg zaštitila je 50% i 33% miševa. (Slika 26A i B). Kombinovana terapija sa pojedinačnim sub efektivnim dozama LC-10 (15 mg/kg) i dvaput dnevno doziranjem vankomicina na 40 mg/kg dovela je do preživljavanja 75% životinja. Devedeset odsto miševa preživelo je kombinacijom vankomicina od 40 mg/kg/dan sa 45 mg/kg LC-10. Razlike u preživljavanju između monoterapije sa vankomicinom i kombinovanom terapijom sa 15 mg/kg ili 45 mg/kg LC-10 su statistički značajne. (p = 0,026 i p = 0,015, respektivno). Istovremena primena vankomicina i LC-10 dala je sinergijski efekat analizom izobolograma (Slika 27).
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
�
�

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, gde se izolovano antitelo ili njegov antigenvezujući fragment vezuju imunospecifično na Staphylococcus aureus polipeptid alfa toksina, i uključuju:
(a) VH CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69;
(b) VH CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70;
(c) VH CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71;
(d) VL CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1;
(e) VL CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, i
(f) VL CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68.
2. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži varijabilni domen teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 57 i varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58.
3. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 2, gde VH i VL odgovaraju aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 57 i 58.
4. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ima jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koju čine:
(a) konstanta afiniteta
(KD) za alfa toksin od oko 13 nM ili manje;
(b) vezivanje za monomere alfa toksina, ali ne inhibira vezivanje alfa toksina na alfa toksin receptor;
(c) inhibira formiranje oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%; (d) smanjenje citolitičke aktivnost alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% (npr., kao što je utvrđeno pomoću testova ćelijske lize, dodavanja hemolize);
(e) smanjuje infiltraciju ćelija i proupalno oslobađanje citokina (npr., u životinjskom modelu upale pluća).
5. Sastav koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.
6. Sastav prema patentnom zahtevu 5, gde sastav sadrži dodatni agens, gde je dodatni agens antibiotik.
7. Komplet, koji sadrži
(a) antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili sastav prema patentnom zahtevu 5 ili 6;
(b) uputstva za upotrebu sastava, ili smernice za dobijanje instrukcija za upotrebu sastava.
8. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili sastav prema patentnom zahtevu 5 ili 6, za upotrebu u sprečavanju, lečenju ili upravljanju upalom pluća kod pacijenta.
9. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili sastav prema patentnom zahtevu 5 ili 6, za upotrebu u sprečavanju, lečenju ili upravljanju stanjima kožnih infekcija kod pacijenta.
10. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, ili sastav prema patentnom zahtevu 5 ili 6, za upotrebu u sprečavanju, lečenju ili upravljanju upalom pluća ili stanja kožne infekcije, kod pacijenta prema patentnom zahtevu 8 ili 9, inhibiranjem formiranja Staphylococcus aureus oligomera alfa toksina za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95%.
11. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji se imunospecifično vezuje za fragment Staphylococcus aureus alfa toksina SEQ ID NO: 39.
12. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment patentnog zahteva 11, gde se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje za fragment koji sadrži aminokiseline 261-272 od SEQ ID NO: 39 i/ili aminokiseline 173-201 od SEQ ID NO: 39.
13. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 12, gde se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuju za fragment koji sadrži aminokiseline 261-272 od SEQ ID NO: 39 i aminokiseline 173-201 od SEQ ID NO: 39
14. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, gde antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sprečava nastanak heptamera alfa toksina, i gde je navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment u dodiru sa ostacima na položajima T261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 i R200 od SEQ ID NO: 39.
15. Sastav prema patentnom zahtevu 6, gde je antibiotik vankomicin.
16. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva od 11 do 14, za primenu u sprečavanju, tretmanu ili upravljanjem upalom pluća ili stanjem kožne infekcije kod pacijenta inhibiranjem formiranja oligomera alfa toksina.
17. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i 11-14 koji obuhvata varijantu Fc regiona gde izolovano antitelo sadrži sledeće sekvence
RS20181450A 2011-02-08 2012-02-07 Antitela koja specifično vezuju staphylococcus aureus alfa toksin i postupci njihove primene RS58190B2 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161440581P 2011-02-08 2011-02-08
EP12745207.6A EP2673373B3 (en) 2011-02-08 2012-02-07 Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
PCT/US2012/024201 WO2012109285A2 (en) 2011-02-08 2012-02-07 Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS58190B1 RS58190B1 (sr) 2019-03-29
RS58190B2 true RS58190B2 (sr) 2021-08-31

Family

ID=46639171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181450A RS58190B2 (sr) 2011-02-08 2012-02-07 Antitela koja specifično vezuju staphylococcus aureus alfa toksin i postupci njihove primene

Country Status (24)

Country Link
US (1) US9527905B2 (sr)
EP (2) EP3470526A3 (sr)
JP (4) JP2014508748A (sr)
KR (1) KR101993839B1 (sr)
CN (2) CN107474133B (sr)
AU (1) AU2012214531C1 (sr)
BR (1) BR112013020086B1 (sr)
CA (1) CA2826566C (sr)
CY (1) CY1121389T1 (sr)
DK (1) DK2673373T6 (sr)
ES (1) ES2709065T7 (sr)
HR (1) HRP20182017T4 (sr)
HU (1) HUE040734T2 (sr)
LT (1) LT2673373T (sr)
MX (3) MX375113B (sr)
PL (1) PL2673373T6 (sr)
PT (1) PT2673373T (sr)
RS (1) RS58190B2 (sr)
RU (1) RU2620065C2 (sr)
SG (3) SG10201913690SA (sr)
SI (1) SI2673373T1 (sr)
SM (1) SMT201800635T1 (sr)
TR (1) TR201817932T4 (sr)
WO (1) WO2012109285A2 (sr)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2838211C (en) 2011-06-10 2023-08-01 Medimmmune Limited Anti-pseudomonas psl binding molecules and uses thereof
HUE050985T2 (hu) 2011-11-07 2021-01-28 Medimmune Ltd Pseudomonas PSL és PCRV elleni kötõmolekulát alkalmazó kombinációs terápiák
EP2793944B1 (en) 2011-12-23 2025-10-08 Nicholas B. Lydon Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes
US9988439B2 (en) 2011-12-23 2018-06-05 Nicholas B. Lydon Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
KR20150082367A (ko) * 2012-11-06 2015-07-15 메디뮨 엘엘씨 항슈도모나스 ｐｓｌ 및 ｐｃｒｖ 결합 분자를 이용한 병용 요법
KR20150092738A (ko) * 2012-11-06 2015-08-13 메디뮨 엘엘씨 에스.아우레우스 연관 질병의 치료 방법
CN104968797B (zh) * 2012-11-06 2018-11-30 米迪缪尼有限公司 金黄色葡萄球菌表面决定簇的抗体
CN105873946A (zh) * 2013-10-17 2016-08-17 阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司 交叉反应性金黄色葡萄球菌抗体序列
US10487140B2 (en) 2014-01-14 2019-11-26 Integrated Biotherapeutics, Inc. Targeting immunological functions to the site of bacterial infections using cell wall targeting domains of bacteriolysins
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
TWI719938B (zh) * 2014-06-19 2021-03-01 美商麥迪紐有限責任公司 多重細菌感染之治療
WO2016023943A1 (en) * 2014-08-12 2016-02-18 Arsanis Biosciences Gmbh Predicting s. aureus disease
AU2015350075B2 (en) 2014-11-17 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using CD3xCD20 bispecific antibody
JP6889701B2 (ja) 2015-09-24 2021-06-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ アルファ溶血素バリアント
WO2017075188A2 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Medimmune, Llc Methods of using anti-alpha toxin antibody
TWI781130B (zh) 2017-01-03 2022-10-21 美商再生元醫藥公司 抗金黃色葡萄球菌溶血素ａ毒素之人類抗體
MA47468A (fr) 2017-02-09 2019-12-18 Bluefin Biomedicine Inc Anticorps anti-ilt3 et conjugués anticorps-médicament
CN108456250B (zh) * 2017-02-17 2025-11-28 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向il-13ra2的抗体及其应用
CN109384844B (zh) * 2017-08-04 2020-12-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体及应用
TWI902669B (zh) 2018-07-24 2025-11-01 美商麥迪紐有限責任公司 抗金黃色葡萄球菌凝集因子a(clfa)之抗體
US11396542B2 (en) 2018-08-21 2022-07-26 Synkrino Biotherapeutics, Inc. Astrotactin1-based compositions and pharmaceutical formulations
IL280875B2 (en) 2018-08-31 2024-12-01 Regeneron Pharma Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
EP3864040A1 (en) 2018-10-09 2021-08-18 Medimmune, LLC Antibodies directed against staphylococcus aureus leukotoxins
WO2020076789A2 (en) 2018-10-09 2020-04-16 Medimmune, Llc Combinations of anti-staphylococcus aureus antibodies
TW202100549A (zh) * 2019-03-13 2021-01-01 美商麥迪紐有限責任公司 降低金黃色葡萄球菌在定殖的患者中之感染
WO2020210650A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Medimmune, Llc Neutralization of tgf-beta or alpha-v-beta-8 integrin for s. aureus infections
CN112538112B (zh) * 2019-09-20 2023-10-27 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗α-溶血素的抗体及其应用
CN113444173A (zh) 2020-03-25 2021-09-28 兴盟生物医药(苏州)有限公司 金黄色葡萄球菌α-毒素特异性抗体及其应用
JP2024503425A (ja) * 2021-01-11 2024-01-25 星濟生物（蘇州）有限公司 黄色ブドウ球菌のα毒素を標的とした抗原結合たんぱく質およびその応用
CN112941136B (zh) * 2021-03-24 2023-04-28 成都欧林生物科技股份有限公司 一种重组金黄色葡萄球菌疫苗hi抗原蛋白的纯化方法
CN114455048B (zh) * 2022-03-02 2023-03-14 江苏微导纳米科技股份有限公司 一种桨杆
WO2023208123A1 (zh) * 2022-04-28 2023-11-02 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 特异性结合金黄色葡萄球菌Hla毒素的全人源单克隆抗体
CN116589566A (zh) * 2022-11-18 2023-08-15 昆明医科大学第一附属医院 一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用
CN116023486B (zh) * 2023-01-10 2024-10-08 西北农林科技大学 金黄色葡萄球菌α-溶血素纳米抗体、制备方法及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
IL126544A (en) 1996-04-25 2004-08-31 Genicon Sciences Inc Analyte assay using scattered-light detectable particles
AU2001276842B2 (en) 2000-06-28 2007-04-26 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
ES2338105T3 (es) 2003-05-14 2010-05-04 Kenta Biotech Ag Anticuerpo monoclonal humano especifico para lipopolisacaridos (lps) de serotipo iats 06 pseudomonas aeruginosa.
CN1324049C (zh) 2003-08-04 2007-07-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗sars冠状病毒基因工程抗体
CN1942483B (zh) * 2004-04-13 2012-09-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗p型选凝素抗体
JP2008513406A (ja) * 2004-09-22 2008-05-01 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
MX2008009220A (es) 2006-01-17 2008-10-10 Biolex Therapeutics Inc Composiciones y metodos para la humanizacion y optimizacion de n-glicanos en plantas.
TW200813091A (en) * 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
EP2719397A1 (en) * 2006-06-12 2014-04-16 GlaxoSmithKline Biologicals SA Use of alpha-toxin for treating and preventing staphylococcus infections
MX2009012891A (es) * 2007-05-31 2009-12-10 Merck & Co Inc Proteinas de union a antigeno dirigidas a staphylococcus aureus orf0657n.
MX2010001918A (es) * 2007-08-21 2010-03-11 Amgen Inc Proteinas enlazadas al antigeno humano de celula de cepa mcdonough de felino.
AU2008292897B2 (en) * 2007-08-31 2015-01-22 University Of Chicago Methods and compositions related to immunizing against staphylococcal lung diseases and conditions
US8172115B1 (en) 2008-04-10 2012-05-08 Spencer Forrest, Inc. Hair building solids dispenser for one handed operation
WO2010003108A2 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. TNF-α ANTAGONIST MULTI-TARGET BINDING PROTEINS
EP2208787A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-21 Université de Liège A recombinant alpha-hemolysin polypeptide of Staphylococcus aureus, having a deletion in the stem domain and heterologous sequences inserted
GB2467939A (en) * 2009-02-20 2010-08-25 Univ Sheffield Removal of bacteria from media
BRPI1015567A2 (pt) * 2009-06-22 2021-08-31 Wyeth Llc Composições imunogênicas de antígenos de staphylococcus aureus
CN104968797B (zh) 2012-11-06 2018-11-30 米迪缪尼有限公司 金黄色葡萄球菌表面决定簇的抗体

Also Published As

Publication number Publication date
PL2673373T3 (pl) 2019-04-30
JP2020172489A (ja) 2020-10-22
HK1248257A1 (zh) 2018-10-12
HRP20182017T1 (hr) 2019-02-08
MX375113B (es) 2025-03-04
SG192212A1 (en) 2013-09-30
SG10201913690SA (en) 2020-03-30
EP2673373A2 (en) 2013-12-18
HUE040734T2 (hu) 2019-03-28
JP6367393B2 (ja) 2018-08-01
PL2673373T6 (pl) 2021-09-27
US9527905B2 (en) 2016-12-27
SMT201800635T1 (it) 2019-01-11
RU2013141134A (ru) 2015-03-20
SG10201600899PA (en) 2016-03-30
ES2709065T3 (es) 2019-04-15
CN103443285B (zh) 2017-06-23
CA2826566A1 (en) 2012-08-16
KR20140019344A (ko) 2014-02-14
CN107474133A (zh) 2017-12-15
ES2709065T7 (es) 2021-12-09
RS58190B1 (sr) 2019-03-29
BR112013020086B1 (pt) 2020-12-08
CN103443285A (zh) 2013-12-11
JP7047017B2 (ja) 2022-04-04
BR112013020086A2 (pt) 2016-11-22
WO2012109285A3 (en) 2012-10-04
MX345285B (es) 2017-01-24
TR201817932T4 (en) 2019-02-21
PT2673373T (pt) 2018-12-05
HRP20182017T4 (hr) 2021-08-20
CN103443285B9 (zh) 2018-04-24
KR101993839B1 (ko) 2019-06-28
RU2620065C2 (ru) 2017-05-22
CN107474133B (zh) 2021-10-15
EP2673373A4 (en) 2015-06-17
CA2826566C (en) 2022-09-13
AU2012214531B2 (en) 2017-03-16
DK2673373T3 (da) 2019-01-02
JP6723293B2 (ja) 2020-07-15
DK2673373T6 (da) 2021-08-23
EP3470526A2 (en) 2019-04-17
JP2014508748A (ja) 2014-04-10
EP2673373B3 (en) 2021-06-02
AU2012214531C1 (en) 2021-07-29
JP2017128575A (ja) 2017-07-27
WO2012109285A2 (en) 2012-08-16
MX2013009127A (es) 2014-01-31
CY1121389T1 (el) 2020-05-29
LT2673373T (lt) 2019-01-25
JP2019011329A (ja) 2019-01-24
EP2673373B1 (en) 2018-08-29
US20140072577A1 (en) 2014-03-13
MX2020009700A (es) 2020-10-07
EP3470526A3 (en) 2019-07-17
SI2673373T1 (sl) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7047017B2 (ja) 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）α毒素に特異的に結合する抗体及び使用方法
AU2019250213B2 (en) A novel il33 form, mutated forms of il33, antibodies, assays and methods of using the same
AU2012214531A1 (en) Antibodies that specifically bind Staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
KR20160070192A (ko) 중화 항-인플루엔자 a 항체 및 이의 용도
HK40007158A (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HK1248257B (zh) 特异性结合金黄色葡萄球菌α毒素的抗体以及使用方法
HK1191978B (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HK1191978A (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HK1191977B (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HK1191977A (en) Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
HK40064533A (en) Neutralizing anti-influenza a antibodies and uses thereof
HK40120900A (zh) 中和抗乙型流感抗体及其用途
HK40064533B (zh) 中和抗甲型流感抗体及其用途
HK40064536B (zh) 中和抗甲型流感抗体及其用途
HK40061870A (en) Neutralizing anti-influenza b antibodies and uses thereof
HK40110292A (zh) 中和抗甲型流感抗体及其用途
HK40061870B (zh) 中和抗乙型流感抗体及其用途
HK40057425B (zh) 中和抗乙型流感抗体及其用途