ES2709065T7 - Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y métodos de uso - Google Patents

Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y métodos de uso Download PDF

Info

Publication number
ES2709065T7
ES2709065T7 ES12745207T ES12745207T ES2709065T7 ES 2709065 T7 ES2709065 T7 ES 2709065T7 ES 12745207 T ES12745207 T ES 12745207T ES 12745207 T ES12745207 T ES 12745207T ES 2709065 T7 ES2709065 T7 ES 2709065T7
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
alpha toxin
seq
antigen
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12745207T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2709065T3 (es
Inventor
Bret Sellman
Christine Tkaczyk
Lei Hua
Partha Chowdhury
Reena Varkey
Melissa Damschroder
Li Peng
Vaheh Oganesyan
Jamese Hilliard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune LLC
Original Assignee
MedImmune LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46639171&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2709065(T7) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by MedImmune LLC filed Critical MedImmune LLC
Publication of ES2709065T3 publication Critical patent/ES2709065T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2709065T7 publication Critical patent/ES2709065T7/es
Active legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/14—Peptides containing saccharide radicals; Derivatives thereof, e.g. bleomycin, phleomycin, muramylpeptides or vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/709—Toxin induced
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y métodos de uso
Campo
La tecnología se relaciona en parte con los anticuerpos, y en ciertas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus.
Antecedentes
Staphylococcus aureus es una bacteria cocos grampositiva, facultativamente aeróbica y que forma grupos que comúnmente coloniza la nariz y la piel de humanos sanos. Aproximadamente el 20-30 % de la población está colonizada con S. aureus en un momento dado. Las bacterias estafilococos aureus, a veces también denominadas “estafilococos”, “estafilococos aureus”, o “S. aureus", se consideran patógenos oportunistas que causan infecciones menores (por ejemplo, granos, forúnculos) e infecciones sistémicas.
Las barreras mucosas y epidérmicas (piel) normalmente protegen contra las infecciones por S. aureus. La interrupción de estas barreras naturales como resultado de lesiones (por ejemplo, quemaduras, traumatismos, procedimientos quirúrgicos y similares) aumenta dramáticamente el riesgo de infección. Las enfermedades que comprometen el sistema inmunitario (por ejemplo, diabetes, enfermedad renal en etapa terminal, cáncer y similares) también aumentan el riesgo de infección. Las infecciones oportunistas por S. aureus pueden volverse graves y causar varias enfermedades o afecciones, entre las que se incluyen bacteriemia, celulitis, infecciones de párpados, intoxicación alimentaria, infecciones de las articulaciones, infecciones de la piel, síndrome de la piel escaldada, síndrome del choque tóxico, neumonía, osteomielitis, endocarditis, meningitis y formación de abscesos.
S. aureus también puede causar infecciones y enfermedades en animales. Por ejemplo, S. aureus frecuentemente se asocia con mastitis bovina.
S. aureus expresa una serie de factores de virulencia, incluyendo polisacáridos capsulares y toxinas proteicas. Un factor de virulencia frecuentemente asociado con la infección por S. aureus que es el principal agente citotóxico es la alfa-toxina (también conocida como alfa-hemolisina o Hla), una exoproteína hemolítica y formadora de poros producida por la mayoría de las cepas patógenas de S. aureus. La toxina forma poros heptaméricos en membranas de células susceptibles como glóbulos blancos, plaquetas, eritrocitos, monocitos de sangre periférica, macrófagos, queratinocitos, fibroblastos y células endoteliales. La formación de poros de toxinas alfa a menudo conduce a la disfunción celular o lisis.
Ragle B. et al. (2009) Infecation and Immunity 77 (1), 2712-2718 divulga los anticuerpos monoclonales 7b8 y 1A9 dirigidos a S. aureus alfa-hemolisina. El documento WO 2009/029831 divulga antiboisis idénticas como Ragle B. et al. (supra) y además enseña que los anticuerpos que se pueden utilizar en terapias de combinación, por ejemplo, antibióticos
Breve resumen de la divulgación
En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo purificado o aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyo anticuerpo o fragmento se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus. Los términos “polipéptido de toxina alfa”, “monómero de toxina alfa” y “oligómeros de toxina alfa (por ejemplo, heptámero)” se refieren aquí como “AT”, “monómero AT” y “oligómero a T”, respectivamente. El término “cadena pesada variable” se conoce como “VH”. El término “cadena ligera variable” se conoce como “VL”.
La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de forma inmunoespecífica a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus e incluye:
(a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: o 69;
(b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70;
(c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71;
(d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y
(f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68.
En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un VH y VL del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que corresponden a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 57 y 58.
En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una o más de las características seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (KD) para toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monómeros de toxinas alfa, pero no inhibe la unión de toxina alfa al receptor de toxina alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %;
(d) reduce la actividad citolítica de la toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % (por ejemplo, según lo determinado por los ensayos de lisis y hemólisis celular); y
(e) reduce la infiltración celular y la liberación de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en un modelo de neumonía animal).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente adicional, en el que el agente adicional es un antibiótico. En algunas realizaciones, el antibiótico es vancomicina.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un kit, que comprende
(a) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de la reivindicación 5 o 6;
(b) instrucciones para usar la composición o guías para obtener instrucciones para usar la composición.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o una composición descrita anteriormente para prevenir, tratar o controlar la neumonía en un sujeto.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno, o una composición como se describió anteriormente para prevenir, tratar o controlar una afección de infección de la piel en un sujeto. En algunas realizaciones, la afección de infección de la piel es dermonecrosis.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno o una composición descrita anteriormente para prevenir, tratar o manejar una condición de infección de la piel o neumonía en un sujeto mediante la inhibición de la formación de oligómeros de toxina alfa de Staphylococcus aureus en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describió anteriormente que se une inmunoespecíficamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus de la SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno como se describió anteriormente que se une inmunoespecíficamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus que comprende los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y/o los aminoácidos 173- 201 de SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describió anteriormente que se une inmunoespecíficamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus que comprende los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y los aminoácidos 173-201 de la Se Q ID NO: 39. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describió anteriormente que previene la formación de heptámero de toxina alfa, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno está en contacto con los residuos en las posiciones T261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de la SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describió anteriormente para prevenir, tratar o manejar una afección por neumonía o infección de la piel en un sujeto mediante la inhibición de la formación de oligómeros de toxina alfa.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describió anteriormente que comprende una región Fc variante en la que el anticuerpo aislado comprende las siguientes secuencias
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHDMHWVRQATGKGLEWVSGI
GTAGDTYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARDRYSPTG
HYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP
EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHK
PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEV
TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
y
DIQ M TQ SPSTLSASVG DRVTITCRASQ SISSW LAW YQ Q KPG KAPKLLIYKASSL
ESGVPSRFSGSG SG TEFTLTISSLQ PDDFATYYCKG YADYW TFG Q G TKVEIKR
TVAAPSVFIFPPSDEQ LKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQ W KVDNALQ SG NSQ E
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV.
Los métodos para prevenir, tratar o controlar una infección por S. aureus divulgada en el presente documento puede estar asociada con el tratamiento de diálisis, cirugía de alto riesgo, neumonía, neumonía asociada a ventilación mecánica (VAP) o reinfección después de la liberación previa de un hospital para un tratamiento previo. o cirugía que incluye administrar una composición que incluya un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se adhiera inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus a un sujeto que lo necesite. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus descrito en el presente documento puede administrarse a un sujeto que lo necesite, en una cantidad eficaz para reducir la lisis celular. En ciertas realizaciones, el método previene una afección asociada con la infección por Staphylococcus aureus. En algunas realizaciones, la célula es un eritrocito de la sangre o el pulmón.
Ciertas realizaciones se describen con más detalle en la siguiente descripción, ejemplos, reivindicaciones y dibujos. Breve descripción de los dibujos
Los dibujos ilustran realizaciones en este documento y no son limitantes. Para mayor claridad y facilidad de ilustración, los dibujos no están hechos a escala y, en algunos casos, varios aspectos pueden mostrarse exagerados o agrandados para facilitar la comprensión de realizaciones particulares.
Las figuras 1A y 1B ilustran gráficamente el porcentaje de inhibición de la lisis de glóbulos rojos por los anticuerpos anti-toxina alfa. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 3.
Las figuras 2A y 2B ilustran gráficamente el porcentaje de inhibición de la lisis de células A549 y THP-1 humanas por anticuerpos anti-toxina alfa. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 3.
Las figuras 3A y 3B ilustran los resultados de la inmunización pasiva con mAb inhibidores de la toxina alfa anti-S. aureus en un modelo de dermonecrosis. Grupos de 5 ratones BALB/c se inmunizaron pasivamente con 5 mg/kg de mAb inhibidores y luego se infectaron con S. aureus Wood y se monitorizó el tamaño de la lesión durante 6 días. La Figura 3A muestra fotografías del tamaño de la lesión 6 días después de la infección. La Figura 3B ilustra gráficamente la reducción en el tamaño de la lesión a lo largo del curso de la infección. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 4.
Las figuras 4-7 ilustran gráficamente la supervivencia de ratones inmunizados pasivamente con varios mAb descritos en el presente documento en un modelo de neumonía. La Figura 4 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 12B8.19 purificados, 24 horas antes de la infección con S. aureus USA300 (3 * 108 ufc).
La Figura 5 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 2A3.1 purificados, 24 horas antes de la infección con S. aureus USA300 (3 * 108 ufc).
La Figura 6 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 28F6.1 purificado, 24 horas antes de la infección con S. aureus USA300 (3 * 108 ufc).
La Figura 7 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 10A7.5 purificado, 24 horas antes de la infección con S. aureus USA300 (3 * 108 ufc). Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 5.
Las figuras 8A y 8B ilustran gráficamente la distribución de bacterias en el pulmón (FIG. 8A) y el riñón (Fig. 8B) en ratones inmunizados pasivamente con una versión completamente humana de mAb 2A3.1 (por ejemplo, 2A3hu) o un control de isotipo (R347). Los ratones C57BL/6J se inmunizaron pasivamente con 2A3hu (15 mg/kg) 24 h antes de la infección con USA300. También se recolectaron muestras para medir los niveles de citoquinas y para el análisis histopatológico. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 5.
La Figura 9 ilustra gráficamente la reducción en la producción de citoquinas inflamatorias después de la inmunización pasiva con mAb 2A3hu. Los resultados en círculo son del punto de tiempo de 24 horas. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 6.
La Figura 10 muestra fotografías representativas de la histología pulmonar en ratones tratados con el control R347 (ver fotografías superior e inferior a la izquierda de la Figura 10) o tratadas con 2A3hu (ver fotografías superior e inferior a la derecha de la Figura 10). Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 6.
La Figura 11 ilustra gráficamente que los mAb anti-AT (toxina alfa de S. aureus) descritos aquí no inhiben la unión de la toxina alfa nativa (NAT) a los receptores presentes en los fantasmas de eritrocitos de conejo. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 8.
La Figura 12 es una transferencia Western representativa que ilustra la inhibición de la formación de heptámero por los anticuerpos descritos en el presente documento. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 8.
Las figuras 13A y 13B ilustran transferencias de western representativas que confirman la inhibición de la oligomerización por los mAb anti-AT descritos en este documento, e ilustran además que la inhibición se puede valorar. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 8.
Las figuras 14-16, ilustran gráficamente la potencia de los anticuerpos anti-AT completamente humanos en los ensayos de inhibición de la lisis celular. Las versiones completamente humanas de los anticuerpos IgG anti-AT exhiben una potencia similar a la de los anticuerpos IgG anti-AT quiméricos correspondientes. La actividad inhibitoria de los anticuerpos IgG completamente humanos se comparó con los anticuerpos IgG quiméricos en la lisis de conejo (células de glóbulos rojos) (Figura 14), la lisis celular A549 (Figura 15) y la lisis de células THP-1 (Figura 16). Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 9.
Las Figuras 17A y 17B ilustran gráficamente la reducción en el tamaño de la lesión a lo largo del curso temporal de la infección después de la inmunización pasiva con mAb de toxina alfa anti-S. aureus inhibidor QD 20, QD37, LC10, QD33, 2A3 y el control R347 en un modelo de dermonecrosis. Grupos de 5 ratones BALB/c se inmunizaron pasivamente con 1 mg/kg (Figura 17A) y 0,5 mg/kg (Figura 17B) de los mAb inhibidores mostrados y luego se infectaron con S. aureus Wood y se monitorizó el tamaño de la lesión durante 6 días.
La Figura 18 ilustra gráficamente la supervivencia de ratones inmunizados pasivamente con los mAb QD 20, QD37, LC10, QD33, 2A3 y el control R347 en un modelo de neumonía. Los ratones se inmunizaron pasivamente con 5 mg/kg de mAb purificado 24 horas antes de la infección con S. aureus USA300 (~2 * 108 ufc).
La Figura 19 representa gráficamente la caracterización por ELISA de la unión de LC10 YTE a la toxina alfa y LukF-PV. El lisado bacteriano que contenía toxina alfa marcada con His o LukF-PV se recubrió sobre la superficie de 96 pozos. Se añadió LC10 YTE o mAb anti-His de ratón a los pozos recubiertos y se incubó durante 1 h. Los niveles de expresión de toxina alfa y LukF-PV fueron similares a los mostrados por las señales de unión del mAb anti-His, mientras que los YTE de LC10 solo se unieron significativamente a la toxina alfa y no a LukF-PV.
La Figura 20 muestra alineamientos de secuencia de toxinas alfa y proteínas LukF-PV. La toxina alfa comparte una identidad de secuencia de aminoácidos del 25% con LukF-PV (número de acceso UniProtKB/TrEMBL B1Q018). La numeración de los aminoácidos se basa en proteínas maduras. La alineación se realizó utilizando el método de Clustal W. El segmento aa 248-277 se resalta subrayando.
La Figura 21 representa representaciones de bosquejos de estructuras de toxinas alfa. A) Representación de bosquejos de la estructura modelada de un monómero soluble de toxina alfa. La estructura de monómero modelada de toxina alfa se construyó con Maestro 9.1 (Schrodinger Inc.) utilizando la estructura cristalina de LukF-PV como plantilla (entrada del banco de datos de proteínas 1PVL) (Pedelacq, Maveyraud et al. 1999). B) Representación de bosquejos de la estructura cristalina de un protómero de toxina alfa de un hexámero (Entrada de Protein Data Bank 7AHL) (Song, Hobaugh et al. 1996). aa 101-110 se muestran en azul, aa 224-231 en naranja y aa 248-277 en rojo.
La Figura 22 es un diagrama de cinta del complejo LC10 YTE Fab-a-toxina. La molécula de toxina alfa está indicada por la cinta en la parte superior del diagrama. La cadena pesada se indica con una cinta de color oscuro en la parte inferior del diagrama, y la cadena ligera se indica con la cinta de color claro en la parte inferior del diagrama.
La Figura 23 es una representación de bosquejos de los estados heptamerales y monoméricos de la molécula de toxina a. a. Un conjunto heptamérico similar a un hongo de la molécula de toxina a que crea un poro en la superficie de la célula huésped. Las regiones de color gris y negro corresponden a los residuos de contacto LC10 YTE que están protegidos en el modelo. Los residuos de contacto que están presentes en las posiciones protegidas son LC10 consistentes bloqueando la formación de heptámero. b. Estructuras superpuestas de moléculas de a-toxina antes (gris claro) y después de la formación de poros (gris oscuro).
La Figura 24 representa gráficamente la eficacia del tratamiento de LC10 en un modelo de dermonecrosis de murino. Grupos de 5 ratones Balb/C se inmunizaron pasivamente con 15 mg/kg de LC10 o R347. Se infectaron ratones Balb/C por vía intranasal con 2 x 108 de S. aureus Wood. (A) 1 hora, (B) 3 horas o (C) 6 horas después de la infección, los ratones se trataron con 5, 15 o 45 mg/kg de LC10 y se controló el tamaño de la lesión durante 6 días. Se incluyeron como controles grupos de 5 administrados 15 mg/kg LC10 o R347 24 horas antes de la exposición bacteriana.
La Figura 25 representa gráficamente la eficacia del tratamiento de LC10 en un modelo de neumonía murina. Grupos de 10 ratones C57BL/6 se inmunizaron pasivamente con 15 mg/kg de LC10 o R34724 horas antes de la exposición intranasal con 2x108 S. aureus USA300. Grupos de 10 ratones C57BL/6 se infectaron por vía intranasal con 2 x 108 de S. aureus USA300. (A) 1 hora, (B) 3 horas o (C) 6 horas después de la infección, los ratones se trataron con 5, 15 o 45 mg/kg de LC10 y la supervivencia se controló durante 7 días. Se incluyeron como controles grupos de 10 administrados 15 mg/kg LC10 o R34724 h antes de la exposición bacteriana.
La Figura 26 representa gráficamente la eficacia del tratamiento de LC10 en un modelo de neumonía murina. Grupos de 10 ratones C57BL/6 se infectaron por vía intradérmica con 2x108 S. aureus USA300. Una hora después de la infección, a los animales se les administró una sola inyección intraperitoneal de LC-10 a (A) 15 mg/kg (B) 45 mg/kg. Un grupo de animales de la cohorte recibió vancomicina subcutánea (VAN) 1 h después de la infección. Se administraron tratamientos adicionales de VAN BID q 12 para un total de 6 tratamientos. Un grupo de control de 10 ratones se trató con 15 mg/kg de R347 1 h después de la infección. La supervivencia se monitorizó durante 7 días.
La Figura 27 es una visualización gráfica de un análisis de isobolograma de sinergia donde N > 1: antagonismo, N = 1: efecto aditivo, N <1: sinergia.
Descripción detallada
Aquí se proporcionan anticuerpos, que incluyen formas humanas, humanizadas y/o quiméricas, así como fragmentos, derivados/conjugados y composiciones de los mismos que se unen a la toxina alfa de Staphylococcus aureus. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para detectar y/o visualizar la toxina alfa y, por lo tanto, pueden ser útiles en ensayos y métodos de diagnóstico. Los anticuerpos descritos en el presente documento también interfieren con la formación del heptámero toxina alfa, inhibiendo así la formación del complejo formador de poros activo, y por lo tanto pueden ser útiles para métodos terapéuticos y profilácticos.
Staphylococcus aureus es un patógeno ubicuo, y algunas veces es un agente etiológico de varias afecciones, que van desde la gravedad de leve a fatal. S. aureus produce una gran cantidad de proteínas extracelulares y asociadas a las células, muchas de las cuales están involucradas en la patogénesis, como la toxina alfa, la toxina beta, la toxina gamma, la toxina delta, la leucocidina, la toxina del síndrome de choque tóxico (TSST), enterotoxinas, coagulasa, proteína A, fibrinógeno, proteína de unión a fibronectina y similares. La toxina alfa (por ejemplo, codificada por el gen hla) es uno de los factores de virulencia de Staphylococcus aureus y es producida por la mayoría de las cepas patógenas de S. aureus.
Las infecciones por S. aureus son relativamente difíciles de tratar y pueden aparecer enfermedades invasivas y recaídas después del tratamiento con antibióticos. Además, las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina se han vuelto más frecuentes, en entornos hospitalarios (por ejemplo, HA-MRSA o atención médica asociada) y entornos no hospitalarios (por ejemplo, CA-MRSA o asociados a la comunidad), lo que complica aún más el tratamiento de las infecciones por S. aureus. En muchos casos, las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina también son resistentes a uno o más antibióticos, que incluyen aminoglucósidos, tetraciclina, cloranfenicol, macrólidos y lincosamidas.
La toxina alfa es una toxina formadora de poros y tiene actividades citolíticas, hemolíticas, dermonecróticas y letales tanto en humanos como en animales. La toxina alfa estafilocócica se secreta como un polipéptido de cadena simple soluble en agua de 293 aminoácidos que tiene aproximadamente 34 kilodaltons (kDa). Sin estar limitado por la teoría, se considera que hay dos métodos de interacción toxina alfa/célula diana; (i) la toxina alfa se une a receptores específicos de alta afinidad (ADAM 10) en la superficie celular de plaquetas humanas, monocitos, células endoteliales, glóbulos blancos, células alveolares de pulmón, macrófagos, queratinocitos, fibroblastos, eritrocitos de conejo y otras células (ver, por ejemplo, Wilke et al., Proc. Natl Acad Sci. 107: 13473-13478 (2010)), o (ii) la toxina alfa interactúa de manera no específica por adsorción a las bicapas lipídicas. En cualquier modo de interacción toxina/célula, siete moléculas monoméricas de toxina alfa se oligomerizan para formar un canal trans-membrana heptamérico de 1-2 nm de diámetro. El flujo posterior de potasio y nucleótidos y la entrada de sodio y calcio conduce a la lisis osmótica y/o acciones secundarias múltiples, incluida la producción de eicosanoides, los procesos secretores, la disfunción contráctil, la apoptosis y la liberación de citoquinas. Se considera que la interrupción de las actividades celulares y la lisis de las células por la toxina alfa contribuye a las condiciones y enfermedades asociadas con la infección por S. aureus.
Los ejemplos no limitantes de algunas afecciones comunes causadas por la infección por S. aureus incluyen quemaduras, celulitis, dermonecrosis, infecciones de párpados, intoxicación alimentaria, infecciones de articulaciones, neumonía, infecciones de la piel, infección de la herida quirúrgica, síndrome de la piel escaldada y síndrome de choque tóxico. Además, es un patógeno frecuente en infecciones de cuerpos extraños, como líneas intravasculares, marcapasos, válvulas cardíacas artificiales e implantes de articulaciones. Algunas de las afecciones o enfermedades causadas por S. aureus se describen más adelante. Algunas o todas las afecciones y enfermedades descritas a continuación pueden involucrar la acción directa de la toxina alfa como un componente de la infección o mediador de la afección o estado de la enfermedad, o algunas o todas las afecciones pueden involucrar la acción indirecta o secundaria de la toxina alfa (por ejemplo, un factor de virulencia primario causa el síntoma principal o la mayoría de los síntomas asociados con la afección, y la toxina alfa actúa para hacer avanzar aún más la enfermedad a través de su interrupción de la función celular y las actividades de lisis celular).
Quemaduras
Las heridas por quemaduras suelen ser estériles inicialmente. Sin embargo, las quemaduras moderadas y graves generalmente comprometen las barreras físicas e inmunes a la infección (por ejemplo, ampollas, agrietamiento o descamación de la piel), causando una pérdida de líquido y electrolitos y provocan una disfunción fisiológica general o local. El contacto de la piel comprometida con bacterias viables a veces puede resultar en una colonización mixta en el sitio de la lesión. La infección se puede restringir a los residuos no viables en la superficie de la quemadura (“escara”), o la colonización puede progresar a una infección completa de la piel e invadir el tejido viable por debajo de la escara. Las infecciones más graves pueden llegar debajo de la piel, entrar en el sistema linfático y/o la circulación sanguínea y convertirse en septicemia. S. aureus se encuentra normalmente entre los patógenos que colonizan las infecciones por quemaduras. S. aureus puede destruir el tejido de granulación y producir septicemia grave.
Infecciones de la piel y tejidos blandos
Celulitis
La celulitis es una infección aguda de la piel que a menudo comienza como una infección superficial que se puede diseminar por debajo de la capa cutánea. La celulitis es más comúnmente causada por una infección mixta de S. aureus junto con S. pyogenes. La celulitis puede conducir a una infección sistémica. La celulitis a veces es un aspecto de la gangrena bacteriana sinérgica. La gangrena bacteriana sinérgica generalmente es causada por una mezcla de S. aureus y estreptococos microaerófilos. La gangrena bacteriana sinérgica causa necrosis y el tratamiento se limita a la escisión del tejido necrótico. La afección a menudo es fatal.
Dermonecrosis
La dermonecrosis es una infección de la piel y los tejidos subcutáneos, que se disemina fácilmente a través del plano fascial dentro del tejido subcutáneo. La afección hace que las capas superiores y/o inferiores de la piel se vuelvan necróticas, y pueden propagarse a los tejidos subyacentes y circundantes.
La fascitis necrotizante
La fascitis necrotizante se conoce como “enfermedad que comen carne” o “síndrome de bacterias que comen carne”. La fascitis necrotizante puede ser causada por una infección polimicrobiana (por ejemplo, tipo I, causada por una infección bacteriana mixta) o por una infección monomicrobiana (por ejemplo, tipo II, causada por una sola cepa patógena de bacterias). Muchos tipos de bacterias pueden causar fascitis necrotizante, entre las que se incluyen ejemplos no limitativos; Estreptococo del grupo A (por ejemplo, Streptococcus pyogenes), Staphylococcus aureus, Vibrio vulnificus, Clostridium perfringens y Bacteroides fragilis. Las personas con sistemas inmunitarios deprimidos o comprometidos tienen más probabilidades de sufrir dermonecrosis (por ejemplo, fascitis necrotizante).
Históricamente, el estreptococo del grupo A se diagnosticó como la causa de la mayoría de los casos de infecciones dermonecróticas tipo II. Sin embargo, desde 2001, el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) se ha observado con mayor frecuencia como causa de la fascitis necrotizante monomicrobiana. La infección comienza localmente, a veces en un sitio de trauma, que puede ser grave (como el resultado de una cirugía), menor o incluso no evidente. Por lo general, los pacientes se quejan de dolor intenso que puede parecer excesivo dada la apariencia externa de la piel. Con la progresión de la enfermedad, el tejido se inflama, a menudo en cuestión de horas. La diarrea y los vómitos también son síntomas comunes.
El síntoma de inflamación puede no ser evidente en las primeras etapas de la infección, si las bacterias se encuentran en lo profundo del tejido. Si las bacterias no son profundas, los síntomas de inflamación, como enrojecimiento y piel inflamada o caliente, se muestran muy rápidamente. El color de la piel puede progresar a violeta y se pueden formar ampollas, con necrosis subsiguiente (por ejemplo, muerte) de los tejidos subcutáneos. Los pacientes con fascitis necrotizante suelen tener fiebre y aparecen muy enfermos. Se han observado tasas de mortalidad tan altas como 73 por ciento si no se tratan. Sin la asistencia médica adecuada, la infección progresa rápidamente y finalmente conduce a la muerte.
Neumonía
S. aureus también se ha diagnosticado como una causa de neumonía estafilocócica. La neumonía por estafilococo causa inflamación e inflamación del pulmón, que a su vez hace que el líquido se acumule en el pulmón. La acumulación de líquido en el pulmón puede evitar que el oxígeno ingrese al torrente sanguíneo. Las personas con influenza tienen riesgo de desarrollar neumonía bacteriana. Staphylococcus aureus es la causa más común de neumonía bacteriana en las personas que ya padecen influenza. Los síntomas comunes de la neumonía por estafilococos incluyen tos, dificultad para respirar y fiebre. Los síntomas adicionales incluyen fatiga, mucosidad amarilla o sanguinolenta y dolor en el pecho que empeora con la respiración. S. aureus resistente a la meticilina (SARM) se diagnostica cada vez más como la cepa identificada en la neumonía estafilocócica.
Infecciones de heridas quirúrgicas
Las heridas quirúrgicas a menudo penetran muy lejos en el cuerpo. La infección de tales heridas representa un grave riesgo para un paciente, si la herida se infecta. S. aureus es frecuentemente un agente causal de infecciones en heridas quirúrgicas. S. aureus es inusualmente un adepto a las heridas quirúrgicas invasoras, las heridas suturadas pueden ser infectadas por muchas menos células de S. aureus que son necesarias para causar una infección en la piel normal. La invasión de la herida quirúrgica puede conducir a una grave septicemia por S. aureus. La invasión del torrente sanguíneo por S. aureus puede conducir a la siembra e infección de los órganos internos, particularmente las válvulas cardíacas y los huesos, causando enfermedades sistémicas, como la endocarditis y la osteomielitis.
Síndrome de la piel escaldada
S. aureus es probablemente un agente causal principal, si no el agente causal, del “síndrome de piel escaldada”, también conocido como “síndrome de la piel escaldada estafilocócica”, “necrosis epidérmica tóxica”, “ impétigo bulloso localizado”, “enfermedad de Ritter “Y” enfermedad de Lyell “ . El síndrome de la piel escaldada ocurre con frecuencia en niños mayores, generalmente en los brotes causados por la floración de las cepas de S. aureus que producen exotoxinas epidermolíticas (por ejemplo, exfoliatina A y B, a veces denominada toxina del síndrome de la piel escaldada), que causa desprendimiento dentro de la capa epidérmica. Una de las exotoxinas está codificada por el cromosoma bacteriano y la otra está codificada por un plásmido. Las exotoxinas son proteasas que escinden desmoglein-1, que normalmente mantienen juntas las capas granulosa y espinosa de la piel.
La bacteria inicialmente puede infectar solo una lesión menor, sin embargo, la toxina destruye las conexiones intercelulares, propaga las capas epidérmicas y permite que la infección penetre la capa externa de la piel, produciendo la descamación que tipifica la enfermedad. El desprendimiento de la capa externa de la piel generalmente revela una piel normal debajo, pero la pérdida de líquido en el proceso puede producir lesiones graves en los niños pequeños si no se trata adecuadamente.
Síndrome de choque tóxico
El síndrome del choque tóxico (SST) es causado por cepas de S. aureus que producen la llamada “toxina del síndrome del choque tóxico”. La enfermedad puede ser causada por la infección por S. aureus en cualquier sitio, pero a menudo se considera erróneamente como una enfermedad exclusiva de mujeres que usan tampones. La enfermedad involucra toxemia y septicemia, y puede ser fatal.
Los síntomas del síndrome de choque tóxico varían según la causa subyacente. El SST resultante de la infección con la bacteria Staphylococcus aureus se manifiesta normalmente en individuos sanos con fiebre alta, acompañados de presión arterial baja, malestar y confusión, que pueden progresar rápidamente hacia el estupor, el coma y la insuficiencia multiorgánica. La erupción característica, que a menudo se observa en una etapa temprana de la enfermedad, se asemeja a una quemadura solar y puede afectar a cualquier región del cuerpo, incluidos los labios, la boca, los ojos, las palmas y las plantas. En los pacientes que sobreviven al ataque inicial de la infección, la erupción se descama o se despega después de 10 a 14 días.
Como se señaló anteriormente, debido al aumento de cepas resistentes a múltiples fármacos de S. aureus, un número creciente de antibióticos comúnmente utilizados para tratar infecciones por S. aureus, ya no controlan ni eliminan infecciones de meticilina y Staphylococcus aureus resistente a múltiples fármacos. Los anticuerpos contra la toxina alfa de S. aureus descritos en el presente documento pueden ayudar a reducir la gravedad de la infección y también pueden ayudar a eliminar, prevenir (profilácticamente) o reducir el S. aureus patógeno de un huésped infectado.
Anticuerpos
Como se usa en el presente documento, los términos “anticuerpo”, “anticuerpos” (también conocidos como inmunoglobulinas) y “fragmentos de unión a antígeno”, abarcan anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de al menos dos fragmentos de unión a epítopos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de camélidos, anticuerpos quiméricos, Fvs de una sola cadena (scFv), anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , fragmentos de anticuerpos que muestran la actividad biológica deseada (por ejemplo, la porción de unión al antígeno), Fvs ligados a disulfuro (dsFv) y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-id para anticuerpos en este documento) proporcionados), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen al menos un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1m (f, z, a o x), G2m (n), G3m (g, b, o c), Am, Em y Km (1, 2 o 3)). Los anticuerpos pueden derivarse de cualquier mamífero, incluidos, entre otros, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones y similares, u otros animales como aves (por ejemplo, pollos).
Los anticuerpos nativos generalmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 Daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes (CH). Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante (CL) en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras se clasifican como cadenas lambda o cadenas kappa basadas en la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera. El dominio variable de una cadena ligera kappa también se puede denotar aquí como VK.
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento incluyen anticuerpos de longitud completa o intactos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de secuencia nativa o variantes de aminoácidos, humanos, humanizados, modificados post-traduccionalmente, anticuerpos quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. Los anticuerpos pueden modificarse en la región Fc, y ciertas modificaciones pueden proporcionar funciones efectoras deseadas o vida media en suero.
También se contemplan los anticuerpos que tienen una o más características biológicas (por ejemplo, potencia, afinidad de toxina alfa, función efectora, afinidad de unión ortóloga, neutralización, inhibición de la formación de heptámero toxina alfa y similares) de los presentes anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa se pueden utilizar para diagnosticar y/o tratar y/o aliviar y/o prevenir uno o más síntomas de la enfermedad asociada a Staphylococcus aureus en un mamífero, como se describió anteriormente.
En el presente documento se proporciona una composición que comprende un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa y un vehículo. Para los fines del tratamiento de la enfermedad asociada a S. aureus, las composiciones pueden administrarse a un paciente que necesite dicho tratamiento, donde la composición puede comprender uno o más anticuerpos anti-toxina alfa y/o fragmentos de los mismos. También se proporcionan formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento del mismo como se presenta en el presente documento y un vehículo. La formulación es una formulación profiláctica o terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los métodos proporcionados aquí son útiles para tratar una enfermedad/afección asociada con Staphylococcus aureus y/o una toxina alfa y/o prevenir y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad o afección en un mamífero, que comprenden administrar un agente terapéutico Cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa para el mamífero. Las composiciones profilácticas o terapéuticas de anticuerpos pueden administrarse a corto plazo (agudas) o crónicas, o de manera intermitente según lo indique un médico.
En este documento se divulgan artículos de fabricación comprenden al menos un anticuerpo o fragmento anti-alfa, tal como en una forma de dosificación estéril y/o en un kit. Un kit que contenga un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede ser útil, por ejemplo, para los ensayos de destrucción de células de S. aureus, para la purificación o inmunoprecipitación de toxina alfa de las células. Por ejemplo, para el aislamiento y la purificación de toxina alfa, un kit puede contener un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Un kit puede contener un anticuerpo para la detección y cuantificación de S. aureus y/o toxina alfa in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Dicho anticuerpo útil para la detección puede proporcionarse con una etiqueta tal como un fluorescente o radiomarcador.
Terminología
Debe entenderse que el método proporcionado en el presente documento no se limita a composiciones específicas o etapas del proceso, ya que puede variar. Se observa que, tal como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, la forma singular “un”, “una” y “ la” incluyen referentes singulares y plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido de toxina alfa (por ejemplo, monómero de toxina alfa, se refiere aquí como un “anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa” en forma singular y como “fragmentos y Anticuerpos anti toxina -alfa” en forma plural. Los polipéptidos de toxinas alfa a veces se denominan alfa hemolisina. La toxina alfa forma poros en las membranas celulares después de la oligomerización en un heptámero, donde los polipéptidos oligomerizados a veces se denominan colectivamente como un “poro de toxina alfa”, o “heptámero de toxina alfa”.
Los aminoácidos a menudo se mencionan aquí mediante los símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, de la misma manera, a menudo son referidos por códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
La numeración de los aminoácidos en el dominio variable, la región determinante de la complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo sigue, a menos que se indique lo contrario, la definición de Kabat según lo expuesto en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de un solo aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después de la cadena pesada Fr residuo 82. La numeración de residuos de Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado mediante el alineamiento en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat “estándar”. La alineación máxima de los residuos de la estructura frecuentemente requiere la inserción de residuos “espaciadores” en el sistema de numeración, para ser utilizados para la región Fv. Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número de sitio Kabat dado puede variar de cadena de anticuerpo a cadena de anticuerpo debido a interespecies o divergencia alélica.
Anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa
En el presente documento se divulga un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa está aislado y/o purificado y/o libre de pirógenos. El término “purificado” como se usa en este documento, se refiere a una molécula de interés, que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su ambiente natural. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado es un anticuerpo purificado en el que se ha separado de uno o más componentes de su entorno natural. El término “anticuerpo aislado” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otras moléculas de anticuerpo que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a la toxina alfa está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a otros antígenos distintos de la toxina alfa). Una molécula de anticuerpo bi o multi-específica es un anticuerpo aislado cuando está sustancialmente libre de otras moléculas de anticuerpo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados son anticuerpos aislados donde se han separado de anticuerpos con una especificidad diferente. Un anticuerpo aislado puede ser un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de toxina alfa de S. aureus puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de Staphylococcus). Un anticuerpo aislado como se proporciona puede estar sustancialmente libre de uno o más de otros materiales celulares. En el presente documento se proporciona una combinación de anticuerpos monoclonales “aislados”, y se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y se combinan en una composición definida. Los métodos de producción y purificación/aislamiento de un anticuerpo o fragmento anti­ toxina alfa se describen aquí con más detalle.
Los anticuerpos aislados presentados comprenden secuencias de aminoácidos de anticuerpos divulgadas en el presente documento, que pueden codificarse por cualquier polinucleótido adecuado. Los anticuerpos aislados a veces se proporcionan de manera formulada. Se divulga en el presente documento, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une a la toxina alfa de S. aureus y, por lo tanto, altera parcial o sustancialmente al menos una actividad biológica de la toxina alfa, por ejemplo, la oligomerización en el complejo heptámero activo.
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa a menudo se une de forma inmunoespecífica a uno o más epítopos específicos de la proteína toxina alfa, péptido, subunidad, fragmento, porción, oligómeros o cualquier combinación de los mismos y, en general, no se unen específicamente a otros polipéptidos. El término “oligómeros” u “oligómeros de toxina alfa” se refiere a una asociación de monómeros toxina alfa (por ejemplo, 2 monómeros, 3 monómeros, 4 monómeros, 5 monómeros, 6 monómeros o 7 monómeros) para formar un poro funcional (por ejemplo, 7 monómeros de alfa de toxinas). Un epítopo puede comprender al menos una región de unión a anticuerpo que comprende al menos una porción de la proteína toxina alfa. El término “epítopo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante proteico capaz de unirse a un anticuerpo. Los epítopos generalmente incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos y/o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características químicas específicas (por ejemplo, carga, polaridad, básica, ácida, hidrofobicidad y similares). Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros, pero no los últimos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epítopo reconocido interfiere con la formación del heptámero activo (por ejemplo, inhibe la oligomerización de monómeros toxina alfa en un complejo de heptámero activo).
El epítopo comprende al menos una porción de la proteína toxina alfa, que está implicada en la formación de un complejo heptámero toxina alfa. Un epítopo especificado puede comprender cualquier combinación de al menos una secuencia de aminoácidos de al menos 3 residuos de aminoácidos en la porción especificada completa de aminoácidos contiguos de la proteína toxina alfa. El epítopo es al menos 4 residuos de aminoácidos, al menos 5 residuos de aminoácidos, al menos 6 residuos de aminoácidos, al menos 7 residuos de aminoácidos, al menos 8 residuos de aminoácidos, al menos 9 residuos de aminoácidos, en al menos 10 residuos de aminoácidos, al menos 11 residuos de aminoácidos, al menos 12 residuos de aminoácidos, al menos 13 residuos de aminoácidos, al menos 14 residuos de aminoácidos, o al menos 15 residuos de aminoácidos a la porción especificada completa de aminoácidos contiguos de la proteína toxina alfa. El epítopo comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos contiguos o no contiguos. Los residuos de aminoácidos comprendidos dentro del epítopo están implicados en la formación del complejo heptámero toxina alfa. Los residuos de contacto comprenden T261, T263, N264, K266 y K271. Los residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de la SEQ ID NO: 39. Los residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 y K271 de SEQ ID NO. 39. La porción de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39. La porción de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende los aminoácidos 248-277 de la SEQ ID NO: 39. La porción de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende los aminoácidos 173-201 y 261-272 de la SEQ ID NO: 39.
Por lo tanto, los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa aislados/purificados se unen inmunoespecíficamente a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 39 y/o a una molécula que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 40. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa también se unen a homólogos u ortólogos de toxinas alfa de diferentes especies, o a variantes de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39, donde la histidina en la posición 35 se reemplaza por leucina, o se reemplaza con otros aminoácidos correspondientes a mutaciones H35 conocidas por un experto en la técnica.
Regiones variables
Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se prepara a partir de un anticuerpo parental. El anticuerpo o fragmento anti-alfa puede estar abarcado dentro del anticuerpo parental. Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo parental” se refiere a un anticuerpo que está codificado por una secuencia de aminoácidos utilizada para la preparación de la variante o derivado, definido en el presente documento. Un polipéptido original puede comprender una secuencia de anticuerpos nativa (es decir, una variante alélica que se produce de forma natural) o una secuencia de anticuerpos con modificaciones de secuencias de aminoácidos preexistentes (como otras inserciones, supresiones y/o sustituciones) de una secuencia que ocurre de forma natural. Un anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa son variantes del anticuerpo parental. Tal como se usa en el presente documento, el término “variante” se refiere a un anticuerpo o fragmento anti­ toxina alfa que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácido o fragmento de aminoácido anti-toxina alfa “parental” en virtud de la adición, eliminación y/o sustitución. de uno o más residuos de aminoácido en la secuencia del anticuerpo pariente.
La porción de unión a antígeno de un anticuerpo comprende uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, toxina alfa). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, a menudo están codificados por genes separados, se pueden unir, mediante métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite fabricarse como una cadena de proteína única en la que el VL y Las regiones VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv). Dichos anticuerpos de cadena simple también se incluyen dentro de los términos “anticuerpo y” porción de unión a antígeno “de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando técnicas conocidas, y los fragmentos pueden seleccionarse para determinar la actividad de unión de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa divulgados en el presente documento comprenden al menos un dominio de unión a antígeno. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 y un VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Véase el Ejemplo 11, Tabla 7 para una representación de las secuencias VH y VL tal como se presentan en el presente documento que pueden estar presentes en cualquier combinación para formar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa, o estar presentes en una combinación para formar un mAb como se divulga en el presente documento. El VH se selecciona de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. El VL se selecciona de la SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Ciertas secuencias de nucleótidos VH y VL se presentan en el Ejemplo 11, Tabla 8.
En el presente documento se divulgan los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno del mismo que comprenden un VH y un VL, donde el VH y el VL tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 20 y 19; SEQ ID NOs; 22 y 21; SEQ ID NOs: 24 y 23; SEQ ID NOs: 26 y 25; SEQ ID NOs: 28 y 27; SEQ ID NOs: 41 y 42; SEQ ID NOs: 43 y 44; SEQ ID NOs: 45 y 46; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 49 y 50; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 53 y 54; SEQ ID NOs: 55 y 56; SEQ ID NOs: 57 y 58; SEQ ID NOs: 59 y 60; SEQ ID NOs: 61 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 63; SEQ ID NOs: 79 y 63.
Las Tablas 1-7 del Ejemplo 11 proporcionan regiones variables de cadena pesada (VH), regiones variables de cadena ligera (VL) y regiones determinantes de complementariedad (CDR) para ciertas realizaciones de los anticuerpos y fragmentos presentados en este documento. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa comprenden un VH y/o VL que tiene un porcentaje dado de identificación de al menos una de las secuencias VH y/o VL divulgadas en la Tabla 7. Como se usa en este documento, el término “porcentaje de identidad de secuencia”, que también incluye “homología”, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las secuencias de referencia, como la secuencia del anticuerpo pariente, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de la secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede producir, además de forma manual, por medio de algoritmos de homología locales conocidos en la técnica o por medio de programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin).
En el presente documento se divulga un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que puede comprender una secuencia de aminoácidos VH que comprende al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de identidad a, o que comprende 100 % de identidad con, la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluye una secuencia de aminoácidos VH al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntico a, o 100 % idéntico a, la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61, o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-alfa comprende 1-10 sustituciones conservativas en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una secuencia de aminoácidos VH con un porcentaje dado se identifica con las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 tiene una o más características (que se describen con más detalle a continuación) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (KD) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monómeros de toxinas alfa, pero no inhibe la unión de la toxina alfa al receptor de toxinas alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxinas alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %;
(d) reduce la actividad citolítica de la toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % (por ejemplo, según lo determinado por los ensayos de hemólisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltración celular y la liberación de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en un modelo de neumonía animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un antígeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (KD) en el rango de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfaque puede comprender una secuencia de aminoácidos VL al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % idéntica o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede incluir una secuencia de aminoácidos VL de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntica a, o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende 1-10 sustituciones conservativas en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una secuencia de aminoácidos VL con un porcentaje dado se identifica con las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 5254, 56, 58, 60 o 63 y tiene una o más características (que se describen con más detalle a continuación) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (KD) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monómeros de toxinas alfa, pero no inhibe la unión de toxina alfa al receptor de toxina alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxinas alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %;
(d) reduce la actividad citolítica de la toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %; (por ejemplo, según lo determinado por los ensayos de hemólisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltración celular y la liberación de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumonía animal).
En el presente documento se divulga un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un antígeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (Kd) en el rango de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
En el presente documento se divulga un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se puede unir de forma inmunoespecífica a la toxina alfa y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43. 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos el 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63, donde el anticuerpo tiene la actividad de inhibir la unión de uno o más monómeros toxina alfa entre sí (por ejemplo, inhibe la oligomerización).
Regiones que determinan la complementariedad
Si bien el dominio variable (VH y VL) comprende la región de unión al antígeno, la variabilidad no se distribuye de manera uniforme a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR), tanto en la cadena ligera (VL o VK) como en los dominios variables de cadena pesada (VH). Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cuatro FR, que adoptan en gran parte una configuración de hoja p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la hoja beta. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por la FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver, Kabat et al., Supra). Las tres CDR de la cadena pesada se designan VH-CDR1, VH CDR2 y VH-CDR-3, y las tres CDR de la cadena ligera se designan VL-CDR1, VL-CDR2 y VI-CDR3 El sistema de numeración de Kabat se utiliza aquí. Como tal, la VH-CDR1 comienza en aproximadamente el aminoácido 31 (es decir, aproximadamente 9 residuos después del primer residuo de cisteína), incluye aproximadamente 5-7 aminoácidos, y termina en el siguiente residuo de serina. La VH-CDR2 comienza en el decimoquinto residuo después del final de la CDR-H1, incluye aproximadamente 16-19 aminoácidos y termina en el siguiente residuo de glicina. VH-CDR3 comienza en aproximadamente el trigésimo residuo de aminoácido después del final de VH-CDR2; incluye aproximadamente 13-15 aminoácidos; y termina en la secuencia M-D-V. La VL-CDR1 comienza en aproximadamente el residuo 24 (es decir, después de un residuo de cisteína); incluye aproximadamente 10-15 residuos; y termina con la secuencia Y — V — S. VL-CDR2 comienza en aproximadamente el decimosexto residuo después del final de VL-CDR1 e incluye aproximadamente 7 residuos. VL-CDR3 comienza aproximadamente en el trigésimo tercer residuo después del final de VH-CDR2; incluye aproximadamente 7-11 residuos y termina en la secuencia TI-L. Tenga en cuenta que las CDR varían considerablemente de un anticuerpo a otro (y, por definición, no mostrarán homología con las secuencias de consenso de Kabat).
Los presentes anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa comprenden al menos un dominio de unión a antígeno que incluye al menos una región determinante de complementariedad (CDR1, CDR2 o CDR3). Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende un VH que incluye al menos una CDR de VH (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3). Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti­ toxina alfa que comprende una VL que incluye al menos una CDR de VL (por ejemplo, CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3).
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus incluye, (a) una CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica o que comprende 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos sustituciones relativas a la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1 ,2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; y (c) una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o que comprenden 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en cada CDR en relación con las SEQ ID NO.: 7, 8 y 9; SEQ ID NO: 10, 11 y 12; SEQ ID NO: 13, 14 y 15; SEQ ID NO: 7, 17 y 18; SEQ ID NOs: 7, 8 y 16; SEQ ID NOs: 7, 8 y 65; SEQ ID NO: 7, 8 y 66; SEQ ID NOs 7, 8 y 67; SEQ ID NOs: 7, 8 y 78; SEQ ID NO: 69, 70 y 71; SEQ ID NO: 7, 8 y 72; SEQ ID NO: 69, 75 y 71; SEQ ID NO: 69, 75 y 76; o SEQ ID NOs: 69, 70 y 71.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus incluye, (a) una CDR1 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica o que comprende 1, 2 o 3 residuos de aminoácidos sustituciones relativas a la SEQ ID NO: 1 o 4; (b) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1,2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (c) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a, o que comprenden 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en cada CDR en relación con las SEQ ID NO.: 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 4, 5 y 6; SEQ ID NOs: 1, 2 y 64; SEQ ID NOs: 1,2 y 68; SEQ ID NOs: 1, 73 y 74; o SEQ ID NOs: 1, 77 y 74.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus comprende un VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a, o que comprende 1,2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en cada CDR en relación con: (a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; (c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78; (d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o 4; (e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una VH CDR1, V h CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas o que comprenden 1, 2 o 3 aminoácidos. sustituciones de residuos en cada CDR en relación con las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 10, 11, 12, 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 13, 14, 15, 4, 5 y 6; SEQ ID NO: 7, 17, 18, 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 7, 8, 16, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1, 2 y 64; SEQ ID NOs; 7, 8, 66, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 78, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 7, 8, 72, 1, 73 y 74; SEQ ID NO: 69, 75, 71, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 77 y 74; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 77 y 74,
Se divulga en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que (i) incluye un dominio de cadena VH que comprende tres CDR y un dominio de cadena VL que comprende tres CDR; y (ii) se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus, donde las tres CDR del dominio de la cadena VH incluyen (a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; y (c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78. La VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 corresponden a las SEQ ID NO: 7, 8 y 9; SEQ ID NO: 10, 11 y 12; SEQ ID NO: 13, 14 y 15; SEQ ID NO: 7, 17 y 18; SEQ ID NOs: 7, 8 y 16; SEQ ID NOs: 7, 8 y 65; SEQ ID NO: 7, 8 y 66; SEQ ID NOs 7, 8 y 67; SEQ ID NOs: 7, 8 y 78; SEQ ID NO: 69, 70 y 71; SEQ ID NO: 7, 8 y 72; SEQ ID NO: 69, 75 y 71; SEQ ID NO: 69, 75 y 76; o SEQ ID NOs: 69, 70 y 71.
Se divulga en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que (i) incluye un dominio de cadena VH que comprende tres CDR y un dominio de cadena VL que comprende tres CDR; y (ii) se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus, donde las tres CDR del dominio de la cadena VL incluyen (a) una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o 4; (b) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (c) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74. La VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 corresponden a las SEQ ID NO: 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 4, 5 y 6; SEQ ID NOs: 1, 2 y 64; SEQ ID NOs: 1,2 y 68; SEQ ID NOs: 1, 73 y 74; o SEQ ID NOs: 1, 77 y 74.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une de forma inmunoespecífica a toxina alfa de S. aureus y comprende (a) una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos con respecto a la SEC. ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; y (c) una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78; (d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o 4; (e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74 y tiene una o más características (que se describen con más detalle a continuación) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) afinidad constante (Kd) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monómeros de toxinas alfa, pero no inhibe la unión de toxina alfa al receptor de toxina alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxinas alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %;
(d) reduce la actividad citolítica de la toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %; (por ejemplo, según lo determinado por ensayos de hemólisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltración celular y la liberación de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumonía animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un antígeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (Kd) en el rango de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Ejemplo 11, las Tablas 1-7 proporcionan secuencias para VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 para anticuerpos de la presente invención. La Tabla 9 proporciona un resumen de las CDR de VH y VL. Estas regiones pueden combinarse en varias combinaciones, ya que cada región CDR puede seleccionarse independientemente para un anticuerpo dado. La Tabla 7 ilustra diferentes secuencias que pueden seleccionarse para cada región. Las secuencias VL CDR3 pueden estar presentes en cualquier combinación para formar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa presente. La VH CDR1 se selecciona de la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69, la VH CDR2 se selecciona de la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75 y la VH CDR3 se selecciona de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78 como se muestra en la Tabla 9. La VL CDR1 se selecciona de la SEQ ID NO: 1 o 4, la VL CDR2 se selecciona de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77 y la VL CDR3 se selecciona de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74 como se muestra en la Tabla 9.
Los dominios VH CDR3 y VL CDR3 cumplen una función en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo por un antígeno. (de acuerdo con un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEC ID No. : SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74. Las porciones restantes de los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa (por ejemplo, CDR1, CDR2, VH, VL y similares) pueden comprender secuencias específicas descritas en el presente documento o secuencias conocidas que proporcionan los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa que se unen de forma inmunoespecífica a S. toxina alfa aureus.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une de forma inmunoespecífica a la toxina alfa y comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78, donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno inhibe la oligomerización de la toxina alfa.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une de forma inmunoespecífica a toxina alfa y comprende una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74, donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno inhibe la oligomerización de la toxina alfa.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une de forma inmunoespecífica a la toxina alfa y comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78, donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno reduce o inhibe la liberación de citoquinas.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une de forma inmunoespecífica a toxina alfa y comprende una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74, donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno reduce o inhibe la liberación de citoquinas.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une de forma inmunoespecífica a la toxina alfa y comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78, donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno alivia o elimina la dermonecrosis.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une de forma inmunoespecífica a toxina alfa y comprende una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74, donde el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno alivia o elimina la dermonecrosis.
Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa a menudo comprenden una o más secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales a una secuencia de aminoácidos descrita en este documento. Las secuencias de aminoácidos que son sustancialmente iguales incluyen secuencias que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas, así como supresiones y/o inserciones de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativa se refiere a la sustitución de un primer aminoácido por un segundo aminoácido que tiene propiedades químicas y/o físicas (por ejemplo, carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilia) que son similares a las del primer aminoácido. Las sustituciones conservativas incluyen el reemplazo de un aminoácido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptófano (W), metionina (M), cisteína (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T.
Regiones marco
Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera comprenden cada uno cuatro regiones marco (en general FR1, FR2, FR3, FR4 o alternativamente FW1, FW2, FW3, FW4), que son las partes más altamente conservadas de los dominios variables. Las cuatro regiones marco de la cadena pesada se designan aquí como VH-FW1, VH-FW2, VH-FW3 y VH-FW4, y las cuatro regiones marco de la cadena ligera se designan aquí VL-FW1, VL-FW2, VL-FW3 y VH-FW4. El sistema de numeración Kabat se usa aquí, y como tal, VH-FW1 comienza en la posición 1 y termina en aproximadamente el aminoácido 30, VH-FW2 es aproximadamente del aminoácido 36 a 49, VH-FW3 es aproximadamente del aminoácido 66 a 94 y VH-FW4 es aproximadamente el aminoácido 103 a 113. VL-FW1 comienza en el aminoácido 1 y termina en aproximadamente el aminoácido 23, VL-FW2 es aproximadamente del aminoácido 35 a 49, VL-FW3 es aproximadamente del aminoácido 57 a 88 y VL-FW4 es aproximadamente del aminoácido 98 a 107. Las regiones marco contienen sustituciones de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, por ejemplo, inserción a 106A en VL-FW1. Además de las sustituciones naturales, también pueden introducirse una o más alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de residuos de FR en un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa. Estas alteraciones dan como resultado una mejora u optimización en la afinidad de unión del anticuerpo para anti-toxina alfa. Los ejemplos no limitantes de residuos de la región marco que pueden modificarse incluyen aquellos que se unen de forma no covalente al antígeno directamente, interactúan con/efectúan la conformación de una CDR y/o participan en la interfaz VL-VH.
Una región marco puede comprender uno o más cambios de aminoácidos para los fines de la “estirpe germinal”. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos seleccionados se comparan con las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de la estirpe germinal y, cuando ciertos residuos estructurales de las cadenas VL y/o VH seleccionadas difieren de la configuración de la estirpe germinal (por ejemplo, de la mutación somática de los genes de inmunoglobulina utilizados para preparar la biblioteca de fagos), puede ser deseable “retromutación” los residuos del marco alterado de los anticuerpos seleccionados a la configuración de la estirpe germinal (es decir, cambiar las secuencias de aminoácidos del marco de los anticuerpos seleccionados de modo que sean las mismas que las secuencias de aminoácidos del marco de la estirpe germinal). Dicha “retromutación” (o “estirpe germinal”) de residuos del marco puede lograrse mediante métodos estándar de biología molecular para introducir mutaciones específicas (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR y similares). Se divulgan en el presente documento residuos del marco variable de la cadena ligera y/o pesada se vuelven a mutar. Se divulga en el presente documento una cadena pesada variable de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo presentado está mutada nuevamente. Se divulga en el presente documento una cadena pesada variable de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más mutaciones anteriores.
Se divulga en el presente documento el VH de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa presentado en este documento que puede comprender FR1, FR2, FR3 y/o FR4 que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos con las regiones marco correspondientes (es decir, FR1 del anticuerpo X en comparación con FR1 del anticuerpo Y) dentro de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 que es de aproximadamente 65% a alrededor del 100%. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una secuencia de aminoácidos VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % idéntico a, o 100 % idéntico a, el FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una secuencia de aminoácidos VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntico a, o 100 % idéntico al FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que puede comprender un VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos en relación con, FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. En particular, Fr 1, FR2, FR3 o FR4 del VH pueden tener cada uno una secuencia de aminoácidos idéntica o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos en relación con el FR1, FR2, FR3 o FR4 correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62.
Se divulga en el presente documento la VL de un anticuerpo anti-toxina alfa o fragmento aquí proporcionado que puede comprender FR1, FR2, FR3 y/o FR4 que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos con las regiones marco correspondientes (es decir, FR1 del anticuerpo X en comparación con FR1 del anticuerpo Y) dentro del FR de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63 (por ejemplo, de aproximadamente 65 % a aproximadamente el 100% de identidad de secuencia). Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una secuencia de aminoácidos VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % idéntico a, o 100 % idéntico a, el FR correspondiente de VL s Eq ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 58, 60 o 63. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una secuencia de aminoácidos VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idéntico a, o 100 % idéntico a, el f R correspondiente de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende un VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos en relación con, la correspondiente FR de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. En particular, FR1, FR2, FR3 o FR4 de la VL pueden tener cada uno una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos con relación a las FR1, FR2, FR3 o FR4 correspondientes de VH SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une de forma inmunoespecífica a toxina alfa y comprende un VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 aminoácidos sustituciones relativas a, el FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 y/o VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoácidos en relación con, el FR correspondiente de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63, donde el anticuerpo tiene una o más características (que se describen con más detalle a continuación) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (Kd) para toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monómeros de toxinas alfa, pero no inhibe la unión de toxina alfa al receptor de toxina alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxinas alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %;
(d) reduce la actividad citolítica de la toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %; (por ejemplo, según lo determinado por ensayos de hemólisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltración celular y la liberación de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumonía animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un antígeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (Kd) en el rango de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos y fragmentos anti toxina alfa
Además de las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, también se proporcionan secuencias de nucleótidos correspondientes a las secuencias de aminoácidos y que codifican los anticuerpos humanos, humanizados y/o quiméricos divulgados en este documento. Se divulgan en el presente documento los polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa descrito en el presente documento o fragmentos del mismo. Estas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente. Las secuencias de nucleótidos se proporcionan en el Ejemplo 11, Tabla 8. Por lo tanto, también se proporcionan secuencias polinucleotídicas que codifican regiones marco VH y VL que incluyen CDR y FR de anticuerpos descritos en el presente documento, así como vectores de expresión para su expresión eficaz en células (por ejemplo, células de mamíferos). Los métodos para hacer un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa usando polinucleótidos se describen a continuación con más detalle.
También se incluyen los polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación rigurosas o de menor rigurosidad, por ejemplo, como se define en el presente documento, con polinucleótidos que codifican un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa. El término “rigurosidad” como se usa en el presente documento se refiere a las condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura y concentración de sal) de un experimento de hibridación para denotar el grado de homología entre dos ácidos nucleicos; cuanto mayor sea la rigurosidad, mayor porcentaje de homología entre los dos ácidos nucleicos.
Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen, pero no se limitan a, la hibridación al ADN unido a un filtro en 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados Celsius seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC/SDS al 0,1 % a aproximadamente 50 - 65 grados centígrados, condiciones altamente estrictas, como la hibridación al ADN unido a un filtro en 6X de SSC a aproximadamente 45 grados centígrados, seguida de uno o más lavados en 0,1X SSC/0,2 % SDS a aproximadamente 65 grados centígrados, o cualquier otra condiciones de hibridación rigurosas conocidas.
Se divulga en el presente documento un ácido nucleico o fragmento del mismo que puede codificar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa e hibridar en condiciones rigurosas a un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleótidos que puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntico a una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntico a un secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 o 38. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluye una secuencia de nucleótidos que comprende al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleótidos que puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntico a una Secuencia de nucleótidos VH que codifica la secuencia de aminoácidos VH de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61, o 62. Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntico a una Secuencia de nucleótidos VH de la SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36 o 38. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica VH que comprende al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62.
Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleótidos que puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntico a una secuencia de nucleótidos VL que codifica la secuencia de aminoácidos VL de SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleótidos que puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntico a un Secuencia de nucleótidos VL de la SEQ ID NO: 29, 31, 33, 35 o 37. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica VL que comprende al menos, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento una secuencia polinucleotídica que puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntico a VH secuencia de aminoácidos y una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos VL, donde las secuencias VH y VL están representadas por las SEQ ID NO: 20 y 19; SEQ ID NOs; 22 y 21; SEQ ID NOs: 24 y 23; SEQ ID NOs: 26 y 25; SEQ ID NOs: 28 y 27; SEQ ID NOs: 41 y 42; SEQ ID NOs: 43 y 44; SEQ ID NOs: 45 y 46; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 49 y 50; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 53 y 54; SEQ ID NOs: 55 y 56; SEQ ID NOs: 57 y 58; SEQ ID NOs: 59 y 60; SEQ ID NOs: 61 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 63; SEQ ID NOs: 79 y 63.
Secuencias sustancialmente idénticas pueden ser secuencias polimórficas, es decir, secuencias alternativas o alelos en una población. Una diferencia alélica puede ser tan pequeña como un par de bases. Secuencias sustancialmente idénticas también pueden comprender secuencias mutagenizadas, que incluyen secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutación puede comprender uno o más cambios de residuos, una eliminación de uno o más residuos, o una inserción de uno o más residuos adicionales.
Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos puede determinarse, por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, un polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente, que, brevemente, involucra la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridación y ligado de los oligonucleótidos, y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Un polinucleótido que codifica un anticuerpo también puede generarse a partir de ácido nucleico a partir de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular no está disponible, pero la secuencia de la molécula del anticuerpo es conocida, un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc del anticuerpo, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, a veces ARN poliA , aislada de cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo, como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables a los 3' y 5' extremos de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia del gen particular para identificar, por ejemplo, un clon de cDNA de una biblioteca de cDNA que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse luego en vectores de clonación replicables usando cualquier método conocido en la técnica.
Una vez que se determina la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos del anticuerpo, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo puede manipularse usando métodos conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR y similares, para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, el término “condiciones rigurosas” se refiere a las condiciones para la hibridación y el lavado. Los expertos en la técnica conocen métodos para optimizar la condición de temperatura de reacción de hibridación. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se pueden utilizar cualquiera de los dos. Ejemplos no limitantes de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en cloruro de sodio 6 x/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centígrados, seguido de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 50 grados centígrados. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centígrados, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 55 grados centígrados. Otro ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en cloruro de sodio 6 x/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centígrados, seguida de uno o más lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 60 grados centígrados. A menudo, las condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6 * cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centígrados, seguida de uno o más lavados en 0,2 * SSC, 0,1 % de SDS a 65 grados centígrados. Más a menudo, las condiciones de rigor son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 grados Celsius, seguido de uno o más lavados a 0,2 x SSC, SDS al 1 % a 65 grados Celsius. Las temperaturas de hibridación rigurosas también se pueden alterar (es decir, disminuir) con la adición de ciertos disolventes orgánicos, formamida, por ejemplo. Los disolventes orgánicos, como la formamida, reducen la estabilidad térmica de los polinucleótidos de doble cadena, de modo que la hibridación se puede realizar a temperaturas más bajas, mientras se mantienen las condiciones rigurosas y se prolonga la vida útil de los ácidos nucleicos que pueden ser lábiles al calor.
Como se usa en el presente documento, la frase “hibridación” o variaciones gramaticales de la misma, se refiere a la unión de una primera molécula de ácido nucleico a una segunda molécula de ácido nucleico en condiciones de rigurosidad baja, media o alta, o en condiciones de síntesis de ácido nucleico. La hibridación puede incluir casos en los que una primera molécula de ácido nucleico se une a una segunda molécula de ácido nucleico, donde la primera y la segunda molécula de ácido nucleico son complementarias. Como se usa en este documento, “hibrida específicamente” se refiere a la hibridación preferencial en condiciones de síntesis de ácido nucleico de un cebador, a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria al cebador en comparación con la hibridación a una molécula de ácido nucleico que no tiene una secuencia complementaria. Por ejemplo, la hibridación específica incluye la hibridación de un cebador a una secuencia de ácido nucleico diana que es complementaria al cebador.
Los cebadores pueden incluir una subsecuencia de nucleótidos que puede ser complementaria a una secuencia de hibridación de cebador de ácido nucleico en fase sólida o sustancialmente complementaria a una secuencia de hibridación de cebador de ácido nucleico en fase sólida (por ejemplo, aproximadamente 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más del 99 % idéntico al complemento de secuencia de hibridación del cebador cuando está alineado). Un cebador puede contener una subsecuencia de nucleótidos no complementaria o sustancialmente no complementaria a una secuencia de hibridación de cebadores de ácidos nucleicos en fase sólida (por ejemplo, en el extremo 3' o 5' de la subsecuencia de nucleótidos en el cebador complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia de hibridación de cebadores de fase sólida).
Un cebador puede contener una modificación tal como inosinas, sitios abásicos, ácidos nucleicos bloqueados, ligantes de surcos menores, estabilizadores dúplex (por ejemplo, acridina, espermidina), modificadores de Tm o cualquier modificador que cambie las propiedades de unión de los cebadores o sondas.
Un cebador puede contener una molécula o entidad detectable (por ejemplo, un fluoróforo, radioisótopo, agente colorimétrico, partícula, enzima y similares). Cuando se desee, el ácido nucleico puede modificarse para incluir una etiqueta detectable utilizando cualquier método conocido por los expertos en la técnica. La etiqueta puede incorporarse como parte de la síntesis o agregarse antes de utilizar el cebador en cualquiera de los procesos descritos en este documento. La incorporación de la etiqueta puede realizarse en fase líquida o en fase sólida. La etiqueta detectable puede ser útil para la detección de objetivos. El marcador detectable puede ser útil para la cuantificación de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, determinar el número de copias de una secuencia particular o especie de ácido nucleico). Cualquier etiqueta detectable adecuada para la detección de una interacción o actividad biológica en un sistema puede ser seleccionada y utilizada apropiadamente por el experto. Ejemplos de marcadores detectables son marcadores fluorescentes como fluoresceína, rodamina y otros (por ejemplo, Anantha, et al., Biochemistry (1998) 37: 27092714; y Qu & Chaires, Methods Enzymol. (2000) 321: 353369); isótopos radiactivos (por ejemplo, 125I, 131I, 35S, 31P, 32P, 33P, 14C, 3H, 7Be, 28Mg, 57Co, 65Zn, 67Cu, 68Ge, 82Sr, 83Rb, 95Tc, 96Tc, 103Pd, 109Cd, y 127Xe); etiquetas de dispersión de luz (por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 6,214,560 y comercialmente disponibles de Genicon Sciences Corporation, California); etiquetas quimioluminiscentes y sustratos de enzimas (por ejemplo, dioxetanos y ésteres de acridinio), etiquetas enzimáticas o de proteínas (por ejemplo, proteína de fluorescencia verde (GFP) o variante de color de las mismas, luciferasa, peroxidasa); otros marcadores o colorantes cromogénicos (por ejemplo, cianina) y otros cofactores o biomoléculas como la digoxigenina, estrepdavidina, biotina (por ejemplo, miembros de un par de enlaces como la biotina y avidina, por ejemplo), fracciones de captura de afinidad y similares. Un cebador puede marcarse con una fracción resto de captura por afinidad. También se incluyen en las etiquetas detectables aquellas etiquetas útiles para la modificación de masas para la detección con espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) y espectrometría de masas de electropulverización (ES)).
Un cebador también puede referirse a una secuencia polinucleotídica que hibrida con una subsecuencia de un ácido nucleico objetivo u otro cebador y facilita la detección de un cebador, un ácido nucleico objetivo o ambos, como con las balizas moleculares, por ejemplo. El término “baliza molecular”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula detectable, donde la propiedad detectable de la molécula es detectable solo bajo ciertas condiciones específicas, lo que le permite funcionar como una señal específica e informativa. Ejemplos no limitativos de propiedades detectables son, propiedades ópticas, propiedades eléctricas, propiedades magnéticas, propiedades químicas y tiempo o velocidad a través de una abertura de tamaño conocido.
Una baliza molecular puede ser un oligonucleótido de cadena sencilla capaz de formar una estructura tallo-bucle, donde la secuencia de bucle puede ser complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de interés y está flanqueada por brazos complementarios cortos que pueden formar un tallo. El oligonucleótido puede estar marcado en un extremo con un fluoróforo y en el otro extremo con una molécula extintora. En la conformación vástago-bucle, la energía del fluoróforo excitado se transfiere al interruptor, a través de un acoplamiento dipolo-dipolo de largo alcance similar al observado en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, o FRET, y se libera como calor en lugar de luz. Cuando la secuencia de bucle se hibrida con una secuencia objetivo específica, los dos extremos de la molécula se separan y la energía del fluoróforo excitado se emite como luz, generando una señal detectable. Las balizas moleculares ofrecen la ventaja adicional de que la eliminación del exceso de sonda es innecesaria debido a la naturaleza de apagado automático de la sonda sin hibridar. Las sondas de balizas moleculares pueden diseñarse para discriminar o tolerar desajustes entre las secuencias de bucle y objetivo modulando las fuerzas relativas de la hibridación de bucle-objetivo y la formación del tallo. Como se menciona aquí, el término “nucleótido no coincidente” o “no coincidencia” se refiere a un nucleótido que no es complementario a la secuencia objetivo en esa posición o posiciones. Una sonda puede tener al menos una falta de coincidencia, pero también puede tener 2, 3, 4, 5, 6 o 7 o más nucleótidos no coincidentes.
Características biológicas de los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa
Un anticuerpo puede tener una o más características idénticas o similares a un anticuerpo descrito en el presente documento, y con frecuencia posee una o más de las características biológicas que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno, la toxina alfa. Como se usa aquí, las “características biológicas” de un anticuerpo se refieren a una o más de las características bioquímicas, de unión y funcionales, que se pueden utilizar para seleccionar anticuerpos para usos terapéuticos, de investigación y de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos anti­ toxina alfa pueden ser iguales o diferentes con respecto a la unión del epítopo, el direccionamiento, la afinidad, la neutralización y la inhibición de la oligomerización o la formación del complejo de poros de heptámero, por ejemplo.
Las características bioquímicas de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluyen, entre otros, el punto isoeléctrico (pl) y la temperatura de fusión (Tm). Las características de unión de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluyen, pero no se limitan a, especificidad de unión; constante de disociación (Kd), o su inversa, constante de asociación (Ka), o su componente kon o k f epítopo al que se une; capacidad para distinguir entre varias formas y/o preparaciones de toxina alfa (por ejemplo, recombinante, nativa, acetilada) y capacidad para unirse a antígenos solubles y/o inmovilizados. Las características funcionales de un anticuerpo presentado aquí incluyen, pero no se limitan a, inhibición de la unión al receptor de toxina alfa, inhibición de la oligomerización de toxina alfa, inhibición de la expresión génica inducida por reacciones en cascada que responden a la expresión o actividad de toxina alfa, agotamiento de células que expresan toxina alfa, inhibición del crecimiento de células que expresan toxina alfa, inhibición de la localización de toxina alfa y protección en uno o más S. aureus, toxina alfa o S. aureus y enfermedades o trastornos relacionados con la toxina alfa. Aquí se describen las características de los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa y los métodos para modificar y ajustar esas características. Los métodos para medir las características de los anticuerpos son conocidos en la técnica, algunos de los cuales se detallan a continuación.
Características de unión
Como se describió anteriormente, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une de forma inmunoespecífica a al menos un epítopo específico o determinantes antigénicos de la proteína, péptido, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de los mismos, exclusiva o preferentemente con respecto a otros polipéptidos. El término “epítopo” o “determinante antigénico” como se usa en el presente documento se refiere a un determinante de proteína capaz de unirse a un anticuerpo, donde el término “unión” a menudo se relaciona con una unión específica. Estos determinantes de proteínas o epítopos a menudo incluyen grupos de moléculas químicamente activas en la superficie tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, a menudo con características estructurales tridimensionales específicas y con características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión a los primeros, pero no los últimos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El término “epítopo discontinuo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un epítopo conformacional en un antígeno proteico formado a partir de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une inmunoespecíficamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y fragmentos antigénicos asociados con la oligomerización de la toxina alfa, de la misma. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une inmunoespecíficamente a la toxina alfa, o al menos cualquiera de los tres aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 39 o 40. Se divulga en el presente documento el epítopo es al menos 4 residuos de aminoácidos, al menos 5 residuos de aminoácidos, al menos 6 residuos de aminoácidos, al menos 7 residuos de aminoácidos, al menos 8 residuos de aminoácidos o al menos 9 residuos de aminoácidos en el porción especificada completa de aminoácidos contiguos de la proteína toxina alfa. Se divulgan en el presente documento residuos de contacto que comprenden T261, T263, N264, K266 y K271. Se divulga en el presente documento residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de la SEQ ID NO: 39. Se divulga en el presente documento los residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 y K271 de SEQ ID NO. 39. Se divulga en el presente documento la porción de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39. La porción de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende los aminoácidos 248-277 de la SEQ ID NO: 39, o aminoácidos 173-201 y 261-272 de la SEQ ID NO: 39.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa asociado con su oligomerización de toxina alfa, se une inmunoespecíficamente a un polipéptido toxina alfa o fragmento antigénico del mismo, que tiene al menos el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de identidad, o 100 % de identidad, a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 o 40. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede a veces unirse de forma inmunoespecífica a un polipéptido toxina alfa o fragmento antigénico del mismo, con al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad, o 100 % de identidad, a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 o 40.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-alfa puede unirse a un epítopo conservado a través de las especies. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une a los homólogos u ortólogos de toxina alfa y toxina alfa de S. aureus de otras especies bacterianas y sus fragmentos antigénicos. El anticuerpo o fragmento anti­ toxina alfa puede unirse a uno o más ortólogos de toxina alfa y/o isoformas. En una realización específica, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une a la toxina alfa y fragmentos antigénicos asociados con la oligomerización de la toxina alfa de una o más especies de bacterias que poseen homólogos u ortólogos de toxina alfa. Los anticuerpos o fragmentos anti-toxina alfa pueden unirse a un epítopo dentro de Staphylococcus u otras bacterias estrechamente relacionadas a través de homólogos de toxina alfa y/o isoformas y/o variantes y/o subtipos conformacionales.
Las interacciones entre antígenos y anticuerpos a menudo son las mismas que para otras interacciones proteínaproteína no covalentes. En general, existen cuatro tipos de interacciones de unión entre antígenos y anticuerpos: (i) enlaces de hidrógeno, (ii) fuerzas de dispersión, (iii) fuerzas electrostáticas entre los ácidos de Lewis y las bases de Lewis, y (iv) interacciones hidrófobas. Las interacciones hidrófobas son una fuerza impulsora significativa para las interacciones anticuerpo-antígeno, y se basan en la repulsión del agua por grupos no polares en lugar de la atracción de moléculas. Sin embargo, ciertas fuerzas físicas también contribuyen a la unión de antígeno-anticuerpo, por ejemplo, el ajuste o complementario de formas de epítopo con diferentes sitios de unión de anticuerpo. Otros materiales y antígenos pueden reaccionar de forma cruzada con un anticuerpo, compitiendo así con el anticuerpo libre disponible.
La medición de una constante de afinidad y la especificidad de unión entre el antígeno y el anticuerpo a menudo es un elemento para determinar la eficacia de los métodos terapéuticos, de diagnóstico y de investigación que utilizan anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa. La “afinidad de unión” generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y generalmente puede representarse por la constante de disociación de equilibrio (Kd), que se calcula como la relación kon/kon. La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluidos los descritos y ejemplificados en este documento (por ejemplo, los métodos BiaCore). Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Varios métodos para medir la afinidad de unión es conocida en la técnica, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente tecnología.
Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa a veces tiene una afinidad de unión por un epítopo de toxina alfa caracterizado por una constante de disociación (Kd) de 1 * 10'2M o menos, 1 * 10'3 M o menos, 1 * 10'4 M o menos, 1 * 10'5 M o menos, 1 * 10'6 M o menos, 1 * 10'7 M o menos, 1 * 10'8 M o menos, 1 * 10'9 M o menos, 1 * 10'1° M o menos, 1 * 10-11 M o menos, 1 * 10'12 M o menos, 1 * 10'13 M o menos, 1 * 10'14 M o menos o 1 * 10'15 M o menos. Por ejemplo, la Kd puede ser de 1 * 1°'15M a 1 * 10'2 M, de 1 * 10'14 M a 1 * 10'1° M, de 1 * 10'9 M a 1 * 10'5 M y de 1 * 10-4 M a 1 * 10-2 M.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo anti-toxina alfa y fragmentos es un anticuerpo de alta afinidad. Por “anticuerpo de alta afinidad” se entiende un anticuerpo que se une a un epítopo de toxina alfa con una afinidad inferior a 10'8 M (por ejemplo, 10'9 M, 10'1° M, y similares).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa tiene una afinidad de unión de una molaridad específica o mejor. “O mejor” cuando se usa aquí se refiere a una unión más fuerte, representada por un valor numérico Kd más pequeño. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad por un antígeno de “0,6 nM o mejor”, la afinidad del anticuerpo por el antígeno es < 0,6 nM, es decir, 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM y similares, o cualquier valor menor que 0,6 nM.
La afinidad de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se describe en términos de la constante de asociación (Ka), que se calcula como la relación kon/koff. En este caso, los presentes anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa tienen afinidades de unión para un epítopo de toxina alfa que incluyen una constante de asociación (Ka) de 1 * 102M'1 o más, 1 * 103 M'1 o más, 1 * 10 M'1 o más, 1 * 105 M'1 o más, 1 * 105 M'1 o más, 1 * 107 M'1 o más, 1 * 108 M'1 o más, 1 * 109 M'1 o más, 1 * 1010 M'1 o más 1 * 1011 M'1 o más 1 * 1012 M'1 o más, 1 * 1013 M'1 o más, 1 * 1014 M'1 o más o 1 * 1015 M'1 o más. Por ejemplo, el Ka puede ser de 1 * 102 M'1 a 1 * 107 M'1, de 1 * 107 M'1 a 1 * 1010 M'1, y de 1 * 1010 M'1 a 1 * 1015 M '1.
En ciertas realizaciones, la velocidad a la que un anticuerpo o fragmento anti-alfa toxina se disocia de un epítopo de toxina alfa puede ser relevante. En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-alfa toxina puede unirse a toxina alfa con un k f de menos de 10'3s'1, menos de 5x10'3 s-1, menos de 10'4s'1, menos de 5x10'4s'1, o menos de 10'5s'1. La velocidad a la que los anticuerpos y fragmentos anti-alfa toxina se asocian con un epítopo de toxina alfa puede ser más relevante que el valor de la Kd o la Ka. En este caso, los presentes anticuerpos y fragmentos anti-alfa toxina se unen a la toxina alfa con una tasa de kon de al menos 10'4 M 'V , al menos 5 x 10'4 M 'V , al menos 105M 'V 1, al menos 5 x105M 'V 1, al menos 106 M'1s'1, al menos 5 x 106 M'1s'1, al menos 107 M'1s'1.
La determinación de la afinidad de unión se puede medir utilizando las técnicas específicas que se describen con más detalle en la sección Ejemplo, ver Ejemplo 1, y los métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo de tal método incluye medir la constante de disociación “Kd” mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe en el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión a la solución de los Fab. para el antígeno mediante el equilibrio de Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y luego se captura el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab. Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtitulación (Dynex) se revisten durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (H 9,6), y posteriormente se bloquean con 2 % (p/v) albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 grados centígrados). En una placa no adsorbente (Nunc # 269620), el antígeno [125I] de 100 pM o 26 pM se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés. El Fab de interés se incuba luego durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un período más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Después de eso, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubar a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la solución y la placa se lava ocho veces con 0,1 % de Tween-20 en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150|jl/pozo de centelleante (MicroScint-20; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual al 20 % de la unión máxima se eligen para uso en ensayos de unión competitiva.
En otro caso, el valor de Kd puede medirse utilizando ensayos de resonancia de plasmón de superficie, que se pueden realizar, por ejemplo, utilizando un BIAcore ™ -2000 o un BIAcore ™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 grados Celsius con chips CM5 de antígeno inmovilizado en ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, en un ejemplo de tal método, los chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N '- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según a las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 1 l0 mM, pH 4,8, en 5 jg/microlitro (~0,2 uM) antes de la inyección en un índice de fluidez de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina IM para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBST) a 25 grados Celsius en un índice de fluidez de aproximadamente 25 jl/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) ajustando simultáneamente el sensor de asociación y disociación.
Si la velocidad de activación excede de 106 M - 1 s - 1 mediante el de resonancia de plasmón de superficie anterior, entonces la velocidad de activación puede determinarse utilizando una técnica de apagado fluorescente, por ejemplo, que mide el aumento o la disminución de la emisión de fluorescencia. Intensidad (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 grados Celsius de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según lo medido en un espectrómetro, como un espectrofotómetro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja agitada. También se puede determinar una “tasa de asociación” o “tasa on” o “ índice de asociación” o “kon” según esta tecnología con la misma técnica de resonancia de plasmón de superficie descrita anteriormente utilizando un BIAcore ™ -2000 o un BIAcore ™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) como se describió anteriormente.
Los métodos y reactivos adecuados para la determinación de las características de unión de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo presentado, o un derivado alterado/mutante del mismo (descrito más adelante), son conocidos en la técnica y/o están disponibles comercialmente. El equipo y el software diseñados para dichos análisis cinéticos están disponibles comercialmente (por ejemplo, los instrumentos Biacore® A100 y Biacore® 2000; Biacore International AB, Uppsala, Suecia).
Se divulga en el presente documento un ensayo de unión que se puede realizar como ensayos de unión directa o como ensayos de unión competitiva. La unión puede detectarse mediante ELISA estándar o ensayos estándar de citometría de flujo. En un ensayo de unión directa, un anticuerpo candidato se analiza para determinar su unión al antígeno toxina alfa. El ensayo de unión competitiva, por otro lado, evalúa la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un anticuerpo o fragmento anti-alfa conocido u otro compuesto que se une a la toxina alfa (por ejemplo, receptor, inhibidor). En general, cualquier método que permita la unión de un anticuerpo con toxina alfa que puede detectarse está incluido en el alcance de la presente tecnología para detectar y medir las características de unión de los anticuerpos. Estos métodos también pueden utilizarse para seleccionar un panel de anticuerpos para aquellos que brindan una característica deseada.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a la toxina alfa y tiene una o más de las características seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (Kd) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monómeros de toxinas alfa, pero no inhibe la unión de toxina alfa al receptor de toxina alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxinas alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %;
(d) reduce la actividad citolítica de la toxina alfa en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % (por ejemplo, según lo determinado por los ensayos de hemólisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltración celular y la liberación de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumonía animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociación (Kd) en el rango de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 50 nM, 0,05 nM, 0,1 nM 0,5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Características funcionales
En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa altera las propiedades biológicas de las células que expresan toxina alfa y/o toxina alfa. En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-alfa neutraliza la actividad biológica de la toxina alfa al unirse al polipéptido e inhibir el ensamblaje de monómeros de toxina alfa en un poro transmembrana (por ejemplo, heptámero de toxina alfa). Los ensayos de neutralización se pueden realizar utilizando métodos conocidos en la técnica usando, en algunas circunstancias, reactivos disponibles comercialmente. La neutralización de la toxina alfa a menudo se mide con un IC50 de 1 * 10-6 M o menos, 1 * 10-7 M o menos, 1 * 10' 8 M o menos, 1 * 10-9 M o menos, 1 * 10-10 M o menos y 1 * 10-11 M o menos. En ciertas realizaciones, la neutralización se produce cuando el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a la toxina alfa de S. aureus se encuentra en una concentración como se describe en los Ejemplos 3-6. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-alfa neutraliza la capacidad de la toxina alfa para oligomerizar y formar un poro transmembrana. El término “concentración inhibitoria al 50 %” (abreviado como “ IC50”) representa la concentración de un inhibidor (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa proporcionado en este documento) que se requiere para la inhibición del 50 % de una actividad dada de la molécula al que se dirige el inhibidor (por ejemplo, la oligomerización de la toxina alfa para formar un complejo de heptámero de poros transmembrana). Un valor de CI50 más bajo generalmente corresponde a un inhibidor más potente.
El anticuerpo o fragmento anti-alfa inhibe una o más actividades biológicas de la toxina alfa. El término “ inhibición”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier disminución estadísticamente significativa de la actividad biológica, incluido el bloqueo total de la actividad. Por ejemplo, “ inhibición” puede referirse a una disminución de alrededor del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % en la actividad biológica. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa inhibe una o más actividades biológicas de la toxina alfa en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 %.
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede agotar la toxina alfa secretada por S. aureus patógeno. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede lograr al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o aproximadamente el 100 % de agotamiento de la toxina alfa secretada por S. aureus. En casos particulares, prácticamente todas las toxinas alfa secretadas detectables se agotan de las células infectadas con S. aureus.
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede inhibir la actividad de toxina alfa estimulada in vitro (por ejemplo, la unión al receptor, la oligomerización) y/o la proliferación de células que expresan o secretan toxina alfa. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa a veces inhibe la actividad de toxina alfa in vitro, patogenicidad de S. aureus en al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 % o al menos alrededor del 75 %. Los métodos para medir la proliferación celular, la patogenicidad y la actividad de la hemolisina alfa son conocidos en la técnica.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-alfa puede inhibir la expresión de uno o más genes inducibles que responden directa o indirectamente al ambiente creado por la infección por S. aureus y/o la expresión y función de la toxina alfa. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa inhibe la expresión de uno o más genes inducibles que responden directa o indirectamente al ambiente creado por la infección por S. aureus y/o la expresión y función de la toxina alfa en al menos un 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 100 %, al menos 120 %, al menos 140 %, al menos 160 %, al menos 180 % o al menos 200 %.
Producción de anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa
A continuación, se describen técnicas a modo de ejemplo para la producción de anticuerpos. Un antígeno de toxina alfa usado para la producción de anticuerpos puede ser un fragmento peptídico que, por ejemplo, incluye una región de la secuencia peptídica de toxina alfa involucrada en la oligomerización. Los anticuerpos contra la toxina alfa pueden generarse utilizando la toxina alfa de S. aureus nativa que comprende la SEQ ID NO: 39, o la toxina alfa mutante que comprende la SEQ ID NO: 40, una variante o un fragmento antigénico de la misma. Las células de S. aureus que expresan y secretan toxina alfa también pueden usarse para generar anticuerpos. Los ejemplos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de toxina alfa están disponibles como se proporciona en la Tabla 10, por ejemplo. La toxina alfa se puede producir de forma recombinante en una forma aislada a partir de células bacterianas o eucariotas utilizando la metodología estándar de ADN recombinante. La toxina alfa se puede expresar como una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de epítopo) u otra proteína de fusión (por ejemplo, una fusión con GST) para facilitar el aislamiento, así como la identificación en varios ensayos. Los anticuerpos o proteínas de unión que se unen a varias etiquetas y secuencias de fusión están disponibles como se detalla a continuación. También se pueden utilizar otras formas de toxina alfa útiles para generar anticuerpos.
Se conocen en la técnica diversos polipéptidos marcados y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); gripe polipéptido etiqueta hA y su anticuerpo 12CA5; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10; y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo. El péptido FLAG es reconocido por un anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. La purificación de una proteína que contiene el péptido FLAG se puede realizar mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando una matriz de afinidad que comprende el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 unido covalentemente a la agarosa. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido epítopo KT3; un péptido de epítopo de a-tubulina; y la etiqueta péptido de la proteína 10 del gen T7.
Los anticuerpos policlonales para un antígeno de interés pueden producirse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de toxina alfa o un fragmento inmunogénico del mismo puede administrarse a varios animales hospedadores, incluidos, entre otros, conejos, ratones, ratas y similares, para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. Se pueden utilizar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen, entre otros, los geles minerales de Freund (completos e incompletos) como el hidróxido de aluminio, las sustancias tensioactivas como la lisolecitina, los polioles plurónicos y los polianiones., péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes también son conocidos en la técnica.
Los anticuerpos policlonales pueden producirse en animales mediante inyecciones subcutáneas múltiples (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se usan péptidos sintéticos) con una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse con hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o de derivatización (grupo reactivo), por ejemplo, éster activado (conjugación a través de residuos de cisteína o lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2 o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los conjugados también se pueden hacer en cultivos de células recombinantes como proteínas de fusión.
Normalmente, los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados combinando una concentración apropiada de antígeno o conjugado con adyuvante e inyectando la solución en múltiples sitios. Las inmunizaciones también se pueden realizar como se describe en el Ejemplo 1 (inmunización/generación de hibridomas).
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinante y de fago, o una combinación de ellas. El término “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos o aislados, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico o múltiples sitios antigénicos en el caso de anticuerpos de ingeniería multiespecífica. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra el mismo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador “monoclonal” no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. A continuación, se describen los métodos representativos para producir anticuerpos monoclonales que no pretenden ser limitativos y se pueden utilizar para producir, por ejemplo, mamíferos monoclonales, quiméricos, humanizados, dominios humanos, diacuerpos, anticuerpos, anticuerpos lineales y multiespecíficos.
Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son rutinarios y conocidos en la técnica. En el método de hibridoma, los ratones u otros animales hospedadores apropiados, como el hámster, se inmunizan como se describió anteriormente para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno usado para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y luego se fusionan con una estirpe celular de mieloma utilizando un agente de fusión o un compañero de fusión adecuado, como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. En las células de mieloma seleccionadas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, apoyan una producción estable de anticuerpos de alto nivel por parte de las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las células parentales no fusionadas. En un aspecto, las estirpes celulares de mieloma son estirpes de mieloma murino, como las derivadas de tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Centro de Distribución Celular del Instituto Salk, San Diego, California, EE. UU., SP-2 y derivados, por ejemplo, las células X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Md., EE. UU. También se han descrito estirpes celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos.
Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y cultivarlos mediante métodos estándar. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal, por ejemplo, por inyección i.p. de las células en ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, Usando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio iónico, etiquetas de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y similares. Los métodos de purificación a modo de ejemplo se describen con más detalle a continuación.
Técnicas de ADN recombinante
Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos usando tecnología de ADN recombinante son rutinarios y conocidos en la técnica. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se puede aislar y/o secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped como las células de E. coli, las células COS de simio, las células de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que no producen proteína de anticuerpo, para Obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Como se describe a continuación para los anticuerpos generados por la presentación de fagos y la humanización de anticuerpos, se puede obtener ADN o material genético para anticuerpos recombinantes de una fuente (s) diferente a los hibridomas para generar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa.
La expresión recombinante de un anticuerpo o variante del mismo a menudo requiere la construcción de un vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifica el anticuerpo. En el presente documento se proporcionan vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una porción del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera, unida operativamente a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresión de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa o las cadenas pesada y ligera completas.
Una vez que un vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales, las células transfectadas se cultivan mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo. Por lo tanto, se proporcionan aquí las células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo presentado o fragmentos del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o una porción del mismo, o un anticuerpo de cadena simple en el presente documento, operativamente unido a un heterólogo promotor. En ciertas realizaciones para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican las cadenas pesada y ligera pueden expresarse conjuntamente en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación.
Las estirpes celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión de anticuerpos recombinantes son conocidas en la técnica e incluyen muchas estirpes celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluidas, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, bebé células de riñón de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón epitelial humano 293 y varias otras estirpes celulares. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación post-traduccionales de proteínas y productos genéticos. Se pueden elegir estirpes celulares apropiadas o sistemas huésped para asegurar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo o la porción del mismo expresada. Para este fin, se pueden utilizar células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripción primaria, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamíferos incluyen, entre otras, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una estirpe celular de mieloma murino que no produce endógenamente cualquier cadena de inmunoglobulina funcional), células SP20, CRL7O3O y HsS78Bst. Estirpes celulares humanas desarrolladas inmortalizando linfocitos humanos pueden usarse para producir recombinantemente anticuerpos monoclonales. La estirpe celular humana PER.C6. (Crucell, Países Bajos) se puede utilizar para producir recombinantemente anticuerpos monoclonales.
Las estirpes celulares adicionales que se pueden utilizar como huéspedes para la expresión de anticuerpos recombinantes incluyen, pero no se limitan a, células de insecto (por ejemplo, Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, Pichia)., US7326681; etc), células de plantas (US20080066200); y células de pollo.
Los anticuerpos presentados en el presente documento se expresan en una estirpe celular con expresión estable del anticuerpo. La expresión estable se puede utilizar para la producción a largo plazo de proteínas recombinantes de alto rendimiento. Por ejemplo, pueden generarse estirpes celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. Las células hospedadoras pueden transformarse con un vector diseñado apropiadamente que comprende elementos de control de la expresión (por ejemplo, promotor, potenciador, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación y similares), y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células que integran de forma estable el plásmido en sus cromosomas crezcan y formen focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en estirpes celulares. Los métodos para producir estirpes celulares estables con un alto rendimiento son conocidos en la técnica y los reactivos están generalmente disponibles comercialmente.
Los anticuerpos presentados en este documento se expresan en una estirpe celular con expresión transitoria del anticuerpo. La transfección transitoria es un proceso en el que el ácido nucleico introducido en una célula no se integra en el genoma o el ADN cromosómico de esa célula. Un ácido nucleico a menudo se mantiene como un elemento extracromosómico, por ejemplo, como un episoma, en la célula. Los procesos de transcripción del ácido nucleico del episoma no se ven afectados y se produce una proteína codificada por el ácido nucleico del episoma.
La estirpe celular, que puede ser estable o transfectada de forma transitoria, se mantiene en medio de cultivo celular y las condiciones conocidas en la técnica dan como resultado la expresión y producción de anticuerpos monoclonales. Los medios de cultivo de células de mamíferos se basan en formulaciones de medios disponibles comercialmente, que incluyen, por ejemplo, DMEM o F12 de Ham. Los medios de cultivo celular se modifican para soportar aumentos tanto en el crecimiento celular como en la expresión de proteínas biológicas. Como se usa en este documento, los términos “medio de cultivo celular”, “medio de cultivo” y “formulación del medio” se refieren a una solución nutritiva para el mantenimiento, crecimiento, propagación o expansión de células en un entorno artificial in vitro fuera de un organismo multicelular o tejido. El medio de cultivo celular puede optimizarse para un uso específico de cultivo celular, incluyendo, por ejemplo, medio de crecimiento de cultivo celular que se formula para promover el crecimiento celular, o medio de producción de cultivo celular que se formula para promover la producción de proteínas recombinantes. Los términos nutriente, ingrediente y componente se usan indistintamente en el presente documento para referirse a los constituyentes que constituyen un medio de cultivo celular.
Las estirpes celulares se mantienen utilizando un método de alimentación por lotes. Tal como se usa en el presente documento, “método de alimentación por lotes”, se refiere a un método por el cual un cultivo celular de alimentación por lotes recibe nutrientes adicionales luego de ser incubado con un medio basal. Por ejemplo, un método de alimentación por lotes puede comprender agregar medios suplementarios de acuerdo con un programa de alimentación determinado dentro de un período de tiempo determinado. Por lo tanto, un “cultivo celular discontinuo alimentado” se refiere a un cultivo celular donde las células, normalmente mamíferos, y el medio de cultivo se suministran al recipiente de cultivo inicialmente y los nutrientes de cultivo adicionales se alimentan, continuamente o en incrementos discretos, al cultivo durante el cultivo. con o sin cosecha periódica de células y/o productos antes de la terminación del cultivo.
El medio de cultivo celular utilizado y los nutrientes contenidos en él son conocidos en la técnica. El medio de cultivo celular comprende un medio basal y al menos un hidrolizado, por ejemplo, hidrolizado a base de soja, hidrolizado a base de levadura o una combinación de los dos tipos de hidrolizados que dan como resultado un medio basal modificado. Los nutrientes adicionales a veces pueden incluir solo un medio basal, como un medio basal concentrado, o pueden incluir solo hidrolizados o hidrolizados concentrados. Los medios basales adecuados incluyen, pero no se limitan a, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), DME/F12, medio esencial mínimo (MEM), medio de águila basal (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio esencial a-mínimo (a-MEM), Medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM), PF CHO (véase, por ejemplo, medio libre de proteínas CHO (Sigma) o medio libre de suero EX-CELL ™ 325 PF CHO para células CHO sin proteínas (SAFC Bioscience), y el Medio de Dulbecco Modificado de Iscove. Otros ejemplos de medios basales que se pueden utilizar en la tecnología de este documento incluyen medio basal BME; Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, polvo) (Gibco-Invitrogen (# 31600). El medio basal puede estar libre de suero, lo que significa que el medio no contiene suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), suero de caballo, suero de cabra o cualquier otro suero derivado de animales conocido en la técnica) o Medios libres de proteínas animales o medios químicamente definidos.
El medio basal puede modificarse para eliminar ciertos componentes no nutricionales que se encuentran en el medio basal estándar, como varios tampones inorgánicos y orgánicos, surfactante (s) y cloruro de sodio. La eliminación de dichos componentes del medio de células basales permite una mayor concentración de los componentes nutricionales restantes y puede mejorar el crecimiento celular general y la expresión de proteínas. Además, los componentes omitidos se pueden volver a agregar al medio de cultivo celular que contiene el medio de células basales modificado de acuerdo con los requisitos de las condiciones del cultivo celular. El medio de cultivo celular contiene un medio celular basal modificado, y al menos uno de los siguientes nutrientes, una fuente de hierro, un factor de crecimiento recombinante; un tampón; un surfactante un regulador de osmolaridad; una fuente de energía; y los hidrolizados no animales. Además, el medio de células basales modificado puede contener opcionalmente aminoácidos, vitaminas o una combinación de ambos aminoácidos y vitaminas. El medio basal modificado contiene además glutamina, por ejemplo, L-glutamina y/o metotrexato.
La producción de anticuerpos se lleva a cabo en gran cantidad mediante un proceso de biorreactor utilizando métodos de biorreactor de alimentación discontinua, discontinua, de perfusión o de alimentación continua conocidos en la técnica. Los biorreactores a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, a veces entre 1.000 y 100.000 litros de capacidad. Estos biorreactores pueden utilizar impulsores agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes. Los biorreactores de pequeña escala se refieren generalmente al cultivo celular en una capacidad volumétrica de no más de aproximadamente 100 litros, y pueden variar desde aproximadamente 1 litro hasta aproximadamente 100 litros. Alternativamente, los biorreactores de un solo uso (SUB) se pueden utilizar para el cultivo a gran escala o a pequeña escala.
La temperatura, el pH, la agitación, la aireación y la densidad del inóculo pueden variar según las células huésped utilizadas y la proteína recombinante a expresar. Por ejemplo, un cultivo celular de proteína recombinante se puede mantener a una temperatura entre 30 y 45 grados Celsius. El pH del medio de cultivo se puede monitorear durante el proceso de cultivo de manera que el pH se mantenga en un nivel óptimo, que puede ser para ciertas células huésped, dentro de un rango de pH de 6,0 a 8,0. Se puede utilizar una mezcla impulsada por impulsor para tales métodos de cultivo para agitación. La velocidad de rotación del impulsor puede ser de aproximadamente 50 a 200 cm/seg., Pero se pueden utilizar otros sistemas de elevación aérea u otros sistemas de mezcla/aireación conocidos en la técnica, dependiendo del tipo de célula huésped que se esté cultivando. Se proporciona una aireación suficiente para mantener una concentración de oxígeno disuelto de aproximadamente 20 % a 80 % de saturación de aire en el cultivo, nuevamente, dependiendo de la célula hospedadora seleccionada que se esté cultivando. Alternativamente, un biorreactor puede expulsar aire u oxígeno directamente al medio de cultivo. Existen otros métodos de suministro de oxígeno, incluidos los sistemas de aireación sin burbujas que emplean aireadores de membrana de fibra hueca.
Técnicas de exhibición de fagos
Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando técnicas como se conocen en la técnica. En tales métodos, se puede aislar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa mediante la selección de una biblioteca de anticuerpos combinatorios recombinantes, a veces una biblioteca de presentación de fagos scFv, preparada utilizando ADNc de VL y VH humanos preparados a partir de ARNm derivado de linfocitos humanos. Las metodologías para preparar y seleccionar tales bibliotecas son conocidas en la técnica.
Purificación y Aislamiento de Anticuerpos
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo por expresión recombinante o hibridoma, se puede purificar por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígenos Proteína A o Proteína G y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente tecnología o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas (denominadas en este documento “etiquetas”) descritas anteriormente o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
Anticuerpos humanizados
Los anticuerpos de la presente tecnología son anticuerpos humanizados, que se generan usando métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados pueden ser anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica o homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que otra parte de la cadena (s) es idéntico o homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Old World Monkey, como babuino, rhesus o mono cynomolgus) y secuencias de región constante humana.
Anticuerpos Humanos
Como una alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos utilizando métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de tales proteínas derivadas de ratas o murinas puede conducir a la rápida eliminación de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por parte de un paciente. Para evitar la utilización de anticuerpos murinos o derivados de ratas, se pueden generar anticuerpos completamente humanos a través de la introducción de loci de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamífero o animal, de modo que el roedor, otro mamífero o animal produzca anticuerpos completamente humanos.
Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de estirpe germinal produce una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de estirpe germinal humana en dichos ratones mutantes de estirpe germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición con antígeno. En la práctica, el uso de cepas XenoMouse® de ratones que han sido diseñados para contener hasta un tamaño inferior a 1000 kb conformó los fragmentos del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa. Las cepas XenoMouse® están disponibles en Amgen, Inc. (Fremont, California).
La producción de las cepas XenoMouse® de ratones y anticuerpos producidos en esos ratones es conocida en la técnica. Esencialmente, las estirpes de ratones XenoMouse® se inmunizan con un antígeno de interés (por ejemplo, Alfa toxina), las células linfáticas (como las células B) se recuperan de los ratones hiperinmunizados, y los linfocitos recuperados se fusionan con un tipo mieloide estirpe celular para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales usando las técnicas descritas anteriormente y conocidas en la técnica. Estas estirpes celulares de hibridoma se seleccionan y seleccionan para identificar estirpes celulares de hibridoma que produjeron anticuerpos específicos para el antígeno de interés.
En un enfoque alternativo, el enfoque de minilocus, un locus de Ig exógeno se imita mediante la inclusión de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y usualmente una segunda región constante (por ejemplo, una región constante gamma) se forman en una construcción para la inserción en un animal.
La generación de anticuerpos humanos de ratones en los que, a través de la fusión de microcélulas, se han introducido grandes piezas de cromosomas o cromosomas completos, se conoce en la técnica. Además, se han generado los ratones KM ™ , que son el resultado del cruce de los ratones Tc de Kirin con los ratones minilocus (Humab) de Medarex. Estos ratones poseen el transcromosoma de IgH humano de los ratones Kirin y el transgén de la cadena kappa de los ratones Genpharm.
Los anticuerpos humanos también pueden derivarse por métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen, entre otros, la presentación de fagos (MedImmune (anteriormente CAT), Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), exhibición de ribosomas (MedImmune (anteriormente CAT)), presentación de levadura, y similares. La tecnología de visualización de fagos se puede utilizar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco en un gen de la proteína de la cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como M13 o fd, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización de fagos puede realizarse en varios formatos. Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de gen V para la visualización de fagos. Se ha aislado una amplia gama de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra una variedad diversa de antígenos (incluidos los antígenos propios) esencialmente siguiendo las técnicas conocidas en la técnica. Como se discutió anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro.
Los genes de inmunoglobulina experimentan varias modificaciones durante la maduración de la respuesta inmunitaria, incluida la recombinación entre los segmentos de los genes V, D y J, el cambio de isotipo y la hipermutación en las regiones variables. La recombinación y la hipermutación somática son la base para la generación de diversidad de anticuerpos y la maduración de afinidad, pero también pueden generar predisposiciones de secuencia que pueden dificultar la producción comercial de inmunoglobulinas como agentes terapéuticos o aumentar el riesgo de inmunogenicidad del anticuerpo. En general, es probable que las mutaciones en las regiones CDR contribuyan a mejorar la afinidad y la función, mientras que las mutaciones en las regiones marco pueden aumentar el riesgo de inmunogenicidad. Este riesgo se puede reducir al revertir las mutaciones del marco a la estirpe germinal al tiempo que se garantiza que la actividad del anticuerpo no se vea afectada negativamente. Los procesos de diversificación también pueden generar algunas predisposiciones estructurales o estas predisposiciones estructurales pueden existir dentro de secuencias de la estirpe germinal que contribuyen a los dominios variables de la cadena pesada y ligera. Independientemente de la fuente, puede ser conveniente eliminar las posibles predisposiciones estructurales que pueden resultar en inestabilidad, agregación, heterogeneidad del producto o aumento de la inmunogenicidad. Los ejemplos de responsabilidades indeseables incluyen cisteínas no pareadas (que pueden dar lugar a aleatorización de enlaces disulfuro, o formación variable de aductos de sulfhidrilo), sitios de glicosilación unidos a N (que dan como resultado heterogeneidad de estructura y actividad), así como desamidación (por ejemplo, NG, NS) Sitios de isomerización (DG), oxidación (metionina expuesta) e hidrólisis (DP).
De acuerdo con lo anterior, para reducir el riesgo de inmunogenicidad y mejorar las propiedades farmacéuticas de los anticuerpos descritos en el Ejemplo 11, Tablas 1-8, puede ser deseable revertir una secuencia marco a la estirpe germinal, revertir una CDR a la estirpe germinal y/o eliminar una predisposición estructural. Por lo tanto, cuando un anticuerpo particular difiere de su secuencia de estirpe germinal respectiva en el nivel de aminoácidos, la secuencia de anticuerpo puede mutarse de nuevo a la secuencia de estirpe germinal. Dichas mutaciones correctivas pueden ocurrir en una, dos, tres o más posiciones, o una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, utilizando técnicas estándar de biología molecular.
Otros enfoques incluyen la tecnología Velocimmune® (Regeneron Pharmaceuticals). La tecnología Velocimmune® se puede utilizar para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para objetivos de interés terapéutico e implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humana operativamente unidas a loci de región constante del ratón endógeno, de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y está unido operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del ser humano. El ADN se expresa luego en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 6,596,541.
Fragmentos de anticuerpos
Los presentes anticuerpos son fragmentos de anticuerpos o anticuerpos que comprenden estos fragmentos. El fragmento de anticuerpo comprende una porción del anticuerpo de longitud completa, que generalmente es la unión a antígeno o región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fd y Fv. Diacuerpos; anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena simple; y los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos formados a partir de estos fragmentos de anticuerpos.
Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos utilizando técnicas conocidas en la técnica. Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células hospedadoras recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, lo que permite la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH también pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2. Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de células hospedadoras recombinantes. Se conocen otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. El anticuerpo de elección es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). El anticuerpo no es un fragmento Fab, Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por lo tanto, son adecuados para una unión no específica reducida durante el uso in vivo. Las proteínas de fusión scFv pueden construirse para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxi de un scFv.
Los actuales anticuerpos son anticuerpos de dominio, por ejemplo, anticuerpos que contienen las unidades de unión funcionales pequeñas de anticuerpos, correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de anticuerpos humanos. Los ejemplos de anticuerpos de dominio incluyen, entre otros, aquellos disponibles de Domantis que son específicos para dianas terapéuticas. Se pueden utilizar bibliotecas de anticuerpos de dominio disponibles comercialmente para identificar anticuerpos de dominio de toxina alfa. Los anticuerpos y fragmentos anti­ toxina alfa comprenden una unidad de unión funcional de toxina alfa y una unidad de unión funcional de receptor gamma Fc.
Los presentes anticuerpos son anticuerpos lineales. Los anticuerpos lineales comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Ciertas modificaciones de la secuencia de aminoácidos
Además de los anticuerpos humanos, humanizados y/o quiméricos descritos anteriormente, la presente tecnología también abarca modificaciones adicionales y, sus variantes y fragmentos de los mismos, de un anticuerpo o fragmento anti-alfa que comprende uno o más de los siguientes: residuo de aminoácido y/o sustitución, adición y/o eliminación de polipéptidos en el dominio variable ligero (VL) y/o dominio pesado variable (VH) y/o región Fc, y una modificación postraduccional. Se incluyen en estas modificaciones los conjugados de anticuerpos en los que un anticuerpo se ha unido covalentemente a una fracción. Las fracciones adecuadas para la unión a los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, fármacos, marcadores y citotoxinas. Estos cambios en los anticuerpos pueden hacerse para alterar o ajustar las características (por ejemplo, bioquímicas, de unión y/o funcionales) de los anticuerpos según sea apropiado para el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades asociadas con S. aureus y/o toxina alfa. Los métodos para formar conjugados, realizar cambios de aminoácidos y/o polipéptidos y modificaciones postraduccionales son conocidos en la técnica, algunos de los cuales se detallan a continuación. Se puede hacer cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar a una construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas.
Los cambios de aminoácidos en los anticuerpos dan como resultado secuencias que son menos del 100 % idénticas a una secuencia de anticuerpos o una secuencia de anticuerpos principal descrita en el presente documento. En este contexto, los anticuerpos pueden tener aproximadamente de 25 % a aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa como se describe en el presente documento. Así, un anticuerpo modificado puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad o similitud de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o fragmento anti-alfa, como se describe en este documento. Un anticuerpo alterado tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos o similitud con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o ligera CDR1, CDR2 o CDR3 de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa como se describe aquí. Un anticuerpo alterado a veces puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 25 %, 35 %, 45 %, 55 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de la identidad o similitud de una secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o ligera FR1, FR2, FR3 o FR4 de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa como se describe en el presente documento.
Los anticuerpos alterados se generan por una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, deleción y/o adiciones) introducidas en una o más de las regiones variables del anticuerpo. Las alteraciones de aminoácidos se introducen en las regiones marco. Una o más alteraciones de los residuos de la región marco pueden dar como resultado una mejora en la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno. Esto puede ser especialmente cierto cuando estos cambios se realizan en anticuerpos humanizados donde la región marco puede ser de una especie diferente a la de las regiones CDR. Los ejemplos de residuos de la región marco para modificar incluyen aquellos que se unen de forma no covalente al antígeno directamente, interactúan con/efectúan la conformación de una CDR y/o participan en la interfaz VL-VH. Se pueden alterar de aproximadamente uno a aproximadamente cinco residuos de la estructura. A veces, esto puede ser suficiente para producir un anticuerpo mutante adecuado para su uso en ensayos preclínicos, incluso cuando ninguno de los residuos de la región hipervariable se haya alterado. Normalmente, sin embargo, un anticuerpo alterado comprenderá alteración (es) de la región hipervariable adicional. Los residuos de la región hipervariable pueden cambiarse aleatoriamente, especialmente cuando la afinidad de unión inicial de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa para el antígeno de la segunda especie de mamífero es tal que tales anticuerpos producidos aleatoriamente pueden seleccionarse fácilmente.
Un procedimiento útil para generar anticuerpos alterados se llama “mutagénesis de exploración alanina”. En este método, uno o más de los residuos de la región hipervariable se reemplazan por uno o más residuos de alanina o polialanina para alterar la interacción de los aminoácidos con la toxina alfa. Los residuos de la región hipervariable que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan mediante la introducción de mutaciones adicionales u otras en o para los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación en sí no necesita ser predeterminada. Los mutantes de Ala producidos de esta manera se analizan por su actividad biológica como se divulga en el presente documento.
La variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para un mayor desarrollo tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitución implica la maduración por afinidad utilizando fagos. En resumen, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los mutantes de anticuerpos así generados se muestran de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Los mutantes mostrados en fagos se examinan luego para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en este documento.
Las mutaciones en las secuencias de anticuerpos pueden incluir sustituciones, supresiones, incluyendo supresiones internas, adiciones, incluyendo adiciones que producen proteínas de fusión, o sustituciones conservativas de residuos de aminoácidos dentro y/o adyacentes a la secuencia de aminoácidos, pero que resultan en un cambio “silencioso”, en que el cambio produce un fragmento o anticuerpo anti-toxina alfa funcionalmente equivalente. Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos conservativas sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Además, la glicina y la prolina son residuos que pueden influir en la orientación de la cadena. Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en la secuencia del anticuerpo. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido alfa-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, gamma-Abu, épsilon-Ahx, Ácido 6-aminohexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, beta-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño tal como aminoácidos beta-metilo, aminoácidos C-alfa-metilo, aminoácidos N-alfa-metilo, aminoácidos, y análogos de en general.
Cualquier residuo de cisteína que no esté involucrado en el mantenimiento de la conformación adecuada de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. A la inversa, los enlaces de cisteína se pueden agregar al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como un fragmento Fv).
Un anticuerpo puede modificarse para producir proteínas de fusión; es decir, el anticuerpo, o un fragmento del mismo, fusionado a una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. La proteína fusionada con la porción de un anticuerpo es un componente enzimático de la terapia de profármacos con enzimas dirigida por anticuerpos (ADEPT). Los ejemplos de otras proteínas o polipéptidos que pueden diseñarse como una proteína de fusión con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a toxinas tales como ricina, abrina, ribonucleasa, DNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antiviral de pokeweed, gelonina, difteria toxina, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que se pueden utilizar incluyen la cadena de la difteria, los fragmentos activos no vinculantes de la toxina de la difteria, la cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena de la ricina A, la cadena de la abrina A, la cadena de modeccin A, la cadena alfa-sarcina, Aleurites proteínas fordii, proteínas diantinas, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de la momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos.
Se pueden generar proteínas de fusión adicionales a través de técnicas conocidas de combinación aleatoria de genes, combinación de motivos, combinación de exones y/o combinación de codones (denominados colectivamente como “combinación de ADN”). El combinado de ADN puede emplearse para alterar las características del anticuerpo o sus fragmentos (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo con afinidades más altas y menores tasas de disociación). Un anticuerpo puede ser además una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión como se conoce en la técnica.
Regiones Fc Variantes
La presente invención también incluye miembros de unión de la invención, y en particular los anticuerpos de la invención, que tienen dominios constantes de IgG modificados. Se utilizan anticuerpos de la clase de IgG humana, que tienen características funcionales tales como una vida media larga en el suero y la capacidad de mediar diversas funciones efectoras (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)). El anticuerpo de clase IgG humana se clasifica adicionalmente en las siguientes 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Hasta el momento, se han realizado una gran cantidad de estudios para ADCC y CDC como funciones efectoras del anticuerpo de clase IgG, y se ha informado que entre los anticuerpos de la clase IgG humana, la subclase IgG1 tiene la actividad ADCC y CDC más alta en humanos. (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).
“Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos” y “ADCC” se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas (por ejemplo, linfocitos citotóxicos (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y Posteriormente provocará la lisis de la célula diana. Dichas células son células humanas. Si bien no desean limitarse a ningún mecanismo de acción en particular, estas células citotóxicas que median la ADCC generalmente expresan los receptores Fc (FcR). Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII, FcyRIII y/o FcyRIV. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en Ravetch y Kinet, Annu Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula, un ensayo in vitro de ADCC, como el que se describe en la patente de EE.UU. 5,500,362 o 5,821,337 pueden realizarse. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citotóxicos naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de las moléculas de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., Proc. Natl Acad Sci. (Us a ), 95: 652-656 (1998).
La “citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la capacidad de una molécula para iniciar la activación del complemento y lisar un objetivo en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) en complejo con un antígeno relacionado. Para evaluar la activación del complemento, un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996), pueden realizarse.
La expresión de la actividad ADCC y la actividad CDC de los anticuerpos de la subclase IgG1 humana generalmente involucra la unión de la región Fc del anticuerpo a un receptor para un anticuerpo (en lo sucesivo, “FcyR”) que existe en la superficie de las células efectoras, como los linfocitos citotóxicos, linfocitos citotóxicos o macrófagos activados. Se pueden unir varios componentes del complemento. Con respecto a la unión, se ha sugerido que varios residuos de aminoácidos en la región bisagra y el segundo dominio de la región C (en lo sucesivo denominado “dominio Cy2”) del anticuerpo son importantes (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) y que una cadena de azúcar en el dominio Cy2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) También es importante.
Las “células efectoras” son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Las células expresan al menos FcyRI, FCyRII, FcyRIII y/o FcyRIV y llevan a cabo la función efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citotóxicos naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Los términos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Además, el FcR es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcyRIV, incluidas variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activador”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor FcyRIIA de activación contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor FcyRIIB inhibidor contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. (Ver, Daeron, Annu Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clinica Med., 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluidos los que se identificarán en el futuro, están incluidos en el término “FcR” en este documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., Immunol., 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24: 249 (1994)).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una región Fc alterada (también denominada en este documento como “región Fc variante”) en la que se han realizado una o más alteraciones en la región Fc para cambiar las propiedades funcionales y/o farmacocinéticas de los anticuerpos. Dichas alteraciones pueden provocar una disminución o un aumento de la unión a C1q y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o de la unión a FcgammaR, para IgG. La presente tecnología abarca los anticuerpos descritos en el presente documento con regiones Fc variantes donde se han realizado cambios para alterar la función efectora, proporcionando un efecto deseado. De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una región Fc variante (es decir, regiones Fc que se han alterado como se describe más adelante). Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa en el presente documento que comprenden una variante de la región Fc también se denominan aquí “anticuerpos variantes de Fc”. Tal como se usa aquí, nativo se refiere a la secuencia parental no modificada y el anticuerpo que comprende una región Fc nativa se denomina aquí como “anticuerpo Fc nativo”. La región Fc variante exhibe un nivel similar de función efectora de inducción en comparación con la región Fc nativa. La región Fc variante exhibe una mayor inducción de la función efectora en comparación con el Fc nativo. La región Fc variante exhibe una menor inducción de la función efectora en comparación con el Fc nativo. Algunas realizaciones específicas de las variantes de las regiones Fc se detallan aquí. Los métodos para medir la función del efector son conocidos en la técnica.
La función efectora de un anticuerpo puede modificarse a través de cambios en la región Fc, que incluyen, entre otros, sustituciones de aminoácidos, adiciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos y cambios en las modificaciones postraduccionales de los aminoácidos Fc (por ejemplo, glicosilación). Los métodos descritos a continuación se pueden utilizar para alterar la función efectora de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno como se describe en este documento, lo que resulta en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que tiene ciertas propiedades ventajosas para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a estafilococo en particular.
Se divulga en el presente documento anticuerpo variante de Fc con propiedades de unión alteradas para un ligando de Fc (por ejemplo, un receptor de Fc, C1q) con respecto a un anticuerpo de Fc nativo. Los ejemplos de propiedades de unión incluyen, pero no se limitan a, especificidad de unión, constante de disociación de equilibrio (Kd), tasas de disociación y asociación (koff y kon respectivamente), afinidad de unión y/o avidez. Se sabe en la técnica que la constante de disociación de equilibrio (Kd) se define como koff/kon. En ciertos aspectos, un anticuerpo que comprende una región variante de Fc con una baja Kd puede ser más deseable para un anticuerpo con una alta Kd. Sin embargo, en algunos casos, el valor de kon o koff puede ser más relevante que el valor de Kd. Se puede determinar qué parámetro cinético es más importante para una aplicación de anticuerpo determinada.
Los anticuerpos de la variante de Fc exhiben afinidad de unión alterada para uno o más receptores de Fc que incluyen, entre otros, FcRn, FcgammaRI (CD64) que incluyen las isoformas FcgammaRIA, FcgammaRIB y FcgammaRIC; FcgammaRII (CD32 que incluye las isoformas FcgammaRIIA, FcgammaRIIB y FcgammaRIIC); y FcgammaRIII (CD16, incluidas las isoformas FcgammaRIIIA y FcgammaRIIIB) en comparación con un anticuerpo Fc nativo.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo variante de Fc que tiene una unión mejorada a uno o más ligandos de Fc en relación con un anticuerpo Fc nativo. El anticuerpo de la variante Fc exhibe una afinidad aumentada o disminuida por un ligando Fc que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o está entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por un ligando de Fc que son al menos el 90 %, al menos el 80 %, al menos el 70 %, al menos el 60 %, al menos el 50 %, al menos el 40 %, al menos el 30 %, al menos el 20 %, al menos el 10 %, o al menos el 5 % más o menos que un anticuerpo Fc nativo. Un anticuerpo variante de Fc tiene una afinidad incrementada por un ligando de Fc. Un anticuerpo de la variante de Fc a veces puede tener una afinidad reducida por un ligando de Fc.
Se divulga en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que tienen una unión mejorada al receptor Fc FcgammaRIIIA. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que tienen una unión mejorada al receptor Fc FcgammaRIIB. En ciertas realizaciones, un anticuerpo variante de Fc tiene una unión mejorada a los receptores Fc FcgammaRIIIA y FcgammaRIIB. Se divulgan en el presente documento los anticuerpos de la variante de Fc que tienen una unión mejorada a FcgammaRIIIA que no tienen un aumento concomitante en la unión del receptor de FcgammaRIIB en comparación con un anticuerpo de Fc nativo. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que tienen una unión reducida al receptor Fc FcgammaRIIIA. Un anticuerpo de la variante de Fc a veces puede tener una unión reducida al receptor Fc FcgammaRIIB. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de variante Fc que muestran afinidad alterada por FcgammaRIIIA y / o FcgammaRIIB que tienen una unión mejorada al receptor FcRn de Fc. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de variante Fc que muestran afinidad alterada por FcgammaRIIIA y / o FcgammaRIIB que tienen una unión alterada a C1q con respecto a un anticuerpo Fc nativo.
Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por el receptor FcgammaRIIIA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o están entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc nativo. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que muestran afinidades por FcgammaRIIIA que son al menos el 90 %, al menos el 80 %, al menos el 70 %, al menos el 60 %, al menos el 50 %, al menos el 40 %, al menos el 30 %, al menos 20 %, al menos 10 %, o al menos 5 % más o menos que un anticuerpo Fc nativo.
Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por el receptor FcgammaRIIB que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o están entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por FcgammaRIIB que son al menos el 90 %, al menos el 80 %, al menos el 70 %, al menos el 60 %, al menos el 50 %, al menos el 40 %, al menos el 30 %, al menos 20 %, al menos 10 %, o al menos 5 % más o menos que un anticuerpo Fc nativo.
Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante de Fc exhiben afinidades aumentadas o disminuidas a C1q con respecto a un anticuerpo de Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por el receptor C1q que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o están entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que un anticuerpo Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por C1q que son al menos el 90 %, al menos el 80 %, al menos el 70 %, al menos el 60 %, al menos el 50 %, al menos el 40 %, al menos el 30 %, al menos 20 %, al menos 10 %, o al menos 5 % más o menos que un anticuerpo Fc nativo. Se divulga en el presente documento un anticuerpo variante de Fc que muestra afinidad alterada por Ciq ha mejorado la unión al receptor FcRn de Fc. En otra realización específica más, un anticuerpo variante de Fc que presenta afinidad alterada por C1q tiene una unión alterada a FcgammaRIIIA y/o FcgammaRIIB con relación a un anticuerpo Fc nativo.
Se contempla que los anticuerpos de la variante de Fc se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de las células efectoras mediadas por FcgammaR. En el presente documento se divulgan anticuerpos de la variante Fc tienen propiedades de unión similares y funciones de las células efectoras en modelos in vivo (como los descritos y divulgados en el presente documento) que los de los ensayos basados in vitro. La tecnología actual no excluye los anticuerpos de la variante Fc que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos basados en in vitro, pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.
La vida media en suero de las proteínas que comprenden regiones Fc se puede aumentar al aumentar la afinidad de unión de la región Fc por FcRn. El término “vida media del anticuerpo”, como se usa en el presente documento, significa una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo medio de supervivencia de las moléculas de anticuerpo después de su administración. La vida media del anticuerpo se puede expresar como el tiempo requerido para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de inmunoglobulina del cuerpo del paciente (u otro mamífero) o un compartimento específico de la misma, por ejemplo, medido en suero, es decir, vida media circulante, o en otros tejidos. La vida media puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otra. En general, un aumento en la vida media del anticuerpo da como resultado un aumento en el tiempo medio de residencia (MRT) en circulación para el anticuerpo administrado.
Un aumento en la vida media permite la reducción de la cantidad de fármaco administrada a un paciente y reduce la frecuencia de administración. Un aumento en la vida media también puede ser beneficioso, por ejemplo, para prevenir una enfermedad o afección asociada con estafilococo aureus, y también para prevenir una recurrencia de infección que a menudo puede ocurrir una vez que un paciente ha sido dado de alta del hospital. Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se conoce en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término “epítopo de unión al receptor de rescate” se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo del Molécula de IgG. Los anticuerpos con vidas medias aumentadas también pueden generarse modificando los residuos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el receptor Fc y el receptor FcRn. Además, la vida media de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede incrementarse por conjugación con PEG o albúmina mediante técnicas ampliamente utilizadas en la técnica. Los anticuerpos que comprenden regiones variantes de Fc de un anticuerpo anti-toxina alfa tienen una vida media aumentada de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, aproximadamente 125%, aproximadamente 150% o más en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc nativa. Los anticuerpos que comprenden regiones variantes de Fc tienen una vida media aumentada de aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces o más, o está entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 25 veces, o entre 15 veces y 50 veces, en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc nativa.
En el presente documento se divulga una tecnología que proporciona variantes de Fc, en el que la región Fc comprende una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, supresiones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 y 443 numerados por el índice de la UE según lo establecido en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender un residuo de aminoácido no natural en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas en la técnica.
En el presente documento se divulga una variante de Fc, en el que la región Fc comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 2341,234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 2351, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 2401,240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y y 434W según lo numerado por el índice de la UE según lo establecido en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender residuos de aminoácidos que no se producen de manera natural y/o alternativa conocidos en la técnica.
En el presente documento se divulga un anticuerpo de variante Fc, en donde la región Fc comprende al menos una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, supresiones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235 y 331. Los aminoácidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en 234F, 235F, 235Y y 331S. En este documento se proporciona una variante de Fc, donde la región Fc comprende al menos un aminoácido no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 239, 330 y 332. Algunas realizaciones, los aminoácidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E.
En el presente documento se divulga un anticuerpo variante de Fc, donde la región Fc comprende al menos un aminoácido no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256. Los aminoácidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, descritos en las patentes de EE.UU. No. 7.083.784, cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
En el presente documento se divulga un anticuerpo anti toxina alfa estafilocócica que tiene una región variante de Fc que aumenta la semivida en suero del anticuerpo, donde el anticuerpo tiene las siguientes secuencias de cadena pesada y cadena ligera:
Cadena pesada: LC10-IgG1-YTE
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHDMHWVRQATGKGLEWVSGIGTAGD
TYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARDRYSPTGHYYGMDVWG
QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:
XX).
Cadena ligera: LC10-Kappa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVP
SRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCKQYADYWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: YY)
Las funciones efectoras provocadas por los anticuerpos IgG dependen en gran medida del resto de carbohidrato unido a la región Fc de la proteína. Por lo tanto, la glicosilación de la región Fc puede modificarse para aumentar o disminuir la función efectora. De acuerdo con lo anterior, las regiones Fc de los anticuerpos anti-toxina alfa y los fragmentos proporcionados en el presente documento comprenden glicosilación alterada de residuos de aminoácidos. La glicosilación alterada de los residuos de aminoácidos da como resultado una función efectora reducida. La glicosilación alterada de los residuos de aminoácidos da como resultado un aumento de la función efectora. La región Fc ha reducido la fucosilación. La región Fc está afucosilada.
Las variantes de Fc en el presente documento pueden combinarse con otras variantes de Fc conocidas como se conoce en la técnica. Se pueden introducir otras modificaciones y/o sustituciones y/o adiciones y/o eliminaciones del dominio Fc.
Glicosilación
Además de la capacidad de la glicosilación para alterar la función efectora de los anticuerpos, la glicosilación modificada en la región variable puede alterar la afinidad del anticuerpo por un antígeno diana. Se modifica el patrón de glicosilación en la región variable de los presentes anticuerpos. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por un antígeno diana. Dichas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de marco de región variable para eliminar así la glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. También se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de un sitio de glicosilación presente en la región Fc (por ejemplo, Asparagina 297 de IgG). Además, pueden producirse anticuerpos aglicosilados en células bacterianas que carecen de la maquinaria de glicosilación necesaria.
Conjugados de Anticuerpos
Los anticuerpos presentados en el presente documento se conjugan o se unen covalentemente a una sustancia usando métodos conocidos en la técnica. La sustancia unida es una etiqueta detectable (también denominada en este documento como una molécula informadora) o un soporte sólido. Las sustancias adecuadas para unirse a los anticuerpos incluyen, entre otros, un aminoácido, un péptido, una proteína, un polisacárido, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un hapteno, un fármaco, una hormona, un lípido, un conjunto lipídico, un polímero sintético, una micropartícula polimérica, una célula biológica, un virus, un fluoróforo, un cromóforo, un colorante, una toxina, un hapteno, una enzima, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un radioisótopo, matrices sólidas, matrices semisólidas y combinaciones de las mismas. Los métodos para la conjugación o la unión covalente de otra sustancia a un anticuerpo son conocidos en la técnica.
Métodos de diagnóstico de uso
La toxina alfa es un factor de virulencia que generalmente se encuentra solo en cepas patógenas de S. aureus. La toxina alfa a veces se une a un receptor de la superficie celular como parte de la formación de complejos activos. Sin embargo, la oligomerización y la formación de un poro transmembrana (por ejemplo, heptámero de toxina alfa) pueden ocurrir en ausencia de unión a un receptor específico. La acción de la toxina alfa oligomerizada en la disfunción celular y la lisis (por ejemplo, la formación de un poro transmembrana) facilita la colonización de bacterias invasoras S. aureus. Los anticuerpos descritos en este documento inhiben el ensamblaje u oligomerización de monómeros de toxina alfa en un poro transmembrana reconociendo una región en la molécula de toxina alfa involucrada directa o indirectamente con la interacción de monómero de toxina alfa - monómero.
Los anticuerpos anti-toxina alfa y los fragmentos y composiciones presentados en este documento pueden usarse in vivo y/o in vitro para diagnosticar cepas de S. aureus que producen afecciones/enfermedades asociadas con toxina alfa y/o toxina alfa. Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra para analizar, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y la toxina alfa. Luego se detecta la formación del complejo (por ejemplo, utilizando un ELISA). Cuando se utiliza una muestra de control junto con la muestra de prueba, el complejo se detecta en ambas muestras y cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos entre las muestras es indicativa de la presencia de S. aureus, toxina alfa o S. aureus y toxina alfa en la muestra de prueba
La tecnología en este documento proporciona un método para determinar la presencia de cepas de S. aureus que producen toxina alfa y/o toxina alfa en una muestra sospechosa de contener S. aureus y/u otras bacterias productoras de homólogos de toxina alfa, el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa, y determinando la unión del anticuerpo a la toxina alfa en la muestra donde la unión del anticuerpo a la toxina alfa en la muestra es indicativa de la presencia de S. aureus y/o alfa Toxina en la muestra. La muestra es una muestra biológica. La muestra biológica es de un mamífero que experimenta o se sospecha que experimenta una enfermedad/trastorno asociado a S. aureus.
Puede usarse un anticuerpo o fragmento anti-alfa para detectar el crecimiento de S. aureus y/o la sobreexpresión de toxina alfa usando un ensayo de diagnóstico in vivo. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se agrega a una muestra donde el anticuerpo se une a la toxina alfa que se va a detectar y se marca con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o una etiqueta fluorescente) y se escanea externamente al paciente Para la localización de la etiqueta.
Los ensayos FISH como el INFORM ™ (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION ™ (Vysis, IL) se pueden llevar a cabo en tejido fijado en parafina, fijado con formalina, para determinar la extensión (si existe) de la sobreexpresión de la toxina alfa en la muestra de tejido.
Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa pueden usarse en un método para detectar toxina alfa en muestras de tejido, sangre o suero (por ejemplo, toxina alfa soluble). El método comprende poner en contacto una muestra de prueba de tejido, sangre o suero de un mamífero sospechoso de experimentar un trastorno mediado por toxina alfa de S. aureus con un anticuerpo o fragmento anti-alfa presentado en este documento y detectar un aumento de toxina alfa en la muestra de prueba en relación con una muestra de control de sangre o suero de un mamífero normal. El método de detección es útil como un método para diagnosticar un trastorno mediado por S. aureus y/o toxina alfa asociado con un aumento de la toxina alfa en el tejido, la sangre o el suero de un mamífero.
Métodos terapéuticos de uso
Puede administrarse un anticuerpo o fragmento anti-alfa para la prevención y/o el tratamiento de una afección mediada por toxina alfa. En el presente documento se presentan métodos para prevenir, tratar, mantener, mejorar y/o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por toxinas alfa, donde los métodos comprenden administrar anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa proporcionados en este documento.
Trastornos mediados por toxinas alfa por estafilococos aureus patógenos
En el presente documento se divulgan métodos para administrar y utilizar composiciones y anticuerpos tal como se presentan en el presente documento para tratar y prevenir una amplia gama de afecciones/enfermedades mediadas por Staphylococcus aureus patógenas, que incluyen afecciones crónicas y agudas, tales como, entre otras, bacteriemia. Quemaduras, celulitis, dermonecrosis, infecciones de párpados, intoxicación alimentaria, infecciones de articulaciones, conjuntivitis neonatal, osteomielitis, neumonía, infecciones de la piel, infección de la herida quirúrgica, síndrome de la piel escaldada, endocarditis, meningitis, formación de abscesos y síndrome de choque tóxico.
Tanto el CA-MRSA como el HA-MRSA son resistentes a los antibióticos anti-estafilocócicos beta-lactámicos tradicionales, como la cefalexina. CA-MRSA tiene un mayor espectro de susceptibilidad antimicrobiana, incluidos los medicamentos sulfa (como el cotrimoxazol/trimetoprim-sulfametoxazol), las tetraciclinas (como la doxiciclina y la minociclina) y la clindamicina, pero ahora se considera que el medicamento de elección para tratar el CA-MRSA Ser vancomicina, según un estudio del Hospital Henry Ford. HA-MRSA es resistente incluso a estos antibióticos y, a menudo, es susceptible solo a la vancomicina. Los medicamentos más nuevos, como la linezolid (que pertenece a la clase más nueva de las oxazolidinonas) y la daptomicina, son eficaces contra el CA-MRSA y e1HA-MRSA.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención se puede utilizar en combinación con un antibiótico que corresponde, por ejemplo, a antibióticos beta-lactámicos (como cefalexina), sulfamidas (como co-trimoxazol/trimetoprim). -sulfametoxazol), tetraciclinas (como doxiciclina y minociclina), clindamicina, vancomicina, linezolid, daptomicina, teicoplanina, quinupristina/dalfopristina (sinercida) o tigeciclina.
Formulaciones farmacéuticas
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa proporcionado en el presente documento puede formularse con un vehículo farmacéuticamente aceptable como composiciones farmacéuticas (terapéuticas), y puede administrarse mediante varios métodos conocidos en la técnica. La ruta y/o el modo de administración pueden variar según los resultados deseados. Como se usa en el presente documento, las formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se denominan formulaciones de la tecnología. El término “portador farmacéuticamente aceptable” significa uno o más materiales no tóxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Dichas preparaciones pueden contener rutinariamente sales, agentes tamponantes, conservantes, vehículos compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos. Dichas preparaciones farmacéuticamente aceptables también pueden contener de manera rutinaria rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles que son adecuadas para la administración en un ser humano. El término “portador” denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también pueden combinarse con los anticuerpos de la presente tecnología, y entre sí, de una manera tal que no haya interacción que pueda dañar sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Las composiciones terapéuticas de la presente tecnología pueden formularse para una dosificación particular. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de composición. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Las composiciones terapéuticas de la presente tecnología pueden formularse para vías de administración particulares, tales como administración oral, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación única que será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico.
Dosis Terapéuticamente Efectivas
Una formulación de anticuerpo descrita en el presente documento puede administrarse en una dosis adecuada y un régimen de dosificación, y tal régimen de dosificación y dosificación puede depender de la enfermedad o afección a tratar. Se puede identificar una dosis terapéuticamente efectiva determinando si una dosis y un régimen de dosis dan lugar a un efecto terapéutico o criterio de valoración terapéutico
Artículos de Fabricación y Kits.
En el presente documento se proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con una formulación líquida o una formulación liofilizada de esta memoria. Se divulga en el presente documento un recipiente lleno con una formulación líquida en que es una jeringa precargada. En casos específicos, las formulaciones en el presente documento comprenden anticuerpos anti-toxina alfa y fragmentos fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente con otra fracción, que incluye, entre otros, una proteína heteróloga, un polipéptido heterólogo, un péptido heterólogo, una molécula grande, una molécula pequeña, una secuencia marcadora, un agente de diagnóstico o detectable, una fracción terapéutica, una fracción de fármaco, un ion metálico radiactivo, un segundo anticuerpo y un soporte sólido. Las formulaciones de este documento se formulan en frascos de dosis única como un líquido estéril. Una formulación de este documento a veces se suministra en una jeringa precargada.
Se divulga en el presente documento kits que comprenden anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa que son útiles para diversos fines, por ejemplo, investigación y diagnóstico, incluso para la purificación o inmunoprecipitación de toxina alfa de las células, detección de toxina alfa y similares. Para el aislamiento y la purificación de la toxina alfa, el kit puede contener un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Pueden proporcionarse kits que contienen los anticuerpos para la detección y cuantificación de la toxina alfa in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot. Al igual que con el artículo de fabricación, el kit comprende un contenedor y una etiqueta o prospecto en o asociado con el contenedor. El recipiente contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa como se describe en este documento. Pueden incluirse contenedores adicionales que contengan, por ejemplo, diluyentes y tampones, anticuerpos de control. La etiqueta o el prospecto pueden proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso in vitro o diagnóstico previsto.
La tecnología actual también abarca un producto farmacéutico empaquetado y etiquetado terminado. Este artículo de fabricación incluye la forma de dosificación unitaria adecuada en un contenedor o recipiente adecuado, como un vial de vidrio, una jeringa precargada u otro recipiente herméticamente cerrado. La forma de dosificación unitaria se proporciona como una solución libre de partículas estéril que comprende un anticuerpo o fragmento anti-alfa que es adecuado para la administración parenteral. La forma de dosificación unitaria se proporciona como un polvo liofilizado estéril que comprende un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que es adecuado para la reconstitución.
La forma de dosificación unitaria es adecuada para administración intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, tópica o subcutánea. Por lo tanto, la tecnología abarca soluciones estériles adecuadas para cada ruta de entrega. La tecnología abarca además polvos liofilizados estériles que son adecuados para la reconstitución.
Al igual que con cualquier producto farmacéutico, el material de empaque y el contenedor están diseñados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y envío. Además, los productos de este documento incluyen instrucciones de uso u otro material informativo que aconseje al médico, técnico o paciente sobre cómo prevenir o tratar adecuadamente la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye medios de instrucción que indican o sugieren un régimen de dosificación que incluye, entre otros, dosis reales, procedimientos de monitoreo y otra información de monitoreo.
Específicamente, la tecnología proporciona un artículo de manufactura que comprende material de empaque, como una caja, botella, tubo, frasco, recipiente, jeringa precargada, rociador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.), sobre y sobre similares; y al menos una forma de dosificación unitaria de un agente farmacéutico contenido dentro del material de envasado, donde el agente farmacéutico comprende una formulación líquida que contiene un anticuerpo. El material de empaque incluye medios de instrucción que indican cómo se puede utilizar el anticuerpo para prevenir, tratar y/o manejar uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno.
Ejemplos
Los ejemplos que se exponen a continuación ilustran ciertos anticuerpos y sus usos y no limitan la tecnología.
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Los materiales y métodos utilizados para el Ejemplo 2 al Ejemplo 9 y el Ejemplo 11 al Ejemplo 13 se proporcionan a continuación.
Clonación y expresión de Wt S. aureus AT y mutante H351 no hemolítico
El ADN genómico de la cepa ATCC BAA1556 de Staphylococcus aureus se utilizó para amplificar el gen de la toxina alfa (AT) de tipo silvestre mediante PCR. La reacción contenía el cebador directo, atatataagcttaatttgtcatttcttctttttccc (Se Q ID NO: 41), cebador inverso, atatataagcttaatttgtcatttcttctttttcc (SEQ ID NO: 42), y aproximadamente 10 ng de ADN genómico en una reacción de 50 |jl utilizando polimerasa Herculase II (Stratagene). El fragmento resultante se digirió con Sac I y Hind III y se ligó en el vector de ADN pCold II (TaKaRa), en marco con una etiqueta 6x His terminal N. El mutante H35L se generó mediante mutagénesis dirigida al sitio del gen de tipo silvestre utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores mutagénicos utilizados para la mutagénesis fueron gataaagaaaatggcatgctcaaaaaagtattttatagttttatc (SEQ ID NO: 43) y gataaaactataaaatacttttttgagcatgccattttctttatc (SEQ ID NO: 44).
Las secuencias del mutante AT y ATh35l de tipo silvestre se confirmaron mediante secuenciación automatizada de ADN. La toxina alfa mutante de tipo silvestre y H35L se expresaron en la cepa BL21 de E. coli. Un 50 ml de cultivo durante la noche crecido en LB más carbenicilina se diluyó 1:10 en un cultivo de 500 ml y se hizo crecer a 37 °C hasta una A600 de aproximadamente 0,5. El cultivo se cambió a 15 °C durante 30 minutos y luego se añadió IPTG 1 M para lograr una concentración final de aproximadamente 100 mM. El cultivo se incubó durante 24 horas adicionales a 15 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación.
Purificación de toxina alfa marcada his recombinante (rAT-his)
Los sedimentos de células bacterianas se descongelaron en hielo y se resuspendieron en tampón de Ni-NTA A (fosfato sódico 20 mM, pH 7,2, NaCl 300 mM). Las células se lisaron por microfluidización (Microfluidics Modelo M-110P) a 20,000 psi y el lisado crudo se clarificó por centrifugación a 27,000 xg durante 10 min. a 4 °C. Después de una filtración de 0,2 |jm, el sobrenadante se cargó en una columna de 5 ml de Ni-NTA Superflow (Qiagen) equilibrada con Tampón de Ni-NTA A. rAT-his se eluyó con un gradiente escalonado de 300 mM y 500 mM de imidazol Las fracciones se recogieron en tubos que contenían EDTA a una concentración final de 1 mM y se dializaron en tampón A de SP (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, NaCl 25 mM, EDTA 1 mM). Los dializados se cargaron en una columna HiTrap SP Sepharose FF de 5 ml (GE Healthcare) en el tampón SP A y el rAT-his se eluyó con un gradiente escalonado a NaCl 1 M. Las fracciones que contenían rAT-his se dializaron en 1x PBS, pH 7,2 con EDTA 1 mM y se congelaron alícuotas a -80 °C.
Purificación de Toxina Alfa Nativa de S. aureus
La toxina alfa nativa (nAT) se purificó a partir de la cepa de S. aureus Wood. La S. aureus Wood se cultivó durante la noche en caldo de soja tríptico (TSB) a 37 °C, con agitación (por ejemplo, aproximadamente 250 RPM). El sobrenadante del cultivo se recogió por centrifugación y luego se llevó a una saturación del 75 % con sulfato de amonio sólido. Después de agitar durante 3 horas a 4 °C, el precipitado se capturó mediante centrifugación a 12.000 x g durante 45 minutos, se resuspendió en tampón SP A (acetato de sodio 25 mM, pH 5,2, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM) y se dializó contra tampón SP A durante la noche a 4 °C con un intercambio. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 27,000 * g durante 30 min. a 4 °C. El dializado soluble se filtró (0,2 |jm) y se cargó en una columna de 10 ml de SP Sepharose FF (GE Healthcare) equilibrada con el tampón SP A. La NAT unida se eluyó con un gradiente lineal hasta NaCl 300 mM, seguido de etapas a 0,5 y 1 M NaCl. Las fracciones que contenían nAT se agruparon y se dializaron durante la noche en PBS, pH 7,2 que contenía EDTA 1 mM. Para el procesamiento final, el dializado se cargó en una columna de alta resolución HiPrep Sephacryl S-200 (GE Healthcare) en un índice de fluidez de 1,3 ml/min en 1x PBS, pH 7,2 con EDTA 1 mM. Las fracciones que contenían nAT se agruparon, se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C.
Inmunización/Generación de Hibridoma
Ratones VelocImmune de ocho semanas de edad recibieron 5 rondas de inyecciones subcutáneas de la rAT H35L en múltiples sitios siguiendo el régimen de inmunización de RIMMS Kilpatrick et al (1997). Los ratones se inmunizaron durante un curso de 13 días a intervalos de 2-3 días. Para cada ronda de inmunización, los ratones se anestesiaron primero con isofluorano. El inmunógeno se emulsionó en adyuvante completo o incompleto de Freund y adyuvante TiterMax Gold y se inyectó bilateralmente en la nuca, la axila, la pantorrilla y la ingle. Los sangrados de prueba se recogieron el día 13 y se analizaron en un ELISA de antígeno. Los ratones recibieron un refuerzo de pre-fusión por vía intraperitoneal y se sacrificaron el día 17. Los linfocitos y esplenocitos de los ganglios linfáticos se fusionaron con un compañero de mieloma para generar hibridomas estables.
Neutralización de la actividad hemolítica.
Se mezclaron cincuenta microlitros de cada sobrenadante de cultivo de hibridoma de células B con toxina alfa-His recombinante (rAT-his, concentración final de 0,1 mg/ml) en placas de 96 pozos, seguido de la adición de 50 j l de glóbulos rojos de conejo al 5 % (RBC) en PBS. Los pozos de control contenían RBC y medios de cultivo solo con o sin AT. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C, y las células intactas se sedimentaron por centrifugación. Se transfirieron 50 j l de los sobrenadantes a una nueva placa de 96 pozos y se midió el A490 en un espectrofotómetro. La actividad neutralizante se calculó con respecto a la lisis con RBC y rAT-his sola y se calculó: % de inhibición = 100 * [100-(A490 nAT Ab)/(A490 nAT sin Ab)].
También se ensayó la inhibición con los mAb purificados. Se agregaron mAb anti-AT a una placa de 96 pozos a aproximadamente 80 jg/m l en PBS y las muestras se diluyeron en serie (dos veces) en PBS hasta un volumen final de 50 jL . Se incluyó una IgG1 no específica (R347) como control de isotipo. Veinticinco microlitros de diluciones de mAb se mezclaron con 25 j l de nAT (toxina alfa nativa) a aproximadamente 0,1 jg/m l en placas de 96 pozos de fondo redondo, seguido de la adición de 50 j l de glóbulos rojos al 5 %. La inhibición de la actividad hemolítica se calculó como anteriormente.
Expresión y purificación de mAb anti-AT quiméricos
Los sobrenadantes anti-AT murinos clarificados (aproximadamente 5 L @ 30-50 mg/L) se concentraron por filtración de flujo tangencial. Los sobrenadantes concentrados se pasaron luego sobre cinco columnas de 5 ml de Proteína G HiTrap HP en secuencia y la IgG unida se eluyó con bicarbonato de sodio 50 mM pH 11,0 y se neutralizó a aproximadamente pH 7,0 con ácido fosfórico 1 M. El material neutralizado se cargó en dos columnas HiTrap Q FF (GE Healthcare) de 1 ml en secuencia. El flujo que contenía IgG se recogió y se dializó en PBS a pH 7,2.
Neutralización de lisis A549
Las células A549 se mantuvieron en una incubadora al 5 % de CO2 a 37 °C en RMPI suplementado con un aminoácido no esencial, glutamina y suero bovino fetal al 10 %. Las células se lavaron una vez con medio equilibrado de Hank y se sembraron en placas a 104 /pozo a 50 |jl en RPMI, 5 % de FBS, y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante 20 horas. Se agregaron mAb anti-AT a una placa de 96 pozos a 80 jg/m l en RPMI y las muestras se diluyeron en serie (dos veces) en RPMI. Se incluyó una IgG1 irrelevante (R347) como control de isotipo. En una placa separada de 96 pozos, se mezclaron 30 j l de los anticuerpos diluidos con 30 j l de nAT (concentración final, 5 jg/ml). Se transfirieron cincuenta microlitros de cada pozo a la placa que contenía células adherentes A549. Se incluyeron los pozos de control de células A549 con o sin NAT. Las placas se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 durante 3 h, se centrifugaron y se transfirieron 50 |jl de sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos. La lisis celular se midió como la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando un kit de ensayo no radiactivo Cytotox 96 (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. La LDH de fondo se sustrajo de cada pozo y se calculó la inhibición de la liberación de LDH: % de inhibición = 100 * [100-(A590 nAT Ab)/(A590 nAT no Ab)].
Neutralización de lisis de THP-1
Las células THP-1 se mantuvieron en una incubadora al 5 % de CO2 a 37 °C en medio RPMI (Invitrogen) suplementado con aminoácidos no esenciales (Invitrogen), glutamina 2 mM (Invitrogen) y suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen). Se agregaron mAb anti-AT a una placa de 96 pozos a 80 jg/m l en RPMI y las muestras se diluyeron en serie (dos veces) en RPMI hasta un volumen final de 50 jl. Se incluyó una IgG1 irrelevante (R347) como control de isotipo. Veinticinco microlitros de las diluciones de mAb se mezclaron con 25 j l de toxina alfa nativa (nAT) a 1,5 jg/m l final, seguido de la adición de 50 j l de células THP-1 lavadas con RMPI (106 células/ml en RPMI con 10 % de FBS) en una placa de 96 pozos. Los pozos de control consistían en células THP-1 con solo o con nAT. Las placas se incubaron en una incubadora al 5 % de CO2 a 37 °C durante 3 h, se centrifugaron y se transfirieron 50 j l del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos. La lisis celular se midió como la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando el kit de ensayo no radiactivo Cytotox 96 (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. La inhibición de la liberación de LDH se calculó como se describió anteriormente.
Clonación de mAb IgG anti-AT y expresión como mAb completamente humanos
El ARNm de cinco clones de hibridoma 2A3, 10A7, 12B8, 25E9 y 28F6 se aislaron utilizando el kit directo de ARNm de Dynabeads (Invitrogen). La primera hebra de ADNc se sintetizó usando SuperScript III (Invitrogen), transcriptasa inversa y cebadores de heptámero aleatorios. La Ig Vl humana (kappa) y Vh se amplificaron por PCR utilizando un conjunto de cebadores Ig (Novagen, número de catálogo 69830). Los productos Vl y Vh amplificados por PCR se clonaron en el vector TOPO TA (Invitrogen pCR2.1-TOPO) y se secuenciaron. El Vh y el Vl (kappa) de cada hibridoma se volvieron a amplificar mediante PCR, agregando sitios de enzimas de restricción para la clonación en el vector humano IgG.kappa.pOE, donde el Vl se clonó en el sitio BssHII/BsiWI fusionado con el c-kappa humano, y el Vh fue clonado en el sitio BsrGI/SalI fusionado con la región constante de la cadena pesada de IgG-1 humana. Los plásmidos pOE resultantes se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Expresión y Purificación de mAb Anti Toxina Alfa
El ADN plasmídico de las construcciones de pOE se preparó utilizando el kit Endofree Plasmid Maxi (Qiagen). Los plásmidos pOE se transfectaron en células en suspensión 293F usando reactivo de 293fectina (Invitrogen) en medio de expresión Freestyle 293 (GIBCO). Los días 6 y 9 después de la transfección, el medio de cultivo se recogió y la IgG se purificó utilizando una columna de proteína A-sefarosa (GE Healthcare). Los picos que contenían IgG se agruparon, se dializaron en PBS, pH 7,4 y se almacenaron a -70 °C. La pureza de las proteínas IgG se verificó mediante SDS-PAGE.
Modelo de neumonía murina.
Veinticuatro horas antes de la infección, grupos de diez ratones C57BL/6J de 7-9 semanas de edad (Harlan) recibieron 0,5 ml de mAb en las concentraciones indicadas mediante la inyección i.p. A continuación, los animales se anestesiaron con isofluorano, se mantuvieron en posición vertical y se inocularon 0,05 ml de suspensión bacteriana de S. aureus (1 * 103 UFC a 3 * 108 UFC) en PBS estéril en las fosas nasales izquierda y derecha. Los animales se colocaron en una jaula en posición supina para la recuperación y se observaron dos veces al día durante el transcurso del estudio. La supervivencia animal fue monitoreada por un máximo de 6 días.
Alternativamente, los animales se sacrificaron mediante inhalación de CO248 h después de la infección por bacterias. Un pulmón y un riñón se eliminaron en PBS estéril, se homogeneizaron, se diluyeron y se sembraron en placas para la enumeración bacteriana. La significación estadística de los estudios de mortalidad se determinó mediante la prueba de log-rank. La importancia de la recuperación bacteriana de los órganos se calculó mediante el análisis de la varianza y la prueba posterior de Dunnett.
Modelo murino de dermonecrosis
Grupos de cinco ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Harlan) se afeitaron en la espalda y se administraron mediante inyección intraperitoneal de 0,5 ml de IgG a la concentración indicada en el gráfico. Veinticuatro horas después, los ratones se infectaron mediante inyección subcutánea de 50 j l de una suspensión bacteriana (1 x 108 S. aureus). Los animales se controlaron dos veces al día para detectar signos de infección y el tamaño del absceso se midió al mismo tiempo diariamente. El área de las lesiones se calculó utilizando la fórmula A = L x W. La significación estadística se determinó mediante el análisis de varianza y la prueba posterior de Dunnett.
Ensayo de unión del receptor
Los fantasmas de glóbulos rojos se prepararon incubando 5 ml de glóbulos rojos de conejo (RBC) lavados y empaquetados en 500 ml de tampón de lisis (fosfato 5 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) o/n a 4 °C con agitación constante. Los fantasmas se eliminaron por centrifugación a 15.000 x g y se lavaron 3 x con tampón de lisis. Luego se lavaron en PBS y se resuspendieron en un volumen final de 3 ml.
Para evaluar la unión de nAT a membranas celulares, los fantasmas de RBC se diluyeron a OD600 aproximadamente 0,2 en PBS y 50 |jL se recubrieron en A pozo de placas de 96 pozos (Costar) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Luego, el líquido se retiró de las placas y los pocillos se bloquearon con 100 |jL de BSA al 1 % en PBS, pH 7,4 durante 2 horas a 4°C y se lavaron 3 veces con PBS. Se mezcló un exceso de 20 moles de IgG con nAT a 3 jg/mL y se agregaron 50 jL a las placas bloqueadas. Las placas se incubaron a 4 °C durante 2 horas y se lavaron 3 veces con PBS. Se añadió IgG anti-AT de conejo marcada con biotina a los pozos a 1 mg/ml y se incubó a 4 °C durante 1 hora, se lavó 3 veces y se incubó con conjugado de estreptavidina peroxidasa (1: 30,000, Jackson Immunoresearch). Los pozos se lavaron 3 veces y se desarrollaron con Sure Blue Reserve (KPL, Inc.). El A450 se leyó utilizando un lector de placas (Molecular Devices) y se calculó el % de unión AT. % de límite AT = 100 x (A450 - AT IgG/A450 - AT solo).
Ensayo de oligomerización
Los liposomas se generaron utilizando un Extrusor Liposofast (Avestin, Inc.) y una membrana con un tamaño de poro de 100 nm. Se secó una mezcla (5:1:4, relación molar) de fosfatidilcolina de yema de huevo (15 mg, Avanti Polar Lipids), fosfatidilglicerol de yema de huevo (2,9 mg, Avanti Polar Lipids) y colesterol (5,8 mg, Avanti Polar Lipids) en cloroformo a 40 °C bajo corriente de nitrógeno. La película lipídica seca se rehidrató luego con 3 ml de PBS, pH 7,4 (Invitrogen) y se incubó a 37 °C durante 30 min. La muestra se agitó vigorosamente en vórtex hasta que formó una suspensión uniforme y luego se sometió a 3 rondas de congelación y descongelación usando un baño de isopropanol con hielo seco y agua a temperatura ambiente. La solución se pasó luego a través del extrusor Liposofast 21 veces.
AT (0,5 jg ) se mezcló con IgG purificada, 5 jL de fantasmas RBC y PBS en un volumen final de 22 jL y se incubó a 37 °C durante 45 min. Las muestras se solubilizaron luego en 5 jL de tampón de muestra SDS-PAGE durante 5 min a 37 °C y 10 jL se sometieron a SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida prefabricado al 4-12 % (Invitrogen). Las proteínas separadas se transfirieron luego a nitrocelulosa, se bloquearon durante 10 minutos con caseína bloqueante en PBS (Thermo Scientific) y se sondaron con IgG anti-AT de conejo (2 jg/mL) durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación constante. Las bandas de AT se detectaron después de 1 hora de incubación con un anti­ conejo 2 de cabra marcado con fosfatasa alcalina y se desarrollaron utilizando el sistema de sustrato de fosfatasa de membrana BCIP/NBT (KPL, Inc.).
Medición de velocidad cinética y constantes de unión (Kp)
Las constantes de velocidad cinética (kon, koff) para la unión de los anticuerpos IgG anti-AT a la nAT purificada se midieron empleando un formato de ensayo de captura de IgG en un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc). Brevemente, se inmovilizó una IgG anti-ratón de rata en un chip sensor CM5 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La densidad superficial final del reactivo de captura en el chip sensor fue aproximadamente 2500 unidades de respuesta (RU), como se describe en este documento. También se preparó una superficie de celda de flujo de referencia en este chip sensor utilizando el protocolo de inmovilización idéntico, y omitiendo nAT. Se prepararon anticuerpos anti-AT IgG a 20 nM en un tampón de instrumentos (tampón HBS-EP que contenía HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y P-20 al 0,005 %) junto con dos diluciones en serie de la nAT. Las diluciones seriales de nAT se realizaron en el rango de aproximadamente 0,78 nM a aproximadamente 50 nM, en tampón de instrumentos.
Se utilizó un enfoque secuencial para las mediciones cinéticas. Cada IgG anti-AT se inyectó primero sobre las superficies de captura y referencia en un índice de fluidez de 50 jL/min. Una vez que la unión de la IgG capturada se había estabilizado, se inyectó una concentración única de la proteína nAT en ambas superficies, en un índice de fluidez de 50 jL/min. Las curvas de respuesta de unión resultantes se utilizaron para determinar los datos de la fase de asociación. Después de la inyección de la NAT, el flujo se cambió de nuevo a tampón del instrumento durante 10 minutos para permitir la recopilación de los datos de la fase de disociación, seguido de un pulso de glicina 10 mM de 1 minuto, pH 1,5 para regenerar la superficie de captura de IgG en el chip. Las respuestas de unión de inyecciones duplicadas de cada concentración de nAT se registraron contra todas las IgG anti-AT.
Además, varias inyecciones de tampón se intercalaron a lo largo de la serie de inyección. Se utilizaron inyecciones de búfer seleccionadas junto con las respuestas de las celdas de referencia para corregir los grupos de datos sin procesar de los artefactos de inyección y/o las interacciones de enlace no específicas comúnmente denominadas “doble referencia” (D. G. Myszka, Mejora del análisis de biosensores. J. Mol. Reconocimiento 12 (1999), pp. 279-284). Los datos de enlace completamente corregidos se ajustaron globalmente a un modelo de enlace 1: 1 (software BIAevaluation 4.1, BIAcore, Inc, Uppsala, Suecia) que incluía un término para corregir el enlace limitado por transporte de masa, en caso de detectarse. Estos análisis determinaron las constantes de velocidad cinética (on, off), a partir de las cuales la KD aparente se calculó como koff/kon.
Medición de los niveles de citoquinas en los pulmones infectados por S. aureus
Se trataron ratones C57BL/6J de siete a nueve semanas de edad con 2A3.1hu (2A3.1 completamente humano) o R347 (45 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal 24 h antes de la infección intranasal con 1,5 * 108 ufc USA300 (BAA -1556, ATCC). Cuatro y veinticuatro horas después de la infección, los ratones se sometieron a eutanasia y los pulmones se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS. El líquido de lavado broncoalveolar (BAL) se almacenó a -70 °C. Las citoquinas proinflamatorias se cuantificaron utilizando el kit de citoquinas de ratón proinflamatorio II 7 (Mesoscale, Gaithersburg, Md.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de citoquinas se expresaron como pg/ml.
Clonación y expresión de proteínas de fusión GST
Las secuencias de genes que codifican AT1-50 y AT51-293 se amplificaron por PCR a partir del clon pColdII AT descrito anteriormente. Las reacciones contenían 10 ng de ADN AT-pColdII y 0,1 mg de cada cebador directo e inverso (AT1-50-F, atattggatccgcagattctgatattaatattaaaac (SEQ ID NO: 45) y AT1-50-R, atacttctcgagttatttattatgatttttatcatcgataaaac (SEQ ID NO) o AT51-293-F catagggatccaaactgctagttattagaacgaaag (SEQ ID NO: 47) y AT 51-293-R, catagctcgagtcaatttgtcatttcttctttttcccaatc (SEQ ID NO: 48)), y la ** polimerasa utilizada. (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de PCR resultante se digirió con BamHI y XhoI y se ligó en el vector de ADN pGex 6P (Stratagene) en el marco con la etiqueta N terminal de glutatión S transferasa (GST). Las secuencias de los clones se confirmaron mediante secuenciación automatizada de ADN.
La expresión de los fragmentos se realizó con la cepa BL21 (DE3) de E. coli como huésped. Se recogieron varias colonias de una placa y se inocularon en 100 ml de LB 100 pg/ml de ampicilina (Sigma Chemical Company) y se cultivaron a 37 °C. Los cultivos durante la noche se diluyeron 1: 100 en cultivos de 3 x 1 L de LB 100 pg/ml de ampicilina y se cultiva con agitación a aproximadamente 250 RPM a un OD600 de aproximadamente 0,8. La expresión de la proteína se indujo luego mediante la adición de 1 mM de IPTG. Los cultivos continuaron la incubación durante 2 horas a 37 °C con agitación. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación y se congelaron a -20 °C.
Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 ml de PBS, pH 7,4 (Invitrogen) y se lisaron mediante microfluidización (Microfluidics Modelo M-110P) a 20,000 psi y el lisado bruto se clarificó mediante centrifugación a 27,000 xg durante 10 min. a 4 °C. El sobrenadante resultante se cargó en una columna GSTrap FF (GE Healthcare) y GST-AT1 -50 y la fracción soluble de GST-AT51-293 se purificó siguiendo las instrucciones del fabricante. La fracción GST-AT51 -293 insoluble se purificó a partir de los sedimentos celulares insolubles. El material insoluble se solubilizó durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente, con balanceo suave, en guanidina-HCl 3 M en fosfato de sodio 25 mM, pH 7,4. El material solubilizado se diluyó 7 veces con tampón de replegamiento A [25 mM de fosfato de sodio, pH 7,4 con 2 M de guanidina-HCl]. GST-AT51-293 se replegó mediante diálisis gradual. Se añadió un volumen igual de tampón de replegamiento B [Fosfato de sodio 25 mM, pH 7,4] al vaso de diálisis después de cada 12-15 horas de diálisis a 4 °C para una concentración de guanidina de aproximadamente 2, 1, luego 0,5 M. GST -AT51-293 se dializó luego contra el replegamiento del tampón B durante 24 horas. El dializado final se aclaró por centrifugación y la fracción soluble se purificó sobre una columna GSTrap como se describió anteriormente.
Ensayos Dot Blot
Los péptidos superpuestos que abarcan el aminoácido 40 a 293 se sintetizaron químicamente (New England Peptide). Se intentó la síntesis de AT1-50 pero no tuvo éxito. La toxina alfa (AT), los péptidos AT y los fragmentos AT (1 pg) se mancharon en nitrocelulosa y se bloquearon durante 10 minutos con bloqueador de caseína en PBS. Luego se sondearon las transferencias con 2 pg/ml de la IgG individual durante 3 horas a temperatura ambiente. Las transferencias se lavaron e incubaron con una IgG anti-ratón de cabra anti-ratón o cabra conjugada con fosfatasa alcalina (1: 1000, Caltag Laboratories) durante 1 hora y se revelaron utilizando el sistema de sustrato de fosfatasa de membrana BCIP/NBT (KPL, Inc).
Caracterización por ELISA de la unión de LC10 YTE a toxina alfa y LukF-PV
El lisado bacteriano que contenía toxina alfa marcada con His o LukF-PV se recubrió sobre la superficie de una placa de 96 pozos durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron seis veces con PBS/Tween 20 al 0,05 % y se bloquearon con un 10 % de tampón de bloqueo Superblock (Pierce, Rockford, Ill.) A 37 °C durante 1 h. Se añadió LC10 YTE o mAb anti-His de ratón a 2 pg/ml (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) A los pozos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. La YTE LC10 unida o el mAb anti-His de ratón se detectaron utilizando un conjugado de HRP anti-IgG humana o anti-ratón (Jackson ImmunoResearch laboratories, Inc. West Grove, Pa.), respectivamente.
G e n e ra c ió n d e v a r ia n te s q u im é r ic a s e n tre la to x in a a lfa y L u k F -P V
S e g e n e ra ro n v a r ia n te s q u im é r ic a s c o m p u e s ta s d e p o rc io n e s d e to x in a a lfa y L u k F -P V p a ra id e n tif ic a r la re g ió n d e u n ió n d e L C 10 Y T E en to x in a a lfa . L a s c o n s tru c c io n e s d e A D N d e s e is v a r ia n te s q u im é r ic a s d e to x in a s a lfa q u e c o d if ic a n re g io n e s L u k F -P V e n a a 1 -51 , a a 52 -110 , a a 111 -147 , a a 148 -205 , a a 204 -241 o a a 248 -293 s e g e n e ra ro n p o r s ín te s is g é n ic a . L a s c o n s tru c c io n e s d e A D N q u e c o d if ic a n la s o tra s v a r ia n te s q u im é r ic a s s e c re a ro n m e d ia n te P C R d e e x te n s ió n s u p e rp u e s ta u t i l iz a n d o un p lá s m id o p E T 3 d q u e c o d if ic a to x in a a lfa o L u k F -P V (p lá s m id o s in te rn o s ) c o m o p la n til la s . T o d a s la s c o n s tru c c io n e s d e A D N s e c lo n a ro n lu e g o e n e l v e c to r d e e x p re s ió n b a c te r ia n a p E T 3 d (E M D C h e m ic a ls Inc , F ila d e lf ia , P A ) y s e t r a n s fo r m a r o n e n la c e p a B L 21 d e E. c o li (D E 3 ) ( In v it ro g e n , C a r ls b a d , C a lifo rn ia ) . L a s c é lu la s B L21 tra n s fo rm a d a s (D E 3 ) se c u lt iv a ro n en e l m e d io d e e x p re s ió n d e E. c o li M a g ic M e d ia ( In v itro g e n , C a r ls b a d , C a lifo rn ia ) p a ra e x p re s a r la s p ro te ín a s v a r ia n te s u t i l iz a n d o p ro to c o lo s e s tá n d a r .
C a ra c te r iz a c ió n d e la s c a ra c te r ís t ic a s d e u n ió n d e L C 10 Y T E a v a r ia n te s q u im é r ic a s u t i l iz a n d o P ro te O n
L a s c a ra c te r ís t ic a s d e u n ió n d e L C 10 Y T E a la s v a r ia n te s q u im é r ic a s d e to x in a a lfa /L u k F -P V se e s tu d ia ro n u til iz a n d o un in s tru m e n to P ro te O n X P R 36 (B io R a d , H e rc u le s , C A ). S e u tiliz ó un a c o p la m ie n to d e a m in a e s tá n d a r p a ra in m o v iliz a r un a n t ic u e rp o p o lic lo n a l a n t i- to x in a a lfa (a n t ic u e rp o g e n e ra d o e n e l s it io ) en a c e ta to d e s o d io 10 m M [p H 5 ,0 ] a la s u p e r f ic ie d e un c h ip b io s e n s o r G L C a a p ro x im a d a m e n te 5000 u n id a d e s d e re s o n a n c ia (R U ) p a ra c a d a c a n a l. L a s p ro te ín a s q u im é r ic a s to x in a a lfa /L u k F -P V en s o b re n a d a n te d e lis a d o b a c te r ia n o se in y e c ta ro n en la s u p e r f ic ie G L C in m o v iliz a d a p a ra o b te n e r u n a re s p u e s ta d e c a p tu ra d e a p ro x im a d a m e n te 200 R U . E l s o b re n a d a n te d e lis a d o b a c te r ia n o n o t r a n s fo rm a d o ta m b ié n se in y e c tó en la s m is m a s c o n d ic io n e s q u e un c a n a l d e re fe re n c ia . L a s m u e s tra s d e L C 10 Y T E se p re p a ra ro n e n s o lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a c o n fo s fa to (P B S ) (p H 7 ,4 ), T w e e n -20 a l 0 ,005 % , y se in y e c ta ro n a 90 p L /m in d u ra n te 150 o 180 s e g u n d o s a c o n c e n tra c io n e s q u e o s c ila n e n tre 50 nM y 3 ,125 nM . S e u t iliz a ro n 600 o 800 s e g u n d o s d e t ie m p o d e d is o c ia c ió n . L o s n iv e le s d e e x p re s ió n d e las v a r ia n te s q u im é r ic a s ta m b ié n s e m o n ito r iz a ro n d e s p u é s d e la in y e c c ió n d e L C 10 Y T E d e la s ig u ie n te m a n e ra : lo s a n t ic u e rp o s p o lic lo n a le s a n t i- to x in a a lfa se h ic ie ro n f lu ir a 90 p L /m in d u ra n te 150 o 180 s e g u n d o s a c o n c e n tra c io n e s q u e o s c ila n e n tre 50 nM y 3 ,125 nM c o n un t ie m p o d e d is o c ia c ió n d e 600 o 800 s e g u n d o s . L a s u p e rf ic ie s e re g e n e ró d o s v e c e s in y e c ta n d o g lic in a (10 m M , p H 1 ,5 ) a 100 p L /m in d u ra n te 30 s e g u n d o s . T o d o s lo s d a to s d e s e n s o rg ra m a s e p ro c e s a ro n c o n e l s o f tw a re P ro te O n M a n a g e r 3.0.1
E je m p lo 2: G e n e ra c ió n d e m A b d e A n t i T o x in a A lfa
S e g e n e ra ro n a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s (m A b ) a n t i- to x in a a lfa (A T ) en ra to n e s V e lo c Im m u n e q u e se d is e ñ a ro n g e n é t ic a m e n te p a ra c o n te n e r un re p e r to r io d e a n t ic u e rp o s c o n re g io n e s v a r ia b le s c o m p le ta m e n te h u m a n a s fu s io n a d a s c o n e l d o m in io c o n s ta n te d e m u r in o . L o s a n t ic u e rp o s re s u lta n te s s o n q u im e ra s d e h u m a n o :ra tó n q u e se c o n v ie r te n fá c i lm e n te e n Ig G c o m p le ta m e n te h u m a n a a l fu s io n a r g e n é t ic a m e n te e l d o m in io v a r ia b le h u m a n o d e l m A b q u im é r ic o c o n la s re g io n e s c o n s ta n te s d e u n a Ig G -1 h u m a n a c lo n a d a . L o s ra to n e s se in m u n iz a ro n c o n un m u ta n te A T no h e m o lít ic o (A T h35l ), d e s c r ito en e s te d o c u m e n to , y lo s h ib r id o m a s s e g e n e ra ro n u t i l iz a n d o m é to d o s e s tá n d a r . In ic ia lm e n te , s e d e s c u b r ió q u e m á s d e 1800 s o b re n a d a n te s d e h ib r id o m a s c o n te n ía n Ig G q u e s e u n ía a A T ( rA T -h is ) re c o m b in a n te p o r a n t íg e n o E L IS A . L o s s o b re n a d a n te s d e h ib r id o m a q u e m o s tra ro n u n ió n a rA T -h is s e e x a m in a ro n p a ra d e te r m in a r su a c t iv id a d m e d ia n te la in h ib ic ió n d e la lis is m e d ia d a p o r rA T -h is d e g ló b u lo s ro jo s d e c o n e jo (R B C ) e n un e n s a y o h e m o lít ic o , p o r lo q u e el c o n ju n to d e m A b fu n c io n a le s se re d u jo a a p ro x im a d a m e n te 250. L o s s o b re n a d a n te s d e h ib r id o m a se n o rm a liz a ro n e n to n c e s p a ra lo s n iv e le s d e Ig G y se c o m p a ra ro n s u s a c t iv id a d e s in h ib ito r ia s . T re c e d e lo s in h ib id o re s d e rA T -h is m á s p o te n te s se s e le c c io n a ro n p a ra la c lo n a c ió n p o r d ilu c ió n lim ita d a y s e u t iliz a ro n p a ra la e x p re s ió n y p u r if ic a c ió n d e Ig G a p e q u e ñ a e s c a la . T ra s la s e le c c ió n d e e s to s c lo n e s y la p o s te r io r c a ra c te r iz a c ió n b io q u ím ic a e in v iv o , c o m o s e d e s c r ib e a c o n tin u a c ió n , la s s e c u e n c ia s V h y V l s e o p t im iz a ro n a ú n m á s p a ra g e n e ra r a n t ic u e rp o s a d ic io n a le s , c o m o s e in d ic a a c o n t in u a c ió n e n la T a b la 7.
E je m p lo 3: In h ib ic ió n d e la a c t iv id a d c ito lít ic a
L a s a c t iv id a d e s in h ib ito r ia s d e la s 13 Ig G a n t i-A T p u r if ic a d a s s e c o m p a ra ro n e n un e n s a y o h e m o lít ic o . L o s m A b a n ti-A T p u r if ic a d o s s e t itu la ro n en un e n s a y o h e m o lít ic o e n p re s e n c ia d e c a n t id a d e s c o n s ta n te s d e n A T y g ló b u lo s ro jo s de c o n e jo . L o s m A b s e v a lo ra ro n c a d a u n o a p a r t ir d e a p ro x im a d a m e n te 20 p g /m l e n p re s e n c ia d e u n a c a n tid a d c o n s ta n te d e A T n a tiv o (n A T ) y g ló b u lo s ro jo s d e c o n e jo (R B C ). La h e m ó lis is se m id ió p o r la l ib e ra c ió n d e h e m o g lo b in a en el s o b re n a d a n te . E l p o rc e n ta je (% ) d e in h ib ic ió n d e la h e m ó lis is se c a lc u ló c o m o s ig u e : % d e in h ib ic ió n = 100 * [100 - (A 490 n A T A b ) / (A 490 n A T no A b )]. L o s e n s a y o s h e m o lít ic o s re p re s e n ta t iv o s q u e d e m u e s tra n lo s t re c e in h ib id o re s d e R A T -h is m á s p o te n te s s e m u e s tra n e n la s F ig s . 1 A y 1B . S e in c lu y ó u n c o n tro l d e Ig G n o e s p e c íf ic o (R 347 ) c o m o c o n tro l n e g a tiv o .
S o lo 7 d e los 13 m A b p u r if ic a d o s (m A b ; 2 A 3.1 , 10 A 7.5 , 11 D 12.1 , 12 B 8.19 , 15 B 6.3 , 25 E 9.1 y 28 F 6.1 ) in h ib ie ro n la lis is d e R B C m e d ia d a p o r n A T (v é a n s e la s F ig u ra s 1 A y 1B ). T re s d e lo s a n t ic u e rp o s (2 A 31., 10 A 7.5 y 12 B 8.19 ) fu e ro n in h ib id o re s p o te n te s y m o s tra ro n a p ro x im a d a m e n te un 80 % d e in h ib ic ió n d e la lis is d e R B C m e d ia d a p o r n A T e n u n a p ro p o rc ió n 1: 1 (m o le Ig G : m o le A T ). E s to s re s u lta d o s s u g ir ie ro n q u e lo s m A b g e n e ra d o s p u e d e n in h ib ir la fo rm a c ió n d e p o ro s e n lo s g ló b u lo s ro jo s d e lo s c o n e jo s .
L o s e r it ro c ito s h u m a n o s n o p o s e e n u n a g ra n c a n tid a d d e re c e p to re s p a ra A T . E n c o n s e c u e n c ia , lo s R B C h u m a n o s no son tan sensibles como los RBC de conejo a la lisis mediada por nAT y probablemente no sean un objetivo primario para la AT durante una infección. Otros tipos de células (por ejemplo, epiteliales, linfocitos, monocitos y macrófagos) son objetivos más relevantes para los efectos de la NAT durante una infección estafilocócica. La actividad de los anticuerpos purificados se examinó en la lisis mediada por nAT de las estirpes celulares humanas, A549 (estirpe celular epitelial alveolar) y THP-1 (estirpe celular monocítica). Los anticuerpos monoclonales (mAb) se valoraron frente a un nivel constante de nAT en presencia de células A549 o THP-1. La lisis celular se cuantificó mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) y se determinó el % de inhibición de la liberación de LDH, como se describe en el presente documento. Los resultados se muestran gráficamente en las Figs. 2A y 2B. Los mAb que inhibieron la lisis de RBC de conejo también inhibieron la lisis mediada por nAT de células A549 y THP-1 humanas (véanse las Figuras 2A y B, respectivamente) con la excepción de 11D12.1 que inhibió la lisis de las células A549 y no tuvo efecto en la nAT Lisis mediada de células THP-1. La potente actividad anti-AT mostrada por estos mAb resalta la utilidad potencial de estos anticuerpos para inhibir la actividad AT durante una infección, lo que limita la progresión de los síntomas y enfermedades relacionados con estafilococos.
Ejemplo 4: Inmunización pasiva con mAb anti-AT reduce las lesiones dermonecróticas
S. aureus es una de las principales causas de infecciones de la piel y tejidos blandos (SSTI) tanto en el hospital como en la comunidad, que a menudo se caracterizan por inflamación, daño tisular y formación de pus. La AT puede cumple una función en estas infecciones que conducen a una respuesta hiperinflamatoria y el daño tisular y la inhibición de la función de la TA limitarían entonces la capacidad de las bacterias para causar enfermedades graves. Para determinar la utilidad de los mAb anti-AT para minimizar, reducir o eliminar los efectos de la infección por S. aureus, se inyectaron intraperitonealmente (IP) grupos de 5 ratones con cada uno de los 7 mAb inhibidores (por ejemplo, aproximadamente 5 mg/kg) y un control de isotipo IgG-1 (R347) control 24 horas antes de la infección subcutánea con S. aureus Wood. El tamaño de las lesiones dermonecróticas se midió diariamente durante 6 días y se documentó fotográficamente, como se muestra en la FIG. 3A (día 6 mostrado en la FIG. 3A). Los 5 inhibidores in vitro más potentes de la función nAT (2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 y 28F6.1), redujeron sustancialmente el tamaño de la lesión en relación con el control R347 mientras que los mAb menos potentes, in vitro (11D12.1, 15B6.3), no tuvo un efecto sustancial sobre el tamaño de la lesión en relación con el control, como se muestra en las Figs. 3A y 3B. La Figura 3B ilustra gráficamente la disminución en el tamaño de la lesión con el tiempo. 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 y 28F6.1 son potentes inhibidores de la función AT in vitro y también muestran un potente efecto profiláctico en un modelo murino de SSTI. Los anticuerpos adicionales, LC10, QD 20, QD33 y QD37 también se probaron en el modelo de dermonecrosis. Estos anticuerpos monoclonales se inyectaron intraperitonealmente (IP) en cinco ratones por grupo a 1 y 0,5 mg/kg 24 horas antes de la infección subcutánea con S. aureus Wood como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en las Figs. 17 A y B). Los valores de p se calcularon utilizando la prueba posterior de Dunnett. Para los experimentos de 1 mg/kg, el valor de p para el control de R347 en comparación con la prueba Abs fue p <0,0001. Para los experimentos de 0,5 mg/kg, el valor de p para el control de R347 en comparación con el Abs de prueba fue p <0,05.
Ejemplo 5: La inmunización pasiva con mAb anti-AT mejora la supervivencia en la neumonía murina
La profilaxis con los mAb anti-AT más potentes generados se probó en un modelo de neumonía murina. Los ratones C57BL/6J se inmunizaron pasivamente con aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg y aproximadamente 45 mg/kg de 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19 o 28F6.1, veinticuatro horas antes de la administración intranasal. infección por S. aureus USA300 (BAA-1556). La supervivencia se controló durante 6 días y se comparó con un control de isotipo (R347) a 45 mg/kg, como se muestra en las Figs. 4-7. La significación estadística se calculó utilizando la prueba log-rank. La Figura 4 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infección por S. aureus después de la inmunización pasiva con varias cantidades de mAB 12B.19. La Figura 5 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infección por S. aureus después de la inmunización pasiva con varias cantidades mAB 2A3.1. La Figura 6 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infección por S. aureus después de la inmunización pasiva con varias cantidades mAB 28F6.1. La Figura 7 ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infección por S. aureus después de la inmunización pasiva con varias cantidades mAB 10A7.5.
Todos los anticuerpos anti-AT mostrados dieron como resultado una mejora significativa en la supervivencia en relación con el control, lo que lleva a una supervivencia de al menos el 90 % con la dosis de 45 mg/kg (ver Figuras 4­ 7). Se considera que la toxina alfa es un determinante clave de la virulencia en la neumonía estafilocócica. Los resultados presentados aquí ilustran que la administración pasiva de mAb inhibidores potentes es un enfoque válido para la prevención de enfermedades. Tomados en conjunto, los estudios en animales presentados en el presente documento apoyan el papel de la AT en la enfermedad estafilocócica y proporcionan apoyo para el uso de mAb que inhiben la función de la AT para limitar la gravedad de la enfermedad o incluso la muerte asociada con una infección por S. aureus.
Para caracterizar aún más el impacto de un mAb anti-AT en el número de bacterias durante una infección, se administró profilácticamente una versión completamente humana de mAb 2A3.1 (por ejemplo, 2A3hu) a ratones 24 horas antes de la infección intranasal con aproximadamente 1,3 * 108 cfu (forma siglada de colony forming units, unidades formadoras de colonias) de S. aureus USA300. Cuarenta y ocho horas después de la infección, los ratones se sometieron a eutanasia y se recogieron sus pulmones y riñones y se procesaron para la enumeración bacteriana (véanse las Figuras 8A y 8B). 4 y 24 horas después de la infección, los ratones se sometieron a eutanasia y se tomaron muestras para medir la producción de citoquinas (descritas a continuación y ver la Figura 9) y para el análisis histopatológico (descrito a continuación y ver la Figura 10). Los valores de p se calcularon utilizando la prueba posterior de Dunnett. Los resultados representativos de la enumeración bacteriana se presentan en las Figs. 8A y 8B. La administración profiláctica de 2A3hu produjo una reducción significativa en el número de bacterias tanto en los pulmones (vea la Figura 8A) como en los riñones (vea la Figura 8B) en relación con el control de R347, lo que indica que la inhibición de la función AT puede limitar la progresión de la enfermedad y también limitar la propagación sistémica del organismo invasor.
También se probaron anticuerpos adicionales, LC10, QD 20, QD33 y QD37 en el modelo de neumonía. Estos anticuerpos monoclonales se inyectaron intraperitonealmente (IP) en diez ratones por grupo a 5 mg/kg 24 horas antes de la infección intranasal (IN) con aproximadamente 2 * 108 ufc de S. aureus USA300. Los resultados de estos experimentos se muestran en la FIG. 18. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba posterior de Dunnett. El valor de p para el mAb 2A3 en comparación con QD37 fue p = 0,0072; el valor p para el mAb 2A3 en comparación con LC10 fue p = 0,0523; el valor p para el mAb 2A3 en comparación con QD33 fue p = 0,0521.
Ejemplo 6: La inhibición de la AT en el modelo de neumonía reduce la producción de citoquinas proinflamatorias
La infección por neumonía por S. aureus suele ir acompañada de una sobreproducción de citoquinas proinflamatorias que se considera conducen a un aumento de la activación y la infiltración de las células inmunitarias, lo que finalmente lleva a un aumento de la congestión y necrosis tisular (Bubeck Wardenburg, J. 2007). Se ha demostrado que un mutante de deleción de S. aureus AT exhibe una virulencia reducida en relación con su S. aureus de tipo silvestre isogénico en el modelo de neumonía murina. Se demostró además que la inmunización activa y pasiva contra la AT redujo la expresión de IL-1p, un mediador conocido de la lesión pulmonar aguda, y protegió a los ratones de la neumonía grave (Bubeck Wardenburg, J. 2007; Bubeck Wardenburg, J. 2008). Estos resultados sugieren que la inhibición de la AT durante la infección por S. aureus puede reducir la producción de citoquinas proinflamatorias y, por lo tanto, limitar la infiltración celular excesiva, con el resultado final de que son menos síntomas de neumonía y un mayor aclaramiento bacteriano como se vio anteriormente.
Para probar esta hipótesis, los ratones se inmunizaron pasivamente con 2A3hu 24 horas antes de la infección intranasal con aproximadamente 1,3 * 108 ufc de S. aureus USA300. Cuatro y veinticuatro horas después de la infección, los ratones se sometieron a eutanasia y la mitad del pulmón se fijó y preparó para la tinción con hematoxilina y eosina y el examen microscópico, mientras que el líquido de lavado broncoalveolar se recogió del otro lado y se procesó para determinar los niveles de citoquinas. Los resultados representativos de la producción de citoquinas después de la inmunización pasiva se muestran en la FIG. 9. La Figura 10 ilustra fotográficamente la efectividad de la inmunización pasiva con mAb descritos en este documento.
Cuatro horas después de la infección los niveles de citoquinas fueron similares en ratones tratados con R347 y 2A3hu, sin embargo, a las 24 horas posteriores a la infección, los niveles de IL-6, TNF-a, KC e IL-1p se redujeron en los animales tratados con 2A3hu, como se muestra en la FIG. 9 (ver los resultados en un círculo en el punto de tiempo de 24 horas), lo que indica que la administración profiláctica de 2A3hu resultó en niveles reducidos de citoquinas detectadas, con respecto al control. Estos datos están respaldados por los resultados del examen histopatológico del pulmón en el que los ratones tratados con R347 tenían una inflamación pulmonar prominente, necrosis y alveolitis junto con la presencia de colonias bacterianas (ver imágenes superior izquierda e inferior izquierda en la Figura 10). En contraste, los animales tratados con 2A3hu tenían una inflamación pulmonar limitada sin necrosis, alveolitis o colonias bacterianas visibles (vea las imágenes superior derecha e inferior derecha en la Figura 10). El efecto protector de los mAb anti-AT en el modelo de neumonía está asociado con una respuesta inflamatoria reducida que puede limitar el daño tisular local y promover el aclaramiento bacteriano.
Ejemplo 7: Cinética de unión y competición.
Las mediciones de afinidad se llevaron a cabo utilizando resonancia de plasmón superficial (SPR), para caracterizar aún más los mAb que mostraron una potente actividad inhibitoria. La IgG purificada se capturó en un sensor utilizando IgG anti-ratón de rata y el chip se expuso a soluciones que tenían diferentes concentraciones de nAT. Se midieron las constantes de velocidad de asociación y disociación, a partir de las cuales se determinaron las constantes de unión. Los anticuerpos 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 y 12B8.19 tenían afinidades similares con valores Kd de 601, 504, 337 y 485 pM respectivamente, mientras que 28F6.1 exhibió un valor Kd de 13 nM, como se muestra en la tabla abajo. Kd se calculó como koff/kon.
Figure imgf000046_0001
continuación
Figure imgf000047_0001
Los experimentos de competencia también se realizaron utilizando SPR, cuyos resultados sugieren que los anticuerpos 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 y 12B8.19 probablemente se unen al mismo epítopo o similar.
Los valores de IC50 y Kd se muestran para los mAb QD 20, LC10, QD33, QD37 y 2A3GL a continuación
Figure imgf000047_0002
La IC50 se calculó utilizando el ensayo hemolítico de RBC con toxina alfa de S. aureus a 0,1 mg/ml. Ejemplo 8: Formación de bloques inhibidores de mAb de heptámero resistente a SDS
Se considera que la toxina alfa (AT) de S. aureus lisa las células en un proceso de múltiples etapas en el que una molécula de AT monomérica soluble secretada se une a un receptor de la superficie celular, o se adsorbe de manera no específica a las membranas celulares, oligomeriza en un antiporo heptamérico en la superficie celular y experimenta un cambio conformacional que conduce a la formación de un barril p transmembrana de 14 cadenas que media la posterior lisis de la célula diana. El mecanismo de inhibición por los mAb descritos en el presente documento se caracterizó adicionalmente para determinar en qué etapa los mAb inhibidores bloquearon la función AT. Se examinó la capacidad de estos mAb para prevenir la unión de AT a fantasmas de RBC de conejo unidos a una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos. Las placas de ELISA de 96 pozos se recubrieron con fantasmas de glóbulos rojos y se bloquearon con BSA al 2 %. Los fantasmas fueron incubados con nAT /- un exceso de 20 molar de IgG anti-AT. Entonces se detectó la unión de nAT con IgG anti-AT de conejo y se calculó el % de unión; % de unión = 100 * [100-(A490 nAT mAb)/(A490 nAT no mAb)]. En un exceso de IgG de 20 molar, no hubo inhibición de la unión de nAT a membranas de glóbulos rojos de conejo, como se muestra en la FIG. 11, lo que indica que estos mAb inhibidores no estaban actuando en la etapa de unión del receptor.
Además de las membranas celulares, se ha demostrado que AT y otras toxinas formadoras de poros se ensamblan fácilmente y forman poros en las membranas de los liposomas. Inicialmente, el efecto de la IgG anti-AT en la formación de heptámero AT se probó en liposomas. Después de la incubación de AT con un exceso molar de 10 veces de liposomas (lípido: AT, peso:peso), en presencia de IgG, se examinó la formación de heptámero mediante análisis de transferencia Western, como se muestra en la FIG. 12. Las muestras se solubilizaron luego en tampón de muestra SDS-PAGE a 37 °C y la formación de heptámero se detectó mediante análisis de transferencia Western. La presencia del heptámero resistente a SDS es evidente en la parte superior del gel mostrado en la FIG. 12, en los carriles 6 y 7 (por ejemplo, mAb9D7.3 y sin carril de control de IgG, respectivamente). Todos los mAb inhibidores eliminaron la formación de heptámero, mientras que un control de isotipo irrelevante (por ejemplo, Línea 6; 9D7.3) no tuvo ningún efecto. La inhibición de la actividad de oligomerización se confirmó utilizando mAb 2A3.1, 10A7.5 y 12B8.19 en un ensayo de oligomerización en fantasmas de conejo RBC, como se ilustra en las transferencias Western representativas mostradas en las Figs. 13A y 13B. AT se incubó con una titulación de IgG antes de la incubación con fantasmas de eritrocitos de conejo y la detección de la formación de heptámero por SDS-PAGE. Los AcM 2A3.1, 10A7.5 y 12B8.19 inhibieron eficazmente la formación de heptámero AT incluso en una proporción de IgG: toxina (mol: mol) 1: 1 y el efecto de inhibición de la oligomerización se valoró a medida que se redujeron los niveles de AcM (ver Fig. 13A y 13B; aparición de heptámero en proporciones molares de 0,5: 1 y 0,25: 1). Estos resultados sugieren que los mAb 2A3.1, 10A7.5 y 12B8.19 previenen la lisis celular mediada por AT mediante la inhibición de la formación de heptámero resistente a SDS.
Ejemplo 9: Conversión a IgG completamente humana
Una IgG completamente humana incluye los dominios variables de las cadenas pesada (Vh ) y ligera (Vl) de los mAb quiméricos descritos en este documento, fusionados genéticamente a los dominios constantes de una IgG-1 humana. Los Vh y Vl de cada uno de los mAb quiméricos se clonaron, se secuenciaron y se fusionaron con los dominios constantes de IgG-1 Vh humana y kappa humano, respectivamente. Se demostró que las IgG-1 completamente humanas resultantes retienen la región variable humana responsable y las propiedades de unión del mAb de interés. Los anticuerpos completamente humanos se expresaron, se purificaron y su actividad se comparó con los mAb quiméricos aislados de los hibridomas de ratón VelocImmune. Los mAb completamente humanos mostraron una potencia similar a la de las quimeras originales en la inhibición de la lisis de células RBC, A549 y THP-1, con la excepción de 25E9.1hu, que se hizo sustancialmente más potente que la quimera original 25E9.1. Las figuras 14-16 ilustran gráficamente la inhibición de la liberación de LDH, característica de la lisis celular, en los glóbulos rojos (RBC; ver Figura 14), células A549 (ver Figura 15) y células THP-1 (ver Figura 16). El aumento en la potencia del mAb 25E9.1 humano (por ejemplo, 25E9.1hu) puede deberse a una población de células mixtas en el hibridoma original que contenía 2 moléculas distintas de IgG anti-AT, solo una de las cuales puede tener la actividad que Función NAT inhibida. Por lo tanto, los cálculos de molaridad y las mediciones de actividad para el mAb de la quimera original pueden no tener una correlación directa.
Ejemplo 10: Secuencias representativas de aminoácidos y nucleótidos para anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de S. aureus
Tabla 1 n i DR L r mA 2A 1 1 A 12B 1 25E9.1
Figure imgf000048_0004
T l 2 n i DR L r mAB 2 F 1
Figure imgf000048_0005
^
Figure imgf000048_0006
^
Figure imgf000048_0003
T l n i DR H r l mA 2 F 1
Figure imgf000048_0001
T l n i DR H r l mA 2 E 1
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0001
(continuación)
Figure imgf000060_0001
(continuación)
Figure imgf000061_0001
Tabla 9: Tabla de resumen de CDR de VL y VH
Figure imgf000062_0001
Table 10: Secuencias de Aminoácido de Toxina Alfa
Figure imgf000062_0002
Ejemplo 11: Mapeo de las regiones de unión de los anticuerpos anti toxina alfa estafilocócicos
Se construyeron variantes quiméricas, compuestas de porciones de toxina alfa y LukF-PV, para identificar el fragmento de toxina alfa al que se une un anticuerpo correspondiente al mAb LC10 que contiene una variante de Fc (LC10 YTE). LukF-PV se eligió como el compañero quimérico porque LC10 YTE no lo reconoce (Figura 19), pero comparte una alta similitud estructural (Gouaux, E., M. Hobaugh, et al. “alpha-Hemolysin, gamma-hemolysin, and leukocidin from Staphylococcus aureus: distant in sequence but similar in structure” Protein Sci 6(12): 2631-5 (1997); Meesters, C., A. Brack, et al. “Structural characterization of the alpha-hemolysin monomer from Staphylococcus aureus." Proteins 75(1): 118-26 (2009)) y 25 % de identidad de secuencia con toxina alfa (Figura 20). Se construyeron una serie de variantes quiméricas mediante la sustitución sistemática de 50 aminoácidos toxina alfa (aa) por sus correspondientes homólogos de LukF-PV. También se reemplazaron las regiones más cortas dentro de segmentos seleccionados de 50 aa de interés (Tabla 11). Se empleó un instrumento ProteOn para analizar la afinidad de unión de LC10 YTE a estas variantes. Los resultados de unión de LC10 YTE a las variantes se resumen en la Tabla 11.
Tabla 11 Perfiles de unión de LC10 YTE a las variantes uiméricas de alfa toxina/LukF-PV
Figure imgf000062_0003
continuación
Figure imgf000063_0001
Todas las construcciones quiméricas podrían expresarse en algún nivel con la excepción de KO -73-81, (Tabla 11). LC10 YTE no se unió a las variantes que codifican LukF-PV en lugar de aa 101-110 de toxina alfa (KO — 52-110 y k O -101-110) o aa 224-231 (KO — 204-241, KO — 204 -231 y KO — 224-231). La unión de LC10 YTE se deterioró significativamente o se interrumpió por completo al reemplazar aa 248-277 (KO — 248-277) o su segmento más grande aa 248-293 (KO — 248-293), respectivamente.
En ciertos casos, una aparente falta de unión a YTE LC10 puede explicarse por variantes individuales de toxina alfa/LukF-PV que muestran un plegamiento incorrecto. Una incapacidad general para plegarse correctamente también puede explicar la aparente falta de expresión de KO 73-81. Además, la homología de la secuencia de aminoácidos entre la toxina alfa y LukF-PV varía sustancialmente en diferentes regiones. Por ejemplo, el segmento correspondiente a un 179-193 de toxina alfa comparte una identidad del 67% con LukF-PV, mientras que la secuencia completa comparte una identidad del 25%. Por lo tanto, aunque no se observó ningún efecto en la unión a YTE con LC10 cuando se intercambiaban regiones de homología de secuencia alta, estas regiones podrían potencialmente contener secuencias adicionales a las que se une el anticuerpo con YTE a LC10.
Los resultados del análisis de mutagénesis anterior indican que la sustitución de cualquiera de las tres regiones de aa 101-110, aa 224-231 y 248-293 de toxina alfa con residuos de LukF-PV dañó la unión de LC10 YTE, mientras que reemplaza las regiones aa restantes No tuvo un impacto significativo.
Estas tres regiones representan dos ubicaciones diferentes en la estructura tridimensional de la toxina alfa. Los segmentos correspondientes a aa 101-110 y 224-231 están en proximidad espacial y localizados en un lado de un dominio de intercalación Beta, mientras que el segmento correspondiente a aa 248-277 está ubicado principalmente en el dominio “Aro” (Song, L., MR Hobaugh, et al., “Estructura de estafilococo alfa-hemolisina, un poro de transmembrana heptamérico”. Science 274 (5294): 1859-66 (1996)) (Figura 21).
El segmento correspondiente a aa 248-277 mostró impacto en la unión y también contenía los residuos de contacto estructural de rayos X identificados como que comprendían aa 261-272 (en la que T263, N264 y K266 son residuos de contacto reales) (Figura 20). Además, la estructura cristalina reveló otro segmento correspondiente a aa 173-201 en el que D183, W187 y N188 son residuos de contacto reales (Figura 20). La variante quimérica que contenía este segmento en particular (KO -148-205) todavía mostraba una buena unión a LC10 YTE. Esto es probablemente atribuible a la alta homología de secuencia de esta región particular (52 % de identidad y 63 % de similitud) entre la toxina alfa y LukF-PV. Los aminoácidos alrededor de los residuos de contacto (aa 179-193) comparten una homología aún mayor (67 % de identidad), mientras que, en contraste, la secuencia completa comparte solo el 25 % de identidad.
Usando el enfoque basado en mutagénesis, el segmento correspondiente a aa 248-277 se identificó como importante para la unión de LC10 YTE. Esto se confirmó aún más mediante el análisis estructural de la estructura del complejo LC10 YTE/toxina alfa. El análisis estructural también reveló ciertos residuos de contacto dentro del fragmento aa 248­ 277 que están presentes dentro de aa 261-272.
Como se discutió anteriormente, se llevaron a cabo experimentos de cristalografía de rayos X para determinar los residuos de contacto del mAb YTE LC10. La a-toxina purificada (residuos 1 a 293) y LC10 YTE Fab se concentraron por separado. Cantidades casi equimolares de estas proteínas se mezclaron y la solución se sometió a cromatografía de filtración en gel en la columna Sephadex S75 (GE Healthcare). El pico eluido contenía ambas moléculas de proteína unidas entre sí. La concentración y la cristalización adicionales produjeron cristales que se difractaron a 2,5 A.
La estructura del complejo se resolvió utilizando el método de reemplazo molecular. La estructura Fab determinada previamente (D25) con unas regiones eliminadas de la complementariedad eliminada se usó como una plantilla para LC10 YTE Fab. El monómero de la molécula de a-toxina derivada de un complejo heptamérico (PDB Id. 7AHL) con algunos truncamientos se utilizó como plantilla para la molécula de a-toxina. La secuencia de la molécula de toxina alfa utilizada para la investigación cristalográfica corresponde a la de la SEQ ID NO: 39. Se identificaron dos complejos por unidad asimétrica del complejo LC10 YTE-a-toxina usando un programa Phaser del conjunto de programas CCp4. El modelo de la estructura se refinó aún más utilizando un programa Refmac del conjunto de programas CCP4. La construcción manual y las mejoras del modelo iterativo se realizaron utilizando el programa cristalográfico específico “O”.
Se encontró que tanto las cadenas pesadas como las ligeras del Fab estaban en contacto con la molécula de toxina a (Figura 22). En particular, los estudios de cristalografía determinaron residuos de contacto dentro de la molécula de toxina alfa que correspondían a lo siguiente para las cadenas pesadas y ligeras: N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W l87, N188, P189, Vl9o, Y191 y R200. Además, se determinó que la cadena ligera tenía contactos con T261, T263, N264, K266 y K271. Los paratopes se identificaron como: LC-W32 (CDR1), K50 (CDR2), Y91, A92, N93, Y94, W95 (CDR3); HC-D33 (CDR1), T53, A54, D56, Y58 (CDR2), D98, Y100, P102, T103, G104, H105, Y106 (CDR3).
El modelado molecular que incorpora los datos estructurales del análisis cristalográfico reveló que la mayor parte de la estructura de la toxina a se mantuvo sin cambios durante la transición del estado monomérico al estado heptamérico. Sin embargo, se demostró que una región de unión crítica (donde los residuos de contacto se identificaron como T261, T263, N264, K266 y K271) corresponde a una porción de la molécula de toxina a que participa en la formación de heptámero. Es esta región crítica la que se pliega de forma compacta cuando la molécula de toxina a se encuentra en un estado monomérico, que se extiende como un bucle antes de la inserción en una membrana de la célula huésped (Figura 23b), y en última instancia forma el tallo de la estructura similar a seta después del ensamblaje en el estado heptamérico (Figura 23a). En el estado heptamérico, esta región, como se muestra en la FIG. 24a, se predeciría que estaría protegido de la unión por la molécula de anticuerpo LC10 YTE.
Ejemplo 12: Eficacia terapéutica de los anticuerpos anti toxina alfa estafilocócica
Los resultados discutidos anteriormente describen la eficacia de los mAb anti-AT usados en la profilaxis. Para explorar la posibilidad de que estos mAb también puedan funcionar terapéuticamente, se probó la eficacia de LC10 en un entorno terapéutico tanto en los modelos de dermonecrosis como de neumonía. En el modelo de dermonecrosis, se administró LC10 IV 24 horas antes de la exposición bacteriana (profilaxis) y 1, 3 o 6 horas después de la infección intradérmica (terapia). El tamaño de la lesión en los animales se monitorizó durante 6 días. La profilaxis (-24 h) y el tratamiento 1 o 3 h después de la infección dieron como resultado una reducción en el tamaño de la lesión con respecto al control negativo (R347) (FIG. 24). El fuerte beneficio del tratamiento se perdió cuando se entregó LC106 h después de la infección en este modelo. Estos resultados indican que el LC10 puede funcionar como una terapia eficaz para las infecciones estafilocócicas de la piel y tejidos blandos.
Se realizaron experimentos similares en el modelo de neumonía en el que se administró LC10 a los ratones (IV) en profilaxis o 1, 3 o 6 horas después de la infección intranasal. Como se esperaba, la administración profiláctica de mAb dio como resultado una supervivencia completa. (Figura 25) Aunque no se obtuvo una supervivencia completa cuando se administró LC10 1, 3 o 6 horas después de la infección, hubo un beneficio en el tiempo hasta la muerte en relación con un control negativo cuando se usó LC10 en el tratamiento 1 hora después de la infección al nivel más alto LC10 dosis. En vista de los requisitos del modelo para una alta dosis de infección y un rápido inicio de la muerte, estas mejoras de supervivencia indican que puede producirse una mejora terapéutica durante una infección humana.
Ejemplo 13: Eficacia de la vancomicina en combinación con el mAb LC-10 antitoxina alfa
Se realizaron estudios para evaluar el potencial de mAb LC 10 anti toxina alfa para uso en terapia adyuvante con vancomicina en un modelo de neumonía murina comparando el mAb anti toxina alfa y la monoterapia con vancomicina con la terapia de combinación.
Se infectaron ratones C57BL/6J hembra de siete semanas de edad por vía intranasal con 2e8 cfu (LD100) de Staphylococcus aureus USA300 resistente a la meticilina. La vancomicina y la LC-10 se valoraron individualmente para determinar las dosis óptimas y subeficaces. Para la evaluación de mAb en monoterapia o terapia dual con vancomicina, los ratones se trataron una hora después de la infección, con una sola dosis intraperitoneal de LC-10, o el anticuerpo de control negativo R347 (15 mg/kg). El tratamiento con vancomicina en terapia mono o dual se inició 1 hora después de la infección y se administró BID por vía subcutánea 3 días. El porcentaje de supervivencia para todos los grupos tratados se determinó al final de siete días. Las curvas de supervivencia se analizaron utilizando la prueba de log-rank de Mandel-Cox.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus e incluye:
(a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69;
(b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70;
(c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71;
(d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y
(f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68.
2. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58.
3. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde VH y VL corresponden a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 57 y 58.
4. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo tienen una o más de las características seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad
(KD) para toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monómeros de toxinas alfa, pero no inhibe la unión de toxina alfa al receptor de toxina alfa; (c) inhibe la formación de oligómeros de toxina alfa en al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %;
(d) reduce la actividad citolítica de la toxina alfa en al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % (por ejemplo, según lo determinado por los ensayos de lisis celular y hemólisis); y
(e) reduce la infiltración celular y la liberación de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en un modelo de neumonía animal).
5. Una composición que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la composición comprende un agente adicional, en donde el agente adicional es un antibiótico.
7. Un kit, que comprende
(a) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de las reivindicaciones 5 o 6;
(b) instrucciones para utilizar la composición o guías para obtener instrucciones para utilizar la composición.
8. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de las reivindicaciones 5 o 6 para uso en la prevención, el tratamiento o el manejo de la neumonía en un sujeto.
9. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de las reivindicaciones 5 o 6 para uso en la prevención, el tratamiento o el manejo de una afección de infección de la piel en un sujeto.
10. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de las reivindicaciones 5 o 6 para uso en la prevención, el tratamiento o el manejo de una neumonía o una afección de infección de la piel en un sujeto según las reivindicaciones 8 o 9 inhibiendo la formación de oligómeros de toxina alfa de Staphylococcus aureus en al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %.
11. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se une inmunoespecíficamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus de la SEQ ID NO: 39.
12. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a un fragmento que comprende los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y/o los aminoácidos 173-201 de la SEQ ID NO: 39.
13. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se unen a un fragmento que comprende los aminoácidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y los aminoácidos 173-201 de la SEQ ID NO: 39.
14. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo evitan la formación de heptámero toxina alfa, y en donde dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno están en contacto con los residuos en posiciones t 261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de la SEQ ID NO: 39.
15. La composición de la reivindicación 6, en la que el antibiótico es vancomicina.
16. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para uso en la prevención, el tratamiento o el manejo de una afección de infección de la piel o neumonía en un sujeto mediante la inhibición de la formación de oligómeros de toxina alfa.
17. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 11-14 que comprenden una región Fc variante en la que el anticuerpo aislado comprende las siguientes secuencias
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHDMHWVRQATGKGLEWVSGIGTA
GDTYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARDRYSPTGHYYGM
DVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK
y
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESG
VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCKQYADYWTFGQGTKVEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ES12745207T 2011-02-08 2012-02-07 Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y métodos de uso Active ES2709065T7 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161440581P 2011-02-08 2011-02-08
PCT/US2012/024201 WO2012109285A2 (en) 2011-02-08 2012-02-07 Antibodies that specifically bind staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2709065T3 ES2709065T3 (es) 2019-04-15
ES2709065T7 true ES2709065T7 (es) 2021-12-09

Family

ID=46639171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12745207T Active ES2709065T7 (es) 2011-02-08 2012-02-07 Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y métodos de uso

Country Status (24)

Country Link
US (1) US9527905B2 (es)
EP (2) EP3470526A3 (es)
JP (4) JP2014508748A (es)
KR (1) KR101993839B1 (es)
CN (2) CN103443285B9 (es)
AU (1) AU2012214531C1 (es)
BR (1) BR112013020086B1 (es)
CA (1) CA2826566C (es)
CY (1) CY1121389T1 (es)
DK (1) DK2673373T6 (es)
ES (1) ES2709065T7 (es)
HK (1) HK1248257A1 (es)
HR (1) HRP20182017T4 (es)
HU (1) HUE040734T2 (es)
LT (1) LT2673373T (es)
MX (2) MX345285B (es)
PL (1) PL2673373T6 (es)
PT (1) PT2673373T (es)
RS (1) RS58190B2 (es)
RU (1) RU2620065C2 (es)
SG (3) SG192212A1 (es)
SI (1) SI2673373T1 (es)
TR (1) TR201817932T4 (es)
WO (1) WO2012109285A2 (es)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2718320T3 (pl) 2011-06-10 2018-06-29 Medimmune Limited Cząsteczki wiążące przeciwko PSL Pseudomonas i ich zastosowanie
CN104136042B (zh) 2011-11-07 2017-08-18 米迪缪尼有限公司 使用抗假单胞菌Psl和PcrV结合分子的联合治疗
WO2013096948A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Lydon Nicholas B Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes
US9988439B2 (en) 2011-12-23 2018-06-05 Nicholas B. Lydon Immunoglobulins and variants directed against pathogenic microbes
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
AU2013341349A1 (en) * 2012-11-06 2015-05-21 Medimmune Limited Combination therapies using anti-Pseudomonas Psl and PcrV binding molecules
MX367082B (es) * 2012-11-06 2019-08-05 Medimmune Llc Anticuerpos anti toxina alfa de s. aureus (anti-ta) y sus usos.
WO2014074540A2 (en) * 2012-11-06 2014-05-15 Medimmune, Llc Antibodies to s. aureus surface determinants
AU2014336111A1 (en) * 2013-10-17 2016-04-14 Arsanis Biosciences Gmbh Cross-reactive Staphylococcus aureus antibody sequences
WO2015109012A1 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Integrated Biotherapeutics, Inc. Targeting immunological functions to the site of bacterial infections using cell wall targeting domains of bacteriolysins
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
TWI719938B (zh) * 2014-06-19 2021-03-01 美商麥迪紐有限責任公司 多重細菌感染之治療
WO2016023943A1 (en) * 2014-08-12 2016-02-18 Arsanis Biosciences Gmbh Predicting s. aureus disease
KR102614189B1 (ko) 2014-11-17 2023-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
EP3353317A1 (en) 2015-09-24 2018-08-01 H. Hoffnabb-La Roche Ag Alpha-hemolysin variants
WO2017075188A2 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Medimmune, Llc Methods of using anti-alpha toxin antibody
TWI781130B (zh) * 2017-01-03 2022-10-21 美商再生元醫藥公司 抗金黃色葡萄球菌溶血素ａ毒素之人類抗體
WO2018148494A1 (en) * 2017-02-09 2018-08-16 Bluefin Biomedicine, Inc. Anti-ilt3 antibodies and antibody drug conjugates
CN109384844B (zh) * 2017-08-04 2020-12-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体及应用
US11155606B2 (en) 2018-07-24 2021-10-26 Medimmune, Llc Antibody directed against S. aureus clumping factor a (ClfA)
WO2020041532A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Sf17 Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating progressive neurodegenerative diseases
MX2021002190A (es) 2018-08-31 2021-05-14 Regeneron Pharma Estrategia de dosificacion que mitiga el sindrome de liberacion de citoquinas para los anticuerpos biespecificos cd3/cd20.
BR112021006622A2 (pt) 2018-10-09 2021-07-20 Medimmune, Llc combinações de anticorpos anti-staphylococcus aureus
MX2021004114A (es) 2018-10-09 2021-07-16 Medimmune Llc Anticuerpos dirigidos contra leucotoxinas de staphylococcus aureus.
EP3938388A1 (en) * 2019-03-13 2022-01-19 MedImmune, LLC Decreasings staphylococcus aureus infections in colonized patients
WO2020210650A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Medimmune, Llc Neutralization of tgf-beta or alpha-v-beta-8 integrin for s. aureus infections
CN112538112B (zh) * 2019-09-20 2023-10-27 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗α-溶血素的抗体及其应用
CN113444172A (zh) * 2020-03-25 2021-09-28 兴盟生物医药(苏州)有限公司 金黄色葡萄球菌α-毒素特异性抗体及其应用
CN112941136B (zh) * 2021-03-24 2023-04-28 成都欧林生物科技股份有限公司 一种重组金黄色葡萄球菌疫苗hi抗原蛋白的纯化方法
CN114455048B (zh) * 2022-03-02 2023-03-14 江苏微导纳米科技股份有限公司 一种桨杆
WO2023208123A1 (zh) * 2022-04-28 2023-11-02 珠海泰诺麦博制药股份有限公司 特异性结合金黄色葡萄球菌Hla毒素的全人源单克隆抗体
CN116589566A (zh) * 2022-11-18 2023-08-15 昆明医科大学第一附属医院 一种HIV-1中和抗体的改造重组单克隆IgM抗体及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
CN1262667C (zh) 1996-04-25 2006-07-05 詹尼康科学公司 利用颗粒标记物检测分析物
PT1522590E (pt) 2000-06-28 2009-10-26 Glycofi Inc Métodos para a produção de glicoproteínas modificadas
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US20030226155A1 (en) * 2001-08-30 2003-12-04 Biorexis Pharmaceutical Corporation Modified transferrin-antibody fusion proteins
ATE458006T1 (de) 2003-05-14 2010-03-15 Kenta Biotech Ag Humaner monoklonaler antikörper spezifisch für lipopolysacchariden (lps) des serotyps iats o6 von pseudomonas aeruginosa
CN1324049C (zh) 2003-08-04 2007-07-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗sars冠状病毒基因工程抗体
EP2360186B1 (en) * 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
EP1804833A2 (en) * 2004-09-22 2007-07-11 GlaxoSmithKline Biologicals SA Staphylococcal immunogenic compositions
CA2637254A1 (en) 2006-01-17 2007-07-26 Biolex Therapeutics, Inc. Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants
TW200813091A (en) * 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
WO2007145689A1 (en) * 2006-06-12 2007-12-21 Nabi Biopharmaceuticals Use of alpha-toxin for treating and preventing staphylococcus infections
US20100166772A1 (en) * 2007-05-31 2010-07-01 Anderson Annaliesa S ANTIGEN-BINDING PROTEINS TARGETING S. AUREUS ORF0657n
RS56743B1 (sr) * 2007-08-21 2018-03-30 Amgen Inc Humani c-fms antigen vezujući proteini
EP2666784B1 (en) * 2007-08-31 2017-04-05 University Of Chicago Methods and compositions related to immunizing against staphylococcal lung diseases and conditions
US8172115B1 (en) 2008-04-10 2012-05-08 Spencer Forrest, Inc. Hair building solids dispenser for one handed operation
CN102171247A (zh) * 2008-07-02 2011-08-31 特鲁比昂药品公司 TNF-α拮抗剂多靶点结合蛋白
EP2208787A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-21 Université de Liège A recombinant alpha-hemolysin polypeptide of Staphylococcus aureus, having a deletion in the stem domain and heterologous sequences inserted
GB2467939A (en) * 2009-02-20 2010-08-25 Univ Sheffield Removal of bacteria from media
SI2445522T1 (sl) * 2009-06-22 2017-10-30 Wyeth Llc Imunogeni sestavki antigenov Staphylococcusa aureusa
WO2014074540A2 (en) * 2012-11-06 2014-05-15 Medimmune, Llc Antibodies to s. aureus surface determinants

Also Published As

Publication number Publication date
EP2673373B3 (en) 2021-06-02
AU2012214531B2 (en) 2017-03-16
MX345285B (es) 2017-01-24
BR112013020086B1 (pt) 2020-12-08
JP2020172489A (ja) 2020-10-22
CN107474133A (zh) 2017-12-15
CN103443285A (zh) 2013-12-11
CN107474133B (zh) 2021-10-15
RS58190B2 (sr) 2021-08-31
JP2014508748A (ja) 2014-04-10
ES2709065T3 (es) 2019-04-15
EP2673373A2 (en) 2013-12-18
DK2673373T3 (da) 2019-01-02
CN103443285B9 (zh) 2018-04-24
MX2013009127A (es) 2014-01-31
SG10201913690SA (en) 2020-03-30
JP6723293B2 (ja) 2020-07-15
CY1121389T1 (el) 2020-05-29
EP3470526A3 (en) 2019-07-17
KR20140019344A (ko) 2014-02-14
AU2012214531C1 (en) 2021-07-29
RU2013141134A (ru) 2015-03-20
EP3470526A2 (en) 2019-04-17
KR101993839B1 (ko) 2019-06-28
RS58190B1 (sr) 2019-03-29
HRP20182017T1 (hr) 2019-02-08
US9527905B2 (en) 2016-12-27
CA2826566C (en) 2022-09-13
US20140072577A1 (en) 2014-03-13
SG192212A1 (en) 2013-09-30
JP2017128575A (ja) 2017-07-27
JP6367393B2 (ja) 2018-08-01
DK2673373T6 (da) 2021-08-23
HUE040734T2 (hu) 2019-03-28
LT2673373T (lt) 2019-01-25
PL2673373T3 (pl) 2019-04-30
HK1248257A1 (zh) 2018-10-12
EP2673373B1 (en) 2018-08-29
HRP20182017T4 (hr) 2021-08-20
JP7047017B2 (ja) 2022-04-04
RU2620065C2 (ru) 2017-05-22
WO2012109285A3 (en) 2012-10-04
PT2673373T (pt) 2018-12-05
SI2673373T1 (sl) 2019-03-29
MX2020009700A (es) 2020-10-07
CN103443285B (zh) 2017-06-23
CA2826566A1 (en) 2012-08-16
BR112013020086A2 (pt) 2016-11-22
WO2012109285A2 (en) 2012-08-16
TR201817932T4 (tr) 2019-02-21
EP2673373A4 (en) 2015-06-17
SG10201600899PA (en) 2016-03-30
JP2019011329A (ja) 2019-01-24
PL2673373T6 (pl) 2021-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7047017B2 (ja) 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）α毒素に特異的に結合する抗体及び使用方法
AU2012214531A1 (en) Antibodies that specifically bind Staphylococcus aureus alpha toxin and methods of use
KR101899835B1 (ko) 항-ｌｒｐ６ 항체
KR102501920B1 (ko) 중화 항-인플루엔자 a 항체 및 이의 용도
ES2692657T3 (es) Proteínas de enlace al antígeno del receptor de oncastatina
BR112014028785B1 (pt) Anticorpo isolado que se liga a um antígeno st2, composição farmacêutica e uso do anticorpo
KR20180101436A (ko) 인플루엔자 a의 치료 방법
BR112012028306A2 (pt) anticorpos para proteína 6 relacionada com lipoproteína de baixa densidade (lrp6) e seus fragmentos, seu uso, ácidos nucléicos, vetores, bem como composições farmacêuticas e combinações
KR20150132473A (ko) 항-혈장 칼리크레인 항체
CN106573154B (zh) 中和抗乙型流感抗体及其用途
TW202305001A (zh) 結合ror1之抗原結合蛋白