ES2709065T3 - Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y métodos de uso - Google Patents

Anticuerpos que se unen específicamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y métodos de uso Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus e incluye: (a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 69; (b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 70; (c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71; (d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; (e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y (f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 68.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos que se unen espedficamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y metodos de uso
Campo
La tecnolog^a se relaciona en parte con los anticuerpos, y en ciertas realizaciones, los anticuerpos que se unen espedficamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus.
Antecedentes
Staphylococcus aureus es una bacteria cocos grampositiva, facultativamente aerobica y que forma grupos que comunmente coloniza la nariz y la piel de humanos sanos. Aproximadamente el 20-30% de la poblacion esta colonizada con S. aureus en un momento dado. Las bacterias estafilococos aureus, a veces tambien denominadas “estafilococos”, “estafilococos aureus”, o “S. aureus”, se consideran patogenos oportunistas que causan infecciones menores (por ejemplo, granos, forunculos) e infecciones sistemicas.
Las barreras mucosas y epidermicas (piel) normalmente protegen contra las infecciones por S. aureus. La interrupcion de estas barreras naturales como resultado de lesiones (por ejemplo, quemaduras, traumatismos, procedimientos quirurgicos y similares) aumenta dramaticamente el riesgo de infeccion. Las enfermedades que comprometen el sistema inmunitario (por ejemplo, diabetes, enfermedad renal en etapa terminal, cancer y similares) tambien aumentan el riesgo de infeccion. Las infecciones oportunistas por S. aureus pueden volverse graves y causar una variedad de enfermedades o afecciones, entre las que se incluyen bacteriemia, celulitis, infecciones de parpados, intoxicacion alimentaria, infecciones de las articulaciones, infecciones de la piel, sindrome de la piel escaldada, sindrome del choque toxico, neumonia, osteomielitis, endocarditis, meningitis y formacion de abscesos.
S. aureus tambien puede causar infecciones y enfermedades en animales. Por ejemplo, S. aureus frecuentemente se asocia con mastitis bovina.
S. aureus expresa una serie de factores de virulencia, incluyendo polisacaridos capsulares y toxinas proteicas. Un factor de virulencia frecuentemente asociado con la infeccion por S. aureus que es el principal agente citotoxico es la alfa-toxina (tambien conocida como alfa-hemolisina o Hla), una exoproteina hemolitica y formadora de poros producida por la mayoria de las cepas patogenas de S. aureus. La toxina forma poros heptamericos en membranas de celulas susceptibles como globulos blancos, plaquetas, eritrocitos, monocitos de sangre periferica, macrofagos, queratinocitos, fibroblastos y celulas endoteliales. La formacion de poros de toxinas alfa a menudo conduce a la disfuncion celular o lisis.
Ragle B. et al. (2009) Infecation and Immunity 77 (1), 2712-2718 divulga los anticuerpos monoclonales 7b8 y 1A9 dirigidos a S. aureus alfa-hemolisina. El documento WO 2009/029831 divulga antiboisis identicas como Ragle B. et al. (supra) y ademas ensena que los anticuerpos que se pueden utilizar en terapias de combinacion, por ejemplo, antibioticos
Breve resumen de la divulgacion
En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo purificado o aislado, o un fragmento de union a antigeno del mismo, cuyo anticuerpo o fragmento se une inmunoespedficamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus. Los terminos “polipeptido de toxina alfa”, “monomero de toxina alfa” y “oligomeros de toxina alfa (por ejemplo, heptamero)” se refieren aqui como “AT”, “monomero AT” y “oligomero AT”, respectivamente. El termino “cadena pesada variable” se conoce como “VH”. El termino “cadena ligera variable” se conoce como “VL”.
La presente invencion proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de union a antigeno del mismo que se une de forma inmunoespedfica a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus e incluye:
(a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: o 69;
(b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 70;
(c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 71;
(d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1;
(e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; y
(f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 68.
En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o el fragmento de union a antigeno comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 57, y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 58.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un VH y VL del anticuerpo o fragmento de union a antigeno que corresponden a las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 57 y 58.
En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo tiene una o mas de las caracteristicas seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (KD) para toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monomeros de toxinas alfa, pero no inhibe la union de toxina alfa al receptor de toxina alfa;
(c) inhibe la formation de oligomeros de toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%;
(d) reduce la actividad citolitica de la toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% (por ejemplo, segun lo determinado por los ensayos de lisis y hemolisis celular); y
(e) reduce la infiltration celular y la liberation de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en un modelo de neumonia animal).
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona una composition que comprende el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un agente adicional, en el que el agente adicional es un antibiotico. En algunas realizaciones, el antibiotico es vancomicina.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un kit, que comprende
(a) un anticuerpo o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composicion de la revindication 5 o 6;
(b) instrucciones para usar la composicion o guias para obtener instrucciones para usar la composicion.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno o una composicion descrita anteriormente para prevenir, tratar o controlar la neumonia en un sujeto.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno, o una composicion como se describio anteriormente para prevenir, tratar o controlar una afeccion de infection de la piel en un sujeto. En algunas realizaciones, la afeccion de infeccion de la piel es dermonecrosis.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno o una composicion descrita anteriormente para prevenir, tratar o manejar una condition de infeccion de la piel o neumonia en un sujeto mediante la inhibition de la formacion de oligomeros de toxina alfa de Staphylococcus aureus en al menos un 50%. , 60%, 70%, 80%, 90% o 95%.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describio anteriormente que se une inmunoespecificamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus de la SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno como se describio anteriormente que se une inmunoespecificamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus que comprende los aminoacidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y/o los aminoacidos 173- 201 de SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describio anteriormente que se une inmunoespecificamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus que comprende los aminoacidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y los aminoacidos 173-201 de la Se Q ID NO: 39. En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describio anteriormente que previene la formacion de heptamero de toxina alfa, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antigeno esta en contacto con los residuos en las posiciones T261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de la SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describio anteriormente para prevenir, tratar o manejar una afeccion por neumoma o infeccion de la piel en un sujeto mediante la inhibicion de la formacion de oligomeros de toxina alfa.
En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describio anteriormente que comprende una region Fc variante en la que el anticuerpo aislado comprende las siguientes secuencias
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHDMHWVRQATGKGLEWVSGI GTAGDTYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARDRYSPTG HYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEV TCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVM HEALH NHYTQKSLSLSPGK
y
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSL ESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCKQYADYWTFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV.
Los metodos para prevenir, tratar o controlar una infeccion por S. aureus divulgada en el presente documento puede estar asociada con el tratamiento de dialisis, cirugia de alto riesgo, neumonia, neumonia asociada a ventilacion mecanica (VAP) o reinfeccion despues de la liberacion previa de un hospital para un tratamiento previo. o cirugia que incluye administrar una composition que incluya un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo que se adhiera inmunoespecificamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus a un sujeto que lo necesite.
El anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que se une inmunoespecificamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus descrito en el presente documento puede administrarse a un sujeto que lo necesite, en una cantidad eficaz para reducir la lisis celular. En ciertas realizaciones, el metodo previene una afeccion asociada con la infeccion por Staphylococcus aureus. En algunas realizaciones, la celula es un eritrocito de la sangre o el pulmon.
Ciertas realizaciones se describen con mas detalle en la siguiente description, ejemplos, reivindicaciones y dibujos.
Breve descripcion de los dibujos
Los dibujos ilustran realizaciones en este documento y no son limitantes. Para mayor claridad y facilidad de ilustracion, los dibujos no estan hechos a escala y, en algunos casos, varios aspectos pueden mostrarse exagerados o agrandados para facilitar la comprension de realizaciones particulares.
Las figuras 1A y 1B ilustran graficamente el porcentaje de inhibicion de la lisis de globulos rojos por los anticuerpos anti-toxina alfa. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 3.
Las figuras 2A y 2B ilustran graficamente el porcentaje de inhibicion de la lisis de celulas A549 y THP-1 humanas por anticuerpos anti-toxina alfa. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 3.
Las figuras 3A y 3B ilustran los resultados de la inmunizacion pasiva con mAb inhibidores de la toxina alfa anti-S. aureus en un modelo de dermonecrosis. Grupos de 5 ratones BALB/c se inmunizaron pasivamente con 5 mg/kg de mAb inhibidores y luego se infectaron con S. aureus Wood y se monitorizo el tamano de la lesion durante 6 dias. La Figura 3A muestra fotografias del tamano de la lesion 6 dias despues de la infeccion. La Figura 3B ilustra graficamente la reduction en el tamano de la lesion a lo largo del curso de la infeccion. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 4.
Las figuras 4-7 ilustran graficamente la supervivencia de ratones inmunizados pasivamente con varios mAb descritos en el presente documento en un modelo de neumonia. La Figura 4 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 12B8.19 purificados, 24 horas antes de la infeccion con S. aureus USA300 (3 x 108 ufc).
La Figura 5 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 2A3.1 purificados, 24 horas antes de la infeccion con S. aureus USA300 ( 3 * 108 ufc).
La Figura 6 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 28F6.1 purificado, 24 horas antes de la infeccion con S. aureus USA300 (3 * 108 ufc).
La Figura 7 ilustra los resultados de ratones C57BL/6J inmunizados pasivamente con 5, 15 y 45 mg/kg de 10A7.5 purificado, 24 horas antes de la infeccion con S. aureus USA300 (3 * 108 ufc). Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 5.
Las figuras 8A y 8B ilustran graficamente la distribucion de bacterias en el pulmon (FIG. 8A) y el rinon (Fig. 8B) en ratones inmunizados pasivamente con una version completamente humana de mAb 2A3.1 (por ejemplo, 2A3hu) o un control de isotipo (R347). Los ratones C57BL/6J se inmunizaron pasivamente con 2A3hu (15 mg/kg) 24 h antes de la infeccion con USA300. Tambien se recolectaron muestras para medir los niveles de citoquinas y para el analisis histopatologico. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 5.
La Figura 9 ilustra graficamente la reduccion en la produccion de citoquinas inflamatorias despues de la inmunizacion pasiva con mAb 2A3hu. Los resultados en circulo son del punto de tiempo de 24 horas. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 6.
La Figura 10 muestra fotografias representativas de la histologia pulmonar en ratones tratados con el control R347 (ver fotografias superior e inferior a la izquierda de la Figura 10) o tratadas con 2A3hu (ver fotografias superior e inferior a la derecha de la Figura 10). Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 6.
La Figura 11 ilustra graficamente que los mAb anti-AT (toxina alfa de S. aureus) descritos aqui no inhiben la union de la toxina alfa nativa (NAT) a los receptores presentes en los fantasmas de eritrocitos de conejo. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 8.
La Figura 12 es una transferencia Western representativa que ilustra la inhibition de la formation de heptamero por los anticuerpos descritos en el presente documento. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 8.
Las figuras 13A y 13B ilustran transferencias de western representativas que confirman la inhibicion de la oligomerization por los mAb anti-AT descritos en este documento, e ilustran ademas que la inhibicion se puede valorar. Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 8.
Las figuras 14-16, ilustran graficamente la potencia de los anticuerpos anti-AT completamente humanos en los ensayos de inhibicion de la lisis celular. Las versiones completamente humanas de los anticuerpos IgG anti-AT exhiben una potencia similar a la de los anticuerpos IgG anti-AT quimericos correspondientes. La actividad inhibitoria de los anticuerpos IgG completamente humanos se comparo con los anticuerpos IgG quimericos en la lisis de conejo (celulas de globulos rojos) (Figura 14), la lisis celular A549 (Figura 15) y la lisis de celulas THP-1 (Figura 16). Los detalles y resultados experimentales se describen en el Ejemplo 9.
Las Figuras 17A y 17B ilustran graficamente la reduccion en el tamano de la lesion a lo largo del curso temporal de la infeccion despues de la inmunizacion pasiva con mAb de toxina alfa anti-S. aureus inhibidor QD 20, QD37, LC10, QD33, 2A3 y el control R347 en un modelo de dermonecrosis. Grupos de 5 ratones BALB/c se inmunizaron pasivamente con 1 mg/kg (Figura 17A) y 0.5 mg/kg (Figura 17B) de los mAb inhibidores mostrados y luego se infectaron con S. aureus Wood y se monitorizo el tamano de la lesion durante 6 dias.
La Figura 18 ilustra graficamente la supervivencia de ratones inmunizados pasivamente con los mAb QD 20, QD37, LC10, QD33, 2A3 y el control R347 en un modelo de neumonia. Los ratones se inmunizaron pasivamente con 5 mg/kg de mAb purificado 24 horas antes de la infeccion con S. aureus USA300 (~2 * 108 ufc).
La Figura 19 representa graficamente la caracterizacion por ELISA de la union de LC10 YTE a la toxina alfa y LukF-PV. El lisado bacteriano que contenia toxina alfa marcada con His o LukF-PV se recubrio sobre la superficie de 96 pozos. Se anadio LC10 YTE o mAb anti-His de raton a los pozos recubiertos y se incubo durante 1 h. Los niveles de expresion de toxina alfa y LukF-PV fueron similares a los mostrados por las senales de union del mAb anti-His, mientras que los YTE de LC10 solo se unieron significativamente a la toxina alfa y no a LukF-PV.
La Figura 20 muestra alineamientos de secuencia de toxinas alfa y proteinas LukF-PV. La toxina alfa comparte una identidad de secuencia de aminoacidos del 25% con LukF-PV (numero de acceso UniProtKB/TrEMBL B1Q018). La numeration de los aminoacidos se basa en proteinas maduras. La alineacion se realizo utilizando el metodo de Clustal W. El segmento aa 248-277 se resalta subrayando.
La Figura 21 representa representaciones de bosquejos de estructuras de toxinas alfa. A) Representation de bosquejos de la estructura modelada de un monomero soluble de toxina alfa. La estructura de monomero modelada de toxina alfa se construyo con Maestro 9.1 (Schrodinger Inc.) utilizando la estructura cristalina de LukF-PV como plantilla (entrada del banco de datos de protemas 1PVL) (Pedelacq, Maveyraud et al. 1999). B) Representacion de bosquejos de la estructura cristalina de un protomero de toxina alfa de un hexamero (Entrada de Protein Data Bank 7AHL) (Song, Hobaugh et al. 1996). aa 101-110 se muestran en azul, aa 224-231 en naranja y aa 248-277 en rojo.
La Figura 22 es un diagrama de cinta del complejo LC10 YTE Fab-a-toxina. La molecula de toxina alfa esta indicada por la cinta en la parte superior del diagrama. La cadena pesada se indica con una cinta de color oscuro en la parte inferior del diagrama, y la cadena ligera se indica con la cinta de color claro en la parte inferior del diagrama.
La Figura 23 es una representacion de bosquejos de los estados heptamerales y monomericos de la molecula de toxina a. a. Un conjunto heptamerico similar a un hongo de la molecula de toxina a que crea un poro en la superficie de la celula huesped. Las regiones de color gris y negro corresponden a los residuos de contacto LC10 YTE que estan protegidos en el modelo. Los residuos de contacto que estan presentes en las posiciones protegidas son LC10 consistentes bloqueando la formation de heptamero. b. Estructuras superpuestas de moleculas de a-toxina antes (gris claro) y despues de la formacion de poros (gris oscuro).
La Figura 24 representa graficamente la eficacia del tratamiento de LC10 en un modelo de dermonecrosis de murino. Grupos de 5 ratones Balb/C se inmunizaron pasivamente con 15 mg/kg de LC10 o R347. Se infectaron ratones Balb/C por via intranasal con 2 x 108 de S. aureus Wood. (A) 1 hora, (B) 3 horas o (C) 6 horas despues de la infection, los ratones se trataron con 5, 15 o 45 mg/kg de LC10 y se controlo el tamano de la lesion durante 6 dias. Se incluyeron como controles grupos de 5 administrados 15 mg/kg LC10 o R34724 horas antes de la exposition bacteriana.
La Figura 25 representa graficamente la eficacia del tratamiento de LC10 en un modelo de neumonia murina. Grupos de 10 ratones C57BL/6 se inmunizaron pasivamente con 15 mg/kg de LC10 o R34724 horas antes de la exposicion intranasal con 2x108 S. aureus USA300. Grupos de 10 ratones C57BL/6 se infectaron por via intranasal con 2 * 108 de S. aureus USA300. (A) 1 hora, (B) 3 horas o (C) 6 horas despues de la infeccion, los ratones se trataron con 5, 15 o 45 mg/kg de LC10 y la supervivencia se controlo durante 7 dias. Se incluyeron como controles grupos de 10 administrados 15 mg/kg LC10 o R34724 h antes de la exposicion bacteriana.
La Figura 26 representa graficamente la eficacia del tratamiento de LC10 en un modelo de neumonia murina. Grupos de 10 ratones C57BL/6 se infectaron por via intradermica con 2x108 S. aureus USA300. Una hora despues de la infeccion, a los animales se les administro una sola inyeccion intraperitoneal de LC-10 a (A) 15 mg/kg (B) 45 mg/kg. Un grupo de animales de la cohorte recibio vancomicina subcutanea (VAN) 1 h despues de la infeccion. Se administraron tratamientos adicionales de VAN BID q 12 para un total de 6 tratamientos. Un grupo de control de 10 ratones se trato con 15 mg/kg de R347 1 h despues de la infeccion. La supervivencia se monitorizo durante 7 dias.
La Figura 27 es una visualization grafica de un analisis de isobolograma de sinergia donde N > 1: antagonismo, N = 1: efecto aditivo, N < 1: sinergia.
Description detallada
Aqui se proporcionan anticuerpos, que incluyen formas humanas, humanizadas y/o quimericas, asi como fragmentos, derivados/conjugados y composiciones de los mismos que se unen a la toxina alfa de Staphylococcus aureus. Dichos anticuerpos pueden ser utiles para detectar y/o visualizar la toxina alfa y, por lo tanto, pueden ser utiles en ensayos y metodos de diagnostico. Los anticuerpos descritos en el presente documento tambien interfieren con la formacion del heptamero toxina alfa, inhibiendo asi la formacion del complejo formador de poros activo, y por lo tanto pueden ser utiles para metodos terapeuticos y profilacticos.
Staphylococcus aureus es un patogeno ubicuo, y algunas veces es un agente etiologico de una variedad de afecciones, que van desde la gravedad de leve a fatal. S. aureus produce una gran cantidad de proteinas extracelulares y asociadas a las celulas, muchas de las cuales estan involucradas en la patogenesis, como la toxina alfa, la toxina beta, la toxina gamma, la toxina delta, la leucocidina, la toxina del sindrome de choque toxico (TSST), enterotoxinas, coagulasa, proteina A, fibrinogeno, proteina de union a fibronectina y similares. La toxina alfa (por ejemplo, codificada por el gen hla) es uno de los factores de virulencia de Staphylococcus aureus y es producida por la mayoria de las cepas patogenas de S. aureus.
Las infecciones por S. aureus son relativamente dificiles de tratar y pueden aparecer enfermedades invasivas y recaidas despues del tratamiento con antibioticos. Ademas, las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina se han vuelto mas frecuentes, en entornos hospitalarios (por ejemplo, HA-MRSA o atencion medica asociada) y entornos no hospitalarios (por ejemplo, CA-MRSA o asociados a la comunidad), lo que complica aun mas el tratamiento de las infecciones por S. aureus. En muchos casos, las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina tambien son resistentes a uno o mas antibioticos, que incluyen aminoglucosidos, tetraciclina, cloranfenicol, macrolidos y lincosamidas.
La toxina alfa es una toxina formadora de poros y tiene actividades citoliticas, hemoliticas, dermonecroticas y letales tanto en humanos como en animales. La toxina alfa estafilococica se secreta como un polipeptido de cadena simple soluble en agua de 293 aminoacidos que tiene aproximadamente 34 kilodaltons (kDa). Sin estar limitado por la teoria, se considera que hay dos metodos de interaccion toxina alfa/celula diana; (i) la toxina alfa se une a receptores espedficos de alta afinidad (ADAM 10) en la superficie celular de plaquetas humanas, monocitos, celulas endoteliales, globulos blancos, celulas alveolares de pulmon, macrofagos, queratinocitos, fibroblastos, eritrocitos de conejo y otras celulas (ver, por ejemplo, Wilke et al., Proc. Natl Acad Sci. 107: 13473-13478 (2010)), o (ii) la toxina alfa interactua de manera no espedfica por adsorcion a las bicapas lipidicas. En cualquier modo de interaccion toxina/celula, siete moleculas monomericas de toxina alfa se oligomerizan para formar un canal trans-membrana heptamerico de 1-2 nm de diametro. El flujo posterior de potasio y nucleotidos y la entrada de sodio y calcio conduce a la lisis osmotica y/o acciones secundarias multiples, incluida la produccion de eicosanoides, los procesos secretores, la disfuncion contractil, la apoptosis y la liberacion de citoquinas. Se considera que la interrupcion de las actividades celulares y la lisis de las celulas por la toxina alfa contribuye a las condiciones y enfermedades asociadas con la infeccion por S. aureus.
Los ejemplos no limitantes de algunas afecciones comunes causadas por la infeccion por S. aureus incluyen quemaduras, celulitis, dermonecrosis, infecciones de parpados, intoxicacion alimentaria, infecciones de articulaciones, neumonia, infecciones de la piel, infeccion de la herida quirurgica, sindrome de la piel escaldada y sindrome de choque toxico. Ademas, es un patogeno frecuente en infecciones de cuerpos extranos, como lineas intravasculares, marcapasos, valvulas cardiacas artificiales e implantes de articulaciones. Algunas de las afecciones o enfermedades causadas por S. aureus se describen mas adelante. Algunas o todas las afecciones y enfermedades descritas a continuacion pueden involucrar la accion directa de la toxina alfa como un componente de la infeccion o mediador de la afeccion o estado de la enfermedad, o algunas o todas las afecciones pueden involucrar la accion indirecta o secundaria de la toxina alfa (por ejemplo, un factor de virulencia primario causa el sintoma principal o la mayoria de los sintomas asociados con la afeccion, y la toxina alfa actua para hacer avanzar aun mas la enfermedad a traves de su interrupcion de la funcion celular y las actividades de lisis celular).
Quemaduras
Las heridas por quemaduras suelen ser esteriles inicialmente. Sin embargo, las quemaduras moderadas y graves generalmente comprometen las barreras fisicas e inmunes a la infeccion (por ejemplo, ampollas, agrietamiento o descamacion de la piel), causando una perdida de Kquido y electrolitos y provocan una disfuncion fisiologica general o local. El contacto de la piel comprometida con bacterias viables a veces puede resultar en una colonizacion mixta en el sitio de la lesion. La infeccion se puede restringir a los residuos no viables en la superficie de la quemadura (“escara”), o la colonizacion puede progresar a una infeccion completa de la piel e invadir el tejido viable por debajo de la escara. Las infecciones mas graves pueden llegar debajo de la piel, entrar en el sistema linfatico y/o la circulacion sanguinea y convertirse en septicemia. S. aureus se encuentra tipicamente entre los patogenos que colonizan las infecciones por quemaduras. S. aureus puede destruir el tejido de granulacion y producir septicemia grave.
Infecciones de la piel y tejidos blandos
Celulitis
La celulitis es una infeccion aguda de la piel que a menudo comienza como una infeccion superficial que se puede diseminar por debajo de la capa cutanea. La celulitis es mas comunmente causada por una infeccion mixta de S. aureus junto con S. pyogenes. La celulitis puede conducir a una infeccion sistemica. La celulitis a veces es un aspecto de la gangrena bacteriana sinergica. La gangrena bacteriana sinergica generalmente es causada por una mezcla de S. aureus y estreptococos microaerofilos. La gangrena bacteriana sinergica causa necrosis y el tratamiento se limita a la escision del tejido necrotico. La afeccion a menudo es fatal.
Dermonecrosis
La dermonecrosis es una infeccion de la piel y los tejidos subcutaneos, que se disemina facilmente a traves del plano fascial dentro del tejido subcutaneo. La afeccion hace que las capas superiores y/o inferiores de la piel se vuelvan necroticas, y pueden propagarse a los tejidos subyacentes y circundantes.
La fascitis necrotizante
La fascitis necrotizante se conoce como “enfermedad que comen carne” o “sindrome de bacterias que comen carne”. La fascitis necrotizante puede ser causada por una infeccion polimicrobiana (por ejemplo, tipo I, causada por una infeccion bacteriana mixta) o por una infeccion monomicrobiana (por ejemplo, tipo II, causada por una sola cepa patogena de bacterias). Muchos tipos de bacterias pueden causar fascitis necrotizante, entre las que se incluyen ejemplos no limitativos; Estreptococo del grupo A (por ejemplo, Streptococcus pyogenes), Staphylococcus aureus, Vibrio vulnificus, Clostridium perfringens y Bacteroides fragilis. Las personas con sistemas inmunitarios deprimidos o comprometidos tienen mas probabilidades de sufrir dermonecrosis (por ejemplo, fascitis necrotizante).
Historicamente, el estreptococo del grupo A se diagnostico como la causa de la mayoria de los casos de infecciones dermonecroticas tipo II. Sin embargo, desde 2001, el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) se ha observado con mayor frecuencia como causa de la fascitis necrotizante monomicrobiana. La infeccion comienza localmente, a veces en un sitio de trauma, que puede ser grave (como el resultado de una cirug^a), menor o incluso no evidente. Por lo general, los pacientes se quejan de dolor intenso que puede parecer excesivo dada la apariencia externa de la piel. Con la progresion de la enfermedad, el tejido se inflama, a menudo en cuestion de horas. La diarrea y los vomitos tambien son smtomas comunes.
El sintoma de inflamacion puede no ser evidente en las primeras etapas de la infeccion, si las bacterias se encuentran en lo profundo del tejido. Si las bacterias no son profundas, los sintomas de inflamacion, como enrojecimiento y piel inflamada o caliente, se muestran muy rapidamente. El color de la piel puede progresar a violeta y se pueden formar ampollas, con necrosis subsiguiente (por ejemplo, muerte) de los tejidos subcutaneos. Los pacientes con fascitis necrotizante suelen tener fiebre y aparecen muy enfermos. Se han observado tasas de mortalidad tan altas como 73 por ciento si no se tratan. Sin la asistencia medica adecuada, la infeccion progresa rapidamente y finalmente conduce a la muerte.
Neumonia
S. aureus tambien se ha diagnosticado como una causa de neumonia estafilococica. La neumonia por estafilococo causa inflamacion e inflamacion del pulmon, que a su vez hace que el liquido se acumule en el pulmon. La acumulacion de liquido en el pulmon puede evitar que el oxigeno ingrese al torrente sanguineo. Las personas con influenza tienen riesgo de desarrollar neumonia bacteriana. Staphylococcus aureus es la causa mas comun de neumonia bacteriana en las personas que ya padecen influenza. Los sintomas comunes de la neumonia por estafilococos incluyen tos, dificultad para respirar y fiebre. Los sintomas adicionales incluyen fatiga, mucosidad amarilla o sanguinolenta y dolor en el pecho que empeora con la respiracion. S. aureus resistente a la meticilina (SARM) se diagnostica cada vez mas como la cepa identificada en la neumonia estafilococica.
Infecciones de heridas quirurgicas
Las heridas quirurgicas a menudo penetran muy lejos en el cuerpo. La infeccion de tales heridas representa un grave riesgo para un paciente, si la herida se infecta. S. aureus es frecuentemente un agente causal de infecciones en heridas quirurgicas. S. aureus es inusualmente un adepto a las heridas quirurgicas invasoras, las heridas suturadas pueden ser infectadas por muchas menos celulas de S. aureus que son necesarias para causar una infeccion en la piel normal. La invasion de la herida quirurgica puede conducir a una grave septicemia por S. aureus. La invasion del torrente sanguineo por S. aureus puede conducir a la siembra e infeccion de los organos internos, particularmente las valvulas cardiacas y los huesos, causando enfermedades sistemicas, como la endocarditis y la osteomielitis.
Sindrome de la piel escaldada
S. aureus es probablemente un agente causal principal, si no el agente causal, del “sindrome de piel escaldada”, tambien conocido como “sindrome de la piel escaldada estafilococica”, “necrosis epidermica toxica”, “impetigo bulloso localizado”, “enfermedad de Ritter “Y” enfermedad de Lyell “. El sindrome de la piel escaldada ocurre con frecuencia en ninos mayores, generalmente en los brotes causados por la floracion de las cepas de S. aureus que producen exotoxinas epidermoliticas (por ejemplo, exfoliatina A y B, a veces denominada toxina del sindrome de la piel escaldada), que causa desprendimiento dentro de la capa epidermica. Una de las exotoxinas esta codificada por el cromosoma bacteriano y la otra esta codificada por un plasmido. Las exotoxinas son proteasas que escinden desmoglein-1, que normalmente mantienen juntas las capas granulosa y espinosa de la piel.
La bacteria inicialmente puede infectar solo una lesion menor, sin embargo, la toxina destruye las conexiones intercelulares, propaga las capas epidermicas y permite que la infeccion penetre la capa externa de la piel, produciendo la descamacion que tipifica la enfermedad. El desprendimiento de la capa externa de la piel generalmente revela una piel normal debajo, pero la perdida de Kquido en el proceso puede producir lesiones graves en los ninos pequenos si no se trata adecuadamente.
Sindrome de choque toxico
El sindrome del choque toxico (SST) es causado por cepas de S. aureus que producen la llamada “toxina del sindrome del choque toxico”. La enfermedad puede ser causada por la infeccion por S. aureus en cualquier sitio, pero a menudo se considera erroneamente como una enfermedad exclusiva de mujeres que usan tampones. La enfermedad involucra toxemia y septicemia, y puede ser fatal.
Los sintomas del sindrome de choque toxico varian segun la causa subyacente. El SST resultante de la infeccion con la bacteria Staphylococcus aureus se manifiesta tipicamente en individuos sanos con fiebre alta, acompanados de presion arterial baja, malestar y confusion, que pueden progresar rapidamente hacia el estupor, el coma y la insuficiencia multiorganica. La erupcion caracteristica, que a menudo se observa en una etapa temprana de la enfermedad, se asemeja a una quemadura solar y puede afectar a cualquier region del cuerpo, incluidos los labios, la boca, los ojos, las palmas y las plantas. En los pacientes que sobreviven al ataque inicial de la infeccion, la erupcion se descama o se despega despues de 10 a 14 dias.
Como se senalo anteriormente, debido al aumento de cepas resistentes a multiples farmacos de S. aureus, un numero creciente de antibioticos comunmente utilizados para tratar infecciones por S. aureus, ya no controlan ni eliminan infecciones de meticilina y Staphylococcus aureus resistente a multiples farmacos. Los anticuerpos contra la toxina alfa de S. aureus descritos en el presente documento pueden ayudar a reducir la gravedad de la infeccion y tambien pueden ayudar a eliminar, prevenir (profilacticamente) o reducir el S. aureus patogeno de un huesped infectado.
Anticuerpos
Como se usa en el presente documento, los terminos “anticuerpo”, “anticuerpos” (tambien conocidos como inmunoglobulinas) y “fragmentos de union a antigeno”, abarcan anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos formados a partir de al menos dos fragmentos de union a epitopos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de camelidos, anticuerpos quimericos, Fvs de una sola cadena (scFv), anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , fragmentos de anticuerpos que muestran la actividad biologica deseada (por ejemplo, la porcion de union al antigeno), Fvs ligados a disulfuro (dsFv) y anticuerpos anti-idiotipicos (anti-id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-id para anticuerpos en este documento) proporcionados), intracuerpos y fragmentos de union a epitopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moleculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunologicamente activos de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen al menos un sitio de union a antigeno. Las moleculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1m (f, z, a o x), G2m (n), G3m (g, b, o c), Am, Em y Km (1, 2 o 3)). Los anticuerpos pueden derivarse de cualquier mamifero, incluidos, entre otros, humanos, monos, cerdos, caballos, conejos, perros, gatos, ratones y similares, u otros animales como aves (por ejemplo, pollos).
Los anticuerpos nativos generalmente son glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150,000 Daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes (CH). Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante (CL) en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras se clasifican como cadenas lambda o cadenas kappa basadas en la secuencia de aminoacidos de la region constante de la cadena ligera. El dominio variable de una cadena ligera kappa tambien se puede denotar aqui como VK.
Los anticuerpos proporcionados en el presente documento incluyen anticuerpos de longitud completa o intactos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de secuencia nativa o variantes de aminoacidos, humanos, humanizados, modificados post-traduccionalmente, anticuerpos quimericos o de fusion, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. Los anticuerpos pueden modificarse en la region Fc, y ciertas modificaciones pueden proporcionar funciones efectoras deseadas o vida media en suero.
Tambien se contemplan los anticuerpos que tienen una o mas caracteristicas biologicas (por ejemplo, potencia, afinidad de toxina alfa, funcion efectora, afinidad de union ortologa, neutralizacion, inhibicion de la formation de heptamero toxina alfa y similares) de los presentes anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa se pueden utilizar para diagnosticar y/o tratar y/o aliviar y/o prevenir uno o mas sintomas de la enfermedad asociada a Staphylococcus aureus en un mamifero, como se describio anteriormente.
En el presente documento se proporciona una composition que comprende un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa y un vehiculo. Para los fines del tratamiento de la enfermedad asociada a S. aureus, las composiciones pueden administrarse a un paciente que necesite dicho tratamiento, donde la composicion puede comprender uno o mas anticuerpos anti-toxina alfa y/o fragmentos de los mismos. Tambien se proporcionan formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento del mismo como se presenta en el presente documento y un vehiculo. La formulation es una formulation profilactica o terapeutica que comprende un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
Los metodos proporcionados aqui son utiles para tratar una enfermedad/afeccion asociada con Staphylococcus aureus y/o una toxina alfa y/o prevenir y/o aliviar uno o mas sintomas de la enfermedad o afeccion en un mamifero, que comprenden administrar un agente terapeutico Cantidad efectiva de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa para el mamifero. Las composiciones profilacticas o terapeuticas de anticuerpos pueden administrarse a corto plazo (agudas) o cronicas, o de manera intermitente segun lo indique un medico.
En este documento se divulgan articulos de fabrication comprenden al menos un anticuerpo o fragmento anti-alfa, tal como en una forma de dosificacion esteril y/o en un kit. Un kit que contenga un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede ser util, por ejemplo, para los ensayos de destruction de celulas de S. aureus, para la purification o inmunoprecipitacion de toxina alfa de las celulas. Por ejemplo, para el aislamiento y la purificacion de toxina alfa, un kit puede contener un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Un kit puede contener un anticuerpo para la deteccion y cuantificacion de S. aureus y/o toxina alfa in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Dicho anticuerpo util para la deteccion puede proporcionarse con una etiqueta tal como un fluorescente o radiomarcador.
Terminologia
Debe entenderse que el metodo proporcionado en el presente documento no se limita a composiciones especificas o etapas del proceso, ya que puede variar. Se observa que, tal como se utiliza en esta especificacion y en las reivindicaciones adjuntas, la forma singular “un”, “una” y “la” incluyen referentes singulares y plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Un anticuerpo aislado, o fragmento de union a antigeno del mismo, que se une especificamente a un polipeptido de toxina alfa (por ejemplo, monomero de toxina alfa, se refiere aqui como un “anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa” en forma singular y como “fragmentos y Anticuerpos anti toxina -alfa” en forma plural. Los polipeptidos de toxinas alfa a veces se denominan alfa hemolisina. La toxina alfa forma poros en las membranas celulares despues de la oligomerizacion en un heptamero, donde los polipeptidos oligomerizados a veces se denominan colectivamente como un “poro de toxina alfa”, o “heptamero de toxina alfa”.
Los aminoacidos a menudo se mencionan aqui mediante los simbolos de tres letras comunmente conocidos o por los simbolos de una letra recomendados por la Comision de Nomenclatura Bioquimica IUPAC-IUB. Los nucleotidos, de la misma manera, a menudo son referidos por codigos de una sola letra comunmente aceptados.
La numeracion de los aminoacidos en el dominio variable, la region determinante de la complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo sigue, a menos que se indique lo contrario, la definicion de Kabat segun lo expuesto en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991). Usando este sistema de numeracion, la secuencia de aminoacidos lineal real puede contener menos aminoacidos o aminoacidos adicionales correspondientes a un acortamiento o insercion en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una insercion de un solo aminoacido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) despues del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) despues de la cadena pesada Fr residuo 82. La numeracion de residuos de Kabat puede determinarse para un anticuerpo dado mediante el alineamiento en regiones de homologia de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat “estandar”. La alineacion maxima de los residuos de la estructura frecuentemente requiere la insercion de residuos “espaciadores” en el sistema de numeracion, para ser utilizados para la region Fv. Ademas, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier numero de sitio Kabat dado puede variar de cadena de anticuerpo a cadena de anticuerpo debido a interespecies o divergencia alelica.
Anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa
En el presente documento se divulga un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa esta aislado y/o purificado y/o libre de pirogenos. El termino “purificado” como se usa en este documento, se refiere a una molecula de interes, que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su ambiente natural. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo proporcionado es un anticuerpo purificado en el que se ha separado de uno o mas componentes de su entorno natural. El termino “anticuerpo aislado” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otras moleculas de anticuerpo que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a la toxina alfa esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especificamente a otros antigenos distintos de la toxina alfa). Una molecula de anticuerpo bi o multi-especifica es un anticuerpo aislado cuando esta sustancialmente libre de otras moleculas de anticuerpo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados son anticuerpos aislados donde se han separado de anticuerpos con una especificidad diferente. Un anticuerpo aislado puede ser un anticuerpo monoclonal. Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a un epitopo, isoforma o variante de toxina alfa de S. aureus puede tener reactividad cruzada con otros antigenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homologos de especies de Staphylococcus). Un anticuerpo aislado como se proporciona puede estar sustancialmente libre de uno o mas de otros materiales celulares. En el presente documento se proporciona una combinacion de anticuerpos monoclonales “aislados”, y se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y se combinan en una composicion definida. Los metodos de produccion y purificacion/aislamiento de un anticuerpo o fragmento antitoxina alfa se describen aqui con mas detalle.
Los anticuerpos aislados presentados comprenden secuencias de aminoacidos de anticuerpos divulgadas en el presente documento, que pueden codificarse por cualquier polinucleotido adecuado. Los anticuerpos aislados a veces se proporcionan de manera formulada. Se divulga en el presente documento, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une a la toxina alfa de S. aureus y, por lo tanto, altera parcial o sustancialmente al menos una actividad biologica de la toxina alfa, por ejemplo, la oligomerizacion en el complejo heptamero activo.
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa a menudo se une de forma inmunoespedfica a uno o mas epitopos espedficos de la proteina toxina alfa, peptido, subunidad, fragmento, porcion, oligomeros o cualquier combinacion de los mismos y, en general, no se unen espedficamente a otros polipeptidos. El termino “oligomeros” u “oligomeros de toxina alfa” se refiere a una asociacion de monomeros toxina alfa (por ejemplo, 2 monomeros, 3 monomeros, 4 monomeros, 5 monomeros, 6 monomeros o 7 monomeros) para formar un poro funcional (por ejemplo, 7 monomeros de alfa de toxinas). Un epitopo puede comprender al menos una region de union a anticuerpo que comprende al menos una porcion de la proteina toxina alfa. El termino “epitopo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante proteico capaz de unirse a un anticuerpo. Los epitopos generalmente incluyen agrupaciones superficiales quimicamente activas de moleculas tales como aminoacidos y/o cadenas laterales de azucar y generalmente tienen caracteristicas estructurales tridimensionales espedficas, asi como caracteristicas quimicas espedficas (por ejemplo, carga, polaridad, basica, acida, hidrofobicidad y similares). Los epitopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la union a los primeros, pero no los ultimos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epitopo reconocido interfiere con la formacion del heptamero activo (por ejemplo, inhibe la oligomerizacion de monomeros toxina alfa en un complejo de heptamero activo).
El epitopo comprende al menos una porcion de la proteina toxina alfa, que esta implicada en la formacion de un complejo heptamero toxina alfa. Un epitopo especificado puede comprender cualquier combinacion de al menos una secuencia de aminoacidos de al menos 3 residuos de aminoacidos en la porcion especificada completa de aminoacidos contiguos de la proteina toxina alfa. El epitopo es al menos 4 residuos de aminoacidos, al menos 5 residuos de aminoacidos, al menos 6 residuos de aminoacidos, al menos 7 residuos de aminoacidos, al menos 8 residuos de aminoacidos, al menos 9 residuos de aminoacidos, en al menos 10 residuos de aminoacidos, al menos 11 residuos de aminoacidos, al menos 12 residuos de aminoacidos, al menos 13 residuos de aminoacidos, al menos 14 residuos de aminoacidos, o al menos 15 residuos de aminoacidos a la porcion especificada completa de aminoacidos contiguos de la proteina toxina alfa. El epitopo comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoacidos contiguos o no contiguos. Los residuos de aminoacidos comprendidos dentro del epitopo estan implicados en la formacion del complejo heptamero toxina alfa. Los residuos de contacto comprenden T261, T263, N264, K266 y K271. Los residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de la SEQ ID NO: 39. Los residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 y K271 de SEQ ID NO. 39. La porcion de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo comprende los aminoacidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39. La porcion de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo comprende los aminoacidos 248-277 de la SEQ ID NO: 39. La porcion de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo comprende los aminoacidos 173-201 y 261-272 de la SEQ ID NO: 39.
Por lo tanto, los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa aislados/purificados se unen inmunoespedficamente a una molecula que comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 39 y/o a una molecula que comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 40. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa tambien se unen a homologos u ortologos de toxinas alfa de diferentes especies, o a variantes de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39, donde la histidina en la posicion 35 se reemplaza por leucina, o se reemplaza con otros aminoacidos correspondientes a mutaciones H35 conocidas por un experto en la tecnica.
Regiones variables
Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se prepara a partir de un anticuerpo parental. El anticuerpo o fragmento anti-alfa puede estar abarcado dentro del anticuerpo parental. Como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo parental” se refiere a un anticuerpo que esta codificado por una secuencia de aminoacidos utilizada para la preparacion de la variante o derivado, definido en el presente documento. Un polipeptido original puede comprender una secuencia de anticuerpos nativa (es decir, una variante alelica que se produce de forma natural) o una secuencia de anticuerpos con modificaciones de secuencias de aminoacidos preexistentes (como otras inserciones, supresiones y/o sustituciones) de una secuencia que ocurre de forma natural. Un anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa son variantes del anticuerpo parental. Tal como se usa en el presente documento, el termino “variante” se refiere a un anticuerpo o fragmento antitoxina alfa que difiere en la secuencia de aminoacidos de un secuencia de aminoacido o fragmento de aminoacido anti-toxina alfa “parental” en virtud de la adicion, eliminacion y/o sustitucion. de uno o mas residuos de aminoacido en la secuencia del anticuerpo pariente.
La porcion de union a antigeno de un anticuerpo comprende uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse espedficamente a un antigeno (por ejemplo, toxina alfa). Se ha demostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro del termino “porcion de union a antigeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb, que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de complementariedad aislada (CDR). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, a menudo estan codificados por genes separados, se pueden unir, mediante metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite fabricarse como una cadena de protema unica en la que el VL y Las regiones VH se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv). Dichos anticuerpos de cadena simple tambien se incluyen dentro de los terminos “anticuerpo y” porcion de union a anMgeno “de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando tecnicas conocidas, y los fragmentos pueden seleccionarse para determinar la actividad de union de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de union a antigeno pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinante, o mediante escision enzimatica o quimica de inmunoglobulinas intactas.
Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa divulgados en el presente documento comprenden al menos un dominio de union a antigeno. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende un VH que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende un VL que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende un VH que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 y un VL que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Vease el Ejemplo 11, Tabla 7 para una representacion de las secuencias VH y VL tal como se presentan en el presente documento que pueden estar presentes en cualquier combination para formar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa, o estar presentes en una combinacion para formar un mAb como se divulga en el presente documento. El VH se selecciona de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. El VL se selecciona de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Ciertas secuencias de nucleotidos VH y VL se presentan en el Ejemplo 11, Tabla 8.
En el presente documento se divulgan los anticuerpos aislados o fragmentos de union a antigeno del mismo que comprenden un VH y un VL, donde el VH y el VL tienen secuencias de aminoacidos representadas por las SEQ ID NO: 20 y 19; SEQ ID NOs; 22 y 21; SEQ ID NOs: 24 y 23; SEQ ID NOs: 26 y 25; SEQ ID NOs: 28 y 27; SEQ ID NOs: 41 y 42; SEQ ID NOs: 43 y 44; SEQ ID NOs: 45 y 46; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 49 y 50; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 53 y 54; SEQ ID NOs: 55 y 56; SEQ ID NOs: 57 y 58; SEQ ID NOs: 59 y 60; SEQ ID NOs: 61 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 63; SEQ ID NOs: 79 y 63.
Las Tablas 1-7 del Ejemplo 11 proporcionan regiones variables de cadena pesada (VH), regiones variables de cadena ligera (VL) y regiones determinantes de complementariedad (CDR) para ciertas realizaciones de los anticuerpos y fragmentos presentados en este documento. Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa comprenden un VH y/o VL que tiene un porcentaje dado de identification de al menos una de las secuencias VH y/o VL divulgadas en la Tabla 7. Como se usa en este documento, el termino “porcentaje de identidad de secuencia”, que tambien incluye “homologia”, se define como el porcentaje de residuos de aminoacidos o nucleotidos en una secuencia candidata que son identicos a los residuos de aminoacidos o nucleotidos en las secuencias de referencia, como la secuencia del anticuerpo pariente, despues de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje maximo de identidad de la secuencia, y no considerar ninguna sustitucion conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineacion optima de las secuencias para comparacion se puede producir, ademas de forma manual, por medio de algoritmos de homologia locales conocidos en la tecnica o por medio de programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin).
En el presente documento se divulga un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que puede comprender una secuencia de aminoacidos VH que comprende al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad a, o que comprende 100% de identidad con, la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluye una secuencia de aminoacidos VH al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identico a, o 100% identico a, la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61, o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-alfa comprende 1-10 sustituciones conservativas en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una secuencia de aminoacidos VH con un porcentaje dado se identifica con las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 tiene una o mas caracteristicas (que se describen con mas detalle a continuation) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (KD) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monomeros de toxinas alfa, pero no inhibe la union de la toxina alfa al receptor de toxinas alfa;
(c) inhibe la formation de oligomeros de toxinas alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%;
(d) reduce la actividad citolitica de la toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% (por ejemplo, segun lo determinado por los ensayos de hemolisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltracion celular y la liberacion de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en un modelo de neumoma animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une a un antigeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociacion (KD) en el rango de aproximadamente 0.01 nM a aproximadamente 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM 0.5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfaque puede comprender una secuencia de aminoacidos VL al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identica o 100% identica a la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede incluir una secuencia de aminoacidos VL de al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identica a, o 100% identica a la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende 1-10 sustituciones conservativas en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una secuencia de aminoacidos VL con un porcentaje dado se identifica con las SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 5254, 56, 58, 60 o 63 y tiene una o mas caracteristicas (que se describen con mas detalle a continuacion) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (KD) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monomeros de toxinas alfa, pero no inhibe la union de toxina alfa al receptor de toxina alfa;
(c) inhibe la formation de oligomeros de toxinas alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%;
(d) reduce la actividad citolitica de la toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%; (por ejemplo, segun lo determinado por los ensayos de hemolisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltracion celular y la liberacion de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumonia animal).
En el presente documento se divulga un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une a un antigeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociacion (Kd) en el rango de aproximadamente 0.01 nM a aproximadamente 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM 0.5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
En el presente documento se divulga un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se puede unir de forma inmunoespecifica a la toxina alfa y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43. 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos el 90% de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63, donde el anticuerpo tiene la actividad de inhibir la union de uno o mas monomeros toxina alfa entre si (por ejemplo, inhibe la oligomerization).
Regiones que determinan la complementariedad
Si bien el dominio variable (VH y VL) comprende la region de union al antigeno, la variabilidad no se distribuye de manera uniforme a traves de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR), tanto en la cadena ligera (VL o VK) como en los dominios variables de cadena pesada (VH). Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cuatro FR, que adoptan en gran parte una configuration de hoja p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de la hoja beta. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por la FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antigeno de los anticuerpos (ver, Kabat et al., Supra). Las tres CDR de la cadena pesada se designan VH-CDR1, VH CDR2 y VH-CDR-3, y las tres CDR de la cadena ligera se designan VL-CDR1, VL-CDR2 y VI-CDR3 El sistema de numeration de Kabat se utiliza aqui. Como tal, la VH-CDR1 comienza en aproximadamente el aminoacido 31 (es decir, aproximadamente 9 residuos despues del primer residuo de cistema), incluye aproximadamente 5-7 aminoacidos, y termina en el siguiente residuo de serina. La VH-CDR2 comienza en el decimoquinto residuo despues del final de la CDR-H1, incluye aproximadamente 16-19 aminoacidos y termina en el siguiente residuo de glicina. VH-CDR3 comienza en aproximadamente el trigesimo residuo de aminoacido despues del final de VH-CDR2; incluye aproximadamente 13-15 aminoacidos; y termina en la secuencia M-D-V. La VL-CDR1 comienza en aproximadamente el residuo 24 (es decir, despues de un residuo de cistema); incluye aproximadamente 10-15 residuos; y termina con la secuencia Y - V - S. VL-CDR2 comienza en aproximadamente el decimosexto residuo despues del final de VL-CDR1 e incluye aproximadamente 7 residuos. VL-CDR3 comienza aproximadamente en el trigesimo tercer residuo despues del final de VH-CDR2; incluye aproximadamente 7-11 residuos y termina en la secuencia TI-L. Tenga en cuenta que las CDR varian considerablemente de un anticuerpo a otro (y, por definicion, no mostraran homolog^a con las secuencias de consenso de Kabat).
Los presentes anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa comprenden al menos un dominio de union a antigeno que incluye al menos una region determinante de complementariedad (CDR1, CDR2 o CDR3). Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende un VH que incluye al menos una CDR de VH (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2 o CDR-H3). Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento antitoxina alfa que comprende una VL que incluye al menos una CDR de VL (por ejemplo, CDR-L1, CDR-L2 o CDR-L3).
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que se une inmunoespecificamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus incluye, (a) una CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica o que comprende 1, 2 o 3 residuos de aminoacidos sustituciones relativas a la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; y (c) una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71,72, 76 o 78.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que comprende una VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 que comprenden secuencias de aminoacidos identicas o que comprenden 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en cada CDR en relacion con las SEQ ID NO.: 7, 8 y 9; SEQ ID NO: 10, 11 y 12; SEQ ID NO: 13, 14 y 15; SEQ ID NO: 7, 17 y 18; SEQ ID NOs: 7, 8 y 16; SEQ ID NOs: 7, 8 y 65; SEQ ID NO: 7, 8 y 66; SEQ ID NOs 7, 8 y 67; SEQ ID NOs: 7, 8 y 78; SEQ ID NO: 69, 70 y 71; SEQ ID NO: 7, 8 y 72; SEQ ID NO: 69, 75 y 71; SEQ ID NO: 69, 75 y 76; o SEQ ID NOs: 69, 70 y 71.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que se une inmunoespecificamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus incluye, (a) una CDR1 de VL que comprende una secuencia de aminoacidos identica o que comprende 1, 2 o 3 residuos de aminoacidos sustituciones relativas a la SEQ ID NO: 1 o 4; (b) una VL CDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (c) una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que comprende una VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que comprenden secuencias de aminoacidos identicas a, o que comprenden 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en cada CDR en relacion con las SEQ ID NO.: 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 4, 5 y 6; SEQ ID NOs: 1, 2 y 64; SEQ ID NOs: 1,2 y 68; SEQ ID NOs: 1, 73 y 74; o SEQ ID NOs: 1, 77 y 74.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que se une inmunoespecificamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus comprende un VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que comprenden secuencias de aminoacidos identicas a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en cada CDR en relacion con: (a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; (c) una VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78; (d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 4; (e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74.
Se divulga en el presente documento el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que comprende una VH CDR1, Vh CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 que comprenden secuencias de aminoacidos identicas o que comprenden 1, 2 o 3 aminoacidos. sustituciones de residuos en cada CDR en relacion con las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 10, 11, 12, 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 13, 14, 15, 4, 5 y 6; SEQ ID NO: 7, 17, 18, 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 7, 8, 16, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1,2 y 64; SEQ ID NOs; 7, 8, 66, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 7, 8, 67, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 78, 1, 2 y 64; SEQ ID NO: 7, 8, 65, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 7, 8, 72, 1, 73 y 74; SEQ ID NO: 69, 75, 71, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 2 y 68; SEQ ID NO: 69, 75, 76, 1, 77 y 74; SEQ ID NO: 69, 70, 71, 1, 77 y 74,
Se divulga en el presente documento una composicion que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de union a antigeno del mismo que (i) incluye un dominio de cadena VH que comprende tres CDR y un dominio de cadena VL que comprende tres CDR; y (ii) se une inmunoespecificamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus, donde las tres CDR del dominio de la cadena VH incluyen (a) una CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; y (c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71,72, 76 o 78. La VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 corresponden a las SEQ ID NO: 7, 8 y 9; SEQ ID NO: 10, 11 y 12; SEQ ID NO: 13, 14 y 15; SEQ ID NO: 7, 17 y 18; SEQ ID NOs: 7, 8 y 16; SEQ ID NOs: 7, 8 y 65; SEQ ID NO: 7, 8 y 66; SEQ ID NOs 7, 8 y 67; SEQ ID NOs: 7, 8 y 78; SEQ ID NO: 69, 70 y 71; SEQ ID NO: 7, 8 y 72; SEQ ID NO: 69, 75 y 71; SEQ ID NO: 69, 75 y 76; o SEQ ID NOs: 69, 70 y 71.
Se divulga en el presente documento una composicion que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de union a antigeno del mismo que (i) incluye un dominio de cadena VH que comprende tres CDR y un dominio de cadena VL que comprende tres CDR; y (ii) se une inmunoespedficamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus, donde las tres CDR del dominio de la cadena VL incluyen (a) una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 4; (b) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (c) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74. La VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 corresponden a las SEQ ID NO: 1, 2 y 3; SEQ ID NO: 4, 5 y 6; SEQ ID NOs: 1, 2 y 64; SEQ ID NOs: 1,2 y 68; SEQ ID NOs: 1, 73 y 74; o SEQ ID NOs: 1, 77 y 74.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une de forma inmunoespedfica a toxina alfa de S. aureus y comprende (a) una VH CDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos con respecto a la SEC. ID NO: 7, 10, 13 o 69; (b) una CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75; y (c) una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78; (d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 o 4; (e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77; y (f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74 y tiene una o mas caracteristicas (que se describen con mas detalle a continuacion) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) afinidad constante (Kd) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monomeros de toxinas alfa, pero no inhibe la union de toxina alfa al receptor de toxina alfa;
(c) inhibe la formation de oligomeros de toxinas alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%;
(d) reduce la actividad citolitica de la toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%; (por ejemplo, segun lo determinado por ensayos de hemolisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltration celular y la liberation de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumonia animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une a un antigeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociacion (Kd) en el rango de aproximadamente 0.01 nM a aproximadamente 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM 0.5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Ejemplo 11, las Tablas 1-7 proporcionan secuencias para VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 para anticuerpos de la presente invention. La Tabla 9 proporciona un resumen de las CDR de VH y VL. Estas regiones pueden combinarse en una variedad de combinaciones, ya que cada region CDR puede seleccionarse independientemente para un anticuerpo dado. La Tabla 7 ilustra diferentes secuencias que pueden seleccionarse para cada region. Las secuencias VL CDR3 pueden estar presentes en cualquier combination para formar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa presente. La VH CDR1 se selecciona de la SEQ ID NO: 7, 10, 13 o 69, la VH CDr 2 se selecciona de la SEQ ID NO: 8, 11, 14, 17, 70 o 75 y la VH CDR3 se selecciona de SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71,72, 76 o 78 como se muestra en la Tabla 9. La VL CDR1 se selecciona de la SEQ ID NO: 1 o 4, la VL CDR2 se selecciona de la SEQ ID NO: 2, 5, 73 o 77 y la VL CDR3 se selecciona de la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74 como se muestra en la Tabla 9.
Los dominios VH CDR3 y VL CDR3 cumplen una funcion en la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo por un antigeno. (de acuerdo con un anticuerpo anti-toxina alfa o un fragmento o fragmento de union a antigeno del mismo comprende una VH CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEC ID No. : SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71,72, 76 o 78. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una CDR3 de VL que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74. Las porciones restantes de los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa (por ejemplo, CDR1, CDR2, VH, VL y similares) pueden comprender secuencias espedficas descritas en el presente documento o secuencias conocidas que proporcionan los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa que se unen de forma inmunoespedfica a S. toxina alfa aureus.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une de forma inmunoespedfica a la toxina alfa y comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71,72, 76 o 78, donde el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno inhibe la oligomerizacion de la toxina alfa.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une de forma inmunoespedfica a toxina alfa y comprende una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74, donde el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno inhibe la oligomerizacion de la toxina alfa.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une de forma inmunoespedfica a la toxina alfa y comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78, donde el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno reduce o inhibe la liberation de citoquinas.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une de forma inmunoespedfica a toxina alfa y comprende una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74, donde el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno reduce o inhibe la liberacion de citoquinas.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une de forma inmunoespedfica a la toxina alfa y comprende una CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 9, 12, 15, 18, 16, 65, 66, 67, 71, 72, 76 o 78, donde el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno alivia o elimina la dermonecrosis.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une de forma inmunoespedfica a toxina alfa y comprende una VL CDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de residuos de aminoacidos en relacion con la SEQ ID NO: 3, 6, 64, 68 o 74, donde el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno alivia o elimina la dermonecrosis.
Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa a menudo comprenden una o mas secuencias de aminoacidos sustancialmente iguales a una secuencia de aminoacidos descrita en este documento. Las secuencias de aminoacidos que son sustancialmente iguales incluyen secuencias que comprenden sustituciones de aminoacidos conservativas, asi como supresiones y/o inserciones de aminoacidos. Una sustitucion de aminoacidos conservativa se refiere a la sustitucion de un primer aminoacido por un segundo aminoacido que tiene propiedades quimicas y/o fisicas (por ejemplo, carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilia) que son similares a las del primer aminoacido. Las sustituciones conservativas incluyen el reemplazo de un aminoacido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina (M), cisteina (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T.
Regiones marco
Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera comprenden cada uno cuatro regiones marco (en general FR1, FR2, FR3, FR4 o alternativamente FW1, FW2, FW3, FW4), que son las partes mas altamente conservadas de los dominios variables. Las cuatro regiones marco de la cadena pesada se designan aqui como VH-FW1, VH-FW2, VH-FW3 y VH-FW4, y las cuatro regiones marco de la cadena ligera se designan aqui VL-FW1, VL-FW2, VL-FW3 y VH-FW4. El sistema de numeration Kabat se usa aqui, y como tal, VH-FW1 comienza en la position 1 y termina en aproximadamente el aminoacido 30, VH-FW2 es aproximadamente del aminoacido 36 a 49, VH-FW3 es aproximadamente del aminoacido 66 a 94 y VH-FW4 es aproximadamente el aminoacido 103 a 113. VL-FW1 comienza en el aminoacido 1 y termina en aproximadamente el aminoacido 23, VL-FW2 es aproximadamente del aminoacido 35 a 49, VL-FW3 es aproximadamente del aminoacido 57 a 88 y VL-FW4 es aproximadamente del aminoacido 98 a 107. Las regiones marco contienen sustituciones de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, por ejemplo, insertion a 106A en VL-FW1. Ademas de las sustituciones naturales, tambien pueden introducirse una o mas alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de residuos de FR en un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa. Estas alteraciones dan como resultado una mejora u optimization en la afinidad de union del anticuerpo para anti-toxina alfa. Los ejemplos no limitantes de residuos de la region marco que pueden modificarse incluyen aquellos que se unen de forma no covalente al antigeno directamente, interaction con/efectuan la conformation de una CDR y/o participan en la interfaz VL-VH.
Una region marco puede comprender uno o mas cambios de aminoacidos para los fines de la “estirpe germinal”. Por ejemplo, las secuencias de aminoacidos de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos seleccionados se comparan con las secuencias de aminoacidos de las cadenas ligeras y pesadas de la estirpe germinal y, cuando ciertos residuos estructurales de las cadenas VL y/o VH seleccionadas difieren de la configuration de la estirpe germinal (por ejemplo, de la mutation somatica de los genes de inmunoglobulina utilizados para preparar la biblioteca de fagos), puede ser deseable “retromutacion” los residuos del marco alterado de los anticuerpos seleccionados a la configuracion de la estirpe germinal (es dedr, cambiar las secuencias de aminoacidos del marco de los anticuerpos seleccionados de modo que sean las mismas que las secuencias de aminoacidos del marco de la estirpe germinal). Dicha “retromutacion” (o “estirpe germinal”) de residuos del marco puede lograrse mediante metodos estandar de biologia molecular para introducir mutaciones espedficas (por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis mediada por PCR y similares). Se divulgan en el presente documento residuos del marco variable de la cadena ligera y/o pesada se vuelven a mutar. Se divulga en el presente documento una cadena pesada variable de un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo presentado esta mutada nuevamente. Se divulga en el presente documento una cadena pesada variable de un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o mas mutaciones anteriores.
Se divulga en el presente documento el VH de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa presentado en este documento que puede comprender FR1, FR2, FR3 y/o FR4 que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos con las regiones marco correspondientes (es decir, FR1 del anticuerpo X en comparacion con FR1 del anticuerpo Y) dentro de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 que es de aproximadamente 65% a alrededor del 100%. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una secuencia de aminoacidos VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identico a, o 100% identico a, el FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una secuencia de aminoacidos VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% identico a, o 100% identico al FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que puede comprender un VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoacidos en relacion con, FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62. En particular, Fr 1, FR2, FR3 o FR4 del VH pueden tener cada uno una secuencia de aminoacidos identica o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoacidos en relacion con el FR1, FR2, FR3 o FR4 correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62.
Se divulga en el presente documento la VL de un anticuerpo anti-toxina alfa o fragmento aqui proporcionado que puede comprender FR1, FR2, FR3 y/o FR4 que tiene una identidad de secuencia de aminoacidos con las regiones marco correspondientes (es decir, FR1 del anticuerpo X en comparacion con FR1 del anticuerpo Y) dentro del FR de VL SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63 (por ejemplo, de aproximadamente 65 % a aproximadamente el 100% de identidad de secuencia). Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una secuencia de aminoacidos VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% identico a, o 100% identico a, el FR correspondiente de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 58, 60 o 63. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una secuencia de aminoacidos VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% identico a, o 100% identico a, el FR correspondiente de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende un VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoacidos en relacion con, la correspondiente FR de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. En particular, FR1, FR2, FR3 o FR4 de la VL pueden tener cada uno una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoacidos con relacion a las FR1, FR2, FR3 o FR4 correspondientes de VH SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une de forma inmunoespedfica a toxina alfa y comprende un VH FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1,2 o 3 aminoacidos sustituciones relativas a, el FR correspondiente de VH SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62 y/o VL FR (FR1, FR2, FR3 y/o FR4) que comprende una secuencia de aminoacidos identica a, o que comprende 1, 2 o 3 sustituciones de aminoacidos en relacion con, el FR correspondiente de VL SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63, donde el anticuerpo tiene una o mas caracteristicas (que se describen con mas detalle a continuacion) seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (Kd) para toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monomeros de toxinas alfa, pero no inhibe la union de toxina alfa al receptor de toxina alfa;
(c) inhibe la formacion de oligomeros de toxinas alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%;
(d) reduce la actividad citolitica de la toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%; (por ejemplo, segun lo determinado por ensayos de hemolisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltracion celular y la liberation de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumoma animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une a un antigeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociacion (Kd) en el rango de aproximadamente 0.01 nM a aproximadamente 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM 0.5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Secuencias de nucleotidos que codifican anticuerpos y fragmentos anti toxina alfa
Ademas de las secuencias de aminoacidos descritas anteriormente, tambien se proporcionan secuencias de nucleotidos correspondientes a las secuencias de aminoacidos y que codifican los anticuerpos humanos, humanizados y/o quimericos divulgados en este documento. Se divulgan en el presente documento los polinucleotidos que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa descrito en el presente documento o fragmentos del mismo. Estas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de nucleotidos que codifican las secuencias de aminoacidos mencionadas anteriormente. Las secuencias de nucleotidos se proporcionan en el Ejemplo 11, Tabla 8. Por lo tanto, tambien se proporcionan secuencias polinucleotidicas que codifican regiones marco VH y VL que incluyen CDR y FR de anticuerpos descritos en el presente documento, asi como vectores de expresion para su expresion eficaz en celulas (por ejemplo, celulas de mamiferos). Los metodos para hacer un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa usando polinucleotidos se describen a continuation con mas detalle.
Tambien se incluyen los polinucleotidos que se hibridan en condiciones de hibridacion rigurosas o de menor rigurosidad, por ejemplo, como se define en el presente documento, con polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa. El termino “rigurosidad” como se usa en el presente documento se refiere a las condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura y concentration de sal) de un experimento de hibridacion para denotar el grado de homologia entre dos acidos nucleicos; cuanto mayor sea la rigurosidad, mayor porcentaje de homologia entre los dos acidos nucleicos.
Las condiciones de hibridacion rigurosas incluyen, pero no se limitan a, la hibridacion al ADN unido a un filtro en 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados Celsius seguido de uno o mas lavados en 0.2 x SSC/SDS al 0.1% a aproximadamente 50 - 65 grados centigrados, condiciones altamente estrictas, como la hibridacion al ADN unido a un filtro en 6X de SSC a aproximadamente 45 grados centigrados, seguida de uno o mas lavados en 0.1X SSC/0.2% SDS a aproximadamente 65 grados centigrados, o cualquier otra condiciones de hibridacion rigurosas conocidas.
Se divulga en el presente documento un acido nucleico o fragmento del mismo que puede codificar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa e hibridar en condiciones rigurosas a un acido nucleico que incluye una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleotidos que puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleotidos puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a un secuencia de nucleotidos de la SEQ iD NO: 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37 o 38. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluye una secuencia de nucleotidos que comprende al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleotidos que puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a una Secuencia de nucleotidos VH que codifica la secuencia de aminoacidos VH de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61, o 62. Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleotidos puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a una Secuencia de nucleotidos VH de la s Eq ID NO: 30, 32, 34, 36 o 38. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa esta codificado por una secuencia de nucleotidos que codifica VH que comprende al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% o 100% de identidad con una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 79, 59, 61 o 62.
Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleotidos que puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a una secuencia de nucleotidos VL que codifica la secuencia de aminoacidos VL de SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63. Se divulga en el presente documento una secuencia de polinucleotidos que puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a un Secuencia de nucleotidos VL de la SEQ ID NO: 29, 31,33, 35 o 37. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa esta codificado por una secuencia de nucleotidos que codifica VL que comprende al menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% o 100% de identidad con una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19, 21,23, 25, 27, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 o 63.
Se divulga en el presente documento una secuencia polinucleotidica que puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a VH secuencia de aminoacidos y una secuencia de nucleotidos que codifica un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% identico a la secuencia de aminoacidos VL, donde las secuencias VH y VL estan representadas por las SEQ ID NO: 20 y 19; SEQ ID NOs; 22 y 21; SEQ ID NOs: 24 y 23; SEQ ID NOs: 26 y 25; SEQ ID NOs: 28 y 27; SEQ ID NOs: 41 y 42; SEQ ID NOs: 43 y 44; SEQ ID NOs: 45 y 46; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 47 y 48; SEQ ID NOs: 49 y 50; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 51 y 52; SEQ ID NOs: 53 y 54; SEQ ID NOs: 55 y 56; SEQ ID NOs: 57 y 58; SEQ ID NOs: 59 y 60; SEQ ID NOs: 61 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 58; SEQ ID NOs: 62 y 63; SEQ ID NOs: 79 y 63.
Secuencias sustancialmente identicas pueden ser secuencias polimorficas, es decir, secuencias alternativas o alelos en una poblacion. Una diferencia alelica puede ser tan pequena como un par de bases. Secuencias sustancialmente identicas tambien pueden comprender secuencias mutagenizadas, que incluyen secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutacion puede comprender uno o mas cambios de residuos, una eliminacion de uno o mas residuos, o una insercion de uno o mas residuos adicionales.
Los polinucleotidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleotidos de los polinucleotidos puede determinarse, por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleotidos del anticuerpo, un polinucleotido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleotidos sintetizados quimicamente, que, brevemente, involucra la sintesis de oligonucleotidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridacion y ligado de los oligonucleotidos, y luego amplification de los oligonucleotidos ligados por PCR.
Un polinucleotido que codifica un anticuerpo tambien puede generarse a partir de acido nucleico a partir de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un acido nucleico que codifica un anticuerpo particular no esta disponible, pero la secuencia de la molecula del anticuerpo es conocida, un acido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse quimicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc del anticuerpo, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o acido nucleico, a veces ARN poliA , aislada de cualquier tejido o celula que exprese el anticuerpo, como celulas de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificacion por PCR utilizando cebadores sinteticos hibridables a los 3' y 5' extremos de la secuencia o mediante donation utilizando una sonda oligonucleotidica especifica para la secuencia del gen particular para identificar, por ejemplo, un clon de cDNA de una biblioteca de cDNa que codifica el anticuerpo. Los acidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse luego en vectores de clonacion replicables usando cualquier metodo conocido en la tecnica.
Una vez que se determina la secuencia de nucleotidos y la correspondiente secuencia de aminoacidos del anticuerpo, la secuencia de nucleotidos del anticuerpo puede manipularse usando metodos conocidos en la tecnica para la manipulation de secuencias de nucleotidos, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante, mutagenesis dirigida al sitio, PCR y similares, para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoacidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoacidos.
Como se usa en el presente documento, el termino “condiciones rigurosas” se refiere a las condiciones para la hibridacion y el lavado. Los expertos en la tecnica conocen metodos para optimizar la condition de temperatura de reaction de hibridacion. Los metodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se pueden utilizar cualquiera de los dos. Ejemplos no limitantes de condiciones de hibridacion rigurosas son la hibridacion en cloruro de sodio 6 x/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centigrados, seguido de uno o mas lavados en 0.2 x SSC, SDS al 0.1% a 50 grados centigrados. Otro ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas es la hibridacion en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centigrados, seguida de uno o mas lavados en 0.2 x SSC, SDS al 0.1% a 55 grados centigrados. Otro ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas es la hibridacion en cloruro de sodio 6 x/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centigrados, seguida de uno o mas lavados en 0.2 x SSC, SDS al 0.1% a 60 grados centigrados. A menudo, las condiciones de hibridacion rigurosas son la hibridacion en 6 * cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados centigrados, seguida de uno o mas lavados en 0.2 * SSC, 0.1% de SDS a 65 grados centigrados. Mas a menudo, las condiciones de rigor son fosfato de sodio 0.5 M, SDS al 7% a 65 grados Celsius, seguido de uno o mas lavados a 0.2 x SSC, SDS al 1% a 65 grados Celsius. Las temperaturas de hibridacion rigurosas tambien se pueden alterar (es decir, disminuir) con la adicion de ciertos disolventes organicos, formamida, por ejemplo. Los disolventes organicos, como la formamida, reducen la estabilidad termica de los polinucleotidos de doble cadena, de modo que la hibridacion se puede realizar a temperaturas mas bajas, mientras se mantienen las condiciones rigurosas y se prolonga la vida util de los acidos nucleicos que pueden ser labiles al calor.
Como se usa en el presente documento, la frase “hibridacion” o variaciones gramaticales de la misma, se refiere a la union de una primera molecula de acido nucleico a una segunda molecula de acido nucleico en condiciones de rigurosidad baja, media o alta, o en condiciones de sintesis de acido nucleico. La hibridacion puede incluir casos en los que una primera molecula de acido nucleico se une a una segunda molecula de acido nucleico, donde la primera y la segunda molecula de acido nucleico son complementarias. Como se usa en este documento, “hibrida especificamente” se refiere a la hibridacion preferencial en condiciones de sintesis de acido nucleico de un cebador, a una molecula de acido nucleico que tiene una secuencia complementaria al cebador en comparacion con la hibridacion a una molecula de acido nucleico que no tiene una secuencia complementaria. Por ejemplo, la hibridacion especifica incluye la hibridacion de un cebador a una secuencia de acido nucleico diana que es complementaria al cebador.
Los cebadores pueden incluir una subsecuencia de nucleotidos que puede ser complementaria a una secuencia de hibridacion de cebador de acido nucleico en fase solida o sustancialmente complementaria a una secuencia de hibridacion de cebador de acido nucleico en fase solida (por ejemplo, aproximadamente 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas del 99% identico al complemento de secuencia de hibridacion del cebador cuando esta alineado). Un cebador puede contener una subsecuencia de nucleotidos no complementaria o sustancialmente no complementaria a una secuencia de hibridacion de cebadores de acidos nucleicos en fase solida (por ejemplo, en el extremo 3' o 5' de la subsecuencia de nucleotidos en el cebador complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia de hibridacion de cebadores de fase solida).
Un cebador puede contener una modificacion tal como inosinas, sitios abasicos, acidos nucleicos bloqueados, ligantes de surcos menores, estabilizadores duplex (por ejemplo, acridina, espermidina), modificadores de Tm o cualquier modificador que cambie las propiedades de union de los cebadores o sondas
Un cebador puede contener una molecula o entidad detectable (por ejemplo, un fluoroforo, radioisotopo, agente colorimetrico, particula, enzima y similares). Cuando se desee, el acido nucleico puede modificarse para incluir una etiqueta detectable utilizando cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. La etiqueta puede incorporarse como parte de la sintesis o agregarse antes de utilizar el cebador en cualquiera de los procesos descritos en este documento. La incorporacion de la etiqueta puede realizarse en fase Kquida o en fase solida. La etiqueta detectable puede ser util para la deteccion de objetivos. El marcador detectable puede ser util para la cuantificacion de acidos nucleicos diana (por ejemplo, determinar el numero de copias de una secuencia particular o especie de acido nucleico). Cualquier etiqueta detectable adecuada para la deteccion de una interaccion o actividad biologica en un sistema puede ser seleccionada y utilizada apropiadamente por el experto. Ejemplos de marcadores detectables son marcadores fluorescentes como fluoresceina, rodamina y otros (por ejemplo, Anantha, et al., Biochemistry (1998) 37: 2709 2714; y Qu & Chaires, Methods Enzymol. (2000) 321: 353369); isotopos radiactivos (por ejemplo, 125I, 131I, 35S, 31P, 32P, 33P, 14C, 3H, 7Be, 28Mg, 57Co, 65Zn, 67Cu, 68Ge, 82Sr, 83Rb, 95Tc, 96Tc, 103Pd, 109Cd, y 127Xe); etiquetas de dispersion de luz (por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 6,214,560 y comercialmente disponibles de Genicon Sciences Corporation, California); etiquetas quimioluminiscentes y sustratos de enzimas (por ejemplo, dioxetanos y esteres de acridinio), etiquetas enzimaticas o de proteinas (por ejemplo, proteina de fluorescencia verde (GFP) o variante de color de las mismas, luciferasa, peroxidasa); otros marcadores o colorantes cromogenicos (por ejemplo, cianina) y otros cofactores o biomoleculas como la digoxigenina, estrepdavidina, biotina (por ejemplo, miembros de un par de enlaces como la biotina y avidina, por ejemplo), fracciones de captura de afinidad y similares. Un cebador puede marcarse con una fraccion resto de captura por afinidad. Tambien se incluyen en las etiquetas detectables aquellas etiquetas utiles para la modificacion de masas para la deteccion con espectrometria de masas (por ejemplo, espectrometria de masas de ionizacion por desorcion laser asistida por matriz (MALDI) y espectrometria de masas de electropulverizacion (ES)).
Un cebador tambien puede referirse a una secuencia polinucleotidica que hibrida con una subsecuencia de un acido nucleico objetivo u otro cebador y facilita la deteccion de un cebador, un acido nucleico objetivo o ambos, como con las balizas moleculares, por ejemplo. El termino “baliza molecular”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula detectable, donde la propiedad detectable de la molecula es detectable solo bajo ciertas condiciones especificas, lo que le permite funcionar como una senal especifica e informativa. Ejemplos no limitativos de propiedades detectables son, propiedades opticas, propiedades electricas, propiedades magneticas, propiedades quimicas y tiempo o velocidad a traves de una abertura de tamano conocido.
Una baliza molecular puede ser un oligonucleotido de cadena sencilla capaz de formar una estructura tallo-bucle, donde la secuencia de bucle puede ser complementaria a una secuencia de acido nucleico diana de interes y esta flanqueada por brazos complementarios cortos que pueden formar un tallo. El oligonucleotido puede estar marcado en un extremo con un fluoroforo y en el otro extremo con una molecula extintora. En la conformacion vastago-bucle, la energia del fluoroforo excitado se transfiere al interruptor, a traves de un acoplamiento dipolo-dipolo de largo alcance similar al observado en la transferencia de energia de resonancia de fluorescencia, o FRET, y se libera como calor en lugar de luz. Cuando la secuencia de bucle se hibrida con una secuencia objetivo espedfica, los dos extremos de la molecula se separan y la energia del fluoroforo excitado se emite como luz, generando una senal detectable. Las balizas moleculares ofrecen la ventaja adicional de que la eliminacion del exceso de sonda es innecesaria debido a la naturaleza de apagado automatico de la sonda sin hibridar. Las sondas de balizas moleculares pueden disenarse para discriminar o tolerar desajustes entre las secuencias de bucle y objetivo modulando las fuerzas relativas de la hibridacion de bucle-objetivo y la formacion del tallo. Como se menciona aqui, el termino “nucleotido no coincidente” o “no coincidencia” se refiere a un nucleotido que no es complementario a la secuencia objetivo en esa posicion o posiciones. Una sonda puede tener al menos una falta de coincidencia, pero tambien puede tener 2, 3, 4, 5, 6 o 7 o mas nucleotidos no coincidentes.
Caracteristicas biologicas de los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa
Un anticuerpo puede tener una o mas caracteristicas identicas o similares a un anticuerpo descrito en el presente documento, y con frecuencia posee una o mas de las caracteristicas biologicas que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antigeno, la toxina alfa. Como se usa aqui, las “caracteristicas biologicas” de un anticuerpo se refieren a una o mas de las caracteristicas bioquimicas, de union y funcionales, que se pueden utilizar para seleccionar anticuerpos para usos terapeuticos, de investigacion y de diagnostico. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos antitoxina alfa pueden ser iguales o diferentes con respecto a la union del epitopo, el direccionamiento, la afinidad, la neutralizacion y la inhibicion de la oligomerizacion o la formacion del complejo de poros de heptamero, por ejemplo.
Las caracteristicas bioquimicas de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluyen, entre otros, el punto isoelectrico (pl) y la temperatura de fusion (Tm). Las caracteristicas de union de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa incluyen, pero no se limitan a, especificidad de union; constante de disociacion (Kd), o su inversa, constante de asociacion (Ka), o su componente kon o koff; epitopo al que se une; capacidad para distinguir entre varias formas y/o preparaciones de toxina alfa (por ejemplo, recombinante, nativa, acetilada) y capacidad para unirse a antigenos solubles y/o inmovilizados. Las caracteristicas funcionales de un anticuerpo presentado aqui incluyen, pero no se limitan a, inhibicion de la union al receptor de toxina alfa, inhibicion de la oligomerizacion de toxina alfa, inhibicion de la expresion genica inducida por reacciones en cascada que responden a la expresion o actividad de toxina alfa, agotamiento de celulas que expresan toxina alfa, inhibicion del crecimiento de celulas que expresan toxina alfa, inhibicion de la localizacion de toxina alfa y proteccion en uno o mas S. aureus, toxina alfa o S. aureus y enfermedades o trastornos relacionados con la toxina alfa. Aqui se describen las caracteristicas de los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa y los metodos para modificar y ajustar esas caracteristicas. Los metodos para medir las caracteristicas de los anticuerpos son conocidos en la tecnica, algunos de los cuales se detallan a continuacion.
Caracteristicas de union
Como se describio anteriormente, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une de forma inmunoespedfica a al menos un epitopo espedfico o determinantes antigenicos de la proteina, peptido, subunidad, fragmento, porcion o cualquier combinacion de los mismos, exclusiva o preferentemente con respecto a otros polipeptidos. El termino “epitopo” o “determinante antigenico” como se usa en el presente documento se refiere a un determinante de proteina capaz de unirse a un anticuerpo, donde el termino “union” a menudo se relaciona con una union espedfica. Estos determinantes de proteinas o epitopos a menudo incluyen grupos de moleculas quimicamente activas en la superficie tales como aminoacidos o cadenas laterales de azucar, a menudo con caracteristicas estructurales tridimensionales espedficas y con caracteristicas de carga espedficas. Los epitopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la union a los primeros, pero no los ultimos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El termino “epitopo discontinuo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un epitopo conformacional en un antigeno proteico formado a partir de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteina.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une inmunoespedficamente a la toxina alfa de Staphylococcus aureus y fragmentos antigenicos asociados con la oligomerizacion de la toxina alfa, de la misma. Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une inmunoespedficamente a la toxina alfa, o al menos cualquiera de los tres aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO: 39 o 40. Se divulga en el presente documento el epitopo es al menos 4 residuos de aminoacidos, al menos 5 residuos de aminoacidos, al menos 6 residuos de aminoacidos, al menos 7 residuos de aminoacidos, al menos 8 residuos de aminoacidos o al menos 9 residuos de aminoacidos en el porcion especificada completa de aminoacidos contiguos de la proteina toxina alfa. Se divulgan en el presente documento residuos de contacto que comprenden T261, T263, N264, K266 y K271. Se divulga en el presente documento residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de la SEQ ID NO: 39. Se divulga en el presente documento los residuos de contacto comprenden N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191, R200, T261, T263, N264, K266 y K271 de SEQ ID NO. 39. Se divulga en el presente documento la porcion de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que comprende los aminoacidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39. La porcion de la toxina alfa en contacto con el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo comprende los aminoacidos 248-277 de la SEQ ID NO: 39, o aminoacidos 173-201 y 261-272 de la SEQ ID NO: 39.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa asociado con su oligomerizacion de toxina alfa, se une inmunoespedficamente a un polipeptido toxina alfa o fragmento antigenico del mismo, que tiene al menos el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad, o 100% de identidad, a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39 o 40. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede a veces unirse de forma inmunoespedfica a un polipeptido toxina alfa o fragmento antigenico del mismo, con al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% de identidad, o 100% de identidad, a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39 o 40.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-alfa puede unirse a un epitopo conservado a traves de las especies. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une a los homologos u ortologos de toxina alfa y toxina alfa de S. aureus de otras especies bacterianas y sus fragmentos antigenicos. El anticuerpo o fragmento antitoxina alfa puede unirse a uno o mas ortologos de toxina alfa y/o isoformas. En una realizacion espedfica, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se une a la toxina alfa y fragmentos antigenicos asociados con la oligomerizacion de la toxina alfa de una o mas especies de bacterias que poseen homologos u ortologos de toxina alfa. Los anticuerpos o fragmentos anti-toxina alfa pueden unirse a un epitopo dentro de Staphylococcus u otras bacterias estrechamente relacionadas a traves de homologos de toxina alfa y/o isoformas y/o variantes y/o subtipos conformacionales.
Las interacciones entre antigenos y anticuerpos a menudo son las mismas que para otras interacciones protemaproteina no covalentes. En general, existen cuatro tipos de interacciones de union entre antigenos y anticuerpos: (i) enlaces de hidrogeno, (ii) fuerzas de dispersion, (iii) fuerzas electrostaticas entre los acidos de Lewis y las bases de Lewis, y (iv) interacciones hidrofobas. Las interacciones hidrofobas son una fuerza impulsora significativa para las interacciones anticuerpo-antigeno, y se basan en la repulsion del agua por grupos no polares en lugar de la atraccion de moleculas. Sin embargo, ciertas fuerzas fisicas tambien contribuyen a la union de antigeno-anticuerpo, por ejemplo, el ajuste o complementario de formas de epitopo con diferentes sitios de union de anticuerpo. Otros materiales y antigenos pueden reaccionar de forma cruzada con un anticuerpo, compitiendo asi con el anticuerpo libre disponible.
La medicion de una constante de afinidad y la especificidad de union entre el antigeno y el anticuerpo a menudo es un elemento para determinar la eficacia de los metodos terapeuticos, de diagnostico y de investigacion que utilizan anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa. La “afinidad de union” generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un unico sitio de union de una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de union (por ejemplo, un antigeno). A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, “afinidad de union” se refiere a la afinidad de union intrinseca que refleja una interaccion 1:1 entre miembros de un par de union (por ejemplo, anticuerpo y antigeno). La afinidad de una molecula X por su companero Y generalmente puede representarse por la constante de disociacion de equilibrio (Kd), que se calcula como la relacion koff/kon. La afinidad se puede medir mediante metodos comunes conocidos en la tecnica, incluidos los descritos y ejemplificados en este documento (por ejemplo, los metodos BiaCore). Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antigeno lentamente y tienden a disociarse facilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antigeno mas rapidamente y tienden a permanecer unidos por mas tiempo. Una variedad de metodos para medir la afinidad de union son conocidos en la tecnica, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente tecnologia.
Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa a veces tiene una afinidad de union por un epitopo de toxina alfa caracterizado por una constante de disociacion (Kd) de 1 * 10’2M o menos, 1 * 10’3M o menos, 1 * 10’4M o menos, 1 x 10’5M o menos, 1 * 10’6M o menos, 1 * 10’7M o menos, 1 * 10’8M o menos, 1 * 10’9M o menos, 1 * 10’10M o menos, 1 * 10-11M o menos, 1 * 10’12M o menos, 1 * 10’13M o menos, 1 * 10’14M o menos o 1 * 10’15M o menos. Por ejemplo, la Kd puede ser de 1 * 10'15M a 1 * 10’2M, de 1 * 10'14M a 1 * 10'10M, de 1 * 10’9M a 1 * 10’5M y de 1 * 10’4M a 1 * 10’2M.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo anti-toxina alfa y fragmentos es un anticuerpo de alta afinidad. Por “anticuerpo de alta afinidad” se entiende un anticuerpo que se une a un epitopo de toxina alfa con una afinidad inferior a 10'8 M (por ejemplo, 10’9M, 10’10M, y similares).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa tiene una afinidad de union de una molaridad espedfica o mejor. “O mejor” cuando se usa aqui se refiere a una union mas fuerte, representada por un valor numerico Kd mas pequeno. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad por un antigeno de “0.6 nM o mejor”, la afinidad del anticuerpo por el antigeno es < 0.6 nM, es decir, 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM y similares, o cualquier valor menor que 0.6 nM.
La afinidad de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se describe en terminos de la constante de asociacion (Ka), que se calcula como la relacion kon/koff. En este caso, los presentes anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa tienen afinidades de union para un epitopo de toxina alfa que incluyen una constante de asociacion (Ka) de 1 * 102M_1 o mas, 1 * 103M_1 o mas, 1 * 10M’1 o mas, 1 * 105M-1 o mas, 1 * 106 M’1 o mas, 1 * 107M_1 o mas, 1 * 108 M’1 o mas, 1 * 109 M’1 o mas, 1 * 1010 M’1 o mas 1 * 1011 M’1 o mas 1 * 1012 M’1 o mas, 1 * 1013 M’1 o mas, 1 * 1014 M’1 o mas o 1 * 1015 M’1 o mas. Por ejemplo, el Ka puede ser de 1 * 102M-1 a 1 * 107 M-1, de 1 * 107 M’1 a 1 * 1010 M-1, y de 1 * 1010 M’1 a 1 * 1015M- 1.
En ciertas realizaciones, la velocidad a la que un anticuerpo o fragmento anti-alfa toxina se disocia de un epitopo de toxina alfa puede ser relevante. En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-alfa toxina puede unirse a toxina alfa con un koff de menos de 10 'V , menos de 5x10'3 s-1, menos de 10 'V , menos de 5 x 10 'V , o menos de 10' 5s-1. La velocidad a la que los anticuerpos y fragmentos anti-alfa toxina se asocian con un epitopo de toxina alfa puede ser mas relevante que el valor de la Kd o la Ka. En este caso, los presentes anticuerpos y fragmentos anti-alfa toxina se unen a la toxina alfa con una tasa de kon de al menos 10'4M'1s'1, al menos 5 x 10-4 M 'V , al menos 105M'1s'1, al menos 5 x105 M 'V , al menos 106M 'V , al menos 5 x 106M 'V , al menos 107 M 'V .
La determinacion de la afinidad de union se puede medir utilizando las tecnicas especificas que se describen con mas detalle en la seccion Ejemplo, ver Ejemplo 1, y los metodos conocidos en la tecnica. Un ejemplo de tal metodo incluye medir la constante de disociacion “Kd” mediante un ensayo de union a antigeno radiomarcado (RIA) realizado con la version Fab de un anticuerpo de interes y su antigeno como se describe en el siguiente ensayo que mide la afinidad de union a la solucion de los Fab. para el antigeno mediante el equilibrio de Fab con una concentracion minima de antigeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulacion de antigeno no marcado, y luego se captura el antigeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab. Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microtitulacion (Dynex) se revisten durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (H 9.6), y posteriormente se bloquean con 2% (p/v) albumina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 grados centigrados). En una placa no adsorbente (Nunc # 269620), el antigeno [125I] de 100 pM o 26 pM se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interes. El Fab de interes se incuba luego durante la noche; sin embargo, la incubacion puede continuar por un periodo mas largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Despues de eso, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubar a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la solucion y la placa se lava ocho veces con 0.1% de Tween-20 en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150 jl/pozo de centelleante (MicroScint-20; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual al 20% de la union maxima se eligen para uso en ensayos de union competitiva.
En otro caso, el valor de Kd puede medirse utilizando ensayos de resonancia de plasmon de superficie, que se pueden realizar, por ejemplo, utilizando un BIAcore ™ -2000 o un BIAcore ™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, New Jersey) a 25 grados Celsius con chips CM5 de antigeno inmovilizado en ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, en un ejemplo de tal metodo, los chips biosensores de dextrano carboximetilados (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N '- (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) segun a las instrucciones del proveedor. El antigeno se diluye con acetato de sodio 110 mM, pH 4.8, en 5 jg/microlitro (~0.2 uM) antes de la inyeccion en un indice de fluidez de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteina acoplada. Despues de la inyeccion de antigeno, se inyecta etanolamina IM para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para las mediciones cineticas, se inyectan diluciones en serie de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0.05% (PBST) a 25 grados Celsius en un indice de fluidez de aproximadamente 25 jl/min. Las tasas de asociacion (kon) y las tasas de disociacion (koff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir uno a uno (BIAcore Evaluation Software version 3.2) ajustando simultaneamente el sensor de asociacion y disociacion.
Si la velocidad de activacion excede de 106 M - 1 s - 1 mediante el de resonancia de plasmon de superficie anterior, entonces la velocidad de activacion puede determinarse utilizando una tecnica de apagado fluorescente, por ejemplo, que mide el aumento o la disminucion de la emision de fluorescencia. Intensidad (excitacion = 295 nm; emision = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 grados Celsius de un anticuerpo anti-antigeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones crecientes de antigeno segun lo medido en un espectrometro, como un espectrofotometro equipado con flujo de parada (Aviv Instruments) o un espectrofotometro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja agitada. Tambien se puede determinar una “tasa de asociacion” o “tasa on” o “indice de asociacion” o “kon” segun esta tecnologia con la misma tecnica de resonancia de plasmon de superficie descrita anteriormente utilizando un BIAcore ™ -2000 o un BIAcore ™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) como se describio anteriormente.
Los metodos y reactivos adecuados para la determinacion de las caracteristicas de union de un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo presentado, o un derivado alterado/mutante del mismo (descrito mas adelante), son conocidos en la tecnica y/o estan disponibles comercialmente. El equipo y el software disenados para dichos analisis cineticos estan disponibles comercialmente (por ejemplo, los instrumentos Biacore® A100 y Biacore® 2000; Biacore International AB, Uppsala, Suecia).
Se divulga en el presente documento un ensayo de union que se puede realizar como ensayos de union directa o como ensayos de union competitiva. La union puede detectarse mediante ELISA estandar o ensayos estandar de citometria de flujo. En un ensayo de union directa, un anticuerpo candidato se analiza para determinar su union al antigeno toxina alfa. El ensayo de union competitiva, por otro lado, evalua la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un anticuerpo o fragmento anti-alfa conocido u otro compuesto que se une a la toxina alfa (por ejemplo, receptor, inhibidor). En general, cualquier metodo que permita la union de un anticuerpo con toxina alfa que puede detectarse esta incluido en el alcance de la presente tecnologia para detectar y medir las caracteristicas de union de los anticuerpos. Estos metodos tambien pueden utilizarse para seleccionar un panel de anticuerpos para aquellos que brindan una caractenstica deseada.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que se une inmunoespedficamente a la toxina alfa y tiene una o mas de las caracteristicas seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (Kd) para la toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monomeros de toxinas alfa, pero no inhibe la union de toxina alfa al receptor de toxina alfa;
(c) inhibe la formation de oligomeros de toxinas alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%;
(d) reduce la actividad citolitica de la toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% (por ejemplo, segun lo determinado por los ensayos de hemolisis y lisis celular);
(e) reduce la infiltration celular y la liberation de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en el modelo de neumonia animal).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo que se une a un antigeno (por ejemplo, toxina alfa) con una afinidad caracterizada por una constante de disociacion (Kd) en el rango de aproximadamente 0.01 nM a aproximadamente 50 nM, 0.05 nM, 0.1 nM 0.5 nM, 1 nN, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM o 40 nM.
Caracteristicas funcionales
En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa altera las propiedades biologicas de las celulas que expresan toxina alfa y/o toxina alfa. En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-alfa neutraliza la actividad biologica de la toxina alfa al unirse al polipeptido e inhibir el ensamblaje de monomeros de toxina alfa en un poro transmembrana (por ejemplo, heptamero de toxina alfa). Los ensayos de neutralization se pueden realizar utilizando metodos conocidos en la tecnica usando, en algunas circunstancias, reactivos disponibles comercialmente. La neutralizacion de la toxina alfa a menudo se mide con un IC50 de 1 * 10-6 M o menos, 1 * 10-7 M o menos, 1 * 10­ 8 M o menos, 1 * 10-9 M o menos, 1 * 10-10 M o menos y 1 * 10-11 M o menos. En ciertas realizaciones, la neutralizacion se produce cuando el anticuerpo o el fragmento de union al antigeno que se une inmunoespedficamente a la toxina alfa de S. aureus se encuentra en una concentration como se describe en los Ejemplos 3-6. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento anti-alfa neutraliza la capacidad de la toxina alfa para oligomerizar y formar un poro transmembrana. El termino “concentracion inhibitoria al 50%” (abreviado como “IC50”) representa la concentracion de un inhibidor (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa proporcionado en este documento) que se requiere para la inhibition del 50% de una actividad dada de la molecula al que se dirige el inhibidor (por ejemplo, la oligomerization de la toxina alfa para formar un complejo de heptamero de poros transmembrana). Un valor de CI50 mas bajo generalmente corresponde a un inhibidor mas potente.
El anticuerpo o fragmento anti-alfa inhibe una o mas actividades biologicas de la toxina alfa. El termino “inhibicion”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier disminucion estadisticamente significativa de la actividad biologica, incluido el bloqueo total de la actividad. Por ejemplo, “inhibicion” puede referirse a una disminucion de alrededor del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en la actividad biologica. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa inhibe una o mas actividades biologicas de la toxina alfa en al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100%.
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede agotar la toxina alfa secretada por S. aureus patogeno. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede lograr al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o aproximadamente el 100% de agotamiento de la toxina alfa secretada por S. aureus. En casos particulares, practicamente todas las toxinas alfa secretadas detectables se agotan de las celulas infectadas con S. aureus.
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede inhibir la actividad de toxina alfa estimulada in vitro (por ejemplo, la union al receptor, la oligomerizacion) y/o la proliferation de celulas que expresan o secretan toxina alfa. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa a veces inhibe la actividad de toxina alfa in vitro, patogenicidad de S. aureus en al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50% o al menos alrededor del 75%. Los metodos para medir la proliferacion celular, la patogenicidad y la actividad de la hemolisina alfa son conocidos en la tecnica.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-alfa puede inhibir la expresion de uno o mas genes inducibles que responden directa o indirectamente al ambiente creado por la infection por S. aureus y/o la expresion y funcion de la toxina alfa. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa inhibe la expresion de uno o mas genes inducibles que responden directa o indirectamente al ambiente creado por la infeccion por S. aureus y/o la expresion y funcion de la toxina alfa en al menos un 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 100%, al menos 120%, al menos 140%, al menos 160%, al menos 180% o al menos 200%.
Produccion de anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa
A continuacion se describen tecnicas ejemplares para la produccion de anticuerpos. Un antigeno de toxina alfa usado para la produccion de anticuerpos puede ser un fragmento peptidico que, por ejemplo, incluye una region de la secuencia peptidica de toxina alfa involucrada en la oligomerizacion. Los anticuerpos contra la toxina alfa pueden generarse utilizando la toxina alfa de S. aureus nativa que comprende la SEQ ID NO: 39, o la toxina alfa mutante que comprende la SEQ ID NO: 40, una variante o un fragmento antigenico de la misma. Las celulas de S. aureus que expresan y secretan toxina alfa tambien pueden usarse para generar anticuerpos. Los ejemplos de secuencias de nucleotidos y aminoacidos de toxina alfa estan disponibles como se proporciona en la Tabla 10, por ejemplo. La toxina alfa se puede producir de forma recombinante en una forma aislada a partir de celulas bacterianas o eucariotas utilizando la metodologia estandar de ADN recombinante. La toxina alfa se puede expresar como una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de epitopo) u otra proteina de fusion (por ejemplo, una fusion con GST) para facilitar el aislamiento asi como la identificacion en varios ensayos. Los anticuerpos o proteinas de union que se unen a varias etiquetas y secuencias de fusion estan disponibles como se detalla a continuacion. Tambien se pueden utilizar otras formas de toxina alfa utiles para generar anticuerpos.
Se conocen en la tecnica diversos polipeptidos marcados y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); gripe polipeptido etiqueta hA y su anticuerpo 12CA5; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10; y la etiqueta de la glicoproteina D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo. El peptido FLAG es reconocido por un anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. La purificacion de una proteina que contiene el peptido FLAG se puede realizar mediante cromatografia de inmunoafinidad utilizando una matriz de afinidad que comprende el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 unido covalentemente a la agarosa. Otros polipeptidos etiqueta incluyen el peptido epitopo KT3; un peptido de epitopo de a-tubulina; y la etiqueta peptido de la proteina 10 del gen T7.
Los anticuerpos policlonales para un antigeno de interes pueden producirse mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un polipeptido de toxina alfa o un fragmento inmunogenico del mismo puede administrarse a varios animales hospedadores, incluidos, entre otros, conejos, ratones, ratas y similares, para inducir la produccion de sueros que contienen anticuerpos policlonales especificos para el antigeno. Se pueden utilizar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunologica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen, entre otros, los geles minerales de Freund (completos e incompletos) como el hidroxido de aluminio, las sustancias tensioactivas como la lisolecitina, los polioles pluronicos y los polianiones., peptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente utiles como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes tambien son conocidos en la tecnica.
Los anticuerpos policlonales pueden producirse en animales mediante inyecciones subcutaneas multiples (sc) o intraperitoneales (ip) del antigeno relevante y un adyuvante. Puede ser util conjugar el antigeno relevante (especialmente cuando se usan peptidos sinteticos) con una proteina que es inmunogenica en la especie a inmunizar. Por ejemplo, el antigeno puede conjugarse con hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina serica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o de derivatizacion (grupo reactivo), por ejemplo, ester activado (conjugation a traves de residuos de cisteina o lisina), glutaraldehido, anhidrido succinico, SOCl2 o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los conjugados tambien se pueden hacer en cultivos de celulas recombinantes como proteinas de fusion.
Normalmente, los animales se inmunizan contra el antigeno, conjugados inmunogenicos o derivados combinando una concentration apropiada de antigeno o conjugado con adyuvante e inyectando la solution en multiples sitios. Las inmunizaciones tambien se pueden realizar como se describe en el Ejemplo 1 (inmunizacion/generacion de hibridomas).
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando una amplia variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, que incluyen el uso de tecnologias de hibridoma, recombinante y de fago, o una combination de ellas. El termino “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos o aislados, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especificos y se dirigen contra un unico sitio antigenico o multiples sitios antigenicos en el caso de anticuerpos de ingenieria multiespecifica. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra el mismo determinante en el antigeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminar por otros anticuerpos. El modificador “monoclonal” no debe interpretarse como que requiere la produccion del anticuerpo por ningun metodo en particular. A continuacion se describen los metodos representativos para producir anticuerpos monoclonales que no pretenden ser limitativos y se pueden utilizar para producir, por ejemplo, mamuferos monoclonales, quimericos, humanizados, dominios humanos, diacuerpos, anticuerpos, anticuerpos lineales y multiespecificos.
Los metodos para producir y seleccionar anticuerpos especificos usando tecnolog^a de hibridoma son rutinarios y conocidos en la tecnica. En el metodo de hibridoma, los ratones u otros animales hospedadores apropiados, como el hamster, se inmunizan como se describio anteriormente para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran especificamente al antigeno usado para la inmunizacion. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Despues de la inmunizacion, los linfocitos se aislan y luego se fusionan con una estirpe celular de mieloma utilizando un agente de fusion o un companero de fusion adecuado, como el polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma. En las celulas de mieloma seleccionadas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, apoyan una produccion estable de anticuerpos de alto nivel por parte de las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio selectivo que selecciona contra las celulas parentales no fusionadas. En un aspecto, las estirpes celulares de mieloma son estirpes de mieloma murino, como las derivadas de tumores de ratones MOPC-21 y MpC-11 disponibles en el Centro de Distribucion Celular del Instituto Salk, San Diego, California, EE. UU., SP-2 y derivados por ejemplo, las celulas X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Md., EE. UU. Tambien se han descrito estirpes celulares de mieloma humano y heteromieloma raton-humano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos.
Una vez que se identifican las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilucion y cultivarlos mediante metodos estandar. Los medios de cultivo adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal, por ejemplo, por inyeccion i.p. de las celulas en ratones.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, liquido ascitico o suero mediante procedimientos de purificacion de anticuerpos convencionales como, por ejemplo, cromatografia de afinidad (por ejemplo, Usando proteina A o proteina G-Sepharose) o cromatografia de intercambio ionico, etiquetas de afinidad, cromatografia de hidroxiapatita, electroforesis en gel, dialisis y similares. Los metodos de purificacion ejemplares se describen con mas detalle a continuacion.
Tecnicas de ADN recombinante
Los metodos para producir y seleccionar anticuerpos especificos usando tecnologia de ADN recombinante son rutinarios y conocidos en la tecnica. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se puede aislar y/o secuenciar facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas oligonucleotidicas que son capaces de unirse especificamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos murinos). Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresion, que luego se transfectan en celulas huesped como las celulas de E. coli, las celulas COS de simio, las celulas de ovario de hamster chino (CHO), o las celulas de mieloma que no producen proteina de anticuerpo, para Obtener la sintesis de anticuerpos monoclonales en las celulas hospedadoras recombinantes. Como se describe a continuacion para los anticuerpos generados por la presentacion de fagos y la humanizacion de anticuerpos, se puede obtener ADN o material genetico para anticuerpos recombinantes de una fuente (s) diferente a los hibridomas para generar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa.
La expresion recombinante de un anticuerpo o variante del mismo a menudo requiere la construccion de un vector de expresion que contenga un polinucleotido que codifica el anticuerpo. En el presente documento se proporcionan vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una molecula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una porcion del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera, unida operativamente a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleotidos que codifica la region constante de la molecula de anticuerpo y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para la expresion de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa o las cadenas pesada y ligera completas.
Una vez que un vector de expresion se transfiere a una celula huesped mediante tecnicas convencionales, las celulas transfectadas se cultivan mediante tecnicas convencionales para producir un anticuerpo. Por lo tanto, se proporcionan aqui las celulas huesped que contienen un polinucleotido que codifica un anticuerpo aislado o un fragmento de union a antigeno del mismo presentado o fragmentos del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o una porcion del mismo, o un anticuerpo de cadena simple en el presente documento, operativamente unido a un heterologo promotor. En ciertas realizaciones para la expresion de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican las cadenas pesada y ligera pueden expresarse conjuntamente en la celula huesped para la expresion de la molecula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuacion.
Las estirpes celulares de mamifero disponibles como hospedadores para la expresion de anticuerpos recombinantes son conocidas en la tecnica e incluyen muchas estirpes celulares inmortalizadas disponibles de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluidas, entre otras, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, bebe celulas de rinon de hamster (BHK), celulas de rinon de mono (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), celulas de rinon epitelial humano 293 y varias otras estirpes celulares. Diferentes celulas huesped tienen mecanismos caracteristicos y especificos para el procesamiento y la modificacion post-traduccionales de protemas y productos geneticos. Se pueden elegir estirpes celulares apropiadas o sistemas huesped para asegurar la modificacion y el procesamiento correctos del anticuerpo o la porcion del mismo expresada. Para este fin, se pueden utilizar celulas hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado de la transcripcion primaria, la glicosilacion y la fosforilacion del producto genico. Dichas celulas huesped de mamiferos incluyen, entre otras, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una estirpe celular de mieloma murino que no produce endogenamente cualquier cadena de inmunoglobulina funcional), celulas SP20, CRL7O3O y HsS78Bst. Estirpes celulares humanas desarrolladas inmortalizando linfocitos humanos pueden usarse para producir recombinantemente anticuerpos monoclonales. La estirpe celular humana PER.C6. (Crucell, Paises Bajos) se puede utilizar para producir recombinantemente anticuerpos monoclonales.
Las estirpes celulares adicionales que se pueden utilizar como huespedes para la expresion de anticuerpos recombinantes incluyen, pero no se limitan a, celulas de insecto (por ejemplo, Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o celulas de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, Pichia)., US7326681; etc), celulas de plantas (US20080066200); y celulas de pollo.
Los anticuerpos presentados en el presente documento se expresan en una estirpe celular con expresion estable del anticuerpo. La expresion estable se puede utilizar para la produccion a largo plazo de proteinas recombinantes de alto rendimiento. Por ejemplo, pueden generarse estirpes celulares que expresan de manera estable la molecula de anticuerpo. Las celulas hospedadoras pueden transformarse con un vector disenado apropiadamente que comprende elementos de control de la expresion (por ejemplo, promotor, potenciador, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion y similares), y un gen marcador seleccionable. Despues de la introduccion del ADN extrano, se puede permitir que las celulas crezcan durante 1-2 dias en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plasmido recombinante confiere resistencia a la seleccion y permite que las celulas que integran de forma estable el plasmido en sus cromosomas crezcan y formen focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en estirpes celulares. Los metodos para producir estirpes celulares estables con un alto rendimiento son conocidos en la tecnica y los reactivos estan generalmente disponibles comercialmente.
Los anticuerpos presentados en este documento se expresan en una estirpe celular con expresion transitoria del anticuerpo. La transfeccion transitoria es un proceso en el que el acido nucleico introducido en una celula no se integra en el genoma o el ADN cromosomico de esa celula. Un acido nucleico a menudo se mantiene como un elemento extracromosomico, por ejemplo, como un episoma, en la celula. Los procesos de transcripcion del acido nucleico del episoma no se ven afectados y se produce una proteina codificada por el acido nucleico del episoma.
La estirpe celular, que puede ser estable o transfectada de forma transitoria, se mantiene en medio de cultivo celular y las condiciones conocidas en la tecnica dan como resultado la expresion y produccion de anticuerpos monoclonales. Los medios de cultivo de celulas de mamiferos se basan en formulaciones de medios disponibles comercialmente, que incluyen, por ejemplo, DMEM o F12 de Ham. Los medios de cultivo celular se modifican para soportar aumentos tanto en el crecimiento celular como en la expresion de proteinas biologicas. Como se usa en este documento, los terminos “medio de cultivo celular”, “medio de cultivo” y “formulacion del medio” se refieren a una solucion nutritiva para el mantenimiento, crecimiento, propagacion o expansion de celulas en un entorno artificial in vitro fuera de un organismo multicelular o tejido. El medio de cultivo celular puede optimizarse para un uso especifico de cultivo celular, incluyendo, por ejemplo, medio de crecimiento de cultivo celular que se formula para promover el crecimiento celular, o medio de produccion de cultivo celular que se formula para promover la produccion de proteinas recombinantes. Los terminos nutriente, ingrediente y componente se usan indistintamente en el presente documento para referirse a los constituyentes que constituyen un medio de cultivo celular.
Las estirpes celulares se mantienen utilizando un metodo de alimentacion por lotes. Tal como se usa en el presente documento, “metodo de alimentacion por lotes”, se refiere a un metodo por el cual un cultivo celular de alimentacion por lotes recibe nutrientes adicionales luego de ser incubado con un medio basal. Por ejemplo, un metodo de alimentacion por lotes puede comprender agregar medios suplementarios de acuerdo con un programa de alimentacion determinado dentro de un periodo de tiempo determinado. Por lo tanto, un “cultivo celular discontinuo alimentado” se refiere a un cultivo celular donde las celulas, tipicamente mamiferos, y el medio de cultivo se suministran al recipiente de cultivo inicialmente y los nutrientes de cultivo adicionales se alimentan, continuamente o en incrementos discretos, al cultivo durante el cultivo. con o sin cosecha periodica de celulas y/o productos antes de la terminacion del cultivo.
El medio de cultivo celular utilizado y los nutrientes contenidos en el son conocidos en la tecnica. El medio de cultivo celular comprende un medio basal y al menos un hidrolizado, por ejemplo, hidrolizado a base de soja, hidrolizado a base de levadura o una combinacion de los dos tipos de hidrolizados que dan como resultado un medio basal modificado. Los nutrientes adicionales a veces pueden incluir solo un medio basal, como un medio basal concentrado, o pueden incluir solo hidrolizados o hidrolizados concentrados. Los medios basales adecuados incluyen, pero no se limitan a, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), DME/F12, medio esencial minimo (MEM), medio de aguila basal (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Medio esencial a-minimo (a-MEM), Medio esencial minimo de Glasgow (GMEM), PF CHO (vease, por ejemplo, medio libre de proteinas CHO (Sigma) o medio libre de suero EX-CELL ™ 325 PF CHO para celulas CHO sin proteinas (SAFC Bioscience), y el Medio de Dulbecco Modificado de Iscove. Otros ejemplos de medios basales que se pueden utilizar en la tecnologia de este documento incluyen medio basal BME; Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, polvo) (Gibco-Invitrogen (# 31600). El medio basal puede estar libre de suero, lo que significa que el medio no contiene suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), suero de caballo, suero de cabra o cualquier otro suero derivado de animales conocido en la tecnica) o Medios libres de proteinas animales o medios quimicamente definidos.
El medio basal puede modificarse para eliminar ciertos componentes no nutricionales que se encuentran en el medio basal estandar, como varios tampones inorganicos y organicos, surfactante (s) y cloruro de sodio. La elimination de dichos componentes del medio de celulas basales permite una mayor concentration de los componentes nutricionales restantes y puede mejorar el crecimiento celular general y la expresion de proteinas. Ademas, los componentes omitidos se pueden volver a agregar al medio de cultivo celular que contiene el medio de celulas basales modificado de acuerdo con los requisitos de las condiciones del cultivo celular. El medio de cultivo celular contiene un medio celular basal modificado, y al menos uno de los siguientes nutrientes, una fuente de hierro, un factor de crecimiento recombinante; un tampon; un surfactante un regulador de osmolaridad; una fuente de energia; y los hidrolizados no animales. Ademas, el medio de celulas basales modificado puede contener opcionalmente aminoacidos, vitaminas o una combination de ambos aminoacidos y vitaminas. El medio basal modificado contiene ademas glutamina, por ejemplo, L-glutamina y/o metotrexato.
La production de anticuerpos se lleva a cabo en gran cantidad mediante un proceso de biorreactor utilizando metodos de biorreactor de alimentation discontinua, discontinua, de perfusion o de alimentation continua conocidos en la tecnica. Los biorreactores a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, a veces entre 1.000 y 100.000 litros de capacidad. Estos biorreactores pueden utilizar impulsores agitadores para distribuir oxigeno y nutrientes. Los biorreactores de pequena escala se refieren generalmente al cultivo celular en una capacidad volumetrica de no mas de aproximadamente 100 litros, y pueden variar desde aproximadamente 1 litro hasta aproximadamente 100 litros. Alternativamente, los biorreactores de un solo uso (SUB) se pueden utilizar para el cultivo a gran escala o a pequena escala.
La temperatura, el pH, la agitation, la aireacion y la densidad del inoculo pueden variar segun las celulas huesped utilizadas y la proteina recombinante a expresar. Por ejemplo, un cultivo celular de proteina recombinante se puede mantener a una temperatura entre 30 y 45 grados Celsius. El pH del medio de cultivo se puede monitorear durante el proceso de cultivo de manera que el pH se mantenga en un nivel optimo, que puede ser para ciertas celulas huesped, dentro de un rango de pH de 6.0 a 8.0. Se puede utilizar una mezcla impulsada por impulsor para tales metodos de cultivo para agitacion. La velocidad de rotation del impulsor puede ser de aproximadamente 50 a 200 cm/seg., Pero se pueden utilizar otros sistemas de elevation aerea u otros sistemas de mezcla/aireacion conocidos en la tecnica, dependiendo del tipo de celula huesped que se este cultivando. Se proporciona una aireacion suficiente para mantener una concentracion de oxigeno disuelto de aproximadamente 20% a 80% de saturation de aire en el cultivo, nuevamente, dependiendo de la celula hospedadora seleccionada que se este cultivando. Alternativamente, un biorreactor puede expulsar aire u oxigeno directamente al medio de cultivo. Existen otros metodos de suministro de oxigeno, incluidos los sistemas de aireacion sin burbujas que emplean aireadores de membrana de fibra hueca.
Tecnicas de exhibition de fagos
Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando tecnicas como se conocen en la tecnica. En tales metodos, se puede aislar un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa mediante la selection de una biblioteca de anticuerpos combinatorios recombinantes, a veces una biblioteca de presentation de fagos scFv, preparada utilizando ADNc de VL y VH humanos preparados a partir de ARNm derivado de linfocitos humanos. Las metodologias para preparar y seleccionar tales bibliotecas son conocidas en la tecnica.
Purification y Aislamiento de Anticuerpos
Una vez que se ha producido una molecula de anticuerpo por expresion recombinante o hibridoma, se puede purificar por cualquier metodo conocido en la tecnica para la purificacion de una molecula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografia (por ejemplo, intercambio ionico, afinidad, particularmente por afinidad por el antigenos Proteina A o Proteina G y cromatografia en columna de tamano), centrifugation, solubilidad diferencial o cualquier otra tecnica estandar para la purificacion de proteinas. Ademas, los anticuerpos de la presente tecnologia o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias polipeptidicas heterologas (denominadas en este documento “etiquetas”) descritas anteriormente o conocidas de otro modo en la tecnica para facilitar la purificacion.
Anticuerpos humanizados
Los anticuerpos de la presente tecnologia son anticuerpos humanizados, que se generan usando metodos conocidos en la tecnica. Los anticuerpos humanizados pueden ser anticuerpos quimericos. Los anticuerpos quimericos son anticuerpos en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica o homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que otra parte de la cadena (s) es identico o homologo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biologica deseada. Los anticuerpos quimericos de interes en el presente documento incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias de union a antigeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Old World Monkey, como babuino, rhesus o mono cynomolgus) y secuencias de region constante humana.
Anticuerpos Humanos
Como una alternativa a la humanizacion, pueden generarse anticuerpos humanos utilizando metodos conocidos en la tecnica. Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de tales proteinas derivadas de ratas o murinas puede conducir a la rapida eliminacion de los anticuerpos o puede llevar a la generation de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por parte de un paciente. Para evitar la utilization de anticuerpos murinos o derivados de ratas, se pueden generar anticuerpos completamente humanos a traves de la introduction de loci de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamifero o animal, de modo que el roedor, otro mamifero o animal produzca anticuerpos completamente humanos.
Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, despues de la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de production de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminacion homocigotica del gen de la region de union de cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutantes quimericos y de estirpe germinal produce una inhibition completa de la produccion de anticuerpos endogenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de estirpe germinal humana en dichos ratones mutantes de estirpe germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposition con antigeno. En la practica, el uso de cepas XenoMouse® de ratones que han sido disenados para contener hasta un tamano inferior a 1000 kb conformo los fragmentos del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa. Las cepas XenoMouse® estan disponibles en Amgen, Inc. (Fremont, California).
La produccion de las cepas XenoMouse® de ratones y anticuerpos producidos en esos ratones es conocida en la tecnica. Esencialmente, las estirpes de ratones XenoMouse® se inmunizan con un antigeno de interes (por ejemplo, Alfa toxina), las celulas linfaticas (como las celulas B) se recuperan de los ratones hiperinmunizados, y los linfocitos recuperados se fusionan con un tipo mieloide estirpe celular para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales usando las tecnicas descritas anteriormente y conocidas en la tecnica. Estas estirpes celulares de hibridoma se seleccionan y seleccionan para identificar estirpes celulares de hibridoma que produjeron anticuerpos especificos para el antigeno de interes.
En un enfoque alternativo, el enfoque de minilocus, un locus de Ig exogeno se imita mediante la inclusion de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o mas genes VH, uno o mas genes DH, uno o mas genes JH, una region constante mu, y usualmente una segunda region constante (por ejemplo, una region constante gamma) se forman en una construction para la insertion en un animal.
La generacion de anticuerpos humanos de ratones en los que, a traves de la fusion de microcelulas, se han introducido grandes piezas de cromosomas o cromosomas completos, se conoce en la tecnica. Ademas, se han generado los ratones KM ™, que son el resultado del cruce de los ratones Tc de Kirin con los ratones minilocus (Humab) de Medarex. Estos ratones poseen el transcromosoma de IgH humano de los ratones Kirin y el transgen de la cadena kappa de los ratones Genpharm.
Los anticuerpos humanos tambien pueden derivarse por metodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen, entre otros, la presentation de fagos (MedImmune (anteriormente CAT), Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), exhibition de ribosomas (MedImmune (anteriormente CAT)), presentacion de levadura, y similares. La tecnologia de visualization de fagos se puede utilizar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta tecnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco en un gen de la proteina de la cubierta mayor o menor de un bacteriofago filamentoso, como M13 o fd, y se muestran como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la particula del fago. Debido a que la particula filamentosa contiene una copia de a Dn de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo tambien dan como resultado la selection del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la celula B. La visualizacion de fagos puede realizarse en una variedad de formatos. Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de gen V para la visualizacion de fagos. Se ha aislado una amplia gama de anticuerpos anti-oxazolona de una pequena biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos contra una variedad diversa de antigenos (incluidos los antigenos propios) esencialmente siguiendo las tecnicas conocidas en la tecnica. Como se discutio anteriormente, los anticuerpos humanos tambien pueden ser generados por celulas B activadas in vitro.
Los genes de inmunoglobulina experimentan varias modificaciones durante la maduracion de la respuesta inmunitaria, incluida la recombinacion entre los segmentos de los genes V, D y J, el cambio de isotipo y la hipermutacion en las regiones variables. La recombinacion y la hipermutacion somatica son la base para la generation de diversidad de anticuerpos y la maduracion de afinidad, pero tambien pueden generar predisposiciones de secuencia que pueden dificultar la production comercial de inmunoglobulinas como agentes terapeuticos o aumentar el riesgo de inmunogenicidad del anticuerpo. En general, es probable que las mutaciones en las regiones CDR contribuyan a mejorar la afinidad y la funcion, mientras que las mutaciones en las regiones marco pueden aumentar el riesgo de inmunogenicidad. Este riesgo se puede reducir al revertir las mutaciones del marco a la estirpe germinal al tiempo que se garantiza que la actividad del anticuerpo no se vea afectada negativamente. Los procesos de diversification tambien pueden generar algunas predisposiciones estructurales o estas predisposiciones estructurales pueden existir dentro de secuencias de la estirpe germinal que contribuyen a los dominios variables de la cadena pesada y ligera. Independientemente de la fuente, puede ser conveniente eliminar las posibles predisposiciones estructurales que pueden resultar en inestabilidad, agregacion, heterogeneidad del producto o aumento de la inmunogenicidad. Los ejemplos de responsabilidades indeseables incluyen cisteinas no pareadas (que pueden dar lugar a aleatorizacion de enlaces disulfuro, o formation variable de aductos de sulfhidrilo), sitios de glicosilacion unidos a N (que dan como resultado heterogeneidad de estructura y actividad), asi como desamidacion (por ejemplo, NG, NS) Sitios de isomerization (DG), oxidation (metionina expuesta) e hidrolisis (DP).
De acuerdo con lo anterior, para reducir el riesgo de inmunogenicidad y mejorar las propiedades farmaceuticas de los anticuerpos descritos en el Ejemplo 11, Tablas 1-8, puede ser deseable revertir una secuencia marco a la estirpe germinal, revertir una CDR a la estirpe germinal y/o eliminar una predisposition estructural. Por lo tanto, cuando un anticuerpo particular difiere de su secuencia de estirpe germinal respectiva en el nivel de aminoacidos, la secuencia de anticuerpo puede mutarse de nuevo a la secuencia de estirpe germinal. Dichas mutaciones correctivas pueden ocurrir en una, dos, tres o mas posiciones, o una combination de cualquiera de las posiciones mutadas, utilizando tecnicas estandar de biologia molecular.
Otros enfoques incluyen la tecnologia Velocimmune® (Regeneron Pharmaceuticals). La tecnologia Velocimmune® se puede utilizar para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para objetivos de interes terapeutico e implica la generacion de un raton transgenico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humana operativamente unidas a loci de region constante del raton endogeno, de manera que el raton produce un anticuerpo que comprende una region variable humana y una region constante de raton en respuesta a la estimulacion antigenica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aisla y esta unido operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada y ligera del ser humano. El ADN se expresa luego en una celula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 6,596,541.
Fragmentos de anticuerpos
Los presentes anticuerpos son fragmentos de anticuerpos o anticuerpos que comprenden estos fragmentos. El fragmento de anticuerpo comprende una portion del anticuerpo de longitud completa, que generalmente es la union a antigeno o region variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fd y Fv. Diacuerpos; anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpo de cadena simple; y los anticuerpos multiespecificos son anticuerpos formados a partir de estos fragmentos de anticuerpos.
T radicionalmente, estos fragmentos se derivaban a traves de la digestion proteolitica de anticuerpos intactos utilizando tecnicas conocidas en la tecnica. Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por celulas hospedadoras recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, lo que permite la produccion facil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH tambien pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse quimicamente para formar fragmentos F(ab')2. Segun otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de celulas hospedadoras recombinantes. Se conocen otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos. El anticuerpo de election es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). El anticuerpo no es un fragmento Fab, Fv y scFv son las unicas especies con sitios de combinacion intactos que carecen de regiones constantes; por lo tanto, son adecuados para una union no especifica reducida durante el uso in vivo. Las proteinas de fusion scFv pueden construirse para producir la fusion de una proteina efectora en el extremo amino o carboxi de un scFv.
Los actuales anticuerpos son anticuerpos de dominio, por ejemplo, anticuerpos que contienen las unidades de union funcionales pequenas de anticuerpos, correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de anticuerpos humanos. Los ejemplos de anticuerpos de dominio incluyen, entre otros, aquellos disponibles de Domantis que son especificos para dianas terapeuticas. Se pueden utilizar bibliotecas de anticuerpos de dominio disponibles comercialmente para identificar anticuerpos de dominio de toxina alfa. Los anticuerpos y fragmentos antitoxina alfa comprenden una unidad de union funcional de toxina alfa y una unidad de union funcional de receptor gamma Fc.
Los presentes anticuerpos son anticuerpos lineales. Los anticuerpos lineales comprenden un par de segmentos Fd en tandem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de union a antigeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecificos o monoespecificos.
Ciertas modificaciones de la secuencia de aminoacidos
Ademas de los anticuerpos humanos, humanizados y/o quimericos descritos anteriormente, la presente tecnologia tambien abarca modificaciones adicionales y, sus variantes y fragmentos de los mismos, de un anticuerpo o fragmento anti-alfa que comprende uno o mas de los siguientes: residuo de aminoacido y/o sustitucion, adicion y/o eliminacion de polipeptidos en el dominio variable ligero (VL) y/o dominio pesado variable (VH) y/o region Fc, y una modificacion postraduccional. Se incluyen en estas modificaciones los conjugados de anticuerpos en los que un anticuerpo se ha unido covalentemente a una fraccion. Las fracciones adecuadas para la union a los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, proteinas, peptidos, farmacos, marcadores y citotoxinas. Estos cambios en los anticuerpos pueden hacerse para alterar o ajustar las caracteristicas (por ejemplo, bioquimicas, de union y/o funcionales) de los anticuerpos segun sea apropiado para el tratamiento y/o diagnostico de enfermedades asociadas con S. aureus y/o toxina alfa. Los metodos para formar conjugados, realizar cambios de aminoacidos y/o polipeptidos y modificaciones postraduccionales son conocidos en la tecnica, algunos de los cuales se detallan a continuacion. Se puede hacer cualquier combinacion de eliminacion, insercion y sustitucion para llegar a una construccion final, siempre que la construccion final posea las caracteristicas deseadas.
Los cambios de aminoacidos en los anticuerpos dan como resultado secuencias que son menos del 100% identicas a una secuencia de anticuerpos o una secuencia de anticuerpos principal descrita en el presente documento. En este contexto, los anticuerpos pueden tener aproximadamente de 25% a aproximadamente 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos del dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o fragmento antitoxina alfa como se describe en el presente documento. Asi, un anticuerpo modificado puede tener una secuencia de aminoacidos que tenga al menos un 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad o similitud de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos del dominio variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o fragmento anti-alfa, como se describe en este documento. Un anticuerpo alterado tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia de aminoacidos o similitud con la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada o ligera CDR1, CDR2 o CDR3 de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa como se describe aqui. Un anticuerpo alterado a veces puede tener una secuencia de aminoacidos que tenga al menos 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de la identidad o similitud de una secuencia de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada o ligera FR1, FR2, FR3 o FR4 de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa como se describe en el presente documento.
Los anticuerpos alterados se generan por una o mas alteraciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones, delecion y/o adiciones) introducidas en una o mas de las regiones variables del anticuerpo. Las alteraciones de aminoacidos se introducen en las regiones marco. Una o mas alteraciones de los residuos de la region marco pueden dar como resultado una mejora en la afinidad de union del anticuerpo por el antigeno. Esto puede ser especialmente cierto cuando estos cambios se realizan en anticuerpos humanizados donde la region marco puede ser de una especie diferente a la de las regiones CDR. Los ejemplos de residuos de la region marco para modificar incluyen aquellos que se unen de forma no covalente al antigeno directamente, interactuan con/efectuan la conformacion de una CDR y/o participan en la interfaz VL-VH. Se pueden alterar de aproximadamente uno a aproximadamente cinco residuos de la estructura. A veces, esto puede ser suficiente para producir un anticuerpo mutante adecuado para su uso en ensayos preclinicos, incluso cuando ninguno de los residuos de la region hipervariable se haya alterado. Normalmente, sin embargo, un anticuerpo alterado comprendera alteracion (es) de la region hipervariable adicional. Los residuos de la region hipervariable pueden cambiarse aleatoriamente, especialmente cuando la afinidad de union inicial de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa para el antigeno de la segunda especie de mamifero es tal que tales anticuerpos producidos aleatoriamente pueden seleccionarse facilmente.
Un procedimiento util para generar anticuerpos alterados se llama “mutagenesis de exploracion alanina”. En este metodo, uno o mas de los residuos de la region hipervariable se reemplazan por uno o mas residuos de alanina o polialanina para alterar la interaccion de los aminoacidos con la toxina alfa. Los residuos de la region hipervariable que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan mediante la introduccion de mutaciones adicionales u otras en o para los sitios de sustitucion. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la naturaleza de la mutacion en si no necesita ser predeterminada. Los mutantes de Ala producidos de esta manera se analizan por su actividad biologica como se divulga en el presente documento.
La variante de sustitucion implica sustituir uno o mas residuos de la region hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para un mayor desarrollo tendra propiedades biologicas mejoradas en relacion con el anticuerpo parental a partir del cual se generan. Una forma conveniente de generar tales variantes de sustitucion implica la maduracion por afinidad utilizando fagos. En resumen, se mutan varios sitios de la region hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoacidos en cada sitio. Los mutantes de anticuerpos asi generados se muestran de forma monovalente a partir de particulas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada particula. Los mutantes mostrados en fagos se examinan luego para determinar su actividad biologica (por ejemplo, afinidad de union) como se describe en este documento.
Las mutaciones en las secuencias de anticuerpos pueden incluir sustituciones, supresiones, incluyendo supresiones internas, adiciones, incluyendo adiciones que producen proteinas de fusion, o sustituciones conservativas de residuos de aminoacidos dentro y/o adyacentes a la secuencia de aminoacidos, pero que resultan en un cambio “silencioso”, en que el cambio produce un fragmento o anticuerpo anti-toxina alfa funcionalmente equivalente. Se pueden realizar sustituciones de aminoacidos conservativas sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipatica de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoacidos no polares (hidrofobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina; los aminoacidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina y glutamina; Los aminoacidos cargados positivamente (basicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoacidos cargados negativamente (acidos) incluyen acido aspartico y acido glutamico. Ademas, la glicina y la prolina son residuos que pueden influir en la orientacion de la cadena. Las sustituciones no conservadoras implicaran el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Ademas, si se desea, pueden introducirse aminoacidos no clasicos o analogos de aminoacidos quimicos como una sustitucion o adicion en la secuencia del anticuerpo. Los aminoacidos no clasicos incluyen, pero no se limitan a, los isomeros D de los aminoacidos comunes, acido alfa-amino isobutirico, acido 4-aminobutirico, Abu, acido 2-amino butirico, gamma-Abu, epsilon-Ahx, Acido 6-aminohexanoico, Aib, acido 2-amino isobutirico, acido 3-amino propionico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, acido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, beta-alanina, fluoroaminoacidos, aminoacidos de diseno tal como aminoacidos beta-metilo, aminoacidos C-alfa-metilo, aminoacidos N-alfa-metilo, aminoacidos, y analogos de en general.
Cualquier residuo de cisteina que no este involucrado en el mantenimiento de la conformation adecuada de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa tambien puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molecula y prevenir la reticulation aberrante. A la inversa, los enlaces de cisteina se pueden agregar al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como un fragmento Fv).
Un anticuerpo puede modificarse para producir proteinas de fusion; es decir, el anticuerpo, o un fragmento del mismo, fusionado a una proteina, polipeptido o peptido heterologo. La proteina fusionada con la portion de un anticuerpo es un componente enzimatico de la terapia de profarmacos con enzimas dirigida por anticuerpos (ADEPT). Los ejemplos de otras proteinas o polipeptidos que pueden disenarse como una proteina de fusion con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a toxinas tales como ricina, abrina, ribonucleasa, DNasa I, enterotoxina A estafilococica, proteina antiviral de pokeweed, gelonina, difteria toxina, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas. Las toxinas enzimaticamente activas y sus fragmentos que se pueden utilizar incluyen la cadena de la difteria, los fragmentos activos no vinculantes de la toxina de la difteria, la cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena de la ricina A, la cadena de la abrina A, la cadena de modeccin A, la cadena alfa-sarcina, Aleurites proteinas fordii, proteinas diantinas, proteinas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de la momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos.
Se pueden generar proteinas de fusion adicionales a traves de tecnicas conocidas de combination aleatoria de genes, combination de motivos, combinacion de exones y/o combinacion de codones (denominados colectivamente como “combinacion de ADN”). El combinado de ADN puede emplearse para alterar las caracteristicas del anticuerpo o sus fragmentos (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo con afinidades mas altas y menores tasas de disociacion). Un anticuerpo puede ser ademas una proteina de fusion de inmunoglobulina de dominio de union como se conoce en la tecnica.
Regiones Fc Variantes
La presente invention tambien incluye miembros de union de la invention, y en particular los anticuerpos de la invention, que tienen dominios constantes de IgG modificados. Se utilizan anticuerpos de la clase de IgG humana, que tienen caracteristicas funcionales tales como una vida media larga en el suero y la capacidad de mediar diversas funciones efectoras (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)). El anticuerpo de clase IgG humana se clasifica adicionalmente en las siguientes 4 subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Hasta el momento, se han realizado una gran cantidad de estudios para ADCC y CDC como funciones efectoras del anticuerpo de clase IgG, y se ha informado que entre los anticuerpos de la clase IgG humana, la subclase IgG1 tiene la actividad ADCC y CDC mas alta en humanos. (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)).
“Citotoxicidad mediada por celulas dependientes de anticuerpos” y “ADCC” se refieren a una reaction mediada por celulas en la que celulas citotoxicas no especificas (por ejemplo, linfocitos citotoxicos (NK), neutrofilos y macrofagos) reconocen el anticuerpo unido en una celula objetivo y Posteriormente provocara la lisis de la celula diana. Dichas celulas son celulas humanas. Si bien no desean limitarse a ningun mecanismo de accion en particular, estas celulas citotoxicas que median la ADCC generalmente expresan los receptores Fc (FcR). Las celulas primarias para mediar ADCC, celulas NK, expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII, FcyRIII y/o FcyRIV. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en Ravetch y Kinet, Annu Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molecula, un ensayo in vitro de ADCC, como el que se describe en la patente de EE.UU. 5,500,362 o 5,821,337 pueden realizarse. Las celulas efectoras utiles para tales ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos citotoxicos naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de las moleculas de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al., Proc. Natl Acad Sci. (USA), 95: 652-656 (1998).
La “citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la capacidad de una molecula para iniciar la activacion del complemento y lisar un objetivo en presencia del complemento. La ruta de activacion del complemento se inicia mediante la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) en complejo con un antigeno relacionado. Para evaluar la activacion del complemento, un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996), pueden realizarse.
La expresion de la actividad ADCC y la actividad CDC de los anticuerpos de la subclase IgG1 humana generalmente involucra la union de la region Fc del anticuerpo a un receptor para un anticuerpo (en lo sucesivo, “FcyR”) que existe en la superficie de las celulas efectoras, como los linfocitos citotoxicos, linfocitos citotoxicos o macrofagos activados. Se pueden unir varios componentes del complemento. Con respecto a la union, se ha sugerido que varios residuos de aminoacidos en la region bisagra y el segundo dominio de la region C (en lo sucesivo denominado “dominio Cy2”) del anticuerpo son importantes (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) y que una cadena de azucar en el dominio Cy2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) Tambien es importante.
Las “celulas efectoras” son leucocitos que expresan uno o mas FcR y realizan funciones efectoras. Las celulas expresan al menos FcyRI, FCyRII, FcyRIII y/o FcyRIV y llevan a cabo la funcion efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), linfocitos citotoxicos naturales (NK), monocitos, celulas T citotoxicas y neutrofilos. Los terminos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Ademas, el FcR es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcyRIV, incluidas variantes alelicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activador”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmicos de los mismos. El receptor FcyRIIA de activacion contiene un motivo de activacion basado en tirosina inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmico. El receptor FcyRIIB inhibidor contiene un motivo de inhibicion basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmatico. (Ver, Daeron, Annu Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clinica Med., 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluidos los que se identificaran en el futuro, estan incluidos en el termino “FcR” en este documento. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., Immunol., 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24: 249 (1994)).
Se divulga en el presente documento un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que comprende una region Fc alterada (tambien denominada en este documento como “region Fc variante”) en la que se han realizado una o mas alteraciones en la region Fc para cambiar las propiedades funcionales y/o farmacocineticas de los anticuerpos. Dichas alteraciones pueden provocar una disminucion o un aumento de la union a C1q y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o de la union a FcgammaR, para IgG. La presente tecnologia abarca los anticuerpos descritos en el presente documento con regiones Fc variantes donde se han realizado cambios para alterar la funcion efectora, proporcionando un efecto deseado. De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa comprende una region Fc variante (es decir, regiones Fc que se han alterado como se describe mas adelante). Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa en el presente documento que comprenden una variante de la region Fc tambien se denominan aqui “anticuerpos variantes de Fc”. Tal como se usa aqui, nativo se refiere a la secuencia parental no modificada y el anticuerpo que comprende una region Fc nativa se denomina aqui como “anticuerpo Fc nativo”. La region Fc variante exhibe un nivel similar de funcion efectora de induction en comparacion con la region Fc nativa. La region Fc variante exhibe una mayor induccion de la funcion efectora en comparacion con el Fc nativo. La region Fc variante exhibe una menor induccion de la funcion efectora en comparacion con el Fc nativo. Algunas realizaciones especificas de las variantes de las regiones Fc se detallan aqui. Los metodos para medir la funcion del efector son conocidos en la tecnica.
La funcion efectora de un anticuerpo puede modificarse a traves de cambios en la region Fc, que incluyen, entre otros, sustituciones de aminoacidos, adiciones de aminoacidos, eliminaciones de aminoacidos y cambios en las modificaciones postraduccionales de los aminoacidos Fc (por ejemplo, glicosilacion). Los metodos descritos a continuation se pueden utilizar para alterar la funcion efectora de un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno como se describe en este documento, lo que resulta en un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que tiene ciertas propiedades ventajosas para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o afeccion asociada a estafilococo en particular.
Se divulga en el presente documento anticuerpo variante de Fc con propiedades de union alteradas para un ligando de Fc (por ejemplo, un receptor de Fc, C1q) con respecto a un anticuerpo de Fc nativo. Los ejemplos de propiedades de union incluyen, pero no se limitan a, especificidad de union, constante de disociacion de equilibrio (Kd), tasas de disociacion y asociacion (koff y kon respectivamente), afinidad de union y/o avidez. Se sabe en la tecnica que la constante de disociacion de equilibrio (Kd) se define como kf/kon. En ciertos aspectos, un anticuerpo que comprende una region variante de Fc con una baja Kd puede ser mas deseable para un anticuerpo con una alta Kd. Sin embargo, en algunos casos, el valor de kon o koff puede ser mas relevante que el valor de Kd. Se puede determinar que parametro cinetico es mas importante para una aplicacion de anticuerpo determinada.
Los anticuerpos de la variante de Fc exhiben afinidad de union alterada para uno o mas receptores de Fc que incluyen, entre otros, FcRn, FcgammaRI (CD64) que incluyen las isoformas FcgammaRIA, FcgammaRIB y FcgammaRlC; FcgammaRII (CD32 que incluye las isoformas FcgammaRIIA, FcgammaRIIB y FcgammaRIIC); y FcgammaRIII (CD16, incluidas las isoformas FcgammaRIIIA y FcgammaRIIIB) en comparacion con un anticuerpo Fc nativo.
Se divulga en el presente documento un anticuerpo variante de Fc que tiene una union mejorada a uno o mas ligandos de Fc en relacion con un anticuerpo Fc nativo. El anticuerpo de la variante Fc exhibe una afinidad aumentada o disminuida por un ligando Fc que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o esta entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, mas o menos que un anticuerpo Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por un ligando de Fc que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos el 20%, al menos el 10%, o al menos el 5% mas o menos que un anticuerpo Fc nativo. Un anticuerpo variante de Fc tiene una afinidad incrementada por un ligando de Fc. Un anticuerpo de la variante de Fc a veces puede tener una afinidad reducida por un ligando de Fc.
Se divulga en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que tienen una union mejorada al receptor Fc FcgammaRIIIA. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que tienen una union mejorada al receptor Fc FcgammaRIIB. En ciertas realizaciones, un anticuerpo variante de Fc tiene una union mejorada a los receptores Fc FcgammaRIIIA y FcgammaRIIB. Se divulgan en el presente documento los anticuerpos de la variante de Fc que tienen una union mejorada a FcgammaRIIIA que no tienen un aumento concomitante en la union del receptor de FcgammaRIIB en comparacion con un anticuerpo de Fc nativo. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que tienen una union reducida al receptor Fc FcgammaRIIIA. Un anticuerpo de la variante de Fc a veces puede tener una union reducida al receptor Fc FcgammaRIIB. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de variante Fc que muestran afinidad alterada por FcgammaRIIIA y / o FcgammaRIIB que tienen una union mejorada al receptor FcRn de Fc. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de variante Fc que muestran afinidad alterada por FcgammaRIIIA y / o FcgammaRIIB que tienen una union alterada a C1q con respecto a un anticuerpo Fc nativo.
Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por el receptor FcgammaRIIIA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o estan entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, mas o menos que un anticuerpo Fc nativo. Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc que muestran afinidades por FcgammaRIIIA que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% mas o menos que un anticuerpo Fc nativo.
Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por el receptor FcgammaRIIB que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o estan entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, mas o menos que un anticuerpo Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por FcgammaRIIB que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% mas o menos que un anticuerpo Fc nativo.
Se divulgan en el presente documento anticuerpos de la variante de Fc exhiben afinidades aumentadas o disminuidas a C1q con respecto a un anticuerpo de Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por el receptor C1q que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o estan entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, mas o menos que un anticuerpo Fc nativo. Los anticuerpos de la variante Fc muestran afinidades por C1q que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos 20%, al menos 10%, o al menos 5% mas o menos que un anticuerpo Fc nativo. Se divulga en el presente documento un anticuerpo variante de Fc que muestra afinidad alterada por Ciq ha mejorado la union al receptor FcRn de Fc. En otra realization especifica mas, un anticuerpo variante de Fc que presenta afinidad alterada por C1q tiene una union alterada a FcgammaRIIIA y/o FcgammaRIIB con relation a un anticuerpo Fc nativo.
Se contempla que los anticuerpos de la variante de Fc se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o mas funciones de las celulas efectoras mediadas por FcgammaR. En el presente documento se divulgan anticuerpos de la variante Fc tienen propiedades de union similares y funciones de las celulas efectoras en modelos in vivo (como los descritos y divulgados en el presente documento) que los de los ensayos basados in vitro. La tecnologia actual no excluye los anticuerpos de la variante Fc que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos basados en in vitro, pero exhiben el fenotipo deseado in vivo.
La vida media en suero de las proteinas que comprenden regiones Fc se puede aumentar al aumentar la afinidad de union de la region Fc por FcRn. El termino “vida media del anticuerpo”, como se usa en el presente documento, significa una propiedad farmacocinetica de un anticuerpo que es una medida del tiempo medio de supervivencia de las moleculas de anticuerpo despues de su administration. La vida media del anticuerpo se puede expresar como el tiempo requerido para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de inmunoglobulina del cuerpo del paciente (u otro mamifero) o un compartimento especifico de la misma, por ejemplo, medido en suero, es decir, vida media circulante, o en otros tejidos. La vida media puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otra. En general, un aumento en la vida media del anticuerpo da como resultado un aumento en el tiempo medio de residencia (MRT) en circulation para el anticuerpo administrado.
Un aumento en la vida media permite la reduction de la cantidad de farmaco administrada a un paciente y reduce la frecuencia de administracion. Un aumento en la vida media tambien puede ser beneficioso, por ejemplo, para prevenir una enfermedad o afeccion asociada con estafilococo aureus, y tambien para prevenir una recurrencia de infection que a menudo puede ocurrir una vez que un paciente ha sido dado de alta del hospital. Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epitopo de union al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se conoce en la tecnica. Como se usa en el presente documento, el termino “epitopo de union al receptor de rescate” se refiere a un epitopo de la region Fc de una molecula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo del Molecula de IgG. Los anticuerpos con vidas medias aumentadas tambien pueden generarse modificando los residuos de aminoacidos identificados como implicados en la interaction entre el receptor Fc y el receptor FcRn. Ademas, la vida media de un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa puede incrementarse por conjugation con PEG o albumina mediante tecnicas ampliamente utilizadas en la tecnica. Los anticuerpos que comprenden regiones variantes de Fc de un anticuerpo anti-toxina alfa tienen una vida media aumentada de aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, aproximadamente 125%, aproximadamente 150 % o mas en comparacion con un anticuerpo que comprende una region Fc nativa. Los anticuerpos que comprenden regiones variantes de Fc tienen una vida media aumentada de aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces o mas, o esta entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 25 veces, o entre 15 veces y 50 veces, en comparacion con un anticuerpo que comprende una region Fc nativa.
En el presente documento se divulga una tecnologia que proporciona variantes de Fc, en el que la region Fc comprende una modification (por ejemplo, sustituciones de aminoacidos, inserciones de aminoacidos, supresiones de aminoacidos) en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 y 443 numerados por el indice de la UE segun lo establecido en Kabat. Opcionalmente, la region Fc puede comprender un residuo de aminoacido no natural en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas en la tecnica.
En el presente documento se divulga una variante de Fc, en el que la region Fc comprende al menos una sustitucion seleccionada del grupo que consiste en 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 2341,234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 2351,235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 2401,240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y y 434W segun lo numerado por el indice de la UE segun lo establecido en Kabat. Opcionalmente, la region Fc puede comprender residuos de aminoacidos que no se producen de manera natural y/o alternativa conocidos en la tecnica.
En el presente documento se divulga un anticuerpo de variante Fc, en donde la region Fc comprende al menos una modificacion (por ejemplo, sustituciones de aminoacidos, inserciones de aminoacidos, supresiones de aminoacidos) en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 234, 235 y 331. Los aminoacidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en 234F, 235F, 235Y y 331S. En este documento se proporciona una variante de Fc, donde la region Fc comprende al menos un aminoacido no natural en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 239, 330 y 332. Algunas realizaciones, los aminoacidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en 239D, 330L y 332E.
En el presente documento se divulga un anticuerpo variante de Fc, donde la region Fc comprende al menos un aminoacido no natural en una o mas posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256. Los aminoacidos no naturales se seleccionan del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E, descritos en las patentes de EE.UU. No. 7.083,784, cuyos contenidos se incorporan aqui como referencia en su totalidad.
En el presente documento se divulga un anticuerpo anti toxina alfa estafilococica que tiene una region variante de Fc que aumenta la semivida en suero del anticuerpo, donde el anticuerpo tiene las siguientes secuencias de cadena pesada y cadena ligera:
cadena pesada: LC10-IgG1-YTE
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHDMHWVRQATGKGLEWVSGIGTAGD TYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARDRYSPTGHYYGMDVWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:
XX).
cadena ligera: LC10-Kappa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLUYKASSLESGVP SRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCKQYADYWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: YY)
Las funciones efectoras provocadas por los anticuerpos IgG dependen en gran medida del resto de carbohidrato unido a la region Fc de la proteina. Por lo tanto, la glicosilacion de la region Fc puede modificarse para aumentar o disminuir la funcion efectora. De acuerdo con lo anterior, las regiones Fc de los anticuerpos anti-toxina alfa y los fragmentos proporcionados en el presente documento comprenden glicosilacion alterada de residuos de aminoacidos. La glicosilacion alterada de los residuos de aminoacidos da como resultado una funcion efectora reducida. La glicosilacion alterada de los residuos de aminoacidos da como resultado un aumento de la funcion efectora. La region Fc ha reducido la fucosilacion. La region Fc esta afucosilada.
Las variantes de Fc en el presente documento pueden combinarse con otras variantes de Fc conocidas como se conoce en la tecnica. Se pueden introducir otras modificaciones y/o sustituciones y/o adiciones y/o eliminaciones del dominio Fc.
Glicosilacion
Ademas de la capacidad de la glicosilacion para alterar la funcion efectora de los anticuerpos, la glicosilacion modificada en la region variable puede alterar la afinidad del anticuerpo por un antigeno diana. Se modifica el patron de glicosilacion en la region variable de los presentes anticuerpos. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion puede alterarse, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por un antigeno diana. Dichas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o mas sitios de glicosilacion dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o mas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado la eliminacion de uno o mas sitios de glicosilacion de marco de region variable para eliminar asi la glicosilacion en ese sitio. Dicha aglicosilacion puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antigeno. Tambien se pueden hacer una o mas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado la eliminacion de un sitio de glicosilacion presente en la region Fc (por ejemplo, Asparagina 297 de IgG). Ademas, pueden producirse anticuerpos aglicosilados en celulas bacterianas que carecen de la maquinaria de glicosilacion necesaria.
Conjugados de Anticuerpos
Los anticuerpos presentados en el presente documento se conjugan o se unen covalentemente a una sustancia usando metodos conocidos en la tecnica. La sustancia unida es una etiqueta detectable (tambien denominada en este documento como una molecula informadora) o un soporte solido. Las sustancias adecuadas para unirse a los anticuerpos incluyen, entre otros, un aminoacido, un peptido, una proteina, un polisacarido, un nucleosido, un nucleotido, un oligonucleotido, un acido nucleico, un hapteno, un farmaco, una hormona, un lipido, un conjunto lipidico, un polimero sintetico, una microparticula polimerica, una celula biologica, un virus, un fluoroforo, un cromoforo, un colorante, una toxina, un hapteno, una enzima, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un radioisotopo, matrices solidas, matrices semisolidas y combinaciones de las mismas. Los metodos para la conjugacion o la union covalente de otra sustancia a un anticuerpo son conocidos en la tecnica.
Metodos de diagnostico de uso
La toxina alfa es un factor de virulencia que generalmente se encuentra solo en cepas patogenas de S. aureus. La toxina alfa a veces se une a un receptor de la superficie celular como parte de la formacion de complejos activos. Sin embargo, la oligomerizacion y la formacion de un poro transmembrana (por ejemplo, heptamero de toxina alfa) pueden ocurrir en ausencia de union a un receptor especifico. La accion de la toxina alfa oligomerizada en la disfuncion celular y la lisis (por ejemplo, la formacion de un poro transmembrana) facilita la colonizacion de bacterias invasoras S. aureus. Los anticuerpos descritos en este documento inhiben el ensamblaje u oligomerizacion de monomeros de toxina alfa en un poro transmembrana reconociendo una region en la molecula de toxina alfa involucrada directa o indirectamente con la interaction de monomero de toxina alfa - monomero.
Los anticuerpos anti-toxina alfa y los fragmentos y composiciones presentados en este documento pueden usarse in vivo y/o in vitro para diagnosticar cepas de S. aureus que producen afecciones/enfermedades asociadas con toxina alfa y/o toxina alfa. Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra para analizar, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo en condiciones que permitan la formacion de un complejo entre el anticuerpo y la toxina alfa. Luego se detecta la formacion del complejo (por ejemplo, utilizando un ELISA). Cuando se utiliza una muestra de control junto con la muestra de prueba, el complejo se detecta en ambas muestras y cualquier diferencia estadisticamente significativa en la formacion de complejos entre las muestras es indicativa de la presencia de S. aureus, toxina alfa o S. aureus y toxina alfa en la muestra de prueba
La tecnologia en este documento proporciona un metodo para determinar la presencia de cepas de S. aureus que producen toxina alfa y/o toxina alfa en una muestra sospechosa de contener S. aureus y/u otras bacterias productoras de homologos de toxina alfa, el metodo comprende exponer la muestra a un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa, y determinando la union del anticuerpo a la toxina alfa en la muestra donde la union del anticuerpo a la toxina alfa en la muestra es indicativa de la presencia de S. aureus y/o alfa Toxina en la muestra. La muestra es una muestra biologica. La muestra biologica es de un mamifero que experimenta o se sospecha que experimenta una enfermedad/trastorno asociado a S. aureus.
Puede usarse un anticuerpo o fragmento anti-alfa para detectar el crecimiento de S. aureus y/o la sobreexpresion de toxina alfa usando un ensayo de diagnostico in vivo. El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se agrega a una muestra donde el anticuerpo se une a la toxina alfa que se va a detectar y se marca con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isotopo radioactivo o una etiqueta fluorescente) y se escanea externamente al paciente Para la localization de la etiqueta.
Los ensayos FISH como el INFORM ™ (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION ™ (Vysis, IL) se pueden llevar a cabo en tejido fijado en parafina, fijado con formalina, para determinar la extension (si existe) de la sobreexpresion de la toxina alfa en el muestra de tejido.
Los anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa pueden usarse en un metodo para detectar toxina alfa en muestras de tejido, sangre o suero (por ejemplo, toxina alfa soluble). El metodo comprende poner en contacto una muestra de prueba de tejido, sangre o suero de un mamifero sospechoso de experimentar un trastorno mediado por toxina alfa de S. aureus con un anticuerpo o fragmento anti-alfa presentado en este documento y detectar un aumento de toxina alfa en la muestra de prueba en relation con una muestra de control de sangre o suero de un mamifero normal. El metodo de detection es util como un metodo para diagnosticar un trastorno mediado por S. aureus y/o toxina alfa asociado con un aumento de la toxina alfa en el tejido, la sangre o el suero de un mamifero.
Metodos terapeuticos de uso
Puede administrate un anticuerpo o fragmento anti-alfa para la prevention y/o el tratamiento de una afeccion mediada por toxina alfa. En el presente documento se presentan metodos para prevenir, tratar, mantener, mejorar y/o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por toxinas alfa, donde los metodos comprenden administrar anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa proporcionados en este documento.
Trastornos mediados por toxinas alfa por estafilococos aureus patogenos
En el presente documento se divulgan metodos para administrar y utilizar composiciones y anticuerpos tal como se presentan en el presente documento para tratar y prevenir una amplia gama de afecciones/enfermedades mediadas por Staphylococcus aureus patogenas, que incluyen afecciones cronicas y agudas, tales como, entre otras, bacteriemia. Quemaduras, celulitis, dermonecrosis, infecciones de parpados, intoxication alimentaria, infecciones de articulaciones, conjuntivitis neonatal, osteomielitis, neumonia, infecciones de la piel, infection de la herida quirurgica, sindrome de la piel escaldada, endocarditis, meningitis, formation de abscesos y sindrome de choque toxico.
Tanto el CA-MRSA como el HA-MRSA son resistentes a los antibioticos anti-estafilococicos beta-lactamicos tradicionales, como la cefalexina. CA-MRSA tiene un mayor espectro de susceptibilidad antimicrobiana, incluidos los medicamentos sulfa (como el cotrimoxazol/trimetoprim-sulfametoxazol), las tetraciclinas (como la doxiciclina y la minociclina) y la clindamicina, pero ahora se considera que el medicamento de election para tratar el CA-MRSA Ser vancomicina, segun un estudio del Hospital Henry Ford. HA-MRSA es resistente incluso a estos antibioticos y, a menudo, es susceptible solo a la vancomicina. Los medicamentos mas nuevos, como la linezolid (que pertenece a la clase mas nueva de las oxazolidinonas) y la daptomicina, son eficaces contra el CA-MRSA y el HA-MRSA.
El anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo de la presente invention se puede utilizar en combination con un antibiotico que corresponde, por ejemplo, a antibioticos beta-lactamicos (como cefalexina), sulfamidas (como co-trimoxazol/trimetoprim). -sulfametoxazol), tetraciclinas (como doxiciclina y minociclina), clindamicina, vancomicina, linezolid, daptomicina, teicoplanina, quinupristina/dalfopristina (sinercida) o tigeciclina.
Formulaciones farmaceuticas
El anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa proporcionado en el presente documento puede formularse con un vehiculo farmaceuticamente aceptable como composiciones farmaceuticas (terapeuticas), y puede administrarse mediante una variedad de metodos conocidos en la tecnica. La ruta y/o el modo de administration pueden variar segun los resultados deseados. Como se usa en el presente documento, las formulaciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa se denominan formulaciones de la tecnologia. El termino “portador farmaceuticamente aceptable” significa uno o mas materiales no toxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biologica de los ingredientes activos. Dichas preparaciones pueden contener rutinariamente sales, agentes tamponantes, conservantes, vehiculos compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapeuticos. Dichas preparaciones farmaceuticamente aceptables tambien pueden contener de manera rutinaria rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes solidas o liquidas compatibles que son adecuadas para la administracion en un ser humano. El termino “portador” denota un ingrediente organico o inorganico, natural o sintetico, con el cual el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicacion. Los componentes de las composiciones farmaceuticas tambien pueden combinarse con los anticuerpos de la presente tecnologia, y entre si, de una manera tal que no haya interaction que pueda danar sustancialmente la eficacia farmaceutica deseada.
Las composiciones terapeuticas de la presente tecnologia pueden formularse para una dosificacion particular. Los regimenes de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar la respuesta optima deseada (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente segun lo indiquen las exigencias de la situation terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificacion para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosificacion. La forma de unidad de dosificacion como se usa en este documento se refiere a unidades fisicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehiculo farmaceutico requerido. La especificacion de las formas unitarias de dosificacion esta dictada por y depende directamente de (a) las caracteristicas unicas del anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa y el efecto terapeutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la tecnica de composition. Un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Las composiciones terapeuticas de la presente tecnologia pueden formularse para vias de administracion particulares, tales como administracion oral, nasal, pulmonar, topica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion unica variara dependiendo del sujeto que se este tratando y del modo particular de administracion. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion unica que sera generalmente la cantidad de la composicion que produce un efecto terapeutico.
Dosis Terapeuticamente Efectivas
Una formulacion de anticuerpo descrita en el presente documento puede administrarse en una dosis adecuada y un regimen de dosificacion, y tal regimen de dosificacion y dosificacion puede depender de la enfermedad o afeccion a tratar. Se puede identificar una dosis terapeuticamente efectiva determinando si una dosis y un regimen de dosis dan lugar a un efecto terapeutico o criterio de valoracion terapeutico
Articulos de Fabricacion y Kits.
En el presente documento se proporciona un paquete o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes llenos con una formulacion liquida o una formulacion liofilizada de esta memoria. Se divulga en el presente documento un recipiente lleno con una formulacion liquida en que es una jeringa precargada. En casos especificos, las formulaciones en el presente documento comprenden anticuerpos anti-toxina alfa y fragmentos fusionados de forma recombinante o conjugados quimicamente con otra fraccion, que incluye, entre otros, una proteina heterologa, un polipeptido heterologo, un peptido heterologo, una molecula grande, una molecula pequena, una secuencia marcadora, un agente de diagnostico o detectable, una fraccion terapeutica, una fraccion de farmaco, un ion metalico radiactivo, un segundo anticuerpo y un soporte solido. Las formulaciones de este documento se formulan en frascos de dosis unica como un liquido esteril. Una formulacion de este documento a veces se suministra en una jeringa precargada.
Se divulga en el presente documento kits que comprenden anticuerpos y fragmentos anti-toxina alfa que son utiles para diversos fines, por ejemplo, investigacion y diagnostico, incluso para la purification o inmunoprecipitacion de toxina alfa de las celulas, detection de toxina alfa y similares. Para el aislamiento y la purificacion de la toxina alfa, el kit puede contener un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Pueden proporcionarse kits que contienen los anticuerpos para la deteccion y cuantificacion de la toxina alfa in vitro, por ejemplo, en un ELISA o un Western blot. Al igual que con el articulo de fabricacion, el kit comprende un contenedor y una etiqueta o prospecto en o asociado con el contenedor. El recipiente contiene una composicion que comprende al menos un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa como se describe en este documento. Pueden incluirse contenedores adicionales que contengan, por ejemplo, diluyentes y tampones, anticuerpos de control. La etiqueta o el prospecto pueden proporcionar una description de la composicion, asi como instrucciones para el uso in vitro o diagnostico previsto.
La tecnologia actual tambien abarca un producto farmaceutico empaquetado y etiquetado terminado. Este articulo de fabricacion incluye la forma de dosificacion unitaria adecuada en un contenedor o recipiente adecuado, como un vial de vidrio, una jeringa precargada u otro recipiente hermeticamente cerrado. La forma de dosificacion unitaria se proporciona como una solution libre de particulas esteril que comprende un anticuerpo o fragmento anti-alfa que es adecuado para la administration parenteral. La forma de dosificacion unitaria se proporciona como un polvo liofilizado esteril que comprende un anticuerpo o fragmento anti-toxina alfa que es adecuado para la reconstitution.
La forma de dosificacion unitaria es adecuada para administracion intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, topica o subcutanea. Por lo tanto, la tecnologia abarca soluciones esteriles adecuadas para cada ruta de entrega. La tecnologia abarca ademas polvos liofilizados esteriles que son adecuados para la reconstitucion.
Al igual que con cualquier producto farmaceutico, el material de empaque y el contenedor estan disenados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y envio. Ademas, los productos de este documento incluyen instrucciones de uso u otro material informativo que aconseje al medico, tecnico o paciente sobre como prevenir o tratar adecuadamente la enfermedad o trastorno en cuestion. En otras palabras, el articulo de fabricacion incluye medios de instruction que indican o sugieren un regimen de dosificacion que incluye, entre otros, dosis reales, procedimientos de monitoreo y otra information de monitoreo.
Especificamente, la tecnologia proporciona un articulo de manufactura que comprende material de empaque, como una caja, botella, tubo, frasco, recipiente, jeringa precargada, rociador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.), sobre y sobre similares; y al menos una forma de dosificacion unitaria de un agente farmaceutico contenido dentro del material de envasado, donde el agente farmaceutico comprende una formulacion liquida que contiene un anticuerpo. El material de empaque incluye medios de instruccion que indican como se puede utilizar el anticuerpo para prevenir, tratar y/o manejar uno o mas sintomas asociados con una enfermedad o trastorno.
EJEMPLOS
Los ejemplos que se exponen a continuation ilustran ciertos anticuerpos y sus usos y no limitan la tecnologia.
Ejemplo 1: Materiales y metodos
Los materiales y metodos utilizados para el Ejemplo 2 al Ejemplo 9 y el Ejemplo 11 al Ejemplo 13 se proporcionan a continuacion.
Clonacion y expresion de Wt S. Aureus AT y mutante H35L no hemolitico
El ADN genomico de la cepa ATCC BAA1556 de Staphylococcus aureus se utilizo para amplificar el gen de la toxina alfa (AT) de tipo silvestre mediante PCR. La reaccion contenia el cebador directo, atatataagcttaatttgtcatttcttctttttccc (Se Q ID NO: 41), cebador inverso, atatataagcttaatttgtcatttcttctttttcc (SEQ ID NO: 42), y aproximadamente 10 ng de ADN genomico en una reaccion de 50 |jl utilizando polimerasa Herculase II (Stratagene). El fragmento resultante se digirio con Sac I y Hind III y se ligo en el vector de ADN pCold II (TaKaRa), en marco con una etiqueta 6x His terminal N. El mutante H35L se genero mediante mutagenesis dirigida al sitio del gen de tipo silvestre utilizando un kit de mutagenesis dirigida al sitio QuikChange II XL (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores mutagenicos utilizados para la mutagenesis fueron gataaagaaaatggcatgctcaaaaaagtattttatagttttatc (SEQ ID NO: 43) y gataaaactataaaatacttttttgagcatgccattttctttatc (SEQ ID NO: 44).
Las secuencias del mutante AT y ATh35l de tipo silvestre se confirmaron mediante secuenciacion automatizada de ADN. La toxina alfa mutante de tipo silvestre y H35L se expresaron en la cepa BL21 de E. coli. Un 50 ml de cultivo durante la noche crecido en LB mas carbenicilina se diluyo 1:10 en un cultivo de 500 ml y se hizo crecer a 37 °C hasta una A600 de aproximadamente 0.5. El cultivo se cambio a 15 °C durante 30 minutos y luego se anadio IPTG 1 M para lograr una concentracion final de aproximadamente 100 mM. El cultivo se incubo durante 24 horas adicionales a 15 °C. Las celulas se recogieron mediante centrifugacion.
Purification de toxina alfa marcada his recombinante (rAT-his)
Los sedimentos de celulas bacterianas se descongelaron en hielo y se resuspendieron en tampon de Ni-NTA A (fosfato sodico 20 mM, pH 7.2, NaCl 300 mM). Las celulas se lisaron por microfluidizacion (Microfluidics Modelo M-110P) a 20,000 psi y el lisado crudo se clarifico por centrifugacion a 27,000 xg durante 10 min. a 4 °C. Despues de una filtration de 0.2 |jm, el sobrenadante se cargo en una columna de 5 ml de Ni-NTA Superflow (Qiagen) equilibrada con Tampon de Ni-NTA A. rAT-his se eluyo con un gradiente escalonado de 300 mM y 500 mM de imidazol Las fracciones se recogieron en tubos que contenian EDTA a una concentracion final de 1 mM y se dializaron en tampon A de SP (fosfato de sodio 50 mM, pH 7.0, NaCl 25 mM, EDTA 1 mM). Los dializados se cargaron en una columna HiTrap SP Sepharose FF de 5 ml (GE Healthcare) en el tampon SP A y el rAT-his se eluyo con un gradiente escalonado a NaCl 1M. Las fracciones que contenian rAT-his se dializaron en 1x PBS, pH 7.2 con EDTA 1 mM y se congelaron alicuotas a -80 °C.
Purificacion de Toxina Alfa Nativa de S. Aureus
La toxina alfa nativa (nAT) se purifico a partir de la cepa de S. aureus Wood. La S. aureus Wood se cultivo durante la noche en caldo de soja triptico (TSB) a 37 °C, con agitation (por ejemplo, aproximadamente 250 RPM). El sobrenadante del cultivo se recogio por centrifugacion y luego se llevo a una saturation del 75% con sulfato de amonio solido. Despues de agitar durante 3 horas a 4 °C, el precipitado se capturo mediante centrifugacion a 12.000 x g durante 45 minutos, se resuspendio en tampon SP A (acetato de sodio 25 mM, pH 5.2, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM) y se dializo contra tampon SP A durante la noche a 4 °C con un intercambio. El material insoluble se elimino mediante centrifugacion a 27,000 * g durante 30 min. a 4 °C. El dializado soluble se filtro (0.2 jm ) y se cargo en una columna de 10 ml de SP Sepharose FF (GE Healthcare) equilibrada con el tampon SP A. La NAT unida se eluyo con un gradiente lineal hasta NaCl 300 mM, seguido de etapas a 0.5 y 1 M NaCl. Las fracciones que contenian nAT se agruparon y se dializaron durante la noche en PBS, pH 7.2 que contenia EDTA 1 mM. Para el procesamiento final, el dializado se cargo en una columna de alta resolution HiPrep Sephacryl S-200 (GE Healthcare) en un indice de fluidez de 1.3 ml/min en 1x PBS, pH 7.2 con EDTA 1 mM. Las fracciones que contenian nAT se agruparon, se dividieron en alicuotas y se congelaron a -80 °C.
Inmunizacion/Generacion de Hibridoma
Ratones VelocImmune de ocho semanas de edad recibieron 5 rondas de inyecciones subcutaneas de la rAT H35L en multiples sitios siguiendo el regimen de inmunizacion de RIMMS Kilpatrick et al (1997). Los ratones se inmunizaron durante un curso de 13 dias a intervalos de 2-3 dias. Para cada ronda de inmunizacion, los ratones se anestesiaron primero con isofluorano. El inmunogeno se emulsiono en adyuvante completo o incompleto de Freund y adyuvante TiterMax Gold y se inyecto bilateralmente en la nuca, la axila, la pantorrilla y la ingle. Los sangrados de prueba se recogieron el dia 13 y se analizaron en un ELISA de antigeno. Los ratones recibieron un refuerzo de pre-fusion por via intraperitoneal y se sacrificaron el dia 17. Los linfocitos y esplenocitos de los ganglios linfaticos se fusionaron con un companero de mieloma para generar hibridomas estables.
Neutralization de la actividad hemolitica.
Se mezclaron cincuenta microlitros de cada sobrenadante de cultivo de hibridoma de celulas B con toxina alfa-His recombinante (rAT-his, concentracion final de 0.1 mg/ml) en placas de 96 pozos, seguido de la adicion de 50 j l de globulos rojos de conejo al 5% (RBC ) en PBS. Los pozos de control contenian RBC y medios de cultivo solo con o sin AT. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C, y las celulas intactas se sedimentaron por centrifugacion. Se transfirieron 50 |jl de los sobrenadantes a una nueva placa de 96 pozos y se midio el A490 en un espectrofotometro. La actividad neutralizante se calculo con respecto a la lisis con RBC y rAT-his sola y se calculo:% de inhibicion = 100 x [100- (A490 nAT Ab)/(A490 nAT sin Ab)].
Tambien se ensayo la inhibicion con los mAb purificados. Se agregaron mAb anti-AT a una placa de 96 pozos a aproximadamente 80 |jg/ml en PBS y las muestras se diluyeron en serie (dos veces) en PBS hasta un volumen final de 50 jL . Se incluyo una IgG1 no especifica (R347) como control de isotipo. Veinticinco microlitros de diluciones de mAb se mezclaron con 25 j l de nAT (toxina alfa nativa) a aproximadamente 0.1 jg/m l en placas de 96 pozos de fondo redondo, seguido de la adicion de 50 j l de globulos rojos al 5%. La inhibicion de la actividad hemolitica se calculo como anteriormente.
Expresion y purificacion de mAb anti-AT quimericos
Los sobrenadantes anti-AT murinos clarificados (aproximadamente 5 L @ 30-50 mg/L) se concentraron por filtracion de flujo tangencial. Los sobrenadantes concentrados se pasaron luego sobre cinco columnas de 5 mL de Proteina G HiTrap HP en secuencia y la IgG unida se eluyo con bicarbonato de sodio 50 mM pH 11.0 y se neutralizo a aproximadamente pH 7.0 con acido fosforico 1M. El material neutralizado se cargo en dos columnas HiT rap Q FF (GE Healthcare) de 1 ml en secuencia. El flujo que contenia IgG se recogio y se dializo en PBS a pH 7.2.
Neutralizacion de lisis A549
Las celulas A549 se mantuvieron en una incubadora al 5% de CO2 a 37 °C en RMPI suplementado con un aminoacido no esencial, glutamina y suero bovino fetal al 10%. Las celulas se lavaron una vez con medio equilibrado de Hank y se sembraron en placas a 104 /pozo a 50 j l en RPMI, 5% de FBS, y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 20 horas. Se agregaron mAb anti-AT a una placa de 96 pozos a 80 jg/m l en RPMI y las muestras se diluyeron en serie (dos veces) en RPMI. Se incluyo una IgG1 irrelevante (R347) como control de isotipo. En una placa separada de 96 pozos, se mezclaron 30 j l de los anticuerpos diluidos con 30 j l de nAT (concentracion final, 5 jg/ml). Se transfirieron cincuenta microlitros de cada pozo a la placa que contenia celulas adherentes A549. Se incluyeron los pozos de control de celulas A549 con o sin NAT. Las placas se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h, se centrifugaron y se transfirieron 50 j l de sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos. La lisis celular se midio como la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando un kit de ensayo no radiactivo Cytotox 96 (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. La LDH de fondo se sustrajo de cada pozo y se calculo la inhibicion de la liberacion de l DH: % de inhibicion = 100 x [100- (A590 nAT Ab)/(A590 nAT no Ab)].
Neutralizacion de lisis de THP-1
Las celulas THP-1 se mantuvieron en una incubadora al 5% de CO2 a 37 °C en medio RPMI (Invitrogen) suplementado con aminoacidos no esenciales (Invitrogen), glutamina 2 mM (Invitrogen) y suero bovino fetal al 10% (Invitrogen). Se agregaron mAb anti-AT a una placa de 96 pozos a 80 jg/m l en RPMI y las muestras se diluyeron en serie (dos veces) en RPMI hasta un volumen final de 50 jl. Se incluyo una IgG1 irrelevante (R347) como control de isotipo. Veinticinco microlitros de las diluciones de mAb se mezclaron con 25 j l de toxina alfa nativa (nAT) a 1.5 jg/m l final, seguido de la adicion de 50 j l de celulas THP-1 lavadas con RMPI (106 celulas/ml en RPMI con 10% de f Bs ) en una placa de 96 pozos. Los pozos de control consistian en celulas THP-1 con solo o con nAT. Las placas se incubaron en una incubadora al 5% de CO2 a 37 °C durante 3 h, se centrifugaron y se transfirieron 50 j l del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos. La lisis celular se midio como la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando el kit de ensayo no radiactivo Cytotox 96 (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. La inhibicion de la liberacion de LDH se calculo como se describio anteriormente.
Clonacion de mAb IgG anti-AT y expresion como mAb completamente humanos
El ARNm de cinco clones de hibridoma 2A3, 10A7, 12B8, 25E9 y 28F6 se aislaron utilizando el kit directo de ARNm de Dynabeads (Invitrogen). La primera hebra de ADNc se sintetizo usando Superscript III (Invitrogen), transcriptasa inversa y cebadores de heptamero aleatorios. La Ig Vl humana (kappa) y Vh se amplificaron por PCR utilizando un conjunto de cebadores Ig (Novagen, numero de catalogo 69830). Los productos Vl y Vh amplificados por PCR se clonaron en el vector TOPO TA (Invitrogen pCR2.1-TOPO) y se secuenciaron. El Vh y el Vl (kappa) de cada hibridoma se volvieron a amplificar mediante PCR, agregando sitios de enzimas de restriction para la clonacion en el vector humano IgG.kappa.pOE, donde el Vl se clono en el sitio BssHII/BsiWI fusionado con el c-kappa humano, y el Vh fue clonado en el sitio BsrGI/SalI fusionado con la region constante de la cadena pesada de IgG-1 humana. Los plasmidos pOE resultantes se verificaron mediante secuenciacion de ADN.
Expresion y Purificacion de mAb Anti Toxina Alfa
El ADN plasmidico de las construcciones de pOE se preparo utilizando el kit Endofree Plasmid Maxi (Qiagen). Los plasmidos pOE se transfectaron en celulas en suspension 293F usando reactivo de 293fectina (Invitrogen) en medio de expresion Freestyle 293 (GIBCO). Los dias 6 y 9 despues de la transfection, el medio de cultivo se recogio y la IgG se purifico utilizando una columna de protema A-sefarosa (GE Healthcare). Los picos que conteman IgG se agruparon, se dializaron en PBS, pH 7.4 y se almacenaron a -70 °C. La pureza de las protemas IgG se verifico mediante SDS-PAGE.
Modelo de neumoma murina.
Veinticuatro horas antes de la infeccion, grupos de diez ratones C57BL/6J de 7-9 semanas de edad (Harlan) recibieron 0.5 ml de mAb en las concentraciones indicadas mediante la inyeccion i.p. A continuacion, los animales se anestesiaron con isofluorano, se mantuvieron en posicion vertical y se inocularon 0.05 ml de suspension bacteriana de S. aureus (1 * 108 UFC a 3 * 108 UFC) en PBS esteril en las fosas nasales izquierda y derecha. Los animales se colocaron en una jaula en posicion supina para la recuperacion y se observaron dos veces al dia durante el transcurso del estudio. La supervivencia animal fue monitoreada por un maximo de 6 dias.
Alternativamente, los animales se sacrificaron mediante inhalacion de CO248 h despues de la infeccion por bacterias. Un pulmon y un rinon se eliminaron en PBS esteril, se homogeneizaron, se diluyeron y se sembraron en placas para la enumeracion bacteriana. La significacion estadistica de los estudios de mortalidad se determino mediante la prueba de log-rank. La importancia de la recuperacion bacteriana de los organos se calculo mediante el analisis de la varianza y la prueba posterior de Dunnett.
Modelo murino de dermonecrosis
Grupos de cinco ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Harlan) se afeitaron en la espalda y se administraron mediante inyeccion intraperitoneal de 0.5 ml de IgG a la concentracion indicada en el grafico. Veinticuatro horas despues, los ratones se infectaron mediante inyeccion subcutanea de 50 |jl de una suspension bacteriana (1 x 108 S. aureus). Los animales se controlaron dos veces al dia para detectar signos de infeccion y el tamano del absceso se midio al mismo tiempo diariamente. El area de las lesiones se calculo utilizando la formula A = L * W. La significacion estadistica se determino mediante el analisis de varianza y la prueba posterior de Dunnett.
Ensayo de union del receptor
Los fantasmas de globulos rojos se prepararon incubando 5 ml de globulos rojos de conejo (RBC) lavados y empaquetados en 500 ml de tampon de lisis (fosfato 5 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4) o/n a 4 °C con agitacion constante. Los fantasmas se eliminaron por centrifugacion a 15.000 * g y se lavaron 3 * con tampon de lisis. Luego se lavaron en PBS y se resuspendieron en un volumen final de 3 ml.
Para evaluar la union de nAT a membranas celulares, los fantasmas de RBC se diluyeron a OD600 aproximadamente 0.2 en PBS y 50 |jL se recubrieron en ^ pozo de placas de 96 pozos (Costar) y se incubaron durante la noche a 4 °C. Luego, el liquido se retiro de las placas y los pocillos se bloquearon con 100 jL de BSA al 1% en PBS, pH 7.4 durante 2 horas a 4 °C y se lavaron 3 veces con PBS. Se mezclo un exceso de 20 moles de IgG con nAT a 3 jg/m L y se agregaron 50 jL a las placas bloqueadas. Las placas se incubaron a 4 °C durante 2 horas y se lavaron 3 veces con PBS. Se anadio IgG anti-AT de conejo marcada con biotina a los pozos a 1 mg/ml y se incubo a 4 °C durante 1 hora, se lavo 3 veces y se incubo con conjugado de estreptavidina peroxidasa (1: 30,000, Jackson Immunoresearch). Los pozos se lavaron 3 veces y se desarrollaron con Sure Blue Reserve (KPL, Inc.). El A450 se leyo utilizando un lector de placas (Molecular Devices) y se calculo el% de union AT. % de limite AT = 100 * (A450 - AT IgG/A450 - AT solo).
Ensayo de oligomerizacion
Los liposomas se generaron utilizando un Extrusor Liposofast (Avestin, Inc.) y una membrana con un tamano de poro de 100 nm. Se seco una mezcla (5:1:4, relacion molar) de fosfatidilcolina de yema de huevo (15 mg, Avanti Polar Lipids), fosfatidilglicerol de yema de huevo (2.9 mg, Avanti Polar Lipids) y colesterol (5.8 mg, Avanti Polar Lipids) en cloroformo a 40 °C bajo corriente de nitrogeno. La pelicula lipidica seca se rehidrato luego con 3 ml de PBS, pH 7.4 (Invitrogen) y se incubo a 37 °C durante 30 min. La muestra se agito vigorosamente en vortex hasta que formo una suspension uniforme y luego se sometio a 3 rondas de congelacion y descongelacion usando un bano de isopropanol con hielo seco y agua a temperatura ambiente. La solucion se paso luego a traves del extrusor Liposofast 21 veces.
AT (0.5 jg ) se mezclo con IgG purificada, 5 jL de fantasmas RBC y PBS en un volumen final de 22 jL y se incubo a 37 °C durante 45 min. Las muestras se solubilizaron luego en 5 jL de tampon de muestra SDS-PAGE durante 5 min a 37 °C y 10 jL se sometieron a SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida prefabricado al 4-12% (Invitrogen). Las proteinas separadas se transfirieron luego a nitrocelulosa, se bloquearon durante 10 minutos con caseina bloqueante en PBS (Thermo Scientific) y se sondaron con IgG anti-AT de conejo (2 jg/mL) durante 2 horas a temperatura ambiente con agitacion constante. Las bandas de AT se detectaron despues de 1 hora de incubacion con un anti-conejo 2 de cabra marcado con fosfatasa alcalina y se desarrollaron utilizando el sistema de sustrato de fosfatasa de membrana BCIP/NBT (KPL, Inc.).
Medicion de velocidad cinetica y constantes de union (Kd)
Las constantes de velocidad cinetica (kon, koff) para la union de los anticuerpos IgG anti-AT a la nAT purificada se midieron empleando un formato de ensayo de captura de IgG en un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc). Brevemente, se inmovilizo una IgG anti-raton de rata en un chip sensor CM5 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La densidad superficial final del reactivo de captura en el chip sensor fue aproximadamente 2500 unidades de respuesta (RU), como se describe en este documento. Tambien se preparo una superficie de celda de flujo de referencia en este chip sensor utilizando el protocolo de inmovilizacion identico, y omitiendo nAT. Se prepararon anticuerpos anti-AT IgG a 20 nM en un tampon de instrumentos (tampon HBS-EP que contenia HEPES 0.01 M, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM y P-20 al 0.005%) junto con dos diluciones en serie de la nAT. Las diluciones seriales de nAT se realizaron en el rango de aproximadamente 0.78 nM a aproximadamente 50 nM, en tampon de instrumentos.
Se utilizo un enfoque secuencial para las mediciones cineticas. Cada IgG anti-AT se inyecto primero sobre las superficies de captura y referencia en un indice de fluidez de 50 |jL/min. Una vez que la union de la IgG capturada se habia estabilizado, se inyecto una concentracion unica de la proteina nAT en ambas superficies, en un indice de fluidez de 50 jL/min. Las curvas de respuesta de union resultantes se utilizaron para determinar los datos de la fase de asociacion. Despues de la inyeccion de la NAT, el flujo se cambio de nuevo a tampon del instrumento durante 10 minutos para permitir la recopilacion de los datos de la fase de disociacion, seguido de un pulso de glicina 10 mM de 1 minuto, pH 1.5 para regenerar la superficie de captura de IgG en el chip. Las respuestas de union de inyecciones duplicadas de cada concentracion de nAT se registraron contra todas las IgG anti-AT.
Ademas, varias inyecciones de tampon se intercalaron a lo largo de la serie de inyeccion. Se utilizaron inyecciones de bufer seleccionadas junto con las respuestas de las celdas de referencia para corregir los grupos de datos sin procesar de los artefactos de inyeccion y/o las interacciones de enlace no especificas comunmente denominadas “doble referencia” (D. G. Myszka, Mejora del analisis de biosensores. J. Mol. Reconocimiento 12 (1999), pp. 279-284). Los datos de enlace completamente corregidos se ajustaron globalmente a un modelo de enlace 1: 1 (software BIAevaluation 4.1, BIAcore, Inc, Uppsala, Suecia) que incluia un termino para corregir el enlace limitado por transporte de masa, en caso de detectarse. Estos analisis determinaron las constantes de velocidad cinetica (on, off), a partir de las cuales la KD aparente se calculo como koff/kon.
Medicion de los niveles de citoquinas en los pulmones infectados por S. aureus
Se trataron ratones C57BL/6J de siete a nueve semanas de edad con 2A3.1hu (2A3.1 completamente humano) o R347 (45 mg/kg) mediante inyeccion intraperitoneal 24 h antes de la infeccion intranasal con 1.5 * 108 ufc USA300 (BAA -1556, ATCC). Cuatro y veinticuatro horas despues de la infeccion, los ratones se sometieron a eutanasia y los pulmones se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS. El liquido de lavado broncoalveolar (BAL) se almaceno a -70 °C. Las citoquinas proinflamatorias se cuantificaron utilizando el kit de citoquinas de raton proinflamatorio II 7 (Mesoscale, Gaithersburg, Md.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de citoquinas se expresaron como pg/ml.
Clonacion y expresion de proteinas de fusion GST
Las secuencias de genes que codifican AT1-50 y AT51-293 se amplificaron por PCR a partir del clon pColdII AT descrito anteriormente. Las reacciones contenian 10 ng de ADN AT-pColdII y 0.1 mg de cada cebador directo e inverso (AT1-50-F, atattggatccgcagattctgatattaatattaaaac (SEQ ID NO: 45) y AT1-50-R, atacttctcgagttatttattatgatttttatcatcgataaaac (SEQ ID NO) o AT51 -293-F catagggatccaaactgctagttattagaacgaaag (SEQ ID NO: 47) y AT 51-293-R, catagctcgagtcaatttgtcatttcttctttttcccaatc (SEQ ID NO: 48)), y la ** polimerasa utilizada. (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de PCR resultante se digirio con BamHI y XhoI y se ligo en el vector de ADN pGex 6P (Stratagene) en el marco con la etiqueta N terminal de glutation S transferasa (GST). Las secuencias de los clones se confirmaron mediante secuenciacion automatizada de ADN.
La expresion de los fragmentos se realizo con la cepa BL21 (DE3) de E. coli como huesped. Se recogieron varias colonias de una placa y se inocularon en 100 ml de LB 100 jg/m l de ampicilina (Sigma Chemical Company) y se cultivaron a 37 °C. Los cultivos durante la noche se diluyeron 1: 100 en cultivos de 3 x 1 L de LB 100 jg/m l de ampicilina y se cultiva con agitacion a aproximadamente 250 RPM a un OD600 de aproximadamente 0.8. La expresion de la proteina se indujo luego mediante la adicion de 1 mM de IPTG. Los cultivos continuaron la incubacion durante 2 horas a 37 °C con agitacion. Las celulas bacterianas se recogieron por centrifugacion y se congelaron a -20 °C.
Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 ml de PBS, pH 7.4 (Invitrogen) y se lisaron mediante microfluidizacion (Microfluidics Modelo M-110P) a 20,000 psi y el lisado bruto se clarifico mediante centrifugacion a 27,000 xg durante 10 min. a 4 °C. El sobrenadante resultante se cargo en una columna GSTrap FF (GE Healthcare) y GST-AT1 -50 y la fraccion soluble de GST-AT51-293 se purifico siguiendo las instrucciones del fabricante. La fraccion GST-AT51 -293 insoluble se purifico a partir de los sedimentos celulares insolubles. El material insoluble se sol u bilizo durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente, con balanceo suave, en guanidina-HCl 3 M en fosfato de sodio 25 mM, pH 7.4. El material solubilizado se diluyo 7 veces con tampon de replegamiento A [25 mM de fosfato de sodio, pH 7.4 con 2 M de guanidina-HCl]. GST-AT51-293 se replego mediante dialisis gradual. Se anadio un volumen igual de tampon de replegamiento B [Fosfato de sodio 25 mM, pH 7.4] al vaso de dialisis despues de cada 12-15 horas de dialisis a 4 °C para una concentracion de guanidina de aproximadamente 2, 1, luego 0.5 M. GST -AT51-293 se dializo luego contra el replegamiento del tampon B durante 24 horas. El dializado final se aclaro por centrifugacion y la fraccion soluble se purifico sobre una columna GSTrap como se describio anteriormente.
Ensayos Dot Blot
Los peptidos superpuestos que abarcan el aminoacido 40 a 293 se sintetizaron quimicamente (New England Peptide). Se intento la smtesis de AT1-50 pero no tuvo exito. La toxina alfa (AT), los peptidos AT y los fragmentos AT (1 |jg) se mancharon en nitrocelulosa y se bloquearon durante 10 minutos con bloqueador de caseina en PBS. Luego se sondearon las transferencias con 2 |jg/ml de la IgG individual durante 3 horas a temperatura ambiente. Las transferencias se lavaron e incubaron con una IgG anti-raton de cabra anti-raton o cabra conjugada con fosfatasa alcalina (1: 1000, Caltag Laboratories) durante 1 hora y se revelaron utilizando el sistema de sustrato de fosfatasa de membrana BCIP/NBT (KPL, Inc).
Caracterizacion por ELISA de la union de LC10 YTE a toxina alfa y LukF-PV
El lisado bacteriano que contenia toxina alfa marcada con His o LukF-PV se recubrio sobre la superficie de una placa de 96 pozos durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron seis veces con PBS/Tween 20 al 0.05% y se bloquearon con un 10% de tampon de bloqueo Superblock (Pierce, Rockford, Ill.) A 37 °C durante 1 h. Se anadio LC10 YTE o mAb anti-His de raton a 2 jg/m l (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) A los pozos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces con PBS/Tween 20 al 0.05%. La YTE LC10 unida o el mAb anti-His de raton se detectaron utilizando un conjugado de HRP anti-IgG humana o anti-raton (Jackson ImmunoResearch laboratories, Inc. West Grove, Pa.), respectivamente.
Generation de variantes quimericas entre la toxina alfa y LukF-PV
Se generaron variantes quimericas compuestas de porciones de toxina alfa y LukF-PV para identificar la region de union de LC10 YTE en toxina alfa. Las construcciones de ADN de seis variantes quimericas de toxinas alfa que codifican regiones LukF-PV en aa 1-51, aa 52-110, aa 111-147, aa 148-205, aa 204-241 o aa 248-293 se generaron por sintesis genica. Las construcciones de ADN que codifican las otras variantes quimericas se crearon mediante PCR de extension superpuesta utilizando un plasmido pET3d que codifica toxina alfa o LukF-PV (plasmidos internos) como plantillas. Todas las construcciones de ADN se clonaron luego en el vector de expresion bacteriana pET3d (EMD Chemicals Inc, Filadelfia, PA) y se transformaron en la cepa BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, California). Las celulas BL21 transformadas (DE3) se cultivaron en el medio de expresion de E. coli MagicMedia (Invitrogen, Carlsbad, California) para expresar las proteinas variantes utilizando protocolos estandar.
Caracterizacion de las caracteristicas de union de LC10 YTE a variantes quimericas utilizando ProteOn
Las caracteristicas de union de LC10 YTE a las variantes quimericas de toxina alfa/LukF-PV se estudiaron utilizando un instrumento ProteOn XPR36 (BioRad, Hercules, CA). Se utilizo un acoplamiento de amina estandar para inmovilizar un anticuerpo policlonal anti-toxina alfa (anticuerpo generado en el sitio) en acetato de sodio 10 mM [pH 5.0] a la superficie de un chip biosensor GLC a aproximadamente 5000 unidades de resonancia (RU) para cada canal. Las proteinas quimericas toxina alfa/LukF-PV en sobrenadante de lisado bacteriano se inyectaron en la superficie GLC inmovilizada para obtener una respuesta de captura de aproximadamente 200RU. El sobrenadante de lisado bacteriano no transformado tambien se inyecto en las mismas condiciones que un canal de referencia. Las muestras de LC10 YTE se prepararon en solution salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.4), Tween-20 al 0.005%, y se inyectaron a 90 jL/min durante 150 o 180 segundos a concentraciones que oscilan entre 50 nM y 3.125 nM. Se utilizaron 600 o 800 segundos de tiempo de disociacion. Los niveles de expresion de las variantes quimericas tambien se monitorizaron despues de la inyeccion de LC10YTE de la siguiente manera: los anticuerpos policlonales anti-toxina alfa se hicieron fluir a 90 jL/min durante 150 o 180 segundos a concentraciones que oscilan entre 50 nM y 3.125 nM con un tiempo de disociacion de 600 o 800 segundos. La superficie se regenero dos veces inyectando glicina (10 mM, pH 1.5) a 100 jL/m in durante 30 segundos. Todos los datos de sensorgrama se procesaron con el software ProteOn Manager 3.0.1
Ejemplo 2: Generation de mAb de Anti Toxina Alfa
Se generaron anticuerpos monoclonales (mAb) anti-toxina alfa (AT) en ratones VelocImmune que se disenaron geneticamente para contener un repertorio de anticuerpos con regiones variables completamente humanas fusionadas con el dominio constante de murino. Los anticuerpos resultantes son quimeras de humano:raton que se convierten facilmente en IgG completamente humana al fusionar geneticamente el dominio variable humano del mAb quimerico con las regiones constantes de una IgG-1 humana clonada. Los ratones se inmunizaron con un mutante AT no hemolitico (AT h35l), descrito en este documento, y los hibridomas se generaron utilizando metodos estandar. Inicialmente, se descubrio que mas de 1800 sobrenadantes de hibridomas contenian IgG que se unia a AT (rAT-his) recombinante por antigeno ELISA. Los sobrenadantes de hibridoma que mostraron union a rAT-his se examinaron para determinar su actividad mediante la inhibition de la lisis mediada por rAT-his de globulos rojos de conejo (RBC) en un ensayo hemolitico, por lo que el conjunto de mAb funcionales se redujo a aproximadamente 250. Los sobrenadantes de hibridoma se normalizaron entonces para los niveles de IgG y se compararon sus actividades inhibitorias. Trece de los inhibidores de rAT-his mas potentes se seleccionaron para la clonacion por dilucion limitada y se utilizaron para la expresion y purificacion de IgG a pequena escala. T ras la seleccion de estos clones y la posterior caracterizacion bioquimica e in vivo, como se describe a continuacion, las secuencias Vh y Vl se optimizaron aun mas para generar anticuerpos adicionales, como se indica a continuacion en la Tabla 7.
Ejemplo 3: Inhibicion de la actividad citolitica
Las actividades inhibitorias de las 13 IgG anti-AT purificadas se compararon en un ensayo hemolitico. Los mAb anti-AT purificados se titularon en un ensayo hemolitico en presencia de cantidades constantes de nAT y globulos rojos de conejo. Los mAb se valoraron cada uno a parti r de aproximadamente 20 |jg/ml en presencia de una cantidad constante de AT nativo (nAT) y globulos rojos de conejo (RBC). La hemolisis se midio por la liberacion de hemoglobina en el sobrenadante. El porcentaje (%) de inhibicion de la hemolisis se calculo como sigue:% de inhibicion = 100 * [100- (A490 nAT Ab)/(A490 nAT no Ab)]. Los ensayos hemoliticos representativos que demuestran los trece inhibidores de RAT-his mas potentes se muestran en las Figs. 1A y 1B. Se incluyo un control de IgG no especifico (R347) como control negativo.
Solo 7 de los 13 mAb purificados (mAb; 2A3.1, 10A7.5, 11D12.1, 12B8.19, 15B6.3, 25E9.1 y 28F6.1) inhibieron la lisis de RBC mediada por nAT (veanse las Figuras 1A y 1B ). Tres de los anticuerpos (2A31., 10A7.5 y 12B8.19) fueron inhibidores potentes y mostraron aproximadamente un 80% de inhibicion de la lisis de RBC mediada por nAT en una proporcion 1: 1 (mole IgG: mole AT). Estos resultados sugirieron que los mAb generados pueden inhibir la formacion de poros en los globulos rojos de los conejos.
Los eritrocitos humanos no poseen una gran cantidad de receptores para AT. En consecuencia, los RBC humanos no son tan sensibles como los RBC de conejo a la lisis mediada por nAT y probablemente no sean un objetivo primario para la AT durante una infeccion. Otros tipos de celulas (por ejemplo, epiteliales, linfocitos, monocitos y macrofagos) son objetivos mas relevantes para los efectos de la NAT durante una infeccion estafilococica. La actividad de los anticuerpos purificados se examino en la lisis mediada por nAT de las estirpes celulares humanas, A549 (estirpe celular epitelial alveolar) y THP-1 (estirpe celular monocitica). Los anticuerpos monoclonales (mAb) se valoraron frente a un nivel constante de nAT en presencia de celulas A549 o THP-1. La lisis celular se cuantifico mediante la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) y se determino el% de inhibicion de la liberacion de LDH, como se describe en el presente documento. Los resultados se muestran graficamente en las Figs. 2A y 2B. Los mAb que inhibieron la lisis de RBC de conejo tambien inhibieron la lisis mediada por nAT de celulas A549 y THP-1 humanas (veanse las Figuras 2A y B, respectivamente) con la exception de 11D12.1 que inhibio la lisis de las celulas A549 y no tuvo efecto en la nAT Lisis mediada de celulas THP-1. La potente actividad anti-AT mostrada por estos mAb resalta la utilidad potencial de estos anticuerpos para inhibir la actividad AT durante una infeccion, lo que limita la progresion de los sintomas y enfermedades relacionados con estafilococos.
Ejemplo 4: Inmunizacion pasiva con mAb anti-AT reduce las lesiones dermonecroticas
S. aureus es una de las principales causas de infecciones de la piel y tejidos blandos (SSTI) tanto en el hospital como en la comunidad, que a menudo se caracterizan por inflamacion, dano tisular y formacion de pus. La AT puede cumple una funcion en estas infecciones que conducen a una respuesta hiperinflamatoria y el dano tisular y la inhibicion de la funcion de la TA limitarian entonces la capacidad de las bacterias para causar enfermedades graves. Para determinar la utilidad de los mAb anti-AT para minimizar, reducir o eliminar los efectos de la infeccion por S. aureus, se inyectaron intraperitonealmente (IP) grupos de 5 ratones con cada uno de los 7 mAb inhibidores (por ejemplo, aproximadamente 5 mg/kg) y un control de isotipo IgG-1 (R347) control 24 horas antes de la infeccion subcutanea con S. aureus Wood. El tamano de las lesiones dermonecroticas se midio diariamente durante 6 dias y se documento fotograficamente, como se muestra en la FIG. 3A (dia 6 mostrado en la FIG. 3A). Los 5 inhibidores in vitro mas potentes de la funcion nAT (2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 y 28F6.1), redujeron sustancialmente el tamano de la lesion en relation con el control R347 mientras que los mAb menos potentes, in vitro (11D12.1, 15B6.3), no tuvo un efecto sustancial sobre el tamano de la lesion en relacion con el control, como se muestra en las Figs. 3A y 3B. La Figura 3B ilustra graficamente la disminucion en el tamano de la lesion con el tiempo. 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19, 25E9.1 y 28F6.1 son potentes inhibidores de la funcion AT in vitro y tambien muestran un potente efecto profilactico en un modelo murino de SSTI. Los anticuerpos adicionales, LC10, QD 20, QD33 y QD37 tambien se probaron en el modelo de dermonecrosis. Estos anticuerpos monoclonales se inyectaron iintraperitonealmente (IP) en cinco ratones por grupo a 1 y 0.5 mg/kg 24 horas antes de la infeccion subcutanea con S. aureus Wood como se describio anteriormente. Los resultados se muestran en las Figs. 17 A y B). Los valores de p se calcularon utilizando la prueba posterior de Dunnett. Para los experimentos de 1 mg/kg, el valor de p para el control de R347 en comparacion con la prueba Abs fue p <0.0001. Para los experimentos de 0.5 mg/kg, el valor de p para el control de R347 en comparacion con el Abs de prueba fue p <0.05.
Ejemplo 5: La inmunizacion pasiva con mAb anti-AT mejora la supervivencia en la neumonia murina
La profilaxis con los mAb anti-AT mas potentes generados se probo en un modelo de neumonia murina. Los ratones C57BL/6J se inmunizaron pasivamente con aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg y aproximadamente 45 mg/kg de 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19 o 28F6.1, veinticuatro horas antes de la administration intranasal. infeccion por S. aureus USA300 (BAA-1556). La supervivencia se controlo durante 6 dias y se comparo con un control de isotipo (R347) a 45 mg/kg, como se muestra en las Figs. 4-7. La significacion estadistica se calculo utilizando la prueba log-rank. La Figura 4 ilustra graficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infeccion por S. aureus despues de la inmunizacion pasiva con varias cantidades de mAB 12B.19. La Figura 5 ilustra graficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infeccion por S. aureus despues de la inmunizacion pasiva con varias cantidades mAB 2A3.1. La Figura 6 ilustra graficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infeccion por S. aureus despues de la inmunizacion pasiva con varias cantidades mAB 28F6.1. La Figura 7 ilustra graficamente el porcentaje de supervivencia en el transcurso de la infeccion por S. aureus despues de la inmunizacion pasiva con varias cantidades mAB 10A7.5.
Todos los anticuerpos anti-AT mostrados dieron como resultado una mejora significativa en la supervivencia en relacion con el control, lo que lleva a una supervivencia de al menos el 90% con la dosis de 45 mg/kg (ver Figuras 4­ 7). Se considera que la toxina alfa es un determinante clave de la virulencia en la neumonia estafilococica. Los resultados presentados aqui ilustran que la administracion pasiva de mAb inhibidores potentes es un enfoque valido para la prevencion de enfermedades. Tomados en conjunto, los estudios en animales presentados en el presente documento apoyan el papel de la AT en la enfermedad estafilococica y proporcionan apoyo para el uso de mAb que inhiben la funcion de la AT para limitar la gravedad de la enfermedad o incluso la muerte asociada con una infeccion por S. aureus.
Para caracterizar aun mas el impacto de un mAb anti-AT en el numero de bacterias durante una infeccion, se administro profilacticamente una version completamente humana de mAb 2A3.1 (por ejemplo, 2A3hu) a ratones 24 horas antes de la infeccion intranasal con aproximadamente 1.3 * 108 cfu de S. aureus USA300. Cuarenta y ocho horas despues de la infeccion, los ratones se sometieron a eutanasia y se recogieron sus pulmones y rinones y se procesaron para la enumeracion bacteriana (veanse las Figuras 8A y 8B). 4 y 24 horas despues de la infeccion, los ratones se sometieron a eutanasia y se tomaron muestras para medir la produccion de citoquinas (descritas a continuacion y ver la Figura 9) y para el analisis histopatologico (descrito a continuacion y ver la Figura 10). Los valores de p se calcularon utilizando la prueba posterior de Dunnett. Los resultados representativos de la enumeracion bacteriana se presentan en las Figs. 8A y 8B. La administracion profilactica de 2A3hu produjo una reduccion significativa en el numero de bacterias tanto en los pulmones (vea la Figura 8A) como en los rinones (vea la Figura 8B) en relacion con el control de R347, lo que indica que la inhibicion de la funcion AT puede limitar la progresion de la enfermedad y tambien limitar la propagacion sistemica del organismo invasor.
Tambien se probaron anticuerpos adicionales, LC10, QD 20, QD33 y QD37 en el modelo de neumonia. Estos anticuerpos monoclonales se inyectaron iintraperitonealmente (IP) en diez ratones por grupo a 5 mg/kg 24 horas antes de la infeccion intranasal (IN) con aproximadamente 2 * 108 ufc de S. aureus USA300. Los resultados de estos experimentos se muestran en la FIG. 18. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba posterior de Dunnett. El valor de p para el mAb 2A3 en comparacion con QD37 fue p = 0.0072; el valor p para el mAb 2A3 en comparacion con LC10 fue p = 0.0523; el valor p para el mAb 2A3 en comparacion con QD33 fue p = 0.0521.
Ejemplo 6: La inhibicion de la AT en el modelo de neumonia reduce la produccion de citoquinas proinflamatorias
La infeccion por neumonia por S. aureus suele ir acompanada de una sobreproduccion de citoquinas proinflamatorias que se considera conducen a un aumento de la activacion y la infiltracion de las celulas inmunitarias, lo que finalmente lleva a un aumento de la congestion y necrosis tisular (Bubeck Wardenburg, J. 2007). Se ha demostrado que un mutante de delecion de S. aureus AT exhibe una virulencia reducida en relacion con su S. aureus de tipo silvestre isogenico en el modelo de neumonia murina. Se demostro ademas que la inmunizacion activa y pasiva contra la AT redujo la expresion de IL-1 p, un mediador conocido de la lesion pulmonar aguda, y protegio a los ratones de la neumonia grave (Bubeck Wardenburg, J. 2007; Bubeck Wardenburg, J. 2008). Estos resultados sugieren que la inhibicion de la AT durante la infeccion por S. aureus puede reducir la produccion de citoquinas proinflamatorias y, por lo tanto, limitar la infiltracion celular excesiva, con el resultado final de que son menos sintomas de neumonia y un mayor aclaramiento bacteriano como se vio anteriormente.
Para probar esta hipotesis, los ratones se inmunizaron pasivamente con 2A3hu 24 horas antes de la infeccion intranasal con aproximadamente 1.3 * 108 ufc de S. aureus USA300. Cuatro y veinticuatro horas despues de la infeccion, los ratones se sometieron a eutanasia y la mitad del pulmon se fijo y preparo para la tincion con hematoxilina y eosina y el examen microscopico, mientras que el liquido de lavado broncoalveolar se recogio del otro lado y se proceso para determinar los niveles de citoquinas. Los resultados representativos de la produccion de citoquinas despues de la inmunizacion pasiva se muestran en la FIG. 9. La Figura 10 ilustra fotograficamente la efectividad de la inmunizacion pasiva con mAb descritos en este documento.
Cuatro horas despues de la infeccion los niveles de citoquinas fueron similares en ratones tratados con R347 y 2A3hu, sin embargo, a las 24 horas posteriores a la infeccion, los niveles de IL-6, TNF-a, KC e IL-1p se redujeron en los animales tratados con 2A3hu, como se muestra en la FIG. .9 (ver los resultados en un circulo en el punto de tiempo de 24 horas), lo que indica que la administracion profilactica de 2A3hu resulto en niveles reducidos de citoquinas detectadas, con respecto al control. Estos datos estan respaldados por los resultados del examen histopatologico del pulmon en el que los ratones tratados con R347 tenian una inflamacion pulmonar prominente, necrosis y alveolitis junto con la presencia de colonias bacterianas (ver imagenes superior izquierda e inferior izquierda en la Figura 10).
En contraste, los animales tratados con 2A3hu teman una inflamacion pulmonar limitada sin necrosis, alveolitis o colonias bacterianas visibles (vea las imagenes superior derecha e inferior derecha en la Figura 10). El efecto protector de los mAb anti-AT en el modelo de neumoma esta asociado con una respuesta inflamatoria reducida que puede limitar el dano tisular local y promover el aclaramiento bacteriano.
Ejemplo 7: Cinetica de union y competicion.
Las mediciones de afinidad se llevaron a cabo utilizando resonancia de plasmon superficial (SPR), para caracterizar aun mas los mAb que mostraron una potente actividad inhibitoria. La IgG purificada se capturo en un sensor utilizando IgG anti-raton de rata y el chip se expuso a soluciones que tenian diferentes concentraciones de nAT. Se midieron las constantes de velocidad de asociacion y disociacion, a partir de las cuales se determinaron las constantes de union. Los anticuerpos 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 y 12B8.19 tenian afinidades similares con valores Kd de 601, 504, 337 y 485 pM respectivamente, mientras que 28F6.1 exhibio un valor Kd de 13 nM, como se muestra en la tabla abajo. Kd se calculo como koff/kon.
IgG kon (1/Ms) (x e+5) koff (1/s) (x e-4) Kd (nM) Chi2
2A3.1 13.7 8.21 0.601 0.433
10A7.5 6.92 3.49 0.504 0.345
12B8.19 5.75 2.78 0.485 0.288
25E9.1 6.24 2.1 0.337 0.291
28F6.1 0.67 8.81 13.1 0.906
Los experimentos de competencia tambien se realizaron utilizando SPR, cuyos resultados sugieren que los anticuerpos 2A3.1, 10A7.5, 25E9.1 y 12B8.19 probablemente se unen al mismo epitopo o similar.
Los valores de IC50 y Kd se muestran para los mAb QD 20, LC10, QD33, QD37 y 2A3GL a continuacion
Ab IC50 (|Jg/ml) Kd (nM)
QD20 0.16 0.087
LC10 0,12 0.17
QD33 0.09 0.33
QD37 0.17 0.18
2A3GL 0.48 1.44
La IC50 se calculo utilizando el ensayo hemolitico de RBC con toxina alfa de S. aureus a 0.1 mg/ml.
Ejemplo 8: Formacion de bloques inhibidores de mAb de heptamero resistente a SDS
Se considera que la toxina alfa (AT) de S. aureus lisa las celulas en un proceso de multiples etapas en el que una molecula de AT monomerica soluble secretada se une a un receptor de la superficie celular, o se adsorbe de manera no especifica a las membranas celulares, oligomeriza en un antiporo heptamerico en el superficie celular y experimenta un cambio conformacional que conduce a la formacion de un barril p transmembrana de 14 cadenas que media la posterior lisis de la celula diana. El mecanismo de inhibicion por los mAb descritos en el presente documento se caracterizo adicionalmente para determinar en que etapa los mAb inhibidores bloquearon la funcion AT. Se examino la capacidad de estos mAb para prevenir la union de AT a fantasmas de RBC de conejo unidos a una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos. Las placas de ELISA de 96 pozos se recubrieron con fantasmas de globulos rojos y se bloquearon con BSA al 2%. Los fantasmas fueron incubados con nAT /- un exceso de 20 molar de IgG anti-AT. Entonces se detecto la union de nAT con IgG anti-AT de conejo y se calculo el% de union; % de union = 100 * [100-(A490 nAT mAb)/(A490 nAT no mAb)]. En un exceso de IgG de 20 molar, no hubo inhibicion de la union de nAT a membranas de globulos rojos de conejo, como se muestra en la FIG. 11, lo que indica que estos mAb inhibidores no estaban actuando en la etapa de union del receptor.
Ademas de las membranas celulares, se ha demostrado que AT y otras toxinas formadoras de poros se ensamblan facilmente y forman poros en las membranas de los liposomas. Inicialmente, el efecto de la IgG anti-AT en la formacion de heptamero AT se probo en liposomas. Despues de la incubacion de AT con un exceso molar de 10 veces de liposomas (Kpido: AT, peso:peso), en presencia de IgG, se examino la formacion de heptamero mediante analisis de transferencia Western, como se muestra en la FIG. 12. Las muestras se solubilizaron luego en tampon de muestra SDS-PAGE a 37 °C y la formacion de heptamero se detecto mediante analisis de transferencia Western. La presencia del heptamero resistente a SDS es evidente en la parte superior del gel mostrado en la FIG. 12, en los carriles 6 y 7 (por ejemplo, mAb9D7.3 y sin carril de control de IgG, respectivamente). Todos los mAb inhibidores eliminaron la formacion de heptamero, mientras que un control de isotipo irrelevante (por ejemplo, Linea 6; 9D7.3) no tuvo ningun efecto. La inhibicion de la actividad de oligomerizacion se confirmo utilizando mAb 2A3.1, 10A7.5 y 12B8.19 en un ensayo de oligomerizacion en fantasmas de conejo RBC, como se ilustra en las transferencias Western representativas mostradas en las Figs. 13A y 13B. AT se incubo con una titulacion de IgG antes de la incubacion con fantasmas de eritrocitos de conejo y la deteccion de la formacion de heptamero por SDS-PAGE. Los AcM 2A3.1, 10A7.5 y 12B8.19 inhibieron eficazmente la formacion de heptamero AT incluso en una proporcion de IgG: toxina (mol: mol) 1: 1 y el efecto de inhibicion de la oligomerizacion se valoro a medida que se redujeron los niveles de AcM (ver Fig. 13A y 13B; aparicion de heptamero en proporciones molares de 0.5: 1 y 0.25: 1). Estos resultados sugieren que los mAb 2A3.1, 10A7.5 y 12B8.19 previenen la lisis celular mediada por AT mediante la inhibicion de la formacion de heptamero resistente a SDS.
Ejemplo 9: Conversion a IgG completamente humana
Una IgG completamente humana incluye los dominios variables de las cadenas pesada (Vh) y ligera (Vl) de los mAb quimericos descritos en este documento, fusionados geneticamente a los dominios constantes de una IgG-1 humana. Los Vh y Vl de cada uno de los mAb quimericos se clonaron, se secuenciaron y se fusionaron con los dominios constantes de IgG-1 Vh humana y kappa humano, respectivamente. Se demostro que las IgG-1 completamente humanas resultantes retienen la region variable humana responsable y las propiedades de union del mAb de interes. Los anticuerpos completamente humanos se expresaron, se purificaron y su actividad se comparo con los mAb quimericos aislados de los hibridomas de raton VelocImmune. Los mAb completamente humanos mostraron una potencia similar a la de las quimeras originales en la inhibicion de la lisis de celulas RBC, A549 y THP-1, con la excepcion de 25E9.1hu, que se hizo sustancialmente mas potente que la quimera original 25E9.1. Las figuras 14-16 ilustran graficamente la inhibicion de la liberacion de LDH, caracterisiica de la lisis celular, en los globulos rojos (RBC; ver Figura 14), celulas A549 (ver Figura 15) y celulas THP-1 (ver Figura 16). El aumento en la potencia del mAb 25E9.1 humano (por ejemplo, 25E9.1hu) puede deberse a una poblacion de celulas mixtas en el hibridoma original que contenia 2 moleculas distintas de IgG anti-AT, solo una de las cuales puede tener la actividad que Funcion NAT inhibida. Por lo tanto, los calculos de molaridad y las mediciones de actividad para el mAb de la quimera original pueden no tener una correlacion directa.
Ejemplo 10: Secuencias representativas de aminoacidos y nucleotidos para anticuerpos que se unen especificamente a la toxina alfa de S. aureus
Tabla 1: Secuencias de CDR de VL para mAb 2A3.1, 10A7.5, 12B8.19 y 25E9.1
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 1 VLCDR1 RASQSISSWLA
SEQ ID NO: 2 VL CDR2 KASSLES
SEQ ID NO: 3 VLCDR3 QQYNSYWT
Tabla 2: Secuencias de CDR de VL para mAB 28F6.1
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 4 mAb 28F6.1 VL CDR1 RASQGIRNDLG
SEQ ID NO: 5 mAb 28F6.1 VL CDR2 DASSLQS
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia SEQ ID NO: 6 mAb 28F6.1 VL CDR3 LQDYNYPWT
Tabla 3: Secuencias de CDR de VH para mAb 2A3.1
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 7 VH CDR1 SYDMH
SEQ ID NO: 8 VH CDR2 GIGTAGDTYYPGSVKG SEQ ID NO: 9 VH CDR3 DNYSSTGGYYGMDV
Tabla 4: Secuencias de CDR de VH para mAb 10A7.5 y 12B8.19
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 10 VH CDR1 RYDMH
SEQ ID NO: 11 VH CDR2 VIGTDGDTYYPGSVKG SEQ ID NO: 12 VH CDR3 DRYSSSNHYNGMDV
Tabla 5: Secuencias de CDR de VH para el mAb 28F6.1
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 13 mAb 28F6.1 VH CDR1 SYAMT
SEQ ID NO: 14 mAb 28F6.1 VH CDR2 VISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO: 15 mAb 28F6.1 VH CDR3 DGRQVEDYYYYYGMDV
Tabla 6: Secuencias CDR de VH para el mAb 25E9.1
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 7 mAb 25E9.1 VH CDR1 SYDMH
SEQ ID NO: 17 mAb 25E9.1 VH CDR2 VIDTAGDTYYPGSVKG SEQ ID NO: 18 mAb 25E9.1 VH CDR3 DRYSGNFHYNGMDV
Tabla 7: Secuencias de aminoacidos VL y VH para mAb anti-toxina alfa
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
mAb 2A3.1 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYNSYW CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T (SEQ ID PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: NO: 3)' SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1)
OYN S YWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 19)
mAb 2A3.1 VH SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DNYSSTGG AASGFTFS S YDMH WVROATGK YYPGSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTTSRENAKNSLYLQLNSLR 8) 9)
AGDTAVYFCARDNYSSTGGYY GMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 20)
KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYNSYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 3)
OYN S YWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 21)
RYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 10) VIGTDGDT DRYSSSNH AASGFTFSRYDMHWVROATG YYPGSVKG YNGMDV KGLEWVSVIGTDGDTYYPGSV (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
KGRFIISRENAKNSLYLEMNSL ID 12)
RAGDTAVYYCARDRYSSSNHY NGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 22)
mAb 12B8.19 KASSLES (SEQ ID
VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYNSYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKVLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 3)
OYNSYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 23)
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
RYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 10) VIGTDGDT DRYSSSNH AASGFTFSRYDMHWVROATG YYPGSVKG YNGMDV KGLEWVSVIGTDGDTYYPGSV (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
KGRFTTSRENAKNSLYLEMNSL ID 12)
RAGDTAVYYCARDRYSSSNHY NGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 24)
DASSLQS (SEQ ID AIQMTQSPS SLS AS VGDRVTITC RASQG1RN NO: 5) L Q D Y N Y P RASOGIRNDLG WY OOKPGKAP DLG (SEQ WT KLLIYDASSLOSGVPSRFSGSGS ID NO: 4) (SEQ ID NO:
GTDFTLTISSLOPEDFATYYCLO 6)
DYNYPWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 25)
mAb 28F6.1 SYAMT (SEQ ID
VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 13) VISGSGGST DGRQVED AASGFTFSSYAMTWVROAPGK YYADSVK YYYYYGM GLEWVSVISGSGGSTYYADSV G DV KGRFTVSRDNSKNTLYLQMNS (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
LRAEDTAVYY CAKDGROVED 14) 15)
YY YYY GMDVW GOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 26)
KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYNSYW
CRASOS1SSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 3)
OYNSYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 27)
SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) VIDTAGDT DRYSGNFH TASGFTFSSYDMHWVROATGK YYPGSVKG YNGMDV GLEWVSVIDTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 17) 18)
AGDTAVYYCVRDRYSGNFHY NGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 28)
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
mAb QD20 VH SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DRYSPTGH AASGFTFS SYDMH WVROATGK YYPGSVKG YMGMDV GLEW VSGIGTAGDTY YPG S VK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 8) 16)
AGDTAVYYCARDRYSPTGHY MGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 41)
mAb QD20 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYDTYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 64)
OYDTY WTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 42)
mAb QD33 VH SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DRYSRTGH AASGFTFS S YDMH WVROATGK YYPGSVKG YMGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 8) 65)
AGDTAVYYCARDRYSRTGHY MGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 43)
mAb QD33 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYDTYW
CRASOS1SSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 64)
OYDTYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 44)
mAb QD37 VH SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DRYSRTGH AASGFTFSSYDMHWVROATGK YYPGSVKG YMGMSL GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 8) 66)
AGDTAVYYCARDRYSRTGHY MGMSLWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 45)
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
mAb QD37 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYDTYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLL1YKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 64)
OYDTYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 46)
mAb QD3 VH SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DNYSRTGH AASGFTFS S YDMH WVROATGK YYPGSVKG YMGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 8) 67)
AGDTAVYYCARDNYSRTGHY MGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 47)
mAb QD3VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) KQYADYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCK 1) 68)
OYADYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 48)
mAb QD4 VH SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DNYSRTGH AASGFTFS S YDMH WVROATGK YYPGSVKG YMGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 8) 67)
AGDTAVYYCARDNYSRTGHY MGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 49)
mAb QD4 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYDTYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 64)
OYDTYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 50)
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
mAb QD23 VH SYDMH (SEQ ID
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC, NO: 7) GIGTAGDT DRYSPTGH AASGFTFSSYDMHWVROATGK YYPGSVKG YMGMSL GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTTSRENAKNSLYLQMNSLR 8) 78)
AGDTAVYYCARDRYSPTGHY MGMSLWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 51)
mAb QD23 VL KASSLES (SEQ ID
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYDTYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLL1YKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 64)
OYDTYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 52)
mAb QD32 VH SYDMH (SEQ ID
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DRYSRTGH AASGFTFS S YDMH WVROATGK YYPGSVKG YMGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: NO: 65) GRFTTSRENAKNSLYLQMNSLR 8 ) AGDTAVYYCARDRYSRTGHY MGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 53)
mAb QD32 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) KQYADYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCK 1) 68)
0 Y AD Y WTF GOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 54)
SYDMH (SEQ ID
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DNYSSTGG AASGFTFSSYDMHWVROATGK YYPGSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTTSRENAKNSLYLQMNSLR 8) 9)
AGDTAVYYCARDNYSSTGGY YGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 55)
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
mAb 2A3GL KASSLES (SEQ ID
VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) QQYNSYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLL1YKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 3)
OYNSYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 56)
mAb LC10 VH SHDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 69) GIGTAGDT DRYSPTGH AAS GFTFS SHDMHWVROATGK YYPDSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPDSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 70) 71)
AGDTAVYYCARDRYSPTGHYY GMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 57)
mAb LC10 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) KQYADYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCK 1) 68)
OYADYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 58)
mAb TVES VH SYDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 7) GIGTAGDT DNYSPTGG AAS GFTF S S YDMH WVROATGK YYPGSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPGSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 8) 72)
AGDT AVY Y CARDN YSPTGG Y YGMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 59)
mAb TVES VL KASSLKS (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 73) QQYESYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLKSGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQ 1) 74)
OYESYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 60)
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
mAb 3H7KAD SHDMH (SEQ ID
VH NO: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC, 69) GIGTRGDT DRYSPTGH AASGFTFSSHDMHWVROATGK YYPDSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTRGDTYYPDSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTTSRENAKNSLYLQMNSLR 75) 71)
AGDTAVYYCARDRYSPTGHYY GMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 61)
mAb 3H7KAD KASSLES (SEQ ID
VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) KQYADYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLL1YKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCK 1) 68)
OYADYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 58)
mAb LC9 VH SHDMH (SEQ ID
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 69) GIGTRGDT DKYSPTGH AAS GFTFS SHDMHWVROATGK YYPDSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTRGDTYYPDSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTTSRENAKNSLYLQMNSLR 75) 76)
AGDT AVY Y CARDKYSPTGHY YGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 62)
mAb LC9 VL KASSLES (SEQ ID DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 2) KQYADYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLESGVPSRFSGSG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
SGTEFTLTISSLQPDDFATYYCK 1) 68)
OYADYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 58)
mAb LC4 VH SHDMH (SEQ ID
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 69) GIGTRGDT DKYSPTGH AASGFTFSSHDMHWVROATGK YYPDSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTRGDTYYPDSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTTSRENAKNSLYLQMNSLR 75) 76)
AGDTAVYYCARDKYSPTGHY YGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 62)
Descripcion Secuencia VH o VL (con CDR CDR1 CDR2 CDR3 subrayado)
mAb LC4 VL KASSLVK (SEQ ID
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS NO: 77) QQYESYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLVKGVPSRFSGS (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GSGTEFTLTIS SLQPDDF ATYYC 1) 74)
OOYESYWTFGOGTKVEIK
(SEQ ID NO: 63)
mAb LC5 VH SHDMH (SEQ ID EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC NO: 69) GIGTAGDT DRYSPTGH AAS GFTFS SHDMHWVROATGK YYPDSVKG YYGMDV GLEWVSGIGTAGDTYYPDSVK (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
GRFTISRENAKNSLYLQMNSLR 70) 71)
AGDTAVYYCARDRYSPTGHYY GMDVWGOGTTVTVSS
(SEQ ID NO: 79)
mAb LC5 VL KASSLVK (SEQ ID
NO: 77) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTIT RASQSISS QQYESYW
CRASOSISSWLAWYOOKPGKA WLA T
PKLLIYKASSLVKGVPSRFSGS (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: GSGTEFTLTISSLQPDDF ATYYC
OOYESYWTFGOGTKVEIK 1) 74)
(SEQ ID NO: 63)
Tabla 8: Secuencias de nucleotidos VL y VH para mAb anti toxina alfa
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 29 Secuencia de nucleotidos mAb 2A3.1 VL
GACATC CAGAT GACCCAGT CT CCTT CCA CCCTGTCT GCAT CT GTAGG AGACAG AGT CACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGT ATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCT GATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTG GGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGG AT CTGG G ACAGAATT CACT CT CACCAT CA GCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAAC TTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTG GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGA AATCAAA
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 30 Secuencia de nucleotidos mAb 2A3.1 VH
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG AGACT CT CCT GT GCAGCCTCTGGATT CA CCTTCAGTAGCTACGACATGCACTGGGT CCGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTGGAG TGGGTCTCAGGTATTGGCACTGCTGGTG ACACATATTATCCAGGCTCCGTGAAGGG CCG ATT C AC CAT CT CCAG AGAAAAT GCC AAG AACT CCTT GTATCTT CAATT G AACAG CCTGAGAGCCGGGGACACGGCTGTGTA CTT CT GT GC AAG AG ACAATT AT AGCAGC A CCGGGGGGTACTACGGTATGGACGTCTG GGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC
CTCA
SEQ ID NO: 31 Secuencia de nucleotidos mAb 10A7.5 VL
GACATC CAGAT GACCCAGT CT CCTT CCA CCCTGTCT GCAT CT GTAGG AGACAG AGT CACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGT ATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCT GATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTG GGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGG ATCTGGGACAGAATTCACT CT CACCAT CA GCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAAC TTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTG GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGA AATCAAA
SEQ ID NO: 32 Secuencia de nucleotidos mAb 10A7.5 VH
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG AGACT CT CCT GT GCAG CCT CT GGATT CA CCTTCAGTAGGTAC GACATGCACTGG GT CCGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTGGAG TGGGT CT CAGTT ATT GGTACT GAT GGTGA CACATACTATCCAGGCTCCGTGAAGGGC CG ATT CAT CAT CTCCAG AG AAAAT GCC AA GAACTCCTTGTATCTTGAAATGAACAG C C TGAGAGCCGGGGACACGGCTGTGTATTA CTGTGCAAGAGATCGGTATAGCAGCTCG AACCACTACAACGGTAT GGAC GTCTG GG GCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC
A
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 33 Secuencia de nucleotidos mAb 12B8.19 VL
GACATC CAGAT GACCCAGT CT CCTT CCA CCCTGTCT GCAT CT GTAGG AGACAG AGT CACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGT ATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCT GATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTG GGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGG AT CTGG G ACAGAATT CACT CT CACCAT CA GCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAAC TTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTG GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGA AATCAAA
SEQ ID NO: 34 Secuencia de nucleotidos mAb 12B8.19 VH
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG AGACTCTCCTGTGCAG CCTCT GGATT CA CCTTCAGTAGGTAC GACATGCACTGG GT CCGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTGGAG TGGGT CT CAGTT ATT GGTACT GAT GGTGA CACATACTATCCAGGCTCCGTGAAGGGC CG ATT CAT CAT CTCCAG AG AAAAT GCC AA GAACTCCTTGTATCTTGAAATGAACAG C C TGAGAGCCGGGGACACGGCTGTGTATTA CTGTGCAAGAGATCGGTATAGCAGCTCG AACCACTACAACGGTAT GGAC GT CTG GG GCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC
A
SEQ ID NO: 35 Secuencia de nucleotidos mAb 28F6.1 VL
GCCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCT CCCTGTCT GCAT CT GTAGG AGACAG AGT CACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGC ATT AG AAAT G ATTTAGG CT G GTAT C AG C A GAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTG AT CT AT GAT G C ATCCAGTTT ACAAAGT GG GGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGA TCTGGCACAG ATTT CACT CT CACCAT C AG CAGCCTGCAGCCT GAAGATTTT GCAACTT ATTACTGTCTACAAGATTACAATTACCCG TGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTG GAAATCAAA
SEQ ID NO: Descripcion Secuencia
SEQ ID NO: 36 Secuencia de nucleotidos mAb 28F6.1 VH
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG AGACTCTCCTGTGCAG CCTCT GGATT CA CCTTTAGCAGCTATGCCATGACCTGGGT CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGA ATG GGT CT CAGTT ATTAGT GGT AGT G GT GGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGA AGGGCCGGTTCACCGTCTCCAGAGACAA TT CC AAG AAC ACGCT GT AT CT GC AAAT G A ACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCG TATATTACTGTGCGAAAGATGGGAGGCA GGTCGAGGATTACTACTACTACTACGGTA TGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGG TCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 37 Secuencia de nucleotidos mAb 25E9.1 VL
GACATC CAGAT GACCCAGT CT CCTT CCA CCCTGTCT GCAT CT GTAGG AGACAG AGT CACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGT ATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCT GATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTG GGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGG ATCTGGGACAGAATTCACT CT CACCAT CA GCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAAC TTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTG GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGA AATCAAA
SEQ ID NO: 38 Secuencia de nucleotidos mAb 25E9.1 VH
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA GGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG AGACTCTCCTGTACAGCCT CT G GATT CAC CTT C AGTAGTT ACG ACATGC ACT G G GTC CGCCAAGCTACAGGAAAAGGTCTGGAGT GGGTCTCAGTTATTGATACTGCTGGTGA CACATACTATCCAGGCTCCGTGAAGGGC CG ATT CACCAT CT CCAG AGAAAAT GCCAA G AACT C CTTGT AT CTT C AAAT G AACAGCC TGAGAGCCGGGGACACGGCTGTGTATTA CTGTGTAAGAGATAGGTATAGTGGGAAC TT CCACTACAACGGTAT GGACGT CTG GG GCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC
A
Tabla 9: Tabla de resumen de CDR de VL y VH
Descripcion SEQ ID NOs
VLCDR 1 1,4
Figure imgf000061_0001
Table 10: Secuencias de Aminoacido de Toxina Alfa
Figure imgf000061_0002
( )
Ejemplo 11: Mapeo de las regiones de union de los anticuerpos anti toxina alfa estafilococicos
Se construyeron variantes quimericas, compuestas de porciones de toxina alfa y LukF-PV, para identificar el fragmento de toxina alfa al que se une un anticuerpo correspondiente al mAb LC10 que contiene una variante de Fc (LC10 YTE). LukF-PV se eligio como el companero quimerico porque LC10 YTE no lo reconoce (Figura 19), pero comparte una alta similitud estructural (Gouaux, E., M. Hobaugh, et al. “alpha-Hemolysin, gamma-hemolysin, and leukocidin from Staphylococcus aureus: distant in sequence but similar in structure” Protein Sci 6(12): 2631-5 (1997); Meesters, C., A. Brack, et al. “Structural characterization of the alpha-hemolysin monomer from Staphylococcus aureus.” Proteins 75(1): 118-26 (2009)) y 25% de identidad de secuencia con toxina alfa (Figura 20).b Se construyeron una serie de variantes quimericas mediante la sustitucion sistematica de 50 aminoacidos toxina alfa (aa) por sus correspondientes homologos de LukF-PV. Tambien se reemplazaron las regiones mas cortas dentro de segmentos seleccionados de 50 aa de interes (Tabla 11). Se empleo un instrumento ProteOn para analizar la afinidad de union de LC10 YTE a estas variantes. Los resultados de union de LC10 YTE a las variantes se resumen en la Tabla 11.
Tabla 11 Perfiles de union de LC10 YTE a las variantes quimericas de alfa toxina/LukF-PV
Figure imgf000062_0001
* Las senales de union de la poli anti toxina alfa a 50 nM fueron superiores a 100RU. ** Las senales de union poli anti toxina alfa a 50 nM estaban por debajo de 100RU.
Todas las construcciones quimericas podrian expresarse en algun nivel con la excepcion de KO -73-81, (Tabla 11). LC10 YTE no se unio a las variantes que codifican LukF-PV en lugar de aa 101-110 de toxina alfa (KO -52-110 y k O -101-110) o aa 224-231 (KO -204-241, KO -204 -231 y KO -224-231). La union de LC10 YTE se deterioro significativamente o se interrumpio por completo al reemplazar aa 248-277 (KO -248-277) o su segmento mas grande aa 248-293 (KO -248-293), respectivamente.
En ciertos casos, una aparente falta de union a YTE LC10 puede explicarse por variantes individuals de toxina alfa/LukF-PV que muestran un plegamiento incorrecto. Una incapacidad general para plegarse correctamente tambien puede explicar la aparente falta de expresion de KO 73-81. Ademas, la homolog â de la secuencia de aminoacidos entre la toxina alfa y LukF-PV varia sustancialmente en diferentes regiones. Por ejemplo, el segmento correspondiente a un 179-193 de toxina alfa comparte una identidad del 67% con LukF-PV, mientras que la secuencia completa comparte una identidad del 25%. Por lo tanto, aunque no se observo ningun efecto en la union a YTE con LC10 cuando se intercambiaban regiones de homologia de secuencia alta, estas regiones podrian potencialmente contener secuencias adicionales a las que se une el anticuerpo con YTE a LC10.
Los resultados del analisis de mutagenesis anterior indican que la sustitucion de cualquiera de las tres regiones de aa 101-110, aa 224-231 y 248-293 de toxina alfa con residuos de LukF-PV dano la union de LC10 YTE, mientras que reemplaza las regiones aa restantes No tuvo un impacto significativo.
Estas tres regiones representan dos ubicaciones diferentes en la estructura tridimensional de la toxina alfa. Los segmentos correspondientes a aa 101-110 y 224-231 estan en proximidad espacial y localizados en un lado de un dominio de intercalacion Beta, mientras que el segmento correspondiente a aa 248-277 esta ubicado principalmente en el dominio “Aro” (Song, L., MR Hobaugh, et al., “Estructura de estafilococo alfa-hemolisina, un poro de transmembrana heptamerico”. Science 274 (5294): 1859-66 (1996)) (Figura 21).
El segmento correspondiente a aa 248-277 mostro impacto en la union y tambien contenia los residuos de contacto estructural de rayos X identificados como que comprendian aa 261-272 (en la que T263, N264 y K266 son residuos de contacto reales) (Figura 20). Ademas, la estructura cristalina revelo otro segmento correspondiente a aa 173-201 en el que D183, W187 y N188 son residuos de contacto reales (Figura 20). La variante quimerica que contenia este segmento en particular (KO -148-205) todavia mostraba una buena union a LC10 YTE. Esto es probablemente atribuible a la alta homologia de secuencia de esta region particular (52% de identidad y 63% de similitud) entre la toxina alfa y LukF-PV. Los aminoacidos alrededor de los residuos de contacto (aa 179-193) comparten una homologia aun mayor (67% de identidad), mientras que, en contraste, la secuencia completa comparte solo el 25% de identidad.
Usando el enfoque basado en mutagenesis, el segmento correspondiente a aa 248-277 se identifico como importante para la union de LC10 YTE. Esto se confirmo aun mas mediante el analisis estructural de la estructura del complejo LC10 YTE/toxina alfa. El analisis estructural tambien revelo ciertos residuos de contacto dentro del fragmento aa 248­ 277 que estan presentes dentro de aa 261-272.
Como se discutio anteriormente, se llevaron a cabo experimentos de cristalografia de rayos X para determinar los residuos de contacto del mAb YTE LC10. La a-toxina purificada (residuos 1 a 293) y LC10 YTE Fab se concentraron por separado. Cantidades casi equimolares de estas proteinas se mezclaron y la solucion se sometio a cromatografia de filtracion en gel en la columna Sephadex S75 (GE Healthcare). El pico eluido contenia ambas moleculas de proteina unidas entre si. La concentracion y la cristalizacion adicionales produjeron cristales que se difractaron a 2.5 A.
La estructura del complejo se resolvio utilizando el metodo de reemplazo molecular. La estructura Fab determinada previamente (D25) con unas regiones eliminadas de la complementariedad eliminada se uso como una plantilla para LC10 YTE Fab. El monomero de la molecula de a-toxina derivada de un complejo heptamerico (PDB id. 7AHL) con algunos truncamientos se utilizo como plantilla para la molecula de a-toxina. La secuencia de la molecula de toxina alfa utilizada para la investigation cristalografica corresponde a la de la SEQ ID NO: 39. Se identificaron dos complejos por unidad asimetrica del complejo LC10 YTE-a-toxina usando un programa Phaser del conjunto de programas CCP4. El modelo de la estructura se refino aun mas utilizando un programa Refmac del conjunto de programas CCP4. La construction manual y las mejoras del modelo iterativo se realizaron utilizando el programa cristalografico especifico “O”.
Se encontro que tanto las cadenas pesadas como las ligeras del Fab estaban en contacto con la molecula de toxina a (Figura 22). En particular, los estudios de cristalografia determinaron residuos de contacto dentro de la molecula de toxina alfa que correspondian a lo siguiente para las cadenas pesadas y ligeras: N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200. Ademas, se determino que la cadena ligera tenia contactos con T261, T263, N264, K266 y K271. Los paratopes se identificaron como: LC-W32 (CDR1), K50 (CDR2), Y91, A92, N93, Y94, W95 (CDR3); HC-D33 (CDR1), T53, A54, D56, Y58 (CDR2), D98, Y100, P102, T103, G104, H105, Y106 (CDR3).
El modelado molecular que incorpora los datos estructurales del analisis cristalografico revelo que la mayor parte de la estructura de la toxina a se mantuvo sin cambios durante la transition del estado monomerico al estado heptamerico. Sin embargo, se demostro que una region de union critica (donde los residuos de contacto se identificaron como T261, T263, N264, K266 y K271) corresponde a una portion de la molecula de toxina a que participa en la formation de heptamero. Es esta region critica la que se pliega de forma compacta cuando la molecula de toxina a se encuentra en un estado monomerico, que se extiende como un bucle antes de la insertion en una membrana de la celula huesped (Figura 23b), y en ultima instancia forma el tallo de la estructura similar a seta despues del ensamblaje en el estado heptamerico (Figura 23a). En el estado heptamerico, esta region, como se muestra en la FIG. 24a, se predeciria que estaria protegido de la union por la molecula de anticuerpo LC10 YTE.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo se une inmunoespedficamente a un polipeptido de toxina alfa de Staphylococcus aureus e incluye:
(a) una VH CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 69;
(b) una VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 70;
(c) una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 71;
(d) una VL CDR1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1;
(e) una VL CDR2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2, y
(f) una VL CDR3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 68.
2. Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno de la reivindicacion 1 que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 57, y un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 58.
3. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno de la reivindicacion 2, en el que VH y VL corresponden a las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 57 y 58.
4. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno del mismo tiene una o mas de las caracteristicas seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) constante de afinidad (Kd) para toxina alfa de aproximadamente 13 nM o menos;
(b) se une a los monomeros de toxinas alfa, pero no inhibe la union de toxina alfa al receptor de toxina alfa;
(c) inhibe la formacion de oligomeros de toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%;
(d) reduce la actividad citolitica de la toxina alfa en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% (por ejemplo, segun lo determinado por los ensayos de lisis celular y hemolisis); y
(e) reduce la infiltracion celular y la liberacion de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, en un modelo de neumonia animal).
5. Una composition que comprende el anticuerpo o el fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde la composicion comprende un agente adicional, en donde el agente adicional es un antibiotico.
7. Un kit, que comprende
(a) un anticuerpo o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composicion de la reivindicacion 5 o 6;
(b) instrucciones para utilizar la composicion o guias para obtener instrucciones para utilizar la composicion.
8. Un anticuerpo o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composicion de la reivindicacion 5 o 6 para uso en la prevention, tratamiento o manejo de la neumonia en un sujeto.
9. Un anticuerpo o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composicion de la reivindicacion 5 o 6 para uso en la prevencion, tratamiento o manejo de una afeccion de infection de la piel en un sujeto.
10. Un anticuerpo o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composicion de la reivindicacion 5 o 6 para uso en la prevencion, tratamiento o manejo de una neumonia o una afeccion de infeccion de la piel en un sujeto segun la reivindicacion 8 o 9 inhibiendo la formacion de oligomeros de toxina alfa de Staphylococcus aureus en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%.
11. Un anticuerpo o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se une inmunoespedficamente a un fragmento de la toxina alfa de Staphylococcus aureus de la SEQ ID NO: 39.
12. Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno de la reivindicacion 11, en el que el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo se une a un fragmento que comprende los aminoacidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y/o los aminoacidos 173-201 de la SEQ ID NO: 39.
13. Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno de la reivindicacion 12, en el que el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo se une a un fragmento que comprende los aminoacidos 261-272 de la SEQ ID NO: 39 y los aminoacidos 173-201 de la SEQ ID NO: 39
14. Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo evita la formacion de heptamero toxina alfa, y en el que dicho anticuerpo o fragmento de union a antigeno esta en contacto con los residuos en posiciones T261, T263, N264, K266, K271, N177, W179, G180, P181, Y182, D183, D185, S186, W187, N188, P189, V190, Y191 y R200 de SEQ ID NO: 39.
15. La composicion de la reivindicacion 6, en la que el antibiotico es vancomicina.
16. Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para uso en la prevention, tratamiento o manejo de una afeccion de infection de la piel o neumonia en un sujeto mediante la inhibition de la formacion de oligomeros de toxina alfa.
17. Un anticuerpo aislado o fragmento de union a antigeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y 11-14 que comprende una region Fc variante en la que el anticuerpo aislado comprende las siguientes secuencias EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHDMHWVRQATGKGLEWVSGIGTAGD TYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARDRYSPTGHYYGMDVWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
y
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLUYKASSLESGVP SRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCKQYADYWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEV
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