CN107459575B - 具有抑制病原体的免疫抑制功能的单克隆抗体，其抗原结合片段，以及产生该抗体的杂交瘤 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有抑制病原体的免疫抑制功能的单克隆抗体、其抗原结合片段、以及产生该抗体的杂交瘤。单克隆抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO:1所表示的或其相似的氨基酸序列所构成的肽结合。本发明还公开了所述单克隆抗体及其抗原结合片段的用途，以及所述杂交瘤的制法。

Description

具有抑制病原体的免疫抑制功能的单克隆抗体，其抗原结合 片段，以及产生该抗体的杂交瘤

技术领域

本发明涉及一种具有抑制病原体的免疫抑制功能的单克隆抗体，其抗原结合片段，以及产生该抗体的杂交瘤，特别涉及一种关闭病原体所分泌的免疫抑制物质的作用，以提高宿主免疫能力的单克隆抗体，其抗原结合片段，以及产生该抗体的杂交瘤。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性细菌，全世界已经有一半的成年人口受到感染。由幽门螺旋杆菌引发的慢性炎症可以导致包括从消化道溃疡到胃癌的数种结果，取决所导致的胃发炎程度与范围而定。虽然宿主体内主要产生趋向Th1型的粘膜免疫反应，但因无法达到足以保护宿主免于幽门螺旋杆菌感染的程度，以致形成慢性感染，并会在部分患者身上发展成胃癌病变。先前的研究已经证明，幽门螺旋杆菌裂解物能抑制诱导有丝分裂原的T细胞增殖。显示该裂解物中存在与免疫抑制活性相关的因子。这些因子可以衰减T细胞的活性，且其作用机制与细菌毒力基因CagA及VacA无关。研究人员已经提出几种机制，用来解释幽门螺旋杆菌能够直接或间接抑制T-细胞的免疫反应的原因。包括：幽门螺旋杆菌可通过精氨酸酶抑制T细胞的增殖以及T细胞上受体的表达；幽门螺旋杆菌能刺激免疫抑制型激素TGF-β的释放；幽门螺旋杆菌会通过VacA干扰恒定链依赖抗原(invariant chain-dependent antigen)的表达；幽门螺旋杆菌会负向调控DC通过CagA磷酸化胞内蛋白的功能；或幽门螺旋杆菌能经由 VirB7和VirB11抑制巨噬细胞的吞噬功能，等等。

虽然上述各种机制都可能言之成理，但目前业界认为调节性T细胞(Treg细胞，regulatory T-cells)是抑制T细胞活性以及平衡炎症和细菌的持续感染的主要调控因素。2003年即有报导指出，CD4⁺CD25⁺T细胞与幽门螺旋杆菌诱导的免疫抑制和其寄生有关。进一步的研究表明，宿主Treg细胞是保护受幽门螺旋杆菌感染的宿主免于产生过度的胃炎症和疾病症候的主要关键，但是同时也会促进细菌寄生在胃和十二指肠黏膜上。此外，患者胃上皮细胞表达的共同刺激因子B7-H1，也会促进CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg细胞在幽门螺旋杆菌感染后的胃上皮细胞的发展。这表示，这种病原体会促进宿主Treg细胞的诱导。随后的研究则检验这些幽门螺杆菌所诱导的Treg细胞的功能。结果显示这种Treg 细胞能够抑制幽门螺杆菌特异性效应T细胞的作用，使其失能。此外，幽门螺旋杆菌引起的胃炎常会并发FoxP3⁺Treg细胞的浸润，其菌体寄生的程度与黏膜中TGF-β的表达程度相关。以上各种研究报告显示，因幽门螺旋杆菌诱导的宿主Treg反应，对于宿主的幽门螺旋杆菌免疫反应，以及对于幽门螺旋杆菌的相关疾病的致病机制，都是重要的调控因素。

幽门螺旋杆菌热休克蛋白60(H.pylori heat shock protein 60– HpHSP60)可诱导单核细胞分泌促发炎细胞激素与TGF-β1的表达。已有报导提出HpHSP60与尿素酶一起表达在细菌的细胞壁，并可作为胃幽门螺旋杆菌对胃上皮细胞的粘附分子。此外，也有研究发现，施用抗HpHSP60抗体可以干扰幽门螺旋杆菌的生长。因此，HpHSP60不仅是影响幽门螺旋杆菌生存能力的重要因素，同时也提供幽门螺旋杆菌在人胃寄生所需的凭借。然而，许多研究也显示，HpHSP60为一种免疫原，会强烈的刺激促炎症细胞激素，如TNF-α、IL-8和IL-6的产生。这些细胞激素造成感染部位发生发炎反应，且这种HpHSP60诱导的发炎反应可促进肿瘤发生恶变，包括血管增生和癌细胞移转。HpHSP60 对于胃幽门螺旋杆菌感染人类宿主也是一种重要的致病因子。

由于HpHSP60和Treg细胞之间的关系复杂，对于两者关系的研究成为此行业重要的课题。不过，过去的研究都着重于HpHSP60所诱导的发炎反应。鲜少对于HpHSP60与宿主免疫抑制间的关系加以探讨。

美国专利号6,403,099涉及一种热休克蛋白与多糖或寡糖所形成的共轭化合物。该化合物可诱导形成抗多糖抗体，可做为人类及动物使用的疫苗。其中，该热休克蛋白包括幽门螺旋杆菌热休克蛋白。

发明内容

根据本发明，某些病原体会产生抑制宿主免疫能力的功能。该功能特别是由该病原体所分泌或产生的免疫抑制物质所提供。通过关闭该免疫抑制物质的作用，即可关闭该病原体的免疫抑制功能。由于该免疫抑制功能遭到关闭，宿主自身的免疫功能即不受抑制。可通过该不受抑制的免疫功能，达成减少甚至消灭该病原体的目的。

本案发明人已发现一种新颖的单克隆抗体，对于病原体的免疫抑制功能或物质，具有显著的抑制功能。基于上述发现完成本发明的单克隆抗体、其抗原结合片段、产生该抗体的杂交瘤、以及其制造方法。

据此，本发明目的在于提供一种新颖的单克隆抗体。该单克隆抗体具有显著的抑制病原体的免疫抑制功能。

本发明的目的也在于提供所述单克隆抗体的抗原结合片段，以及产生该抗体的杂交瘤。

本发明的目的也在于提供所述单克隆抗体，其抗原结合片段，以及产生该抗体的杂交瘤的制造方法。

本发明的目的也在于提供所述单克隆抗体，其抗原结合片段，以及产生该抗体的杂交瘤的应用。

根据本发明的一个方面，所述单克隆抗体或其抗原结合片段是 SEQ ID NO:1所表示的或其相似的氨基酸序列所构成的肽结合。

本发明也提供一种能产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤。

本发明的单克隆抗体对于特定病原体的免疫抑制活性具有明显的抑制效果，能够有效利用在抑制病原体所引发的免疫抑制现象。在本发明的实施例中，该病原体的免疫抑制功能是由该病原体所分泌或产生的免疫抑制物质所提供。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段主要通过抑制病原体的免疫抑制功能，活化宿主免疫反应而清除病原体。

根据本发明的另一个方面，提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段、及杂交瘤能的制造方法，该方法包括：使用由SEQ ID NO:1所表示的或其相似的氨基酸序列所构成的肽作为抗原，使一哺乳动物对于所述抗原产生免疫反应；取得对于所述抗原免疫的哺乳动物的免疫细胞，将该免疫细胞与一哺乳动物的骨髓瘤细胞融合；从所得到的杂交瘤进行克隆，得到本发明的杂交瘤。本发明的方法还可包括：以所述杂交瘤生产本发明的抗体，以及回收所述杂交瘤所产生的抗体的步骤。

在本发明的优选实施例中，该免疫细胞宜采用脾细胞。

本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可直接使用，也可与药学上所容许的添加剂等共同作为医药组成物而使用。依据本发明的一个实例，提供一种医药组成物，该组成物含有本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。依据本发明另一种形态，该医药组成物用作免疫抑制物质的功能抑制剂。此外，本发明也提供一种本发明的单克隆抗体的应用，该应用包括用于医药组成物的制造。

附图说明

图1示出HpHSP60对PBMC增殖的影响的实验结果。

图2示出HpHSP60对PBMC中T细胞增殖的影响的实验结果。

图3示出测定HpHSP60对PBMC细胞周期的影响的实验结果。

图4示出以HpHSP60对Treg细胞进行体外诱导的实验结果。

图5示出检验HpHSP60促进Treg增殖的实验结果。

图6示出HpHSP60诱导型Treg细胞对抑制T细胞增殖的实验结果。

图7示出在活体动物中幽门螺旋杆菌因HSP60受到抑制而抑制菌体生长的实验结果。

图8也示出在活体动物中幽门螺旋杆菌因HSP60受到抑制而抑制菌体生长的实验结果。

图9示出在活体动物中因HSP60受到抑制而抑制Treg的实验结果。

图10示出HpHSP60中诱导Treg细胞的活性序列的位置的检测结果。

图11示出图10的实验结果数据化的结果。

图12示出探究抗HpHSP60抗体的免疫机制的实验结果。

图13示出抗HpHSP60抗体对Treg细胞在胃粘膜的表达的检测结果。

图14示出抗HpHSP60抗体对IL-10在胃粘膜的表达的检测结果。

图15示出检测LHP-1(9E4)抗体识别的HpHSP60片段的实验结果。

图16示出进一步检测LHP-1(9E4)抗体识别的HpHSP60片段的实验结果。

具体实施方式

虽然不意在被任何理论所拘束或限制，但根据本发明，某些病原体可以产生或分泌免疫抑制物质，以抑制宿主的免疫能力，达到使病原体增殖而造成宿主疾病的结果。此种病原体包括幽门螺旋杆菌以及其他类似的细菌，例如Arcobacter suis、Tannerellaforsythia、 Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Helicobacter felis等菌。本发明发现，热休克蛋白即为此种免疫抑制物质的一种。根据本发明的实施例，幽门螺旋杆菌热休克蛋白(HpHSP60) 能够通过与单核细胞的作用，刺激免疫抑制型激素IL-10以及TGF-β的产生，进而诱导Treg细胞的增殖，造成宿主免疫抑制现象，导致无法对抗幽门螺旋杆菌的慢性感染。

本发明进一步发展出一种提高宿主免疫能力的新方法，利用可以关闭该免疫抑制物质作用的功能抑制剂，关闭该免疫抑制物质的作用，有效抑制Treg细胞的增殖，消除免疫抑制的现象。

本案发明人发现一种新颖的单克隆抗体，对于病原体的免疫抑制功能或物质，具有显著的抑制功能。该单克隆抗体或其抗原结合片段即适合作为所述功能抑制剂。所述功能抑制剂能辨认所述免疫抑制物质或其一部份结构，并关闭(block)该免疫抑制物质的作用。

保藏

本发明的杂交瘤hybridoma 9E4原保藏日为2016年3月2日，而保藏在美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection

)(地址：美国20110维吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801)， ATCC保藏编号为PTA-122900。

单克隆抗体以及杂交瘤

本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，与由SEQ ID NO:1所表示的或其相似的氨基酸序列所构成的肽结合，能够有效抑制病原体所引发的免疫抑制现象。病原体的免疫抑制功能是由病原体所分泌或产生的免疫抑制物质所提供。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段主要通过抑制病原体的免疫抑制功能，活化宿主免疫反应而清除病原体。具有活性的单克隆抗体或其抗原结合片段对于病原体所引发的免疫抑制功能，表达显著的抑制能力，实属一种前所未见的现象。

依据本发明一个实施方式，抗体或其抗原结合片段是由对应于 SEQ ID NO:1所表示的或其相似的氨基酸序列所构成的肽。

本发明的抗体或其抗原结合片段可含有重链及/或轻链。各轻链及重链的N-末端可具有可变区域，在各可变区域中，还可交替含有4个架构区区域(framework region)(FR)与3个互补性决定区域(CDR)。

在本发明的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段的轻链可变区域可含有：由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列所构成的CDR1、由 SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列所构成的CDR2、以及由SEQ ID NO:4 所表示的氨基酸序列所构成的CDR3。在一个优选实施方式中，轻链可变区域含有SEQ ID NO:6的第21位～第131位所表示的氨基酸序列。

在本发明的一些实例中，抗体或其抗原结合片段的重链可变区域可含有：由SEQID NO:7所表示的氨基酸序列所构成的CDR1、由SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列所构成的CDR2、以及由SEQ ID NO:9所表示的氨基酸序列所构成的CDR3。在一种优选实施方式中，重链可变区域乃是含有SEQ ID NO:11的第20位～第139位所表示的氨基酸序列。

在本发明另一种优选实例中，抗体或其抗原结合片段含有轻链可变区域以及重链可变区域。其中，轻链可变区域含有：由SEQ ID NO:2 所表示的氨基酸序列所构成的CDR1、由SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列所构成的CDR2、及由SEQ ID NO:4所表示的氨基酸序列所构成的 CDR3；且重链可变区域则含有：由SEQ ID NO:7所表示的氨基酸序列所构成的CDR1、由SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列所构成的CDR2、及由SEQ ID NO:9所表示的氨基酸序列所构成的CDR3。

在上述实例中，一个更优选的实施方式为抗体或其抗原结合片段含有轻链可变区域与重链可变区域，其中，轻链可变区域含有SEQ ID NO:6的第21位～第131位所表示的氨基酸序列；且重链可变区域含有 SEQ ID NO:11的第20位～第139位所表示的氨基酸序列。

根据本发明的实例，单克隆抗体优选为嵌合体抗体、人源化抗体或完全人类型抗体。

在本发明的优选实施方式中，抗原结合片段可为Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv或scFv。其全抗体免疫球蛋白可为IgG1、IgG2、IgG4、IgA、IgE 或IgD。

本发明也提供一种杂交瘤，用以产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。在本发明的优选实例中，杂交瘤为hybridoma 9E4。

本发明的单克隆抗体、其抗原结合片段，以及杂交瘤可以如下的方法制造。使用由SEQ ID NO:1所表示的或其相似的氨基酸序列所构成的肽作为抗原，使一哺乳动物对于抗原产生免疫反应；取得对于抗原免疫的哺乳动物的浆细胞(免疫细胞)，将免疫细胞与一哺乳动物的骨髓瘤细胞融合；从所得到的杂交瘤进行克隆，得到本发明的杂交瘤。本发明的方法还可包括：以杂交瘤生产本发明的抗体，以及回收杂交瘤所产生的抗体的步骤。

其中，使哺乳动物免疫的方法可采用在本技术领域中已知的给药法。适用的方法包括：腹腔内注射、脾脏内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、口服给药、经黏膜给药、经皮给药等。其中，以腹腔内注射、脾脏内注射等为优选。抗原的给药间隔可依照抗原的给药量以及哺乳动物的种类等条件而适当决定，例如，每个月数次。

经过免疫处理的哺乳动物种类并无特别的限定。但应当考虑细胞融合所使用的骨髓瘤细胞的相容性等条件，斟酌选择。适用的哺乳动物包括小鼠、大鼠、仓鼠等。其中以小鼠为优选。

免疫细胞以脾细胞为优选，但并非任何技术限制。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合，可以利用任何已知方法。例如密尔斯坦等人(Milstein et.al.)所提出的方法(Methods Enzymol.,73,3-46,1981)，即属适用。方法主要包括：在融合促进剂的存在下，在培养基中将免疫细胞与骨髓瘤细胞混合。在细胞融合的过程中，适量添加培养基，并重复以离心方式分离，以获得杂交瘤。

适合用于细胞融合的培养基包括：RPMI-1640培养基、MEM培养基等。等培养基在细胞融合中经常使用。在融合过程还可适当添加胎牛血清等血清补充液。

通常而言，细胞融合温度优选为25～37℃，更优选为30～37℃。骨髓瘤细胞与免疫细胞的混合比率优选为1：1～1：10左右。

适用的融合促进剂可包括：聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。其中优选PEG。如使用PEG，其分子量也可适当选用，例如使用平均分子量1,000～6,000左右的PEG。再者，培养基中的PEG之浓度可为约30～ 60％(W/V)。

在上述本发明方法中，杂交瘤的筛选可包括如下步骤：将由细胞融合所得到的杂交瘤，以培养基进行培养。培养基优选为选择性培养基(selective medium)，例如HAT培养基等市售的培养基。使用极限稀释法(limiting dilution)进行筛检。筛检时可以对于例如由SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列所构成的肽的抗体价等，作为指标。以培养基进行的培养时间，须足以使目标杂交瘤以外的细胞死亡，通常为数日至数周。以上述方式所得的本发明杂交瘤可提供以现有培养基进行继代培养的能力，也可长期保存在液态氮中。

在方法中，回收本发明单克隆抗体或其抗体结合片段的步骤包括：利用已知方法培养杂交瘤；以及由其培养上清液得到单克隆抗体。另一种方法包括：将杂交瘤对杂交瘤具适应性的哺乳动物给药，使杂交瘤增殖；由哺乳动物的腹水得到单克隆抗体等步骤。其中，由培养上清液得到单克隆抗体的方法可以获得高纯度的抗体。由哺乳动物的腹水得到单克隆抗体的方法可用以大量生产抗体。本领域技术人员可以依照目的选择使用。

由以上步骤得到的单克隆抗体或其抗体结合片段可进一步纯化。纯化方法可包括任何已知的方法，例如盐析法、胶体过滤法、亲和层析等。

本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可表现显著的抑制免疫抑制功能的活性。在应用上，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可直接使用，也可与药学上所容许的添加剂一起作为医药组成物使用。本发明的医药组成物，含有有效剂量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。医药组成物的应用包括作为抑制病原体引发免疫抑制现象的功能抑制剂。本发明也提供一种本发明的单克隆抗体的应用，包括应用于医药组成物的制造。

本发明的医药组成物包括一种免疫抑制功能的功能抑制剂组成物，其制法包括将本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段溶于注射用生理盐水、注射用蒸馏水、注射用缓冲溶液等缓冲液体；以及调制组成物等步骤。本发明的免疫抑制功能的功能抑制剂组成物可包含其他添加剂。适用的添加剂包括：溶剂、溶解助剂、保存剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、无痛剂、等张化剂、缓冲剂、赋形剂、增黏剂、着色剂，以及传统的载体，例如各种核糖体、聚氨基酸载体、合成高分子化合物、天然高分子化合物等。

依据本发明还提供一种方法，用以抑制因幽门螺旋杆菌或其他类似的细菌等致病源所分泌的热休克蛋白60所引发的免疫抑制现象。经由对活体宿主给药本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段后，可抑制致病源的热休克蛋白60所引发的免疫抑制现象，通过活化宿主本身的免疫系统，达到清除致病源的功效。

在方法中，可对宿主的全身或局部给药本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。给药方法包括任何已知方法，例如点滴、静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、口服给药、经黏膜给药、经皮给药等。

本发明的单克隆抗体或抗原结合片段的有效量并无任何技术上的限制，本领域技术人员可因宿主的种类、性质、性别、年龄等适当决定。

以下将以实例并参考图式，说明本发明具有抑制病原体的免疫抑制功能的单克隆抗体、其抗原结合片段、以及产生抗体的杂交瘤。但须理解，本发明的范围并不限于实施例所记载的范围。例如，实施例虽然以幽门螺旋杆菌的致病机制及幽门螺旋杆菌热休克蛋白60 (HpHSP60)的功能抑制剂作为实例，但例如Helicobacter felis菌(可导致人类慢性肠炎)与Arcobactersuis菌(可导致人类牙周病)的热休克蛋白氨基酸序列中，也含有与HpHSP60相同的片段，例如HSP 60 101-200。本发明的方法及用途均可应用于此类以及其他致病的细菌，以及其他具相同致病机制的病原体。

实施例1：细胞培养，PBMC与T-细胞的分离

由健康供体所提供的人类外周血单核细胞(PBMC)使用 Ficoll-Paque Plus(商标，瑞典Uppsala的GE Healthcare公司生产)以密度梯度离心法分离，再悬浮于含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的 RPMI-1640培养液中。为进行单核细胞的移除，将PBMC在10-cm的培养皿中培养，在10⁶/mL的密度下过夜，使单核细胞附着。而悬浮的细胞在1500rpm下离心15分钟后收集。从PBMC获得的全部T细胞使用磁力分选装置(MiltenyiBiotec公司，美国麻州)，进行负向筛选分离。简言之，即将PBMC以非T细胞抗体混合物(此抗体混合物皆标记有生物素)共同培养，接着以再与含抗生物素抗体的微磁珠反应，再利用磁座将非T细胞-生物素-抗生物素-磁珠复合物吸附，T细胞则经由制造商的冲堤液冲堤后收集而得。

实施例2：HpHSP60对PBMC增殖的影响

以细胞增殖测定法检测，将以CD3 mAb活化的PBMC，加入不同剂量的HpHSP60、rGFP及煮沸后的HpHSP60，分析其细胞增殖情形。将各组细胞取0.2毫升，以1×10⁶细胞/ml的浓度接种在预处理有抗CD3 单克隆抗体的96孔微量培养盘的各孔中。在96小时后以MTT分析法测定细胞的增殖。图1显示实验结果。图中显示的数值为增殖指数。细胞增殖指数的计算方法如下：

增殖指数(100％)＝(经抗-CD3+HpHSP60处理的细胞的OD₅₉₅值)/(经抗CD3-处理的细胞的OD₅₉₅值)×100％。与未经加入HpHSP60 的对照组比较，如有显著差异，则以*表示(P<0.05)(n＝15)。

图1显示，(◆)为HpHSP60加入至人外周血单核细胞(PBMC)后， T细胞增殖现象受到抑制。(■)rGFP为实验系统对照组蛋白，对T细胞增殖现象没有影响。由对照组可知，并非任何蛋白都可抑制T细胞增殖。 (▲)Boiled HpHSP60表示只有HpHSP60序列经煮沸丧失蛋白质的结构，使蛋白质变性失活。实验结果显示煮沸后的HpHSP60序列不会影响T细胞增殖。

实施例3：HpHSP60对PBMC中T细胞增殖的影响

经抗CD3单克隆抗体处理，含T-细胞或无T细胞的PBMC，加入或不加入HpHSP60(200ng)，以CD3表面标记染色鉴定后，计算细胞数量。进行CD3表面标记染色时，将收集的细胞以CD3单克隆抗体(OKT3) 染色。其次再以IgG FITC荧光二级抗体(Biolegend公司，美国加州) 染色。为进行FoxP3的细胞内染色，将细胞收集后，以CD4 FITC荧光单克隆抗体(Biolegend公司，美国加州)染色。将处理后的细胞固定和细胞膜打洞。随后用FoxP3-PE单克隆抗体(BD Biosciences公司，美国麻州)根据制造商的规定做细胞内染色。之后进行细胞周期分析：在 72小时后将细胞用70％的乙醇固定。再以DNA染色缓冲液(含5％的Triton-X 100，0.1毫克/毫升的RNase A和4微克/毫升的PI)染色，在室温下进行30分钟，之后检测DNA含量的变化。使用FACS流式细胞仪 (Becton Dickinson公司，德国海德堡)和CELLQUESTPro程序(Becton Dickinson公司，德国海德堡)进行荧光分析。

实验结果在图2示出。图2中如下计算增殖指数：增殖指数(倍数) ＝(经抗CD3/HpHSP60处理组中的T细胞或非T细胞数量)/(在未处理的对照组中的T细胞或非T细胞数量)。如有显著差异，则以*表示(P <0.05)，(N＝4)。实验结果证明HpHSP60可抑制PBMC中T细胞的增殖。图中，(□)显示PBMC中T细胞的部分；(■)显示PBMC中非T细胞的部分。由结果得知HpHSP60是针对T细胞作抑制。

实施例4：测定HpHSP60对细胞周期的影响

取PBMC细胞，以PBMC细胞本身、经过CD3活化的PBMC细胞以及经Anti-CD3+HpHSP60处理的PBMC，观察其subG1，G1，S和G2/M 期的百分比，结果在图3的直方图中示出。图中显示三次重复实验的结果。

图3显示，HpHSP60可抑制T细胞的增殖，而非造成T细胞死亡。图中，图3A的Cellalone示出一般T细胞未经CD3活化会处在休眠期 (G0/G1)。图3B的Anti-CD3示出经过CD3活化后，T细胞开始活化生长，而形成典型细胞周期图形。图3C的Anti-CD3+HpHSP60则示出与图3B 比较，并无变化，且在Sub G0/G1期(代表细胞死亡的DNA片段)的比例与Anti-CD3组相比没有增加。实验结果显示HpHSP60的作用是抑制T细胞的生长，而不是造成T细胞死亡。

实施例5：以HpHSP60对Treg细胞作体外诱导的结果

对在经HpHSP60处理的PBMC细胞中，CD4⁺FoxP3⁺细胞的比例，随时间推移量作测量。与仅以抗CD3处理的对照组比较，如有显著差异，则以*表示(P<0.05)(n＝5)。结果显示于图4。

由于CD4和FoxP3是Treg细胞的标记，所以从图4即可直接辨认 HpHSP60对Treg细胞生长的影响。图中，(●)cell alone表示Treg细胞原始生长现象。(■)anti-CD3表示以CD3活化后Treg细胞生长现象。

Anti-CD3⁺HpHSP60则表示Treg细胞大幅增殖。实验结果证明HpHSP60 可促进Treg细胞的增殖。

实施例6：HpHSP60促进Treg细胞增殖

承接实施例5，在72小时后收集细胞后，作总RNA分离。使用实时 PCR测定FoxP3mRNA表达量。与以抗CD3抗体处理的对照组比较，如有显著差异，则以*表示(P<0.05)，(n＝4)。结果显示于图5。

由于FoxP3是Treg细胞的标记，所以Treg细胞被活化时，FoxP3表达量也会增加。图中显示，由分析mRNA结果发现加入HpHSP60后 FoxP3的表达量明显增加，进一步证明加入HpHSP60会促进Treg增殖。

实施例7：HpHSP60诱导型Treg细胞对抑制T细胞增殖的影响

以功能性检测法测量HpHSP60诱导的Treg细胞对T细胞增殖的影响。所得结果在图6的直方图示出。图中的数字表示增殖性细胞的百分比。图代表三次重复的结果。

实验结果显示，当Treg细胞增加，相对会抑制T细胞活化。证明 PBMC加入HpHSP60后，由于Treg细胞增殖，抑制了T细胞的活化。

实施例8：抗HpHSP60血清(anti-HpHSP60 serum)与HpHSP60单克隆抗体的制备

将幽门螺旋杆菌热休克蛋白60(HpHSP60)打入小鼠体内，使其发生免疫反应(immunization)。经过多次施打HpHSP60后(boost)，小鼠体内产生抗HpHSP60的抗体。将小鼠的血液收集后，取其血清，得到含有抗HpHSP60抗体的血清，称为抗HpHSP60血清(anti-HpHSP60 serum)。此步骤取得的抗体为多克隆抗体(polyclonal antibody)。

将小鼠的脾脏细胞与骨髓癌细胞融合形成杂交瘤(hybridoma)。进一步筛选，利用酵素免疫分析法(ELISA)挑出专一性抗体。

将所得的细胞株稀释，重新平分到96槽细胞培养盘中，计算使得每槽中只含有一个细胞，使其生长成群落后，再次以ELISA筛选专一性抗体。得到单克隆的抗体。

接着分析抗体变异区的蛋白质序列。结果得知其轻链变异区的序列如SEQ ID NO:2～6的氨基酸序列，其重链的变异区的序列如SEQ ID NO:7～11的氨基酸序列。

实施例9：幽门螺旋杆菌因HSP60受到体内抑制而抑制菌体生长的效果

从中国 台湾台北的实验动物繁育研究中心购买C3H/HeN小鼠，并保持在无病原体隔离下。使用前所有食物、水和笼架用品都进行消毒。 5周龄雄性小鼠在接种幽门螺旋杆菌前，先以静脉注射0.1毫升由实施例 8得到的抗HSP60血清(anti-HpHSP60 serum)。在施打抗血清24小时后，使小鼠感染0.5mL的活幽门螺杆菌(ATCC编号为15,415的菌株，约109 菌落形成单位)。以BHI液体培养基经由口服管喂法，在3天的期间内喂食两次。在确认感染幽门螺旋杆菌后，将小鼠静脉注射0.1ml由实施例8得到的抗HSP60血清，每3天一次。

在感染幽门螺旋杆菌第8周后，所有的小鼠在无菌条件下牺牲。将完整的胃沿小弯切开。每个胃分割成两个相等的纵向样品，每个样品都含有胃体和胃窦。再将胃组织磨碎后培养胃组织中的幽门螺旋杆菌，另外以免疫组织化学染色分析FoxP3的表达，以评估幽门螺旋杆菌在胃中寄生的状态。评估结果以平均值±SEM表示。使用单尾Student’s t-test 方法评量统计学显著性。P<0.05即视为有显著差异。结果示出于图7、图8、图9。

图7和图8显示，抗HpHSP60血清显著降低在小鼠接种幽门螺旋杆菌第8周后从其胃组织裂解液得到的幽门螺杆菌的菌落数。为研究抗体减少幽门螺旋杆菌在胃部寄生的机制，对Treg细胞在受幽门螺杆菌感染的胃组织中的表达量进行评估。图9显示，抗HpHSP60血清的处理，显著降低Treg细胞在胃粘膜的表达量。上述结果表明，幽门螺旋杆菌慢性感染与HpHSP60具有相关性，且抑制HpHSP60可减少幽门螺旋杆菌的寄生量，同时也减少Treg细胞的产生。

实施例10：HpHSP60中诱导Treg细胞的活性序列的位置

为找出HpHSP60中诱导调控型T细胞的活性序列的位置，准备抗 HpHSP60的单克隆抗体，包括含HpHSP60全序列以及其片段的单克隆抗体。依照实施例9的方法，先将小鼠在以抗HpHSP60血清处理24小时后，喂食幽门螺旋杆菌并确认感染幽门螺旋杆菌后，将小鼠静脉注射 0.1ml，每3天一次分别施打PBS、血清、抗HSP60血清、LHP-1(9E4) 单克隆抗体及LHP-2(5A8)单克隆抗体。于8周后牺牲小鼠，将小鼠胃壁磨碎后，在胃幽门螺旋杆菌分离培养基(EYE agar)上再培养胃匀浆，以确认胃中的幽门螺旋杆菌寄生。结果显示于图10。

图10中的红色点为幽门螺旋杆菌菌落，显示抗HSP60血清虽有抑制幽门螺旋杆菌生长的效果，但LHP-1(9E4)抗体则能有效完全消灭幽门螺旋杆菌。

计算胃幽门螺旋杆菌分离培养基平板中的有色菌落数，测定幽门螺旋杆菌菌落数(CFU)。如有显著差异，则以*表示(P<0.05)。结果显示于图11。图11显示经施以LHP-1(9E4)抗体后，可以完全消灭幽门螺旋杆菌。

实施例11：抗HpHSP60抗体的免疫机制

为了解抗HpHSP60抗体的免疫机制，对于实施例10的小鼠，在接种幽门螺旋杆菌后第2、3、8周，分别测定其幽门螺旋杆菌的尿素酶活性，以测定幽门螺旋杆菌分泌酵素UreaseB的活性。尿素酶活性以对照组小鼠(未经幽门螺旋杆菌感染)的尿素酶活性作标准化。结果显示于图12。图显示，LHP-1(9E4)抗体是通过抑制HpHSP60而达成抑制幽门螺旋杆菌生长，甚至消灭幽门螺旋杆菌的效果。

LHP-1(9E4)抗体是以位于HpHSP60 101-200的氨基酸序列作为抗原。含抗体的杂交瘤hybridoma 9E4原保藏日为2016年3月2日，保藏在美国模式培养物集存库

ATCC保藏编号为PTA-122900

实施例12：抗HpHSP60抗体对Treg细胞在胃粘膜的表达的评估

为明了抗HpHSP60抗体对Treg细胞在胃粘膜的表达的评估结果。将实施例10的小鼠胃以10％福尔马林固定，经石蜡包埋。将组织切片以H&E染色，随后对FoxP3作免疫组织化学染色。结果显示于图13(原物200μm，放大倍数100倍)。图中显示在第8周牺牲的小鼠胃壁切片中 Treg细胞的表达量。显示经LHP-1(9E4)处理的小鼠胃黏膜找不到Treg 表达。

实施例13：抗HpHSP60抗体对IL-10在胃粘膜的表达的评估

将实施例10的小鼠胃以10％福尔马林固定，经石蜡包埋。将组织切片以H&E染色，随后对IL-10作免疫组织化学染色。结果显示于图13 (原物200μm，放大倍数100倍)。图中显示在第8周牺牲的小鼠胃壁切片中IL-10细胞的表达量。显示经LHP-1(9E4)处理的小鼠胃黏膜找不到IL-10表达。

实施例14：LHP-1(9E4)抗体识别的HpHSP60片段

为明了8LHP-1(9E4)抗体识别的HpHSP60片段，以8LHP-1(9E4) 抗体识别不同片段的HpHSP60。结果显示在图14。图中黑点部分代表 LHP-1抗体识别到HpHSP60的片段。所识别的片段包括以下，并以IgK 作为本实验的阳性对照组，因大部分作出小鼠的单克隆抗体为kappa种类：

Whole-HpHSP60 1-547全长。

1-200-HpHSP60 1-200片段

101-200-HpHSP60 101-200片段

1-250-HpHSP60 1-250片段

200-300-HpHSP60 200-300片段

300-547-HpHSP60 300-547片段

由结果得知，LHP-1抗体识别到HpHSP60的片段为101-200。片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

实施例15：LHP-1(9E4)抗体识别的HpHSP60片段进一步限定

以实施例14的方法，将LHP-1(9E3)抗体识别的序列缩小至31个氨基酸序列。结果显示于图15。图中，黑点部分代表LHP-1(9E3)抗体识别到HpHSP60的片段。图中显示，[1]为HpHSP60 134-200片段。观察到黑点，为识别。而[5]为HpHSP60 101-168片段，未观察到黑点，为不识别。此实验可以推论，LHP-1(9E3)抗体识别HpHSP60的序列为170-200 片段。片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

生物材料保藏

美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection

)(地址：美国20110维吉尼亚州马纳萨斯市大学大道10801)， 2016年3月2日，ATCC保藏编号为PTA-122900。

Claims (6)

1.一种可与由SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列所构成的肽结合的单克隆抗体，其轻链可变区域含有SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列所构成的CDR1、SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列所构成的CDR2、以及SEQ ID NO:4所表示氨基酸序列所构成的CDR3，其重链可变区域含有SEQ ID NO:7所表示的氨基酸序列所构成的CDR1、SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列所构成的CDR2、及SEQ ID NO:9所表示的氨基酸序列所构成的CDR3。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其轻链可变区域含有SEQ ID NO:6的第21位～第131位所表示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其重链可变区域含有SEQ ID NO:11的第20位～第139位所表示的氨基酸序列。

4.一种将如权利要求1至3中的任一项所述的单克隆抗体应用于制备抑制幽门螺旋杆菌抑制宿主免疫力功能的药物的用途。

5.如权利要求1至3中的任一项所述的单克隆抗体，其由保藏号为PTA-122900的杂交瘤产生。

6.ATCC保藏号为PTA-122900的杂交瘤。

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