KR20160098358A - 스타필로코커스 아우레우스의 LukGH (LukAB) 독소에 대해 지시된 항체 및 항체 서열 - Google Patents
스타필로코커스 아우레우스의 LukGH (LukAB) 독소에 대해 지시된 항체 및 항체 서열 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 LukGH 복합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 항체를 제공하고, 상기 항체는 적어도 표 1에 열거된 바와 같은 임의의 CDR1 내지 CDR3 서열, 또는 이의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
Description
본 발명은 특정 아미노산 서열을 특징으로 하는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 세포독소 LukGH (LukAB로도 불림)에 대한 항체에 관한 것이다.
스타필로코커스 아우레우스 (에스 . 아우레우스)는 무증상 집락화 및 경미한 피부 감염부터 중증 심부 조직 감염, 폐렴, 혈류 감염 및 패혈증에 이르는 인간에서 광범위한 감염을 초래할 수 있는 가장 중요한 인간 병원체 중 하나이다. 이 병원체는 질환을 유발하고 숙주 방어를 교란하기 위해 다중 독성 기전을 사용한다. 이의 가장 강력한 독성 인자 중 하나가 혈액 세포, 특히 포식세포를 사멸하는데 특별히 특화된 류코시딘 (leukocidin)이다. LukGH (LukAB로도 불림)는 다형핵 세포 (PMN), 단핵구 및 수지상 세포를 용해할 수 있고 [Dumont et al. Mol Microbiol. 2011 Feb; 79(3): 814-25; Ventura et al. PLoS One. 2010 Jul 16; 5(7): e11634] 또한 전-염증성 사이토카인을 생산하도록 이들을 활성화시킬 수 있는 가장 최근에 동정된 류코시딘이다.
LukGH는 HlgAB, HlgCB, LukED 및 LukSF (PVL)와 유사하게, 이성분 세포용해소 (bi-component cytolysin)이다. LukH (S-성분) 및 LukG (F-성분)는 각각 상기에 언급된 이성분 류코시딘의 S 및 F 성분과 대략 30% 및 40% 아미노산 상동성을 나타낸다.
LukGH는 가장 가변적인 이성분 에스. 아우레우스 독소이다. LukSF, LukED 및 HlgABC가 다양한 에스 . 아우레우스 균주에서 고도로 보존적인 반면, LukGH는 최대 14% 아미노산 변화를 나타낸다. 이러한 아미노산 차이의 수준은 2개의 상이한 독소, 예컨대 HlgC 대 LukS 또는 LukS 대 HlgAC 또는 LukE 사이에서 관찰되는 수준 (~16% 차이)에 거의 이른다. LukGH의 기능에 대한 데이터는 거의 없으며 이들은 서로 거의 동일한 뉴만 (Newman) 및 LAC (USA300) 균주로부터의 2개 서열을 이용해 생성된다. 다른 변형체, 특히 USA300 및 다른 에스 . 아우레우스 클론 복합체와 가장 상이한 것으로 간주되는 2개의 에스 . 아우레우스 게놈, MRSA252 (EMRSA16) 및 MSHR1132 ("실버" 에스 . 아우레우스)로부터 유래된 2개의 서열이 인간 세포에 활성인지 여부는 알려져 있지 않다.
에스 . 아우레우스 배양물 상청액의 PMN 용해 활성에 근거하여, LukGH는 인간 자연 세포에 대해 가장 강력한 류코탁신 중 하나인 것으로 보인다 [Dumont et al. Infect Immun. 2013 May; 81(5): 1830-41; Malachowa et al. J Infect Dis. 2012 Oct; 206(8): 1185-93]. 따라서, 항체 중화에 의해 LukGH의 독소 기능을 억제하는 것은 에스 . 아우레우스 질환 중에 긍정적인 효과를 미치고 감염 부위로의 포식 세포 이동을 감소시킴으로써 숙주 방어를 지원하는 것은 타당할 수 있다. LukGH 독소를 중화하는 단일클론 항체로 인간 에스 . 아우레우스 감염을 예방하고 치료하기 위한 인간 치료제를 개발하는 것이 본 발명의 목적이다.
문헌에 의하면, 이성분 류코시딘의 S 성분은 세포 표면 수용체를 인식하고, 이 상호작용은 F-성분의 결합 및 LukSF 및 HlgAB에 대해 기술된 팔합체 막 관통 (octameric membrane spanning) 기공 구조의 형성을 초래하는 입체형태적 변화를 유도한다 [Colin, Infect Immun, 1994: 3184; Meunier, Biochim Biophys Acta, 1997: 275].
에스 . 아우레우스 세포독소 LukGH (LukAB로도 불림)에 지시되는 항체로서 이 독소의 상이한 변이체들 사이에서 교차-반응성인 항체를 제공하고 교차 중화능을 제공하는 항체를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 구체적으로, 본 목적은 시험관 내에서 LukGH에 대해 높은 중화능을 갖고 개별적인 LukG 또는 LukH 항원에는 특이적으로 결합하지만, LukGH 복합체에는 낮은 수준으로 결합하는 항체에 비해 향상된 보호를 갖는 항체를 언급한다.
본 목적은 본 발명의 청구대상에 의해 해결된다.
본 발명에 따르면, LukGH 복합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 항체가 제공되는데, 이 항체는 적어도 표 1에 열거된 바와 같은 CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 서열, 또는 이의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
구체적으로, 항체는 단일클론 항체이다.
구체적으로, 항체는 하기의 그룹 멤버 i) 내지 viii)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 4의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 6의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
ii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 26, 서열번호: 36, 또는 서열번호: 38의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 28, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 또는 서열번호: 40의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 26, 서열번호: 36, 또는 서열번호: 38의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 28, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 또는 서열번호: 40의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 30의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
iii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 47, 서열번호: 55, 서열번호: 57, 서열번호: 59, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 또는 서열번호: 64의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 49, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 65, 또는 서열번호: 66의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 47, 서열번호: 55, 서열번호: 57, 서열번호: 59, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 또는 서열번호: 64의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 49, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 65, 또는 서열번호: 66의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 51의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
iv)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 71, 서열번호: 77, 서열번호: 79, 서열번호: 81, 서열번호: 83, 또는 서열번호: 85의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 72, 서열번호: 78, 서열번호: 84, 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 73의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 71, 서열번호: 77, 서열번호: 79, 서열번호: 81, 서열번호: 83, 또는 서열번호: 85의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 72, 서열번호: 78, 서열번호: 84, 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 73의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
v)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 87, 서열번호: 97, 서열번호: 99, 또는 서열번호: 101의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 88, 서열번호: 98, 서열번호: 100, 또는 서열번호: 102의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 87, 서열번호: 97, 서열번호: 99, 또는 서열번호: 101의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 88, 서열번호: 98, 서열번호: 100, 또는 서열번호: 102의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 89의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
vi)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 104, 서열번호: 110, 서열번호: 112, 서열번호: 38, 서열번호: 114, 서열번호: 119, 또는 서열번호: 120의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR 1; 및
b) 서열번호: 105, 서열번호: 109, 서열번호: 111, 서열번호: 113, 서열번호: 102, 서열번호: 115, 또는 서열번호: 121의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 106의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 104, 서열번호: 110, 서열번호: 112, 서열번호: 38, 서열번호: 114, 서열번호: 119, 또는 서열번호: 120의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 105, 서열번호: 109, 서열번호: 111, 서열번호: 113, 서열번호: 102, 서열번호: 115, 또는 서열번호: 121의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 106의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
vii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 125의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 126의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 127의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 125의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 126의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 127의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
및
viii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 134의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 135의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 137의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 134의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR1; 및/또는
b) 서열번호: 135의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR2; 및/또는
c) 서열번호: 137의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
여기서, 기능적 활성 CDR 변형체 [특히, 상기 그룹 멤버 i) 내지 viii)의 하나에서 특정되는 바와 같음] 중 임의의 것은 모체 CDR 서열 내에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고, 모체 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
구체적으로, 항체는 그룹 멤버 iv) (상기 참조)의 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체이고, 여기서
a) VH CDR1의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, F, H, I, K, L, M, R, V, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 E, F, M, W 또는 Y 중의 것이고/이거나;
b) VH CDR2의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, H, L, S, T, V 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, H 또는 Y 중의 것이고/이거나;
c) VH CDR2의 위치 3에서, 아미노산 잔기는 Y, H, T 및 W로부터 선택되고/되거나;
d) VH CDR2의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 S, A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 N, R 또는 W이고, 더욱 우선적으로는 N 또는 W이고/이거나;
e) VH CDR2의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, D, F, H, K, L, M, N, R 및 W로부터 선택되고/되거나;
f) VH CDR2의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, D, E, F, N, S 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고, 더욱 우선적으로는 H이고/이거나;
g) VH CDR3의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 R, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고/이거나;
h) VH CDR3의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 G, A, F 및 Y로부터 선택되고/되거나;
i) VH CDR3의 위치 6에서, 아미노산 잔기는 M, E, F, H 및 Q로부터 선택되고, 우선적으로는 F 또는 H이고/이거나;
j) VH CDR3의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 H, A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, K, Q, R, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 W 또는 Y이다.
구체적으로, 기능적 활성 CDR 변형체는 하기의 적어도 하나를 포함한다:
a) 모체 CDR 서열 내 1, 2, 또는 3개 점 돌연변이; 또는
b) 모체 CDR 서열의 임의의 4개 C- 말단 또는 4개 N-말단, 또는 4개 중심 아미노산 위치 내에서 1 또는 2개 점 돌연변이.
구체적으로, 기능적 활성 변형체 항체는 본 발명의 기능적 활성 CDR 변형체의 적어도 하나를 포함한다.
구체적으로, 기능적 활성 변형체는 모체 항체, 예컨대 도 1 (표 1) 또는 도 2에 열거된 바와 같은 항체 중 임의의 항체와, 예컨대, 모체 CDR로부터 유래된 CDR 변형체를 수득하기 위한, 아미노산 서열 내, 바람직하게는 CDR 내 적어도 하나의 점 돌연변이에서 상이하고, 여기서 각각의 CDR 아미노산 서열 내 점 돌연변이의 개수는 0, 1, 2 또는 3개 중 하나이다.
구체적으로, 항체는 각각의 CDR 서열, 또는 예컨대 하나의 CDR 루프 내, 예컨대 5-18개 아미노산의 CDR 길이 내, 예컨대 5-15개 아미노산 또는 5-10개 아미노산의 CDR 영역 내 1, 2 또는 3개 점 돌연변이를 갖는, 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는 CDR 변형체를 이용하여, 이러한 항체로부터 유래된다. 대안적으로, 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는 항체를 제공하기 위해, 하나의 CDR 루프 내, 예컨대 5개 아미노산 미만의 CDR 길이 내에 1 내지 2개 점 돌연변이가 존재할 수 있다. 특정 CDR 서열, 예컨대 CDR2 또는 CDR5 서열은 짧을 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 기능적 활성 CDR 변형체는 4 또는 5개 아미노산 미만으로 이루어진 CDR 서열 중 임의의 서열 내 1 또는 2개 점 돌연변이를 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 항체는 CDR 및 골격 서열을 포함하는데, CDR 및 골격 서열의 적어도 하나는 인간, 인간화된, 키메라, 뮤린 또는 친화도 성숙 서열을 포함하고, 바람직하게는 골격 서열은 IgG 항체, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형, 또는 IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체의 것이다.
예컨대 모체 항체의 제조성 또는 내구성을 개선하고, 예컨대 모체 항체에 비해 임의의 CDR 서열 및/또는 골격 서열 내 돌연변이를 갖는 인간화된 항체와 같이, 낮은 면역원성 잠재력을 갖는 개선된 (변이된) 항체를 제공하기 위해, 골격 변이된 항체로서 특정 항체가 제공된다.
예컨대, 항체의 친화도를 개선하고/하거나 모체 항체에 의해 표적되는 에피토프 근처의 동일한 에피토프 또는 에피토프들을 표적 (에피토프 쉬프트)하기 위해, CDR 변이된 항체로서 추가의 특정 항체가 제공된다.
따라서, 도 1 또는 도 2에 열거된 바와 같은 항체 중 임의의 항체가 개선된 변형을 조작하기 위한 모체 항체로 사용될 수 있다.
구체적으로, 기능적 활성 변형체 항체는 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는다.
특정 측면에 따르면, 적어도 하나의 점 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 임의의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이다.
구체적으로, 기능적 활성 변형체 항체는 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는다.
특정 측면에 따르면, 적어도 하나의 점 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 임의의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이다.
구체적으로, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 38의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 39의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 30의 CDR3 서열;
b) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 47의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 49의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 51의 CDR3 서열;
c) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 83의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 84의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 73의 CDR3 서열;
d) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 104의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 105의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열;
및
e) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 114의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 115의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열.
구체적으로, 항체는 하기를 포함한다:
a) 도 2에 도시된 바와 같은 VH 서열 중 임의의 서열로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
b) 서열번호: 147, 서열번호: 149, 서열번호: 151, 서열번호: 153, 서열번호: 155, 서열번호: 157, 서열번호: 159, 서열번호: 161, 서열번호: 163, 서열번호: 165, 서열번호: 167, 서열번호: 169, 및 서열번호: 171로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중쇄 (HC) 아미노산 서열;
c) 서열번호: 147, 서열번호: 149, 서열번호: 151, 서열번호: 153, 서열번호: 155, 서열번호: 157, 서열번호: 159, 서열번호: 161, 서열번호: 163, 서열번호: 165, 서열번호: 167, 서열번호: 169, 및 서열번호: 171로 이루어진 군으로부터 선택되고, VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우에는 C-말단 아미노산의 결실 및/또는 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는, 항체 중쇄 (HC) 아미노산 서열.
특정 항체는 각각의 신호 서열을 갖거나 갖지 않는, 또는 대안적인 신호 또는 리더 서열을 갖는 그러한 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 이해된다.
특정 측면에 따르면, 각각의 HC 서열은 불변 영역 내에서 말단적으로 연장되거나 결실될 수 있고, 예컨대 C-말단 아미노산의 하나 이상의 결실일 수 있다
구체적으로, C-말단 라이신 잔기를 포함하는 각각의 HC 서열은 바람직하게는 이러한 C-말단 라이신 잔기의 결실이 이용된다.
특정 실시양태에 따르면, 항체는 항체 경쇄 가변 영역 (VL)의 적어도 3개의 상보성 결정 영역 (CDR4 내지 CDR6)을 추가로 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 항체는 표 1에 열거된 바와 같은 임의의 CDR4 내지 CDR6 서열, 또는 이의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 경쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함한다.
구체적으로, 항체는 표 1에 열거된 바와 같은 적어도 CDR4 서열, 또는 적어도 CDR4 및 CDR5 서열, 또는 적어도 CDR4, CDR5, 및 CDR6 서열을 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 항체는 표 1에 열거된 바와 같은 CDR 조합을 포함한다. 특정 측면에 따르면, 본 발명의 항체는, 특히 항체가 여전히 기능적으로 활성이라면, 표 1에 열거된 바와 같은 CDR 조합을 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 항체는 표 1에 열거된 바와 같은 임의의 항체의 CDR1-6을 포함한다. 그러나, 대안적인 실시양태에 따르면, 항체는 상이한 CDR 조합을 포함할 수 있는데, 예컨대 표 1에 열거된 바와 같은 항체는 한 항체의 적어도 하나의 CDR 서열, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR 서열 및 표 1에 열거된 바와 같은 임의의 항체들 중의 상이한 항체의 적어도 하나의 추가 CDR 서열을 포함한다. 특정 예시에 따르면, 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR 서열을 포함하는데, 여기서 CDR 서열은 1개 초과의 항체, 예컨대 2, 3, 4, 5, 또는 6개 상이한 항체의 CDR 조합이다. 예를 들어, CDR 서열은 바람직하게는 표 1에 열거된 바와 같은 임의의 항체의 1, 2, 또는 3개 모두의 CDR1-3, 및 표 1에 열거된 같거나 임의의 다른 항체의 1, 2, 또는 3개 모두의 CDR4-6을 포함하도록 조합될 수 있다.
CDR1, 2, 및 3으로 번호 매겨진 CDR은 VH 도메인의 결합 영역을 나타내고, CDR4, 5, 및 6은 VL 도메인의 결합 영역을 나타내는 것으로 본 명세서에서 구체적으로 이해된다.
예를 들어, CDR 서열은 바람직하게는, 표 1에 열거된 바와 같은 임의의 항체, 예컨대 #AB-29, #AB-30, #AB-31, #AB-32, #AB-33, #AB-34, #AB-35, 또는 #AB-36으로 명명된 항체 중 임의의 항체, 또는 #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체 중 임의의 항체, 적어도 CDR1-3, 및/또는 표 1에 열거된 바와 같은 항체 중 임의의 항체, 예컨대 #AB-29, #AB-30, #AB-31, #AB-32, #AB-33, #AB-34, #AB-35, 또는 #AB-36으로 명명된 항체 중 임의의 항체, 또는 #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체 중 임의의 항체의 적어도 CDR4-6을 포함하도록 조합될 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 표 1에 열거된 바와 같은 항체 중 임의의 항체, 예컨대 #AB-29, #AB-30, #AB-31, #AB-32, #AB-33, #AB-34, #AB-35, 또는 #AB-36으로 명명된 항체 중 임의의 항체, 또는 #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체 중 임의의 항체의 CDR1-6을 포함한다. 그러나, 추가의 특정 측면에 따르면, 항체는 상이한 CDR 조합을 포함할 수 있는데, 예컨대 표 1에 열거된 바와 같은 항체, 예컨대 #AB-29, #AB-30, #AB-31, #AB-32, #AB-33, #AB-34, #AB-35, 또는 #AB-36으로 명명된 항체 중 임의의 항체, 또는 #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체 중 임의의 항체는 상이한 항체, 예컨대 표 1에 열거된 바와 같은 항체 중 임의의 상이한 항체, 예컨대 #AB-29, #AB-30, #AB-31, #AB-32, #AB-33, #AB-34, #AB-35, 또는 #AB-36으로 명명된 임의의 항체들 중의 임의의 상이한 항체, 또는 #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 임의의 항체의 임의의 상이한 항체의 적어도 하나의 CDR 서열, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR 서열을 포함하고, 여기서 CDR 서열은 1개 초과의 항체, 예컨대 2, 3, 4, 5, 또는 6개 상이한 항체의 CDR 조합이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 항체는 도 1 또는 도 2에 도시된 바와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열 중 임의의 서열의 조합, 또는 HC 및 LC 아미노산 서열의 이러한 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함한다. 대안적으로, 만약 항체가 여전히 기능적으로 활성이라면, 상이한 2개 항체의 면역글로불린 쇄의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 항체의 HC 서열이 또 다른 항체의 LC 서열과 조합될 수 있다. 추가의 특정 실시양태에 따르면, 도 1 또는 도 2에 제공된 바와 같은 골격 영역 중 임의의 영역이 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 CDR 서열 및/또는 VH/VL 조합에 대한 골격으로 사용될 수 있다.
도 1은 각 그룹 내 CDR 중 임의의 것에서 유사성을 갖는 상이한 HC 및/또는 LC 서열을 특징으로 하는 8개 그룹의 항체를 나타내고, HC 및 LC 중 임의의 것의 조합, 특히 동일한 그룹의 HC 및 LC의 조합을 지지한다. 특정 측면에 따르면, 하나의 HC의 CDR1-3의 하나, 예컨대 CDR1은 두 번째 및 선택적으로 세 번째 HC의 임의의 다른 CDR 서열, 예컨대 각각 두 번째 및 세 번째 HC의 CDR2 및 CDR3과 조합되는데, 여기서 특히 CDR1-3 서열의 조합은 동일한 그룹 내이다. 특정 측면에 따르면, 하나의 LC의 CDR4-6의 하나, 예컨대 CDR4는 두 번째 및 선택적으로 세 번째 LC의 임의의 다른 CDR 서열, 예컨대 각각 두 번째 및 세 번째 LC의 CDR5 및 CDR6과 조합되는데, 여기서 특히 CDR4-6 서열의 조합은 동일한 그룹 내이다.
구체적으로, 항체는 하기의 그룹 멤버 i) 내지 viii)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
i)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 9 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 11, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 21의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 13, 서열번호: 17, 서열번호: 23, 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 9 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 11, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 21의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 13, 서열번호: 17, 서열번호: 23, 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
ii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 33 또는 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 35, 서열번호: 42, 서열번호: 43, 또는 서열번호: 45의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 33 또는 서열번호: 41의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 35, 서열번호: 42, 서열번호: 43, 및/또는 서열번호: 45의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
iii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 53, 서열번호: 67, 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 54, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 또는 서열번호: 70의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 53, 서열번호: 67, 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 21의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 54, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 또는 서열번호: 70의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
iv)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 75 또는 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 76 또는 서열번호: 86의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 75 또는 서열번호: 32의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 76 또는 서열번호: 86의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR6;
v)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 92의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 96 또는 서열번호: 103의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 92의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 96 또는 서열번호: 103의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR6;
vi)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 94 또는 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 108, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 123의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 94 또는 서열번호: 117의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 108, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 123의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
vii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 또는 서열번호: 132의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 또는 서열번호: 132의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
및
viii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 140, 서열번호: 96, 서열번호: 142, 또는 서열번호: 143의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 및/또는
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 및/또는
c) 서열번호: 140, 서열번호: 96, 서열번호: 142, 또는 서열번호: 143의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
여기서 임의의 기능적 활성 CDR 변형체 (특히, 상기 그룹 멤버 i) 내지 viii)의 하나로 특정된 바와 같음)는 모체 CDR 서열 내 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고, 모체 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어짐.
구체적으로, 항체는 그룹 멤버 iv) (상기 참조)의 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체이고, 여기서
a) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고/이거나;
b) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y, 우선적으로는 I 또는 W; 및/또는
c) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고/이거나;
d) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고/이거나;
e) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고/되거나;
f) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고/되거나;
g) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택된다.
구체적으로, 항체는 도 2에 도시된 바와 같은 VL 서열 중 임의의 서열로부터 선택된 VL 아미노산 서열, 또는 서열번호: 148, 서열번호: 150, 서열번호: 152, 서열번호: 154, 서열번호: 156, 서열번호: 158, 서열번호: 160, 서열번호: 162, 서열번호: 164, 서열번호: 166, 서열번호: 168, 서열번호: 170, 및 서열번호: 172로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 경쇄 (LC) 아미노산 서열, 또는 전술한 것들 중 임의의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하고, 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만, 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도, 예컨대 피코몰 범위의 친화도를 갖는다.
구체적으로, 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체는 도 2, 그룹 4에 도시된 바와 같은 VL 서열 중 임의의 서열로부터 선택된 VL 아미노산 서열, 또는 서열번호: 158, 서열번호: 160, 서열번호: 162로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 경쇄 (LC) 아미노산 서열을 포함하고, 여기서
a) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고/이거나;
b) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고/이거나;
c) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고/이거나;
d) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고/이거나;
e) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고/되거나;
f) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고/되거나;
g) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택된다.
구체적으로, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 38의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 39의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 30의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 32의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 33의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 35의 CDR6 서열;
b) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 47의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 49의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 51의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 53의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 21의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 54의 CDR6 서열;
c) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 83의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 84의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 73의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 75의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 41의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 76의 CDR6 서열;
d) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 104의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 105의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 92의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 94의 CDR5 서열; 및
f.서열번호: 108의 CDR6 서열;
및
e) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 114의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 115의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 116의 CDR4 서열; 및
f. 서열번호: 117의 CDR5 서열; 및
g. 서열번호: 118의 CDR6 서열;
또는 전술한 것들 중 어느 하나 (특히 상기 그룹 멤버 a) 내지 e)의 하나에서 특정된 바와 같은 항체)의 기능적 활성 CDR 변형체로, 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만, 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도, 예컨대 피코몰 범위의 친화도를 가진다.
구체적으로, 항체는 그룹 멤버 c)의 항체 (상기 참조, 서열번호: 83의 CDR1 서열; 서열번호: 84의 CDR2 서열; 서열번호: 73의 CDR3 서열; 서열번호: 75의 CDR4 서열; 서열번호: 41의 CDR5 서열; 및 서열번호: 76의 CDR6 서열을 특징으로 함) 또는 이의 기능적 활성 변형체이고, 여기서:
a) VH CDR1의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, F, H, I, K, L, M, R, V, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 E, F, M, W 또는 Y 중의 것이고/이거나;
b) VH CDR2의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, H, L, S, T, V 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, H 또는 Y 중의 것이고/이거나;
c) VH CDR2의 위치 3에서, 아미노산 잔기는 Y, H, T 및 W로부터 선택되고/되거나;
d) VH CDR2의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 S, A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 N, R 또는 W 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 N 또는 W이고/이거나;
e) VH CDR2의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, D, F, H, K, L, M, N, R 및 W로부터 선택되고/되거나;
f) VH CDR2의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, D, E, F, N, S 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고, 더욱 우선적으로는 H이고/이거나;
g) VH CDR3의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 R, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고/이거나;
h) VH CDR3의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 G, A, F 및 Y로부터 선택되고/되거나;
i) VH CDR3의 위치 6에서, 아미노산 잔기는 M, E, F, H 및 Q로부터 선택되고, 우선적으로는 F 또는 H이고/이거나;
j) VH CDR3의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 H, A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, K, Q, R, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 W 또는 Y이고/이거나;
k) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고/이거나;
l) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고/이거나;
m) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고/이거나;
n) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고/이거나;
o) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고/되거나;
p) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고/되거나;
q) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택된다.
구체적으로, VH 골격 영역의 첫 번째 아미노산 (VH FR1)이 Q인 경우에, 항체는 선택적으로 Q1E 점 돌연변이를 포함하는, 표 1에 열거된 바와 같은 VH 및/또는 VL의 골격 영역 중 임의의 것을 포함하는, 면역글로불린 불변 영역 또는 불변 도메인으로 이루어진 면역글로불린 골격과 같은 골격을 포함한다.
구체적으로, 항체는 도 2에 나타난 바와 같은 HC 아미노산 서열을 포함한다.
구체적으로, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
a) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 147의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 148의 LC 아미노산 서열;
b) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 149의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 150의 LC 아미노산 서열;
c) 하
기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 151의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 152의 LC 아미노산 서열;
d) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 153의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 154의 LC 아미노산 서열;
e) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 155의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 156의 LC 아미노산 서열;
f) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 157의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 158의 LC 아미노산 서열;
g) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 159의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 160의 LC 아미노산 서열;
h) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 161의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 162의 LC 아미노산 서열;
i) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 163의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 164의 LC 아미노산 서열;
j) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 165의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 166의 LC 아미노산 서열;
k) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 167의 HC 아미노산 서열; 및
b) 서열번호: 168의 LC 아미노산 서열;
l) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 169의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 170의 LC 아미노산 서열;
및
m) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 171의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 172의 LC 아미노산 서열;
또는 전술한 것들 중 어느 하나 (특히 상기 그룹 멤버 a) 내지 m)의 하나에서 특정된 바와 같은 항체)의 기능적 활성 CDR 변형체로, 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만, 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도, 예컨대 피코몰 범위의 친화도를 가진다.
구체적으로, 항체는 그룹 멤버 f) (상기 참조, 서열번호: 157의 HC 아미노산 서열; 및 서열번호: 158의 LC 아미노산 서열을 특징으로 함), g) (서열번호: 159의 HC 아미노산 서열; 및 서열번호: 160의 LC 아미노산 서열을 특징으로 함), 및 h) (서열번호: 161의 HC 아미노산 서열; 및 서열번호: 162의 LC 아미노산 서열을 특징으로 함)의 임의의 항체, 또는 전술한 것들 중 임의의 기능적 활성 변형체이고, 여기서
a) VH CDR1의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, F, H, I, K, L, M, R, V, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 E, F, M, W 또는 Y 중의 것이고/이거나;
b) VH CDR2의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, H, L, S, T, V 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, H 또는 Y 중의 것이고/이거나;
c) VH CDR2의 위치 3에서, 아미노산 잔기는 Y, H, T 및 W로부터 선택되고/되거나;
d) VH CDR2의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 S, A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 N, R 또는 W 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 N 또는 W이고/이거나;
e) VH CDR2의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, D, F, H, K, L, M, N, R 및 W로부터 선택되고/되거나;
f) VH CDR2의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, D, E, F, N, S 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고, 더욱 우선적으로는 H이고/이거나;
g) VH CDR3의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 R, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고/이거나;
h) VH CDR3의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 G, A, F 및 Y로부터 선택되고/되거나;
i) VH CDR3의 위치 6에서, 아미노산 잔기는 M, E, F, H 및 Q로부터 선택되고, 우선적으로는 F 또는 H이고/이거나;
j) VH CDR3의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 H, A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, K, Q, R, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 W 또는 Y이고/이거나;
k) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고/이거나;
l) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고/이거나;
m) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고/이거나;
n) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고/이거나;
o) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고/되거나;
p) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고/되거나;
q) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 항체는 도 2에 도시된 바와 같은 임의의 HC 및 LC 아미노산 서열 조합, 또는 이러한 HC 및 LC 아미노산 서열의 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함한다.
구체적으로, 항체는 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만, 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도, 예컨대 피코몰 범위의 친화도를 갖는다.
구체적으로, 항체는 LukGH 복합체에 결합하는 친화도보다 낮은, 바람직하게는 10-7M 초과, 바람직하게는 10-6M 초과의 Kd로, 각각의 LukG 및/또는 LukH 항원에 결합하는 친화도를 갖는다.
구체적으로, 각각의 LukG 또는 LukH 항원에 비해 LukGH 복합체에 우선적으로 결합하기 위한 Kd 차이는 적어도 2 로그 (logs), 바람직하게는 적어도 3 로그이다.
본 발명은 도 2에 도시된 바와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열중 임의의 서열의 조합, 또는 이러한 HC 및 LC 아미노산 서열의 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함하는 본 발명의 임의의 항체인 모체 항체의 기능적으로 활성인 항체 변이체를 제조하는 방법을 추가로 제공하고, 본 방법은 변형체 항체를 수득하기 위해 골격 영역 (FR) 또는 불변 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR1 내지 CDR6) 중의 것에 적어도 하나의 점 돌연변이를 조작하고, 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만, 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도, 예컨대 피코몰 범위의 친화도에 의해 변형체 항체의 기능적 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 이때 기능적 활성의 측정 시, 기능적 활성 변형체가 재조합 생산 방법에 의한 생산을 위해 선택된다.
구체적으로, LukGH 복합체는 용액 중에서 각각의 LukG 및 LukH 항원의 조립으로부터 생성된 항원성 구조를 특징으로 한다.
구체적으로, LukGH 복합체는 단리되고 선택적으로 정제된 복합체 항원으로 제공된다.
구체적으로, LukGH 복합체는 헤테로다이머 또는 헤테로올리고머로서 LukG 및 LukH 성분을 포함한다.
구체적으로, LukGH 복합체는 에스 . 아우레우스 균주로부터 유래된 재조합 단백질 및/또는 단백질들로 구성된다.
구체적으로, LukG 및 LukH 성분은 재조합 숙주 세포에 의해 동시-발현되고, 천연 공급원으로부터 정제되고/되거나 동시-재중첩된다.
구체적으로, 항원은 가용성 형태의 단백질 복합체로서 제공된다.
특정 측면에 따르면, 항체는 포스포콜린 또는 포스파티딜콜린, 특히 포유동물 세포막의 포스파티딜콜린에 대한 LukGH 복합체의 결합을 억제한다.
구체적으로, 항체는 LukGH 복합체를 중화시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 항체는 상이한 LukGH 변형체들 사이에서 교차-반응성이다.
구체적으로, 항체는 LukGH 복합체 및 LukGH 복합체 변형체를 교차-중화한다.
구체적으로, 항체는 USA300 클론으로부터, 바람직하게는 TCH1516 균주로부터 유래된 LukGH 복합체, 및 적어도 하나의 LukGH 복합체 변형체에 결합한다.
구체적으로, LukGH 복합체 변형체는 최소한 USA300 클론으로부터 유래된 LukGH 복합체와 비교하여, LukG 또는 LukH 성분 중의 것의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 점 돌연변이, 예컨대 상기 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 변화를 갖는다. MRSA252 및 MSHR1132 균주로부터 유래된 매우 상이한 LukGH 복합체 변형체도 본 발명의 항체에 특이적으로 교차-결합되고, 교차-중화된다.
구체적으로, 본 발명의 항체는 USA300 클론 (예컨대, 균주 TCH_1516)으로부터의 LukGH 및 적어도 하나의 LukGH 변형체에 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 교차-중화 항체이다. 구체적으로, LukGH 독소는 EMRSA16 MRSA252 균주 또는 MSHR1132 균주에 의해 발현된 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 측면에 따르면, 항체는 100:1 미만의 mAb:독소 비율 (mol/mol), 바람직하게는 50:1 미만, 바람직하게는 25:1 미만, 바람직하게는 10:1 미만, 더욱 바람직하게는 1:1 미만의 IC50으로 세포-기반 분석에서 시험관 내 중화능을 나타낸다.
추가의 특정 측면에 따르면, 항체는 인간 및 비-인간 동물 모두를 포함하는 동물에서 표적된 LukGH 복합체를 중화하여, 생체 내 에스 . 아우레우스 발병, 바람직하게는 폐렴, 세균혈증, 패혈증, 종기, 피부 감염, 복막염, 카테터 및 의치 (prothetic) 장치 관련 감염 및 골수염의 임의의 모델을 억제한다.
구체적으로, 항체는 전장의 단일클론 항체, 결합 부위를 통합하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 통합하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 바람직하게는, 항체는 뮤린, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체, 중쇄 항체, Fab, Fd, scFv 및 단일-도메인 항체 유사 VH, VHH 또는 VL로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 인간 IgG1 항체이다.
본 발명은 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 발현하기 위한 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
구체적으로 하기를 포함하는 숙주 세포 및 이러한 숙주 세포를 이용하는 생산 방법이 제공된다:
- 항체 경쇄를 발현하기 위한 코딩 서열을 포함하는, 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트; 및
- 항체 중쇄를 발현하기 위한 코딩 서열을 포함하는, 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트.
본 발명은 본 발명에 따른 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공하는데, 본 발명의 숙주 세포가 상기 항체를 생산하기 위한 조건하에서 배양되거나 유지된다.
본 발명은 본 발명의 임의의 항체, 예컨대 도 1 또는 도 2에 열거된 바와 같은 항체, 또는 도 1 또는 도 2에 열거된 바와 같은 임의의 HC 및 LC 아미노산 서열 조합을 포함하는 항체, 또는 이러한 HC 및 LC 아미노산 서열의 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함하는 항체인 모체 항체의 기능적으로 활성인 항체 변형체를 생산하는 방법을 추가로 제공하고, 본 방법은 변형체 항체를 수득하기 위해 골격 영역 (FR) 또는 불변 도메인, 또는 상보성 결정 영역 (CDR1 내지 CDR6) 중의 것에 적어도 하나의 점 돌연변이를 조작하고, 하기 중의 것에 의해 변형체 항체의 기능적 활성을 결정하는 것을 포함한다:
- 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만, 바람직하게는 10-10M 미만, 바람직하게는 10-11M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도, 예컨대 피코몰 범위의 친화도, 및/또는
- 모체 항체와 경쟁하는 LukGH 복합체에 대한 변형체 항체의 결합;
여기서 기능적 활성의 결정 시, 기능적 활성 변형체는 재조합 생산 방법에 의한 생산을 위해 선택된다.
기능적 활성 변형체 항체는 VH 또는 VL 서열 중의 것가 다르거나, 공통의 VH 및 VL 서열울 공유할 수 있고, 각각의 FR 내에 변형을 포함할 수 있다. 돌연변이화에 의해 모체 항체로부터 유래된 변형체 항체는 당해 분야에 잘 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다.
예시적인 모체 항체가 하기 실시예 항목 및 도 1 및 도 2에 기술된다. 구체적으로, 항체는 도 1 또는 도 2에 열거된 바와 같은 모체 항체의 기능적 활성 유도체이다. 하나 이상의 변형된 CDR 서열, 및/또는 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열과 같은 하나 이상의 변형된 FR 서열, 또는 변형된 불변 도메인 서열을 갖는 변형체가 조작될 수 있다.
본 발명은 하기를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 추가로 제공한다:
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 3차원 구조의 에피토프로 비-인간 동물을 면역접종하는 단계;
(b) 단리된 B-세포로부터 무한증식 세포주를 형성하는 단계;
(c) 스타필로코커스 아우레우스의 LukGH 복합체 및 선택적으로 적어도 하나의 LukGH 복합체 변형체에 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 세포주를 동정하기 위해 세포주를 스크리닝하는 단계; 및
(d) 단일클론 항체, 또는 이 항체의 인간화된 또는 인간 형태, 또는 상기 단일클론 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 이의 유도체를 생산하는 단계.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 비-인간 동물을 스타필로코커스 아우레우스의 LukGH 복합체로 면역접종하고 항체를 생산하는 B-세포를 단리하는 단계;
(b) 단리된 B-세포로부터 무한증식 세포주를 형성하는 단계;
(c) 스타필로코커스 아우레우스의 LukGH 복합체 및 선택적으로 적어도 하나의 LukGH 복합체 변형체에 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 세포주를 동정하기 위해 세포주를 스크리닝하는 단계; 및
(d) 단일클론 항체, 또는 이 항체의 인간화된 또는 인간 형태, 또는 상기 단일클론 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 이의 유도체를 생산하는 단계.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 항체는, 구체적으로 에스 . 아우레우스 감염의 위험에 처했거나 이를 앓고 있는 개체를 치료하는데 사용하기 위한, 의학 용도를 위해 제공되고, 이는 개체에서 감염을 제한하고, 상기 감염으로부터 초래되는 질환 병태를 완화시키고, 또는 에스 . 아우레우스 질환 발병, 예컨대 폐렴, 패혈증, 세균혈증, 상처 감염, 종기, 수술 부위 감염, 내안구염 (endothalmitis), 종기증, 큰종기증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염을 억제하기 위해, 유효량의 항체를 개체에 투여하는 것을 포함한다.
구체적으로, 항체는 에스 . 아우레우스 감염으로부터의 보호를 위해 제공된다.
추가적인 측면에 따르면, 치료 방법이 추가로 제공되는데, 여기서 본 발명의 항체는 에스 . 아우레우스 감염 또는 상기 감염으로부터 초래되는 질환 병태의 위험에 처했거나 이를 앓고 있는 개체를 치료하고, 개체에서 상기 감염을 제한하고, 상기 감염으로부터 초래되는 질환 병태를 완화하고, 또는 에스 . 아우레우스 질환 발, 예컨대 폐렴, 패혈증, 세균혈증, 상처 감염, 종기, 수술 부위 감염, 내안구염, 종기증, 큰종기증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염을 억제하는데 효과적인 양으로 사용된다.
구체적으로, 치료 방법은 병원성 에스 . 아우레우스에 대한 보호를 제공한다
추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 항체를 포함하고, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학적 제제가 추가로 제공된다.
이러한 약학적 조성물은 유일한 활성 성분으로서, 또는 다른 활성 성분과 조합하여 항체를 포함하거나, 또는 적어도 2 또는 3개의 상이한 항체의 조합 또는 칵테일과 같은 활성 성분들의 칵테일을 포함할 수 있고, 예컨대 다른 활성 성분은 추가로 에스 . 아우레우스를 추가로 표적하고, 예컨대 OPK 항체 또는 적어도 하나의 다른 독소를 표적하는 항체이다. 구체적으로, 항체의 칵테일은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하고, 이들 각각은 독소를 표적하고 그 조합은 칵테일 내 단 하나의 항체보다 더 다양한 에피토프 또는 독소를 표적한다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 항체는 괴사성 폐렴과 종기증 및 큰종기증에서 독소 생산과 같은 고 독소 생산 MRSA 감염을 포함하는, 임의의 에스 . 아우레우스 감염을 검출하기 위한 진단 용도를 위해 제공된다.
추가적인 측면에 따르면, 표지를 갖는 항체 및/또는 표지를 갖는 추가의 진단 시약을 선택적으로 포함하는, 본 발명의 항체의 진단적 제제가 추가로 제공된다.
구체적으로, 항체는 본 발명에 따른 진단 용도를 위해 제공되는데, 개체에서 에스. 아우레우스에 의한 전신 감염은 상기 개체의 체액 시료를 항체와 접촉시킴으로써 생체 외에서 측정되고, 여기서 항체의 특이적 면역 반응이 감염을 결정한다.
따라서, 본 발명은 개체에서 에스 . 아우레우스 감염을 진단하는, 특히 개체에서 에스 . 아우레우스에 의한 전신 감염이 결정되는, 별개의 방법을 추가로 언급한다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 추가로 제공된다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 항체의 단리된 파라토프, 또는 상기 파라토프를 포함하는 결합 분자가 제공된다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 단리된 입체형태 에피토프가 제공되는데, 이러한 에피토프는 각각이 본 발명의 항체에 의해 인식되는, 단일 에피토프 또는 에피토프 변형체를 포함하는 에피토프의 혼합물로 이루어질 수 있다.
에피토프는 구체적으로 하기를 특징으로 한다:
a) LukG의 rim 도메인 및 접촉 아미노산 잔기 Asn71, Tyr73, Trp74, Asn206, Leu207, Trp208, Lys210, Asp211, Trp262, 및 Phe267의 구조 좌표를 포함하는 에 스. 아우레우스의 LukGH 복합체의 3차원 구조; 또는
b) a)의 동족체 (homolog)로서, 상기 동족체가 0.00 A과 2.00 A 사이인 접촉 아미노산 잔기의 골격 원자로부터 평균평방근편차를 갖는 결합 부위를 포함하는, 3차원 구조.
구체적으로, 에피토프는 결합 분자에 의해 결합되거나 인식된다.
추가적인 측면에 따르면, 구체적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 에피토프를 인식하고, 바람직하게는 단백질, 펩티드, 펩티드 모방체, 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩티드, 앱타머 및 소분자 화합물, 바람직하게는 항체, 결합 부위를 통합하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 통합하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합 분자가 제공된다. 구체적으로, 결합 분자는 에스. 아우레우스의 LukGH 복합체를 인식하는 특이적 결합제이다. 구체적으로, 결합제는 표적 세포에 대한 LukGH 결합을 방지하고 본 발명의 항체와 경쟁한다.
추가적인 측면에 따르면, 하기 단계를 포함하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 에피토프를 특별히 인식하는 결합제를 동정하기 위한 스크리닝 방법 또는 분석이 제공된다:
- 후보 화합물을 본 명세서에 정의된 바와 같은 3차원 구조 (특히, 입체형태 에피토프를 특징으로 함)와 접촉하게 하는 단계; 및
- 후보 화합물과 3차원 구조 사이의 결합을 평가하는 단계로, 후보 화합물과 3차원 구조 사이의 결합이 에스 . 아우레우스의 LukGH 복합체를 인식하는 특이적 결합제로서 후보 화합물을 동정하는 단계. 예를 들어, 후보 화합물과 3차원 구조 또는 에피토프 사이의 명백한 기능적 결합 반응은 이 화합물을 보호적 결합제로서 동정한다.
추가적인 측면에 따르면, 하기를 포함하는 면역원이 제공된다:
a) 본 명세서에 기술된 바와 같은 에피토프; 및
b) 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 완충제 및/또는 애주번트 물질을 포함한다.
구체적으로, 면역원은 바람직하게는 비경구 사용을 위해, 백신 제형으로 제공된다.
구체적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 면역원은 에스 . 아우레우스 감염으로부터 개체를 보호하고, 상기 감염으로부터 초래되는 질환 병태를 예방하고 또는 에스 . 아우레우스 폐렴 발병을 억제하기 위해 상기 면역원의 유효량을 투여함으로써 개체를 치료하는데 사용하기 위해 제공된다.
구체적으로, 면역원은 보호적 면역 반응을 유도하기 위해 사용된다.
특정 측면에 따르면, 에스 . 아우레우스 감염의 위험에 처한 개체를 치료하는 치료 방법이 추가로 제공되는데, 본 방법은 개체에서 감염을 예방하고, 특히 병원성 에스 . 아우레우스로부터 보호하기 위해 면역원의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하거나, 또는 본 발명의 에피토프를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
도 1:
표 1: LukGH 특이적 mAb의 아미노산 서열
범례: 컬럼
A … 서열번호 VH FR1
B … 서열번호 VH CDR1
C … 서열번호 VH FR2
D … 서열번호 VH CDR2
E … 서열번호 VH FR3
F … 서열번호 VH CDR3
G … 서열번호 VH FR4
H … 서열번호 VL FR1
I … 서열번호 VL CDR4
J … 서열번호 VL FR2
K … 서열번호 VL CDR5
L … 서열번호 VL FR3
M … 서열번호 VL CDR6
N … 서열번호 VL FR4
도 1에 사용된 명명법은 하기 의미를 가질 것이다:
VH CDR1 = CDR1
VH CDR2 = CDR2
VH CDR3 = CDR3
VL CDR4 = CDR4 = VL CDR1
VL CDR5 = CDR5 = VL CDR2
VL CDR6 = CDR6 = VL CDR3
표 1은 8개 부분 (그룹 1-8의 항체에 대해)으로 구분된다: 표 1.1 - 1.8.
표 1.1a는 그룹 1의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.1b는 그룹 1의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.2a는 그룹 2의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.2b는 그룹 2의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.3a는 그룹 3의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.3b는 그룹 3의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.4a는 그룹 4의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.4b는 그룹 4의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.5a는 그룹 5의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.5b는 그룹 5의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.6a는 그룹 6의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.6b는 그룹 6의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.7a는 그룹 7의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.7b는 그룹 7의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.8a는 그룹 8의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.8b는 그룹 8의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 2: LukGH에대한 AB-32-9 접촉 잔기의 돌연변이 시 결합 에너지의 변화 (ΔΔG).
도 2: 선택된 LukGH 특이적 mAb의 전장 아미노산 서열
도 3: 에스. 아우레우스 LukG 및 LukH 독소 서열
USA300 TCH1516 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Genbank, 등재번호 CP000730), 서열번호: 173;
USA300 TCH1516 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 174;
USA300 TCH1516 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 175;
USA300 TCH1516 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 176;
MRSA252 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Genbank, 등재번호 BX571856), 서열번호: 177;
MRSA252 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 178;
MRSA252 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 179;
MRSA252 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 180;
MSHR1132 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Genbank, 등재번호 FR821777), 서열번호: 181;
MSHR1132 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 182;
MSHR1132 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 183;
MSHR1132 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 184;
H19 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Patric, 게놈 ID 72956; Genebank, 등재번호 ACSS01000001 내지 ACSS01000063), 서열번호: 185;
H19 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 186;
H19 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 187;
H19 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 188.
도 4: 선택된 LukGH mAb의 결합 친화도
도 5: LukGH mAb의 시험관 내 중화능: mAb를 분석 배지로 연속적으로 희석하고, 인간 호중구-유사 분화된 HL-60 세포 (A,B) 또는 인간 호중구 (C)의 중독 전에 재조합 LukGH_TCH1516 (A), LukGH_MRSA252 (B) 및 LukGH_MSHR1132 (C)와 예비-인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션 후, 세포 생존능을 세포 ATP 수준의 형광 측정에 의해 결정하였다. 독소 활성의 억제 (%)를 하기 식을 이용하여 계산하였다: 억제 (%) = [(정상 활성 - 억제된 활성) / (정상 활성)] x 100. 무관계 항원에 대해 생성된 인간 IgG1 대조군 mAb를 대조군으로 포함시켰다.
도 6: LukGH:AB-32-9 복합체의 구조로, LukGH는 회색 동그라미로, 접촉 잔기는 흑색 동그라미로, AB-32-9의 Fab 단편은 경쇄의 경우 흑색 밑그림으로, 중쇄의 경우 회색 밑그림으로 나타내었다.
표 1: LukGH 특이적 mAb의 아미노산 서열
범례: 컬럼
A … 서열번호 VH FR1
B … 서열번호 VH CDR1
C … 서열번호 VH FR2
D … 서열번호 VH CDR2
E … 서열번호 VH FR3
F … 서열번호 VH CDR3
G … 서열번호 VH FR4
H … 서열번호 VL FR1
I … 서열번호 VL CDR4
J … 서열번호 VL FR2
K … 서열번호 VL CDR5
L … 서열번호 VL FR3
M … 서열번호 VL CDR6
N … 서열번호 VL FR4
도 1에 사용된 명명법은 하기 의미를 가질 것이다:
VH CDR1 = CDR1
VH CDR2 = CDR2
VH CDR3 = CDR3
VL CDR4 = CDR4 = VL CDR1
VL CDR5 = CDR5 = VL CDR2
VL CDR6 = CDR6 = VL CDR3
표 1은 8개 부분 (그룹 1-8의 항체에 대해)으로 구분된다: 표 1.1 - 1.8.
표 1.1a는 그룹 1의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.1b는 그룹 1의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.2a는 그룹 2의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.2b는 그룹 2의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.3a는 그룹 3의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.3b는 그룹 3의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.4a는 그룹 4의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.4b는 그룹 4의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.5a는 그룹 5의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.5b는 그룹 5의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.6a는 그룹 6의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.6b는 그룹 6의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.7a는 그룹 7의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.7b는 그룹 7의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.8a는 그룹 8의 항체의 VH FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 1.8b는 그룹 8의 항체의 VL FR 및 CDR 서열을 보여준다;
표 2: LukGH에대한 AB-32-9 접촉 잔기의 돌연변이 시 결합 에너지의 변화 (ΔΔG).
도 2: 선택된 LukGH 특이적 mAb의 전장 아미노산 서열
도 3: 에스. 아우레우스 LukG 및 LukH 독소 서열
USA300 TCH1516 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Genbank, 등재번호 CP000730), 서열번호: 173;
USA300 TCH1516 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 174;
USA300 TCH1516 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 175;
USA300 TCH1516 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 176;
MRSA252 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Genbank, 등재번호 BX571856), 서열번호: 177;
MRSA252 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 178;
MRSA252 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 179;
MRSA252 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 180;
MSHR1132 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Genbank, 등재번호 FR821777), 서열번호: 181;
MSHR1132 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 182;
MSHR1132 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 183;
MSHR1132 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 184;
H19 균주의 LukH 뉴클레오티드 서열 (Patric, 게놈 ID 72956; Genebank, 등재번호 ACSS01000001 내지 ACSS01000063), 서열번호: 185;
H19 균주의 LukH 아미노산 서열, 서열번호: 186;
H19 균주의 LukG 뉴클레오티드 서열, 서열번호: 187;
H19 균주의 LukG 아미노산 서열, 서열번호: 188.
도 4: 선택된 LukGH mAb의 결합 친화도
도 5: LukGH mAb의 시험관 내 중화능: mAb를 분석 배지로 연속적으로 희석하고, 인간 호중구-유사 분화된 HL-60 세포 (A,B) 또는 인간 호중구 (C)의 중독 전에 재조합 LukGH_TCH1516 (A), LukGH_MRSA252 (B) 및 LukGH_MSHR1132 (C)와 예비-인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션 후, 세포 생존능을 세포 ATP 수준의 형광 측정에 의해 결정하였다. 독소 활성의 억제 (%)를 하기 식을 이용하여 계산하였다: 억제 (%) = [(정상 활성 - 억제된 활성) / (정상 활성)] x 100. 무관계 항원에 대해 생성된 인간 IgG1 대조군 mAb를 대조군으로 포함시켰다.
도 6: LukGH:AB-32-9 복합체의 구조로, LukGH는 회색 동그라미로, 접촉 잔기는 흑색 동그라미로, AB-32-9의 Fab 단편은 경쇄의 경우 흑색 밑그림으로, 중쇄의 경우 회색 밑그림으로 나타내었다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는, 링커 서열의 존재 또는 부재인, 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로 이해되는, 항체 도메인으로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 것이다. 루프 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타-가닥으로 이루어진 베타-원통형 (beta-barrel) 구조를 포함하는 경우, 폴리펩티드는 항체 도메인으로 이해된다. 항체 도메인은 천연 구조이거나, 예컨대 항원 결합 특성 또는 임의의 다른 특성, 예컨대 안정성 또는 기능적 특성, 예컨대 Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fc감마 수용체에의 결합을 변형하기 위한, 돌연변이화 또는 유도체화에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 항체는 VH, VL 또는 VHH와 같은 단일 가변 항체 도메인의 CDR 결합 부위, 또는 VL/VH 쌍과 같은 가변 항체 도메인 쌍의 결합 부위를 포함하는, 하나 이상의 항원 또는 이러한 항원의 하나 이상의 에피토프에 대한 특이적 결합 부위를 가지며, 항체는 VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인, 예컨대 Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fv, 또는 전장 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 VH, VL 또는 VHH와 같은 단일 가변 항체 도메인, 또는 VL/VH 쌍과 같은 가변 항체 도메인을 포함하는, 연결 (linking) 서열 또는 힌지 영역을 갖거나 갖지 않는 가변 및/또는 불변 항체 도메인의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 항체 형태를 구체적으로 지칭할 것이고, 항체는 VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인, 예컨대 IgG 타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체의, 예컨대 중쇄 항체, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv, 또는 전장 항체를 포함하거나 이로 이루어진다. 용어 "전장 항체"는 자연 발생적인 항체 단량체에서 일반적으로 발견되는 Fc 도메인 및 다른 도메인의 적어도 대부분을 포함하는 임의의 항체 분자를 치징하는데 사용될 수 있다. 이 어구는 본 명세서에서 특정 항체 분자가 항체 단편이 아님을 강조하기 위해 사용된다.
용어 "항체"는 상이한 표적 항원에 대해 지시되거나 상이한 구조적 배열의 항체 도메인을 포함하는 다른 항체가 실질적으로 결여된, 단리된 형태의 항체를 구체적으로 포함할 것이다. 여전히, 단리된 항체는, 예컨대 상이한 특이성을 갖는 단일클론 항체 또는 항체 단편과 같은 적어도 하나의 다른 항체와 단리된 항체의 조합을 함유하는 조합 제조물에 포함될 수 있다.
용어 "항체"는 인간 종을 포함하는 동물 기원, 예컨대 인간, 뮤린, 토끼, 염소, 라마, 소 및 말을 비롯한 포유동물, 또는 암탉과 같은 조류를 비롯한, 동물 기원의 항체에 적용될 것이고, 이 용어는 동물 기원의 서열, 예컨대 인간 서열을 기반으로 하는 재조합 항체를 구체적으로 포함할 것이다.
용어 "항체"는 뮤린 및 인간 기원의 서열과 같은 다른 종 기원의 서열을 갖는 키메라 항체에 추가로 적용된다.
항체와 관련하여 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라"는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 일 부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정한 부류에 속하는 항체 내 상응하는 서열에 상동인 반면, 쇄의 나머지 분절은 다른 종 또는 부류 내 상응하는 서열에 상동인 그러한 항체를 지칭한다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 한 종의 포유동물로부터 유래한 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 영역은 다른 종으로부터 유래한 항체의 서열에 상동한다. 예를 들어, 가변 영역은, 예컨대, 인간 세포 제조물로부터 유래한 불변 영역과 조합하여 비-인간 숙주 유기체로부터 용이하게 이용가능한 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 유래할 수 있다.
용어 "항체"는 인간화된 항체에 추가로 적용될 수 있다.
항체와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된"은 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래한 항원 결합 부위를 갖는 분자로서, 그 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 기반으로 하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 위에 융합된 완전 가변 도메인 또는 가변 도메인 내 적절한 골격 영역 위에 이식된 유일한 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형, 바람직하게는 인간 면역글로불린에 더욱 근접하게 유사하도록 변형될 수 있다. 일부 형태의 인간화된 항체는 모든 CDR 서열 (예를 들어, 마우스 항체로부터의 모든 6개 CDR를 포함하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태는 원래 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
용어 "항체"는 추가로 인간 항체에 적용된다.
항체와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "인간"은 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR 내에 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대, 시험관 내 랜덤 또는 부위-지정 돌연변이화 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의한 돌연변이)을 포함할 수 있다. 인간 항체에는 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉인 (transgenic) 동물로부터 단리된 항체가 포함된다.
용어 "항체"는 특히 임의의 부류 또는 아부류의 항체에 적용된다. 이들의 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존적으로, 항체는 항체 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 주요 부류로 지정될 수 있고, 이들 중 몇몇은 아부류 (아형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 구분될 수 있다.
이 용어는 단일클론 또는 다중클론 항체, 구체적으로 재조합 항체에 추가로 적용되고, 이 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 항체 및 항체 구조, 예컨대 상이한 기원으로부터의 유전자 또는 서열을 포함하는 인간을 비롯한 포유동물과 같은 동물 기원의 항체, 예컨대 키메라, 인간화된 항체, 또는 하이브리도마 유래된 항체를 포함한다. 추가의 예시는 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합 조합적 라이브러리 (combinatorial library)로부터 단리된 항체, 또는 다른 DNA 서열에 대한 항체 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 지칭한다.
용어 "항체"는 또한 항체의 유도체, 특히 기능적 활성 유도체를 지칭하는 것으로 이해된다. 항체 유도체는 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체의 및/또는 융합 단백질의 임의의 조합으로서 이해되고, 항체의 임의의 도메인은 다른 항체, 예컨대 CDR 루프를 포함하는 결합 구조, 수용체 폴리펩티드, 뿐만 아니라 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등과 같은 하나 이상의 다른 단백질의 임의의 위치에 융합될 수 있다. 항체의 유도체는 공유 결합, 정전기적 상호작용, 이황화 결합 등과 같은 다양한 화학적 기술에 의해 다른 물질에의 연합 또는 결합에 의해 수득될 수 있다. 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자 또는 이들의 임의 조합 (예컨대, PEG, 전구약물 또는 약물)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 생물학적으로 허용가능한 화합물과의 특이적 상호작용을 가능케 하는 부가적인 태그 (tag)를 포함하는 유도체이다. 본 발명에 사용 가능한 태그와 관련하여, 이들이 항체의 그의 표적에 대한 결합에 수용가능한 부정적 효과를 갖거나 아무런 부정적 효과를 나타내지 않는 한, 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 적절한 태그의 예시에는 His-태그, Myc-태그, FLAG-태그, Strep-태그, 칼모듈린 (Calmodulin)-태그, GST-태그, MBP-태그, 및 S-태그가 포함된다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 표지 (label)를 포함하는 유도체이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 단독으로 검출될 수 있는데, 예컨대 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지, 또는, 효소적 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바람직한 유도체는 항원 결합과 관련하여 기능적으로 활성이고, 유도체화되지 않은 항체와 같이, 바람직하게는 에스 . 아우레우스를 중화시키는 능력을 갖고/갖거나 방어 항체이다.
모체 항체 또는 항체 서열, 예컨대 모체 CDR 또는 FR 서열로부터 유래된 항체는, 예컨대 인 실리코 (in silico) 또는 재조합 조작에 의해, 그렇지 않으면 화학적 유도체화 또는 합성에 의해 수득된 변이체 또는 변형체로서 본 명세서에서 구체적으로 이해된다.
구체적으로, 본 발명의 항체로부터 유래된 항체는, 적어도 하나의 CDR 또는 FR 영역에, 또는 HC 또는 LC의 불변 영역 내 적어도 하나의 점 돌연변이를 갖는, 적어도 하나 이상의 CDR 영역 또는 이의 CDR 변형체, 예컨대 중쇄 가변 영역의 적어도 3개 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역의 적어도 3개 CDR을 포함할 수 있고, 이는 기능적으로 활성인데, 예컨대 개별적 LukG 및 LukH 독소의 어셈블리에 의해 형성된 에피토프, 따라서 LukGH 이량체의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
용어 "항체"는 또한 모체 CDR 서열의 기능적 활성 CDR 변형체, 및 모체 항체의 기능적 활성 변형체 항체를 갖는 항체를 포함하는, 항체의 변형체를 지칭하는 것으로 이해된다.
용어 "변형체"는, 예컨대 불변 도메인에서 항체 안정성, 효과기 기능 또는 반감기를 조작하기 위해, 예컨대 돌연변이화 방법에 의해, 특히 특정 항체 아미노산 서열 또는 영역을 결실, 교환, 도입, 또는 삽입하거나 아미노산 서열을 화학적으로 유도체화시켜 수득되거나, 또는 가변 도메인에서 항원-결합 특성을 개선하기 위해, 예컨대 당해 분야에 이용 가능한 친화도 돌연변이 기술에 의해 수득된, 돌연변이 항체 또는 항체의과 같은 항체를 구체적으로 지칭할 것이다. 예컨대 무작위화 기술에 의해 수득되는 목적하는 위치에서의 점 돌연변이를 비롯한, 임의의 공지된 돌연변이화 방법이 사용될 수 있다. 일부 경우에는, 예컨대 임의의 가능한 아미노산에 의해 또는 항체 서열을 무작위화하는데 바람직한 아미노산의 선택에 의해, 위치가 무작위적으로 선택된다. 용어 "돌연변이화"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 변경을 위한 임의의 당해 분야에 공지된 기술을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이화에는 오류 경향 (error prone) PCR 돌연변이화, 포화 돌연변이화, 또는 다른 부위 지정 돌연변이화가 포함된다.
용어 "변형체"는 기능적 활성 변형체를 구체적으로 포함할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 CDR 서열의 "기능적 활성 변형체"는 "기능적 활성 CDR 변형체"로 이해되고, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체의 "기능적 활성 변형체"는 "기능적 활성 항체 변형체"로 이해된다. 기능적 활성 변형체는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 유도체화에 의한 이 서열 (모체 항체 또는 모체 서열)의 변형, 또는 뉴클레오티드 서열 내 뉴클레오티드, 또는 이 서열 중의 것 또는 둘 모두의 원위 말단에서, 예컨대 CDR 서열 내 N-말단 및/또는 C-말단의 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산, 및/또는 중심의 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 (즉, CDR 서열의 중앙)의 변형으로부터 초래된 서열을 의미하고, 이 변형은 이 서열의 활성에 아무런 영향을 미치지 않으며, 특히 손상시키지 않는다. 선택된 표적 항원에 대해 특이성을 갖는 결합 부위의 경우에, 항체의 기능적 활성 변형체는, 예컨대 특정 에피토프에 대한 우수한 특이성, 친화도, 친화력 (avidity), Kon 또는 Koff 속도 등이 변하도록 변화될 수 있지만, 기결정된 결합 특이성을 여전히 보유할 것이다. 예를 들어, 친화도 성숙된 항체가 기능적 활성 변형체 항체로 구체적으로 이해된다. 따라서, 친화도 성숙된 항체 내 변형된 CDR 서열은 기능적 활성 CDR 변형체로 이해된다. 예컨대 LukGH 복합체 또는 LukGH 이량체의 더 많은 변형체, 또는 모체 항체 이외의 추가의 독소 또는 독소 성분을 표적하는 교차-특이성을 확대하거나, 그의 반응성을 증가시키기 위해 추가의 변형이 돌연변이화를 통해 이루어질 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 항체의 기능적 활성 변형체는, 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같이, LukGH 복합체 또는 LukGH 이량체에 결합하는 결합 부위를 갖는다. 기능적 활성의 추가의 지표는 세포막, 특히 포스포콜린에 대한 LukG, LukH 또는 LukGH 복합체 중의 것의 경쟁적 결합일 것이다.
기능적 활성은 바람직하게는 세포용해 독소에 대한 항체의 중화능을 측정하는 분석에서 결정되는데, 예컨대 소정의 독소에 감수성인 세포의 증가된 생존능 또는 기능성을 측정하기 위한 표준 분석에서 결정된다. 예를 들어, 만약 항체가 100:1 미만의 mAb:독소 비율 (mol/mol), 바람직하게는 50:1 미만, 바람직하게는 25:1 미만, 바람직하게는 10:1 미만, 더욱 바람직하게는 1:1 미만의 IC50으로 세포-기반 분석에서 시험관 내 중화능을 나타낸다면 기능적 활성으로 결정된다. 중화는 전형적으로 항체 존재 및 부재 시의 생존 가능한 세포의 퍼센트로 표현된다. 고도로 강력한 항체의 경우, 중화능을 표현하는 바람직한 방식은 항체:독소 몰비이고, 여기서 더 낮은 값은 더 높은 중화능에 상응한다. 10 미만의 값은 높은 기능적 활성을 정의한다. 선택적으로, 이 값은 가장 엄격한 분석에서 1과 10 사이이다.
기능적 활성 변형체는 결합 부위, 즉 CDR 영역에 의해 형성되거나, VH 및 VL 영역에 의해 형성된 결합 부위를 포함하는, 모체 항체, 예컨대 표 1 (도 1) 또는 도 2에 열거된 바와 같은 항체를 변화시킴으로써 수득될 수 있고, 이 모체 항체 또는 서열은 결합 부위 이외의 항체 영역 내에 변형을 갖지만, LukGH에 대한 그의 특이적 결합을 특징으로 하거나, 또는 항원 결합을 손상시키지 않고, 바람직하게는 에스. 아우레우스의 독소에 결합하고/하거나 특이적 효능으로 에스 . 아우레우스를 중화시키는 능력을 포함하는, 에스 . 아우레우스 또는 에스 . 아우레우스 독소를 표적하는 특이적 결합 분석 또는 기능적 검사에 의해 결정되는 바와 같이, 모체 항체와 유사한 생물학적 활성을 갖는, 예컨대 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는, 결합 부위 내 변형을 특징으로 한다.
구체적으로, 하기 CDR 서열 중 임의의 서열, 또는 하나 이상의 하기 CDR 서열이 하기를 포함하도록 변형될 수 있다:
a) VH CDR1의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, F, H, I, K, L, M, R, V, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 E, F, M, W 또는 Y 중의 것이고/이거나;
b) VH CDR2의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, H, L, S, T, V 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, H 또는 Y 중의 것이고/이거나;
c) VH CDR2의 위치 3에서, 아미노산 잔기는 Y, H, T 및 W로부터 선택되고/되거나;
d) VH CDR2의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 S, A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 N, R 또는 W 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 N 또는 W이고/이거나;
e) VH CDR2의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, D, F, H, K, L, M, N, R 및 W로부터 선택되고/되거나;
f) VH CDR2의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, D, E, F, N, S 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고, 더욱 우선적으로는 H이고/이거나;
g) VH CDR3의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 R, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고/이거나;
h) VH CDR3의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 G, A, F 및 Y로부터 선택되고/되거나;
i) VH CDR3의 위치 6에서, 아미노산 잔기는 M, E, F, H 및 Q로부터 선택되고, 우선적으로는 F 또는 H이고/이거나;
j) VH CDR3의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 H, A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, K, Q, R, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 W 또는 Y이고/이거나;
k) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고/이거나;
l) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고/이거나;
m) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고/이거나;
n) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고/이거나;
o) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고/되거나;
p) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고/되거나;
q) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한 생물학적 활성"은 상응하는 또는 모체 항체에 대해 결정된 바와 같은 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 예컨대 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 예컨대 최대 200%의 활성인 실질적으로 동일한 활성에 의해 지시되는 바와 같은 활성을 지칭한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 바람직한 변형체 또는 유도체는 항원 결합과 관련하여 기능적으로 활성이고, 바람직하게는 개별적인 독소에 특이적으로 결합하는 효능을 가지며, 예컨대 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그의 Kd 값 차이를 가지고 표적 독소가 아닌 다른 항원에는 유의미하게 결합하지 않는다. 기능적 활성 변형체에 의한 항원 결합은 전형적으로 손상되지 않으며, 예컨대 2 로그 미만, 바람직하게는 3 로그 미만의 Kd 값 차이를 갖지만, 예컨대 적어도 1 log, 바람직하게는 적어도 2 로그의 Kd 값 차이로 더욱 개선된 친화도의 가능성을 가지고 모체 항체 또는 서열, 또는 서열 변형체를 포함하는 항체와 대략 실질적으로 동일한 결합 친화도에 상응한다.
LukGH 복합체의 특이적 표적화에 의해 결정되는 바와 같은 기능적 활성은 특히 추가로 개별적 독소 LukG 및 LukH에 비해 LukGH 복합체의 선호적 결합을 특징으로 한다. 헤테로다이머 또는 올리고머 LukGH 항원에 대한 본 발명의 항체의 결합이, 예컨대 감별 친화도 또는 적어도 1 또는 2 로그 차이의 Kd를 특징으로 하는 바와 같이, 개별적인 (단량체) LukG 또는 LukH 중의 것 또는 둘 모두에 대한 결합에 비해 더욱 개선됨이 구체적으로 입증될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 모체 항체의 기능적 활성 변형체는
a) 항체의 생물학적 활성 단편으로, 이 단편은 이 분자 서열의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%를 포함하고;
b) 적어도 하나의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 항체로부터 유도되고, 이 기능적 활성 변형체는 분자 또는 그의 일부에 대한 서열 동일성, 예컨대 항체의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;
c) 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체 및 부가적으로 이 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 상동인 적어도 하나의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 일 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체의 기능적 활성 변형체는 상기에 기술된 변형체와 본질적으로 동일하지만, 상이한 종의 동종 서열로부터 유래된, 그의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열은 각각 다르다. 이들은 자연 발생적인 변형체 또는 유사체로서 언급된다.
용어 "기능적 활성 변형체"는 또한 자연 발생적인 대립 (allelic) 변형체, 뿐만 아니라 변이체 또는 임의의 다른 비-자연 발생적인 대립 변형체를 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립 변형체는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 본질적으로 변경하지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 것을 특징으로 하는 (폴리) 펩티드의 대안적인 형태이다.
기능적 활성 변형체는, 예컨대 하나 이상의 점 돌연변이에 의한 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 내 서열 변경에 의해 수득될 수 있고, 이 서열 변경은 본 발명의 조합에 사용되는 경우, 불변의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 보유하거나 향상시킨다. 이러한 서열 변경은, 이로 제한되는 것은 아니지만, (보존적) 치환, 부가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있다.
특정한 기능적 활성 변형체는 CDR 변형체이다. CDR 변형체는 CDR 영역에서 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변형은 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적 변경일 수 있고, 이 변형은 변형체가 비변형된 서열의 생물학적 특성을 보유하는 것을 허용한다. CDR 아미노산 서열의 부분적 변경은 1개 내지 수개의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 결실 또는 치환, 1개 내지 수개의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 부가 또는 삽입, 또는 1개 내지 수개의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 화학적 유도체화, 또는 이들의 조합에 의해서일 수 있다. 아미노산 잔기 내 치환은, 예를 들어 하나의 소수성 아미노산을 대체의 소수성 아미노산으로 치환하는, 보존적 치환일 수 있다.
보존적 치환은 이들의 측쇄에서 화학적 특성과 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어날 수 있는 치환이다. 이러한 패밀리의 예시는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비-극성 지방족 측쇄, 비-극성 방향족 측쇄, 비하전된 극성 측쇄, 소 측쇄, 거대 측쇄 등을 갖는 아미노산이다.
점 돌연변이는 구체적으로, 다른 아미노산에 대한 하나 이상의 단일 (비-보존적) 또는 이중체 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 비-조작된 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열의 발현을 초래하는 폴리-뉴클레오티드의 조작으로 이해된다.
바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하를 갖는 아미노산의 교환을 지칭한다. 이와 관련하여, 아미노산은 64개의 삼중체 코돈에 의해 암호화되는 20개의 자연 발생적인 아미노산을 지칭한다. 이들 20개의 아미노산은 중성 전하, 양성 전하, 및 음성 전하를 갖는 것들로 분류될 수 있다:
"중성" 아미노산은 이들 각각의 3-문자 및 1-문자 및 극성과 함께 하기에 표시된다:
알라닌: (Ala, A) 비극성, 중성;
아스파라긴: (Asn, N) 극성, 중성;
시스테인: (Cys, C) 비극성, 중성;
글루타민: (Gln, Q) 극성, 중성;
글리신: (Gly, G) 비극성, 중성;
이소류신: (Ile, I) 비극성, 중성;
류신: (Leu, L) 비극성, 중성;
메티오닌: (Met, M) 비극성, 중성;
페닐알라닌: (Phe, F) 비극성, 중성;
프롤린: (Pro, P) 비극성, 중성;
세린: (Ser, S) 극성, 중성;
트레오닌: (Thr, T) 극성, 중성;
트립토판: (Trp, W) 비극성, 중성;
티로신: (Tyr, Y) 극성, 중성;
발린: (Val, V) 비극성, 중성; 및
히스티딘: (His, H) 극성, 양성 (10%) 중성 (90%).
"양으로" 하전된 아미노산은 하기이다:
아르기닌: (Arg, R) 극성, 양성; 및
라이신: (Lys, K) 극성, 양성.
"음으로" 하전된 아미노산은 하기이다:
아스파르트산: (Asp, D) 극성, 음성; 및
글루탐산: (Glu, E) 극성, 음성.
본 명세서에 기술된 항체 서열 및 동종체와 관련하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 서열들을 정렬하고, 필요에 따라서, 최대 퍼센트의 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 배제한 후, 특정 폴리펩티드 서열 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 비율로 정의된다. 통상의 기술자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐서 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
항체 변형체는 구체적으로, 예컨대 당화조작 (glycoengineering)에 의해 생산된, 특정 당화 패턴을 갖는 동종체, 유사체, 단편, 변형 또는 변형체를 포함하는 것으로 이해되고, 이들은 기능적이고, 예컨대 특정 표적에 결합하고 기능적 특성을 갖는, 기능적 등가물로서 제공될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 바람직한 변형체는 항원 결합과 관련하여 기능적으로 활성이고, 바람직하게는 에스 . 아우레우스를 중화시키는 효능을 갖고/갖거나 방어 항체이다.
본 발명의 항체는 Fc 효과기 기능을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 작용 방식이 주로 Fc 효과기 기능이 없는 항체를 중화함으로써 주로 매개된다 하더라도, Fc는 면역 복합체의 형성을 통해 순환계로부터 보체를 동원하고 표적 항원, 예컨대 독소의 제거를 보조할 수 있다.
특정 항체는 활성 Fc 모이어티가 결여될 수 있고, 그로써 항체의 Fc 부분을 포함하지 않거나 Fc감마 수용체 결합 부위를 포함하지 않는 항체 도메인으로 이루어지고, 또는 예컨대 Fc 효과기 기능의 감소, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 폐지 또는 감소시키기 위한 변형에 의해, Fc 효과기 기능이 결여된 항체 도메인을 포함한다. 대안적인 항체가 Fc 효과기 기능의 증가, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 증강시키기 위한 변형을 도입하도록 조작될 수 있다.
이러한 변형은, Fc 효과기 기능의 감소 또는 증가를 달성하기 위해, Fc감마 수용체 결합 부위 내 돌연변이와 같은 돌연변이화에 의해 또는 항체 포맷의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 방해하는 유도체 또는 제제에 의해 달성될 수 있다.
Fc 효과기 기능의 유의미한 감소는 전형적으로, ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정되는 바와 같이, 비변형된 (야생형) 포맷의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 효과기 기능을 지칭하는 것으로 이해된다.
Fc 효과기 기능의 유의미한 증가는 전형적으로, ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정되는 바와 같이, 비변형된 (야생형) 포맷의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%의 증가를 지칭하는 것으로 이해된다성.
항체 서열과 관련하여 용어 "당화조작된 (glycoengineered)" 변형체는 당화조작의 결과로서, 변형된 면역원성 또는 면역조절성 (예컨대, 항-염증성) 특성, ADCC 및/또는 CDC를 갖는 당화 변형체를 지칭할 것이다. 모든 항체는 중쇄 불변 영역 내 보존된 위치에 탄수화물 구조를 포함하고, 각각의 아형은 N-연결된 탄수화물 구조의 독특한 어레이를 보유하며, 이는 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 다양하게 영향을 미친다. IgG1 유형 항체는 각 CH2 도메인 내 Asn297에 보존된 N-연결된 당화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합체 이-촉각 (bi-antennary) 올리고당은 CH2 도메인들 사이에 매립되어, 폴리펩티드 골격과의 광범위한 접촉을 형성하고, 이들의 존재는 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)과 같은 효과기 기능을 매개하기 위해 항체에 필수적이다. 예를 들어, A로의 N297의 돌연변이를 통해, N297, 또는 T299에서 N-글리칸의 제거는 전형적으로 감소한 ADCC를 갖는 비당화된 항체 포맷을 초래한다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 당화 또는 당화조작된, 또는 비당화된 항체일 수 있다.
항체 당화에 있어 주된 차이는 세포주 사이에서 일어나고, 사소한 차이라도 상이한 배양 조건하에서 성장한 소정의 세포주에 대해서 보여진다. 세균 세포에서의 발현은 전형적으로 비당화된 항체를 위해 제공된다. 이분하는 (bisecting) GIcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인, β(1,4)-N-아세틸글루코사민트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17: 176-180). 숙주 세포의 선택에 더하여, 항체의 재조합 생산 동안에 당화에 영향을 미치는 요인에는 성장 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산화, pH, 정제 계획 등이 포함된다.
용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 부위"는 항원 결합에 참여하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 중쇄 ("H") 및/또는 경쇄 ("L")의 N-말단 가변 ("V") 영역, 또는 이의 가변 도메인의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 지칭되는, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내 3개의 고도로 분기된 신장 (highly divergent stretches)이 골격 영역으로 알려진 더 보존적인 인접하는 신장들 사이에 개재된다. 항원-결합 부위가 결합된 에피토프 또는 항원의 3차원 표면에 상보적인 표면으로 제공되고, 초가변 영역은 "상보성-결정 영역", 또는 "CDR"로 지칭된다. CDR에 도입된 결합 부위는 또한 "CDR 결합 부위"로 불린다.
구체적으로, 본 명세서에 언급되는 바와 같이, CDR 서열은 카밧 명명법 (Kabat nomenclature)에 따라 결정되는 바와 같이 항체의 그러한 아미노산 서열로 이해된다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services. (1991) 참조).
용어 "표적" 또는 "표적 항원"과 호환적으로 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 결합 부위에 의해 인식되는 전체 표적 분자 또는 이러한 분자의 단편을 지칭할 것이다. 구체적으로, 면역학적으로 관련된, 항원의 아구조, 예를 들어, 일반적으로 B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프와 같은 "에피토프"로 지칭되는, 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조가 이러한 결합 부위에 의해 인식될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체의 결합 부위에 대한 특이적 결합 파트너를 완전하게 구성하거나 특이적 결합 파트너의 일부일 수 있는 분자 구조를 특별히 지칭할 것이다. 에피토프는 또한 탄수화물, 펩티드성 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 이의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다. 만약 에피토프가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 펩티드성 구조로 이루어진다면, 이는 통상 적어도 3개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40개 아미노산, 및 더욱 바람직하게는 약 10-20개 사이의 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 입체형태 에피토프 중 하나일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물 쇄의 일차 서열의 단일 분절로 이루어진다. 선형 에피토프는 인접하고 있거나 중첩될 수 있다.
입체형태 에피토프는 3차 구조를 형성하기 위해 폴리펩티드를 중첩함으로써 합쳐지는 아미노산 또는 탄수화물로 이루어지는데, 이 아미노산은 선형 서열로 또 다른 것과 인접할 필요는 없다. 폴리펩티드 항원과 관련하여 구체적으로, 입체형태 또는 비연속 (discontinuous) 에피토프는, 일차 서열 내 단리된, 2개 이상의 별개의 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 하지만, 폴리펩티드가 천연 단백질/항원으로 중첩되는 경우에는 분자의 표면 위에 일관된 구조로 조립된다. 구체적으로, 입체형태 에피토프는 폴리펩티드 서열의 길이를 따라서 비-연속적인 방식으로 간격을 두고 배치되거나 모이게 되는 정렬에서 비-선형인 일련의 아미노산 잔기로 이루어지는 에피토프이다. 이러한 입체형태 에피토프는 접촉 아미노산 잔기 및/또는 결정학적 분석, 예컨대 특이적 항체 또는 Fab 단편에 의해 결합된 에피토프의 면역 복합체에 의해 형성된 결정의 분석에 의해 결정되는 바와 같은 특정 구조 좌표를 갖는 3차원 구조를 특징으로 한다.
특히, 에피토프에 기여하는 결합 잔기는 본 명세서에서 접촉 아미노산 잔기로 이해된다.
구조 좌표는 전형적으로 결정 형태에서 항원 또는 면역 복합체의 원자, 즉 산란 중심에 의한 C-선의 단색광 (monochromatic beam)의 회절 상에서 수득되는 패턴과 관련된 수학 방정식으로부터 유래된 카테지안 (Cartesian) 원자 좌표로 이해된다. 회절 데이터가 결정의 반복 단위의 전자 밀도 지도를 계산하기 위해 사용된다. 전자 밀도 지도는 그 후에, 예컨대 특이적 항체 또는 Fab에 의해 결합된 바와 같은, 에피토프의 개별적 원자를 확립하는데 사용된다. 항원에 대한 한 세트의 구조 좌표가 3차원에서 형상을 정의하는 상대적 세트의 지점인 것으로 이해된다. 개별 좌표 내 사소한 변화는 전체 형상에 거의 영향을 미치지 않을 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 항원의 구조 좌표에 기술된 관련 골격 원자 상에 겹쳐질 때 0.00 A과 2.00 A 사이의 보존적 잔기 골격 원자의 평균평방근편차를 갖는 임의의 3차원 구조는 동일하거나 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 본 발명의 목적을 위하여, 사소한 변화가 개별 좌표에 존재하더라도 이들이 구조 좌표에 의해 정의된 전체 형상에 영향을 미치지 않는다면, 구조 좌표는 동일하거나 실질적으로 동일한 것으로 간주된다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 항체는 구체적으로 LukG 독소의 rim 도메인, 특히 LukGH 복합체를 형성하기 위해 LukH 독소와 복합체와된 LukG를 인식한다. rim 도메인은 숙주 형질막의 외엽 (outer leaflet)에 병렬된 이 독소의 도메인으로 이해되고, 이 rim 도메인은 세포막 결합에 관여한다. 이에 rim 영역은 막 고정 (anchor)으로 제공된다. 따라서, rim 영역 또는 rim 도메인 내에 위치하는, 본 발명의 항체에 의해 표적된 에피토프는 면역관련성일 가능성, 즉 능동 또는 수동 면역요법에 의한 보호와 관련이 있을 가능성을 갖는다.
본 발명의 동정된 에피토프를 기반으로, 각각의 파라토프, 예컨대 항체의 항원-결합 부위인 에피토프를 인식하는 전장 항체의 일부와 같은, 본 발명의 항체의 파라토프를 추가적으로 제공하는 것이 실현 가능하다. 이는 전형적으로 항체 Fv 영역의 15-22개 아미노산의 작은 영역이다. 이러한 파라토프는 융합 단백질 또는 인위적 스캐폴드와 같은 스캐폴드-유형 분자를 수득하고, 목적하는 교차-반응성 결합 특성을 갖는 특이적 결합제 또는 결합 분자를 수득하기 위해 적합한 스캐폴드 내로 도입될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "결합 분자"는 표적을 특이적으로 인식하고, 특히 표적 독소에 대해 교차-특이성을 나타내는, 에피토프-결합 분자 또는 항원-결합 분자로 이해된다. 결합 분자의 특정 예시는 단백질, 펩티드, 펩티드모방체, 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩티드, 앱타머 및 소 분자 화합물, 바람직하게는 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질로부터 선택된다.
결합 분자는 후보 화합물을 수득하기 위해, 예를 들어 적합한 결합체 라이브러리, 예컨대 항체 라이브러리, 또는 다른 화합물 또는 스캐폴드의 라이브러리, 예컨대 DARPins, HEAT 반복 단백질, ARM 반복 단백질, 테트라트리코펩티드 (tetratricopeptide) 반복 단백질, 및 자연 발생적인 반복 단백질에 기반한 다른 스캐폴드로부터, 적합한 스크리닝 방법에 의해 선택될 수 있고, 그 후에 그의 결합 특성에 대해 추가적으로 특징 분석된다.
용어 "발현"은 하기 방식으로 이해된다. 작동가능한 연결로 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체와 같은 발현 산물의 목적하는 코딩 서열과, 예컨대 프로모터와 같은 조절 서열을 포함하는 핵산 분자가 발현 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들 서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주는 암호화된 단백질을 생산할 수 있다. 형질전환을 달성하기 위하여, 발현 시스템은 벡터 내에 포함될 수 있고; 그러나 관련 DNA는 또한 숙주 염색체 내로 통합될 수 있다. 구체적으로 이 용어는, 예컨대 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포 내로 도입된 외래 DNA에 의해 암호화된 단백질의 발현에 적합한 조건 하의 숙주 세포 및 호환성 벡터를 지칭한다.
코딩 DNA는 예컨대 항체와 같은 특정 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 코딩 DNA의 발현을 개시하고, 조절하고, 또는 다르게는 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 코딩 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 유래할 수 있고, 동일하거나 상이한 유기체로부터 유래할 수도 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 항생제 내성과 같은 숙주 세포 내 선별을 위한 하나 이상의 마커, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
본 명세서에 사용된 "벡터"는 적합한 숙주 유기체 내에서 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 이들의 mRNA의 번역을 위해 요구되는 DNA 서열로 정의된다.
"발현 카세트"는 정의된 제한 부위에서 벡터 내로 삽입될 수 있는 발현 산물을 암호화하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA의 분절을 지칭한다. 카세트 제한 부위는 적절한 해독 틀 내 카세트의 삽입을 보장하도록 고안된다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에서 삽입되고, 그 후에 벡터에 의해 전달성 벡터 DNA와 함께 숙주 세포 내로 운반된다. 발현 벡터와 같이 삽입 또는 부가된 DNA를 갖는 DNA의 분절 또는 서열은 또한 "DNA 컨스트럭트"로 불릴 수 있다.
발현 벡터는 발현 카세트를 포함하고 추가적으로 통상은 숙주 세포 또는 유기체 통합 부위 내 자율적 복제 기원, 하나 이상의 선택 가능한 마커 (예컨대, 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 카나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결자를 포함하며, 이들 성분은 작동 가능하게 함께 연결된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 게놈 통합 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 벡터의 통상의 유형은 "플라스미드"로서, 이는 추가의 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포 내로 쉽게 도입될 수 있는 일반적으로 이중-가닥 DNA의 자가-함유 (self-contained) 분자이다. 플라스미드 벡터는 종종 코딩 DNA 및 프로모터 DNA를 포함하고 외래 DNA를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 구체적으로, 용어 "벡터" 또는 "플라스미드"는 숙주를 형질전환하고 도입된 서열의 발현 (예컨대, 전사 및 번역)을 촉진하기 위해, 그에 의해 DNA 또는 RNA 서열 (예컨대, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 운반체 (vehicle)를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체와 같이 특정 재조합 단백질을 생산하도록 형질전환된 일차 대상 세포, 또는 이의 임의의 자손을 지칭할 것이다. 모든 자손이 (고의적 또는 우연한 돌연변이 또는 환경의 차이로 인해) 모체 세포와 정확히 동일하지는 않는 것으로 이해되지만, 이러한 변경된 자손이 최초 형질전환된 세포의 것과 동일한 기능성을 보유하기만 한다면, 자손은 이들 용어에 포함된다. 용어 "숙주 세포주"는 재조합 항체와 같은 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 재조합 유전자를 발현하기 위해 사용되는 바와 같은 숙주 세포의 세포주를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포주"는 연장된 기간에 걸쳐서 증식할 수 있는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 이러한 숙주 세포 또는 숙주 세포주는 세포 배양액 중에 유지되고/되거나 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 배양된다.
본 명세서에서 또한 항원 또는 에피토프를 포함하는 "면역원"으로 명명된, 조성물, 예컨대 면역원성 조성물, 또는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 백신에 대한 "면역 반응"은 숙주 또는 개체에서 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포성- 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 발현이다. 일반적으로 이러한 반응은 개체가 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포를 생산하는 것으로 이루어진다.
"방어적 면역 반응"은 비-면역 집단의 것에 비해 유도성 또는 천연인 감염 또는 독소 시험감염에서 유의미하게 더 나은 결과를 제공하는 면역 반응으로 이해된다. 독소에 대한 방어적 면역 반응은 10-8M 미만의 Kd로 높은 친화도를 갖는 항체를 중화시킴으로써 주로 매개된다. 독소 중화의 이점은 표적 세포의 보호 및 염증의 예방이다. Fc 매개된 면역 복합체 형성이 또한 (RES 세포를 통해) 배양으로부터 독소를 제거함으로써 기여할 수 있다.
면역원 또는 면역원성 조성물은 일반적으로 항원 또는 에피토프 및 담체를 포함하고, 이는 특별히 애주번트를 포함할 수 있다. 용어 "애주번트"는 항원과 함께 투여될 때는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키고/시키거나 재지시하지만, 단독으로 투여될 때는 항원에 대한 면역 반응을 생성하지 않는 화합물을 지칭한다. 애주번트는 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 비롯한 몇몇 기전에 의해 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 예시적인 담체는 리포좀 또는 양이온성 펩티드이고; 예시적인 애주번트는 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록사이드, MF59 또는 CpG 올리고뉴클레오티드이다.
핵산, 항체 또는 다른 화합물과 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된" 또는 "단리"는, "실질적으로 순수한" 형태로 존재하기 위해, 그와 자연적으로 연관되어 있을 수 있는 환경으로부터 분리되어 있는 그러한 화합물을 지칭할 것이다. "단리된"은 다른 화합물 또는 재료와의 인공적 또는 합성적 혼합물의 배제, 또는 기본적인 활성을 방해하지 않으면서, 예를 들어 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 반드시 의미하는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 코돈-최적화 핵산 또는 cDNA와 같이 자연 발생적이지 않거나 화학적으로 합성된 것들을 포함하는 것을 또한 의미한다.
마찬가지로, 본 발명의 단리된 항체는 특히 다른 항체와의 조합 제조물로 제공되는 바와 같이 비-자연 발생적이고, 이 조합은 자연계에서 발생하지 않으며 (예컨대, 하나 이상의 단일특이적 항체 및/또는 적어도 2개의 상이한 표적을 인식하는 교차-특이적 항체의 조합), 또는 자연 발생적인 항체의 최적화 또는 친화도-성숙된 변형체, 또는 항체의 제조성을 향상시키도록 조작된 골격-영역을 갖는 항체이다.
본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "단리된 핵산"이 때때로 사용된다. DNA에 적용될 때, 이 용어는 그것이 기원하는 유기체의 자연 발생적인 게놈 내 그와 바로 연속된 서열로부터 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터 내로 삽입되거나, 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA 내로 통합된 DNA 분자를 포함한다. RNA에 적용될 때, 용어 "단리된 핵산"은 주로 상기에 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 암호화되는 RNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 이 용어는 그의 자연 상태 (즉, 세포 또는 조직 내)에서 그와 연합되어 있을 수 있는 다른 핵산으로부터 분리되어 있는 RNA 분자를 지칭할 수 있다. "단리된 핵산" (DNA 또는 RNA 중의 것)은 생물학적 또는 합성적 수단에 의해 직접적으로 생산되고 그의 생산 동안에 다른 성분으로부터 분리된 분자를 추가로 나타낼 수 있다.
본 발명의 단리된 항체 또는 에피토프와 같은 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여, 용어 "단리된"은 그들의 천연 환경, 또는 이러한 제조가 시험관 내 또는 생체 내에서 숙련된 재조합 DNA 기술에 의한 것일 경우 이들이 제조되는 환경 (즉, 세포 배양)에서 이들과 함께 발견되는 다른 화합물과 같이 이들이 자연적으로 연합되는 물질이 없거나 실질적으로 없는 화합물을 구체적으로 지칭할 것이다. 단리된 화합물은 희석제 또는 애주번트와 함께 조제될 수 있고 여전히 실용적 목적을 위해 단리될 수 있다 - 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 진단 또는 치료에 사용될 때 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "LukGH 복합체"는 LukG 및 LukH 성분ㅇ의 1 이량체 또는 임의의 다른 비율, 바람직하게는 적어도 1 LukG 및 적어도 1 LukH 성분, 또는 LukG 또는 LukH 성분 중의 것 또는 둘 모두의 적어도 2, 또는 적어도 3, 또는 적어도 4를 포함하는 복합체를 비롯한, 이량체 또는 올리고머를 지칭할 것이다. 본 명세서에서 LukGH 이량체는 용액 중에서 전정기적 또는 친수성/소수성 상호작용에 의해 조립되는, 한 분자의 LukG 및 한 분자의 LukH의 헤테로이량체로 이해된다. 놀랍게도 LukH 및 LukG가 표적 세포와의 접촉 없이 용액 중에서 복합체를 형성함이 발견되었다.
용어 "중화하는" 또는 "중화"는 본 명세서에서 광범위한 의미로 사용되고, 중화가 달성되는 기전과 무관하게, 에스 . 아우레우스와 같은 병원체가 개체를 감염시키는 것을 억제하거나, 또는 병원체가 강력한 단백질 독소를 생산함으로써 감염을 촉진하는 것을 억제하거나, 독소가 개체에서 표적 세포를 손상시키는 것을 억제하는 임의의 분자를 지칭한다. 중화는, 예컨대 표적 세포 상에서 그의 동족 수용체와 에스 . 아우레우스 독소(들)의 결합 및/또는 상호작용을 억제하는 항체에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기술된 항체는 독소와 표적 세포, 예컨대 적혈구 세포 사이의 상호작용의 생체 내 또는 시험관 내 효과가 감소 또는 제거되는, 독소 활성을 중화시킬 수 있다. 중화는 활성 독소의 형성을 억제함으로써, 예를 들어 에스 . 아우레우스 LukGH 복합체의 경우 LukG 및 LukF 항원이 서로에게 결합하는 것을 억제하거나, 또는 LukGH 이량체 또는 올리고머가 표적 세포에 결합하는 것을 억제하거나, 또는 세포막 내 올리고머 기공의 형성을 억제함으로써 추가로 일어날 수 있다.
세포용해 독소에 대한 항체의 중화능은 전형적으로 소정의 독소에 감수성인 세포의 증가한 생존능 또는 기능성을 측정함으로써 표준 분석에서 결정된다. 중화는 항체의 존재 및 부재 하의 생존가능 세포의 비율로 표시될 수 있다. 고도로 강력한 항체의 경우, 중화능을 표현하는 바람직한 방식은 항체:독소 몰비로서, 더 낮은 값은 더 높은 중화능에 상응한다. 10 미만의 값이 높은 중화능을 정의하는 반면, 1 미만의 값은 매우 높은 중화능을 정의한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "교차-중화하는"은 다수의 독소, 예컨대 상이한 LukGH 변형체를 발현하는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 또는 적어도 4개 또는 적어도 3개의 상이한 에스 . 아우레우스 균주의 LukGH 복합체의 에피토프를 통합하는 독소를 중화하는 것을 지칭할 것이고, 이 에피토프는 본 발명의 항체에 인식된다. 상이한 LukGH 복합체 변형체에 우세한 이러한 에피토프는 또한 "교차-반응성" 에피토프로 불린다.
용어 "스타필로코커스 아우레우스 " 또는 "에스 . 아우레우스 " 또는 "병원성 에스. 아우레우스 "는 하기 방식으로 이해된다. 스타필로코커스 아우레우스 세균은 일반적으로 피부 위 또는 사람 및 동물의 코 안에서 발견된다. 이들이 절개 또는 다른 상처를 통해 체내로 유입되지 않는 한, 이 세균은 일반적으로 무해하다. 전형적으로, 감염은 건강한 사람에게서 사소한 피부 트러블이다. 역사적으로, 메티실린과 같은 광범위한 스펙트럼의 항생제에 대해 감염이 시험되었다. 현재, 그럼에도 불구하고, 메티실린 및 다른 베타-락탐계 항생제, 예컨대 페니실린 및 세팔로스포린에 내성인 특정 균주가 출현하였다. 이들은 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스로 언급된다 (또한 다약제 내성 스타필로코커스 아우레우스, 또는 "MRSA"로도 알려짐).
중요한 인간 병원체인, 스타필로코커스 아우레우스는 수많은 분비 독소 (외독소)를 발현한다. 이들은 적혈구, 호중구 과립구 및 기타 면역 세포뿐만 아니라 폐 또는 피부의 상피 세포를 비롯한 다양한 숙주 세포 유형을 공격할 수 있다. 에스 . 아우레우스 독소의 저명한 일원이 알파 용혈소 (alpha hemolysine, Hla)인데, 이는 림프구, 대식세포, 폐 상피 세포 및 폐 내피 세포에 세포용해 기능을 발휘한다.
MRSA를 비롯한 에스 . 아우레우스 감염은 일반적으로 뾰루지, 부스럼 또는 거미 물린 자국과 비슷한 작은 적색의 돌기로서 시작한다. 이들 돌기 또는 흠은 외과적 배농 (draining)을 요구하는 심한, 고통스러운 종기로 신속히 변할 수 있다. 때때로 이 세균은 피부에 국한된 채로 존재한다. 가끔, 이들은 체내로 깊이 파고 들어가, 피부, 연조직, 뼈, 관절, 외과적 상처, 혈류, 심장 판막, 폐, 또는 다른 장기를 포함하는, 광범위한 인간 조직에서 잠재적으로 생명을-위협하는 감염을 초래할 수 있다. 따라서, 에스 . 아우레우스 감염은, 괴사성 근막염, 심내막염, 패혈증, 세균혈증, 복막염, 독성 쇼크 증후군, 및 괴사성 폐렴을 비롯한 다양한 형태의 폐렴, 및 종기증 및 큰종기증에서의 독소 생산과 같은 잠재적으로 치명적인 질환인, 이들과 연관이 있는 질환 병태를 초래할 수 있다. MRSA 감염은 환자가 열린 상처, 침습성 장치, 및 약화된 면역 시스템의 위험에 처하거나 그러기 쉽고, 그로써 대중보다 감염에 더 많은 위험에 처하게 되는, 병원 또는 양호 시설 환경에서 특히 문제가 된다.
에스 . 아우레우스 독소를 중화하는 항체는 병원체 및 발병 반응을 방해하고, 그로써 감염을 제한 또는 예방하고/하거나 이러한 감염으로부터 초래되는 질환 병태를 완화시키거나, 에스 . 아우레우스 발병, 특히 폐렴, 복막염, 골수염, 세균혈증 및 패혈증 발병을 억제할 수 있다. 이와 관련하여, "방어 항체"는 본 명세서에서 능동 또는 수동 면역에서 관찰되는 감염성 제제에 대한 면역을 담당하는 중화 항체로 이해된다. 특히, 본 명세서에 기재된 바와 같이 방어 항체는 분비된 독성 인자 (외독소)의 독성 효과 (예컨대, 세포용해, 표적 세포에 의한 전-염증성 사이토카인 발현의 유도)를 중화시키고 그로써 에스. 아우레우스의 발병능을 방해한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 "유전적 조작에 의해 제조되거나 또는 그의 결과"를 의미한다. 재조합 숙주는 구체적으로 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 또는 특히 숙주에 외래인 뉴클레오티드 서열을 이용하는, 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전적으로 조작되어 있다. 재조합 단백질은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현함으로써 생산된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 (transchromosomal)인 동물 (예컨대, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 예컨대, 이입세포 (transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 재조합의, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열에의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 셍성 또는 단리된 항체에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 항체는, 예를 들어 항체 돌연변이 도중에 일어나는, 재배열 및 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "특이성" 또는 "특이적 결합"은 분자의 비균질 집단에서 관심의 동족 리간드의 결정 요인인 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 (예컨대, 면역분석 조건) 하에서, 항체는 그의 특정 표적에 특이적으로 결합하고 시료 내 존재하는 다른 분자의 유의미한 양에는 결합하지 않는다. 특이적 결합은 결합이 선별된 바와 같은 표적 동일성, 고, 중 또는 저 결합 친화도 또는 친화력의 측면에서 선택적인 것을 의미한다. 선택적 결합은, 결합 상수 또는 결합 동역학이 다른 항원과 비교하여 적어도 10배 차이 (적어도 1 로그 차이로 이해됨)인 경우에, 바람직하게는 이 차이가 적어도 100배 (적어도 2 로그 차이로 이해됨), 및 더욱 바람직하게는 적어도 1000배 (적어도 3 로그 차이로 이해됨)인 경우에, 일반적으로 달성된다.
용어 "특이성" 또는 "특이적 결합"은 또한 하나 이상의 분자에 결합하는 결합제, 예컨대 교차-특이적 결합제에 적용하는 것으로 이해된다. 적어도 2개의 상이한 항원을 표적하거나 적어도 2개의 상이한 항원 상의 교차-반응성 에피토프를 표적하는 바람직한 교차-특이적 (다특이적 또는 교차-반응성으로도 불림) 결합제는 실질적으로 유사한 결합 친화도, 예컨대 100배 미만 차이 또는 심지어 10배 미만 차이를 갖는 항원을 특이적으로 결합한다.
예를 들어, 교차-특이적 항체는 교차-반응성 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다. 이러한 항체의 결합 부위와 적어도 2개의 상이한 항원 또는 적어도 2개의 상이한 항원의 교차-반응성 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는 항체는 또한 각각 다특이적 또는 교차-특이적 결합 부위 및 항체로 불린다. 예를 들어, 항체는 본질적으로 동일한 구조의 입체형태 에피토프를 제공하기 위해 에피토프 및/또는 구조적 유사성 내에서 서열 상동성을 갖는 다수의 상이한 항원에 교차-반응성인, 예컨대, 적어도 2개의 상이한 LukGH 복합체 변형체에 교차-반응성인 에피토프에 특이적으로 결합하는 다특이적 결합 부위를 가질 수 있다.
항체가 교차-반응성 결합 서열에 대해 나타내는, 항체의 면역특이성, 그의 결합능 및 수반하는 친화도는 그와 항체가 면역반응하는 (결합하는) 교차-반응성 결합 서열에 의해 결정된다. 교차-반응성 결합 서열 특이성은, 적어도 부분적으로는, 면역글로불린 항체의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 잔기 및/또는 경쇄 가변 영역 아미노산 잔기 서열에 의해 정의된다.
용어 "동일한 특이성을 갖는", "동일한 결합 부위를 갖는" 또는 "동일한 에피토프를 갖는"의 사용은 등가 단일클론 항체가 동일하거나 본질적으로 동일한, 즉 유사한 면역반응 (결합) 특성을 나타내고 사전-선택된 표적 결합 서열에의 결합에 경쟁하는 것을 나타낸다. 특정 표적에 대한 항체 분자의 상대적 특이성은, 예컨대 문헌 [Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에 기술된 바와 같이, 경쟁 분석에 의해 상대적으로 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "개체"는 온혈 포유동물, 특히 인간 또는 비-인간 동물을 지칭할 것이다. MRSA는 수의학에서도 대두되는 문제인 치명적으로 중요한 인간 병원체이다. 이는 광범위한 비-인간 동물 종에 존재한다. 따라서, 용어 "개체"는 또한 개, 고양이, 토끼, 말, 소, 돼지 및 가금을 비롯한 동물을 특별히 지칭할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 의학적 용도 또는 각각의 치료 방법은 에스 . 아우레우스 감염과 연관된 질환 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 적용된다. 개체는 에스 . 아우레우스 감염의 위험에 처하거나 초기 단계 또는 말기 단계 질환을 비롯한, 질환을 앓고 있는 개체일 수 있다. 용어 "환자"는 예방적 및 치료적 처리를 받는 인간 및 다른 포유동물 개체를 포함한다. 용어 "처리"는 따라서 예방적 및 치료적 처리 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다.
개체는, 예컨대 에스 . 아우레우스 질환 병태의 예방 또는 치료를 위해 처리된다. 특히, 감염 또는 이러한 질환 또는 질환 재발이 발병할 위험에 처했거나, 이러한 감염 및/또는 이러한 감염과 연관된 질환을 앓고 있는 개체가 처리된다.
구체적으로, 용어 "예방"은 발병 개시의 방지를 포함하는 것으로 의도되는 방지 대책 또는 발병의 위험성을 감소시키기 위한 예방 대책을 지칭한다.
구체적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 개체에서 질환 병태를 치료, 예방 또는 지연시키는 방법은, 이 병태의 원인 물질로서 에스 . 아우레우스의 발병을 방해함으로써 이루어지고, 이 발병은 개체의 세포막 위에서, 예컨대 특이적 독성 인자 또는 독소에 의해 기공을 형성하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "독소"는 에스 . 아우레우스의 알파-독소 (Hla) 및 이-성분 독소를 지칭할 것이다. 구체적으로 본 발명의 항체에 의해 표적되는 독소는, 예컨대 에스 . 아우레우스에 의해 발현되는 바와 같은 가용성 단량체 독소 또는 기공 형성 독소의 형태와 같은 독소, 또는 예컨대 이-성분 독소의 성분과 같은 독소 성분 중의 것인 것으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "독소"는 면역관련 에피토프를 보유하는 독소 또는 독소 성분, 둘 모두를 지칭할 것이다.
에스. 아우레우스의 독력 (virulence)은, 세균이 진핵 세포의 세포막에 부착하게 하는 표면-연관 단백질, 옵소닌식세포작용 (opsonophagocytosis)으로부터 이를 보호하는 피막 다당류, 및 여러 외독소를 포함하는 다수의 독성 인자들의 조합에 기인한다. 에스 . 아우레우스는 용혈소 (hemolysins), 장독소 및 독소 쇼크 증후군 독소와 같은 분비된 독성 인자의 생산을 통해 주로 질환을 야기한다. 이들 분비된 독성 인자는 숙주에서 다수의 면역학적 기전을 불활성화시킴으로써 면역 반응을 억제하고, 조직 파괴를 야기하며 감염 확립을 지원한다. 후자는 일군의 기공 형성 독소에 의해 달성되고, 이의 가장 유명한 것은 에스 . 아우레우스 폐렴의 핵심 독성 인자인 Hla이다.
에스 . 아우레우스는 이 세균이 다양한 종류의 면역 세포, 특히 신체의 일차 방어 체계를 구성하는 백혈구의 부분모집단에 의한 공격에 대항하거나 이를 견디게 할 수 있는, 다양한 종류의 추가의 독성 인자 및 독소를 생산한다. 이들 독성 인자 및 독소의 생산은 에스 . 아우레우스가 감염성 상태를 유지하는 것을 가능케 한다. 이들 독성 인자 중에서, 에스 . 아우레우스는 LukG 및 LukH 류코시딘 항원을 생산한다.
포유동물 세포에 대한 류코시딘의 독성은 2가지 성분의 작용을 포함한다. 첫 번째 아단위는 클래스 S 성분으로 명명되고, 두 번째 아단위는 클래스 F 성분으로 명명된다. S 및 F 아단위는 단핵구, 대식세포, 수지상세포 및 호중구 (포괄적으로 포식세포로 알려짐)를 비롯한 백혈구 세포 위에 기공을 형성하기 위해 상승적으로 작용한다. 감마 용혈소, 특히 HlgAB 및 HlgA-LukD는 또한 적혈구 세포에 작용하고 LukED는 T 세포에 작용한다. 에스 . 아우레우스에 의해 생산된 이-성분 류코탁신의 레퍼토리는 F 및 S 성분의 동족 및 비-동족 쌍, 예컨대 감마-용혈소, HIgAB, HIgCB, LukSF, LukED, LukGH, LukS-HlgB, LukSD, HIgA-LukD, HIgA-LukF, LukG-HlgA, LukEF, LukE-HlgB, HIgC-LukD 또는 HIgC-LukF를 비롯한 PVL 독소 및 PVL-유사 독소를 포함하는 것으로 알려진다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"은 화합물, 예컨대 핵산 분자 또는 항체의 적어도 50% (w/w), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 포함하는 제조물을 지칭할 것이다. 순도는 그 화합물에 적합한 방법에 의해 측정된다 (예컨대, 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, HPLC 분석 등).
본 발명의 항체 또는 면역원과 같은 화합물의 "효과적인 양" 또는 "충분한 양"이라는 용어는 어느 하나와 호환적으로 본 명세서에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은, 개체에 투여될 때 임상 결과를 비롯한 유익한 또는 바람직한 결과를 초래하기에 충분한 품질 또는 활성이고, 그로써 효과적인 양 또는 이의 동의어는 그것이 적용되는 문맥에 좌우된다.
효과적인 양은 이러한 질환 또는 장애를 치료, 예방 또는 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미하는 것으로 의도된다. 질환의 문맥에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 치료학적 유효량은 구체적으로 에스 . 아우레우스 또는 에스 . 아우레우스 발병의 억제로부터 이득을 보는 질환 또는 병태를 치료하고, 조절하고, 약화시키고, 반전시키거나 또는 이에 영향을 주기 위해 사용된다.
이러한 효과적인 양에 상응할 화합물의 양은 소정의 약물 또는 화합물, 약제학적 제형, 투여 경로, 질환 또는 장애의 유형, 처리되는 개체 또는 숙주의 정체성 등과 같은 다양한 인자에 의존적으로 달라질 것이지만, 그럼에도 불구하고 통상의 기술자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역원은 에스 . 아우레우스 감염의 개시를 예방적으로 억제하고, 또는 에스 . 아우레우스 감염, 특히 난치성으로 알려지거나, 특정 개체의 경우에 다른 조합 항생제 용법을 이용한 치료에 불응인 것으로 판명된 MRSA와 같은 에스. 아우레우스 감염을 치료적으로 처리하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 치료학적 유효량은, 예컨대 이를 필요로 하는 인간 환자에 제공되는 바와 같은 치료학적 유효량은, 더 높은 용량이 예컨대 급성 질환 병태를 치료하기 위해 지시될 수 있지만, 구체적으로 0.5-50 mg/kg, 바람직하게는 5-40 mg/kg의 범위, 더욱 더 바람직하게는 최대 20 mg/kg, 최대 10 mg/kg, 최대 5 mg/kg일 수 있다.
더욱이, 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 이용한 개체의 치료 또는 예방 섭생은 단일 투여로 이루어질 수 있고, 또는 대안적으로 일련의 적용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 적어도 1년에 1회, 적어도 6개월에 1회 또는 적어도 한달에 1회 투여될 수 있다. 그러나, 다른 실시양태에서, 항체는 소정의 처리를 위해 약 매주 1회 내지 약 매일 투여로 개체에 투여될 수 있다. 처리 기간의 길이는 질환의 중증도, 급성 또는 만성 질환 여부, 환자의 연령, 항체 형태의 농도 및 활성과 같은 다양한 인자에 좌우된다. 치료 또는 예방에 사용하기에 효과적인 투여량은 특정 치료 또는 예방 처방 동안에 걸쳐서 증가 또는 감소할 수 있음이 또한 인식될 것이다. 투여량의 변화가 일어나고 당해 분야에 공지된 표준 진단 분석에 의해 자명해질 수 있다. 일부 사례에서, 만성 투여가 요구될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 면역원의 효과적인 양은, 예컨대 에스 . 아우레우스 감염과 연관된 질환 병태가 발병할 위험에 처한 환자에게 제공되는 바와 같은 효과적인 양은 구체적으로 1-20 mg/kg 용량의 범위일 수 있다.
예를 들어, 면역원은 특정 시간단위 내에서, 에스 . 아우레우스 감염에 대해 장기간 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 초회-자극 면역접종 처방에 따라서, 제1 용량에 이어 1회 이상의 추가접종 용량(들)로서 투여될 수 있다. 바람직한 예방접종 일정은 3회 용량, 예컨대 0일째 제1 용량, 5-40일째 제2 용량, 10-100일째 제3 용량, 바람직하게는 0, 28 및 90일째의 투여를 포함할 것이다. 바람직한 가속 일정에 따르면, 투여는 0, 7 및 14일째일 수 있다. 가속 일정은, 예컨대 예정된 수술이 잡혀 있는 환자에 대한 예방을 위해 지시될 수 있다. 일반적으로 인산염 또는 수산화물과 같은 백반 (alum)이 애주번트로 사용된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 제공된 도면에 열거된 바와 같은 예시적인 항체, 및 특히 VH 및 VL 아미노산 서열에 의해 형성되거나, 아니면 도 2의 HC 및 LC 아미노산 서열에 의해 형성된 특이적 결합 부위, 또는 이러한 VH/VL 도메인에 의해 형성된 결합 부위를 특징으로 하는 모체 항체와, 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 변형체를 포함하는, 추가적인 항체 변형체를 제공한다. 이러한 항체는, 예컨대 모체 항체의 각각의 CDR 또는 항체 서열을 변형시켜 수득된 기능적 활성 변형체 항체일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 항체 서열은, 예컨대 점 돌연변이에 의해 변화에 적용되는 "모체" 서열이 고려된다.
예시적인 모체 항체가 하기의 실시예 항목 및 도 1 및 2에 기술된다. 예컨대, #AB-29, #AB-30, #AB-31, #AB-32, #AB-33, #AB-34, #AB-35, 및 #AB-36으로 명명된 항체가 하나 이상의 변형된 CDR 서열을 갖는 기능적 활성 CDR 변형체, 및 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열과 같은 하나 이상의 변형된 FR 서열, 또는 불변 도메인 서열, 및/또는 하나 이상의 변형된 CDR 서열을 갖는 기능적 활성 항체 변형체를 생산하기 위한 모체 항체로 사용된다. 돌연변이화에 의해 모체 항체로부터 유래된 변형체 항체가 하기에 예시된다 (도 1 참조). 이들 변형체 항체는 표적 항원에 결합하고, 그로써 기능적으로 활성인 것으로 고려된다. 또한, 기능적으로 활성인, 예컨대 각각의 FR 또는 CDR 서열 내 변형을 갖는 변형체 VH 또는 VL 도메인 또는 변형체 HC 또는 LC 쇄가 사용될 수 있음이 가능하다. 본 명세서에 기술된 항체의 FR 또는 CDR 서열의 일부가 다른 항체, 예컨대 도 1에 열거된 항체의 것들과 교환될 수 있음이 또한 가능하다.
구체적으로, #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 임의의 항체 또는 이의 임의의 기능적 활성 변형체는, 예컨대 IgG 항체를 생산하기 위해, 선택적으로 추가의 면역글로불린 서열과 함께, 재조합 수단에 의해 본 명세서에 제공된 바와 같은 서열을 이용하여 제조될 수 있다.
추가의 항체 변형체가 실행 가능한데, 이는 동일한 결합 부위를 포함한다. 구체적으로, 도 2의 항체의 가변 영역, 또는 적어도 하나의 CDR 서열, 바람직하게는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 CDR 서열, 또는 기능적으로 활성인 이의 CDR 변형체를 포함하는 항체가 제공된다. 더욱 구체적으로, 도 2에 제공된 서열을 특징으로 하는, #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체가 제공된다. 이들 항체는, 예컨대 이들의 친화도, 안정성 또는 제조성을 향상시키기 위하여 기능적 활성 항체 변형체를 조작하는데 특히 유용하다.
특정 측면에서, 본 발명은 이러한 변형체 항체, 바람직하게는 단일클론 항체, 가장 바람직하게는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 인간 항체를 제공하고, 여기서 임의의 중쇄 또는 VH 가변 영역 또는 각각의 CDR은, 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의해, #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체의 하나인 모체 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 이러한 기능적 활성 변형체 항체, 바람직하게는 단일클론 항체, 가장 바람직하게는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 인간 항체를 제공하고, 여기서 임의의 경쇄 또는 VL 가변 영역 또는 각각의 CDR은, 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의해, #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체의 하나인 모체 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 또한 이러한 기능적 활성 변형체 항체, 바람직하게는 단일클론 항체, 가장 바람직하게는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 인간 항체를 제공하고, 여기서 임의의 중쇄 및 경쇄, 또는 VH/VL 가변 영역, 또는 각각의 CDR은, 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의해, #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 항체의 하나인 모체 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 또한, 상기의 모체 항체로부터 유래된 바와 같은, 가변 서열 및/또는 CDR 서열과 같은 각각의 결합 서열을 포함하는 이러한 변형체 항체를 제공하고, 여기서 결합 서열 또는 CDR은 모체 항체로부터 유래된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 변형체는 기능적 활성 변형체이다.
구체적으로, 기능적 활성은 LukGH 복합체에 결합하는 특이성 및 친화도에 의해, 선택적으로는, 예를 들어 각각의 모체 항체와 동일한 에피토프 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합함으로써, 임의의 개별적 LukG 또는 LukH 항원의 결합에 비해 LukGH 복합체의 선호적 결합에 의해 결정된다.
만약 항체가 교차-경쟁하여 단 하나의 항체만이 소정의 시점에서 에피토프에 결합할 수 있다면, 즉 한 항체가 다른 항체의 결합을 방지하거나 그의 효과를 조절한다면, 이들 항체는 "동일한 에피토프에 결합하고" 또는 "동일한 결합 부위를 포함하고" 또는 "실질적으로 동일한 결합" 특성을 갖는 것이라고 한다.
항체와 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "경쟁하다" 또는 "교차-경쟁하다"는 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합 결과가 제2 항체의 부재 시 제1 항체의 결합에 비해 제2 항체의 존재 시 검출 가능하게 감소되도록, 제1 항체, 또는 그의 항원-결합 부분이 제2 항체, 또는 그의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 그의 에피토프에 대한 제2 항체의 결합이 또한 제1 항체의 존재 시에 검출 가능하게 감소되는 대안이 있을 수 있지만, 그 경우일 필요는 없다. 즉, 제1 항체는, 제2 항체가 그의 각각의 에피토프에 제1 항체의 결합을 억제하지 않으면서, 그의 에피토프에 제2 항체의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프의 결합을 동일하거나, 더 높거나, 더 낮은 수준으로, 검출 가능하게 억제하는 경우, 이들 항체는 이들 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁한다"라고 말한다. 경쟁하는 및 교차-경쟁하는 항체 둘 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서 경쟁은, 예컨대 실시예 항목에서 기술되는 바와 같은, 경쟁 ELISA 분석 또는 ForteBio 분석에 의해 결정되는 바와 같이 약 30%보다 더 큰 상대적 억제를 의미한다. 특정 문맥 내, 예컨대 경쟁 분석이 에스 . 아우레우스의 부가적 또는 다른 독소의 결합의 의도된 기능을 갖도록 고안된 새로운 항체를 선별 또는 스크리닝하는데 사용되는 경우에, 적합한 수준의 경쟁의 기준으로서 상대적 억제의 더 높은 문턱값을 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체가 충분히 경쟁적인 것으로 고려되기 전에, 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 심지어 적어도 100%의 상대적 억제가 검출되는 경쟁적 결합에 대한 기준을 설정할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일 측면에서 본 발명은, 예컨대 LukGH 복합체 또는 헤테로이량체에의 결합에 대해 #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 임의의 항체와 경쟁하는 능력을 특징으로 하는 항체 분자를 제공한다.
본 발명의 바람직한 항체는 고 친화도, 특히 높은 개시 및/또는 낮은 종료 속도, 또는 높은 결합 친화력을 갖고 상기 개별적 항원에 결합한다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 항체의 농도 측면에서 특정되는데, 그 농도에서 항원 결합 부위의 절반이 점유되고, 이는 해리 상수 (Kd, 또는 KD)로 알려져 있다. 일반적으로 결합제는 Kd<10-8 M, 바람직하게는 Kd<10-9 M을 갖는 높은 친화도 결합제로 고려되고, 더욱 더 바람직하게는 Kd<10-10 M이다.
여전히, 특히 바람직한 실시양태에서, 개별적 항원 결합 친화도는, 예컨대 적어도 2개의 항원에 결합하는 경우, 예컨대 10-6 미만 및 최대 10-8 M의 Kd를 갖는, 중등 친화도이다.
중등 친화도 결합제가, 바람직하게는 필요에 따라 친화도 성숙 과정과 함께, 본 발명에 따라 제공될 수 있다.
친화도 성숙은 그에 의해 표적 항원에 대해 증가된 친화도를 갖는 항체가 생산되는 과정이다. 당해 분야에 이용가능한 친화도 성숙 라이브러리를 제조하고/하거나 이용하는 임의의 하나 이상의 방법이 본 명세서에 기술된 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서 친화도 성숙된 항체를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 랜덤 돌연변이화, 세균성 변이유발 균주 계대배양, 부위-지정 돌연변이화, 돌연변이 핫스팟 표적화 (mutational hotspots targeting), 긴축 (parsimonious) 돌연변이화, 항체 셔플링 (shuffling), 경쇄 셔플링, 중쇄 셔플링, CDR1 및/또는 CDR1 돌연변이화와 같은 예시적인 이러한 친화도 성숙 방법 및 용도, 및 본 명세서에 기술된 본 발명의 다양한 실시양태에 따라서 방법 및 용도를 실시하는데 적용 가능한 친화도 성숙 라이브러리를 생산하고 사용하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679] 에 기술된 것들을 포함한다.
아미노산 돌연변이화를 포함하거나 또는 면역글로불린 유전자 분절 내 체세포 돌연변의 결과로서 항체의 구조적 변화를 이용해, 항원에 대한 결합 부위의 변형체가 생산되고 더 높은 친화도에 대해 선별된다. 친화도 성숙된 항체는 모체 항체보다 수배 로그 더 높은 친화도를 나타낼 수 있다. 단일 모체 항체가 친화도 성숙에 적용될 수 있다. 대안적으로 표적 항원에 대해 유사한 결합 친화도를 갖는 항체의 풀 (pool)이 친화도 성숙된 단일 항체 또는 이러한 항체의 친화도 성숙된 풀을 수득하기 위해 달라지는 모체 구조로 고려될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 바람직한 친화도 성숙된 변형체는 결합 친화도에 있어 적어도 2배 증가, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 또는 바람직하게는 적어도 100배 증가를 나타낸다. 친화도 성숙은 모체 분자의 각각의 라이브러리를 이용하고, 또한 결합 친화도 Kd<10-8 M의 특이적 표적 결합 특성을 갖는 본 발명의 항체를 수득하기 위하여 중등 결합 친화도를 갖는 항체를 이용하는 선발 캠페인의 과정에 이용될 수 있다. 대안적으로, 친화도는 10-9 M 미만, 바람직하게는 10-10 M 미만 또는 심지어 10-11 M 미만, 가장 바람직하게는 피코몰 범위의 Kd에 상응하는 높은 값을 수득하기 위하여 본 발명에 따른 항체의 친화도 성숙에 의해 더욱 더 증가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 결합 친화도는 친화도 ELISA 분석에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 결합 친화도는 BIAcore, ForteBio 또는 MSD 분석에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 결합 친화도는 역학적 방법에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 결합 친화도는 평형/용액 방법에 의해 결정된다.
식세포 효과기 세포는 보체의 활성화를 이용하는 또 다른 경로를 통해 활성화될 수 있다. 미생물의 표면 항원에 결합하는 항체는 이들의 Fc 영역을 이용해 보체 캐스케이드의 첫 번째 성분을 유인하고 "전통적인" 보체 시스템의 활성화를 개시한다. 이는 식세포 효과기 세포의 자극을 초래하고, 궁극적으로 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 표적을 사멸한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 표준 ADCC 또는 CDC 분석에서 측정되는 바와 같이 면역-효과기 세포의 존재 하에서 세포독성 활성을 갖는다. 대조군에 비해 세포용해의 비율에 있어 유의미한 증가가 있는 경우, ADCC 또는 CDC 분석 중의 것에 의해 결정된 바와 같이, 세포독성 활성이 본 발명의 항체에 대해 나타날 수 있다. ADCC 또는 CDC와 관련된 세포독성 활성은 바람직하게는 절대 백분율 증가로 측정되는데, 바람직하게는 5% 초과, 더욱 바람직하게는 10% 초과, 더욱 더 바람직하게는 20% 초과이다. 보체 고정이 구체적으로 관련될 수 있고, 이 기전은 형성된 면역 복합체의 제거에 의해 감염 부위 또는 혈액으로부터 독소를 제거할 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명의 항체는 IgG의 Fc 부분에 의해 발휘되는 면역조절 기능을 갖는다. 예컨대 말단 갈락토스 잔기 위에서, 시알릴화 (sialylation) 함량을 증가시키는 변화된 당화는 DC-SIGN 신호절단을 통해 항-염증 효과를 가질 가능성이 있다. 어쩌면 Ia, IIa 및 III Fc감마 수용체에 대한 Fc감마 수용체 IIb (억제성)의 선호적 결합은 항-염증 효과를 제공한다.
본 발명은, 예컨대 교차-반응성 발견 선발 계획에 의해, 다중 특이성을 갖는 중화 항체를 동정하기 위한 과정에 의해 수득되는, 교차-반응성 항체를 구체적으로 제공한다. 따라서, 2개 표적, 표적 A 및 B에 반응성을 나타내는 항체를 포함하는 항체 라이브러리를 표적 중 하나, 예컨대 표적 A에 대한 반응성에 대해 먼저 선발하고, 이어서 다른 표적, 예컨대 표적 B에 대한 반응성에 대해 선발한다. 각각의 연속적인 선발 회차는 두 표적에 대한 수득된 풀의 반응성 강도를 강화한다. 따라서, 이 방법은 2개의 상이한 표적에 대해 지시된 교차-반응성, 및 병원체를 교차-중화하는 가능성을 갖는 항체를 동정하는데 특히 유용하다. 본 방법은 부가적인 표적(들)에 대한 부가적인 회차의 농축에 의해, 추가의 표적에 대해 반응성을 나타내는 항체를 동정하도록 확장될 수 있다.
일부 경우에서, 교차-반응성 항체는 단일 항원에 대한 스크리닝을 통해 나타난다. 교차-반응성 클론을 분리할 가능성을 증가시키기 위하여 다중 항원에 대해 점진적으로 스크리닝함으로써 다중 선택적 압력을 부가할 수 있다. 특별한 mAb 선발 전략은 양자 택일적 방식으로 상이한 독소 성분을 이용한다. 예를 들어, 중화 LukGH mAb는 상이한 균주로부터 수득된 LukGH 복합체에 대한 결합에 대해 검사된다
도 3의 각각의 서열을 이용한 재조합 기술에 의해 생산된 재조합 독소, 또는 에스. 아우레우스 배양물 상청액으로부터 단리된 독소는 항체 라이브러리, 예컨대 효모-디스플레이 항체 라이브러리로부터 항체를 선발하는데 사용될 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Blaise L, Wehnert A, Steukers MP, van den Beucken T, Hoogenboom HR, Hufton SE Construction and diversification of yeast cell surface displayed library by yeast mating: application to the affinity maturation of Fab antibody fragments. Gene. 2004 Nov 24; 342(2): 211-8; Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997 Jun; 15(6): 553-7; Kuroda K, Ueda M. Cell surface engineering of yeast for applications in white biotechnology. Biotechnol Lett. 2011 Jan; 33(1): 1-9. doi: 10.1007/s10529-010-0403-9. Review; Lauer TM, Agrawal NJ, Chennamsetty N, Egodage K, Helk B, Trout BL. Developability index: a rapid in silico tool for the screening of antibody aggregation propensity. J Pharm Sci. 2012 Jan; 101(1): 102-15; Orcutt K.D. and Wittrup K.D. (2010), 207-233 doi: 10.1007/978-3-642-01144-3_15; Rakestraw JA, Aird D, Aha PM, Baynes BM, Lipovsek D. Secretion-and-capture cell-surface display for selection of target-binding proteins. Protein Eng Des Sel. 2011 Jun; 24(6): 525-30; US Patent No. 6,423,538; US Patent No. 6,696,251; US Patent No. 6,699,658; published PCT application publication No. WO2008118476) 참조].
어느 쪽이든, 교차-반응성은 당해 분야에 공지된 항체 최적화 방법에 의해 더욱 향상될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역글로불린 쇄의 가변 영역의 특정 영역은 경쇄 셔플링, 목적성 (destinational) 돌연변이화, CDR 아말감화 (amalgamation), 및 선택된 CDR 및/또는 골격 영역의 지정 돌연변이화를 포함하는, 하나 이상의 최적화 전략에 적용될 수 있다.
목적하는 중화능을 갖는 항체를 동정하기 위한 스크리닝 방법은 표적 세포에의 독소 결합의 억제, 이량체 또는 올리고머의 형성 억제, 기공 형성 억제, 세포 용해 억제, 사이토카인, 림포카인, 및 임의의 염증성 신호전달의 유도 억제, 및/또는 동물에 대한 생체 내 효과 (사망, 용혈, 과도한 염증, 장기 부전)의 억제일 수 있다. 반응성은, 예컨대 표준 분석을 이용하여, 목적하는 독소에의 직접 결합을 토대로 평가될 수 있다.
일단 목적하는 특성을 갖는 중화 또는 교차-중화 항체가 동정되었다면, 이 항체에 의해 인식되는 유력한 에피토프 또는 에피토프들이 결정될 수 있다. 에피토프 맵핑 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Epitope Mapping: A Practical Approach, Westwood and Hay, eds., Oxford University Press, 2001]에 기술되어 있다.
에피토프 맵핑은 그에 항체가 결합하는 에피토프의 동정을 고려한다. 항체-항원 복합체의 결정학 분석, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석, 및 합성 펩티드-기반 분석을 포함하는, 단백질 상의 에피토프 위치를 결정하기 위해 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법이 있다. 참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합"하는 항체는 본 명세서에서 하기 방식으로 이해된다. 2개의 항체가 동일한 에피토프 또는 입체적으로 중첩되는 에피토프를 인식하는 경우, 이들 항체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 언급된다. 2개의 항체가 동일하거나 입체적으로 중첩되는 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법이 경쟁 분석으로서, 이는 표지된 항원 또는 표지된 항체 중의 것를 사용하여, 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있다. 일반적으로, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정되고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력이 방사능 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다.
일단 목적하는 중화능 또는 교차-중화능을 갖는 항체가 동정되면, 항체 단편을 포함하는 이러한 항체는, 예를 들어 하이브리도마 기술 또는 재조합 DNA 기술을 비롯한, 당해 분야에 잘 알려진 방법에 의해 생산될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 숙주 동물, 예컨대 햄스터가 면역접종을 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역접종된다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역접종될 수 있다. 그 후에 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양물 배지는 항원에 대해 지시된 단일클론 항체의 생산에 대해 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관 내 결합 분석, 예컨대 방사면역분석 (RIA) 또는 효소-연계 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정된다.
재조합 단일클론 항체는 요구되는 항체 쇄를 암호화하는 DNA를 단리하고, 잘 알려진 재조합 발현 벡터, 예컨대 본 발명의 플라스미드 또는 항체 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트(들)를 사용하여, 발현을 위한 코딩 서열로 재조합 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합 숙주 세포는 상기에 기술된 것들과 같이, 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
특정 측면에 따르면, 뉴클레오티드 서열은 항체를 인간화하거나 또는 친화도, 또는 항체의 다른 특성을 개선하기 위한 유전적 조작을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 만약 항체가 인간에서 임상 시험 및 치료에 사용된다면, 불변 영역은 면역 반응을 회피하기 위해 인간 불변 영역과 더더욱 유사하게 조작될 수 있다. 표적 독소에 대한 더 높은 친화도 및 에스. 아우레우스에 대한 더 높은 효능을 달성하기 위하여 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항체에 이루어질 수 있고 여전히 표적 독소에 대한 그의 결합능을 유지할 수 있음이 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
다양한 수단에 의한 항체 분자의 생산이 일반적으로 잘 이해된다. 예를 들어, 미국특허 제6331415호 (Cabilly 등)는 중쇄 및 경쇄가 단일 세포에서 단일 벡터로부터 또는 2개의 별개의 벡터로부터 동시에 발현되는 항체의 재조합적 생산 방법을 기술한다. Wibbenmeyer 등 (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191-202) 및 Lee 및 Kwak (2003, J. Biotechnology 101: 189-198)은 E. coli의 개별 배양에서 발현된 플라스미드를 이용하여, 개별적으로 생산된 중쇄 및 경쇄로부터의 단일클론 항체의 생산을 기술한다. 항체의 생산과 관련된 다양한 다른 기술이, 예컨대 문헌 [Harlow, et al., Antibodies: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]에 제공된다.
바람직하다면, 본 발명의 항체, 예컨대 #AB-30-3, #AB-31, #AB-32-6, #AB-34, #AB-34-6, #AB-30-8, #AB-32-9, #AB-34-14, 또는 #AB-34-15로 명명된 임의의 항체의 서열을 분석하고, 그 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식용 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내 벡터에 유지될 수 있고 숙주 세포는 그 후에 증폭되고 이후 사용을 위해 동결될 수 있다. 세포 배양물에서 재조합 단일클론 항체의 생산은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체의 생산을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 에피토프, 또는 본 발명의 이러한 에피토프를 포함하는 분자의 생산을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 그러나, 본 발명의 에피토프는 또한 예컨대 당해 분야에 잘 알려진 임의의 합성 방법을 통해, 합성적으로 생산될 수 있다.
항체 또는 에피토프를 암호화하는 핵산은 임의의 적합한 특성을 가질 수 있고 임의의 특징 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체 또는 에피토프를 암호화하는 핵산은 DNA, RNA, 또는 이들의 하이브리드 형태일 수 있고, 비-자연 발생적인 염기, 변형된 골격, 예컨대 핵산의 안정성을 촉진하는 포스포로티오에이트 골격, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 핵산은 표적 숙주 세포(들)에서 목적하는 발현, 복제, 및/또는 선발을 촉진하는 특징을 포함하는, 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 플라스미드 내에 유리하게 통합될 수 있다. 이러한 특징의 예시에는 복제 성분 기원, 선발 유전자 성분, 프로모터 성분, 인핸서 요소 성분, 폴리아데닐화 서열 성분, 종결 성분 등이 포함되고, 이의 다수의 적합한 예시가 알려져 있다.
본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 구조물을 추가로 제공한다. 이들 재조합 구조물은 임의의 기술된 항체를 암호화하는 DNA 분자가 삽입된, 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터와 관련하여 사용된다.
단일클론 항체는 배양 중인 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산하는 임의의 방법을 이용하여 생산된다. 단일클론 항체를 제조하는 적합한 방법의 예시에는 Kohler 등 (1975, Nature 256: 495-497)의 하이브리도마 방법 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법 (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; 및 Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63)이 포함된다.
나아가 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 면역원 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이들 약학적 조성물은 일시 주사 또는 주입으로서 또는 연속 주입에 의해 본 발명에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 투여 수단을 용이하게 하는데 적합한 약학적 담체가 당해 분야에 잘 알려져 있다.
약학적으로 허용가능한 담체에는 일반적으로 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 관련된 조성물 또는 조합과 생리학적으로 혼화성인 임의의 모든 적합한 용액, 분산 매질, 코팅제, 항생제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약학적으로 허용가능한 담체의 추가의 예시에는 멸균수, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 임의의 조합이 포함된다.
이러한 일 측면에서, 항체는 바람직한 투여 경로에 적합한 하나 이상의 담체와 조합될 수 있고, 항체는, 예컨대 락토스, 수크로스, 전분, 알카노산의 셀룰로스 에스테르, 스테아르산, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 옥사이드, 인산 및 황산의 나트륨염 및 칼슘염, 아카시아, 젤라틴, 소듐 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올 중의 것와 혼합될 수 있고, 선택적으로 추가로 통상적인 투여를 위해 정제로 만들어지거나 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 항체는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드 용액, 에탄올, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 참기름, 트라가칸쓰 검, 및/또는 다양한 완충제에 용해될 수 있다. 기타 담체, 애주번트, 및 투여 방식이 약학적 분야에 잘 알려져 있다. 담체는 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 단독 또는 왁스와 함께와 같이 서방출 재료 또는 시간 지연 재료, 또는 당해 분야에 잘 알려진 다른 재료를 포함할 수 있다.
추가적인 약학적으로 허용가능한 담체가 당해 분야에 알려져 있고, 예컨대 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]에 기술되어 있다. 액체 제형은 용액, 에멀젼 또는 현탁액일 수 있고 현탁제, 안정화제, 계면활성제, 방부제 및 킬레이트화제와 같은 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역원 및 하나 이상의 치료학적 활성제가 제제화된 약학적 조성물이 고려된다. 본 발명의 항체 또는 면역원의 적합한 제형은 바람직한 수준의 순도를 갖는 상기 면역글로불린을 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써, 동결건조 제형 또는 수성 용액의 형태로 저장을 위해 제조된다. 생체 내 투여를 위해 사용되는 제형은 특히 멸균이고, 바람직하게는 멸균 수성액의 형태이다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과 또는 다른 방법에 의해 용이하게 달성된다. 본 명세서에 기술된 항체 및 다른 치료학적 활성제가 또한 면역리포좀으로 제제화될 수 있고/있거나 미소캡슐 내로 포획될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역원을 포함하는 약학적 조성물의 투여는, 경구, 피하, 정맥내, 비강내, 이내 (intraotically), 경피, 점막, 국소 (예컨대, 겔, 연고, 로숀, 크림 등), 복막내, 근육내, 폐내 (예컨대, 흡입 기술 또는 폐 전달 시스템을 이용함), 질내, 비경구, 직장, 또는 안구내를 비롯한 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
비경구 투여에 사용되는 바와 같은 예시적인 제형에는 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 것들, 예를 들어, 멸균 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 면역원은, 예컨대 질환 개질 또는 예방 단일요법으로서 개체에 투여되는 유일한 치료학적 활성제이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 면역원은, 칵테일이 질환 개질 또는 예방 조합 요법으로서 개체에 투여되는 하나 이상의 치료학적 활성제를 포함하도록, 에스 . 아우레우스를 표적하기 위해, 예컨대 혼합물 또는 키트의 일부로서 조합되는, 칵테일로 추가의 항체 또는 면역원과 조합된다.
대안적으로, 본 발명의 항체 또는 면역원은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 표준 처치, 예컨대 항생제, 염증의 스테로이드 및 비-스테로이드 저해제, 및/또는 항균제 또는 항염증제를 이용하는 기타 항체 기반 요법을 포함하는, 하나 이상의 다른 치료제 또는 예방제와 조합되어 투여된다.
조합 요법은 특히, 예컨대 MRSA 감염을 치료하기 위해 사용되는 바와 같은, 표준 섭생을 이용한다. 이는, 예컨대 타이게사이클린 (tygecycline), 리네졸린, 메티실린 및/또는 반코마이신과 같은 항체제를 포함한다.
조합 요법에서, 항체는 혼합물로서, 또는 하나 이상의 다른 치료 섭생과 수반되어, 예컨대 수반 요법 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다.
일부 사례에서 면역원의 예방적 투여가 본 발명의 면역원을 포함하는 백신, 즉 단가 백신을 이용할 수 있다. 그러나, 동일하거나 상이한 표적 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위하여 상이한 면역원을 포함하는 다가 백신이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체, 면역원 또는 각각의 약학적 제제의 생물학적 특성은 세포, 조직, 및 전체 유기체 실험에서 생체 외로 분석될 수 있다. 당해 분여에 알려진 바와 같이, 약물은 종종 질환 또는 질환 모델에 대한 약물의 치료의 효능을 측정하기 위하여, 또는 약물의 약물동태학, 약력학, 독성, 및 기타 특성을 측정하기 위하여, 이로 제한되는 것은 아니지만, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 및 원숭이를 비롯한 동물에서 생체 내로 시험된다. 동물은 질환 모델로서 언급될 수 있다. 치료제는 종종, 이로 제한되는 것은 아니지만, 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스, 및 형질전환 마우스 [넉인 (knockin) 및 넉아웃 (knockout) 포함]를 비롯한 마우스에서 시험된다. 이러한 실험은 능동 또는 수동 면역요법 시 적합한 반감기, 효과기 기능, (교차-) 중화 활성 및/또는 면역 반응을 갖는 치료제 또는 예방제로서 사용되는 항체의 가능성을 결정하기 위한 유의미한 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물이 시험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간에 대한 이들의 유전적 유사성으로 인해, 영장류, 원숭이가 적합한 치료적 모델일 수 있고, 이에 대상 제제 또는 조성물의 효능, 독성, 약물동태학, 약력학, 반감기, 또는 다른 특성을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 인간에서의 시험이 약물로서의 승인을 위해 궁극적으로 필요하고, 따라서 물론 이러한 실험이 고려된다. 따라서, 본 발명의 항체, 면역원 및 각각의 약학적 조성물은 이들의 치료적 또는 예방적 효능, 독성, 면역원성, 약물동태학, 및/또는 다른 임상적 특성을 결정하기 위해 인간에서 시험될 수 있다.
본 발명은 또한 진단 목적을 위해, 예컨대 생물학적 유체 시료에서 면역시약 또는 표적으로서 독소 또는 항체의 농도를 검출하고 정량적으로 측정하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 대상 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 체액과 같은 생물학적 시료에서 독소 또는 에스 . 아우레우스 감염을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 면역침전 분석 및 효소-연계 면역흡착 분석 (ELISA)과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 체액에는 조직 추출물, 소변, 혈액, 혈청, 변 및 점액과 같은 개체의 생물학적 시료가 포함된다.
일 실시양태에서, 본 방법은 본 발명의 항체에 의해 표적되는 적어도 하나의 독소와 같은 표적과 특이적으로 복합체를 형성하는 특정 유형의 항체 단편의 과량을 고체 지지체와 접촉시키고, 항체가 이 고체 지지체의 표면에 부착하는 것을 허용하도록 조절하는 것을 포함한다. 그에 항체가 부착된 결과의 고체 지지체를 그 후에 생물학적 유체 내 표적이 항체에 결합하여 표적-항체 복합체를 형성하도록 생물학적 유체 시료와 접촉시킨다. 복합체는 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 대안적으로, 표적 또는 항체 중의 것가 복합체의 형성 전에 표지될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 마커 (표지)가 항체에 접합될 수 있다. 그 후에 복합체는 검출되고 정량적으로 측정되어 생물학적 유체 시료 내 표적의 농도를 검출하고 정량적으로 측정할 수 있다.
특정 적용을 위해, 본 발명의 항체는 유기 분자, 효소 표지, 방사능 표지, 유색 표지, 형광 표지, 색소 표지, 발광 표지, 합텐, 딕옥시게닌, 비오틴, 금속 착체, 금속, 콜로이드 골드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지 또는 리포더 분자에 접합된다. 표지 또는 리포터 분자에 접합된 항체는, 예를 들어, 예컨대 에스 . 아우레우스 감염 또는 이와 연관된 질환 병태를 진단하기 위한, 분석 시스템 또는 진단 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 결합 분석 (예컨대, ELISA) 및 결합 연구에서 상기 접합의 단순 검출을 가능케 하는 다른 분자에 접합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 항체에 더하여, 다양한 진단제 또는 치료제를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 이러한 사용설명서는, 예를 들어 키트에 포함된 기구 상에, 예컨대 질환을 진단하기 위해 각각의 독소(들)를 측정하기 전에 세포 및/또는 단백질을 함유하는 분획을 분리하는 것과 같이 진단 목적을 위해 생물학적 시료를 준비하기 위한 도구 또는 장치 상에 제공될 수 있다. 유리하게는, 이러한 키트는 본원에 기술된 다양한 진단 방법의 하나 이상에서 사용될 수 있는 항체 및 진단제 또는 시약을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 키트는 가까운 시일 내 투여를 위해 주사가능한 조성물을 형성하는데 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체(들)와 조합하여 항체, 예컨대 동결건조된 형태의 항체를 포함한다.
구체적으로, #AB-29로 명명된 항체는 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 하는데, 여기서 HC 서열은 서열번호: 147로 확인되고, LC 서열은 서열번호: 148로 확인된다. 특히, VH CDR 서열은 CDR1 서열번호: 2, CDR2 서열번호: 4, 및 CDR3 서열번호: 6으로 확인되고, VH FR 서열은 FR1 서열번호: 1, FR2 서열번호: 3, FR3 서열번호: 5, 및 FR4 서열번호: 7로 확인된다. VL CDR 서열은 CDR4 서열번호: 9, CDR5 서열번호: 11, 및 CDR6 서열번호: 13으로 확인되고, VL FR 서열은 FR1 서열번호: 8, FR2 서열번호: 10, FR3 서열번호: 12, 및 FR4 서열번호: 14로 확인된다.
구체적으로, #AB-30으로 명명된 항체는 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 하는데, 여기서 HC 서열은 서열번호: 149로 확인되고, LC 서열은 서열번호: 150으로 확인된다. 특히, VH CDR 서열은 CDR1 서열번호: 26, CDR2 서열번호: 28, 및 CDR3 서열번호: 30으로 확인되고, VH FR 서열은 FR1 서열번호: 25, FR2 서열번호: 27, FR3 서열번호: 29, 및 FR4 서열번호: 31로 확인된다. VL CDR 서열은 CDR4 서열번호: 32, CDR5 서열번호: 33, 및 CDR6 서열번호: 35로 확인되고, VL FR 서열은 FR1 서열번호: 18, FR2 서열번호: 20, FR3 서열번호: 34, 및 FR4 서열번호: 14로 확인된다.
#AB-30-3, 및 #AB-30-8으로 명명된 항체 변형체는 #AB-30의 기능적 활성 변형체이고 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열, 구체적으로 각각의 VH 또는 HC 서열, 및 추가로 도 1에 기술된 바와 같은 FR 및 CDR 서열을 포함하는, VL 또는 LC 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 한다.
구체적으로, #AB-31로 명명된 항체는 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 하는데, 여기서 HC 서열은 서열번호: 155로 확인되고, LC 서열은 서열번호: 156으로 확인된다. 특히, VH CDR 서열은 CDR1 서열번호: 47, CDR2 서열번호: 49, 및 CDR3 서열번호: 51로 확인되고, VH FR 서열은 FR1 서열번호: 46, FR2 서열번호: 48, FR3 서열번호: 50, 및 FR4 서열번호: 52로 확인된다. VL CDR 서열은 CDR4 서열번호: 53, CDR5 서열번호: 21, 및 CDR6 서열번호: 54로 확인되고, VL FR 서열은 FR1 서열번호: 18, FR2 서열번호: 20, FR3 서열번호: 22, 및 FR4 서열번호: 14로 확인된다.
구체적으로, #AB-32로 명명된 항체는 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 하는데, 여기서 HC 서열은 서열번호: 157로 확인되고, LC 서열은 서열번호: 158로 확인된다. 특히, VH CDR 서열은 CDR1 서열번호: 71, CDR2 서열번호: 72, 및 CDR3 서열번호: 73으로 확인되고, VH FR 서열은 FR1 서열번호: 1, FR2 서열번호: 3, FR3 서열번호: 5, 및 FR4 서열번호: 74로 확인된다. VL CDR 서열은 CDR4 서열번호: 75, CDR5 서열번호: 41, 및 CDR6 서열번호: 76으로 확인되고, VL FR 서열은 FR1 서열번호: 18, FR2 서열번호: 20, FR3 서열번호: 34, 및 FR4 서열번호: 14로 확인된다.
#AB-32-6, 및 #AB-32-9로 명명된 항체 변형체는 #AB-32의 기능적 활성 변형체이고 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열, 구체적으로 각각의 VH 또는 HC 서열, 및 추가로 도 1에 기술된 바와 같은 FR 및 CDR 서열을 포함하는, VL 또는 LC 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 한다.
구체적으로, #AB-33으로 명명된 항체는 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 하는데, 여기서 HC 서열은 서열번호: 163으로 확인되고, LC 서열은 서열번호: 164로 확인된다. 특히, VH CDR 서열은 CDR1 서열번호: 87, CDR2 서열번호: 88, 및 CDR3 서열번호: 89로 확인되고, VH FR 서열은 FR1 서열번호: 25, FR2 서열번호: 27, FR3 서열번호: 29, 및 FR4 서열번호: 90으로 확인된다. VL CDR 서열은 CDR4 서열번호: 92, CDR5 서열번호: 94, 및 CDR6 서열번호: 96으로 확인되고, VL FR 서열은 FR1 서열번호: 91, FR2 서열번호: 93, FR3 서열번호: 95, 및 FR4 서열번호: 14로 확인된다.
구체적으로, #AB-34로 명명된 항체는 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 하는데, 여기서 HC 서열은 서열번호: 165로 확인되고, LC은 서열번호: 166으로 확인된다. 특히, VH CDR 서열은 CDR1 서열번호: 104, CDR2 서열번호: 105, 및 CDR3 서열번호: 106으로 확인되고, VH FR 서열은 FR1 서열번호: 125, FR2 서열번호: 27, FR3 서열번호: 29, 및 FR4 서열번호: 107로 확인된다. VL CDR 서열은 CDR4 서열번호: 92, CDR5 서열번호: 94, 및 CDR6 서열번호: 108로 확인되고, VL FR 서열은 FR1 서열번호: 91, FR2 서열번호: 93, FR3 서열번호: 95, 및 FR4 서열번호: 14로 확인된다.
#AB-34-14, #AB-34-6, 및 #AB-34-15로 명명된 항체 변형체는 #AB-34의 기능적 활성 변형체이고 도 1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열, 구체적으로 각각의 VH 또는 HC 서열, 및 추가로 도 1에 기술된 바와 같은 FR 및 CDR 서열을 포함하는, VL 또는 LC 서열을 특징으로 하고, 추가로 도 2에 열거된 HC 및 LC 서열을 특징으로 한다.
도 1 또는 2에서 확인된 항체 중 임의의 항체의 추가 변형체, 예컨대 CDR 변형체 및/또는 임의의 CDR 또는 FR 서열에 돌연변이를 갖는 변형체, 특히 모체 항체의 서열을 기반으로 하고 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 변형체가 고려된다.
전술한 기재는 하기 실시예를 참고하여 더욱 완전히 이해될 것이다. 그러나 이러한 실시예는 단지 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 실시하는 방법을 대표하는 것일 뿐 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예
실시예
1: 고 친화도로 결합하는
LukGH
mAb의
생성
재조합 독소의 생성:
방법: 8종의 에스 . 아우레우스 독소 - LukH_TCH1516, LukH_MRSA252, LukH_MSHR1132, LukH_H19 LukG_TCH1516, LukG_MRSA252, LukG_MSHR1132 및 LukG_H19 - 를 개별적으로 또는 LukGH 복합체로서, E. coli Tuner DE3에서 재조합적으로 생산하였다. 성숙 단백질을 위한 독소 유전자 (SignalP 4.1 Server; http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/를 이용하여 결정됨)를 E. coli 발현을 위해 코돈 최적화하고 스타필로코커스 아우레우스 균주 USA300_TCH1516, MRSA252, MSHR1132 및 H19의 공개된 게놈 서열을 기반으로 유전자 합성에 의해 생성하였다. 개별적 LukH 및 LukG 단백질 (USA300_TCH1516, MRSA252 및 MSHR1132 변형체용)을 불용성 형태로 태그 없이 발현시키고, 봉입체로부터 분리하고, 재중첩 후 정제하였다. 재중첩된 LukH 단백질은 크기 배제 및 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 반면, 변성된 LukG 단백질은 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 후 이어서 재충접시켰고, 재충첩된 단백질을 pH 10.2 - 11.0에서 양이온 교환에 의해 추가로 정제하였다. 4종의 LukGH 복합체 (USA300_TCH1516, MRSA252, MSHR1132 및 H19 변형체)를 lukH 또는 lukG 유전자 중의 것를 보유하고, 상이한 항생제 마커를 함유하는 2종의 플라스미드를 이용한 E. coli의 동시-형질감염에 의해 형성하였다. LukG는 복합체의 금속 친화도 정제를 가능케 하는 N-말단에 NusA/His6를 갖는 융합 단백질로 발현된 반면, LukH는 비-태그된 형태로 발현되었다. 2종의 단백질이 가용성 분획에서 발견되었고 이들을 고정화 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 동시-정제하였다. NusA/His6 태그를 비-태그된, 성숙 LukGH 복합체를 제공하는 엔테로키나제를 이용해 단백분해적으로 제거하였고, 상기 복합체를 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 이 단백질을 SDS-PAGE에 의한 순도, 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단량체 상태, 및 시험관 내 독소능 분석으로 기능성에 대해 분석하였다.
동시-발현은 개별적 단백질을 안정화시켰다. 개별적 성분들이 항상 E. coli 의 불용성 분획으로 발현되는데 반해, 동시-발현된 LukGH는 가용성 분획에서 발견되었다.
SDS-PAGE는 복합체 내 LukG : LukH의 화학량론이 1:1임을 나타내었다. 용액 중의 복합체의 크기를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 정전기적 광산란 검출기 (static light scattering detector)가 장착된 DynoPro NanoStar (Wyatt) 기구를 사용하는 동적 광산란 (DLS) 측정을 이용하였다. 정전기적 광산란 검출기로 측정된 분자량은 이량체의 계산된 분자량인 73 kDa과 거의 (excellent) 일치한다.
항체 선발을 위해, 단백질을 제조사의 지침에 따라서 아미노 반응성 시약인 설포-NHS-LC 비오틴 (Thermo-Scientific)으로 표지하여, 1 - 2.5 비오틴/단백질의 비오틴 수준을 양산하였다.
단일클론 항체의 선발:
독소-특이적 항체를 시험관 내 효모 선발 시스템 및 관련 방법을 이용하여 전장의 인간 IgG1 항체 라이브러리 (WO2009/036379A2; WO2010105256; WO2012009568)로부터 분리하였다. 비오틴 표지된 LukGH_TCH1516을 항체 발현 효모 세포와 다양한 농도로 인큐베이션한 후 자석 비드 선발 (Miltenyi, Biotec) 및 수회의 연속적 선발 회차에서 스트렙타비딘 2차 시약을 사용하는 형광-활성화 세포 분류 (FACS, FACSAria II, BD Biosciences)를 수행하여 독소 결합 mAb를 농축하였다. 최종 회차의 농축 후 효모를 분류하고 한천 플레이트 상에 도말한 후 서열분석 및 IgG 생산을 위해 클론을 분리하였다. 중쇄 CDR1 및 CDR2의 경쇄 셔플링 및 표적화 돌연변이에 의해 생성된 서브-라이브러리와 함께 더 낮은 농도의 독소 베이트 (baits)를 이용한 연속적 주기의 선발 회차에서 더 높은 친화도에 대한 항체의 최적화가 수행되었다.
그 후에 선발된 효모 클론으로부터 항체를 생산하고 단백질 A 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.
상이한 독소에 대한 mAb의 결합을 ForteBio Octet Red 기구 (Pall Life Sciences)를 사용하여 간섭 (interferometry) 측정법에 의해 확인하였다. 비오틴화된 항원 또는 항체를 센서 위에 고정하고, 용액 중의, 항체 Fab 단편 또는 항원의 결합 및 해리 각각 (전형적으로 70-270 nM)을 측정하였다. Fab Kd 친화도를 Sector Imager 2400 기구 (Meso Scale Discovery)를 사용하는 MSD 방법에 의해 측정하였다. 전형적으로 20 pM의 비오틴화된 항원을 실온에서 16시간 동안 다양한 농도의 Fab와 인큐베이션하였고, 비결합된 항원을 고정된 IgG에 포획하였다. 예를 들어, 또한 문헌 [Estep et al., "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning", MAbs, Vol. 5(2), pp. 270-278 (2013)] 참조.
결과:
LukGH mAb는 효모 표면에 발현된 전장의 인간 IgG1 (대략 ~ 10-10의 다양성)의 라이브러리로부터의 항원인, LukGH_TCH1516을 이용한 연속적 회차의 선별에서 발견되었다. 최종 최적화 회차로부터의 항체는 MSD Fab Kd 및 ForteBio 측정에 의해 결정되는 바와 같이, LukGH_TCH1516에 대해 높은 친화도 (< 5 pM, Fab MSD Kd로 측정된 바와 같음)를, LukG_TCH1516에 대해 적어도 20배 더 낮은 친화도를 나타내고, LukH_TCH1516에 대해서는 결합을 나타내지 않는다 (도 4). 이 항체는 또한 ForteBio에 의해 결정된 바와 같이 LukGH_TCH1516, LukGH_MRSA252, LukGH_MSHR1132 및 LukGH_H19에 대해 유사한 친화도를 나타내면서, 연구된 LukGH 변형체들 사이에서 교차-반응성이다 (도 4).
실시예
2:
LukGH
중화 활성에 대한 인간
mAb의
분석
USA300 LukGH 독소 및 MRSA252 및 MSHR1132의 변형체 독소에 대한 인간 mAb의 중화 활성을 인간 전혈로부터 분리되거나 분화된 ("호중구-유사") 인간 PMNs를 사용한 생존능 분석에서 평가하였다. HL60 세포 (ATCC CCL-240™)를 문헌 [Romero-Steiner, Clin Diagn Lab Immunol, 1997: 415]에 기술된 바와 같이, 3-5일간 DMF (N,N-디메틸포름아미드, 100 mM)를 이용해 분화시켰다. 문헌 (예컨대, Collado-Escobar, Biochem J, 1994: 553; Trayner, Leuk Res, 1998: 537; Watanabe, J Leuk Biol, 1993: 40)에 기술된 표준 방법에 따라서, 브릴리언트 바이올렛 421 접합된 항-CD11b (클론 ICRF44, BioLegend, USA) 및 PE-접합된 항-CD71 단일클론 항체 (클론 OKT9, eBioscience, USA)를 사용한 CD71 염색의 실종 및 CD11b 염색의 출연에 의해 분화를 결정하였다. 생존능 분석을 위하여, 세포를 10% FCS, L-글루타민 및 Pen/Strep이 보충된 RPMI 1640 (PAA Laboratories, Austria) (=호중구 배지)에 재-현탁하였다. 단일클론 항체를 호중구 배지로 연속 희석하고 세포 생존능을 > 80%로 감소시키는 고정된 농도 [0.69 - 4.11 nM, 사용된 세포 유형 및 LukGH 변형체에 좌우됨]에서 독소와 혼합하였다. 생존능 분석을 LukGH에 대한 항체 결합이 가능하도록 사전-인큐베이선 단계 30분 후에 개시하였다. 25,000 세포를 웰에 첨가한 후 이어서 5% CO2의 가습 대기에서, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 제조사의 지침에 따라서 세포 ATP 수준 (CellTiter-Glo® 발광 세포 생존능 분석; Promega, USA)을 측정하여 세포 생존능을 평가하였다. 독소 활성의 억제 (%)를 하기 식을 이용하여 계산하였다:
억제 (%) = [(정상 활성 - 억제된 활성) / (정상 활성)] x 100.
대조군 mAb (관련성이 없는 항원에 대해 생성됨)를 모든 분석에 포함시켰다.
결과:
> 80% 세포 용해를 유도하는 고정된 농도 (2.74 nM, 200 ng/ml)에서 재조합 LukGH_TCH1516의 예비-인큐베이션 후 0.03-208 nM mAb 농도 범위에서 호중구-유사 HL 세포에 대해 LukGH mAb의 독소 중화 활성을 측정하였다. 선택된 항체는 LukGH 세포독성을 억제하는데 매우 강력한 것으로 입증되었다. 가장 효과적인 mAb는 ≤1의 절반 최대 용해 농도 (IC50)에서 항체 대 독소의 몰비에 도달하였다. (실시예 AB-31, AB-32-6, AB-32-9, AB-34, AB-34-14, AB-34-6 및 AB-34-15가 도 5A에 나타나 있다).
다른 LukGH 서열 변형체의 교차-반응성을 검사하기 위하여, 선택된 항체를 또한 균주 MRSA252 (실시예 AB-29-2, AB-30-3, AB-31, AB-32-6, AB-33, AB-34, AB-34-15가 도 5B에 나타나 있음) 및 MSHR1132 (실시예 AB-29-2, AB-30-3, AB-31, AB-32-6, AB-33, AB-34, AB-34-15가 도 5C에 나타나 있음)의 LukGH 변형체의 중화에 대해 검사하였다. LukGH_TCH1516에 대해 나타난 바와 같이, 가장 효과적인 mAb는 MSH1132 및 MRSA252 서열 변형체를 중화하는데 매우 강력하였다.
실시예
6.
LukGH:AB
-32-9 복합체의 결정 구조를 이용한 항체의
에피토프
맵핑
/결합
LukGH 분자 내 AB-32-9 항체의 에피토프 잔기를 AB-32-9의 Fab 단편을 이용하여 복합체 내 LukGH의 결정 구조로부터 동정하였다. 에피토프는 특정 결합제, 예컨대 Fab 잔기와 접촉하게 되는 Fab-독소 경계면에서의 독소 잔기로 정의되고, 즉 임의의 이들의 수소 결합들 사이의 거리는 Pymol (PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.4 Schrodinger, LLC)에서 측정되는 바와 같이, 4.0 A보다 작거나 이와 동일하다.
도 6에 도시된 LukGH 에피토프는 LukG의 rim 도메인 (구형 표시)에서 발견되고, AB-32-9 Fab의 가변 도메인의 경쇄 (흑색 밑그림) 및 중쇄 (회색 밑그림) 둘 모두로부터의 잔기에 결합한다. 결정 구조로부터 결정된 LukG 접촉 잔기 (도 6, 흑색 구형)는 하기 아미노산이다: Asn71, Tyr73, Trp74, Asn206, Leu207, Trp208, Lys210, Asp211, Trp262, Phe267. 이들 모든 아미노산은 LukGH 변형체들 사이에서 완전히 보존된다.
실시예
7.
LukGH
:
Fab
AB-32-9 복합체의 결정 구조를 이용한
변형체
아미노산의 인
실리코
(
In
silico
) 분석
LukGH를 이용한 복합체 내 AB-32-9 Fab 단편의 결정 구조를 모든 접촉 위치에 대해서뿐만 아니라, LukGH에 대해 개선된 결합을 갖는 변형체를 예측하기 위해 Fab 접촉 잔기의 인 실리코 돌연변이를 위한 결합 에너지를 계산하는데 사용하였다.
이 구조는, 이온 및 물 분자를 제거하고, 수소를 부가하고, 가파른 경사 최소화 (steepest descent minimization)를 이용하여, 최적화하는, YASARA (Krieger E, Koraimann G, Vriend G. Increasing the precision of comparative models with YASARA NOVA--a self-parameterizing force field. Proteins. 2002; 47(3): 393-402)를 이용하여 준비되었다. 전체 결합 에너지에 대한 각 잔기의 기여를 추가의 최적화 없이 Rosetta 점수 12 함수 (Kaufmann KW, Lemmon GH, Deluca SL, Sheehan JH, Meiler J. Practically useful: what the Rosetta protein modeling suite can do for you. Biochemistry. 2010 Apr 13; 49(14): 2987-98)를 이용하여 계산하였다. 선발된 접촉 위치를 Cys 및 Pro를 제외한 모든 아미노산에 대해 변이시켰고, 각 돌연변이에 대한 결합 에너지 변화가 하기 표 2에 제공된다.
인 실리코 돌연변이는 몇몇 AB-32-9 접촉 잔기의 변화, 즉 VL CDR4에서 N7F, N7Y, S8I, Y9R이, VL CDR2에서 A1G가, VH CDR1에서 S1E, S1F, S1H, S1I, S1K, S1L, S1M, S1R, S1V, S1W, S1Y가, VH CDR2에서 S5R, S5W, S7D, S7M, S7N, S7R, Y9D, Y9H가, VH CDR3에서 R4D, R4H, M6F, M6H, H7E, H7K, H7Q, H7R이 LukGH에의 개선된 결합을 초래할 수 있음을 나타내었다. LukGH에의 결합에 영향을 미치지 않는 상대적으로 많은 개수의 돌연변이가 또한 존재하고 (ΔΔG 값<0.5), 따라서 이들 변형체는 AB-32-9와 유사한 프로파일을 나타낼 것으로 기대된다 (표 2).
Claims (34)
- LukGH 복합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 항체로서, 적어도, 표 1에 열거된 바와 같은 CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 서열 또는 이의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는, 항체.
- 제1항에 있어서, 그룹 멤버 i) 내지 viii)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
임의의 기능적 활성 CDR 변형체는 모체 CDR 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 모체 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 항체:
i)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 15의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 4의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 6의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
ii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 26, 서열번호: 36, 또는 서열번호: 38의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 28, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 또는 서열번호: 40의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 26, 서열번호: 36, 또는 서열번호: 38의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 28, 서열번호: 37, 서열번호: 39, 또는 서열번호: 40의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 30의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
iii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 47, 서열번호: 55, 서열번호: 57, 서열번호: 59, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 또는 서열번호: 64의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 49, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 65, 또는 서열번호: 66의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 모체 CDR2; 및
c) 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 모체 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 47, 서열번호: 55, 서열번호: 57, 서열번호: 59, 서열번호: 61, 서열번호: 63, 또는 서열번호: 64의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 49, 서열번호: 56, 서열번호: 58, 서열번호: 60, 서열번호: 62, 서열번호: 65, 또는 서열번호: 66의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 51의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
iv)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 71, 서열번호: 77, 서열번호: 79, 서열번호: 81, 서열번호: 83, 또는 서열번호: 85의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 72, 서열번호: 78, 서열번호: 84, 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 73의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 71, 서열번호: 77, 서열번호: 79, 서열번호: 81, 서열번호: 83, 또는 서열번호: 85의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 72, 서열번호: 78, 서열번호: 84, 또는 서열번호: 4의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 73의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
v)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 87, 서열번호: 97, 서열번호: 99, 또는 서열번호: 101의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 88, 서열번호: 98, 서열번호: 100, 또는 서열번호: 102의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 89의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 87, 서열번호: 97, 서열번호: 99, 또는 서열번호: 101의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 88, 서열번호: 98, 서열번호: 100, 또는 서열번호: 102의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 89의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
vi)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 104, 서열번호: 110, 서열번호: 112, 서열번호: 38, 서열번호: 114, 서열번호: 119, 또는 서열번호: 120의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 105, 서열번호: 109, 서열번호: 111, 서열번호: 113, 서열번호: 102, 서열번호: 115, 또는 서열번호: 121의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 106의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 104, 서열번호: 110, 서열번호: 112, 서열번호: 38, 서열번호: 114, 서열번호: 119, 또는 서열번호: 120의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 105, 서열번호: 109, 서열번호: 111, 서열번호: 113, 서열번호: 102, 서열번호: 115, 또는 서열번호: 121의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 106의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
vii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 125의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 126의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 127의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 125의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 126의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 127의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR3;
및
viii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 134의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR1; 및
b) 서열번호: 135의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR2; 및
c) 서열번호: 137의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR3;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 134의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 모체 CDR1; 또는
b) 서열번호: 135의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 모체 CDR2; 또는
c) 서열번호: 137의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 모체 CDR3. - 제2항에 있어서, 그룹 멤버 iv)의 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체이고,
a) VH CDR1의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, F, H, I, K, L, M, R, V, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 E, F, M, W 또는 Y 중의 것이고;
b) VH CDR2의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, H, L, S, T, V 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, H 또는 Y 중의 것이고;
c) VH CDR2의 위치 3에서, 아미노산 잔기는 Y, H, T 및 W로부터 선택되고;
d) VH CDR2의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 S, A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 N, R 또는 W 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 N 또는 W이고;
e) VH CDR2의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, D, F, H, K, L, M, N, R 및 W로부터 선택되고;
f) VH CDR2의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, D, E, F, N, S 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고, 더욱 우선적으로는 H이고;
g) VH CDR3의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 R, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고;
h) VH CDR3의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 G, A, F 및 Y로부터 선택되고;
i) VH CDR3의 위치 6에서, 아미노산 잔기는 M, E, F, H 및 Q로부터 선택되고, 우선적으로는 F 또는 H이고; 및/또는
j) VH CDR3의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 H, A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, K, Q, R, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 W 또는 Y인 것인, 항체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 활성 CDR 변형체는 하기중 적어도 하나를 포함하는 것인, 항체:
a) 모체 CDR 서열 내 1, 2, 또는 3개의 점 돌연변이; 또는
b) 모체 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 위치에 1개 또는 2개의 점 돌연변이. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체:
a) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 38의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 39의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 30의 CDR3 서열;
b) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 47의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 49의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 51의 CDR3 서열;
c) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 83의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 84의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 73의 CDR3 서열;
d) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 104의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 105의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열;
및
e) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 114의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 115의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 것인, 항체:
a) 도 2에 도시된 바와 같은 VH 서열 중 임의의 서열로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
b) 서열번호: 147, 서열번호: 149, 서열번호: 151, 서열번호: 153, 서열번호: 155, 서열번호: 157, 서열번호: 159, 서열번호: 161, 서열번호: 163, 서열번호: 165, 서열번호: 167, 서열번호: 169, 및 서열번호: 171로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 중쇄 (HC) 아미노산 서열;
c) 서열번호: 147, 서열번호: 149, 서열번호: 151, 서열번호: 153, 서열번호: 155, 서열번호: 157, 서열번호: 159, 서열번호: 161, 서열번호: 163, 서열번호: 165, 서열번호: 167, 서열번호: 169, 및 서열번호: 171로 이루어진 군으로부터 선택되고, VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우에는, C-말단 아미노산의 결실 및/또는 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는, 항체 중쇄 (HC) 아미노산 서열. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 열거된 바와 같은 CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 서열, 또는 이의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 경쇄 가변 영역 (VL)을 추가로 포함하는 것인, 항체.
- 제7항에 있어서, 하기 그룹 멤버 i) 내지 viii)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
임의의 기능적 활성 CDR 변형체는 모체 CDR 서열에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 모체 CDR 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인, 항체:
i)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 9 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 11, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 21의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 13, 서열번호: 17, 서열번호: 23, 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 9 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 11, 서열번호: 16, 또는 서열번호: 21의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 13, 서열번호: 17, 서열번호: 23, 또는 서열번호: 24의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
ii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 33 또는 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 35, 서열번호: 42, 서열번호: 43, 또는 서열번호: 45의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 33 또는 서열번호: 41의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 35, 서열번호: 42, 서열번호: 43, 또는 서열번호: 45의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
iii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 53, 서열번호: 67, 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 54, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 또는 서열번호: 70의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 53, 서열번호: 67, 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 21의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 54, 서열번호: 68, 서열번호: 69, 또는 서열번호: 70의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR6;
iv)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 75 또는 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 76 또는 서열번호: 86의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 75 또는 서열번호: 32의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 76 또는 서열번호: 86의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR6;
v)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 92의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 96 또는 서열번호: 103의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 92의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 96 또는 서열번호: 103의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR6;
vi)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 94 또는 서열번호: 117의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 108, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 123의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 94 또는 서열번호: 117의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 108, 서열번호: 118, 또는 서열번호: 123의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
vii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 또는 서열번호: 132의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 32의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 41의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 129, 서열번호: 130, 서열번호: 131, 또는 서열번호: 132의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6;
및
viii)
A) 하기를 포함하는 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR4; 및
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR5; 및
c) 서열번호: 140, 서열번호: 96, 서열번호: 142, 또는 서열번호: 143의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CDR6;
또는
B) 하기의 적어도 하나의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는, 항체 A의 기능적 활성 변형체인 항체:
a) 서열번호: 92 또는 서열번호: 116의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR4; 또는
b) 서열번호: 94의 아미노산 서열로 이루어진 모체 CDR5; 또는
c) 서열번호: 140, 서열번호: 96, 서열번호: 142, 또는 서열번호: 143의 아미노산 서열 중 임의의 서열로 이루어진 모체 CDR6. - 제8항에 있어서, 그룹 멤버 iv)의 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체이고,
a) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고;
b) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고;
c) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고;
d) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고;
e) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고;
f) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고; 및/또는
g) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택되는 것인, 항체 - 제7항 또는 제8항에 있어서, 도 2에 도시된 바와 같은 VL 서열 중 임의의 서열로부터 선택된 VL 아미노산 서열, 또는 서열번호: 148, 서열번호: 150, 서열번호: 152, 서열번호: 154, 서열번호: 156, 서열번호: 158, 서열번호: 160, 서열번호: 162, 서열번호: 164, 서열번호: 166, 서열번호: 168, 서열번호: 170, 및 서열번호: 172로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 경쇄 (LC) 아미노산 서열, 또는 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도를 갖는,전술한 것들 중 임의의 것의 기능적 활성 CDR 변형체를 포함하는 것인, 항체.
- 제10항에 있어서, 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체가 도 2, 그룹 4에 도시된 바와 같은 VL 서열 중 임의의 서열로부터 선택된 VL 아미노산 서열, 또는 서열번호: 158, 서열번호: 160, 서열번호: 162로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 경쇄 (LC) 아미노산 서열을 포함하고,
a) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고;
b) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고;
c) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고;
d) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고;
e) VL CDR6이 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고;
f) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고; 및/또는
g) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택되는 것인, 항체. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체:
a) 하기를 포함하는 항체
a. 서열번호: 38의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 39의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 30의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 32의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 33의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 35의 CDR6 서열;
b) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 47의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 49의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 51의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 53의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 21의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 54의 CDR6 서열;
c) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 83의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 84의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 73의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 75의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 41의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 76의 CDR6 서열;
d) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 104의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 105의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 92의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 94의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 108의 CDR6 서열;
및
e) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 114의 CDR1 서열; 및
b. 서열번호: 115의 CDR2 서열; 및
c. 서열번호: 106의 CDR3 서열; 및
d. 서열번호: 116의 CDR4 서열; 및
e. 서열번호: 117의 CDR5 서열; 및
f. 서열번호: 118의 CDR6 서열,
또는 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도를 갖는, 전술한 것들 중 임의의 것의 기능적 활성 CDR 변형체. - 제12항에 있어서, 그룹 멤버 c)의 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체이고,
a) VH CDR1의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, F, H, I, K, L, M, R, V, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 E, F, M, W 또는 Y 중의 것이고;
b) VH CDR2의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, H, L, S, T, V 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, H 또는 Y 중의 것이고;
c) VH CDR2의 위치 3에서, 아미노산 잔기는 Y, H, T 및 W로부터 선택되고;
d) VH CDR2의 위치 5에서, 아미노산 잔기는S, A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 N, R 또는 W 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 N 또는 W이고;
e) VH CDR2의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, D, F, H, K, L, M, N, R 및 W로부터 선택되고;
f) VH CDR2의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, D, E, F, N, S 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고, 더욱 우선적으로는 H이고;
g) VH CDR3의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 R, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고;
h) VH CDR3의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 G, A, F 및 Y로부터 선택되고;
i) VH CDR3의 위치 6에서, 아미노산 잔기는 M, E, F, H 및 Q로부터 선택되고, 우선적으로는 F 또는 H이고;
j) VH CDR3의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 H, A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, K, Q, R, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 W 또는 Y이고;
k) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고;
l) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고;
m) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고;
n) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고;
o) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고;
p) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고; 및/또는
q) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택되는 것인, 항체. - 제12항 또는 제13항에 있어서, 표 1에 열거된 바와 같은 VH 및/또는 VL의 골격 영역 중 임의의 영역을 포함하는 골격을 포함하고, VH 골격 영역 (VH FR1)의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우에는, 선택적으로 Q1E 점 돌연변이를 포함하는 것인, 항체.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 도 2에 열거된 바와 같은 HC 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체:
a) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 147의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 148의 LC 아미노산 서열;
b) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 149의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 150의 LC 아미노산 서열;
c) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 151의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 152의 LC 아미노산 서열;
d) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 153의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 154의 LC 아미노산 서열;
e) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 155의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 156의 LC 아미노산 서열;
f) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 157의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 158의 LC 아미노산 서열;
g) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 159의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 160의 LC 아미노산 서열;
h) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 161의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 162의 LC 아미노산 서열;
i) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 163의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 164의 LC 아미노산 서열;
j) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 165의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 166의 LC 아미노산 서열;
k) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 167의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 168의 LC 아미노산 서열;
l) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 169의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 170의 LC 아미노산 서열;
및
m) 하기를 포함하는 항체:
a. 서열번호: 171의 HC 아미노산 서열; 및
b. 서열번호: 172의 LC 아미노산 서열,
또는 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도를 갖는, 전술한 것들 중 임의의 것의 기능적 활성 CDR 변형체. - 제16항에 있어서, 그룹 멤버 f), g) 및 h) 중 임의의 항체 또는 이의 기능적 활성 변형체이고,
a) VH CDR1의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, F, H, I, K, L, M, R, V, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 E, F, M, W 또는 Y 중의 것이고;
b) VH CDR2의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, H, L, S, T, V 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, H 또는 Y 중의 것이고;
c) VH CDR2의 위치 3에서, 아미노산 잔기는 Y, H, T 및 W로부터 선택되고;
d) VH CDR2의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 S, A, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 N, R 또는 W 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 N 또는 W이고;
e) VH CDR2의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 S, D, F, H, K, L, M, N, R 및 W로부터 선택되고;
f) VH CDR2의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, D, E, F, N, S 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고, 더욱 우선적으로는 H이고;
g) VH CDR3의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 R, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 D 또는 H이고;
h) VH CDR3의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 G, A, F 및 Y로부터 선택되고;
i) VH CDR3의 위치 6에서, 아미노산 잔기는 M, E, F, H 및 Q로부터 선택되고, 우선적으로는 F 또는 H이고;
j) VH CDR3의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 H, A, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 E, K, Q, R, W 또는 Y 중의 것이고, 더욱 우선적으로는 W 또는 Y이고;
k) VL CDR4의 위치 7에서, 아미노산 잔기는 N, A, D, E, F, G, H, K, L, M, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 F, L, W, 또는 Y이고, 더욱 우선적으로는 L 또는 W이고;
l) VL CDR4의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 S, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 I 또는 W이고;
m) VL CDR4의 위치 9에서, 아미노산 잔기는 Y, F, R 및 W로부터 선택되고, 우선적으로는 R 또는 W이고;
n) VL CDR5의 위치 1에서, 아미노산 잔기는 A, G, S, W 및 Y로부터 선택되고, 우선적으로는 G이고;
o) VL CDR6의 위치 4에서, 아미노산 잔기는 F, H, M, W 및 Y로부터 선택되고;
p) VL CDR6의 위치 5에서, 아미노산 잔기는 D, A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고; 및/또는
q) VL CDR6의 위치 8에서, 아미노산 잔기는 F, H, R 및 W로부터 선택되는 것인, 항체. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 10-8M 미만, 바람직하게는 10-9M 미만의 Kd로 LukGH 복합체에 결합하는 친화도를 갖는, 항체.
- 제18항에 있어서, LukGH 복합체에 결합하는 친화도보다 낮은, 바람직하게는 10-7M 초과, 바람직하게는 10-6M 초과의 Kd로 별개의 LukG 및/또는 LukH 항원에 결합하는 친화도를 갖는, 항체.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 전장의 단일클론 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 항체.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 에스 . 아우레우스 감염을 제한하거나, 상기 감염으로부터 초래되는 질환 병태를 완화하거나, 폐렴, 패혈증, 세균혈증, 상처 감염, 종기, 수술 부위 감염, 내안구염, 종기증, 큰종기증, 심내막염, 복막염, 골수염 또는 관절 감염과 같은 에스 . 아우레우스 질환 발병을 억제하는데 효과적인 양의 항체를 투여하는 것을 포함하는 에스 . 아우레우스 감염의 위험성이 있거나 이를 앓고 있는 개체를 치료하는데 사용하기 위한, 항체.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는, 약학적 제제.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 괴사성 폐렴 및, 종기증 및 큰종기증에서 독소 생산과 같은 고 독소 생산 MRSA 감염을 포함한 임의의 에스 . 아우레우스 감염을 검출하기 위한 진단적 사용을 위한, 항체.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 진단 제제로서, 선택적으로 표지를 갖는 항체 및/또는 표지를 갖는 진단 시약을 함유하는 진단 제제.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체의 단리된 파라토프 (paratope), 또는 상기 파라토프를 포함하는 결합 분자.
- 하기를 특징으로 하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체에 의해 인식되는 단리된 입체형태적 에피토프:
a) LukG의 rim 도메인 및 접촉 아미노산 잔기 Asn71, Tyr73, Trp74, Asn206, Leu207, Trp208, Lys210, Asp211, Trp262, 및 Phe267의 구조 좌표 (structure coordinate)를 포함하는 에스. 아우레우스의 LukGH 복합체의 3차원 구조; 또는
b) a)의 동족체로서, 접촉 아미노산 잔기의 골격 원자로부터 0.00 A 내지 2.00 A의 평균평방근편차 (root mean square deviation)를 갖는 결합 부위를 포함하는, 3차원 구조. - 제27항에 있어서, 결합 분자에 의해 결합되는, 에피토프.
- 제27항 또는 제28항의 에피토프를 특이적으로 인식하는 결합 분자로서, 바람직하게는 단백질, 펩티드, 펩티드모방체, 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩티드, 앱타머 및 소분자 화합물, 바람직하게는 항체, 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 이의 항체 단편, 또는 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 결합 분자가 에스. 아우레우스의 LukGH 복합체를 인식하는 특이적 결합제인, 결합 분자.
- 하기 단계를 포함하는, 제27항 또는 제28항의 에피토프를 특이적으로 인식하는 결합제를 동정하기 위한 스크리닝 방법 또는 분석:
- 후보 화합물을 제27항에 정의된 바와 같은 3차원 구조와 접촉하게 하는 단계; 및
- 후보 화합물과 3차원 구조 사이의 결합을 평가하는 단계로, 후보 화합물과 3차원 구조 사이의 결합이 에스 . 아우레우스의 LukGH 복합체를 인식하는 특이적 결합제로서 후보 화합물을 동정하는 단계. - 하기를 포함하는 면역원:
a) 제27항 또는 제28항의 에피토프; 및
b) 담체, 바람직하게는 완충제 및/또는 애주번트 물질을 포함하는, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체. - 제31항에 있어서, 바람직하게는 비경구 사용을 위한, 백신 제형인 면역원.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 에스 . 아우레우스 감염으로부터 개체를 보호하거나, 상기 감염으로부터 초래된 질환 병태를 예방하거나, 에스 . 아우레우스 폐렴 발병을 억제하기에 효과적인 양의 상기 면역원을 투여함으로써 개체를 치료하는데 사용하기 위한, 면역원.
- 제33항에 있어서, 방어적 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 면역원.
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