CN103055311B

CN103055311B - 一种传染性喉气管炎粘膜疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103055311B
Application number: CN201210586649.7A
Authority: CN
Inventors: 曹永长; 薛春宜; 鄢慧民; 王林果
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103055311A

Abstract

本发明涉及一种传染性喉气管炎粘膜疫苗、制备方法及应用，所述传染性喉气管炎粘膜疫苗包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素；所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素；所述传染性喉气管炎病毒为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317。所述传染性喉气管炎粘膜疫苗通过添加鞭毛素作为粘膜免疫佐剂，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应；安全性好、不存在散毒的危险；可直接应用于预防家禽免于传染性喉气管炎病毒的感染及传播。

Description

一种传染性喉气管炎粘膜疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于兽医生物医药技术领域，尤其涉及一种传染性喉气管炎粘膜疫苗及其制备方法。

背景技术

传染性喉气管炎（Infectious Laryngotracheitis，ILT）是由疱疹病毒科（Herpetoviridae）疱疹病毒属（Herpesvirus）的传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV）引起的一种急性呼吸道传染病，可引起鸡死亡和产蛋下降，造成生产的严重损失。严重感染时病鸡呼吸困难、喘气、咳出血样粘液，死亡率高。

ILT是家禽的第一个研制出有效疫苗的主要病毒性疾病。目前，疫苗免疫接种仍是我国控制家禽ILT的主要措施。尽管弱毒疫苗存在散毒的危险，但是目前主要还是使用弱毒疫苗来预防ILT，所使用的弱毒疫苗是经细胞传代或鸡胚传代致弱的病毒以及经选择的地方流行的温和型毒株，他们都能使易感鸡产生坚强的免疫力，但弱毒疫苗存在毒力偏强、易于返祖、并且与强毒株一样能形成潜伏感染等弊端。弱毒疫苗的接种方法主要有点眼、喷雾和饮水等方式。实际应用中的弱毒疫苗的病毒毒力普遍偏强，接种后鸡群发病率在5％左右，而进一步致弱的疫苗株其免疫原性也下降，进而导致免疫效果不佳。

粘膜免疫和粘膜疫苗具有许多引人关注的特性，然而要真正通过抗原的粘膜免疫途径刺激产生强大的粘膜免疫反应（包括粘膜特异的sIgA和CTLs）和保护效应并非那么容易。目前只有极少数几种粘膜免疫途径的疫苗用于临床。有效的佐剂可以大大加强疫苗刺激机体有效的保护性免疫应答，而研发新型粘膜疫苗配方的一个最明显的限制在于缺乏有效的佐剂。因此，筛选合适免疫佐剂，研制新型ILT疫苗，增强疫苗免疫效力，成为研制传染性喉气管炎粘膜疫苗的重点。

发明内容

为了克服现有佐剂效果差的问题，本发明提供一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，该传染性喉气管炎粘膜疫苗使用鞭毛素作为佐剂。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式，所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式，所述传染性喉气管炎病毒为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317。

一种传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将传染性喉气管炎病毒用10日龄SPF鸡胚进行培养和传代；

步骤2：将传染性喉气管炎病毒进行灭活；

步骤3：将大肠杆菌源鞭毛素在原核表达系统中表达，纯化，去内毒素；

步骤4：将大肠杆菌源鞭毛素与灭活的传染性喉气管炎病毒进行混合制成传染性喉气管炎粘膜疫苗。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤1中的传染性喉气管炎病毒为疫苗株K317。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤2中的灭活采用的是热处理，样品置65℃水浴或者65℃培养箱中放置2h灭活。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤2还包括病毒的活性检测和细菌检测。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤3中选用的鞭毛素来源于大肠杆菌。

本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗在制备预防传染性喉气管炎的药物中的应用。

本发明提供的新型的传染性喉气管炎粘膜疫苗具有明显的优点和效果。

（1）传染性喉气管炎粘膜疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强，持续时间长，可以作为预防传染性喉气管炎。

（2）由于该新型疫苗的抗原是灭活病毒，安全、不存在散毒的危险。

（3）和一般的灭活疫苗比较，通过添加鞭毛素作为粘膜免疫佐剂，激发内在免疫应答，同时增强目标靶点对疫苗抗原产生的抗体反应，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应，预防家禽传染性喉气管炎。

附图说明

图1灭活病毒接胚后活性检测结果；第一泳道为DL2000 Marker；第二和三泳道为阳性对照；第四和五泳道为检测样品。

图2重组蛋白的可溶性分析结果；第一泳道为pET-His-Flagellin诱导表达上清；第二泳道为pET-His-Flagellin诱导表达沉淀。

图3纯化鞭毛素蛋白的SDS-PAGE图；第一泳道为Marker，第二泳道为纯化后的鞭毛素蛋白；

图4牛血清白蛋白标准曲线；

图5一免后16小时血清抗体ELISA值；

图6一免后1周血清抗体ELISA值；

图7一免后2周血清抗体ELISA值；

图8二免后第2周血清抗体ELISA值；

图9二免后第3周血清抗体ELISA值；

图10肺洗液早期炎性细胞因子IL-6 ELISA值；

图11肺洗液早期炎性细胞因子IFNγELISA值。

具体实施方式

通过下面给出的某些实验的具体实施例子可以进一步清楚地理解本发明。但下述实施例不是对本发明的限定。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式，所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素。近年来，研究证明运动性革蓝氏阴性细菌的鞭毛素是一种具有潜力的免疫佐剂，能有效诱发固有性免疫应答和适应性免疫应答。伤寒杆菌（Salmonllena enteritidis）的鞭毛素作为鼻腔内免疫佐剂能在小鼠体内诱导有效防御致死量鼠疫耶氏菌（Yersinia pestis）的呼吸道感染。创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的鞭毛素作为鼻腔内免疫佐剂与破伤风类毒素（tetanustoxoid，TT)一起免疫小鼠能诱导有效的保护免疫效应。更重要的是，体内已产生存在的鞭毛素特有免疫性并不会削弱鞭毛素融合蛋白疫苗的有效性。作为一个细菌Toll样受体（Toll-like receptor，TlR）激动剂，鞭毛素可激发内在的免疫应答，从而产生一个非特异性的免疫反应。由鞭毛素激发的内在免疫应答可同时增强目标靶点对疫苗抗原产生的抗体反应，从而得到一个更为保护和持久的免疫作用。但是目前关于大肠杆菌来源的鞭毛素的研究较少。大肠杆菌来源的鞭毛素蛋白属于肠道病原的大肠杆菌鞭毛素，能激发产生白细胞介素-8，作为佐剂效果更好。

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的一种优选实施方式，所述传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV）属于疱疹病毒科（Herpetoviridae）疱疹病毒属（Herpesvirus），为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317，购自中国兽药监察所。

一种传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤2：将传染性喉气管炎病毒进行灭活；

作为本发明传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法的一种优选实施方式，所述步骤2中的灭活采用的是热处理，取足量保存备用样品置65℃水浴或者65℃培养箱中放置2h灭活，分装到2ml灭菌离心管中。

实施例1

步骤1 ILTV的培养和传代

传染性喉气管炎病毒为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317，在-80℃保存。使用前取出，接种10日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚接种量为0.3ml/枚，连续传四代。

步骤2 毒株灭活、活性检测及菌检

灭活：取足量保存备用样品置65℃水浴或者65℃培养箱中放置2h即为灭活野毒株，样品分装到2ml灭菌离心管中。

活性检测：灭活样品接种10枚10日龄SPF鸡胚，0.2ml/枚，37℃培养，弃去24小时内死胚，144小时后冻胚，观察尿囊膜病变情况并记录，收集尿囊膜碾磨后反复冻融三次，2000rpm 4℃ 5min取上清，上清PCR检测，记录结果。结果如图1所示。第一泳道为DL2000Marker；第二和三泳道为阳性对照；第四和五泳道为检测样品。接种的SPF鸡胚无1枚死亡。接种5天后冻胚观察无尿囊膜病变，无可见痘斑。收集尿囊膜做PCR检测，均为阴性。

菌检：灭活样品接种取100μL涂到普通琼脂平板，37℃放置1小时后翻板培养两天，观察细菌生长情况。两天后观察，无细菌生长。

步骤3 鞭毛素的表达和纯化

(1）目的蛋白的诱导表达

将表达大肠杆菌（Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655）来源鞭毛素基因（Gene ID：949101，核酸长度为1497bp，具体序列如SEQ ID NO.1所示）的pET-His-E质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21（DE3）感受态中，并涂布于含氨苄青霉素（Amp）的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。挑取一个单菌落接种到4ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，并置于37℃中，220rpm振荡培养6h作为种子液。将种子液按1∶100的比例接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养约2.5h，检测当菌液OD600在0.4-0.6间时，加入IPTG至终浓度为1.0mM，37℃，220rpm振荡培养4h，收集菌体。

取2ml诱导前、后的菌液，室温12000g离心1min，弃上清，沉淀重悬于1ml 1×PBS中，室温12000g离心1min，弃上清，重复洗涤一次后，菌体沉淀用100ulPBS重悬，再加入25μl 5×Loading Buffer。混匀后，沸煮5min，以完全裂解菌体并使蛋白变性。室温12000g离心5min，取5-10μl上样，进行SDS-PAGE垂直电泳检测。

将成功表达的融合蛋白，将菌液按照1∶100的比例接种到500ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在菌液OD600在0.4-0.6间时，加入IPTG至终浓度为1.0mM，180r/min，18℃振荡培养过夜；8000rpm，4℃，5min离心收集菌体；每50ml的菌液用5ml PBS洗涤沉淀，洗涤两次后，称重，约每克菌体湿重加入5ml 1×PBS进行重悬；并用超声波破碎的方法裂解菌体，然后8000rpm，4℃，离心10min，分别回收上清和沉淀。取一定量的上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性。重组蛋白的可溶性分析见图2。泳道1是pET-His-Flagellin诱导表达上清；2：pET-His-Flagellin诱导表达沉淀，可见鞭毛素蛋白是以可溶性的形式表达。

（2）重组表达蛋白的纯化

由于pET-His载体上带有6个组氨酸标签，于是使用GE公司的HisTrap FF crude进行镍离子亲和层析的方法进行纯化。纯化后的鞭毛素蛋白结果见图3，大肠杆菌来源的鞭毛素蛋白大小为55kDa左右。

（3）佐剂去内毒素

采用金斯瑞的ToxinEraser^TM去内毒素试剂盒，它是一类高效内毒素去除树脂，以修饰过的多粘菌素B（PMB）为配体，进行特异性的去除内毒素。经ToxinEraser^TM endotoxinremoval resin纯化，样品最终的内毒素水平可低于0.1EU/ml。

鞭毛素蛋白含量的测定：采用Bradford法测定样品裂解液中的蛋白质含量，以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白，用分光光度计测定吸光值OD595nm，作标准曲线；将待测样品适当稀释，测定吸光值OD595，根据标准曲线算出待测样品的蛋白浓度，每个样品测三次，取平均值。具体做法是取纯化的蛋白20μL加入980μL的考马斯亮蓝染色液，充分混匀，每孔200μL加入ELISA板中，3个重复样品。630nm波长检测，得到OD值，对照公式计算，X为蛋白含量，标准曲线见图4。大肠杆菌鞭毛素蛋白浓度为6.8mg/ml。

步骤4 将大肠杆菌源鞭毛素与灭活的传染性喉气管炎病毒进行混合制成传染性喉气管炎粘膜疫苗

ILTV灭活前的滴度至少为10^4.0EID₅₀/0.1ml，按30mL灭活ILTV+5mg鞭毛素蛋白的比例进行混合。

传染性喉气管炎粘膜疫苗效果验证

用未灭活的传染性喉气管炎病毒疫苗株K317、商品疫苗和沙门氏菌来源鞭毛素（沙门氏菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2，GeneID：1253480，具体序列如SEQ ID NO.2所示）作对照。

用21日龄鸡接种各组疫苗，具体分组如表1。一免后16h先采血5只并收集血清，然后每组处死3只鸡，用200μL细胞培养液冲洗肺支气管收集肺洗液用于早期炎性细胞因子IFNγ及IL-6的检测。早期炎性细胞因子IFNγ及IL-6的检测用检测试剂盒按照说明书进行操作，肺洗液1：100稀释后加样。一免后1、2周和二免后2、3周采血取样，用ELISA实验进行IgG抗体水平检测。

表1 免疫方案

注：ILTV灭活前的滴度至少为10^4.0EID₅₀/0.1ml；S：代表灭活的；H：代表活的；Y：代表商品疫苗（（喉倍灵（LT-BLEN）传染性喉气管炎活疫苗，梅里亚动物保健有限公司）；y：代表灭活的分离株病毒；z：代表佐剂；10、50：代表剂量；d：代表滴鼻；q：代表气管滴注；1：FLA（沙门氏菌来源）；2：FLB（大肠杆菌来源）；+：代表混合。

（1）免疫鸡只血清抗体ELISA值

血清IgG抗体水平检测结果显示（图5、图6、图7、图8和图9），ILTV灭活后免疫SPF鸡只，在早期刺激方面，可以跟活疫苗免疫效果相似。但免疫后期效果上看，没有一种方式或剂量免疫效果能跟活疫苗比，差异显著（p＜0.05）且大部分差异极显著（p＜0.01），表明优良的灭活苗研制还需要做很多工作。免疫途径而言，从后期血清抗体值检测值比较看，点眼滴鼻相对于喉气管内滴注要好。免疫佐剂来源而言，大肠杆菌来源的鞭毛素蛋白优于沙门氏菌来源的大肠杆菌鞭毛素蛋白，两种佐剂存在显著差异，表明选择合适的佐剂来源对免疫增强作用很重要。

（2）肺洗液早期炎性因子IL-6与INF-γELISA值

SPF鸡免疫后16h收集其肺洗液用于早期炎性细胞因子IFNγ和IL-6的检测。检测结果显示（图10和图11），鞭毛蛋白明显上调了IFNγ和IL-6的分泌表达水平。单独的灭活分离株气管滴注方式能促进IL-6的分泌（P<0.05），但点眼滴鼻方式不能(p>0.05)。与此相反，单独的灭活分离株气管滴注方式不能促进IFNγ的分泌（p>0.05），但点眼滴鼻方式能(p<0.05)。这可能与两种细胞因子功能不同有关。单独使用佐剂免疫鸡只，无论何种剂量都不能有效刺激细胞因子产生，与对照组差异不显著（p>0.05）。IFNγ检测结果显示，单独病毒免疫组与对照组相比，IFNγ的分泌水平虽然有了一定的上升，但明显低于含佐剂组水平，佐剂加入后，IFNγ的分泌水平比单独病毒免疫组提高了较多，差异显著（p＜0.05）。IL-6分泌表达水平检测结果显示同样的结果，单独病毒免疫后，IL-6的表达量明显升高，但佐剂加入后，这一水平又有了明显的提高，含佐剂组与不含佐剂组的IL-6分泌表达水平相比，差异显著（p＜0.05）。

试验结果表明：

1）使用鞭毛素作为佐剂能促进血清抗体的增加和细胞因子（IL-6和INF-γ）的分泌。

2）免疫途径方面，在同等佐剂剂量条件下，检测到的ILTV血清抗体气管途径相对点眼滴鼻要低一些，但差异不显著，故点眼滴鼻这种长期养殖总结出来的免疫方式存在着其优势，一是免疫难度相对较小，二是免疫效果相对明显些，三是免疫后成功几率相对较高。

3）免疫剂量方面，血清抗体ELISA值数据显示免疫早期两个剂量差异不显著，但二免后差距较大，50μg组相对能更好刺激产生抗体，增加免疫应答。比较早期炎性因子ELISA值发现，大剂量佐剂组也同样较好刺激机体产生早期炎性因子。因此实验证明佐剂剂量对免疫应答效果有影响，提示可以在不超过动物体最高耐受的剂量范围内，提高佐剂量用量可以达到提高免疫应答效果的需要。

4）无论是血清抗体ELISA值还是早期炎性因子ELISA值结果都显示，在佐剂剂量相同和免疫途径相同的情况下，大肠杆菌来源的佐剂的免疫增强效果要较沙门氏菌来源的佐剂要好一些。

Claims

1.一种传染性喉气管炎粘膜疫苗，其特征在于，包含灭活的传染性喉气管炎病毒和鞭毛素，所述鞭毛素为大肠杆菌源鞭毛素，所述传染性喉气管炎病毒为传染性喉气管炎病毒疫苗株K317，传染性喉气管炎病毒灭活前的滴度至少为10^4.0EID50/0.1mL，按30mL灭活传染性喉气管炎病毒和5mg鞭毛素蛋白的比例进行混合。

2.一种权利要求1所述的传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2：将传染性喉气管炎病毒进行灭活；所述的灭活采用的是热处理，样品置65℃水浴或者65℃培养箱中放置2h灭活；

步骤4：将大肠杆菌源鞭毛素与灭活的传染性喉气管炎病毒进行混合制成传染性喉气管炎粘膜疫苗，传染性喉气管炎病毒灭活前的滴度至少为10^4.0EID50/0.1mL，按30mL灭活传染性喉气管炎病毒和5mg鞭毛素蛋白的比例进行混合。

3.根据权利要求2所述的传染性喉气管炎粘膜疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2还包括病毒的活性检测和细菌检测。