CN101972482A - 一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了ILTV HN1株gB和ChIL-18完整基因，所述双价核酸疫苗共表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因。本发明采用的真核双表达载体pIRES在启动子下游的MCS A和MCS B的多克隆酶切位点分别插入鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因片段和鸡白介素-18基因片段，获得真核双表达质粒pIRES-gB/IL18。避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例问题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答潜伏期，为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。

Description

一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种核酸疫苗，具体涉及一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗及其制备方法。

背景技术

鸡传染性喉气管炎是一种急性、高度接触性上呼吸道传染病。本病特征为呼吸困难，喘气，咳出带血分泌物，喉部和气管黏膜肿胀、出血，并形成糜烂。该病急性爆发时，发病率可达100％，死亡率一般在20％左右，产蛋鸡的产蛋量明显下降，被国际兽疫局列为B类疾病。自1925年美国报道该病以来，现已遍及世界各国，我国于50年代发现有本病的存在。

目前国内外防制ILT的主要措施是采用减毒疫苗。减毒疫苗存在毒力偏强、潜伏感染、易于返祖等弊端，长期使用减毒疫苗不利于ILTV的根除，因此国内外研究人员都在不断致力于ILTV新型疫苗的研制，并已取得了一定的进展。哈尔滨兽医研究所张绍杰等以鸡痘病毒(FPV)为载体，构建了含ILTV糖蛋白gB基因的重组FPV，该重组病毒可稳定表达ILTV糖蛋白gB，该重组病毒的免疫保护性效果与常规的ILTV弱毒疫苗相当，是一种很有希望的预防ILT疫苗。由于活载体疫苗存在宿主对载体本身免疫的限制，通常不能进行多次免疫接种，因此研究人员正在积极探索其它新型疫苗的研制。

自从1990年出现基因免疫以来，许多病毒的不同基因导入各种动物体内，产生了较好的免疫效果。DNA疫苗作为第3代疫苗，因其既有亚单位疫苗的安全性，又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的瞩目。目前基因疫苗已在多种人和动物的传染病、寄生虫病、抗肿瘤等方面取得进展。在禽病基因疫苗研究方面，许多学者对AIV、IBDV、IBV、NDV等的基因免疫已进行了研究。但是DNA疫苗诱导机体产生的抗体水平低，还不能完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击，因此，如何增强DNA疫苗的免疫保护率成为急需解决的问题。许多研究表明，细胞因子能够增强抗原的免疫原性，这些细胞因子包括IL-2、IFN-γ、IL-6和IL-18等。研究表明，将编码细胞因子的质粒DNA与DNA疫苗同时插入到一个真核表达载体中，使细胞因子与抗原在机体中同时表达，利用细胞因子在免疫应答中的免疫调节功能来调节和增强DNA疫苗的免疫效果，从而发挥细胞因子的佐剂作用。

质粒pIRES为双顺反子真核表达载体，在其多克隆位点MCS A和MCS B之间设计有微小RNA病毒的内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site，IRES)，由IRES连接的两个开放阅读框架，其转录产物在翻译时核糖体能同时进入并开始翻译IRES上游及下游的两个转录子。用于转录后修饰的SV40mRNA早期PolyA信号肽位于MCS B下游，确保克隆入多克隆位点内的两个外源基因共同转录，所翻译出的目的蛋白各自具有独自的空间结构和生理活性，而不是融合蛋白。

白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是近年来新发现的一种重要的细胞免疫调节因子，它可刺激Th1细胞高水平诱生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等细胞因子，促进T细胞的增殖，显著增强Th1细胞和NK细胞的细胞毒作用等免疫调节功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种增强免疫效果的鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗及其制备方法。

本发明的技术方案是：一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了ILTV HN1株gB和ChIL-18完整基因，所述双价核酸疫苗共表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因。

鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗的制备方法，它的步骤如下：

(1)设计并合成1对扩增ChIL-18的引物，

上游引物Y1为：5’-GTAGGATCCATGAGCTGTGAAGAGAT-3’，

下游引物Y2为：5’TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3’，

上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点，预期扩增长度为615bp；

设计并合成1对扩增ILTV gB的引物，

上游引物Y3为：5’-GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3’，

下游引物Y4为：5’-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3’，

上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，预期扩增长度为2.6kb；

分别以质粒pGEM-T-IL-18和pGEM-T-gB为模板，应用PCR技术，通过引物Y1/Y2扩增ChIL-18，通过Y3/Y4扩增gB基因；通过每对引物的限制性酶切位点，把gB和ChIL-18分别插入pIRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-gB/IL18重组质粒；

(2)真核重组表达载体的构建

将PCR产物ChIL-18，经BamHI和Sal I双酶切回收后插入真核表达载体pIRES的MCSB位点上，得到pIRES-IL18，重组质粒pGEM-T-gB1，经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB基因插入重组真核表达质粒pIRES-IL18的MCS A位点上，构建成重组质粒pIRES-gB/IL18，制成鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗。

重组质粒pIRES-gB/IL18经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了重组质粒pIRES-gB/IL18；将构建成功的重组质粒pIRES-gB/IL18用脂质体法转染鸡胚成纤维细胞，以RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，经RT-PCR检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到gB蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。

本发明的有益效果是：本发明采用的真核双表达载体pIRES在启动子下游的MCS A和MCS B的多克隆酶切位点分别插入鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因片段和鸡白介素-18基因片段，获得真核双表达质粒pIRES-gB/IL18。避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例问题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答潜伏期，为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。

本发明鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因和鸡IL-18基因双价核酸疫苗的制备方法，简称共表达ILTV HN1株gB和ChIL-18双价核酸疫苗的制备方法，本发明根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCS A、MCS B多克隆位点的序列和ILTV HN1株gB和ChIL-18基因阅读框架，分别设计并合成了针对ChIL-18和gB的引物Y1/Y2，Y3/Y4。利用引物Y1/Y2，PCR扩增ChIL-18基因。将PCR产物ChIL-18经BamHI与Sal I双酶切回收后，插入pIRES的MCS B位点上，得到真核表达质粒pIRES-IL18；利用引物Y3/Y4，PCR扩增gB基因，克隆到pGEM-T Easy载体。PCR、酶切和测序鉴定正确的重组质粒pGEM-T-gB1经Xho I与Mlu I双酶切后，回收的gB基因插入同样处理的重组真核表达质粒pIRES-IL18的MCS A位点上，得到真核表达质粒pIRES-gB/IL18。经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了共表达质粒pIRES-gB/IL18。将构建成功的重组质粒pIRES-gB/IL18用脂质体法转染鸡胚成纤维细胞，以RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，经RT-PCR检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到gB蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。

本发明中采用的真核双表达载体plRES能在细胞基因组外扩增表达目的基因。质粒plRES含有人巨细胞病毒启动子、脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(internal ribosome entrysite，IRES)，IRES连接两个开放阅读框，其转录产物在翻译时，核糖体能同时进入并开始翻译IRES上游及下游的两个转录子。本研究利用的真核双表达载体plRES在启动子下游的MCS A的酶切位点Xho 1与Mlu I之间插入鸡传染性喉气管炎病毒HN1株gB基因片段，在MCS B的酶切位点BamHI与Sal I之间插入鸡白介素-18基因片段，获得真核双表达质粒pIRES-gB/IL18。避免两种质粒共同免疫时可能存在的细胞摄取不成比例问题，提高局部抗原提成效率，增强局部免疫应答强度，缩短免疫应答潜伏期。该核酸疫苗免疫机体后，表达的gB糖蛋白可刺激机体产生针对鸡传染性喉气管炎病毒的免疫保护作用，同时表达的鸡白介素-18可以发挥明显的免疫调节，两者协同作用增强免疫效果，为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。

通过对鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗免疫学试验可以得出，pIRES-gB/IL18诱导的血清抗体，都高于pIRES-gB免疫组，差异不显著(P＞0.05)，而在诱导外周血T淋巴细胞亚群数量上，都要优于pIRES-gB，差异显著(P＜0.05)，这表明IL-18能增强Th1型免疫应答。此外，在诱导T淋巴细胞亚群数量和特异性抗体上，pIRES-gB/IL18免疫组都要明显优于pIRES-gB免疫组，表明gB基因和IL-18共表达能更加有效的刺激机体产生全面的免疫应答。IL-18与抗原基因共表达而对免疫效果的加强作用，可能是由于共表达可以使IL-18和抗原基因存在于同一个微环境中，从而对免疫应答反应起了促进作用。

攻毒试验结果表明，鸡传染性性喉气管炎病毒DNA疫苗免疫组的试验鸡都获得了较高的保护率，但通过攻毒后每组鸡的发病情况统计结果可以看出，pIRES-gB/IL18组的试验鸡的发病数量少，并且发病症状较轻，恢复比较快。这些结果表明，鸡IL-18能明显地增强DNA疫苗pIRES-gB诱导细胞免疫的作用，提高鸡传染性性喉气管炎病毒DNA疫苗的免疫保护。pIRES-gB/IL18免疫组的保护率为93％。

附图说明

图1为鸡IL-18全基因的PCR扩增；

图2为pIRES载体图；

图3为真核共表达质粒pIRES-gB/IL18载体的构建流程图；

图4为重组质粒pIRES-IL18的PCR和酶切鉴定图

其中，M.DNA markerλ-EcoT14I；1.SalI单酶切；2.BamH I+SalI双酶切；3.重组质粒的PCR产物；

图5为ILTV gB基因的PCR扩增结果

其中，M.DNA Markerλ-EcoT14I；1-2.PCR产物；3.阴性对照；

图6为重组质粒pIRES-gB/IL-18的菌液PCR扩增

其中，M.DNA marker DL2000；1.gB基因PCR产物；m.DNA Marker DL2000；2.鸡IL-18基因PCR产物；3.阴性对照；

图7为重组质粒pIRES-gB/IL18的PCR和酶切鉴定图

其中，M.DNA markerλ-EcoT14I；1Sal I单酶切；2.BamHI+Sal I双酶切；3.重组质粒的PCR产物；m.DNA Marker DL2000；

图8为重组质粒pIRES-gB/IL18的酶切鉴定图

其中，M.DNA markerλ-EcoT14I；1Mlu I单酶切；2.Xho I和Mlu I双酶切；

图9为真核表达质粒pIRES-gB/IL18转录产物的RT-PCR检测

其中，M.DNA markerλ-EcoT14 digest；1.gB引物；2.IL-18引物；

图10为间接免疫荧光检测gB基因在CEF中的表达

其中，A：重组质粒pIRES-gB/IL18；B：阴性对照；

图11为免疫后鸡外周血中CD3⁺T淋巴细胞的动态变化；

图12为免疫后鸡外周血中CD4⁺T淋巴细胞的动态变化；

图13为免疫后鸡外周血中CD8⁺T淋巴细胞的动态变化；

图14为免疫后各试验组鸡外周血抗ILTV血清ELISA抗体水平的动态变化(n＝5)。

具体实施方式

实施例

一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了ILTV HN1株gB和ChIL-18完整基因，所述双价核酸疫苗共表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因和鸡IL-18基因。

鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗的制备方法，它的步骤如下：

(1)设计并合成1对扩增ChIL-18的引物，

上游引物Y1为：5’-GTAGGATCCATGAGCTGTGA AGAGAT-3’，

下游引物Y2为：5’-TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3’，

上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点(下划线部分)，预期扩增长度为615bp；

设计并合成1对扩增ILTV gB的引物，

上游引物Y3为：5’-GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3’，

下游引物Y4为：5’-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3’，

上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点(下划线部分)，预期扩增长度为2.6kb；

分别以质粒pGEM-T-IL-18和pGEM-T-gB为模板，应用PCR技术，通过引物Y1/Y2扩增ChIL-18，通过Y3/Y4扩增gB基因；通过每对引物的限制性酶切位点，把gB和ChIL-18分别插入pIRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-gB/IL18重组质粒，该质粒经酶切、PCR及测序鉴定；

(2)真核重组表达载体的构建

将PCR产物ChIL-18，经BamHI和Sal I双酶切回收后插入真核表达载体pIRES的MCSB位点上，得到pIRES-IL18，重组质粒pGEM-T-gB1，经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB基因插入重组真核表达质粒pIRES-IL18的MCS A位点上，构建成重组质粒pIRES-gB/IL18，经PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体pIRES-gB/IL18；

(3)真核重组质粒pIRES-gB/IL18的转染

将构建成功的重组质粒pIRES-gB/IL18用脂质体法转染鸡胚成纤维细胞，以RT-PCR和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，经RT-PCR检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到gB蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。

本发明中，详细实验过程如下：

1材料

1.1质粒、毒株及实验动物

pGEM-T Easy载体等Promega公司，鸡IL-18的克隆质粒pGEM-T-IL-18购自河南省动物性食品安全重点实验室，ILTV HN1株gB基因的克隆质粒pGEM-T-gB购自河南省动物性食品安全重点实验室。真核表达质粒载体pIRES购自上海捷瑞生物工程公司，质粒pIRES-gB和ILTV HN1株购自河南省动物性食品安全重点实验室。21日龄雏鸡购自河南农业大学种鸡场。

1.2主要试剂及仪器

Premix Ex TaqDNA聚合酶，DNA Markerλ-EcoT14I，X-gal和IPTG，限制性内切酶Xho I、Mlu I、Sal I、BamHI等购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA Marker DL2000购自博大泰克。DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司(V-gene)；DNA marker DL2000和质粒快速提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。T₄DNA连接酶和Wizard PureFection Plasmid DNA Purification为Promega公司产品；Lipofectamine^TM 2000Reagent为Invitrogen公司产品；EZ Spin Column Total RNA Isolation Kit和AMV Single Step RT-PCR Kit均购自BBI公司。淋巴细胞分离液、邻苯二胺(OPD)、吐温20(Tween-20)、牛血清白蛋白(BSA)等购自上海华舜生物公司，其它常规试剂为进口或国产分析纯。流式细胞仪(BDFACSCalibur，BD Biosciences)；酶标仪(Model 680，BIO-RAD)。

1.3抗体

鸡传染性喉气管炎阳性血清购自河南省动物性食品安全重点实验室；FITC标记的兔抗鸡IgG(二抗)为Sigma公司产品。PE标记的CD4⁺和CD8⁺及SPRD标记的CD3⁺均购自美国Southern Biotech公司。

2方法

2.1真核表达质粒pIRES-IL18载体的构建

2.1.1ChIL-18全基因目的片段引物设计与合成

根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCS B多克隆位点的序列和重组质粒pGEM-T-IL-18中ChIL-18基因阅读框架，设计1对引物，上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点(下划线部分)，跨幅为615bp，上游引物位于起始密码子之前，下游引物位于终止密码子之后，两引物间包括完整的IL-18基因阅读框架(597bp)，引物本身不形成发夹结构，2条引物间不形成二聚体。引物由上海生物工程有限公司合成。

上游引物Y 1为5’-GTAGGATCCATGAGCTGTGAAGAGAT-3’，

下游引物Y2为5’-TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3’。

2.1.2ChIL-18基因的扩增

以pGEM-T-IL-18质粒为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为：Premix Ex Taq DNA聚合酶25μL，1μL模板质粒，上、下游引物各1μL，补超纯水至50μL。混匀后于PCR仪上进行扩增另设无DNA对照。扩增程序为94℃预变性5min；然后进入94℃40s，56℃30s，72℃1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后置4℃保存。反应结束后取5μL PCR产物，以0.8％琼脂搪凝胶电泳观察结果。

2.1.3ChIL-18片段的酶切回收

取回收的目的DNA 50μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、BamHI 5μL、Sal I 5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化8h。电泳切下所需的目的条带，参照V-geneDNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。

2.1.4真核表达载体pIRES的酶切回收

取真核表达载体pIRES 30μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)5μL、BamHI 2.5μL、Sal I 2.5μL，加灭菌水至50μL，置37℃水浴中消化3h。电泳切下所需的目的条带，参照V-geneDNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。

2.1.5ChIL-18目的片段与真核表达载体pIRES的连接

取酶切回收的IL-18目的片段7μL、pIRES载体1μL于200μL反应管中，加入10×ligation buffer 1μL、T₄DNA连接酶1μL，混匀后置16℃连接过夜，构建重组质粒pIRES-IL18。

2.1.6连接产物的转化

取目的片段与真核表达载体的连接产物10μL转化到50μL E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃过夜培养12-16h。挑取白色菌落，提取真核重组表达质粒。

2.1.7重组表达质粒pIRES-IL18的PCR及双酶切鉴定

取重组表达质粒1μL做模板，PCR扩增体系和反应条件参照2.1.2进行，同时设以PIRES载体质粒为模板的阴性对照。上述PCR扩增产物各取5μL进行电泳分析。

取PCR扩增初步鉴定为阳性的重组质粒10μL，加入200μL反应管中，同时加入10×buffer(H)1μL，BamHI 1μL，Sal I 1μL，加灭菌水至20μL，离心混合均匀，置37℃水浴消化3h。电泳观察酶切结果。

2.1.8重组表达质粒pIRES-IL18的测序鉴定

将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-IL18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。

2.2真核表达质粒pIRES-gB/IL18载体的构建

2.2.1gB全基因目的片段引物设计与合成

根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCS B多克隆位点的序列和重组质粒pGEM-T-gB中gB基因阅读框架，应用Primer(Version 5.0)基因分析软件设计1对引物，上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点(下划线部分)。该对引物扩增长度为2.6kb，上游引物位于起始密码子之前，下游引物位于终止密码子之后，两引物间包括完整的gB基因阅读框架(2622bp)，引物本身不形成发夹结构，2条引物间不形成二聚体。引物由上海生物工程有限公司合成。

上游引物Y3为：5’-GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3’，

下游引物Y4为：5’-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3’，

2.2.2gB全基因目的克隆

应用设计的引物，以pGEM-T-gB为模板，扩增ILTV gB全基因。反应体系为25μL PremixEx Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA，上、下游引物各1μL，补灭菌去离子水至50μL。PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后进入94℃1min，54℃50s，72℃3.5min循环，进行36个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物的回收。回收的PCR产物按说明书方法与pGEM-T Easy Vector载体连接，构建重组质粒pGEM-T-gB1，转化E.coli JM109感受态细胞，挑选白色菌落接种含有Amp的LB液体培养基。提取重组质粒进行PCR扩增、酶切及测序鉴定。

2.2.3gB全基因片段的酶切回收

取鉴定正确的重组质粒pGEM-T-gB150μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)10μL、Mlu I 5μL、Xho I 5μL，加灭菌水至100μL，置37℃水浴中消化8h。电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。

2.2.4真核重组表达质粒pIRES-IL18的酶切回收

取重组表达质粒pIRES-IL1830μL于200μL反应管中，加入10×buffer(H)5μL、Mlu I 2.5μL、Xho I 2.5μL，灭菌水至50μL，置37℃水浴中消化3h。电泳切下所需的目的条带，参照V-gene DNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带。电泳观察回收情况。

2.2.5gB目的片段与重组表达质粒pIRES-IL18的连接

取Mlu I和Xho I双酶切的质粒pIRES/IL-181μL、Mlu I和Xho I双酶切回收的gB目的片段7μL于200μL反应管中，加入10×ligation buffer 1μL、T₄DNA连接酶1μL，混匀后置16℃连接过夜，构建重组质粒pIRES-gB/IL18。

2.2.6连接产物的转化

取目的片段与表达质粒的连接产物10μL转化到100μL E.coli DH5a感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃过夜培养12-16h。

2.2.7重组真核表达质粒pIRES-gB/IL18的PCR及双酶切鉴定

取重组表达质粒各1μL做模板，鸡IL-18基因PCR鉴定扩增体系和反应条件参照2.1.2。鸡传染性喉气管炎病毒gB基因PCR鉴定扩增体系和反应条件参照2.2.2，同时设以pIRES质粒为模板的阴性对照。上述PCR扩增产物各取5μL进行电泳分析。

取PCR扩增初步鉴定为阳性的重组质粒各10μL，分别加入4个200μL反应管中，其中一管同时加入10×buffer(H)2μL，Mlu I 1μL，Xho I 1μL；一管加入10×buffer(H)2μL，Mlu I 1μL；一管同时加入10×buffer(H)2μL，BamHI 1μL，Sal I 1μL；另一管加入10×buffer(H)2μL，SalI 1μL，都加入灭菌水至20μL，离心混合均匀，置37℃水浴消化3h。电泳观察酶切结果。

2.2.8重组表达质粒pIRES-gB/IL18的测序鉴定

将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-gB/IL18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，验证其阅读框架及其连接方向。

2.3真核表达质粒的转染及表达产物的检测

参照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification使用说明进行重组质粒pIRES-gB/IL18的纯化。转染时，先用DMEM培养液洗涤已长成80％的单层鸡胚成纤维细胞(Chicken embryofiber，CEF)，按Lipofectamine^TM 2000Reagent试剂盒的使用说明进行转染。转染细胞经37℃培养36～48h后，对其表达产物进行检测。

2.3.1RT-PCR

以EZ Spin Column Total RNA Isolation Kit提取转染后48h及阴性对照的CEF细胞总RNA，用gB和鸡IL-18基因的特异性引物，按AMV Single Step RT-PCR kit试剂盒说明书进行RT-PCR检测。电泳检测扩增结果。

2.3.2间接免疫荧光试验

待细胞转染48h后，用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤1次，自然干燥；用100％丙酮固定5-10min，自然干燥后用PBST洗涤3次；10％BSA封闭30min，再PBST洗涤3次；用PBS将ILTV阳性血清作1∶40稀释，滴加于6孔培养板上，置湿盒内37℃1h。取出后用PBST洗涤3遍，每次5min，再用去离子水冲洗1遍后，自然干燥；用PBS将FITC标记的兔抗鸡IgG(二抗)稀释到工作浓度，滴加在6孔培养板上，置湿盒内37℃1h，用PBST洗涤3遍，每次5min，再用去离子水冲洗1遍，自然干燥，在荧光显微镜下观察。

2.4鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗免疫学试验

2.4.1真核表达质粒的制备

将pIRES-gB、pIRES-gB/IL18及空载体pIRES真核表达质粒分别转化JM109菌于LB培养基中(含氨苄青霉素50μg/ml)大量扩增培养，参照Wizard PureFection Plasmid DNA Purification使用说明进行质粒的纯化，纯化后测定其浓度，适当稀释后用于动物免疫。

2.4.2动物分组免疫

将1000只21日龄雏鸡随机分为4组，250只/组。其中A为pIRES-gB免疫组，B为pIRES-gB/IL18免疫组，C为空白pIRES质粒组，D为PBS对照组。采用腿部肌肉多点注射，2周后再加强免疫1次。

2.4.3淋巴细胞亚群测定方法

免疫前、免疫后0、1、2、3、4、5、6周，从各试验组中随机抽取4羽经翅静脉采血2mL，柠檬酸钠抗凝，按常规方法分离淋巴细胞，用PBS溶液将细胞数调至5.0×10⁶mL^-1。一管加入鼠抗鸡CD3-SPRD、CD4-PE单克隆抗体各10μL，另一管加入CD3-SPRD、CD8-PE单克隆抗体各10μL，相应对照管加入鼠抗人IgG-FITC、IgG-PE单克隆抗体各10μL，再分别加入淋巴细胞悬液50μL，混匀，4℃避光作用20min。加入PBS溶液500μL，混匀，室温避光作用10min。重悬细胞，流式细胞仪检测。

2.4.4ELISA抗体效价的测定

免疫前、免疫后0、1、2、3、4、5、6周，从各试验组中随机抽取5羽经翅静脉采血，37℃放置1h，然后置4℃冰箱过夜，分离血清，56℃灭活30min，-20℃保存备用。抗IBV血清ELISA抗体效价的测定采用间接ELISA方法，按常规步骤进行。

2.4.5攻毒保护试验

各组试验鸡于二免疫后第3周，每组选取15只应用ILTV HN1株强毒通过口、鼻途径进行攻击，100ELD₅₀/羽。攻毒后观察各组试验鸡群的发病、死亡情况，连续观察14d后全部扑杀，取喉气管组织用常规的PCR进行病毒的检测，并计算攻毒保护率。

2.4.6数据处理

用SPSS11.5 for Windows及Microsoft Excel统计软件将所得的数据进行统计学处理，计算其平均值。

3结果与分析

3.1重组表达质粒pIRES-IL18的构建与鉴定

3.1.1鸡IL-18基因的扩增

利用特异性引物，采用PCR技术，从重组载体pGEM-T-IL-18质粒为模板中扩增出约600bp的片段，与预期增片段大小吻合，如图1所示。

3.1.2真核表达质粒pIRES-IL18的构建

将扩增的鸡白细胞介素-18基因与真核表达载体pIRES(如图2所示)分别经用BamH I和Sal I双酶切后连接，构建重组表达质粒pIRES-IL18。重组表达质粒的构建路线如图3所示。

3.1.3真核表达质粒pIRES-IL18的酶切和PCR鉴定

提取重组质粒pIRES-IL18，进行PCR扩增，扩增出了1条0.6kb左右的目的条带，经BamHI和Sal I双酶切后，出现了2条带，其中1条带为载体条带，位置约为6100bp，另1条为插入的目的条带，位置约为600bp，经SalI单酶切只切出了1条约6700bp的条带，与预期结果相符，如图4所示。

3.1.4重组表达质粒pIRES-IL18的序列鉴定及分析

将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-IL18送往宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定，结果显示，插入的鸡IL-18基因核苷酸序列为597bp，包含一个完整的开放阅读框，编码198个氨基酸，与重组质粒pGEM-T-IL18中鸡IL-18基因核苷酸序列完全一致。证明重组质粒pIRES-IL18中插入了鸡IL-18基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。

3.2真核表达质粒pIRES-gB/IL18载体的构建与鉴定

3.2.1ILTV gB基因的扩增、克隆及鉴定

利用特异性引物，以pGEM-T-gB作为模板，利用PCR技术扩增出gB基因。产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，在约2.6kb处有1条清晰带，与预期结果相符，如图5所示。

回收的PCR产物按说明书方法与pGEM-T Easy Vector载体连接，构建重组质粒pGEM-T-gB1，转化E.coli JM109感受态细胞，挑选白色菌落接种含有Amp的LB液体培养基。经PCR扩增、酶切鉴定正确的重组质粒pGEM-T-gB1进行测序测定，结果显示插入的gB基因核苷酸序列为2642bp，包含一个完整的开放阅读框(2622bp)，编码873个氨基酸，与重组质粒pGEM-T-gB中gB基因核苷酸序列完全一致。证明重组质粒pGEM-T-gB1中插入了gB基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。

3.2.2重组质粒pIRES-gB/IL18的构建

重组质粒pGEM-T-gB1经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB基因与Mlu I和Xho I双酶切回收的真核重组表达质粒pIRES-IL18进行连接，构建重组表达质粒pIRES-gB/IL18，重组表达质粒的构建路线如图3所示。

3.2.3重组质粒pIRES-gB/IL18的菌液PCR扩增

利用ILTV gB基因和鸡IL-18基因的特异性引物，采用PCR技术，以重组载体pIRES-gB/IL18质粒为模板，分别进行PCR扩增，电泳结果在约2.6kb和0.6kb处出现特异性条带，与预期两条扩增片段大小吻合，如图6所示。

3.2.4真核表达质粒pIRES-gB/IL18的酶切鉴定

重组质粒pIRES-gB/IL18经BamHI和Sal I双酶切后，出现了2条带，其中1条带为载体条带，位置约为8.7kb，另1条为插入的目的条带(ChIL-18)，位置约为0.6kb，经Sal I单酶切只切出了1条9.3kb的条带，应用扩增鸡IL-18的特异引物，以重组质粒为模板进行PCR扩增、电泳，出现1条约0.6kb的特异性条带，如图7所示，与预期结果相符；重组质粒pIRES-gB/IL18经Xho I和Mlu I双酶切后，得到约2.6kb和6.7kb的2条带，用Mlu I单酶切得到1条约9.3kb的带，如图8所示，与预期结果相一致。

3.2.5重组表达质粒pIRES-gB/IL18的序列鉴定及分析

将PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒pIRES-gB/IL18送往宝生物工程(大连)有限公司，进行序列测定，结果所测序列与重组质粒pGEM-T-gB中gB基因核苷酸序列相一致。证明重组质粒pIRES-gB/IL18中插入了gB基因的核苷酸序列及阅读框完全正确。

3.3真核表达质粒pIRES-gB/IL18转染后转录产物的鉴定

3.3.1RT-RT检测

结果表明，转染pIRES-gB/IL18的细胞中均能扩增出特异的gB和鸡IL-18基因片段，如图9所示，而以未转染重组质粒的CEF细胞总RNA为模板进行PCR扩增时则没有相应的片段。

3.3.2间接免疫荧光检测

转染细胞48h后，转染了真核表达质粒pIRES-gB/IL18的CEF细胞显示出黄绿色荧光，而转染pIRES的细胞没有显示出任何特异荧光，如图10所示，表明构建的真核表达质粒pIRES-gB/IL18能在细胞中表达ILTV gB糖蛋白。

3.4鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗免疫学试验

3.4.1CD3⁺T淋巴细胞亚群数量的动态变化

如图11所示，首次免疫后第7d，pIRES-gB和pIRES-gB/IL18组的外周血CD3⁺T淋巴细胞百分比显著高于pIRES和PBS水对照组(P＜0.05)。ILTV疫苗组免疫后第7d迅速升高。在整个试验过程中，pIRES-gB/IL18组都高于pIRES-gB组，免疫后14、28d时差异极显著(P＜0.01)，35、42d差异显著(P＜0.05)。

3.4.2CD4⁺T淋巴细胞亚群数量的动态变化

如图12所示，所有疫苗组的外周血CD4⁺T淋巴细胞百分比在免疫后迅速升高。二免后所有疫苗组CD4⁺T淋巴细胞百分比显著升高，攻毒后继续上升。pIRES-gB和pIRES-gB/IL18组一直高于空载体pIRES和PBS对照组，其中pIRES-gB/IL18组都高于pIRES-gB组，差异显著(P＜0.05)。

3.4.3CD8⁺T淋巴细胞亚群数量的动态变化

如图13所示，所有疫苗组在免疫7d后CD8⁺T淋巴细胞都明显的升高，都高于对照组及空载体组。二免后所有疫苗组CD8⁺T淋巴细胞百分比迅速升高，攻毒后继续上升。pIRES-gB/IL18组一直高于pIRES-gB组，差异显著(P＜0.05)。

3.4.4ELISA抗体效价的测定

如图14所示，各疫苗组在免疫后7d开始出现抗体，随着免疫时间的延长，其抗体水平逐渐增加。二免后其抗体水平稍有下降，然后逐渐升高。ILTV疫苗组免疫后第7d抗体水平达到较高水平。各疫苗组在整个检测过程中都高于对照组，其中pIRES-gB/IL18组高于pIRES-gB，差异不显著(P＞0.05)。表明鸡IL-18在提高鸡传染性喉气管病毒基因疫苗pIRES-gB抗体水平方面差异不显著。

3.4.5攻毒保护

各组试验鸡于二免疫后第3周，用ILTV强毒进行攻击。攻毒后每组鸡发病、死亡及保护情况的统计见表1和表2。各组均有不同程度的鸡只死亡，解剖后均具有典型的ILT病变，保护率13％～93％。对攻毒后14d扑杀的鸡只，取喉气管组织进行病毒的PCR检测，所有疫苗组均有不同数量的鸡只在喉气管组织中检测到IBV。其中pIRES-gB/IL18免疫组保护率为93％，要高于pIRES-gB组(80％)。

表1  ILTV HN1株攻毒后每组鸡的发病情况统计

表2  ILTV HN1株攻毒后每组鸡的死亡及保护情况统计

Claims (2)

1.一种鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗，其特征在于：在真核表达载体pIRES的2个多克隆位点中分别插入了ILTV HN1株gB和ChIL-18完整基因，所述双价核酸疫苗共表达鸡传染性喉气管炎病毒gB蛋白和鸡IL-18蛋白。

2.根据权利要求1所述的鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗的制备方法，其特征在于它的步骤如下：

(1)设计并合成1对扩增ChIL-18的引物，

上游引物Y1为：5’-GTAGGATCCATGAGCTGTGA AGAGAT-3’，

下游引物Y2为：5’-TACGTCGACTTATAGGTTGTGCCTTTC-3’，

上、下游引物分别加入BamHI和Sal I酶切位点，预期扩增长度为615bp；

设计并合成1对扩增ILTV gB的引物，

上游引物Y3为：5’-GTTACTCGAGATGGCTAGCTTGAAATG-3’，

下游引物Y4为：5’-GGGTACGCGTTTATTCGTCTTCGCTT-3’，

上、下游引物分别加入Xho I和Mlu I酶切位点，预期扩增长度为2.6kb；

分别以质粒pGEM-T-IL-18和pGEM-T-gB为模板，应用PCR技术，通过引物Y1/Y2扩增ChIL-18，通过Y3/Y4扩增gB基因；通过每对引物的限制性酶切位点，把gB和ChIL-18分别插入pIRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-gB/IL18重组质粒；

(2)真核重组表达载体的构建

将PCR产物ChIL-18，经BamHI和Sal I双酶切回收后插入真核表达载体pIRES的MCSB位点上，得到pIRES-IL18，重组质粒pGEM-T-gB1，经Xho I与Mlu I双酶切，回收的gB基因插入重组真核表达质粒pIRES-IL18的MCS A位点上，构建成重组质粒pIRES-gB/IL18，制成鸡传染性喉气管炎双价核酸疫苗。

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