KR101652060B1 - 재조합 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
재조합 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법을 제공한다. 아비박테리움 파라갈리나룸 A형균 및 C형균의 균체 외막 단백질 유래 각 펩티드로 이루어지는 융합 펩티드를 봉입체로서 생산하는 대장균을 구축하고, 당해 대장균을 배양한 배양물로부터 봉입체를 회수ㆍ정제하고, 수득된 봉입체를 제제화하는 공정을 포함하는, 재조합 닭 전염성 코라이자 백신의 제조방법 및 상기 융합 펩티드를 유효성분으로 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신이 제공된다. 융합 펩티드의 결합 부분에 링커서열을 삽입할 수 있다. A형균 및 C형균 유래의 펩티드로서, 함께 감염 방어능을 담당하는 영역 2내 또는 그 근방의 아미노산 서열영역이 사용된다.
Description
본원 발명은 재조합 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는, 아비박테리움 파라갈리나룸(Avibacterium paragallinarum: 이하, 「A.pg」이라고 언급하기도 한다) A형균의 균체 외막 단백질의 일부와 A.pgC형균의 균체 외막 단백질의 일부로 이루어지는 융합 펩티드를 유효성분으로 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법에 관한 것이다.
닭의 중요한 호흡기관계 질병으로서, A.pg의 감염에 의해 발병하는 닭 전염성 코라이자가 있다. 닭 전염성 코라이자를 발병한 닭은 주요 증상으로서 콧물 누출, 안면의 종창 혹은 유루(流淚)를 나타낸다. 닭 전염성 코라이자는 닭의 육성율의 저하, 산란개시의 지연, 산란율의 저하 혹은 산란정지를 가져오기 때문에, 그 경제적 손실은 크다.
Page들은 A.pg를 혈청형의 차이에 의거하여 A, B 및 C형의 3개의 형으로 분류하고(예를 들면, 비특허문헌 1 참조), Sawata들은 1형 및 2형의 2개의 형으로 분류하였다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조). 그 후에 Kume들에 의해, Page들의 A형은 Sawata들의 1형에, Page들의 C형은 Sawata들의 2형에 상당하다는 것이 보고되고(예를 들면, 비특허문헌 3 및 4 참조), 현재는 A.pg의 A형(1형)균(이하, 「A.pgA형균」이라고 언급하는 경우도 있다)과 C형(2형)균(이하, 「A.pgC형균」이라고 언급하는 경우도 있다)이 닭 전염성 코라이자의 주요한 원인균이 되고 있다.
닭 전염성 코라이자의 예방에 관해서는 종래, A.pgA형균이나 A.pgC형균의 균체를 포르말린이나 티메로살 등으로 불활성화한 불활성화 백신이 널리 사용되고 있고, 그 예방효과에 있어서 양호한 성적을 거두고 있지만, 한편으로, 이것들의 불활성화 백신을 투여하였을 경우, 접종 닭의 국소에 괴사병소의 형성이 관찰되는 등 부작용의 문제가 지적되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 5 참조). 이러한 상황 하, 안전한 백신개발의 대처로서, 유전자 재조합 기술에 의해 취득한 감염 방어항원을 백신으로 하는 재조합 백신의 연구가 이루어지고 있다.
예를 들면, Tokunaga들은 A.pgA형균의 균체 외막 단백질을 코딩하는 유전자(균체 외막 단백질 유전자)를 단리, 동정하고, 동 유전자의 일부(HPG3.5kbp, HPG4.1kbp)를 대장균에서 발현시켜서 얻은 펩티드가 닭 전염성 코라이자의 감염 방어항원으로서 유용한 것임을 발견하였다. 또, 그것들은 그 DNA 단편을 프로브로서 C형균의 균체 외막 단백질 유전자를 취득하고, A형균과 C형균에 있어서의 균체 외막 단백질 유전자의 오픈 리딩 프레임의 염기서열을 비교 해석하였다. 그 결과, 양자의 상동성은 전체에서 약 80%인 것, 5'측의 약 3.4kbp의 영역(이하, 「영역1」이라고 언급하는 경우도 있다)과 3'측의 약 1.2kbp의 영역(이하, 「영역3」이라고 언급하는 경우가 있다)은 매우 높은 상동성을 가지는 것, 및 영역1과 3에 끼워진 약 1.5kbp의 영역(이하, 「영역2」이라고 언급하는 경우도 있다)은 상동성이 낮은 것을 명백하게 하였다(예를 들면, 특허문헌 1 참조).
Tokunaga들이 발견한 균체 외막 단백질이 닭 전염성 코라이자의 방어항원으로서 중요한 것은 Noro들에 의해서도 보고되어 있다. Noro은 A.pgA형균의 균체 외막 단백질 유전자의 일부인 4,801bp 및 5,157bp의 DNA 단편에 코딩되는 펩티드를 닭에 면역하는 것에 의해, 그 펩티드가 A.pgA형균에 대한 HI항체의 유도능 및 백신효과를 가지는 것을 나타내고(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 추가로 A.pgC형균의 균체 외막 단백질 유전자의 일부인 약 5.1kbp과 5.5kbp의 DNA 단편에 코딩되는 펩티드에 관해서도 동일한 기능 및 효과가 있다는 것을 보고하였다(예를 들면, 특허문헌 3 참조).
한편, Yamamoto들도 A.pgA형균의 균체 외막 단백질 유전자의 대부분을 포함하는 2,016bp의 DNA 단편에 코딩되는 폴리펩티드를 사용하여, 닭 전염성 코라이자의 백신으로서의 유용성을 나타냈지만(예를 들면, 특허문헌 4 참조), 그들이 보고한 DNA 단편의 3'말단의 약 300bp는 Tokunaga, Noro들이 나타낸 염기서열과는 크게 다른 것이었다.
Am. J. Vet. Res., 23:85-95, 1962
Jpn. J. Vet. Sci., 40:645-652, 1978
Am. J. Vet. Res., 41:757-760, 1980
Am. J. Vet. Res., 41:1901-1904, 1980
Avian Dis., 15:109-117, 1971
상기한 바와 같이, 닭 전염성 코라이자의 주된 원인균인 A.pgA형균 및 A.pgC형균의 균체 외막 단백질 또는 그 일부로 구성되는 펩티드가 닭 전염성 코라이자의 감염 방어항원으로서 유용한 것임이 밝혀져 있다. 따라서, 이들의 감염 방어항원을 혼합하는 것에 의해, 효율적으로 닭 전염성 코라이자에 대한 면역을 실시할 수 있다. 그렇지만, 단순하게 혼합백신으로 하는 방법으로는, 2개의 감염 방어항원을 각각 제조할 필요가 있어, 제조 코스트가 증가하게 된다. 일반적으로, 동물용 백신은 인간용 백신과는 달리, 품질에 부가하여, 저가격이 아니면 축산농가에서는 사용하기 어렵다. 그 때문에, 동물용 백신에는 제조 코스트를 더욱 억제한 생산방법이 요구된다.
본원 발명자들은 상기의 목적을 달성하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, A.pgA형균 및 A.pgC형균의 균체 외막 단백질 유전자의 영역2(A.pgA형균에서는 3,639bp에서 5,162bp, A.pgC형균에서는 4,247bp에서 5,758bp의 염기서열; 도 1 및 도 2 참조)를 포함하는 약 1.6kbp의 서열에 의해 코딩되는 펩티드 단편(A.pgA형균에서는 3,558bp에서 5,192bp, A.pgC형균에서는 4,166bp에서 5,788bp의 DNA 단편에 의해 코딩되는 펩티드, 이하, 각각 「AΔ5-1」 및 「CΔ5-1」이라고 언급하는 경우가 있다(도 1 및 도 2 참조))이 닭 전염성 코라이자의 방어항원으로서 유효한 것임을 밝혀내고, AΔ5-1 을 코딩하는 DNA 단편과 CΔ5-1을 코딩하는 DNA 단편을 연결해서 발현시킨 융합 펩티드(이하, 「ACΔ5-1」이라고 언급하는 경우가 있다)는 융합한 후에 있어서도 각각의 면역원성을 지니고 있을 것, 추가로 AΔ5-1 및 CΔ5-1을 각각 단독으로 발현시켰을 경우와 동등 이상의 닭 전염성 코라이자에 대한 감염 방어효과를 나타내는 것임을 발견하였다.또 CΔ5-1은 단독으로 발현시켰을 때는 가용성의 분획으로 발현하지만, ACΔ5-1은 봉입체를 형성해서 불용성의 분획으로 발현하는 것임을 발견하고, 본원 발명을 완성하였다.
따라서, 본원 발명의 목적은 A.pgA형균의 균체 외막 단백질의 특정영역을 포함하는 펩티드 단편과 A.pgC형균의 균체 외막 단백질의 특정영역을 포함하는 펩티드 단편을 결합시킨 융합 펩티드를 유효성분으로 하는 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법을 제공하는 것에 있다.
이하, 본원 발명에서는 Tokunaga등(특허문헌 1)이 단리ㆍ동정한 A.pgA형균 및 A.pgC형균의 균체 외막 단백질을 총칭해서 「HMTp210 단백질」이라고 하고, A형균 및 C형균의 HMTp210 단백질에 유래하는 펩티드 단편을 각각 「펩티드A」 및 「펩티드C」라고 언급하는 경우도 있다.
따라서, 본원 발명은 다음과 같다.
[1] A.pgA형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드A)과 A.pgC형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드C)로 이루어지는 융합 펩티드를 봉입체로서 생산하는 숙주를 구축하는 공정, 상기의 숙주를 배양하고, 배양물로부터 봉입체 분획을 회수, 정제하는 공정, 및 상기의 정제 봉입체 분획을 함유하는 조성물을 조제하는 공정을 포함하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신의 제조방법.
[2] 상기 [1]에서, 펩티드A 및 펩티드C가 각각 600개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
[3] 상기 [1]에서, 펩티드A가 서열번호 1, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열, 및 펩티드C가 서열번호 2, 3, 4, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 56의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[4] 상기 [3]에서, 펩티드A가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 펩티드C가 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
[5] 상기 [3] 또는 [4]에서, 펩티드A 또는 펩티드C가 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 가지는 것인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 융합 펩티드의 펩티드A와 펩티드C의 비율이 펩티드A가 1에 대해서 펩티드C가 1∼3인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에서, 융합 펩티드가 적어도 1세트 펩티드A의 C말단측에 펩티드C를 결합시킨 구조를 포함하는 것인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에서, 융합 펩티드가 펩티드A와 펩티드A와의 사이, 펩티드C와 펩티드C와의 사이 또는 펩티드A와 펩티드C와의 사이에 링커를 가지는 것인 것을 특징으로 하는 제조방법.
[9] 상기 [3]에서, 융합 펩티드가 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 61, 62, 63, 64, 65, 66 및 67의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
[10] A.pgA형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드A)과 A.pgC형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드C)으로 이루어지는 융합 펩티드를 유효성분으로 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신.
[11] 상기 [10]에서, 융합 펩티드가 숙주에 의해 생산될 때에 봉입체를 형성하는 성질을 가지는 것을 특징으로 하는 백신.
[12] 상기 [10]에서, 펩티드A 및 펩티드C가 600개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
[13] 펩티드A가 서열번호 1, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열, 및 펩티드C가 서열번호 2, 3, 4, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 56의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열인 것을 특징으로 하는 백신.
[14] 상기 [13]에서, 펩티드A가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 펩티드C가 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
[15] 상기 [13] 또는 [14]에서, 펩티드A 또는 펩티드C가 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 가지는 것인 것을 특징으로 하는 백신.
[16] 상기 [10] 내지 [15] 중 어느 하나에서, 융합 펩티드의 펩티드A와 펩티드C의 비율이 펩티드A가 1에 대해서 펩티드C가 1∼3인 것을 특징으로 하는 백신.
[17] 상기 [10] 내지 [16] 중 어느 하나에서, 융합 펩티드가 적어도 1세트의 펩티드A의 C말단측에 펩티드C를 결합시킨 구조를 포함하는 것인 것을 특징으로 하는 백신.
[18] 상기 [10] 내지 [17] 중 어느 하나에서, 융합 펩티드가 펩티드A와 펩티드A와의 사이, 펩티드C와 펩티드C와의 사이 또는 펩티드A와 펩티드C와의 사이에 링커를 가지는 것인 것을 특징으로 하는 백신.
[19] 상기 [13]에서, 융합 펩티드가 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 61, 62, 63, 64, 65, 66 및 67의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
[20] 서열번호 1의 아미노산 서열의 N말단측 및/또는 C말단측에 1∼200의 아미노산이 부가된 아미노산 서열 내이고, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신.
[21] 상기 [20]에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 백신.
[22] 서열번호 3의 아미노산 서열의 N말단측 및/또는 C말단측에 1∼200의 아미노산이 부가된 아미노산 서열 내이고, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신.
[23] 상기 [22]에서, 서열번호 3 또는 52의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 백신.
[24] 상기 [21] 또는 [23]에서, 펩티드가 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 가지는 것인 백신.
본원 발명에 따르면, A.pgA형균의 HMTp210 단백질의 펩티드 단편과 A.pgC형균의 HMTp210 단백질의 펩티드 단편을 결합시킨 융합 펩티드를 유효성분으로 하는 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법이 제공된다. 본원 발명의 닭 전염성 코라이자 백신은 A.pgA형균 및 A.pgC형균의 각각에 기인하는 닭 전염성 코라이자를 예방하기 위한 면역을 동시에 부여할 수 있다.
또 본원 발명에 방법에 따르면, 예를 들면 단독으로 발현시켰을 때는 가용성의 분획에 발현하는 CΔ5-1을 AΔ5-1과 결합시킨 하나의 융합 펩티드로서 발현시키는 것에 의해, 봉입체를 형성시키고, 불용분획으로 발현시킬 수 있다. 그 결과, 그융합 펩티드의 정제가 용이해질 뿐만 아니라, A.pgA형균, A.pgC형균의 각각에 대응한 감염 방어항원을 한번의 배양으로 제작할 수 있으므로 제조 코스트의 저감을 가져온다.
도 1은 A.pgA형균의 HMTp210 유전자(HMTp210A 유전자)에 있어서의 AΔ5-1 단편의 위치를 나타내는 도면이다. 도면 중에 기재된 염기서열번호는 특허문헌 1(Tokunaga들)에 개시된 염기서열번호에 상당한다.
도 2는 A.pgC형균의 HMTp210 유전자(HMTp210C 유전자)에 있어서의 CΔ4c-1, CΔ5-1 및 CΔ6b-1b단편의 위치를 나타내는 도면이다. 도면 중에 기재된 염기서열번호는 특허문헌 1(Tokunaga들)에 개시된 염기서열번호에 상당한다.
도 3은 융합 펩티드 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 상청액 및 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: AΔ5-1/CΔ4c-1(침전물 분획), 래인 2: AΔ5-1/CΔ4c-1(상청액 분획), 래인 3: ACΔ5-1(침전물 분획), 래인 4: ACΔ5-1(상청액 분획), 래인 5: AΔ5-1/CΔ6b-1b(침전물 분획), 래인 6: AΔ5-1/CΔ6b-1b(상청액 분획). 화살표는 발현한 융합 펩티드를 나타낸다.
도 4는 A.pgA형균의 HMTp210 유전자(HMTp210A 유전자)에 있어서의 AΔ5-1, AΔ5-2, AΔ5-3, AΔ5-4, AΔ9-2, AΔ9-3, AΔ9-4, AΔ6-2, AΔ6-3 및 AΔ6-4 단편의 위치를 나타내는 도면이다. 도면 중에 기재된 염기서열번호는 특허문헌 1(Tokunaga들)에 개시된 염기서열번호에 상당한다.
도 5는 A.pgC형균의 HMTp210 유전자(HMTp210C 유전자)에 있어서의 CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 및 CΔ6-4단편의 위치를 나타내는 도면이다. 도면 중에 기재된 염기서열번호는 특허문헌 1(Tokunaga들)에 개시된 염기서열번호에 상당한다.
도 6은 융합 펩티드 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: ACΔ5-1(침전물 분획), 래인 2: AΔ5-2/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 3: AΔ5-3/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 4: AΔ5-4/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 5: AΔ9-2/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 6: AΔ9-3/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 7: AΔ9-4/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 8: AΔ6-2/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 9: AΔ6-3/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 10: AΔ6-4/CΔ5-1(침전물 분획). 화살표는 발현한 융합 펩티드를 나타낸다.
도 7은 융합 펩티드 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: ACΔ5-1(침전물 분획), 래인 2: AΔ5-1/CΔ5-2(침전물 분획), 래인 3: AΔ5-1/CΔ5-4(침전물 분획), 래인 4: AΔ5-1/CΔ9-0(침전물 분획), 래인 5: AΔ5-1/CΔ9-2(침전물 분획), 래인 6: AΔ5-1/CΔ9-4(침전물 분획), 래인 7: AΔ5-1/CΔ6-2(침전물 분획), 래인 8: AΔ5-1/CΔ6-4(침전물 분획). 화살표는 발현한 융합 펩티드를 나타낸다.
도 8은 펩티드C 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 상청액 또는 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: CΔ5-1-pQE(상청액 분획), 래인 2: CΔ5-2-pQE(상청액 분획), 래인 3: CΔ5-4-pQE(상청액 분획), 래인 4: CΔ9-0-pQE(상청액 분획), 래인 5: CΔ9-2-pQE(상청액 분획), 래인 6: CΔ9-4-pQE(상청액 분획), 래인 7: CΔ6-2-pQE(침전물 분획), 래인 8: CΔ6-4-pQE(상청액 분획). 화살표는 발현한 펩티드를 나타낸다.
도 2는 A.pgC형균의 HMTp210 유전자(HMTp210C 유전자)에 있어서의 CΔ4c-1, CΔ5-1 및 CΔ6b-1b단편의 위치를 나타내는 도면이다. 도면 중에 기재된 염기서열번호는 특허문헌 1(Tokunaga들)에 개시된 염기서열번호에 상당한다.
도 3은 융합 펩티드 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 상청액 및 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: AΔ5-1/CΔ4c-1(침전물 분획), 래인 2: AΔ5-1/CΔ4c-1(상청액 분획), 래인 3: ACΔ5-1(침전물 분획), 래인 4: ACΔ5-1(상청액 분획), 래인 5: AΔ5-1/CΔ6b-1b(침전물 분획), 래인 6: AΔ5-1/CΔ6b-1b(상청액 분획). 화살표는 발현한 융합 펩티드를 나타낸다.
도 4는 A.pgA형균의 HMTp210 유전자(HMTp210A 유전자)에 있어서의 AΔ5-1, AΔ5-2, AΔ5-3, AΔ5-4, AΔ9-2, AΔ9-3, AΔ9-4, AΔ6-2, AΔ6-3 및 AΔ6-4 단편의 위치를 나타내는 도면이다. 도면 중에 기재된 염기서열번호는 특허문헌 1(Tokunaga들)에 개시된 염기서열번호에 상당한다.
도 5는 A.pgC형균의 HMTp210 유전자(HMTp210C 유전자)에 있어서의 CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 및 CΔ6-4단편의 위치를 나타내는 도면이다. 도면 중에 기재된 염기서열번호는 특허문헌 1(Tokunaga들)에 개시된 염기서열번호에 상당한다.
도 6은 융합 펩티드 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: ACΔ5-1(침전물 분획), 래인 2: AΔ5-2/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 3: AΔ5-3/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 4: AΔ5-4/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 5: AΔ9-2/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 6: AΔ9-3/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 7: AΔ9-4/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 8: AΔ6-2/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 9: AΔ6-3/CΔ5-1(침전물 분획), 래인 10: AΔ6-4/CΔ5-1(침전물 분획). 화살표는 발현한 융합 펩티드를 나타낸다.
도 7은 융합 펩티드 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: ACΔ5-1(침전물 분획), 래인 2: AΔ5-1/CΔ5-2(침전물 분획), 래인 3: AΔ5-1/CΔ5-4(침전물 분획), 래인 4: AΔ5-1/CΔ9-0(침전물 분획), 래인 5: AΔ5-1/CΔ9-2(침전물 분획), 래인 6: AΔ5-1/CΔ9-4(침전물 분획), 래인 7: AΔ5-1/CΔ6-2(침전물 분획), 래인 8: AΔ5-1/CΔ6-4(침전물 분획). 화살표는 발현한 융합 펩티드를 나타낸다.
도 8은 펩티드C 생산 대장균의 파쇄물을 원심분리한 상청액 또는 침전물 분획의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
M: 마커, 래인 1: CΔ5-1-pQE(상청액 분획), 래인 2: CΔ5-2-pQE(상청액 분획), 래인 3: CΔ5-4-pQE(상청액 분획), 래인 4: CΔ9-0-pQE(상청액 분획), 래인 5: CΔ9-2-pQE(상청액 분획), 래인 6: CΔ9-4-pQE(상청액 분획), 래인 7: CΔ6-2-pQE(침전물 분획), 래인 8: CΔ6-4-pQE(상청액 분획). 화살표는 발현한 펩티드를 나타낸다.
본원 발명의 특징은 아비박테리움 파라갈리나룸(「A.pg」라고 약칭한다) A형균의 HMTp210 단백질 유래의 펩티드A와 A.pgC형균의 HMTp210 단백질 유래의 펩티드C로 이루어지는 봉입체 형성 융합 펩티드를 제작하는 공정을 포함하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신의 제조방법에 있다. 더 구체적으로는, 본원 발명의 특징은 A.pgA형균의 HMTp210 단백질의 펩티드 단편 및 A.pgC형균의 HMTp210 단백질의 펩티드 단편으로 구성되는 융합 펩티드를 봉입체로서 생산하는 숙주를 구축하는 공정, 상기의 숙주를 배양하고, 배양물로부터 봉입체 분획을 회수, 정제하는 공정, 및 상기의 정제 봉입체 분획을 함유하는 조성물을 조제하는 공정을 포함하는 닭 전염성 코라이자 백신의 제조방법 및 상기 융합 펩티드를 유효성분으로 함유하는 닭 전염성 코라이자 백신에 있다.
A.pgA형균의 HMTp210 단백질의 아미노산 서열(서열번호 25)을 코딩하는 유전자(이하, 「HMTp210A 유전자」라고 언급하는 경우도 있다) 및 A.pgC형균의 HMTp210 단백질의 아미노산 서열(서열번호 26)을 코딩하는 유전자(이하, 「HMTp210C 유전자」라고 언급하는 경우도 있다)의 일부로 이루어지는 DNA 단편은 이하의 방법에 따라서 취득할 수 있다.
A.pgA형균 및 A.pgC형균에는 여러 종류의 분리주가 존재하지만, 본원 발명에 있어서의 사용에 있어서는 특별하게 한정되지 않는다. 지금까지 A.pgA형균으로서, 예를 들면 221주, O83주 및 W주 등, A.pgC형균으로서, 예를 들면 53-47주, modesto주 및 HK-1주 등이 분리되고 있어, 이들 주간에는 1개에서 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가한 돌연변이가 생각되지만, 본 발명에는 어느 쪽의 주도 사용 될 수 있다.
A.pgA형균 및 A.pgC형균의 증식에는 폴리펩톤, 포도당, 카사미노산, 글루탐산나트륨, 효모엑스, 염화나트륨, 닭 육수, βNAD, 닭혈청 등을 적당히 함유하는 배지가 사용된다. 본원 발명에서는 소ㆍ중 용량의 균체증식을 위해서, 닭혈청이 첨가된 닭육즙 배지(배지 1,000㎖ 중, 폴리펩톤S 5g, 카사미노산 1g, 염화나트륨 5g, L-글루탐산나트륨 5g, 글루코스 1g, 효모엑스 10g, 닭육수 175㎖, 닭혈청 25㎖, 니코틴아미드ㆍ아데닌ㆍ디뉴클레오티드(β-NAD) 0.025%를 포함한다)를 사용하였다. 배양조건은 통상, 온도 37℃, 기간 16∼24시간의 범위로 설정되지만, 사용목적, 배양형태, 이식한 균량, 배지 스케일 등에 따라서 적당하게 조절할 수 있다.
배양액 중의 균체는 원심분리(5,800g, 20분간)에 의해 침전물에 회수된다. HMTp210A 유전자 및 HMTp210C 유전자(이하, 특히 양자를 구별하는 필요가 없은 경우에는 단순하게 「HMTp210 유전자」라고 언급하기도 한다)는 균체로부터 추출한 게놈 DNA를 출발재료로 하고, Sambrook들이 기술하고 있는 일반적인 유전자 재조합 기술(Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989)에 따라서 조제할 수 있다. 또, 시판의 키트가 사용된다. 예를 들면 염색체 DNA의 추출에는 PureGene Kit(GentraSystems사), SepaGene kit(SankoJunyaku사), ISOPLANT(WakoJunyaku사) 등이 사용된다.
더 구체적으로는, 원심분리에 의해 회수된 균체로부터 PureGene Kit(GentraSystems사) 등을 사용해서 염색체 DNA를 추출하고, Tokunaga들 의 방법(특허문헌 1)에 따라서, 균체의 게놈 DNA 라이브러리를 조제한다. 수득된 DNA 단편을 주형(템플레이트)으로 하고, Prime STAR HS DNA Polymerase(다카라바이오주식회사)를 사용하고, 첨부된 프로토콜에 따라서, PCR 법에 의해 소망하는 사이즈의 DNA 단편이 증폭된다. PCR에 사용하는 프라이머는 Tokunaga들이 개시한 A.pgA형균 및 A.pgC형균 유래의 HMTp210 유전자의 염기서열(특허문헌 1)에 의거하여 설계된다. PCR용 프라이머는 DNA 합성 수탁기관(예를 들면 Sigma Genosys Japan사) 등에 의뢰하면 용이하게 입수 가능한다. 이 때 상류측 Primer의 5'말단 및 하류측 Primer의 5'말단에 적당한 제한효소 절단부위의 염기서열이 부가된다.
본원 발명의 융합 펩티드를 코딩하는 DNA 단편은 상기에서 수득된 HMTp210A 유전자의 DNA 단편과 HMTp210C 유전자의 DNA 단편을 직접적으로 혹은 일단 제한효소로 절단한 후, DNA 합성효소로 결합시키는 것에 의해 수득된다. 이 때, HMTp210A 유전자의 DNA 단편과 HMTp210C 유전자의 DNA 단편 사이에 적당한 사이즈의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 코딩하는 DNA 단편을 부가할 수도 있다. 아미노산으로서는 자유도가 큰 글리신, 세린 등의 중성 아미노산의 사용이 바람직하고, 1종류의 아미노산으로 이루어지는 링커 또는 2종류 이상의 아미노산으로 이루어지는 링커가 사용된다. 링커의 사이즈는 일반적으로는 5∼20 아미노산이 사용되지만, 바람직하게는 10∼15 아미노산이다.
본원 발명에는 A.pgA형균 및 A.pgC형균에 대한 감염 방어능을 가지며, 또한 봉입체를 형성하는 융합 펩티드를 코딩하는 HMTp210A 유전자 및 HMTp210C 유전자의 DNA 단편이 사용된다. 이러한 DNA 단편으로서, 예를 들면 균체 외막 단백질의 영역2의 펩티드를 코딩하는 DNA 단편, 동 영역2와 그 N말단측 및/또는 C말단측의 아미노산 서열이 부가된 펩티드를 코딩하는 DNA 단편, 동 영역2와 그 N말단측 또는 C말단측의 아미노산 서열이 부가되고, 한쪽의 반대측의 N말단측 또는 C말단측의 아미노산 서열이 결실한 펩티드를 코딩하는 DNA 단편, 동 영역2의 N말단측 및/또는 C말단측의 아미노산 서열이 결실한 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 들 수 있다. 상기의 부가 또는 결실되는 아미노산 서열의 개수는 1∼200개, 바람직하게는 30∼150개이다.
바람직하게는, 서열번호 1, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 A.pgA형균의 HMTp210 단백질 유래의 펩티드, 및 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지는 A.pgC형균의 HMTp210 단백질 유래의 펩티드를 코딩하는 DNA 단편이다. 상기의 펩티드의 아미노산의 1 내지 수개가 치환, 결실 또는 부가된 돌연변이 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 사용할 수도 있다. 여기에서, 「아미노산의 1 내지 수개가 치환, 결실 또는 부가된 돌연변이 펩티드」란, 아미노산이 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개가 치환, 결실 또는 부가된 돌연변이 펩티드를 말한다. 이러한 돌연변이 펩티드를 코딩하는 DNA 단편은 상기의 펩티드를 코딩하는 DNA 단편에 상보적인 염기서열을 가지는 DNA 단편과 스트리전트한 조건으로 하이브리다이즈시키는 방법이나 부위 지정 돌연변이(site directed mutagenesis)에 의한 돌연변이 도입법에 의할 수 있을 수 있다. 어느 것이나 키트가 시판되고 있으므로 이것들을 이용할 수 있다.
또, HMTp210A 유전자 유래의 DNA 단편 및 HMTp210C 유전자 유래의 DNA 단편은 융합 펩티드가 봉입체를 형성한다면, 어떤 조합일 수도 있다. 예를 들면 융합 펩티드를 코딩하는 DNA 단편은 HMTp210A 유전자 유래의 DNA 단편의 하류에 HMTp210C 유전자 유래의 DNA 단편을 결합시킨 것일 수도 있고, 그 반대일 수도 있다. 또 융합 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 탠덤으로 결합시킬 수도 있고, 또 HMTp210A 유전자 유래의 DNA 단편을 2개 이상 연결하였지만 하류에 HMTp210C 유전자 유래의 DNA 단편을 2개 이상 연결할 수도 있다. 또, 융합 펩티드를 코딩하는 DNA 단편은 HMTp210A 유전자 유래의 DNA 단편1에 대해서, HMTp210C 유전자 유래의 DNA 단편1∼3의 비율로 구성된다. 바람직하게는 당해 비율은 1:1이다. 수득된 DNA 단편의 염기서열은 일단 pBluescript II SK+(Stratagene사) 또는 pCR2.1-TOPO(Invitrogen사)에 클로닝한 후, DNA시퀀서(ABI Prism 377 Applied Biosystems)에 의해 결정된다.
이렇게 해서 수득된 A.pgA형균 및 A.pgC형균 유래의 DNA 단편 혹은 융합 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 적당한 발현벡터에 통합하고, 이것을 숙주에 도입하는 것에 의해서, 각 DNA 단편의 발현이 수행된다. 외래단백이나 펩티드의 발현에는 세균, 효모, 동물세포, 식물세포 및 곤충세포 등이 상용되지만, 봉입체를 형성하는 것이라면 어떠한 숙주도 사용할 수 있다. 숙주세포를 형질전환할 때에는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 인산 칼슘법, DEAE덱스트란법, 리포펙틴계의 리포솜을 사용하는 방법, 프로토플래스트 폴리에틸렌글리콜 융합법, 일렉트로포레이션법, 히트쇼크법 등을 이용할 수 있고, 사용하는 숙주세포에 의해 적당한 방법을 선택할 수 있다. 바람직하게는 외래 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있는 대장균이 사용된다.
대장균 발현용으로 trp프로모터, T7프로모터, cspA프로모터 등을 가지는 여러 가지의 발현벡터가 개발ㆍ시판되고 있으므로 이들 중에서 적당하게 선택해서 사용할 수 있다. 이러한 발현벡터로서 예를 들면 pET-11d(메르크주식회사)나 pQE30(Qiagen사)를 들 수 있다. 발현벡터에 맞추어서 적당한 대장균, 예를 들면BL21, HMS174, DH5α, HB101, JM109등이 숙주로서 선택된다. 대장균의 형질전환은 시판의 컴피턴트셀을 사용하고, 첨부된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 이렇게 해서 소망하는 폴리펩티드를 생산하는 재조합 대장균이 수득된다. 대장균의 배양에 사용되는 배지(예를 들면, LB, SOC, SOB 등), 형질전환체의 선택에 사용할 수 있는 시약(예를 들면 암피실린 등) 및 발현유도에 사용되는 시약(예를 들면 인돌 아세트산(IAA), 아이소프로필 티오-베타-D-갈락토피라노사이드(IPTG))은 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 또 배지의 pH는 대장균의 증식에 적합한 범위(pH6∼8)에서 사용할 수 있다.
목적의 펩티드(목적물)을 발현하고 있는 재조합 대장균의 스크리닝은 다음과 같이 수행된다. 발현 유도제(본 발명에 사용한 발현 시스템에서는 IPTG를 사용)의 존재 하에, 배양ㆍ증식한 균체를 원심분리(9,100g, 5분간)에 의해 회수하고, 이것에 일정한 증류수 혹은 PBS를 첨가하고 현탁한 후, 초음파처리, 또는 French press, Menton Gaulin 등의 호모게나이저에 의해 균체를 파쇄하고, 원심분리(예를 들면 17,800g, 15분간)해서 침전물 및 상청액을 분리ㆍ회수한다. 증류수에, 적당하게 계면활성제(예를 들면Triton X100), 킬레이트제(예를 들면 EDTA), 리소자임 등을 첨가할 수 있다. 회수한 상청액 및 침전물의 일정량을 SDS-폴리아크릴아미드 겔전기영동에 걸고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 후, 분자사이즈 및 염색 상으로부터 목적물의 발현을 확인한다. 또, 목적물의 확인(또는 검출)에는 상기의 분자사이즈에 의거하는 방법 이외에, ELISA법, 웨스턴 블롯법, 도트-블롯법 등의 항원항체반응에 의거하는 방법이 선택되는 경우도 있다. 어느 것이나 대장균에서 발현시킨 외래 단백질이나 폴리펩티드를 검출할 때의 일반적인 방법이고, 목적에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 이렇게 해서 침전물로 회수되는 클론, 즉, 봉입체를 형성하는 융합 펩티드 생산 클론이 선택된다.
상기의 융합 펩티드 생산 클론으로부터 봉입체를 회수할 때는, 이하의 방법에 따를 수 있다. 우선, 원심분리기나 적당 사이즈의 MF막(아사히화성사)을 사용해서 균체가 회수된다. 회수한 균체를 적절한 방법으로 파쇄하고, 융합 펩티드로 이루어지는 봉입체를 균체 외로 방출시킨다. 균체의 파쇄에는 예를 들면 화학물질, 계면활성제, 효소 등으로 용해시키는 방법 또는 French press나 초음파처리 등의 물리적처리에 의한 방법이 선택되지만, 어떤 방법일 수 있다. 이들의 방법을 수개 조합하는 것에 의해 더 효과적으로 균체를 파쇄할 수 있다.
예를 들면, MF막으로 회수한 균체를 탈이온수로 희석 농축해서 잔존하는 배지성분 및 균체의 대사산물 등을 제거한 후, 적당한 완충액 및 리소자임을 첨가하고, 저온(4∼15℃)에서 하룻밤 정치해서 균체의 세포벽을 용해하고, 이 균체 처리액을 500∼600kg/㎠의 조건으로 French press(Menton Gaulin사)에 걸고, 균체를 파쇄한다. 완충액의 종류는 트리스버퍼 등 리소자임이 작용하는 pH범위(7.5∼9)에서 완충능력을 가지는 것이라면 특별하게 제한되지 않는다. 당해 완충액의 농도는 일반적으로 완충액으로 사용되는 범위(10∼50mM)로 사용할 수 있다. 리소자임은 0.3∼1.0g/ℓ의 농도로 사용된다. 예를 들면 20mM의 pH8.5의 트리스버퍼를 첨가하고, 리소자임(0.6g/ℓ)을 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하고 균체의 세포벽을 용해한다. French press로 균체를 파쇄한 후, 완충액이나 탈이온수와 MF막으로 이 파쇄액의 희석과 농축을 반복하는 것에 의해 대부분의 균체 성분이 제거된다. 경우에 따라서는, Triton-X100 등의 계면활성제를 첨가하는 경우도 있다. 봉입체는 농축한 봉입체 함유용액을 원심분리하는 것에 의해, 침전으로서 회수된다.
회수된 봉입체는 일단, 변성제를 함유하는 용액으로 용해된다. 변성제로서 요소, 구아니딘염산염 등을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 요소이다. 이러한 요소 및 구아니딘염산염은 각각 4∼8M 및 2∼6M의 농도범위에서 사용된다. 본원 발명에 있어서는 8M요소를 사용하는 것이 바람직하다. 변성제 및 환원제를 용해할 때는 pH6∼9의 완충액을 사용할 수 있다. 바람직하게는, pH7∼8이다. 완충액은 상기의 pH범위에서 완충능력을 가지는 인산완충액, 트리스완충액, 글리신완충액, 탄산완충액 등 어느 것이나 사용할 수 있다. 용해시의 온도는 40℃이하라면 특별히 제한할 필요는 없다. 용해시간은 봉입체의 용해상황을 보면서 설정할 수 있고, 통상, 30분∼1시간 교반된다.
다음에, 봉입체의 용해액에, 당해 용해액에 대해서 10∼20배량의 완충액을 첨가하는, 혹은 완충액에 대해서 투석하는 것에 의해, 융합 펩티드의 리폴딩, 즉 정상인 입체구조의 재구축이 수행된다. 리폴딩할 때의 완충액의 종류 및 농도, pH는 봉입체를 용해할 때와 동일한 것을 사용할 수 있다. 리폴딩시의 온도는 실온이하라면 특별히 제한할 필요는 없다. 리폴딩은 1∼7일간, 바람직하게는 3∼4일간, 정치하는 것에 의해 이루어진다.
융합 펩티드 함유용액은 필요에 따라서 다음 정제공정에 적용된다. 이러한 정제공정에는 일반적으로, 단백질화학에 있어서 사용되는 정제방법, 예를 들면 원심분리, 염석법, 한외여과법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환 크로마토그래피법, 겔여과크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 소수 크로마토그래피법, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피법 등의 방법을 조합시킨 방법이 사용된다. 수득된 단백질이나 폴리펩티드의 량은 BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce Biotechnology, Inc), Protein Assay Kit(BIO-RAD, Inc) 등의 단백측정 시약을 사용해서 측정된다.
본 발명의 융합 펩티드의 닭 전염성 코라이자 백신으로서의 유용성은 당해 융합 펩티드 함유 용액으로 닭을 면역하고, 수득되는 혈청 중의 A.pgA형균 및 A.pgC형균에 대한 항체값을 조사하는 것에 의해, 혹은 당해 면역닭을 강독균으로 공격시험을 실시하여 닭의 생사, 안면종창, 콧물누출, 유루 등의 임상증상을 관찰하는 것에 의해 나타낼 수 있다. 닭에 면역할 때에는, 융합 펩티드에 후술하는 제제화에 사용되는 면역부활제(어쥬번트)를 첨가하는 경우도 있다. 투여방법에 대해서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면 피하, 피내, 복강내, 점비 등에, 통상 1∼3회, 2∼4주 간격으로 투여된다.
본 발명의 융합 펩티드를 백신으로 제제화할 때에는, 당해 융합 펩티드 함유 액을 멤브레인 필터 등으로 무균 여과하고, 이것에, 필요에 따라서 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 광유 및 비광유 등의 면역부활제(어쥬번트), 폴리솔베이트80, 아미노산 및 락토오스나 수크로오스 등의 당 등의 안정제 및 포르말린, 티메로살, 2-페녹시에탄올, 벤질알코올, 염화벤제토늄 및 염화벤잘코늄 등의 보존제가 첨가된다. 또 부형제로서의 효과를 가지는 락토오스, 수크로오스 등의 당을 첨가하는 것에 의해, 동결건조제제로서 제제화하는 것도 가능하다. 이렇게 해서 본 발명의 융합 펩티드를 유효성분으로 함유하는 백신이 제조된다.
수득된 백신은 단독으로 닭 전염성 코라이자 백신으로 사용할 수도 있고, 다른 바이러스(예를 들면 닭 전염성 기관지염 바이러스, 닭 전염성 파브리우스낭병 바이러스, 닭뇌척수염 바이러스, 산란 저하 증후군 바이러스), 세균(예를 들면 살모넬라 티피뮤리움, 살모넬라 엔터라이티스, 살모넬라 폴로룸) 및 원충(예를 들면 류코싸이토준 카울레리, 에이메리아 테네라, 아이메리아 멕시마)에 대한 백신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1종류의 백신과 조합하는 것에 의해 혼합 백신으로서 사용할 수도 있다.
실시예
이하, 실시예에 따라서, 본원 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 하기의 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다.
실시예
1
《융합 펩티드 발현용 플라스미드의 구축》
A.pgA형균 221주 및 A.pgC형균 53-47주의 게놈 DNA 라이브러리를 Tokunaga들 의 방법(특허문헌 1)에 의해 조제하였다. 간단하게는, 원심분리(토미정공사, RD-20PIV, 4,400g, 20분간)에 의해 회수한 균체로부터 PureGene Kit(GentraSystems사)를 사용해서 게놈 DNA를 추출하고, 그 DNA를 주형(템플레이트)으로 하고, Prime STAR HS DNA 폴리머라제(다카라바이오주식회사)를 사용해서 PCR를 실시하고, A.pgA형균 및 A.pgC형균의 HMTp210 단백질 유전자의 DNA 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 98℃에서 1분간 반응한 후, 열변성(98℃에서 10초간), 어닐링(55℃에서 15초간), 신장반응(72℃에서 120초간의 반응)을 15사이클 실시하고, 정지반응(72℃에서 7분간)으로 실시하였다.
각 DNA 단편 및 증폭에 사용한 PCR프라이머의 명칭과 서열번호를 표 1에 나타낸다. A.pgA형균의 DNA 단편을 증폭하기 위한 5'프라이머에 NcoI 인식서열을, 3'프라이머에 BamHI 인식서열을 부가하고, A.pgC형균의 DNA 단편을 증폭하기 위한 프라이머에는 5' 및 3'프라이머의 어느 쪽에도 BamHI 인식서열을 부가하였다. 도 1 및 2에, 수득된 각 DNA 단편의 위치관계를 나타낸다. 또, 표 중의 DNA 단편의 란에 기재된 서열번호는 각 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.
발현 플라스미드는 아래와 같이 제조하였다. 우선, AΔ5-1을 NcoI 및 BamHI로 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하였다. 수득된 단편을, NcoI 및 BamHI로 소화한 발현벡터 pET-11d(메르크주식회사)에 결합하고, 이것을 사용해서 대장균 BL21(DE3)주(메르크주식회사)을 형질전환하였다. 이 형질전환체로부터 Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega사)을 사용해서 발현 플라스미드(pET-11d-AΔ5-1)를 추출하였다.
다음에, CΔ4c-1, CΔ5-1 및 CΔ6b-1b를 BamHI로 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하였다. 추가로, 수득된 단편을, 미리 BamHI로 소화시킨 pET-11d-AΔ5-1에 정방향으로 연결하고, 이것을 사용해서 대장균 BL21(DE3)주(메르크주식회사)을 형질전환하고, 각 발현 플라스미드(pET-11d-AΔ5-1-CΔ4c-1, pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1 및 pET-11d-AΔ5-1-CΔ6b-1b)를 얻었다. 구축된 각 발현 플라스미드에 있어서, CΔ4c-1, CΔ5-1 및 CΔ6b-1b는 AΔ5-1의 바로 아래에 정방향으로 삽입되고 있고, 표 2의 융합 펩티드가 수득된다.
실시예
2
《링커 부가 융합 펩티드 발현용 플라스미드의 구축》
링커 서열을 부가하기 위해서, 실시예 1과 동일한 방법에 따라서 A.pg의 HMTp210 단백질 유전자의 DNA 단편을 증폭하였다. 각 DNA 단편 및 증폭에 사용한 PCR 프라이머의 명칭과 서열번호를 표 3에 나타낸다. 5'프라이머에는 XbaI 인식서열을, 3'프라이머에는 BamHI 인식서열을 부가하였다. 또, 표 중의 DNA 단편의 란에 기재된 서열번호는 각 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.
AΔ5-1의 바로 아래에 링커 서열을 부가한 발현 플라스미드는 아래와 같이 제조하였다. 우선, 실시예 1에서 얻은 AΔ5-1을 NcoI 및 BamHI로 소화하고, 0.8% 아가로오스 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하였다. 이어서, 수득된 단편의 C말단측에 10개의 글리신을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 링커 서열(Gly Linker; 서열번호 24)을 DNA 리가제로 부가한 DNA 단편(AΔ5-1-L)을 얻었다. 이 링커서열의 부가에 의해, AΔ5-1의 C말단측의 BamHI 인식서열이 소실하고, 새롭게 XbaI 인식서열이 발생한다.
다음에, CΔ4c-1, CΔ5-1 및 CΔ6b-1b을 XbaI 및 BamHI로 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하였다. 수득된 각 단편을 AΔ5-1과 라이게이션후, BamHI로 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하였다. 추가로 수득된 단편을 NcoI 및 BamHI로 소화한 발현벡터 pET-11d(메르크주식회사)에 삽입하고, 이것을 사용해서 대장균 BL21(DE3)주(메르크주식회사)을 형질전환하고, 발현 플라스미드(pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ4c-1, pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ5-1 및 pET-11d-AΔ5-1-L-CΔ6b-1b)를 얻었다. 구축된 발현 플라스미드에 있어서, CΔ4c-1, CΔ5-1 및 CΔ6b-1b는 링커서열의 바로 아래에 정방향으로 삽입되어 있고, 링커서열에 유래하는 글리신을 통해서 표 4의 융합 펩티드가 수득된다.
실시예
3
《단축형 융합 펩티드 발현용 플라스미드의 구축1》
A.pgA형균 221주의 게놈 DNA라이브러리를 실시예 1과 동일한 방법에 따라서 조제하고, PCR 에 의해 표 5의 DNA 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 98℃에서 1분 반응후, 열변성(98℃에서 10초간), 어닐링ㆍ신장반응(70℃에서 120초간)을 15사이클 실시하고, 정지반응(72℃에서 7분간)으로 실시하였다. 이들 단편을 가지는 발현 플라스미드(pET-11d-AΔ5-1, pET-11d-AΔ5-2, pET-11d-AΔ5-3, pET-11d-AΔ5-4, pET-11d-AΔ9-2, pET-11d-AΔ9-3, pET-11d-AΔ9-4, pET-11d-AΔ6-2, pET-11d-AΔ6-3 및 pET-11d-AΔ6-4)를 추출하였다. 각 DNA 단편의 증폭에 사용한 PCR 프라이머의 명칭과 서열번호를 표 5에 나타낸다. 5'프라이머에 NcoI 인식서열을, 3'프라이머에 BamHI 인식서열을 부가하였다. 도 4에, 수득된 각 DNA 단편의 위치관계를 나타낸다. 또, 표 중의 DNA 단편의 란에 기재된 서열번호는 각 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.
다음에, 실시예 1에서 얻은 CΔ5-1을 BamHI로 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하였다. 추가로, 수득된 단편을 미리 BamHI로 소화한 pET-11d-AΔ5-1, pET-11d-AΔ5-2, pET-11d-AΔ5-3, pET-11d-AΔ5-4, pET-11d-AΔ9-2, pET-11d-AΔ9-3, pET-11d-AΔ9-4, pET-11d-AΔ6-2, pET-11d-AΔ6-3 및 pET-11d-AΔ6-4에 정방향으로 연결하고, 이것들을 사용해서 대장균 BL21(DE3)주(메르크주식회사)를 형질전환하고, 각 발현 플라스미드(pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1, pET-11d-AΔ5-2-CΔ5-1, pET-11d-AΔ5-3-CΔ5-1, pET-11d-AΔ5-4-CΔ5-1, pET-11d-AΔ9-2-CΔ5-1, pET-11d-AΔ9-3-CΔ5-1, pET-11d-AΔ9-4-CΔ5-1, pET-11d-AΔ6-2-CΔ5-1, pET-11d-AΔ6-3-CΔ5-1 및 pET-11d-AΔ6-4-CΔ5-1)를 얻었다. 구축된 각 발현 플라스미드에 있어서, CΔ5-1은 펩티드A발현 유전자의 바로 아래에 정방향으로 삽입되어 있고, 표 6의 융합 펩티드가 수득된다.
실시예
4
《단축형 융합 펩티드 발현용 플라스미드의 구축2》
A.pgC형균 53-47주의 게놈 DNA 라이브러리를 실시예 1과 동일한 방법에 따라서 조제하고, 표 7의 DNA 단편을 얻었다. PCR 조건은 실시예 3의 조건에 따랐다. 각 DNA 단편의 증폭에 사용한 PCR프라이머의 명칭과 서열번호를 표 7에 나타낸다. 5' 및 3'프라이머의 모두 BamHI 인식서열을 부가하였다. 도 5에, 수득된 각 DNA 단편의 위치관계를 나타낸다. 또, 표 중의 DNA 단편의 란에 기재된 서열번호는 각 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다.
다음에, 실시예1와 동일한 방법에 따라서, CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 및 CΔ6-4을 BamHI로 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하고, 수득된 단편을 미리 BamHI에서 소화한 pET-11d-AΔ5-1에 정방향으로 연결해서 각발현 플라스미드(pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-1, pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-2, pET-11d-AΔ5-1-CΔ5-4, pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-0, pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-2, pET-11d-AΔ5-1-CΔ9-4, pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-2 및 pET-11d-AΔ5-1-CΔ6-4)를 얻었다.구축된 각발현 플라스미드에 있어서, CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 및 CΔ6-4은 AΔ5-1의 바로 아래에 정방향으로 삽입되고 있어, 표8의 융합 펩티드가 수득된다.
실시예
5
《펩티드C 발현용 플라스미드의 구축》
A.pgC형균 53-47주의 게놈 DNA 라이브러리를 실시예 1과 동일한 방법에 따라서 조제하고, 표 7과 동일한DNA 단편을 얻었다. PCR 조건은 실시예 3의 조건에 따랐다. 각 DNA 단편의 증폭에 사용한 PCR 프라이머의 명칭과 서열번호는 표 7과 동일하지만, 증폭단편을 발현벡터 pQE30(QIAGEN사)에 효율적으로 삽입하기 위해서, 3'프라이머의 제한효소 인식서열을 BamHI 인식서열에서 HindIII 인식서열로 변경하였다.
다음에, CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 및 CΔ6-4을 BamHI 및 HindIII로 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기영동으로 분리후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega사)을 사용해 용출, 회수하였다. 수득된 단편을 BamHI 및 HindIII로 소화한 발현벡터 pQE30에 결합하고, 이것을 사용해서 대장균 JM109주(QIAGEN사)를 형질전환하고, CΔ5-1, CΔ5-2, CΔ5-4, CΔ9-0, CΔ9-2, CΔ9-4, CΔ6-2 및 CΔ6-4을 발현하는 플라스미드를 얻었다. 이들 발현 플라스미드로부터 수득되는 펩티드의 아미노산 서열은, 표 7에 기재된 각 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 N말단측에 벡터 유래의 히스티딘 태그서열(MRGSHHHHHHGS)을 갖는다.
실시예
6
《융합 펩티드의 발현 1》
실시예 1 및 2에서 수득된 각 발현 플라스미드를 가지는 대장균 BL21(DE3)주(Merck사)를 암피실린 50㎍/㎖ 함유 LB배지 1∼5㎖에 접종하고, 30∼37℃에서 진탕하면서, 배양균액의 OD600이 0.5에 달할때 까지 진탕 배양하고, IPTG 를 최종농도1mM이 되도록 첨가하고, 추가로 3시간 배양하였다. 원심분리(토미정공사, MX-300, 9,100g, 5분간)후, 상청액을 버리고, 원래의 배양 균액량과 등량의 세정버퍼(PBS)를 첨가하고, 균일해질 때까지 현탁하였다. 이 현탁액을 빙냉 하에서, Handy Sonicater(토미정공사, UR-20P)을 사용하고, 파워 10으로 10초간, 10회 초음파처리를 하고, 17,800g으로 15분간 원심분리하였다. 원심 상청액을 회수한 후, 그 침전물에 원심 전의 초음파 처리액과 등량의 세정버퍼를 첨가해서 재차 균일해질때까지 현탁하였다. 회수한 원심 상청액 및 침전물 현탁액의 각각에 등량의 샘플버퍼(2×SDS)를 첨가하고, 자비수 중에서 5분간 가열후, 정법에 의해 SDS-PAGE에 걸고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. 각 융합 펩티드가 침전물 현탁액로 인정되었을 경우, 당해 융합 펩티드는 봉입체를 형성하고 있다고 판단하였다 .각 발현 패턴을 도 3에 나타낸다.
단독으로 발현시켰을 경우, CΔ4c-1은 가용성 분획에, CΔ5-1은 발현 분획이 안정적이지 않았지만, 모든 융합 펩티드는 안정적이어서 봉입체를 형성하였다. 발현량은 AΔ5-1/CΔ4c-1이 약간 낮고, 다른 2개의 융합 펩티드(ACΔ5-1 및 AΔ5-1/CΔ6b-1b)가 거의 동등하여 양호한 발현을 나타냈다. 또 링커를 부가한 각 융합 펩티드의 발현량은 링커를 부가하지 않고 있는 것과 동등한 발현량이었다.
실시예
7
《융합 펩티드의 면역원성 1》
융합 펩티드의 백신효과를 확인하기 위해서, 호모의 강독주를 사용해서 공격시험을 실시하였다. 실시예 6에서 얻은 ACΔ5-1 및 ACΔ5-1-L의 침전물 현탁액 중의 봉입체를 8M 요소로 가용화하고, 추가로 투석막을 사용해서 버퍼를 PBS(pH7.4)로 치환하였다. 1도즈(dose) 0.5㎖ 중에, 표 9에 나타낸 각 항원량의 ACΔ5-1을 포함하도록 오일 어쥬번트를 첨가해서 유화한 백신을 8주령SPF닭의 다리부 근육내에 1회 투여하고, 면역하였다. 대조로서, 불활성화 균체를 사용한 시판의 오일 어쥬번트 백신(Oilvacks NB2AC, 재단법인화학과 혈청요법연구소) 투여군과 비접종군을 준비하였다. 면역 4주후에 A.pgA형균 221주(1.0×1010CFU/㎖), 혹은 A.pgC형균 53-47주(3.0×109CFU/㎖)의 균액 0.2㎖을 비강내투여 하고, 1 주간, 안면종창, 콧물누출, 유루 등의 임상증상을 관찰하였다.
그 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이, 융합 펩티드가 투여된 닭 그룹은 A.pgA형균 221주 및 A.pgC형균 53-47주의 공격에 대해서, 양호한 방어성적을 나타내고, 0.06㎍/dose 에 있어서도 시판의 오일 어쥬번트 백신 1/1,000량 이상의 백신효과를 나타냈다. 또 링커를 부가한 펩티드에 관해서도 동일한 방어성적을 나타냈다. 이상으로부터 당해 융합 펩티드는 백신으로서 유용한 것임이 확인되었다.
실시예
8
《융합 펩티드의 헤테로주에 대한 유효성》
융합 펩티드의 제작에 사용한 A.pgA형균 221주 및 A.pgC형균 53-47주 이외의 균주(헤테로주)에 대한 융합 펩티드의 백신효과를 확인하기 위해서, 실시예 7과 동일한 공격시험을 실시하였다. 면역에 사용한 항원량 및 공격에 사용한 강독주(A.pgA형균 083주(1.0×109CFU/㎖), A.pgA형균 W주(4.1×109CFU/㎖) 및 A.pgC형균 Modesto주(2.8×109CFU/㎖))가 다른 이외는 실시예 7에 기재된 방법에 따랐다.
그 결과, 표 10에 나타낸 바와 같이 각 펩티드로 면역된 닭 그룹은 A.pgA형균 083주, W주 및 A.pgC형균 Modesto주의 어느 쪽의 주로 공격시험을 실시하였을 경우도 양호한 방어성적을 나타내고, 융합 펩티드의 유전자에 유래하지 않은 다른 강독주에 대해서도 유용한 것임이 확인되었다.
공격시험에 사용한 각각의 주의 영역2에 있어서의 염기서열을 해석하였다. 그 결과, A.pgA형균의 경우, 083주와 W주 사이에서 완전하게 일치하고, 221 주와 083주 사이 및 221주와 W주 사이에서 1염기(A/G)의 돌연변이(서열번호 25의 1227번째의 글루탐산이 글리신으로 치환)가 인정되었다. 또 A.pgC형균의 경우, 53-47주에 대해서 Modesto주는 3염기 AAG(서열번호 26의 1144번째의 글루탐산)의 결실이 인정되었다.
실시예
9
《융합 펩티드 ACΔ5-1과 각 펩티드의 유효성의 비교》
융합 펩티드 ACΔ5-1과 융합전의 펩티드A 및 펩티드C의 백신효과를 비교하기 위해서, 면역시험을 실시하였다. 실시예 7과 동일한 방법으로 백신을 제작하고, 1 도즈(dose) 0.5㎖ 중에, 표 11에 나타낸 각 항원량의 ACΔ5-1, 펩티드A 및 펩티드C를 각각 포함하도록 오일 어쥬번트를 첨가해서 유화한 백신을 4주령 SPF닭의 다리부 근육내에 1회 투여하고, 면역하였다. 대조로서, 비접종군을 준비하였다. 면역 4주후에 Ushijima들의 방법(일본 특허출원 2008-29589)에 의해 항체값을 확인하였다. 구체적으로는 ELISA법으로 항체측정을 실시하였다.
A형 및 C형균의 영역2 내의 다른 펩티드를 1㎍/㎖가 되도록 50mM 중탄산 버퍼로 희석하고, 96웰 플레이트에 50㎕씩 넣고 고상화하였다. 4℃에서 하룻 밤 흡착후, 반응액을 버리고, 300㎕의 PBS-T(8.1mM 인산수소2나트륨, 1.5mM 인산2수소1칼륨, 137mM 염화나트륨, 2.7mM 염화칼륨, 0.1% Tween20)로 세정후, 300㎕ 의 5% 스킴밀크가 부가된 PBS-T를 넣어 블록킹하였다. 블록킹액을 버리고, 혈청을 10% 스킴밀크가 부가된 PBS-T로 100배 희석하여 각 웰에 50㎕씩 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 제거후, PBS-T로 3회 세정하고, 항닭 IgG-HRP 표지항체를 5% 스킴밀가 부가된 PBS-T로 20,000배 희석하여 50㎕씩 첨가하였다. 암소에서 실온, 30분간 반응시켰다. 반응액을 제거후, PBS-T로 3회 세정하고, 발색 기질액(TMB+substrate-chromogen; DAKO사)을 100㎕씩 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 3M 황산을 100㎕씩 첨가하고, 발색을 정지시켰다. 96웰 플레이트리더(Molecula Devices Japan사)로 450nm의 파장을 측정하였다.
그 결과, 표 11에 나타내는 바와 같이 융합 펩티드 ACΔ5-1로 면역 된 닭 그룹은 0.6㎍/dose에 있어서 높은 항체값을 나타내고, 항체의 양전율은 A형 및 C형 어느 것에 대해서도 100%이었다. 0.06㎍/dose 군에서는 A형균에 대해서 80%, C형균에 대해서 40%의 양전율이 확인되었지만, 펩티드A 또는 펩티드C의 0.03㎍/dose군에서는 각각 60%, 0%로, 융합 펩티드 ACΔ5-1은 융합전의 각 펩티드보다도 유효성이 높은 것임이 확인되었다.
실시예
10
《융합 펩티드의 발현 2》
실시예 3 및 4에서 수득된 각 발현 플라스미드를 가지는 대장균 BL21(DE3)주(Merck사)를 실시예 6과 동일한 방법으로 발현시키고, 발현량을 확인하였다. 각 발현 패턴을 도 6 및 7에 나타낸다. 펩티드A에 대해서는 단독으로 발현시켰을 경우, AΔ5-4, AΔ9-2, AΔ9-4, AΔ6-2, AΔ6-4는 가용성 분획으로 발현하였지만, CΔ5-1 과 융합한 결과, AΔ6-4이외의 융합 펩티드는 안정적으로 봉입체를 형성하였다. AΔ6-4/CΔ5-1 은 주로 봉입체를 형성하지만, 가용성 분획으로 발현하는 경우도 있어, 발현이 불안정하였다. 발현량은 모든 융합 펩티드에서 거의 동등하여, 양호한 발현을 나타냈다. 한편, 펩티드C에 대해서는 단독으로 발현시켰을 경우, CΔ6-2를 제외하는 모든 펩티드C가 가용성 분획으로 발현했지만, AΔ5-1 과 융합한 결과, 융합 펩티드는 안정적으로 봉입체를 형성하였다. 발현량은 모든 융합 펩티드에서 거의 동등하여, 양호한 발현을 나타냈다.
실시예
11
《융합 펩티드의 면역원성 2》
실시예 10에서 얻은 융합 펩티드의 백신효과를 확인하기 위해서, 호모의 강독주(A.pgA형균 221주)를 사용해서 실시예 7과 동일한 공격시험을 실시하였다. 면역에 사용한 항원량 및 공격에 사용한 강독주의 균수(A.pgA형균 221주1.2×109CFU/㎖)가 다른 이외는 실시예 7에 기재된 방법에 따랐다. 그 결과, 표 12에 나타내는 바와 같이 각 융합 펩티드로 면역된 닭 그룹은 A.pgA형균 221주로 공격시험을 실시하였을 경우에 양호한 방어성적을 나타내고, AΔ6-4/CΔ5-1 에서 80%의 방어율을, 그것보다 긴 융합 펩티드에서는 100%의 방어율을 확인하였다.
실시예
12
《펩티드C의 발현》
실시예 5에서 수득된 각 발현 플라스미드를 가지는 대장균 JM109주(QIAGEN사)를 실시예 6과 동일한 방법으로 발현시키고, 각각의 균체에 있어서의 발현량을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다(도8). 수득된 각 펩티드를 각각, CΔ5-1-pQE, CΔ5-2-pQE, CΔ5-4-pQE, CΔ9-0-pQE, CΔ9-2-pQE, CΔ9-4-pQE, CΔ6-2-pQE 및 CΔ6-4-pQE이라고 명명하였다. CΔ6-2-pQE를 제외한 모든 펩티드C는 가용성 분획으로 발현하고, 발현량도 양호하였다.
실시예
13
《펩티드C의 방어효과 확인》
실시예 12에서 수득된 펩티드C의 백신효과를 확인하기 위해서, 실시예 7과 동일한 공격시험을 실시하였다. 표 13에 나타낸 항원량의 펩티드C를 포함하도록 오일 어쥬번트를 첨가해서 유화한 백신을 4주령 SPF닭의 다리부 근육내에 1회 투여하고, 면역하였다. 면역 4주 후에 A.pgC형균 53-47주(5.2×109CFU/㎖)의 균액 0.2㎖을 비강내 투여하고, 1 주간, 안면종창, 콧물누출, 유루 등의 임상증상을 관찰하였다.
그 결과, 표 13에 나타내는 바와 같이, CΔ5-1-pQE 및 CΔ9-0-pQE로 면역된 닭 그룹은 3㎍/dose에 있어서 양호한 방어성적을 나타냈다. 또 가장 짧은 CΔ6-4-pQE에 있어서도 60%의 방어효과가 확인되었다. 이것들의 결과로부터, C형균 에 대한 방어효과에는, A형균과의 비상동영역(영역2)에 있어서의 C말단측의 서열이 중요하다고 예상되지만, 적어도 CΔ6-4의 영역을 포함함으로써 비교적 높은 방어효과를 나타내는 것이 확인되었다. 또 실시예 9에 나타내는 바와 같이 융합 발현함으로써 단독으로 면역하였을 경우보다도 면역원성의 향상이 기대된다.
(산업상의 이용가능성)
본원 발명을 이용하여 아비박테리움 파라갈리나룸 A형균 및 C형균을 원인으로 하는 닭 전염성 코라이자 백신을 제공할 수 있다.
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<213> Aviibacterium paragallinarum type A
<400> 1
Met Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Ala
1 5 10 15
Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Gly Ile Tyr Leu
20 25 30
Lys Ala Asp Gln Asn Asp Pro Thr Gly Asn Gln Gly Gln Lys Val Glu
35 40 45
Leu Gly Asn Ala Ile Thr Leu Ser Ala Thr Asn Gln Trp Ala Asn Asn
50 55 60
Gly Val Asn Tyr Lys Thr Asn Asn Leu Thr Thr Tyr Asn Ser Gln Asn
65 70 75 80
Gly Thr Ile Leu Phe Gly Met Arg Glu Asp Pro Ser Val Lys Gln Ile
85 90 95
Thr Ala Gly Thr Tyr Asn Thr Thr Gly Asp Ala Asn Asn Lys Asn Gln
100 105 110
Leu Asn Asn Thr Leu Gln Gln Thr Thr Leu Glu Ala Thr Gly Ile Thr
115 120 125
Ser Ser Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gly Phe Ser Leu Gly Ala Asp
130 135 140
Ser Val Thr Phe Ser Lys Gly Gly Ala Gly Thr Val Lys Leu Ser Gly
145 150 155 160
Val Ser Asp Ala Thr Ala Asp Thr Asp Ala Ala Thr Leu Lys Gln Val
165 170 175
Lys Glu Tyr Arg Thr Thr Leu Val Gly Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Gly Thr Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Asn Leu Ser Leu
195 200 205
Asn Lys Gly Thr Val Ser Ala Thr Glu Glu Lys Val Val Ser Gly Lys
210 215 220
Thr Val Tyr Glu Ala Ile Arg Asn Ala Ile Thr Gly Asn Ile Phe Thr
225 230 235 240
Ile Gly Leu Asp Asp Thr Thr Leu Asn Lys Ile Asn Asn Pro Ala Asp
245 250 255
Gln Asp Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Thr Gly
260 265 270
Leu Val Asp Val Val Lys Lys Thr Asn Ser Pro Ile Thr Val Glu Pro
275 280 285
Ser Thr Asp Ser Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly Val Asp Phe
290 295 300
Thr Asp Thr Ile Thr Glu Gly Asp Ala Thr Asp Asp Lys Lys Leu Thr
305 310 315 320
Thr Ser Lys Ser Val Glu Ser Tyr Val Thr Asn Lys Leu Ala Asn Phe
325 330 335
Ser Thr Asp Ile Leu Leu Ser Asp Gly Arg Ser Gly Asn Ala Thr Thr
340 345 350
Ala Asn Asp Gly Val Gly Lys Arg Arg Leu Ser Asp Gly Phe Thr Ile
355 360 365
Lys Ser Glu Asn Phe Thr Leu Gly Ser Lys Gln Tyr Asn Gly Ser Asp
370 375 380
Ser Leu Gly Val Met Tyr Asp Asp Gln Asn Gly Val Phe Lys Leu Ser
385 390 395 400
Leu Asn Met Thr Ala Leu Thr Thr Ser Leu Ala Asn Thr Phe Ala Lys
405 410 415
Leu Asp Ala Ser Asn Leu Thr Asp Asp Ser Asn Lys Glu Lys Trp Arg
420 425 430
Thr Ala Leu Asn Val Tyr Ser Lys Thr Glu Val Asp Ala Glu Ile Gln
435 440 445
Lys Ser Lys Val Thr Leu Thr Pro Asp Ser Gly Leu Ile Phe Ala Thr
450 455 460
Lys Gln Ala Gly Ser Gly Asn Asn Ala Gly Ile Asp Ala Gly Asn Lys
465 470 475 480
Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly Asp Ile Ser Pro Thr Ser Gly Asp
485 490 495
Val Val Thr Gly Arg Gln Leu Tyr Ala Leu Met Gln Lys Gly Ile Arg
500 505 510
Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser Pro Thr Lys Thr Gln Thr Thr Ala Pro
515 520 525
Thr Asn Ala Asn Pro Thr Ala Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr
530 535 540
Gln Gly Gly Ser Ala
545
<210> 2
<211> 574
<212> PRT
<213> Aviibacterium paragallinarum type C
<400> 2
Arg Gly Ser Gly Ser Gln Leu Tyr Ala Thr Asn Phe Met Leu Asn Lys
1 5 10 15
Leu Ala Gln Ser Val Lys Thr Asn Phe Gly Gly Asn Ala Asn Leu Ala
20 25 30
Thr Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Asp
35 40 45
Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu Ile Ser Leu
50 55 60
Ser Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Ala Val Tyr Asp
65 70 75 80
Ala Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala Asn Lys Gly
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Val Glu Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly
115 120 125
Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp Lys Ser
130 135 140
Gly Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser Ala Gly Leu
145 150 155 160
Thr Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr Thr Phe Ala
165 170 175
Glu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala Gln Thr Asn
180 185 190
Leu Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Gly Ser Asp
195 200 205
Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu Asn Ala
210 215 220
Glu His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala Asp Asn
225 230 235 240
Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ile Thr Leu
245 250 255
Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val Ala Asp
260 265 270
Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly Gln Leu
275 280 285
Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly Gly Thr Glu
290 295 300
Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln Ala Leu Thr
305 310 315 320
Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly Lys Thr Val
325 330 335
Lys Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn Ile Asp Ala
340 345 350
Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys Asp Lys Leu
355 360 365
Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala Ser Gln Asn
370 375 380
Ile Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr Glu Gly Ile
385 390 395 400
Val Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu Ser Leu Ser
405 410 415
Gly Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser Gly Val Lys
420 425 430
Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Asp Lys
435 440 445
Leu Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp Leu Ala Val
450 455 460
Thr Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile Asn Gly Thr
465 470 475 480
Ala Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr Thr Ala Val
485 490 495
Asn Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr Gly Ile Asp
500 505 510
Gly Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly Asp
515 520 525
Ile Ser Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln Leu Tyr Ala
530 535 540
Leu Met Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser Pro Thr
545 550 555 560
Lys Thr Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln Gly
565 570
<210> 3
<211> 545
<212> PRT
<213> Aviibacterium paragallinarum type C
<400> 3
Arg Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gln Asp Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu
20 25 30
Ile Ser Leu Ser Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Ala
35 40 45
Val Tyr Asp Ala Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala
50 55 60
Asn Lys Gly Ile Thr Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser
65 70 75 80
Pro Ile Thr Val Glu Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe
85 90 95
Thr Val Gly Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe
100 105 110
Asp Lys Ser Gly Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser
115 120 125
Ala Gly Leu Thr Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr
130 135 140
Thr Phe Ala Glu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ile Thr Leu Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly
225 230 235 240
Val Ala Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly
245 250 255
Gly Gln Leu Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly
260 265 270
Gly Thr Glu Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln
275 280 285
Ala Leu Thr Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Ile Asp Ala Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys
325 330 335
Asp Lys Leu Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala
340 345 350
Ser Gln Asn Ile Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr
355 360 365
Glu Gly Ile Val Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu
370 375 380
Ser Leu Ser Gly Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser
385 390 395 400
Gly Val Lys Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln
405 410 415
Leu Asp Lys Leu Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp
420 425 430
Leu Ala Val Thr Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile
435 440 445
Asn Gly Thr Ala Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr
450 455 460
Thr Ala Val Asn Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr
465 470 475 480
Gly Ile Asp Gly Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala
485 490 495
Asp Gly Asp Ile Ser Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln
500 505 510
Leu Tyr Ala Leu Met Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val
515 520 525
Ser Pro Thr Lys Thr Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln
530 535 540
Gly
545
<210> 4
<211> 387
<212> PRT
<213> Aviibacterium paragallinarum type C
<400> 4
Arg Gly Ser Gly Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr
1 5 10 15
Phe Asp Lys Ser Gly Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser
20 25 30
Ser Ala Gly Leu Thr Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr
35 40 45
Thr Thr Phe Ala Glu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser
50 55 60
Ala Gln Thr Asn Leu Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys
65 70 75 80
Asn Gly Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly
85 90 95
Ala Glu Asn Ala Glu His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu
100 105 110
Lys Ala Asp Asn Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp
115 120 125
Ala Ile Thr Leu Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr
130 135 140
Gly Val Ala Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gln Leu Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile
165 170 175
Gly Gly Thr Glu Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys
180 185 190
Gln Ala Leu Thr Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn
195 200 205
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210 215 220
Asn Ile Asp Ala Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Asp Lys Leu Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val
290 295 300
Ser Gly Val Lys Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly
305 310 315 320
Gln Leu Asp Lys Leu Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr
325 330 335
Asp Leu Ala Val Thr Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro
340 345 350
Ile Asn Gly Thr Ala Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu
355 360 365
Thr Thr Ala Val Asn Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala
370 375 380
Thr Gly Ile
385
<210> 5
<211> 573
<212> PRT
<213> Aviibacterium paragallinarum type C
<400> 5
Ser Arg Gly Ser Gln Leu Tyr Ala Thr Asn Phe Met Leu Asn Lys Leu
1 5 10 15
Ala Gln Ser Val Lys Thr Asn Phe Gly Gly Asn Ala Asn Leu Ala Thr
20 25 30
Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Asp Thr
35 40 45
Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu Ile Ser Leu Ser
50 55 60
Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Ala Val Tyr Asp Ala
65 70 75 80
Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala Asn Lys Gly Ile
85 90 95
Thr Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser Pro Ile Thr Val
100 105 110
Glu Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly Leu
115 120 125
Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp Lys Ser Gly
130 135 140
Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser Ala Gly Leu Thr
145 150 155 160
Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr Thr Phe Ala Glu
165 170 175
Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala Gln Thr Asn Leu
180 185 190
Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Gly Ser Asp Glu
195 200 205
Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu Asn Ala Glu
210 215 220
His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala Asp Asn Thr
225 230 235 240
Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ile Thr Leu Ala
245 250 255
Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val Ala Asp Gly
260 265 270
Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly Gln Leu Arg
275 280 285
Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly Gly Thr Glu Lys
290 295 300
Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln Ala Leu Thr Asp
305 310 315 320
Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly Lys Thr Val Lys
325 330 335
Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn Ile Asp Ala Ser
340 345 350
Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys Asp Lys Leu Thr
355 360 365
Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala Ser Gln Asn Ile
370 375 380
Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr Glu Gly Ile Val
385 390 395 400
Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu Ser Leu Ser Gly
405 410 415
Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser Gly Val Lys Ala
420 425 430
Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Asp Lys Leu
435 440 445
Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp Leu Ala Val Thr
450 455 460
Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile Asn Gly Thr Ala
465 470 475 480
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485 490 495
Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr Gly Ile Asp Gly
500 505 510
Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly Asp Ile
515 520 525
Ser Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln Leu Tyr Ala Leu
530 535 540
Met Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser Pro Thr Lys
545 550 555 560
Thr Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln Gly
565 570
<210> 6
<211> 543
<212> PRT
<213> Aviibacterium paragallinarum type C
<400> 6
Ser Arg Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln
1 5 10 15
Asp Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu Ile Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Ala Val Tyr
35 40 45
Asp Ala Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala Asn Lys
50 55 60
Gly Ile Thr Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Glu Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val
85 90 95
Gly Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp Lys
100 105 110
Ser Gly Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser Ala Gly
115 120 125
Leu Thr Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr Thr Phe
130 135 140
Ala Glu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala Gln Thr
145 150 155 160
Asn Leu Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Gly Ser
165 170 175
Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu Asn
180 185 190
Ala Glu His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala Asp
195 200 205
Asn Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ile Thr
210 215 220
Leu Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val Ala
225 230 235 240
Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly Gln
245 250 255
Leu Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly Gly Thr
260 265 270
Glu Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln Ala Leu
275 280 285
Thr Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly Lys Thr
290 295 300
Val Lys Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn Ile Asp
305 310 315 320
Ala Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys Asp Lys
325 330 335
Leu Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala Ser Gln
340 345 350
Asn Ile Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr Glu Gly
355 360 365
Ile Val Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu Ser Leu
370 375 380
Ser Gly Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser Gly Val
385 390 395 400
Lys Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Asp
405 410 415
Lys Leu Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp Leu Ala
420 425 430
Val Thr Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile Asn Gly
435 440 445
Thr Ala Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr Thr Ala
450 455 460
Val Asn Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr Gly Ile
465 470 475 480
Asp Gly Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly
485 490 495
Asp Ile Ser Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln Leu Tyr
500 505 510
Ala Leu Met Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser Pro
515 520 525
Thr Lys Thr Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln Gly
530 535 540
<210> 7
<211> 386
<212> PRT
<213> Aviibacterium paragallinarum type C
<400> 7
Ser Arg Gly Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe
1 5 10 15
Asp Lys Ser Gly Gln Asp Leu Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Leu Thr Phe Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr
35 40 45
Thr Phe Ala Glu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala
50 55 60
Gln Thr Asn Leu Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn
65 70 75 80
Gly Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala
85 90 95
Glu Asn Ala Glu His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys
100 105 110
Ala Asp Asn Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala
115 120 125
Ile Thr Leu Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly
130 135 140
Val Ala Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly
145 150 155 160
Gly Gln Leu Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly
165 170 175
Gly Thr Glu Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln
180 185 190
Ala Leu Thr Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly
195 200 205
Lys Thr Val Lys Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn
210 215 220
Ile Asp Ala Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys
225 230 235 240
Asp Lys Leu Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn Ala
245 250 255
Ser Gln Asn Ile Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr
260 265 270
Glu Gly Ile Val Leu Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Gly Ala Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser
290 295 300
Gly Val Lys Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln
305 310 315 320
Leu Asp Lys Leu Phe Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp
325 330 335
Leu Ala Val Thr Lys Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile
340 345 350
Asn Gly Thr Ala Pro Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr
355 360 365
Thr Ala Val Asn Thr Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr
370 375 380
Gly Ile
385
<210> 8
<211> 1119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections
from each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 8
Met Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Ala
1 5 10 15
Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Gly Ile Tyr Leu
20 25 30
Lys Ala Asp Gln Asn Asp Pro Thr Gly Asn Gln Gly Gln Lys Val Glu
35 40 45
Leu Gly Asn Ala Ile Thr Leu Ser Ala Thr Asn Gln Trp Ala Asn Asn
50 55 60
Gly Val Asn Tyr Lys Thr Asn Asn Leu Thr Thr Tyr Asn Ser Gln Asn
65 70 75 80
Gly Thr Ile Leu Phe Gly Met Arg Glu Asp Pro Ser Val Lys Gln Ile
85 90 95
Thr Ala Gly Thr Tyr Asn Thr Thr Gly Asp Ala Asn Asn Lys Asn Gln
100 105 110
Leu Asn Asn Thr Leu Gln Gln Thr Thr Leu Glu Ala Thr Gly Ile Thr
115 120 125
Ser Ser Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gly Phe Ser Leu Gly Ala Asp
130 135 140
Ser Val Thr Phe Ser Lys Gly Gly Ala Gly Thr Val Lys Leu Ser Gly
145 150 155 160
Val Ser Asp Ala Thr Ala Asp Thr Asp Ala Ala Thr Leu Lys Gln Val
165 170 175
Lys Glu Tyr Arg Thr Thr Leu Val Gly Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Gly Thr Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Asn Leu Ser Leu
195 200 205
Asn Lys Gly Thr Val Ser Ala Thr Glu Glu Lys Val Val Ser Gly Lys
210 215 220
Thr Val Tyr Glu Ala Ile Arg Asn Ala Ile Thr Gly Asn Ile Phe Thr
225 230 235 240
Ile Gly Leu Asp Asp Thr Thr Leu Asn Lys Ile Asn Asn Pro Ala Asp
245 250 255
Gln Asp Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Thr Gly
260 265 270
Leu Val Asp Val Val Lys Lys Thr Asn Ser Pro Ile Thr Val Glu Pro
275 280 285
Ser Thr Asp Ser Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly Val Asp Phe
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340 345 350
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355 360 365
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420 425 430
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675 680 685
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<211> 1089
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections
from each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 9
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1085
<210> 10
<211> 932
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of a section of the membrane proteins
from each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 10
Met Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Ala
1 5 10 15
Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Gly Ile Tyr Leu
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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405 410 415
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Lys Asn Gly Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile
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645 650 655
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660 665 670
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930
<210> 11
<211> 1131
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C with a linker
between the two sections
<400> 11
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1 5 10 15
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130 135 140
Ser Val Thr Phe Ser Lys Gly Gly Ala Gly Thr Val Lys Leu Ser Gly
145 150 155 160
Val Ser Asp Ala Thr Ala Asp Thr Asp Ala Ala Thr Leu Lys Gln Val
165 170 175
Lys Glu Tyr Arg Thr Thr Leu Val Gly Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Gly Thr Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Asn Leu Ser Leu
195 200 205
Asn Lys Gly Thr Val Ser Ala Thr Glu Glu Lys Val Val Ser Gly Lys
210 215 220
Thr Val Tyr Glu Ala Ile Arg Asn Ala Ile Thr Gly Asn Ile Phe Thr
225 230 235 240
Ile Gly Leu Asp Asp Thr Thr Leu Asn Lys Ile Asn Asn Pro Ala Asp
245 250 255
Gln Asp Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Thr Gly
260 265 270
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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755 760 765
Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu Asn Ala Glu His Val
770 775 780
Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala Asp Asn Thr Ser Asp
785 790 795 800
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805 810 815
Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val Ala Asp Gly Asn Ile
820 825 830
Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly Gln Leu Arg Thr Leu
835 840 845
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945 950 955 960
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965 970 975
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1130
<210> 12
<211> 1101
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C with a linker
between the two sections
<400> 12
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1 5 10 15
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20 25 30
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115 120 125
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210 215 220
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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1100
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C with a linker
between the two sections
<400> 13
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type A
<400> 14
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<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type A
<400> 15
cgcggatcca ccttgagtgc tagatgctgt aggtgc 36
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 16
cgcggatccg gctcacagct ttatgcaacg aactttatg 39
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 17
cgcggatccc taaccttgag tgctagatgc tgtaggtgc 39
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 18
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<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 19
cgcggatccg gcttaatgaa agacattgaa 30
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 20
cgcggatccc taaatacctg ttgccaaaat acctaccttt ga 42
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 21
gctctagagg ctcacagctt tatgcaacga actttatg 38
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 22
gctctagaga tggcacaatt acatttacaa atatt 35
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 23
gctctagagg cttaatgaaa gacattgaag gggtaaac 38
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence which encodes the linker consisting of glycine
<400> 24
ggcggaggtg gcggaggtgg cggaggtggc 30
<210> 25
<211> 2042
<212> PRT
<213> Aviibacterium paragallinarum type A
<400> 25
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Gly Tyr Gly Ala Lys Asn Glu Ser Thr Ala Pro Ser Ser Val Thr Ile
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225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
Gly Glu Met Ser Thr Ala Val Gly Ser Leu Ala Phe Ala Leu Ala Asp
340 345 350
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355 360 365
Gly Gly Thr Ala Ile Gly Glu Glu Ser Arg Thr Phe Ala Lys Asp Ser
370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Gly Tyr Lys Ala Lys Ala Val Gly Ala Gly Ala Ile Ala Ile Gly
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740 745 750
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900 905 910
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915 920 925
Asn Asn Asn Tyr Leu Asn Asp Gly Ala Lys Gly Gln Asp Ser Ile Ala
930 935 940
Phe Gly Trp Gln Ala Lys Thr Ser Gly Ala Asn Asn Gly Leu Ala Gly
945 950 955 960
Lys Gln Ala Ile Ala Ile Gly Phe Gln Ala Asn Ser Ser Ala Glu Asn
965 970 975
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980 985 990
Ala Ile Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Ala Gly Gly Lys Pro Ser Ile
995 1000 1005
Ala Leu Gly Gln Asp Ser Thr Val Ala Asn Ser Ala Ile Ser Arg
1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
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260 265 270
Leu Val Asp Val Val Lys Lys Thr Asn Ser Pro Ile Thr Val Glu Pro
275 280 285
Ser Thr Asp Ser Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly Val Asp Phe
290 295 300
Thr Asp Thr Ile Thr Glu Gly Asp Ala Thr Asp Asp Lys Lys Leu Thr
305 310 315 320
Thr Ser Lys Ser Val Glu Ser Tyr Val Thr Asn Lys Leu Ala Asn Phe
325 330 335
Ser Thr Asp Ile Leu Leu Ser Asp Gly Arg Ser Gly Asn Ala Thr Thr
340 345 350
Ala Asn Asp Gly Val Gly Lys Arg Arg Leu Ser Asp Gly Phe Thr Ile
355 360 365
Lys Ser Glu Asn Phe Thr Leu Gly Ser Lys Gln Tyr Asn Gly Ser Asp
370 375 380
Ser Leu Gly Val Met Tyr Asp Asp Gln Asn Gly Val Phe Lys Leu Ser
385 390 395 400
Leu Asn Met Thr Ala Leu
405
<210> 29
<211> 267
<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type A
<400> 29
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1 5 10 15
Thr Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Gly Ile Tyr Leu
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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Ser Val Thr Phe Ser Lys Gly Gly Ala Gly Thr Val Lys Leu Ser Gly
145 150 155 160
Val Ser Asp Ala Thr Ala Asp Thr Asp Ala Ala Thr Leu Lys Gln Val
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210 215 220
Thr Val Tyr Glu Ala Ile Arg Asn Ala Ile Thr Gly Asn Ile Phe Thr
225 230 235 240
Ile Gly Leu Asp Asp Thr Thr Leu Asn Lys Ile Asn Asn Pro Ala Asp
245 250 255
Gln Asp Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gly Lys
260 265
<210> 30
<211> 457
<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type A
<400> 30
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1 5 10 15
Gly Gln Lys Val Glu Leu Gly Asn Ala Ile Thr Leu Ser Ala Thr Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Asn Lys Asn Gln Leu Asn Asn Thr Leu Gln Gln Thr Thr Leu Glu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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<400> 31
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<400> 32
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<210> 33
<211> 387
<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type A
<400> 33
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385
<210> 34
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<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type A
<400> 34
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<213> Avibacterium paragallinarum type A
<400> 35
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<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type A
<400> 36
catgccatgg ggatctacct taaag 25
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type A
<400> 37
catgccatgg gaacctataa tacaacgggt gat 33
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type A
<400> 38
cgcggatcca ttactaattt tcttattccc agc 33
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type A
<400> 39
cgcggatcca agtgcggtca tatttaggct 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type A
<400> 40
cgcggatcct ttgccacttt cactgaggtt 30
<210> 41
<211> 1027
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 41
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<210> 42
<211> 949
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 42
Met Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Ala
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<400> 43
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each of Avibacterium paragallinarum types A and C
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115 120 125
Ala Gln Thr Asn Leu Val Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys
130 135 140
Asn Gly Ser Asp Glu Ser Lys Leu Ala Ser Thr Lys Leu Ser Ile Gly
145 150 155 160
Ala Glu Asn Ala Glu His Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu
165 170 175
Lys Ala Asp Asn Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp
180 185 190
Ala Ile Thr Leu Ala Gly Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr
195 200 205
Gly Val Ala Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn
210 215 220
Gly Gly Gln Leu Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile
225 230 235 240
Gly Gly Thr Glu Lys Thr Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys
245 250 255
Gln Ala Leu Thr Asp Ala Thr Leu Ala Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn
260 265 270
Gly Lys Thr Val Lys Leu Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr
275 280 285
Asn Ile Asp Ala Ser Val Glu Asp Asn Gly Val Val Lys Phe Thr Leu
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Lys Asp Lys Leu Thr Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr Glu Ser Leu Asn
305 310 315 320
Ala Ser Gln Asn Ile Ile Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu
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Thr Gly Ile Asp Gly Ile Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500
<210> 53
<211> 442
<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type C
<400> 53
Leu Ile Ser Leu Ser Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu
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Ala Val Tyr Asp Ala Leu Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu
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165 170 175
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275 280 285
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305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Thr Thr Ala Val Asn Thr Gly Trp Gly Ser
435 440
<210> 54
<211> 241
<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type C
<400> 54
Leu Ile Ser Leu Ser Ala Thr Glu Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu
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195 200 205
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Gly Gly Gln Leu Arg Thr Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile
225 230 235 240
Gly
<210> 55
<211> 375
<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type C
<400> 55
Gly Leu Met Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp Lys
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Val Asn Thr Gly Trp Gly Ser
370 375
<210> 56
<211> 174
<212> PRT
<213> Avibacterium paragallinarum type C
<400> 56
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115 120 125
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130 135 140
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165 170
<210> 57
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 5'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 57
cgcggatcct tgatctcgct ttcggcaaca ga 32
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 58
cgcggatccc tatgatcccc aacctgtatt cac 33
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 59
cgcggatccc tagccaattt tagccccgct atc 33
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A 3'primer for the amplification of the DNA fragment from
Avibacterium paragallinarum type C
<400> 60
cgcggatccc tatgtttgag tcttcgttgg act 33
<210> 61
<211> 1017
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 61
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115 120 125
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130 135 140
Ser Val Thr Phe Ser Lys Gly Gly Ala Gly Thr Val Lys Leu Ser Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Lys Glu Tyr Arg Thr Thr Leu Val Gly Asp Asn Asp Ile Thr Ala Ala
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Gly Leu Asp Asp Thr Thr Leu Asn Lys Ile Asn Asn Pro Ala Asp
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260 265 270
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Thr Ser Lys Ser Val Glu Ser Tyr Val Thr Asn Lys Leu Ala Asn Phe
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340 345 350
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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580 585 590
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Ala Asp Asn Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala
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<210> 62
<211> 816
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 62
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275 280 285
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290 295 300
Thr Asp Thr Ile Thr Glu Gly Asp Ala Thr Asp Asp Lys Lys Leu Thr
305 310 315 320
Thr Ser Lys Ser Val Glu Ser Tyr Val Thr Asn Lys Leu Ala Asn Phe
325 330 335
Ser Thr Asp Ile Leu Leu Ser Asp Gly Arg Ser Gly Asn Ala Thr Thr
340 345 350
Ala Asn Asp Gly Val Gly Lys Arg Arg Leu Ser Asp Gly Phe Thr Ile
355 360 365
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Leu Asp Ala Ser Asn Leu Thr Asp Asp Ser Asn Lys Glu Lys Trp Arg
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435 440 445
Lys Ser Lys Val Thr Leu Thr Pro Asp Ser Gly Leu Ile Phe Ala Thr
450 455 460
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Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly Asp Ile Ser Pro Thr Ser Gly Asp
485 490 495
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<210> 63
<211> 1052
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> A fusion peptide consisting of membrane protein sections from
each of Avibacterium paragallinarum types A and C
<400> 63
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Ile Gly
Claims (30)
- A.pgA형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드A)과 A.pgC형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드C)으로 이루어지는 융합 펩티드를 봉입체로서 생산하는 숙주를 구축하는 공정, 상기 숙주를 배양하고, 배양물로부터 봉입체 분획을 회수, 정제하는 공정, 및 상기 정제 봉입체 분획을 함유하는 조성물을 조제하는 공정을 포함하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신의 제조방법으로서, 펩티드A가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 펩티드C가 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며, 펩티드A 및 펩티드C가 각각 600개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 펩티드A가 서열번호 1, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열이고, 펩티드C가 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 56의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 융합 펩티드의 펩티드A와 펩티드C의 비율이 펩티드A가 1에 대해서 펩티드C가 1∼3인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 융합 펩티드가 적어도 1세트의 펩티드A의 C말단측에 펩티드C를 결합시킨 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 융합 펩티드가 펩티드A와 펩티드A와의 사이, 펩티드C와 펩티드C와의 사이 또는 펩티드A와 펩티드C와의 사이에 링커를 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 3 항에 있어서, 융합 펩티드가 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 61, 62, 63, 64, 65, 66 및 67의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- A.pgA형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드A)과 A.pgC형균의 HMTp210 단백질 유래 펩티드 단편(펩티드C)으로 이루어지는 융합 펩티드를 유효성분으로 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신으로서, 펩티드A가 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하고, 펩티드C가 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하며, 펩티드A 및 펩티드C가 600개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
- 삭제
- 삭제
- 제 10 항에 있어서, 펩티드A가 서열번호 1, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열이고, 펩티드C가 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 50, 51, 52, 53, 54, 55 및 56의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열인 것을 특징으로 하는 백신.
- 삭제
- 삭제
- 제 10 항에 있어서, 융합 펩티드의 펩티드A와 펩티드C의 비율이 펩티드A가 1에 대해서 펩티드C가 1∼3인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 10 항에 있어서, 융합 펩티드가 적어도 1세트의 펩티드A의 C말단측에 펩티드C를 결합시킨 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 10 항에 있어서, 융합 펩티드가 펩티드A와 펩티드A와의 사이, 펩티드C와 펩티드C와의 사이 또는 펩티드A와 펩티드C와의 사이에 링커를 가지는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 13 항에 있어서, 융합 펩티드가 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 61, 62, 63, 64, 65, 66 및 67의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백신.
- 서열번호 1의 아미노산 서열의 N말단측, 또는 C말단측, 또는 N말단측 및 C말단측 양쪽에 1∼200의 아미노산이 부가된 아미노산 서열 내이고, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신.
- 제 20 항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로서 함유하는 백신.
- 서열번호 3의 아미노산 서열의 N말단측, 또는 C말단측, 또는 N말단측 및 C말단측 양쪽에 1∼200의 아미노산이 부가된 아미노산 서열 내이고, 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 재조합 닭 전염성 코라이자 백신.
- 제 22 항에 있어서, 서열번호 3 또는 52의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 함유하는 백신.
- 삭제
- 제 3 항에 있어서, 융합 펩티드가 하기 (1) 또는 (2)의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법:
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드A와 서열번호 2, 3, 4, 50, 51, 52, 53, 54 및 56의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 펩티드C와의 조합으로 이루어진 융합 펩티드;
(2) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드C와 서열번호 1, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 펩티드A와의 조합으로 이루어진 융합 펩티드. - 제 25 항에 있어서, 융합 펩티드가 서열번호 43, 44, 46, 47 및 49의 아미노산 서열의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 25 항에 있어서, 융합 펩티드가 서열번호 9 또는 12의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 13 항에 있어서, 융합 펩티드가 하기 (1) 또는 (2)의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 백신:
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드A와 서열번호 2, 3, 4, 50, 51, 52, 53, 54 및 56의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 펩티드C와의 조합으로 이루어진 융합 펩티드;
(2) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드C와 서열번호 1, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 펩티드A와의 조합으로 이루어진 융합 펩티드. - 제 28 항에 있어서, 융합 펩티드가 서열번호 43, 44, 46, 47 및 49의 아미노산 서열의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 28 항에 있어서, 융합 펩티드가 서열번호 9 또는 12의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 백신.
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