CN110506116A - 抑制masp2表达的核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有MASP2表达抑制活性的核酸、包含该核酸的医药组合物以及包含该核酸的、预防或治疗APS、SLE等自身免疫疾病及血液透析中的血栓症的药物。

Description

抑制MASP2表达的核酸
技术领域
本发明涉及用于抑制MASP2表达的核酸或包含该核酸的医药组合物。
背景技术
甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(Mannan-binding lectin serineprotease 2，MASP2)是由686个氨基酸构成的蛋白质，其自N末端侧起构成为CUB结构域-EGF结构域-CUB结构域-CCP1-CCP2-丝氨酸蛋白酶结构域。MASP2是肝脏中产生的补体蛋白质之一，在补体途径中也与凝集素途径的激活相关(非专利文献1)。
关于与疾病的相关性，认为MASP2在IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、C3肾病、血栓性血小板减少性紫癜、血栓性微血管病、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)这样的补体参与的自身免疫疾病中是重要的疾病相关蛋白质(非专利文献2、3)。另外，报道了MASP2是缺血再灌注损伤时组织损伤的原因之一，由动物模型的研究以及临床研究强烈暗示了通过阻遏MASP2能够减轻缺血时的肾损伤、脑梗塞时的组织损伤(非专利文献4、5)。虽然可期待通过特异性地阻遏MASP2能够预防或者治疗上述的疾病，但迄今为止并没有报道特异性地阻遏MASP2表达的医药品。
作为对基因的表达本身加以抑制的方法，例如利用RNA干扰(RNA interference，下文称为RNAi)的方法等是已知的。具体而言，发现通过导入具有与靶序列相同的序列的双链RNA，从而使得该靶基因的表达被特异性地抑制，所述RNA被命名为短干扰RNA(siRNA)(专利文献1)。此外，作为除RNA干扰之外的抑制基因表达的方法，反义法也是已知的(专利文献2)。但是，显示可有效地抑制人的MASP2基因的siRNA序列是未知的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2001/75164号小册子
专利文献2：国际公开第98/56905号小册子
非专利文献
非专利文献1：Immunobiology，205，455-466(2002)
非专利文献2：Nat Rev Nephrol.，12，383-401(2016)
非专利文献3：Nephrol Dial Transplant.，13，1984-1990(1998)
非专利文献4：FASEB J.，28，3996-4003(2014)
非专利文献5：J Neuroinflammation.，13，213(2016)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供能够抑制MASP2表达的核酸。本发明的目的还在于提供用于预防或治疗与MASP2的表达相关的疾病的医药组合物。
用于解决课题的手段
本发明涉及以下的(1)～(16)。
(1)双链核酸，其降低MASP2基因的表达，所述双链核酸由有义链及反义链组成，且包含至少11个碱基对的双链区，在所述反义链中的、链长为至少17个核苷酸且至多30个核苷酸的寡核苷酸链中，与选自表1-1～表1-22所记载的组中的靶标MASP2 mRNA序列互补。
(2)如(1)所述的双链核酸，其中，所述双链区为11～27个碱基对，与选自表1-1～表1-22所记载的组中的靶标MASP2 mRNA序列互补的所述反义链的5’末端起第2位核苷酸与该靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第2位核糖核苷酸互补。
(3)如(1)或(2)所述的双链核酸，其中，所述有义链的3’末端及所述反义链的5’末端形成平末端。
(4)如(3)所述的双链核酸，其中，所述有义链为21个核苷酸长，且所述反义链为23个核苷酸长。
(5)如(1)或(2)所述的双链核酸，其中，所述有义链为21个核苷酸长，且所述反义链为21个核苷酸长。
(6)如(5)所述的双链核酸，其中，所述有义链的3’末端及所述反义链的3’末端具有突出部分。
(7)如(1)～(6)中任一项所述的双链核酸，其中，所述反义链包含选自表1-1～表1-22、及表2的“反义链”所记载的组中的序列。
(8)如(1)～(6)中任一项所述的双链核酸，其中，所述有义链包含选自表1-1～表1-22、及表2的“有义链”所记载的组中的序列。
(9)如(1)～(6)中任一项所述的双链核酸，其包含选自由表1-1～表1-22、及表2所记载的有义链/反义链组成的组中的1对有义链/反义链的序列。
(10)如前述(1)～(9)中任一项所述的双链核酸，其含有2’-修饰核苷酸。
(11)如前述(10)所述的双链核酸，其中，双链区内的核苷酸的50～100％为2’-修饰核苷酸。
(12)如(1)～(11)中任一项所述的双链核酸，其包含配体。
(13)单链核酸，其仅由(1)～(12)中任一项所述的双链核酸的反义链组成。
(14)医药组合物，其包含(1)～(13)中任一项所述的核酸。
(15)对由补体凝集素途径的异常介导的障碍进行治疗的方法，其包括下述步骤：向有此治疗需要的人施予治疗有效量的(1)～(13)中任一项中所述的核酸或(14)所述的医药组合物。
(16)如(15)所述的方法，其中，所述障碍为IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、C3肾病、血栓性血小板减少性紫癜、血栓性微血管病、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、或缺血时的肾损伤、脑梗塞时的组织损伤。
发明效果
通过施予本发明的核酸或包含该核酸的医药组合物，从而能够抑制MASP2的表达。特别地，可用于治疗·预防与MASP2的表达相关的疾病。
具体实施方式
作为本发明的核酸靶向的MASP2基因(编码MASP2的基因)，可举出对应于以Genbank登记号NM_006610.3登记的MASP2 cDNA(序列号2827)的、产生MASP2的全长mRNA的基因。
另外，人以外的物种的MASP2基因的mRNA也可以成为本发明的核酸的靶标基因。例如，作为对应于小鼠MASP2基因的全长mRNA的cDNA碱基序列，可举出Genbank登记号NM_001003893.2，作为对应于大鼠MASP2基因的全长mRNA的cDNA碱基序列，可举出Genbank登记号NM_172043.1，作为对应于食蟹猴CFB基因的全长mRNA的cDNA碱基序列，可举出Genbank登记号XM_005544812.2，作为对应于猕猴(Macaca mulatta)CFB基因的全长mRNA的cDNA碱基序列，可举出Genbank登记号XM_001118827.3等。
1.本发明的核酸
在本发明中，包含与MASP2 mRNA互补的碱基序列的核酸被称为反义链核酸，包含与反义链核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸也被称为有义链核酸。在本说明书中，除非另有指明，则“本发明的核酸”以涵盖反义链核酸、有义链核酸、以及有义链和反义链核酸配对而成的双链核酸的含义使用。
作为本发明的核酸，只要是由核苷酸或具有与该核苷酸等同的功能的分子聚合而成的分子即可，可以是任意的分子，可举出例如作为核糖核苷酸聚合物的RNA、作为脱氧核糖核苷酸聚合物的DNA、由RNA和DNA组成的嵌合核酸、以及这些核酸中的至少一个核苷酸被具有与该核苷酸等同的功能的分子取代而得到的核苷酸聚合物。此外，在这些核酸中含有至少一个具有与核苷酸等同的功能的分子的衍生物也被本发明的核酸所涵盖。尿嘧啶(U)能够毫无疑义地替换记载为胸腺嘧啶(T)。
作为具有与核苷酸等同的功能的分子，可举出例如核苷酸衍生物等。作为核苷酸衍生物，只要是对核苷酸施以修饰而得到的分子即可，可以是任意的分子，例如，优选使用为了较之RNA或DNA而言提高核酸酶抗性或使其稳定、增强与互补链核酸的亲和力、增强细胞透过性、或使之可视化而对核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸施以修饰而得到的分子等。
作为对核苷酸施以修饰而得到的分子，可举出例如糖部修饰核苷酸、磷酸二酯键修饰核苷酸、碱基修饰核苷酸、以及对糖部、磷酸二酯键和碱基中的至少一者进行修饰而得到的核苷酸等。
作为糖部修饰核苷酸，只要是针对核苷酸的糖的化学结构的一部分或全部以任意取代基进行修饰或取代而成的核苷酸、或者以任意原子进行取代而成的核苷酸即可，可以是任意的糖部修饰核苷酸，但优选使用2’-修饰核苷酸。
作为2’-修饰核苷酸，可举出例如核糖的2’-OH基被选自由H、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及I组成的组(R为烷基或芳基，优选碳原子数为1～6的烷基，R’为亚烷基，优选碳原子为1～6的亚烷基)中的取代基取代而成的核苷酸，优选可举出2’-OH基被H、F或甲氧基取代而成的核苷酸，更优选可举出2’-OH基被F或甲氧基取代而成的核苷酸。此外，还可举出2’-OH基被选自由2-(甲氧基)乙氧基、3-氨基丙氧基、2-[(N，N-二甲基氨基)氧基]乙氧基、3-(N，N-二甲基氨基)丙氧基、2-[2-(N，N-二甲基氨基)乙氧基]乙氧基、2-(甲基氨基)-2-氧基乙氧基、2-(N-甲基氨基甲酰基)乙氧基及2-氰基乙氧基组成的组中的取代基取代而成的核苷酸等。
相对于双链核酸区内的核苷酸而言，优选含有50～100％的2’-修饰核苷酸，更优选含有70～100％的2’-修饰核苷酸，进一步优选含有90～100％的2’-修饰核苷酸。
作为被施以2’-修饰核苷酸的双链核酸，例如，可举出包含选自由表2所记载的有义链/反义链组成的组中的1对有义链/反义链的序列的双链核酸。需要说明的是，表2中，N(M)表示2’-O-甲基-RNA，N(F)表示2’-F-RNA。此处，N表示A、C、G或U。
另外，作为糖部修饰核苷酸，可举出通过向糖部导入桥联结构从而具有两个环状结构的桥联结构型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)，具体而言，可举出2’位氧原子与4’位碳原子介由亚甲基桥联而成的锁人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、亚乙基桥联结构型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research，32，e175(2004)]、限制性乙基(Constrained Ethyl)(cEt)[The Journal of OrganicChemistry 75，1569(2010)]、酰胺基桥联核酸(Amido-Bridged Nucleic Acid)(AmNA)[Chem Bio Chem 13，2513(2012)]及2’-O，4’-C-螺亚环丙基桥联核酸(2’-O，4’-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid)(scpBNA)[Chem.Commun.，51，9737(2015)]等，进而还可举出肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.，32，624(1999)]、氧基肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.，123，4653(2001)]、肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.，122，6900(2000)]等。
作为磷酸二酯键修饰核苷酸，只要是针对核苷酸的磷酸二酯键的化学结构的一部分或全部以任意取代基进行修饰或取代而成的核苷酸、或者以任意原子进行取代而成的核苷酸即可，可以是任意的磷酸二酯键修饰核苷酸，可举出例如磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代而成的核苷酸、磷酸二酯键被二硫代磷酸酯键取代而成的核苷酸、磷酸二酯键被烷基膦酸酯键取代而成的核苷酸、磷酸二酯键被亚磷酰胺(phosphoramidite)键取代而成的核苷酸等。
作为碱基修饰核苷酸，只要是针对核苷酸的碱基的化学结构的一部分或全部以任意取代基进行修饰或取代而成的核苷酸、或者以任意原子进行取代而成的核苷酸即可，可以是任意的碱基修饰核苷酸，可举出例如碱基中的氧原子被硫原子取代而成的核苷酸、氢原子被碳原子数为1～6的烷基、卤素等取代而成的核苷酸、甲基被氢、羟甲基、碳原子数为2～6的烷基等取代而成的核苷酸、氨基被碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为1～6的烷酰基、氧代基、羟基等取代而成的核苷酸。需要说明的是，代替胞嘧啶(C)而使用5-甲基胞嘧啶(5-mC)作为碱基修饰核苷酸也是本发明的优选方式之一。
作为核苷酸衍生物，还可举出在核苷酸或者对糖部、磷酸二酯键或碱基中的至少一者进行了修饰的核苷酸衍生物上直接加成配体或介由接头加成配体而得到的核苷酸衍生物，所述配体例如为：胆固醇、脂肪酸、生育酚、类视黄醇等脂质类、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)等糖类、完整抗体、Fab、scFv、VHH等片段抗体、低密度脂蛋白(LDL)、人血清白蛋白等蛋白质、RGD、NGR、R9、CPP等肽类、吩嗪、菲啶、蒽醌、叶酸等小分子、合成聚氨基酸等合成聚合物、核酸适配体、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素等色素、Cy3系列、Alexa系列、黑洞淬灭剂等荧光团等其他化学物质。具体而言，可举出多胺加成核苷酸衍生物、胆固醇加成核苷酸衍生物、甾体加成核苷酸衍生物、GalNAc加成核苷酸衍生物、胆汁酸加成核苷酸衍生物、脂肪酸加成核苷酸衍生物、维生素加成核苷酸衍生物、Cy5加成核苷酸衍生物、Cy3加成核苷酸衍生物、6-FAM加成核苷酸衍生物及生物素加成核苷酸衍生物等，可优选举出GalNAc加成核苷酸衍生物。对于上述物质而言，在固相上进行延伸反应时，通过使能在固相上反应的修饰剂进行反应，从而能够在5’末端、3’末端及/或序列内部施以修饰。另外，也可预先合成导入了氨基、巯基、叠氮基或者三键等官能团的核酸并进行纯化，通过使修饰剂与它们发生作用来得到核苷酸衍生物。
对于核苷酸衍生物而言，可以形成将核酸内的其他核苷酸或核苷酸衍生物与亚烷基结构、肽结构、核苷酸结构、醚结构、酯结构、及这些结构中的至少一者进行组合而成的结构等桥联结构。
本发明的核酸还涵盖核酸分子中的一部分或全部原子被质量数不同的原子(同位素)取代而成的核酸。
在本说明书中，“互补”意为两个碱基之间能够进行碱基配对的关系，表示例如腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶的关系、以及鸟嘌呤与胞嘧啶的关系这样可介由疏松的氢键而作为双链区整体采取双螺旋结构的形式。
在本说明书中，所谓“互补的”，不仅表示两个核苷酸序列完全互补的情况，还表示该核苷酸序列之间可以具有0～30％、0～20％或0～10％的错配碱基，例如，与MASP2 mRNA互补的反义链可在与该mRNA的部分碱基序列完全互补的碱基序列中包含一个或多个碱基的取代。具体而言，反义链可相对于靶标基因的靶序列而言具有1～8个(优选1～6个、1～4个、1～3个，特别是2个或1个)的错配碱基。例如，当反义链为21个碱基长时，其可以相对于靶标基因的靶序列而言具有6个、5个、4个、3个、2个或1个错配碱基，该错配的位置可以是各序列的5’末端或3’末端。
此外，所谓“互补的”，涵盖了一方的核苷酸序列是在与另一方的核苷酸序列完全互补的碱基序列中添加/或缺失了一个或多个碱基而成的序列的情况。例如，MASP2 mRNA与本发明的反义链核酸可通过在反义链中添加及/或缺失碱基从而在反义链及/或靶标MASP2mRNA区域中具有1或2个凸起碱基(bulge base)。
本发明的核酸为包含与MASP2 mRNA的一部分碱基序列互补的碱基序列的核酸、及/或包含与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸即可，其可由任意的核苷酸或其衍生物构成。对于本发明的双链核酸而言，只要包含与靶标MASP2 mRNA序列互补的碱基序列的核酸、和包含与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸能够形成双链即可，可以是任意长度，能形成双链的序列长度通常为11～35个碱基，优选为15～30个碱基，更优选为17～25个碱基，进一步优选为17～23个碱基，特别优选为19～23个碱基。另外，也优选由21～23个碱基组成。
作为本发明的反义链核酸，可以使用包含与靶标MASP2 mRNA序列互补的碱基序列的核酸，也可使用该核酸中的1～3个碱基(优选1～2个碱基，更优选1个碱基)缺失、取代或者添加而成的核酸。作为抑制MASP2表达的核酸，优选使用：包含与靶标MASP2 mRNA序列互补的碱基序列、且抑制MASP2表达的单链核酸；或由包含与靶标MASP2 mRNA序列互补的碱基序列的核酸和包含与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸组成、且抑制MASP2表达的双链核酸。
在本发明中，所谓双链核酸，是指两条核苷酸链配对而具有双链区的核酸。所谓双链区，是指构成双链核酸的核苷酸或其衍生物构成碱基对从而形成了双链的部分。双链区通常为11～27个碱基对，优选为15～25个碱基对，更优选为15～23个碱基对，进一步优选为17～21个碱基对，特别优选为17～19个碱基对。
构成双链核酸的单链核酸通常由11～30个碱基组成，优选由15～29个碱基组成，更优选由15～27个碱基组成，进一步优选由15～25个碱基组成，特别优选由17～23个碱基组成，最优选由19～23个碱基组成。另外，也优选由21～23个碱基组成。
当在本发明的双链核酸中于紧邻双链区的3’侧或5’侧具有不形成双链的额外的核苷酸或核苷酸衍生物时，将其称为突出部(overhang)。当具有突出部时，构成突出部的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或它们的衍生物。
作为具有突出部的双链核酸，可以使用在至少一条链的3’末端或者5’末端具有由1～6个碱基(通常为1～3个碱基)组成的突出部的双链核酸，优选使用具有由2个碱基组成的突出部的双链核酸，可举出例如具有由dTdT或UU组成的突出部的双链核酸。突出部可以仅存在于反义链中、仅存在于有义链中、以及存在于反义链和有义链这两者中，在本发明中，优选使用在反义链和有义链这两者中具有突出部的双链核酸。需要说明的是，对于反义链而言，在包含双链区及紧邻其的突出部的、由至少17个核苷酸且至多30个核苷酸组成的寡核苷酸链中，与选自表1-1～表1-22及表2所记载的组中的靶标MASP2 mRNA序列充分互补。此外，作为本发明的双链核酸，也可使用例如基于Dicer等核酸酶的作用而生成上述双链核酸的核酸分子(WO2005/089287)、不具有3’末端、5’末端的突出部而是形成平末端的双链核酸、仅有义链或反义链突出的双链核酸(US2012/0040459)等。
作为本发明的双链核酸，可使用由与靶标基因的碱基序列或其互补链的碱基序列相同的序列组成的核酸，也可使用由该核酸的至少一条链的5’末端或3’末端被削除1～4个碱基而得到的核酸、和包含与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的核酸组成的双链核酸。
本发明的双链核酸可以是RNA彼此形成了双链的双链RNA(dsRNA)、DNA彼此形成了双链的双链DNA(dsDNA)、或者RNA与DNA形成了双链的杂合核酸。或者，双链中的一条链或两条链可以是DNA与RNA形成的嵌合核酸。优选为双链RNA(dsRNA)。
优选的是，本发明的反义链的5’末端起第2位核苷酸与靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第2位核糖核苷酸互补；更优选的是，反义链的5’末端起第2位～第7位核苷酸与靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第2位～第7位核糖核苷酸完全互补；进一步优选的是，反义链的5’末端起第2位～第11位核苷酸与靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第2位～第11位核糖核苷酸完全互补。另外，优选的是，本发明的核酸中的反义链的5’末端起第11位核苷酸与靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第11位核糖核苷酸互补；更优选的是，反义链的5’末端起第9位～第13位核苷酸与靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第9位～第13位核糖核苷酸完全互补；进一步优选的是，反义链的5’末端起第7位～第15位核苷酸与靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第7位～第15位核糖核苷酸完全互补。
作为制造本发明核酸的方法，没有特别限定，可举出使用已知的化学合成的方法或者酶转录法等。作为使用已知的化学合成的方法，可举出亚磷酰胺法、硫代磷酸酯法、磷酸三酯法、CEM法[Nucleic Acid Research，35，3287(2007)]等，例如，可利用ABI3900高通量核酸合成仪(Applied Biosystems公司制)来合成。合成结束之后，进行从固相的脱离、保护基的脱保护及目标产物的纯化等。期望通过纯化而得到纯度为90％以上、优选95％以上的核酸。为双链核酸时，可在将经合成及纯化得到的有义链、反义链以合适的比率(例如相对于1当量的反义链而言为0.1～10当量、优选0.5～2当量、更优选0.9～1.1当量、进一步优选等摩尔量的有义链)混合之后进行退火再使用，或者，也可省去退火工序而直接使用混合物。退火可在能形成双链核酸的任意条件下进行，通常如下所述进行：将有义链、反义链以大致等摩尔量混合后，于94℃左右加热5分钟左右，然后缓慢冷却至室温。作为制备本发明核酸的酶转录法，可举出下述方法：以具有目标碱基序列的质粒或DNA作为模板，使用噬菌体RNA聚合酶、例如T7、T3或SP6RNA聚合酶进行转录。
本发明的核酸可使用转染用担载体(优选阳离子型脂质体等阳离子型担载体)导入至细胞内。此外，也可通过磷酸钙法、电穿孔法或显微注射法等直接导入至细胞内。
本发明的核酸的5’末端、3’末端或/及序列内部可以被1个以上配体、荧光团修饰，利用配体、荧光团修饰而得到的核酸也称为核酸缀合物。在固相上进行延伸反应时，可通过使能在固相上反应的修饰剂进行反应，从而对5’末端、3’末端或/及序列内部施以修饰。另外，也可预先合成导入了氨基、巯基、叠氮基或者三键等官能团的核酸并进行纯化，通过使修饰剂与它们发生作用从而得到核酸缀合物。作为配体，可以是与生物分子有亲和性的分子，可举出例如胆固醇、脂肪酸、生育酚、类视黄醇等脂类、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)等糖类、完整抗体、Fab、VHH等抗体、低密度脂蛋白(LDL)、人血清白蛋白等蛋白质、RGD、NGR、R9、CPP等肽类、叶酸等小分子、合成聚氨基酸等合成聚合物、或核酸适配体等，它们也可组合使用。作为荧光团，可举出Cy3系列、Alexa系列、黑洞淬灭剂等。
可使用在导入至细胞内后能够表达本发明核酸那样的载体，来代替本发明的核酸。具体而言，可将编码本发明核酸的序列插入到表达载体内的启动子下游而构建表达载体，将其导入至细胞中，由此使其表达该核酸等。作为表达载体，可举出pCDNA6.2-GW/miR(Invitrogen公司制)、pSilencer 4.1-CMV(Ambion公司制)、pSINsi-hH1 DNA(宝生物公司制)、pSINsi-hU6 DNA(宝生物公司制)、pENTR/U6(Invitrogen公司制)等。
另外，也可将编码本发明核酸的序列插入到病毒载体内的启动子下游、将该载体导入包装细胞而生产得到的重组病毒载体。作为病毒载体，可举出逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。
2.具有MASP2表达抑制活性的核酸
本发明的反义链及有义链可基于例如以Genbank登记号NM_006610.3登记的人MASP2全长mRNA的cDNA(有义链)的碱基序列(序列号2827)来进行设计。另外，也可通过对人MASP2的全长mRNA的cDNA的碱基序列和其他物种的MASP2的全长mRNA的cDNA的碱基序列进行比较，来设计在多个物种中抑制MASP2 mRNA表达的反义链、有义链。
作为具有MASP2表达抑制活性的核酸，可举出下述双链核酸，所述双链核酸由包含与MASP2 mRNA互补的碱基序列的本发明的反义链核酸、和包含与该核酸的碱基序列互补的碱基序列的本发明的有义链核酸组成，且具有MASP2表达抑制活性。构成该双链核酸的单链的核酸通常由11～30个碱基组成，优选由15～29个碱基组成，更优选由15～27个碱基组成，进一步优选由15～25个碱基组成，特别优选由17～23个碱基组成，最优选由19～21个碱基组成。也可由19～23个碱基、优选21～23个碱基组成。该双链核酸具有由通常15～27个碱基对、优选15～25个碱基对、更优选15～23个碱基对、进一步优选15～21个碱基对组成的双链区。
可通过将上述双链核酸导入细胞来抑制MASP2的表达。例如，将本发明的双链核酸以数pM～数nM的浓度导入细胞后，可在24小时以上、例如48小时的培养阶段中抑制MASP2的mRNA的表达。
另外，本发明的双链核酸的MASP2 mRNA表达抑制活性的评价可通过以下方式进行：利用阳离子型脂质体等将该核酸等转染至人细胞株等，培养一定时间后，对该人细胞株中的MASP2的mRNA的表达量进行定量。
作为具有MASP2表达抑制活性的核酸，除了上述双链核酸之外，还可举出下述单链核酸，所述单链核酸包含与MASP2 mRNA的部分碱基序列互补的碱基序列，且抑制MASP2的表达。构成该核酸的单链核酸通常由8～30个碱基组成，优选由12～30个碱基组成，更优选由12～20个碱基组成。也可由19～23个碱基、优选21～23个碱基组成。
通过将这些单链核酸导入细胞，也可抑制MASP2的表达。例如，将本发明的单链核酸以数pM～数nM的浓度导入细胞后，可在24小时以上、例如48小时的培养阶段中抑制MASP2的mRNA的表达。
另外，本发明的单链核酸的MASP2 mRNA表达抑制活性的评价可通过以下方式进行：使用阳离子型脂质体等将该核酸等转染至人细胞株等，培养一定时间后，对该人细胞株中的MASP2的mRNA的表达量进行定量。
3.本发明的医药组合物
本发明还涉及含有上述双链核酸、单链核酸等核酸作为有效成分的医药组合物。本发明的医药组合物可用作抗磷脂抗体综合征(APS)、系统性红斑狼疮(SLE)这样的自身免疫疾病及血液透析中的血栓症的治疗剂或预防剂。
另外，本发明的医药组合物可优选用于与MASP2的表达相关的疾病、尤其是由补体凝集素途径的异常介导的障碍的治疗或预防用途。在本说明书中，由补体凝集素途径的异常介导的障碍是指上述的自身免疫疾病(例如APS、SLE)、血液透析中的血栓症、以及例如IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、C3肾病、血栓性血小板减少性紫癜、血栓性微血管病、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、缺血时的肾损伤、脑梗塞时的组织损伤等。因此，本发明的医药组合物可用作IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、C3肾病、血栓性血小板减少性紫癜、血栓性微血管病、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、缺血时的肾损伤、脑梗塞时的组织损伤等的治疗剂或预防剂。
该医药组合物可以还包含能有效地使核酸转移至细胞内的担载体。作为能有效地使核酸转移至细胞内的担载体，可举出例如阳离子型担载体。作为阳离子型担载体，可举出阳离子型脂质体及阳离子型聚合物等。另外，作为能有效地使核酸转移至细胞内的担载体，可以使用利用了病毒包膜的担载体。作为阳离子型聚合物，优选使用JetSI(Qbiogene公司)、Jet-PEI(聚乙烯亚胺，Qbiogene公司)等。作为利用了病毒包膜的担载体，优选使用GenomeOne(注册商标)(HVJ-E脂质体，石原产业公司)等。
包含本发明核酸和上述担载体的组合物可通过本领域技术人员已知的方法进行制备。例如，可通过将合适浓度的担载体分散液和核酸溶液混合来制备。当使用阳离子型担载体时，由于核酸通常在水溶液中带负电荷，因此可通过常规方法在水溶液中混合从而容易地制备。作为用于制备该组合物的水性溶剂，可举出注射用水、注射用蒸馏水、生理盐水等电解质溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖溶液等糖溶液等。另外，制备该组合物时的pH及温度等条件可由本领域技术人员适当选择。对于该组合物而言，在必要时，还可使用超声波分散装置、高压乳化装置等进行分散处理来制成均匀的组合物。由于制备包含担载体和核酸的组合物的最合适的方法及条件取决于所用的担载体，因此，本领域技术人员可选择对所用担载体而言最合适的方法，而不必局限于上述方法。
另外，作为本发明的医药组合物，也优选使用例如下述组合物，所述组合物由以核酸和引导(lead)颗粒作为构成成分的复合颗粒、和覆盖该复合颗粒的脂质膜构成。作为引导颗粒，可举出例如脂质组装体、脂质体、乳液颗粒、高分子、金属胶体、微粒制剂等，优选使用阳离子型脂质体。本发明中的引导颗粒可以以将脂质组装体、脂质体、乳液颗粒、高分子、金属胶体、微粒制剂等中的两种以上组合而成的复合体作为构成成分，也可以以将脂质组装体、脂质体、乳液颗粒、高分子、金属胶体、微粒制剂等与其他化合物(例如糖、脂质、无机化合物等)组合而成的复合体作为构成成分。
作为覆盖该复合颗粒的脂质膜，可举出例如以非阳离子性脂质、阻止颗粒凝集的脂质及阳离子性脂质等作为构成成分的脂质膜。
该组合物可按照例如国际公开公报2006/080118号小册子等所记载的方法制备。
关于本发明的医药组合物中所含的核酸和担载体的配合比，合适的是，相对于1重量份核酸而言，担载体为1～200重量份。优选相对于1重量份核酸而言、担载体为2.5～100重量份，更优选相对于1重量份核酸而言、担载体为7～25重量份。
关于本发明医药组合物的大小，平均粒径优选为约10nm～300nm，更优选为约30nm～200nm，进一步优选为约50nm～150nm。
除了上述担载体之外，本发明的医药组合物可还包含医药上可接受的运载体(carrier)或稀释剂等。医药上可接受的运载体或稀释剂等为本质上无化学活性且无害的组合物，对本发明的医药组合物的生物活性完全没有影响。这样的运载体或稀释剂的例子包括盐溶液、糖溶液、甘油溶液、乙醇等，但不限于此。
本发明的医药组合物含有对于治疗或预防疾病而言有效的量的该复合体，并且以能合适地施予至患者的形态提供。本发明的医药组合物的制剂形态可以是例如注射剂、滴眼剂、用于吸入等的液体制剂、例如软膏、洗剂等外用制剂等。
液体制剂的情况下，本发明医药组合物中的有效成分的浓度范围通常为0.001～25％(w/v)，优选为0.1～10％(w/v)，更优选为0.5～5％(w/v)。本发明的医药组合物可还含有合适量的医药上可接受的任意添加剂，例如乳化辅助剂、稳定剂、等渗剂、pH调节剂等。医药上可接受的任意添加剂可于所述复合体分散之前或者分散之后在适当的工序中添加。
该液体制剂的pH通常调节为约5.0～约8.5、优选约6.0～约8.0，优选使用膜滤器等进行过滤除菌等灭菌处理。
本发明的医药组合物还可以制备成冷冻干燥制剂的形式。冷冻干燥制剂可通过在对核酸和担载体进行分散处理后进行冷冻干燥处理来制备。冷冻干燥处理可通过常规方法进行。例如，可以将上述分散处理后的复合体溶液在无菌状态下以规定量分装到小瓶中，在约-40～-20℃的条件下预干燥约2小时左右，于约0～10℃在减压条件下进行第一干燥，然后于约15～25℃在减压条件下进行第二干燥，由此进行冷冻干燥。然后，例如，通过使用氮气对小瓶内部进行置换、加盖，从而可得到本发明的医药组合物的冷冻干燥制剂。
冷冻干燥制剂可通过添加任意合适的溶液再次溶解而使用。作为这样的溶液，可举出注射用水、生理盐水等电解质溶液、葡萄糖溶液、其他常规输注液等。该溶液的液量根据用途等而不同，没有特别限定，优选为冷冻干燥前的液量的0.5～2倍量、或500ml以下。
对于包括人在内的动物而言，本发明的医药组合物可进行例如静脉内施予、动脉内施予、经口施予、组织内施予、经皮施予、经粘膜施予或者经直肠施予，优选根据患者的症状利用的合适方法进行施予。特别优选使用静脉内施予、经皮施予、经粘膜施予。另外，也可进行癌内局部施予等局部施予。作为适合这些施予方法的剂型，可举出例如各种注射剂、口服剂、滴注剂、吸收剂、滴眼剂、软膏剂、洗剂、栓剂等。
本发明的医药组合物的用量期望在考虑核酸、剂型、年龄、体重等患者的状态、施予途径、疾病的性质和程度等的基础上确定，通常，以核酸的质量计，对于成人按每天计为0.1mg～10g/天，优选为1mg～500mg/天。根据情况，有时上述量以下也是充分的，或者相反地、需要上述量以上的用量。另外，可以每天施予1次～数次，也可间隔1天～数天进行施予。
4.治疗方法
本发明还提供对由补体凝集素途径的异常介导的障碍进行治疗的方法，所述方法(本发明的治疗方法)包括下述步骤：向有此治疗需要的人施予治疗有效量的本发明的核酸或本发明的医药组合物。
本发明的治疗方法优选为对IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、C3肾病、血栓性血小板减少性紫癜、血栓性微血管病、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、缺血时的肾损伤、脑梗塞时的组织损伤等疾病进行治疗的方法，其特征在于，向有此治疗需要的人施予治疗有效量的本发明的核酸或本发明的医药组合物。其他的工序及条件没有任何限定。
本发明的治疗方法可引用例如前述本发明的医药组合物的施予方法、用量、制备方法等。
以下，通过实施例说明本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
实施例1
人细胞中的MASP2 mRNA的敲低活性的测定
在96孔培养板中以成为10,000个细胞/80μL/孔的方式接种人肝癌来源的细胞株HepG2/C3A细胞(获得自ATCC，ATCC号：CRL-10741)。培养基使用了含有10％胎牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠(Nacalai Tesque公司制，产品目录编号：06977-34)、1％MEM非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：11140-050)的MEM培养基(NacalaiTesque公司制，产品目录编号：21442-25)。关于双链核酸，由Sigma-Aldrich合成表1-1～表1-22所记载的双链核酸来利用。具体而言，由使由序列号1～942所示的核糖核苷酸组成的有义链、由序列号943～1884所示的核糖核苷酸组成的反义链退火而得到的双链核酸构成(序列号n(n＝1～942)所示的有义链与序列号[n+942]所示的反义链配对)。将该表1-1～表1-22所记载的双链核酸和RNAiMax转染试剂(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：13778-150)用Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：31985-070)稀释，以双链核酸的最终浓度成为10nM的方式向各96孔培养板中添加20μL的siRNA/RNAiMax混合液，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。然后，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞，使用SuperPrep(注册商标)Cell Lysis&RT Kit for qPCR试剂盒(东洋纺公司制，产品目录编号：SCQ-101)，按照制品附带的说明书所记载的方法从各板合成cDNA。向MicroAmpOptical 384孔板(Applied Biosystems 公司制，产品目录编号：4309849)中添加4μL该cDNA，进而添加10μL的TaqMan(注册商标)基因表达预混合液(Gene ExpressionMaster Mix)(Applied Biosystems公司制，产品目录编号4369016)、4μL的UltraPure蒸馏水(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：10977-015)、1μL的人MASP2探针(Applied Biosystems公司制，Hs00198244_ml)、1μL的人GAPDH探针(Applied Biosystems公司制，Hs02786624_g1)。使用QuantStudio(注册商标)12K Flex实时PCR装置，实施人MASP2基因及人GAPDH(D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶，D-glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)基因的实时PCR。GAPDH是组成型表达的基因，作为内部对照对其进行测定，对MASP2表达量进行校正。将不添加siRNA而只用转染试剂处理HepG2/C3A细胞时的MASP2mRNA量作为1.0，计算导入了各双链核酸时的MASP2 mRNA相对表达量。实施2次或3次本实验，将MASP2 mRNA相对表达量的平均值示于表1-1～表1-22。表1-1～表1-22中的备注栏中，*符号表示2次实验的平均值，除此以外表示3次实验的平均值。
[表1-1]
[表1-2]
[表1-3]
[表1-4]
[表1-5]
[表1-6]
[表1-7]
[表1-8]
[表1-9]
[表1-10]
[表1-11]
[表1-12]
[表1-13]
[表1-14]
[表1-15]
[表1-16]
[表1-17]
[表1-18]
[表1-19]
[表1-20]
[表1-21]
[表1-22]
实施例2
修饰siRNA的人细胞中的MASP2 mRNA的敲低活性的测定
在96孔培养板中以成为10,000个细胞/80μL/孔的方式接种人肝癌来源的细胞株HepG2/C3A细胞(获得自ATCC，ATCC号：CRL-10741)。培养基使用了含有10％胎牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠(Nacalai Tesque公司制，产品目录编号：06977-34)、1％MEM非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：11140-050)的MEM培养基(NacalaiTesque公司制，产品目录编号：21442-25)。关于双链核酸，由GeneDesign，Inc.合成表2所记载的双链核酸来利用。具体而言，由使由序列号2828～2899所示的核糖核苷酸组成的有义链、由序列号2900～2971所示的核糖核苷酸组成的反义链退火而得到的双链核酸构成(序列号n(n＝2828～2899)所示的有义链与序列号[n+72]所示的反义链配对)。将该表2所记载的双链核酸和RNAiMax转染试剂(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：13778-150)用Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：31985-070)稀释，以双链核酸的最终浓度成为10nM的方式向各96孔培养板中添加20μL的siRNA/RNAiMax混合液，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。然后，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞，使用SuperPrep(注册商标)Cell Lysis&RT Kit for qPCR试剂盒(东洋纺公司制，产品目录编号：SCQ-101)，按照制品附带的说明书所记载的方法从各板合成cDNA。向MicroAmpOptical 384孔板(Applied Biosystems公司制，产品目录编号：4309849)中添加4μL该cDNA，进而添加10μL的TaqMan(注册商标)基因表达预混合液(Applied Biosystems公司制，产品目录编号4369016)、4μL的UltraPure蒸馏水(Thermo Fisher Scientific公司制，产品目录编号：10977-015)、1μL的人MASP2探针(Applied Biosystems公司制，Hs00198244_m1)、1μL的人GAPDH探针(Applied Biosystems公司制，Hs02786624_g1)。使用QuantStudio(注册商标)12K Flex实时PCR装置，实施人MASP2基因及人GAPDH(D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶，D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因的实时PCR。GAPDH是组成型表达的基因，作为内部对照对其进行测定，对MASP2表达量进行校正。将不添加siRNA而只用转染试剂处理HepG2/C3A细胞时的MASP2 mRNA量作为1.0，计算导入了各双链核酸时的MASP2 mRNA相对表达量。实施2次或4次本实验，将MASP2 mRNA相对表达量的平均值示于表2。表2中的备注栏中，*符号表示4次实验的平均值，除此以外表示2次实验的平均值。
[表2]
本申请以在日本提出申请的日本特愿2017-045226(申请日：2017年3月9日)为基础，通过在此声明，该申请的内容全部包括在本说明书中。
产业上的可利用性
通过本发明，可提供具有MASP2表达抑制活性的核酸、以该核酸作为有效成分的医药组合物等。本发明的核酸和医药组合物可抑制MASP2的表达，并可用于治疗或预防APS、SLE等自身免疫疾病以及血液透析中的血栓症。

Claims (16)

1.双链核酸，其降低MASP2基因的表达，所述双链核酸由有义链及反义链组成，且包含至少11个碱基对的双链区，在所述反义链中的、链长为至少17个核苷酸且至多30个核苷酸的寡核苷酸链中，与选自表1-1～表1-22所记载的组中的靶标MASP2 mRNA序列互补。
2.如权利要求1所述的双链核酸，其中，所述双链区为11～27个碱基对，与选自表1-1～表1-22所记载的组中的靶标MASP2 mRNA序列互补的所述反义链的5’末端起第2位核苷酸与该靶标MASP2 mRNA序列的3’末端起第2位核糖核苷酸互补。
3.如权利要求1或2所述的双链核酸，其中，所述有义链的3’末端及所述反义链的5’末端形成平末端。
4.如权利要求3所述的双链核酸，其中，所述有义链为21个核苷酸长，且所述反义链为23个核苷酸长。
5.如权利要求1或2所述的双链核酸，其中，所述有义链为21个核苷酸长，且所述反义链为21个核苷酸长。
6.如权利要求5所述的双链核酸，其中，所述有义链的3’末端及所述反义链的3’末端具有突出部分。
7.如权利要求1～6中任一项所述的双链核酸，其中，所述反义链包含选自表1-1～表1-22、及表2的“反义链”所记载的组中的序列。
8.如权利要求1～6中任一项所述的双链核酸，其中，所述有义链包含选自表1-1～表1-22、及表2的“有义链”所记载的组中的序列。
9.如权利要求1～6中任一项所述的双链核酸，其包含选自由表1-1～表1-22、及表2所记载的有义链/反义链组成的组中的1对有义链/反义链的序列。
10.如权利要求1～9中任一项所述的双链核酸，其含有2’-修饰核苷酸。
11.如权利要求10所述的双链核酸，其中，双链区内的核苷酸的50～100％为2’-修饰核苷酸。
12.如权利要求1～11中任一项所述的双链核酸，其包含配体。
13.单链核酸，其仅由权利要求1～12中任一项所述的双链核酸的反义链组成。
14.医药组合物，其包含权利要求1～13中任一项所述的核酸。
15.对由补体凝集素途径的异常介导的障碍进行治疗的方法，其包括下述步骤：向有此治疗需要的人施予治疗有效量的权利要求1～13中任一项所述的核酸或权利要求14所述的医药组合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述障碍为IgA肾病、膜性肾病、狼疮性肾炎、C3肾病、血栓性血小板减少性紫癜、血栓性微血管病、非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)、或缺血时的肾损伤、脑梗塞时的组织损伤。
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