JP2013510584A - アンチセンス抗ウイルス性化合物およびインフルエンザウイルス感染を処置するための方法 - Google Patents

アンチセンス抗ウイルス性化合物およびインフルエンザウイルス感染を処置するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、アンチセンス抗ウイルス化合物、ならびにそれらの化合物を用いて、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの増殖の阻害およびウイルス感染の処置をもたらす方法に関する。その化合物は、哺乳動物におけるインフルエンザウイルス感染の処置において特に有用である。本発明の実施形態は、別の態様において、一本鎖で分節型のマイナスセンスゲノムを有し、かつＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科から選択される、感染しているインフルエンザウイルスの哺乳動物宿主細胞内での複製を阻害する抗ウイルス化合物を含む。

Description

関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／２６１，２７８号、２０１０年１月４日に出願された米国仮特許出願第６１／２９２，０５６号、および２０１０年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／３７７，３８２号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
配列表に関する陳述
本願に付随する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供してあり、本明細書によって本明細書中に参考として援用される。その配列表を含むテキストファイルの名称は、１２０１７８＿４５６ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、３３ＫＢであり；２０１０年１１月１１日に作成され；ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
発明の分野
本発明は、インフルエンザウイルス感染を処置する際に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびそのオリゴヌクレオチドを使用した抗ウイルス処置方法に関する。
発明の背景
インフルエンザウイルスは、有史時代全体を通してヒトの大量死および罹患の主因であり続けている。インフルエンザＡウイルスへの感染により、世界中で毎年、数百万の重篤疾病の症例および５００，０００もの死亡数が生じる。流行は、重症度が大きく異なるが一定間隔で発生し、いつも高齢者集団において最も高い頻度で、著しい死亡率および罹患率をもたらす。マッチしたインフルエンザ株に対するワクチンは、健常成人の６０〜８０％において疾病を予防することができるが、高リスク群における防御の割合は、それよりもかなり低い。さらに、ワクチン接種は、予想外の株に対しては防御しない（例えば、１９９７年の香港ならびに２００３年および２００４年の欧州および東南アジアにおけるＨ５およびＨ７トリインフルエンザの大流行）。現行の抗インフルエンザ薬は、防御および治療効果を提供する能力に限りがある（Ｃｏｘ ａｎｄ Ｓｕｂｂａｒａｏ １９９９；Ｃｏｘ ａｎｄ Ｓｕｂｂａｒａｏ ２０００）。
インフルエンザＡは、マイナス極性の分節型ＲＮＡウイルスである。ゲノムセグメントは、４つのタンパク質：３つのポリメラーゼポリペプチド（ＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２）およびＮＰ（核タンパク質）の複合体によって複製される。８つすべてのゲノムセグメントの５’および３’末端の配列領域は、遺伝子型内で高度に保存されている（Ｓｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｕｓｓ ２００２）。
インフルエンザＡウイルスは、それらの表面糖タンパク質の抗原性および遺伝的性質に従って亜型に分類され得る；１５種の赤血球凝集素（ＨＡ）および９種のノイラミニダーゼ（ＮＡ）の亜型が、今までに同定されている。鳥類の宿主からは、すべての公知のＨＡ亜型およびＮＡ亜型を有するウイルスが単離されているが、ヒトではＨ１Ｎ１（１９１８）、Ｈ２Ｎ２（１９５７／５８）およびＨ３Ｎ２（１９６８）亜型のウイルスだけが広範囲に及ぶ流行に関連している（Ｓｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｕｓｓ ２００２）。
Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスがヒトに伝染し、感染した１８人中６人が死亡した１９９７年以降、トリインフルエンザウイルスが哺乳動物に複数伝染している。ホールウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）が直接伝染しているか、またはそのトリインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントを哺乳動物株が獲得しているかのいずれかである。アジアの広範囲でＨ５Ｎ１ウイルスに家禽が感染したことによって、この亜型がヒトからヒトに伝播して、種間伝播を確立し得るという懸念が大きくなっている。種々のタイプのインフルエンザウイルスが感染することができる種は、種々の形態のウイルスの糖タンパク質（ＨＡ、ＮＡ）によって決定される。これにより、鳥類とヒトとの間に容易に乗り越えられない大きな種の壁がもたらされる。しかしながら、ブタは、両方のタイプのウイルスに感染することができる「混合ポット」を提供し、それによりトリのウイルスがヒトに運搬されてしまう。個別のブタ細胞が、トリのインフルエンザウイルスとヒトのインフルエンザウイルスの両方に同時に感染するとき、トリのＨＡ遺伝子型を有するが容易にヒトに感染する組換え型が出現し得る。トリのＨＡは、ブタに感染することができるが、ヒトには感染できない。ブタでは、ゲノムセグメントのパッケージングの際に、いくつかのトリのセグメントならびにヒトのＨＡおよび／またはＮＡセグメントを有するウイルスを作り出すことができる（Ｃｏｘ ａｎｄ Ｓｕｂｂａｒａｏ ２０００）。
インフルエンザウイルスは、ヒトおよび動物（例えば、ブタ、鳥類、ウマ）に感染し、急性の呼吸器疾患を引き起こし得る。インフルエンザウイルスに対して有効なワクチンの製造が数多く試みられている。しかしながら、特に長期ベースでは、完全に成功したものはない。これは、インフルエンザウイルスゲノムが分節性であるという特徴（これにより、セグメントの再集合によって数多くの型を生じさせることが可能である）に少なくとも部分的に起因し得る。例えば、動物のインフルエンザウイルスとヒトのインフルエンザウイルスとの間でＲＮＡセグメントが交換され得、それにより、新しい抗原性の亜型が両方の集団に導入され得ると示唆されている。したがって、長期のワクチン接種アプローチは、新しい亜型の出現が原因で失敗している（抗原「シフト」）。さらに、ウイルスの表面タンパク質である赤血球凝集素およびノイラミニダーゼは、絶えず小さい抗原性の変化を起こしている（抗原「ドリフト」）。この高い変化の程度は、なぜ特定のインフルエンザウイルスに対して生じる特異免疫が新しいバリアントに対する防御を確立しないのかを説明する。ゆえに、代替の抗ウイルスストラテジーが必要とされている。インフルエンザＢおよびＣウイルスは、Ａ型よりも臨床疾患を引き起こさないが、新しい抗ウイルス薬は、これらの物質によって引き起こされる感染を抑える際にも役立つはずである。
鳥類に天然に存在するインフルエンザウイルスは、トリインフルエンザ（鳥インフルエンザ）と呼ばれる。鳥類は、それらのウイルスを腸内に保有するが、通常、その感染によって病気にならない。しかしながら、飼育されているニワトリ、アヒルおよびシチメンチョウに感染して疾病および死さえも引き起こす鳥インフルエンザを渡り鳥が運び得る。トリインフルエンザは、容易にヒトに感染しないが、飼育されている鳥類との接触などヒトへの曝露が高頻度であるとき、ヒトへの感染が起きる。危険な鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）が、１９６１年に南アフリカのアジサシにおいて初めて同定され、死に至らしめる恐れのある型のインフルエンザとして同定された。Ｈ５Ｎ１の大流行は、２００３年後期および２００４年にアジアの８つの国において発生した。当時、これらの国の１億羽を超える鳥類が、死亡するか、または大流行を抑制するために殺された。２００４年の６月のはじめに、現在も進行中のＨ５Ｎ１の新しい致死的な大流行がアジアで報告された。Ｈ５Ｎ１のヒトへの感染は、タイ、ベトナムおよびカンボジアで観察され、その死亡率は約５０パーセントだった。これらの感染は、主に、感染した家禽と接触したヒトから生じたが、Ｈ５Ｎ１のヒトからヒトへの伝播が数例生じていた。
１９９８年以来、ブタ由来のセグメント（ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、ＭおよびＮＳ）、ヒト由来のセグメント（ＰＢ１）および鳥類由来のセグメント（ＰＢ２およびＰＡ）を有するトリプル再集合体インフルエンザＡ（Ｈ１）ウイルスが出回っている。新たに報告されたブタ起源の新規のインフルエンザＡ（２００９Ｈ１Ｎ１）ウイルス（Ｓ−ＯＩＶ）は、進行中の世界的な疾患の大流行に関与しており、このウイルスは、ユーラシアのブタのウイルス（Ｅｕｒａｓｉａｎ ｓｗｉｎｅ ｖｉｒｕｓ）のノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメントおよびマトリックス（Ｍ）セグメントと再集合した既存のウイルスの遺伝因子を含むトリプル再集合体ウイルスである（Ｓ−ＯＩＶ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｔｅａｍ，２００９）。以前のインフルエンザＡ（Ｈ１）トリプル再集合体ウイルスは、時折ヒトに伝染したがヒトからヒトへの伝播は効率的でなかったが、この新しいＳ−ＯＩＶは、ヒトからヒトへの伝染が非常に効率的である。最近、検査で確認された３４４０例のＳ−ＯＩＶ感染が、２９の国から報告された。この大流行は、メキシコで始まり、合計１３６４例が記録に残され、４５人が死亡した（致死率３．３％）。メキシコ以外では、３人の死亡しか報告されなかった（致死率０．１％）。この死亡率の地理的不均衡の理由は、現時点では明らかでない。
そのＳ−ＯＩＶは、現在、ノイラミニダーゼインヒビターであるオセルタミビルおよびザナミビルに感受性であるが、季節性インフルエンザは、以前に、ノイラミニダーゼインヒビター耐性を付与する変異を発生させると記録に残されている。Ｓ−ＯＩＶは、季節性インフルエンザウイルスとしてヒトＨ１にとって代わるのか、またはＳ−ＯＩＶは、なおも別のインフルエンザ株と再集合して別の新しいバリアントを作り出すのか？それは、より致死的になるように進化するか？これらの不確実性は、新しいウイルスの同定から新しいワクチンの製造および流通までの時間差によって、一層大きくなる。さらに、十分に新規のウイルス赤血球凝集素抗原は、高用量の免疫原およびプライムブーストスケジュールの使用を必要とすることがあり、これは、迅速に防御免疫を誘発しなければならない集団ワクチン接種キャンペーンに対して実際的な問題点を提起する。これらの考慮すべき点に照らして、理想的には様々なインフルエンザウイルスの株、亜型およびタイプに対して広い活性を有する、特にＳ−ＯＩＶに対する新規の予防および治療の形態を作り出すことが急務である。
（ａ）このウイルスが、継続的な低レベルの抗原ドリフトと、頻度は低いが予測不可能な大きな抗原シフトとの両方を起こすことにより汎発流行病に至らしめる公知の性質があること、（ｂ）株が妥当にマッチしているときでさえ、ワクチン接種がかなりの割合のワクチンレシピエントにおけるインフルエンザ関連疾病の予防に明らかに失敗していること、および（ｃ）インフルエンザに対して承認された形態の治療薬（例えば、アダマンタン誘導体、およびより最近では、ノイラミニダーゼインヒビターであるオセルタミビル）に対して耐性になる頻度が高いことに基づくと、インフルエンザＡに対する新しい処置の形態を作り出すことが急務である。
インフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患の重症度を考慮すると、インフルエンザ感染を処置する新しい治療法が差し迫って必要とされている。ゆえに、有効な予防法または治療法がないということからして、インフルエンザウイルスに感染した宿主を処置するための治療用化合物および治療方法を提供することが、本発明の目的である。
簡単な要旨
本発明の実施形態は、１つの態様において、一本鎖のマイナスセンスゲノムを有し、かつＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ａ属、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ｂ属およびＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ｃ属を含むＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科から選択されるＲＮＡウイルスの宿主細胞内での複製を阻害する際に有効な抗ウイルス化合物を含む。その化合物は、以下から選択される領域内のウイルスＲＮＡ配列を標的にし得る：１）マイナスセンスウイルスＲＮＡセグメントの５’または３’末端の２５塩基；２）プラスセンスｃＲＮＡの５’または３’末端の末端の２５塩基；３）インフルエンザウイルスのｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基および；４）選択的スプライシングに供されるインフルエンザｍＲＮＡのスプライス供与部位またはスプライス受容部位の周辺の５０塩基。
ある特定の実施形態において、抗ウイルス化合物は、ａ）ヌクレアーゼ抵抗性骨格、ｂ）１２〜４０ヌクレオチド塩基、ならびにｃ）以下：ｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのマイナスセンスウイルスＲＮＡセグメント（例えば、Ｍ１またはＭ２を含むセグメント）の５’または３’末端の２５塩基、ｉｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのプラスセンスｃＲＮＡの５’または３’末端の末端の２５塩基、ｉｉｉ）インフルエンザウイルスのｍＲＮＡ（例えば、Ｍ１またはＭ２ ｍＲＮＡ）のＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基、ならびにｉｖ）選択的スプライシングに供されるインフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのｍＲＮＡ（例えば、Ｍ１またはＭ２ ｍＲＮＡ）のスプライス供与部位またはスプライス受容部位の周辺の５０塩基から選択される標的領域にハイブリダイズする少なくとも１０塩基長の標的化配列を特徴とするオリゴヌクレオチドを含み得る。
オリゴヌクレオチドはまた、ａ）哺乳動物宿主細胞によって能動的に取り込まれる能力、および／またはｂ）ウイルス標的領域とヘテロ二重鎖構造を形成する能力を特徴とし得、ここで、前記ヘテロ二重鎖構造は：ｉ）そのウイルスのプラスセンス鎖またはマイナスセンス鎖およびオリゴヌクレオチド化合物から構成され、そしてｉｉ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍを特徴とする。
本発明の実施形態は、別の態様において、一本鎖で分節型のマイナスセンスゲノムを有し、かつＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科から選択される、感染しているインフルエンザウイルスの哺乳動物宿主細胞内での複製を阻害する抗ウイルス化合物を含む。その化合物は、上に記載されたエレメントを特徴とするオリゴヌクレオチドとして、感染した宿主細胞に投与され得る。その化合物は、インフルエンザウイルスに感染しているかまたはインフルエンザウイルスに感染するリスクのある哺乳動物被験体に投与され得る。
本化合物は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に結合する非荷電のリン含有サブユニット間結合によって連結されたモルホリノサブユニットから構成され得る。１つの実施形態において、サブユニット間結合は、以下の構造：
Figure 2013510584
 を有する結合などのホスホロジアミデート結合であり、ここで、Ｙ１＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的な水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンもしくはピリミジンまたは等価な塩基対形成部分であり、そしてＸは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノであり、例えば、Ｘ＝ＮＲ２である（各Ｒは独立して水素またはメチルである）。
本化合物は、正に帯電した結合の間に散在する上に記載された非荷電結合で連結されたモルホリノサブユニットから構成され得る。正に帯電した結合の総数は、２と、結合の総数の半数以下との間である。その正に帯電した結合は、Ｘが１−ピペラジンである上記の構造を有する。
本化合物は、上記ウイルスのプラスまたはマイナスセンスＲＮＡ鎖と上記のようなヘテロ二重鎖構造を形成することができるオリゴヌクレオチドアナログ部分と、宿主細胞内への本化合物の取り込みを増大するのに有効なアルギニンリッチポリペプチドとの共有結合性の結合体を含み得る。例示的なポリペプチドとしては、配列番号１１５〜１２８として特定される配列のうちの１つが挙げられる。
関連する態様において、本発明の実施形態は、以下：
（ａ）マイナスセンスウイルスＲＮＡの５’もしくは３’末端の２５塩基および／または；
（ｂ）プラスセンスｍＲＮＡの５’もしくは３’末端の末端の２５塩基および／または；
（ｃ）ウイルスｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基および／または；
（ｄ）選択的スプライシングに供されるインフルエンザｍＲＮＡのスプライス供与部位もしくはスプライス受容部位の周辺の５０塩基と；
（ｅ）
（ｉ）ヌクレアーゼ抵抗性骨格
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取り込みが可能であること
（ｉｉｉ）１２〜４０ヌクレオチド塩基を含むこと
を特徴とするオリゴヌクレオチド
との間に形成されるヘテロ二重鎖複合体を含み、ここで、前記ヘテロ二重鎖複合体は、少なくとも４５℃の解離Ｔｍを有する。
ある特定の実施形態において、例示的なオリゴヌクレオチドは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に結合する非荷電のリン含有サブユニット間結合によって連結されたモルホリノサブユニットから構成され得る。その化合物は、以下の構造におけるようなホスホロジアミデート結合を有し得、
Figure 2013510584
 ここで、Ｙ１＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的な水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対形成部分であり、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノである。好ましい化合物では、各Ｒが独立して水素またはメチルであるＸ＝ＮＲ２である。その化合物はまた、正に帯電した結合の間に散在する上に記載された非荷電結合で連結されたモルホリノサブユニットから構成され得る。正に帯電した結合の総数は、２と、結合の総数の半数以下との間である。その正に帯電した結合は、Ｘが１−ピペラジンである上記の構造を有する。
本化合物は、オリゴヌクレオチド単独であってもよいし、オリゴヌクレオチドと、宿主細胞内への本化合物の取り込みを増大することができるアルギニンリッチポリペプチドとの結合体であってもよい。例示的なポリペプチドは、配列番号１１５〜１２８として特定される配列のうちの１つを有する。
なおも別の態様において、本発明の実施形態は、一本鎖で分節型のマイナスセンスＲＮＡゲノムを有し、かつＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科から選択されるインフルエンザウイルスの哺乳動物宿主細胞内での複製を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび関連方法を含む。その化合物は、本明細書中に記載されるウイルスＲＮＡエレメントを特徴とし得る。ある特定の実施形態において、その細胞は、被験体内の細胞であり、代表的には、インフルエンザウイルス感染を有する被験体内の細胞である。
いくつかの実施形態において、その被験体は、二次的細菌感染を有し、その方法は、細菌用抗生物質を、その抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドと別個にまたはそれと同時に投与する工程をさらに包含する。特定の実施形態において、二次的細菌感染は、連鎖球菌性肺炎への感染（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｏｍｏｎｉａｅ）である。ある特定の実施形態において、抗生物質は、ベータ−ラクタムである。特定の実施形態において、抗生物質は、ペニシリン、アモキシシリン、セファロスポリン、クロラムフェニコールおよびクリンダマイシンから選択される。
インフルエンザウイルスの複製を減少させる方法もまた含まれ、その方法は、ＣＤ２００またはＣＤ２００レセプターをコードするＲＮＡ分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本明細書中に記載される１つ以上の抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドと別個にまたはそれと同時に投与する工程を包含する。
本明細書中に記載される抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。いくつかの実施形態において、その薬学的組成物は、細菌用抗生物質（例えば、ペニシリン、アモキシシリン、セファロスポリン、クロラムフェニコールまたはクリンダマイシン）をさらに含む。好ましい実施形態において、その細菌用抗生物質は、静菌性である。いくつかの実施形態において、その薬学的組成物は、ＣＤ２００またはＣＤ２００レセプターをコードするＲＮＡ分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに含む。
インフルエンザＡウイルスなどのインフルエンザウイルスを処置するために、標的化配列は、配列番号１〜１１と特定される配列の群のうちの１つに関連する領域にハイブリダイズし得る。好ましい標的化配列は、配列番号４のマイナス鎖標的または配列番号２のプラス鎖標的のいずれかと相補的な標的化配列である。これらの２つの領域を標的にする例示的なアンチセンスホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（「ＰＭＯ」）は、それぞれ配列番号２３および１２として列挙されている。
図１Ａは、ホスホロジアミデート結合を有する例示的なモルホリノオリゴマー構造を示している； 図１Ｂは、図１Ａにおけるようなモルホリノオリゴマーであるが、その骨格結合が、１つの正に帯電した基を（ピペラジノ）ホスホロジアミデート結合の形態で含む、モルホリノオリゴマーを示している； 図１Ｃは、アルギニンリッチペプチドと本発明の１つの実施形態におけるアンチセンスオリゴマーとの結合体を示している； 図１Ｄ〜Ｇは、ＤからＧと称される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示している。 図１Ｄ〜Ｇは、ＤからＧと称される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示している。 図１Ｄ〜Ｇは、ＤからＧと称される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示している。 図１Ｄ〜Ｇは、ＤからＧと称される例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示している。 図２は、ＰＭＯｐｌｕｓ（商標）型（Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧｐｌｕｓ；配列番号１３）における本発明の好ましい例示的なアンチセンス化合物の構造を示している。３つの（ピペラジノ）ホスホロジアミデート（ｐｉｐ−ＰＤＡ）結合が、正味の正電荷を付与するので、用語ＰＭＯｐｌｕｓ（商標）である。 図２は、ＰＭＯｐｌｕｓ（商標）型（Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧｐｌｕｓ；配列番号１３）における本発明の好ましい例示的なアンチセンス化合物の構造を示している。３つの（ピペラジノ）ホスホロジアミデート（ｐｉｐ−ＰＤＡ）結合が、正味の正電荷を付与するので、用語ＰＭＯｐｌｕｓ（商標）である。 図３は、感染した細胞に存在する異なる３種のインフルエンザウイルスＲＮＡであるｖＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｖｃＲＮＡ、ならびに本明細書中に記載される標的化ＰＭＯの標的位置を示している。 図４Ａは、重要な血清型のインフルエンザ：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２およびＨ７Ｎ７由来のＭ１／Ｍ２セグメントの５’末端の６０ヌクレオチドの配列保存を示している。図４Ｂは、記載の塩基を有する分離株のパーセンテージを、Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ標的（配列番号１２）に対する各塩基の後の下付きの数字として示している。 図５Ａ〜５Ｂは、それぞれＡＵＧ開始コドンおよびｖｃＲＮＡの５’末端に対する本発明の標的化配列の位置を示している。 図５Ａ〜５Ｂは、それぞれＡＵＧ開始コドンおよびｖｃＲＮＡの５’末端に対する本発明の標的化配列の位置を示している。 図６は、Ｈ３Ｎ２マウスモデル系において本発明のＭ１／Ｍ２−ＡＵＧ標的化化合物（配列番号１２および１３）を用いたときの、ウイルス力価の用量依存的減少を示している。 図７Ａ〜７Ｄは、Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ（配列番号１２および１３）で処置されたフェレットが、２００９Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）汎発性ブタインフルエンザ単離株に感染した後に生存中にインフルエンザの臨床的徴候を減少させたことを示している。 図７Ａ〜７Ｄは、Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ（配列番号１２および１３）で処置されたフェレットが、２００９Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）汎発性ブタインフルエンザ単離株に感染した後に生存中にインフルエンザの臨床的徴候を減少させたことを示している。 図７Ａ〜７Ｄは、Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ（配列番号１２および１３）で処置されたフェレットが、２００９Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）汎発性ブタインフルエンザ単離株に感染した後に生存中にインフルエンザの臨床的徴候を減少させたことを示している。 図７Ａ〜７Ｄは、Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ（配列番号１２および１３）で処置されたフェレットが、２００９Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）汎発性ブタインフルエンザ単離株に感染した後に生存中にインフルエンザの臨床的徴候を減少させたことを示している。 図７Ｅは、Ｓ−ＯＩＶに感染し、本発明のＭ１／Ｍ２−ＡＵＧ化合物（配列番号１２および１３）で処置されたたフェレットがウイルス力価の２．３ｌｏｇの阻害をもたらしたことを示している。 図８Ａ〜Ｃは、それぞれ、ウイルスのＨＡ ＲＮＡ、Ｍ１タンパク質およびＭ２タンパク質の発現に対する、スプライス受容部位を標的にするＰＰＭＯの作用を示している。 図８Ａ〜Ｃは、それぞれ、ウイルスのＨＡ ＲＮＡ、Ｍ１タンパク質およびＭ２タンパク質の発現に対する、スプライス受容部位を標的にするＰＰＭＯの作用を示している。 図８Ａ〜Ｃは、それぞれ、ウイルスのＨＡ ＲＮＡ、Ｍ１タンパク質およびＭ２タンパク質の発現に対する、スプライス受容部位を標的にするＰＰＭＯの作用を示している。 図９Ａ〜Ｂは、ウイルスのＨＡ ＲＮＡおよびＭ２タンパク質の発現に対する、Ｍ１／Ｍ２ＡＵＧ開始コドンを標的にするアンチセンスＬＮＡオリゴマーの作用を示している。 図９Ａ〜Ｂは、ウイルスのＨＡ ＲＮＡおよびＭ２タンパク質の発現に対する、Ｍ１／Ｍ２ＡＵＧ開始コドンを標的にするアンチセンスＬＮＡオリゴマーの作用を示している。 図１０Ａ〜Ｂは、ウイルスのＨＡ ＲＮＡおよびＭ２タンパク質の発現に対する、Ｍ１／Ｍ２ ＡＵＧ開始コドンおよびスプライス受容部位を標的にするアンチセンス２’ＯＭｅオリゴマーの作用を示している。 図１０Ａ〜Ｂは、ウイルスのＨＡ ＲＮＡおよびＭ２タンパク質の発現に対する、Ｍ１／Ｍ２ ＡＵＧ開始コドンおよびスプライス受容部位を標的にするアンチセンス２’ＯＭｅオリゴマーの作用を示している。 図１１は、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８に感染し、Ｍ１／Ｍ２ ＡＵＧ開始コドンを標的にするＰＰＭＯで処置されたＭＤＣＫ細胞における、Ｍ１およびＭ２タンパク質の発現の阻害を示している。
詳細な説明
定義
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試行において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載される。本発明のために、以下の用語が下で定義される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１つより多い（すなわち、少なくとも１つの）、その冠詞の文法上の対象のことを指すために本明細書中で使用される。例としては、「エレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメントまたは１つより多いエレメントのことを意味する。
「約」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％だけ異なる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さのことを意味する。
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与する任意の核酸配列のことを意味する。対照的に、用語「非コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与しない任意の核酸配列のことを指す。
本明細書全体を通して、文脈が別のことを求めない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられている工程もしくはエレメントまたは工程もしくはエレメントの群を含むこと、他の任意の工程もしくはエレメントまたは工程もしくはエレメントの群を排除しないことを含意すると理解される。
「〜からなる」は、句「〜からなる」の後に何が来ようともそれらを含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、句「〜からなる」は、列挙されるエレメントが、必要または必須であること、かつ他のエレメントが存在し得ないことを示す。「〜から本質的になる」は、その句の後に列挙される任意のエレメントを含むこと、かつ列挙されるエレメントについて、本開示において特定される活性または作用を干渉しないかまたはそれらに関与しない他のエレメントに限定されることを意味する。したがって、句「〜から本質的になる」は、列挙されるエレメントが、必要または必須であるが、他のエレメントが随意であり、列挙されるエレメントの活性または作用に大きく影響しないか否かに応じて、存在してもよいし、存在してはならないことを示す。
用語「相補的」および「相補性」とは、塩基対形成の規則によって関係づけられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）のことを指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部だけが塩基対形成の規則に従ってマッチしている「部分的」であり得る。または、核酸間には、「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」相補性または「全（ｔｏｔａｌ）」相補性があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な影響を有する。完璧な相補性がしばしば望まれるが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して１つ以上であるが好ましくは６、５、４、３、２または１個のミスマッチを含み得る。オリゴマー内の任意の位置にバリエーションが含まれる。ある特定の実施形態において、オリゴマーの末端付近の配列内のバリエーションは、通常、内部のバリエーションよりも好ましく、存在する場合、代表的には、５’および／または３’末端の約６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に存在する。
用語「細胞透過性ペプチド」または「ＣＰＰ」は、交換可能に使用され、輸送ペプチド、キャリアペプチドまたはペプチド導入ドメインとも呼ばれるカチオン性の細胞透過性ペプチドのことを指す。このペプチドは、本明細書中に示されるように、所与の細胞培養集団の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（これらの間のすべての整数を含む）以内の細胞の細胞透過を誘導する能力を有し、全身投与された際に、インビボにおいて複数の組織内での高分子のトランスロケーションを可能にする。
用語「アンチセンスオリゴマー」または「アンチセンス化合物」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、環式サブユニットの配列のことを指し、そのサブユニットの各々は、塩基対形成部分が、ワトソン−クリック塩基対形成によって核酸（代表的には、ＲＮＡ）としての標的配列にハイブリダイズしてその標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にする、サブユニット間結合によって連結された塩基対形成部分を有する。これらの環式サブユニットは、リボースもしくは別のペントース糖、またはある特定の実施形態では、モルホリノ基（下記のモルホリノオリゴマーの説明を参照のこと）に基づき得る。ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ干渉物質（ｓｉＲＮＡ物質）ならびに当該分野で公知の他のアンチセンス物質もまた企図される。
そのようなアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するかもしくは阻害するように、または天然のプレｍＲＮＡのスプライシングプロセスを阻害するように、または標的にしているｍＲＮＡの分解を誘導するように、設計され得、それがハイブリダイズする標的配列「に向けられている」またはそれ「を標的にしている」と言われることがある。ある特定の実施形態において、標的配列は、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、プロセシングを受ける前の（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）ｍＲＮＡの３’または５’スプライス部位、ブランチポイントを含む領域を含む。標的配列は、エキソン内またはイントロン内に存在し得る。スプライス部位に対する標的配列は、プロセシングを受ける前のｍＲＮＡ内の通常のスプライスアクセプター分岐点から１〜約２５塩基対下流の５’末端を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。好ましいスプライス部位標的配列は、スプライス部位を含むかまたは完全にエキソンコード配列内に含まれるかまたはスプライス受容部位もしくはスプライス供与部位にまたがる、プロセシングを受ける前のｍＲＮＡの任意の領域である。オリゴマーは、上に記載された様式で標的の核酸を標的にするとき、より一般的には、生物学的に関連性のある標的（例えば、タンパク質、ウイルスまたは細菌）「を標的にしている」と言われる。
配列番号１２〜１１４のうちの１つ以上を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。これらのアンチセンスオリゴマーのバリアント（配列番号１２〜１１４のいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％（これらの間のすべての整数を含む）の配列同一性または配列相同性を有するバリアントオリゴマーを含む）、および／またはこれらの配列と約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド異なるバリアント、好ましくは、細胞内でのインフルエンザの複製を阻害するバリアントもまた含まれる。本明細書中に記載されるように、適当な数の荷電結合（例えば、２〜５個の非荷電結合ごとに最大約１個（例えば、１０個の非荷電結合ごとに約４〜５個））を含み、かつ／または本明細書中に記載されるように、それに付着されるＡｒｇリッチペプチドを含む、配列番号１２〜１１４のうちのいずれか１つ以上のオリゴヌクレオチドもまた含まれる。
用語「モルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」（ホスホルアミデートモルホリノオリゴマーまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー）とは、モルホリノサブユニット構造から構成されるオリゴヌクレオチドアナログのことを指し、ここで、（ｉ）その構造は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に結合する、好ましくは、非荷電またはカチオン性の、１〜３原子長、好ましくは、２原子長のリン含有結合によって共に連結されており、そして（ｉｉ）各モルホリノ環は、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンもしくはピリミジンまたは等価な塩基対形成部分を有する。例えば、好ましいホスホロジアミデート結合のタイプを示している図１Ａの構造を参照のこと。結合または活性を干渉しない限り、この結合に対してバリエーションを生成することができる。例えば、リンに付着されている酸素は、硫黄で置換され得る（チオホスホロジアミデート）。５’酸素は、アミノまたは低級アルキル置換アミノで置換され得る。リンに付着されているペンダント窒素は、非置換であり得るか、または（必要に応じて置換される）低級アルキルで一置換もしくは二置換され得る。下記のカチオン性結合の考察も参照のこと。そのプリンまたはピリミジン塩基対形成部分は、代表的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号、ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０７／１１４３５（カチオン性結合）およびＰＣＴ出願番号ＵＳ２００８／０１２８０４（改善された合成）（これらのすべてが、本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。
用語「オリゴヌクレオチドアナログ」とは、（ｉ）改変された骨格構造、例えば、天然のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、ならびに（ｉｉ）必要に応じて、改変された糖部分、例えば、リボース部分またはデオキシリボース部分ではなくモルホリノ部分を有するオリゴヌクレオチドのことを指す。オリゴヌクレオチドアナログは、ワトソン−クリック塩基対形成によって標準的なポリヌクレオチド塩基に水素結合することができる塩基を支持し、ここで、そのアナログ骨格は、そのオリゴヌクレオチドアナログ分子と、標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間のそのような水素結合を配列特異的な形式で可能にする様式で塩基を提示する。好ましいアナログは、実質的に非荷電のリン含有骨格を有するアナログである。
オリゴヌクレオチドアナログ内の実質的に非荷電のリン含有骨格は、サブユニット結合の大部分、例えば、その結合の５０〜１００％、代表的には、少なくとも６０％〜１００％または７５％または８０％が、非荷電または実質的に非荷電であり、単一のリン（ＩＩＩ）原子を含む骨格である。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログは、約８〜４０個のサブユニット、代表的には、約８〜２５個のサブユニット、好ましくは、約１２〜２５個のサブユニットを含み得る。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下で定義されるように、標的配列に対して厳密な配列相補性またはよく似た相補性を有し得る。
オリゴヌクレオチドの「サブユニット」とは、１つのヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）単位のことを指す。この用語は、付着されたサブユニット間結合を有するかまたは有しないヌクレオチド単位のことを指し得るが、「荷電サブユニット」のことを指すとき、その電荷は、代表的には、サブユニット間結合（例えば、図１Ｂに示されるような、リン酸結合もしくはホスホロチオエート結合またはカチオン性結合）内に存在する。
プリンまたはピリミジン塩基対形成部分は、代表的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミンまたはイノシンである。塩基（例えば、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメ１１５トキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、キューオシン（ｑｕｅｓｏｓｉｎｅ）、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルチジン（ａｃｅｔｙｌｔｉｄｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン（ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎｙｈｎｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸、２−チオシチジン、トレオニン誘導体など（Ｂｕｒｇｉｎら、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ，前出））も含まれる。この態様における「改変された塩基」は、上で例証されたようなアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）以外のヌクレオチド塩基のことを意味し；そのような塩基は、アンチセンス分子内の任意の位置において使用され得る。当業者は、オリゴマーの用途に応じて、ＴとＵとが相互交換可能であることを認識するだろう。例えば、よりＲＮＡ様である２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの他のアンチセンス化学を用いるとき、Ｔ塩基は、Ｕとして示され得る（例えば、配列表を参照のこと）。
「アミノ酸サブユニット」または「アミノ酸残基」とは、α−アミノ酸残基（−ＣＯ−ＣＨＲ−ＮＨ−）またはβ−もしくは他のアミノ酸残基（例えば、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎＣＨＲ−ＮＨ−）（ここで、Ｒは、側鎖（水素を含み得る）であり、ｎは、１〜７、好ましくは、１〜４である）のことを指し得る。
用語「天然に存在するアミノ酸」とは、天然に見られるタンパク質中に存在するアミノ酸（例えば、タンパク質生合成において利用される２０種の（Ｌ）−アミノ酸）、ならびにその他のもの（例えば、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリンおよびオルニチン）のことを指す。用語「非天然アミノ酸」とは、天然に見られるタンパク質中に存在しないアミノ酸のことを指し、例としては、ベータ−アラニン（β−Ａｌａ）、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）および６−アミノペンタン酸が挙げられる。「非天然アミノ酸」の追加の例としては、当業者に公知である、（Ｄ）−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
「単離された」とは、通常、自然の状態でそれを伴う成分を実質的または本質的に含まない材料のことを意味する。例えば、本明細書中で使用されるとき、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたかまたは取り出されたポリヌクレオチド、例えば、通常そのフラグメントに隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントのことを指し得る。
「有効量」または「治療有効量」とは、単一用量または一連の投薬の一部として哺乳動物被験体に投与される、所望の治療効果をもたらすのに有効な治療用化合物（例えば、アンチセンスオリゴマーまたはＲＮＡ干渉物質（例えば、ｓｉＲＮＡ））の量のことを指す。アンチセンスオリゴマーの場合、この作用は、代表的には、選択された標的配列の翻訳または天然のスプライシングプロセスの阻害によってもたらされる。感染しているインフルエンザウイルスを標的にする「有効量」は、感染しているウイルスの複製の割合および／またはウイルス量および／またはそのウイルス感染に関連する症状を減少させるのに有効な量にも関する。
「増大する（ｅｎｈａｎｃｅ）」もしくは「増大する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」もしくは「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）」もしくは「刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ）」とは、一般に、ある物あるいはアンチセンス化合物もしくはアンチセンス組成物またはＲＮＡｉ化合物もしくはＲＮＡｉ組成物が、細胞または被験体において、アンチセンス化合物なしまたはコントロール化合物によって引き起こされる応答と比べて、より大きな生理反応（すなわち、下流の作用）をもたらすかまたは引き起こす能力のことを指す。「増加される」または「増大される」量は、代表的には、「統計学的に有意な」量であり、アンチセンス化合物なし（ある物質の非存在）またはコントロール化合物によってもたらされる量の１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０倍またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（これらの間の１より大きいすべての整数および小数点を含む）、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）の増加を含み得る。
用語「減少させる」または「阻害する」は、通常、本発明の１つ以上のアンチセンス化合物またはＲＮＡｉ化合物が、診断の分野における通例の手法に従って測定される、関連性のある生理学的応答または細胞応答（例えば、本明細書中に記載される疾患または状態の症状）を「減少させる」能力に関し得る。関連性のある生理学的応答または細胞応答（インビボまたはインビトロ）は、当業者に明らかであり、インフルエンザ感染の症状もしくは病態の減少、またはウイルスの複製もしくはウイルス量の減少を含み得る。応答の「減少」は、アンチセンス化合物なしまたはコントロール組成物によってもたらされる応答と比べて「統計学的に有意」であり得、その減少としては、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の減少（その間のすべての整数を含む）が挙げられ得る。
用語「標的配列」とは、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス物質が対象にしている標的ＲＮＡの一部、すなわち、そのオリゴヌクレオチドが相補的な配列のワトソン−クリック塩基対形成によってハイブリダイズし得る配列のことを指す。ある特定の実施形態において、その標的配列は、ウイルスのマイナス鎖ＲＮＡまたはウイルスのｍＲＮＡの連続している領域であってもよいし、ウイルスのゲノムＲＮＡまたはウイルスの相補的ＲＮＡの５’および３’末端の配列の領域から構成されてもよい。
用語「標的化配列」または「アンチセンス標的化配列」とは、ＲＮＡゲノム内の標的配列に相補的な（さらに、実質的に相補的を意味する）オリゴヌクレオチド内または他のアンチセンス物質内の配列のことを指す。アンチセンス化合物の配列全体または一部のみが、標的配列と相補的であり得る。例えば、２０〜３０塩基を有するオリゴヌクレオチドにおいて、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９が、その標的領域と相補的な標的化配列であり得る。代表的には、標的化配列は、連続した塩基から形成されるが、その代わりに、一体となって（例えば、オリゴヌクレオチドの逆末端から）配置されると標的配列に及ぶ配列を構成する不連続な配列から形成されることがある。
標的配列および標的化配列は、アンチセンス化合物の結合が、１）マイナスセンスウイルスＲＮＡの５’もしくは３’末端の２５塩基内；２）プラスセンスｍＲＮＡの５’もしくは３’末端の末端の３０塩基内；３）ウイルスのｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基内、および／または；４）選択的スプライシングに供されるウイルスのｍＲＮＡのスプライス供与部位もしくはスプライス受容部位の周辺の５０塩基内の領域に対する結合であるように選択され得る。ある特定の実施形態において、標的領域は、１）マイナスセンスウイルスＲＮＡのＭ１もしくはＭ２領域の５’もしくは３’末端の２５塩基；２）プラスセンスＭ１もしくはＭ２ ｍＲＮＡの５’もしくは３’末端の末端の３０塩基；３）Ｍ１もしくはＭ２ ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基、および／または；４）Ｍ１もしくはＭ２ウイルスのｍＲＮＡのスプライス供与部位もしくはスプライス受容部位の周辺の５０塩基を含み得る。ある特定の実施形態において、標的領域は、ＡＵＧコドンと、ウイルスＲＮＡ（例えば、Ｍ１またはＭ２ ｍＲＮＡ）のスプライス供与部位の周辺の塩基またはそれに関与する塩基（例えば、ポリピリミジントラクトまたはラリアット形成配列）との両方を含み得る。ある特定の実施形態において、Ｍ１／Ｍ２ ＲＮＡのＡＵＧ開始コドンと近位のスプライス供与配列（例えば、ポリピリミジントラクト）との両方を標的にする単一のアンチセンスオリゴマーまたはＲＮＡｉ物質を用いることにより、標的タンパク質の発現の減少、ウイルスの複製の減少、またはその両方に関して相乗効果がもたらされ得る。
標的配列および標的化配列は、逆平行の配置においてハイブリダイゼーションが生じるとき、互いに「相補的」と記載される。標的化配列は、標的配列に対して「よく似た」相補性または「実質的な」相補性を有し得、本発明のためになおも機能し得、すなわち、標的配列は、なおも機能的に「相補的」であり得る。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的配列と１０ヌクレオチドのうち多くても１つのミスマッチを有し得、好ましくは、２０のうち多くても１つのミスマッチを有し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載される例示的なアンチセンス標的化配列と少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性を有し得る。
オリゴヌクレオチドが、生理学的条件下において標的にハイブリダイズする場合、そのオリゴマーは、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズ」し、Ｔｍは、４５℃より実質的に高く、好ましくは、少なくとも５０℃より高く、代表的には、６０℃〜８０℃またはそれより高い。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所与のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。また、そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対するそのアンチセンスオリゴマーの「よく似た」相補性または「実質的な」相補性、ならびに正確な相補性で生じ得る。
「相同性」とは、同一であるアミノ酸または保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージの数値のことを指す。相同性は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７−３９５）などの配列比較プログラムを用いて決定され得る。このように、本明細書中で引用される配列と類似の長さまたは実質的に異なる長さの配列は、アラインメントにギャップを挿入することによって比較され得、そのようなギャップは、例えば、ＧＡＰが使用する比較アルゴリズムによって決定される。
「配列同一性」という詳述または例えば「〜と５０％同一の配列」を含む詳述は、本明細書中で使用されるとき、配列が、比較範囲にわたって、ヌクレオチドごとに基づいてまたはアミノ酸ごとに基づいて同一である程度のことを指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を、比較の範囲にわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列に存在する位置の数を測定することによりマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較の範囲内の位置の総数（すなわち、範囲サイズ）で除し、その結果に１００を乗じることにより配列同一性のパーセンテージを得ることによって、算出され得る。
２つ以上のポリヌクレオチド間または２つ以上のポリペプチド間の配列の関係性を記載するために使用される用語としては、「参照配列」、「比較範囲」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、少なくとも８または１０モノマー単位の長さであるが、頻繁に１５〜１８モノマー単位、しばしば少なくとも２５モノマー単位の長さである。２つのポリヌクレオチドは各々、（１）その２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）および（２）その２つのポリヌクレオチド間で互いに異なる配列を含み得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列の比較は、代表的には、配列が似ている局所領域を同定して比較するためにその２つのポリヌクレオチドの配列を「比較範囲」にわたって比較することによって行われる。「比較範囲」とは、２つの配列（ある配列および参照配列）を最適にアラインメントした後に、そのある配列が、参照配列の同じ数だけ連続した位置と比較される、少なくとも６つ連続した（通常、約５０〜約１００、より通常では約１００〜約１５０の）位置の概念的なセグメントのことを指す。その比較範囲は、２つの配列を最適にアラインメントするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較範囲をアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実行、または検査、および選択される様々な方法のいずれかによって生成される最善のアラインメント（すなわち、比較範囲に対して最も高い相同性パーセンテージがもたらされるアラインメント）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムに対しても参照が行われ得る。配列解析に関する詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のＵｎｉｔ１９．３に見られ得る。
「ヌクレアーゼ抵抗性」オリゴマー分子（オリゴマー）とは、その骨格が、ハイブリダイズされていない形態またはハイブリダイズされた形態で、身体内の通常の細胞外および細胞内のヌクレアーゼによるヌクレアーゼ切断に対して実質的に抵抗性であるオリゴマー分子のことを指し、すなわち、そのオリゴマーは、オリゴマーが曝される身体内の通常のヌクレアーゼ条件下において、ほとんどまたはまったくヌクレアーゼ切断を示さない。
「ヘテロ二重鎖」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと、標的ＲＮＡの相補的な一部との間の二重鎖のことを指す。「ヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖」とは、相補的な標的に対するアンチセンスオリゴマーの結合によって形成されるヘテロ二重鎖のことを指し、そのヘテロ二重鎖は、細胞内および細胞外のヌクレアーゼ（例えば、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断することができるＲＮａｓｅＨ）によるインビボでの分解に対して実質的に抵抗性である。
「標的ＲＮＡが関わる塩基特異的な細胞内結合事象」とは、細胞内部における標的ＲＮＡ配列へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異的な結合のことを指す。そのような結合に関する塩基の特異性は、配列依存的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列内の相補的な一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「体液」は、尿、唾液、血漿、血液、髄液を含む被験体から得られる種々のサンプルタイプ、または生物学的起源の他のサンプル（例えば、皮膚細胞または皮膚の残骸）を包含し、それらに懸濁された細胞もしくは細胞フラグメント、または液体の媒質およびその溶質のことを指し得る。
用語「相対量」は、試験測定値とコントロール測定値とが比較される場合に使用される。ある反応において複合体を形成する反応物の相対量は、コントロール検体と反応する量と比べたときの、試験検体と反応する量である。コントロール検体は、同じアッセイにおいて別個に扱われてもよいし、同じサンプルの一部（例えば、組織切片内の悪性領域の周辺の正常組織）であってもよい。
個体または細胞の「処置」は、個体または細胞における疾患または病態の自然経過を変化させる手段として提供される任意のタイプの介入である。処置としては、例えば、薬学的組成物の投与が挙げられるがこれに限定されず、処置は、予防的に、または病的な事象が開始した後もしくは病因物質と接触した後に、行われ得る。処置は、インフルエンザウイルス感染に関連する疾患または状態の症状または病態に対する任意の望ましい作用を含む。特定のウイルスに感染したと診断された患者と比べて「改善された治療成績」という関連する用語は、ウイルスの増殖またはウイルス量またはその特定のウイルスによる感染に関連する検出可能な症状の遅延または減少のことを指し得る。
処置される疾患または状態の進行速度を減少させること、その疾患もしくは状態の発生を遅延させること、またはその発生の深刻度を減少させることに向けられ得る「予防的な」処置も含まれる。「処置」または「予防」は、必ずしも、その疾患もしくは状態またはその関連症状の完全な根絶、治癒または防止を示すわけではない。
ある物質が、細胞膜を越えた受動拡散以外の機構によって細胞に侵入することができるとき、その物質は、「哺乳動物の細胞によって能動的に取り込まれる」。その物質は、例えば、「能動輸送」（例えばＡＴＰ依存的な輸送機構による、哺乳動物の細胞膜を越えた物質の輸送のことを指す）、または「促進輸送」（結合したアンチセンス物質が膜を越えて通過するのを促進する輸送タンパク質にアンチセンス物質が結合していることを必要とする輸送機構による、細胞膜を越えたアンチセンス物質の輸送のことを指す）によって、運搬され得る。能動輸送と促進輸送の両方のために、オリゴヌクレオチドアナログは、好ましくは、下記に定義されるような実質的に非荷電の骨格を有する。
あるいは、アンチセンス化合物は、複合体化された形態で（例えば、エンドサイトーシス機構によって細胞内に取り込まれ得る、カチオン性の脂質またはリポソームと複合体化されたアニオン性骨格を有する物質として）製剤化され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、例えば、その５’または３’末端において、アルギニンリッチペプチド（例えば、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の一部）、ポリアルギニン、またはアルギニンと他のアミノ酸（非天然アミノ酸である６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）およびベータ−アラニン（βＡｌａ）を含む）との組み合わせに結合体化され得る。例示的なアルギニンリッチ送達ペプチドは、配列番号１１５〜１２８として列挙される。これらの例示的なアルギニンリッチ送達ペプチドは、記載されているように（Ｍｏｕｌｔｏｎ，Ｎｅｌｓｏｎら、２００４）標的宿主細胞内への輸送を促進する。
ゆえに、本発明の１つ以上のアンチセンスオリゴマー（例えば、配列番号１２〜１１４およびそれらのバリアント）を、必要に応じて薬学的製剤または薬学的剤形の一部として、インフルエンザウイルス感染を処置する必要のある被験体に投与することによる、インフルエンザウイルス感染を処置する方法が含まれる。「被験体」は、本明細書中で使用されるとき、本発明のアンチセンス化合物で処置され得る症状を示すかまたはその症状を示すリスクのある任意の動物（例えば、インフルエンザウイルスに感染しているかまたは感染するリスクのある被験体）を含み得る。適当な被験体（患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、家畜および飼育されている動物またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、および好ましくは、ヒト患者が含まれる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えば、二本鎖ＲＮＡ分子すなわちｄｓＲＮＡが関わるもの）の別の方法もまた企図される。用語「二本鎖」とは、それらの鎖の少なくとも一部が、水素結合と十分に相補的であり、二重鎖構造を形成する領域を含む、２本の別個の核酸鎖のことを意味する。用語「二重鎖」または「二重鎖構造」とは、２本の別個の鎖が、実質的に相補的であるがゆえに互いにハイブリダイズする、二本鎖分子の領域のことを指す。
「ｄｓＲＮＡ」とは、２本の相補的かつ逆平行の核酸鎖（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子のことを指す。ｄｓＲＮＡのすべてのヌクレオチドが、ワトソン−クリック塩基対を示さなければならないわけではない；それらの２本のＲＮＡ鎖は、実質的に相補的であり得る。それらのＲＮＡ鎖は、同じ数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。用語「ｄｓＲＮＡ」には、「ｓｉＲＮＡ」または低分子干渉ＲＮＡも含まれる。
用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、改変されたＲＮＡまたはヌクレオチド代理物の場合、１つ以上の位置における、改変されたヌクレオチドまたは代理物置換部分のことも指し得ることが理解されるだろう。したがって、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な領域であるかまたはそのような領域を含む。ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡと完全に相補的である。ｄｓＲＮＡと標的との間に完璧な相補性が存在することは不可欠ではないが、その対応は、ｄｓＲＮＡまたはその切断産物が配列特異的なサイレンシング（例えば、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断によるサイレンシング）を指示できるのに十分でなければならない。標的鎖との相補性、すなわち相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重大である。特にアンチセンス鎖において完璧な相補性が望まれることが多いが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して１つ以上であるが、好ましくは、６、５、４、３、２個またはそれより少ないミスマッチを含み得る。それらのミスマッチは、末端の領域において最も許容され、存在する場合、好ましくは、末端の領域、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４または３ヌクレオチド以内に存在する。センス鎖は、その分子の全体的な二本鎖の特性を維持するためにアンチセンス鎖と実質的に相補的であることだけが必要である。
本明細書中で使用されるとき、「改変されたｄｓＲＮＡ」とは、それを、同じ標的ＲＮＡを認識する同一のｄｓＲＮＡ分子よりもヌクレアーゼ（例えば、タンパク質キナーゼ）に対して抵抗性にする少なくとも１つの変更を含むｄｓＲＮＡ分子のことを指す。改変されたｄｓＲＮＡは、一本鎖ヌクレオチドオーバーハングおよび／または少なくとも１つの置換ヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で使用されるとき、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、一方のＲＮＡ鎖の３’末端が他方の相補鎖の５’末端を超えて伸長しているときまたはその逆のとき二重鎖構造から突出している、対になっていないヌクレオチドのことを指す。「ブラント」または「平滑末端」とは、対になっていないヌクレオチドがｄｓＲＮＡの末端に存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、その長さ全体にわたって二本鎖である、すなわち、その分子の両端においてヌクレオチドオーバーハングがない、ｄｓＲＮＡである。
用語「末端の塩基対」とは、本明細書中で使用されるとき、二本鎖分子の二重鎖領域の一方の末端における最後のヌクレオチド塩基対のことを指す。例えば、ｄｓＲＮＡまたは他の分子が、平滑末端化されている場合（すなわち、ヌクレオチドオーバーハングを有しない場合）、その分子の両端における最後のヌクレオチド塩基対が、末端の塩基対である。ｄｓＲＮＡまたは他の分子が、二重鎖構造の片端または両端にヌクレオチドオーバーハングを有する場合、そのヌクレオチドオーバーハングのすぐ隣りの最後のヌクレオチド塩基対が、その分子のその末端における末端の塩基対である。
本発明のオリゴマーのインフルエンザウイルス標的化配列を発現することができるベクター送達系（例えば、本明細書中に記載されるような配列番号１２〜１１４のうちのいずれか１つ以上もしくはそれらのバリアントを含むポリヌクレオチド配列を発現するベクター、または配列番号１〜１１の標的配列のうちのいずれかまたはそれ以上と相補的なポリヌクレオチド配列を発現するベクター）もまた含まれる。ｓｉＲＮＡまたは他の二重鎖形成ＲＮＡ干渉分子を発現するベクターが含まれる。
「ベクター」または「核酸構築物」は、ポリヌクレオチド分子、好ましくは、例えば、ポリヌクレオチドが挿入され得るかまたはクローニングされ得る、プラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスに由来するＤＮＡ分子のことを意味する。ベクターは、好ましくは、１種以上の唯一の制限酵素認識部位を含み、定義された宿主細胞（標的細胞もしくは標的組織またはその前駆細胞もしくは前駆組織を含む）内での自律複製が可能であり得るか、またはクローニングされた配列が複製可能であるように、定義された宿主のゲノムとインテグレート可能であり得る。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の実体として存在するベクター（その複製は、染色体の複製から独立している）、例えば、直鎖状もしくは閉環状のプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体であり得る。そのベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、そのベクターは、それが宿主細胞内に導入されたときに、そのゲノムにインテグレートされて、それがインテグレートされた染色体と共に複製されるベクターであり得る。
ベクター系または核酸構築物系は、単一のベクターまたはプラスミド、２つ以上のベクターまたはプラスミドを含み得、それらは共に、宿主細胞のゲノム内に導入される全ＤＮＡまたはトランスポゾンを含む。ベクターの選択は、代表的には、ベクターが導入される宿主細胞とそのベクターとの適合性に依存し得る。本発明の場合、そのベクターまたは核酸構築物は、好ましくは、筋細胞などの哺乳動物細胞内において作動可能に機能的であるものである。そのベクターは、適当な形質転換体またはトランスフェクタントの選択または同定のために使用され得る、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子または薬物耐性遺伝子）またはレポーター遺伝子（すなわち、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）も含み得る。例示的な送達系としては、ウイルスのベクター系（すなわち、ウイルス媒介性の形質導入）（当該分野で公知の他のもののうち、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられ得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「作動可能に連結された」は、オリゴマーをコードする配列を、そのオリゴマーの転写を制御するプロモーターの調節管理下に置くことを意味する。
野生型の遺伝子または遺伝子産物は、ある集団において最も頻繁に観察される遺伝子または遺伝子産物であり、ゆえに、その遺伝子の「正常型」または「野生型」と任意に称される（ｄｅｓｉｇｎｅｄ）。
「アルキル」とは、分枝状、直鎖状または環状（シクロアルキル）であり得る、炭素および水素を含む完全に飽和した一価ラジカルのことを指す。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、イソプロピル、シクロプロピル、シクロペンチル、エチルシクロペンチルおよびシクロヘキシルである。一般に、「低級アルキル」と呼ばれる１〜６個の炭素原子を有するアルキル基が好ましく、それらは、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチルおよびイソペンチルによって例証される。１つの実施形態において、低級アルキルとは、Ｃ１〜Ｃ４アルキルのことを指す。
「アルケニル」とは、分枝状、直鎖状または環状であり得る、炭素および水素を含む不飽和の一価ラジカルのことを指す。アルケニル基は、一不飽和または多価不飽和であり得る。一般に、「低級アルケニル」と呼ばれる１〜６個の炭素原子を有するアルケニル基が好ましい。
「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、２〜１８個の炭素を含む不飽和の直鎖または分枝鎖の炭化水素ラジカルのことを指す。例としては、エチニル、プロピニル、イソ−プロピニル、ブチニル、イソ−ブチニル、ｔｅｒｔ−ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが挙げられるが、これらに限定されない。用語「低級アルキニル」とは、２〜８個の炭素を含む、本明細書中で定義されるようなアルキニル基のことを指す。
「シクロアルキル」とは、単環式または多環式のアルキルラジカルのことを指す。例としては、シクロブチル、シクロペンチル（ｃｙｃｏｐｅｎｔｙｌ）、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられるが、これらに限定されない。
「アリール」とは、通常１つの環（例えば、フェニル）または２つの縮合環（例えば、ナフチル）を有する、置換されたまたは非置換の一価芳香族ラジカルのことを指す。この用語には、環内に１つ以上の窒素、酸素または硫黄原子を有する芳香族環基であるヘテロアリール基（例えば、フリル、ピロリル、ピリジルおよびインドリル）が含まれる。「置換された」は、アリール基内の１つ以上の環水素が、ハロゲン化物（例えば、フッ素、塩素または臭素）；１つもしくは２つの炭素原子を含む低級アルキル基；ニトロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、メトキシ、ハロメトキシ、ハロメチルまたはハロエチルで置き換えられていることを意味する。好ましい置換基としては、ハロゲン、メチル、エチルおよびメトキシが挙げられる。１つの環を有するアリール基が一般に好ましい。
「アラルキル」とは、アリール基でさらに置換されたアルキル、好ましくは、低級（Ｃ１−Ｃ４、より好ましくは、Ｃ１−Ｃ２）アルキル置換基のことを指し；例は、ベンジル（−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）およびフェネチル（−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）である。
「チオアルコキシ」とは、式−ＳＲｃのラジカルのことを指し、ここで、Ｒｃは、本明細書中で定義されるようなアルキルラジカルである。用語「低級チオアルコキシ」とは、１〜８個の炭素を含む、本明細書中で定義されるようなアルコキシ基のことを指す。
「アルコキシ」とは、式−ＯＲｄａのラジカルのことを指し、ここで、Ｒｄは、本明細書中で定義されるようなアルキルラジカルである。用語「低級アルコキシ」とは、１〜８個の炭素を含む、本明細書中で定義されるようなアルコキシ基のことを指す。アルコキシ基の例としては、メトキシおよびエトキシが挙げられるがこれらに限定されない。
「アルコキシアルキル」とは、アルコキシ基で置換されたアルキル基のことを指す。
「カルボニル」とは、−Ｃ（＝Ｏ）−ラジカルのことを指す。
「グアニジニル」とは、Ｈ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２）−ＮＨ−ラジカルのことを指す。
「アミジニル」とは、Ｈ２Ｎ（Ｃ＝ＮＨ２）ＣＨ−ラジカルのことを指す。
「アミノ」とは、−ＮＨ２ラジカルのことを指す。
「アルキルアミノ」とは、式−ＮＨＲｄまたは−ＮＲｄＲｄのラジカルのことを指し、ここで、各Ｒｄは、独立して、本明細書中で定義されるようなアルキルラジカルである。用語「低級アルキルアミノ」とは、１〜８個の炭素を含む、本明細書中で定義されるようなアルキルアミノ基のことを指す。
「複素環」は、飽和、不飽和または芳香族であり、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式環のことを意味し、ここで、その窒素および硫黄ヘテロ原子は、必要に応じて酸化され得、窒素ヘテロ原子は、必要に応じて四級化され得、この複素環には、上記複素環のいずれかがベンゼン環に縮合された二環式環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して付着され得る。好ましくは、環原子は、３〜６個の炭素原子を含む。そのような複素環としては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホリンが挙げられる。
複素環には、下で定義されるようなヘテロアリールが含まれる。したがって、下に列挙されるヘテロアリールに加えて、複素環には、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオピラニルなども含まれる。
「ヘテロアリール」は、窒素、酸素および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を有し、かつ少なくとも１つの炭素原子を含む、５〜１０員の芳香族複素環のことを意味し、このヘテロアリールは、単環式の環系と二環式の環系の両方を含む。代表的なヘテロアリールは、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニルおよびキナゾリニルである。
アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルまたはアルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）基に関する用語「置換された」とは、ヘテロ原子含有置換基（例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソ（ケト）、ニトロ、シアノ）または様々な酸もしくはエステル（例えば、カルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸）による水素原子の置き換えのことを指す。
特にアルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノ基に関する用語「置換された」とは、ヘテロ原子含有置換基（例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソ（ケト）、ニトロ、シアノ）または様々な酸もしくはエステル（例えば、カルボン酸、スルホン酸またはホスホン酸）による炭素上の水素原子の置き換えのことを指す。置換とは、アルキル、カルボニルまたは他の炭素含有基によるヘテロ原子（例えば、アミン水素）上の水素原子の置き換えのことも指し得る。
ある特定の実施形態において、用語「必要に応じて置換されるアルキル」、「必要に応じて置換されるアルケニル」、「必要に応じて置換されるアルコキシ」、「必要に応じて置換されるチオアルコキシ」、「必要に応じて置換されるアルキルアミノ」、「必要に応じて置換される低級アルキル」、「必要に応じて置換される低級アルケニル」、「必要に応じて置換される低級アルコキシ」、「必要に応じて置換される低級チオアルコキシ」、「必要に応じて置換される低級アルキルアミノ」および「必要に応じて置換されるヘテロシクリル」は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が置換基で置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。その際、置換基には：ジュウテリウム、必要に応じて置換されるアルキル、必要に応じて置換されるアルケニル、必要に応じて置換されるアルキニル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換される複素環、必要に応じて置換されるシクロアルキル、オキソ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲｘ、ＮＲｘＲｙ、ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｍＲｘおよび−ＳＯｍＮＲｘＲｙが含まれ、ここで、ｍは、０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じかまたは異なり、それらは独立して、水素、必要に応じて置換されるアルキル、必要に応じて置換されるアルケニル、必要に応じて置換されるアルキニル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換される複素環または必要に応じて置換されるシクロアルキルであり、前記必要に応じて置換されるアルキル、必要に応じて置換されるアルケニル、必要に応じて置換されるアルキニル、必要に応じて置換されるアリール、必要に応じて置換される複素環および必要に応じて置換されるシクロアルキル置換基の各々は、オキソ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＲｘ、ＮＲｘＲｙ、ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｍＲｘおよび−ＳＯｍＮＲｘＲｙのうちの１つ以上でさらに置換され得る。
インフルエンザウイルスゲノムの複製を阻害することができる標的化配列の選択は、以下で論じられる。
標的にされるウイルス
本発明の実施形態は、（ｉ）１）マイナスセンスウイルスＲＮＡの５’もしくは３’末端の２５塩基；２）プラスセンスｍＲＮＡの５’もしくは３’末端の末端の３０塩基；３）ウイルスｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基、および／または；４）選択的スプライシングに供されるインフルエンザｍＲＮＡのスプライス供与部位もしくはスプライス受容部位の周辺の５０塩基を標的にする、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、ならびに（ｉｉ）宿主細胞内でのアンチセンス化合物とウイルスとの有効な相互作用を可能にする物理的特徴および薬物動態学的特徴を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物に、インフルエンザウイルスに感染した動物を曝露することによって、一本鎖で分節型のマイナスセンスＲＮＡウイルスの有効な阻害が達成され得るという発見に部分的に基づく。ある特定の実施形態において、そのオリゴマーは、インフルエンザウイルスに感染した哺乳動物被験体を処置する際に使用され得る。
ある特定の実施形態は、（ｉ）一本鎖であり、（ｉｉ）分節型であり、かつ（ｉｉｉ）マイナス極性であるゲノムを有するＲＮＡウイルスを標的にする。標的にされるウイルスは、プラス極性を有するマイナスセンスビリオンＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の、２つの異なるバージョンのゲノム相補鎖（ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を合成する：１）マイナスセンスビリオンＲＮＡの複製のための鋳型として使用されるｃＲＮＡ、および２）ウイルスタンパク質の翻訳のために使用される相補的なプラスセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。図３は、本発明に記載されるこれらの異なるＲＮＡ種およびアンチセンスＰＭＯの標的位置を示している例示的な概略図である。
標的にされるウイルスの科としては、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ａ属、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ｂ属およびＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ｃ属を含むＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーが挙げられる。Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーの様々な物理的特性、形態学的特性および生物学的特性は、例えば、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｂｅｌｓｈｅ，ｅｄ．，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｓｂｙ，１９９１、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ＶｉｒｕｓｅｓのＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＣＴＶｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）およびヒトウイルス学のテキスト（例えば、（Ｓｔｒａｕｓｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｕｓｓ ２００２）を参照のこと）に見られ得る。Ｏｒｔｈｏｍｘｙｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの鍵となる生物学的特性のいくつかが、下に記載される。
Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ａ、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ ＢおよびＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ Ｃウイルスは、それぞれ、インフルエンザウイルスＡ属、インフルエンザウイルスＢ属およびインフルエンザウイルスＣ属の唯一のメンバーである。これらのウイルスは、膜に囲まれたウイルスであり、そのゲノムは、ＲＮＡの分節型のマイナスセンス（すなわちマイナス）鎖（（−）ＲＮＡ）である。１０個のインフルエンザウイルス遺伝子が、ＡおよびＢ株の一本鎖ＲＮＡの８つのセグメント上、およびＣ株の一本鎖ＲＮＡの７つのセグメント上に存在する。それらのセグメントは、サイズが異なり（８９０〜２３４１ヌクレオチド長）、各々が、異なるｍＲＮＡの合成のための鋳型である。インフルエンザウイルスビリオンは、これらの鋳型からのｍＲＮＡの合成に必要なウイルス特異的ＲＮＡポリメラーゼを含み、そのような特異的ポリメラーゼの非存在下では、インフルエンザウイルスＲＮＡのマイナス鎖は、感染性でない。それらのｍＲＮＡの転写の開始は、インフルエンザウイルスｍＲＮＡポリメラーゼが、細胞のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の５’末端から１２〜１５ヌクレオチドを拝借し、借用したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するとき、生じる。このプロセスは、５’キャップ構造をウイルスのｍＲＮＡ上に置くので、「キャップ・スナッチング」と呼ばれている。一般に、このプロセスによって生成されるｍＲＮＡは、ただ１つのタンパク質をコードする。また、Ｍ遺伝子およびＮＳ遺伝子のウイルスＲＮＡセグメントは、スプライスされるｍＲＮＡをコードし、それにより、これらの２つのセグメントの各々について２つの異なるタンパク質が生成される。
インフルエンザウイルスＲＮＡの複製は、核内で生じ、３つの異なる種のＲＮＡの合成を含む。このプロセスの概略図が、図３に示されている。ナイーブな細胞の感染後、マイナス鎖ビリオンＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、核に運搬され、核において、翻訳されることになっているＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、ウイルスによってコードされた酵素によって、キャッピングされた細胞のプレｍＲＮＡ分子から切断された５’末端の１０〜１３ヌクレオチドプライマーを用いて合成される（すなわち、キャップ・スナッチング）。各ｍＲＮＡの合成は、ゲノムセグメントの末端付近まで続き、そこでオリゴ（Ｕ）ストレッチに遭遇し、ポリ（Ａ）テイルが付加される。特定の目的のウイルスｍＲＮＡが、翻訳のために細胞質に運搬され、そして、十分なウイルスタンパク質が核内に運搬された後、新生のビリオンになることになっているｖＲＮＡの合成が開始される。ゲノムｖＲＮＡの完璧な相補鎖であり、新しいｖＲＮＡを生成するための鋳型として働くｖＲＮＡの正確なアンチゲノムのコピーが合成される（ｃＲＮＡと呼ばれる）。インフルエンザウイルス複製中に合成される種々のＲＮＡが、図３に模式的に示されている。
インフルエンザＡのゲノムセグメントを表している例示的なウイルス核酸標的配列に対するＧｅｎＢａｎｋ参照が、下記の表１に列挙されている。表１のヌクレオチド配列番号は、プラス鎖ＲＮＡに対するＧｅｎｂａｎｋ参照から得られる。これらの配列は、文献の利用可能な遺伝子配列データベースまたは特許リソースから入手可能であり得るように、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科における他の配列の単なる例示であることが理解されるだろう。配列番号１〜１１と特定される下記の配列は、本明細書の終わりの配列表にも列挙されている。
表１は、ゲノムセグメント７によってコードされるインフルエンザＡウイルス遺伝子Ｍ１およびＭ２に対する標的を列挙している。表１の標的配列は；１）マイナスセンスウイルスＲＮＡの３’末端の２５塩基（配列番号４）；２）プラスセンスｍＲＮＡの５’末端の末端の２５塩基（配列番号３）；３）記載のインフルエンザウイルス遺伝子のＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基（配列番号２）を表している。示されている配列は、マイナス鎖の配列（すなわち、ゲノムＲＮＡまたはビリオンＲＮＡ）である配列番号４を除いて、５’から３’への向きでのプラス鎖（すなわち、アンチゲノムまたはｍＲＮＡ）配列である。標的がマイナス鎖ｖＲＮＡであるとき、標的にされる配列は、別段述べられない限り（例えば、配列番号４）、表１に列挙される配列の相補鎖であることが明らかであり得る。
Ｍ１およびＭ２タンパク質は、それぞれ、ウイルスのマトリックスタンパク質およびイオンチャネル活性の構成要素である。これら２つのタンパク質は、同じＡＵＧ開始部位を利用するセグメント７ｖｃＲＮＡの選択的スプライシング型から生成される。Ｍ２タンパク質は、２つの現行の抗インフルエンザ治療薬であるアマンタジンおよびリマンタジンの標的である。Ｍ１／Ｍ２遺伝子のＡＵＧ開始コドン領域（ＡＵＧ開始コドンに対して−２０から＋２５）に対する例示的な標的配列は、配列番号１として列挙されている末端の６０ヌクレオチド領域の部分配列である配列番号２として表されている。Ｍ１／Ｍ２セグメントの３’末端の標的配列（２５ヌクレオチド）は、これも末端の６０ヌクレオチド領域の部分配列である配列番号３によって表されており、そのセグメントのプラス鎖（ｖｃＲＮＡ）とマイナス鎖（ｖＲＮＡ）の両方において標的にされ得る。その５’末端の配列（配列番号３）は、配列番号４として下記に示されるマイナス鎖において首尾良く標的にされ得る。配列番号１〜４は、２００９Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ｓ−ＯＩＶ）由来であり、アクセッション番号ＧＱ３３２６４６としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに見られるウイルスの例示的な単離株由来である。他の参照インフルエンザＡ亜型の５’末端の６０ヌクレオチド領域は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＨ２Ｎ２に対してそれぞれ配列番号５、６、７、８として表１に列挙される。対応するＡＵＧおよび末端の標的領域は、上に記載された指針を用いてこれらのウイルスの配列から得られ得る。
Ｍ１／Ｍ２セグメントのスプライス供与領域およびスプライス受容領域を標的にすることも可能である。そのスプライス供与部位およびスプライス受容部位は、それぞれヌクレオチド５１および７４０である。本発明のアンチセンス化合物を用いていずれかのスプライスジャンクションを標的にすることが企図される。さらに、適切に設計されたアンチセンス化合物（例えば、配列番号１２〜１６および１９〜２２）を用いて、ＡＵＧ開始部位とスプライス供与部位の両方を阻止することも可能である。標的とするスプライス受容領域は、２００９Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）亜型について、配列番号１０として下記に示される。Ｈ５Ｎ１亜型の場合の対応する領域は、表１に配列番号９として列挙されている。
さらに、Ｍ１／Ｍ２セグメントの任意の翻訳感受性、スプライシング感受性または複製感受性の領域が、本発明の化合物を用いて標的にされ得ることが企図される。プロトタイプのＨ１Ｎ１亜型（プエルトリコ／８／３４）に対する参照Ｍ１／Ｍ２（セグメント７）配列は、表１に配列番号１１として示され、ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅデータベースにおいてＮＣ＿００２０１６として見られ得る。対応するＭ１／Ｍ２セグメント配列は、公的に利用可能な配列データベースから得ることができる。追加の翻訳感受性、スプライシング感受性および／または複製感受性の標的領域が同定され得るという見込みで、本発明のアンチセンス化合物がこのセグメントの他の領域を標的にし得ると企図される。
表１：例示的なインフルエンザウイルス核酸標的配列
Figure 2013510584
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 図４Ａは、インフルエンザＡの重要な亜型：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２およびＨ７Ｎ７由来のＭ１／Ｍ２セグメントの５’末端の６０ヌクレオチドの保存を示している。図４Ｂは、ゲノム配列のＮＣＢＩインフルエンザデータベースに基づいて（Ｂａｏ Ｙ．，Ｐ．Ｂｏｌｏｔｏｖ，Ｄ．Ｄｅｒｎｏｖｏｙ，Ｂ．Ｋｉｒｙｕｔｉｎ，Ｌ．Ｚａｓｌａｖｓｋｙ，Ｔ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｊ．Ｏｓｔｅｌｌ，ａｎｄ Ｄ．Ｌｉｐｍａｎ．Ｔｈｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８ Ｊａｎ；８２（２）：５９６−６０１）好ましいＰＭＯ（Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ；配列番号１２）の各塩基に対する、インフルエンザの１つの重要な血清型である、ブタ起源のインフルエンザＡ（Ｓ−ＯＩＶ）としても知られるＨ１Ｎ１（２００９）における標的配列の保存を示している。大文字は、標的塩基を示しており、その塩基の隣の下付きの数字は、配列の上に示されるそのデータベース内のＨ１Ｎ１（２００９）単離株についてのその塩基に対する保存パーセントを示している。これらのデータは、塩基の位置が、Ｈ１Ｎ１（２００９）に対するＭ１／Ｍ２−ＡＵＧ標的についていかなる有意なバリエーションも示していないことを示している。
ある特定の実施形態において、アンチセンス標的化配列は、表１に列挙される標的配列のうちの１つ以上の領域にハイブリダイズするように設計される。選択されたアンチセンス標的化配列は、例えば、約１２塩基またはそれ以上、例えば、約４０塩基短く作製され得、その配列が、標的とのハイブリダイゼーションの際に、翻訳、スプライシングおよび／または複製の阻害をもたらすのに十分相補的である限り、少数のミスマッチを含み得、４５℃以上のＴｍを有するヘテロ二重鎖をウイルスＲＮＡと形成する。
ある特定の実施形態において、標的配列とアンチセンス標的化配列との間の相補性の程度は、安定な二重鎖を形成するのに十分である。標的ＲＮＡ配列とアンチセンスオリゴマーとの相補性の領域は、８〜１１塩基もの短さであり得るが、好ましくは、１２〜１５塩基またはそれ以上、例えば、１２〜２０塩基または１２〜２５塩基（これらの範囲の間のすべての整数を含む）である。約１４〜１５塩基のアンチセンスオリゴマーは、一般に、ウイルスゲノム内で唯一の相補的な配列を有するのに十分長い。ある特定の実施形態において、下記で論じられるように、必要な結合Ｔｍを達成する最も短い長さの相補的な塩基が要求されることがある。
ある特定の実施形態において、４０塩基もの長さのオリゴマーが適当である場合があり、ここで、少なくとも最小数の塩基、例えば、１０〜１２塩基が、標的配列と相補的である。しかしながら、一般に、細胞における促進性の取り込みまたは能動的な取り込みが、約３０未満のオリゴマー長において最適化される。下記にさらに記載されるＰＭＯオリゴマーの場合、結合安定性と取り込みとの最適なバランスは、一般に、１８〜２５塩基の長さにおいて生じる。約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０塩基からなるアンチセンスオリゴマー（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、２’−ＯＭｅ）およびＰＭＯオリゴマーが含まれ、ここで、少なくとも約６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個連続した塩基または連続していない塩基が、配列番号１〜１１の標的配列またはそれらのバリアントと相補的である。
ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ウイルス核酸標的配列と１００％相補的であってもよいし、オリゴマーとウイルス核酸標的配列との間に形成されるヘテロ二重鎖が、細胞のヌクレアーゼの作用およびインビボで生じ得る他の分解形式に耐えるのに十分に安定である限り、例えばバリアントに適応させるために、ミスマッチを含んでもよい。ヌクレアーゼによる切断にそれほど影響されやすくないオリゴマー骨格は、下で論じられる。ミスマッチは、存在する場合、中央よりもハイブリッド二重鎖の末端領域のほうが不安定にしない。許容されるミスマッチの数は、十分に理解されている二重鎖安定性の原理に従って、オリゴマーの長さ、二重鎖内のＧ：Ｃ塩基対のパーセンテージ、および二重鎖内のミスマッチの位置に依存し得る。そのようなアンチセンスオリゴマーは、必ずしもウイルス核酸標的配列と１００％相補的でないが、それは、核酸標的の生物学的活性、例えば、ウイルスタンパク質の発現が調節されるように、標的配列と安定的かつ特異的に結合するのに有効である。
オリゴマーと標的配列との間で形成される二重鎖の安定性は、結合Ｔｍと、細胞の酵素的切断に対する二重鎖の感受性との関数である。相補的な配列のＲＮＡに関して、アンチセンス化合物のＴｍは、従来の方法（例えば、Ｈａｍｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７−１０８によって記載されているかまたはＭｉｙａｄａ Ｃ．Ｇ．ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ．Ｂ．，１９８７，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４ ｐｐ．９４−１０７に記載されているような方法）によって測定され得る。ある特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、相補的な配列のＲＮＡに関して、体温より高い結合Ｔｍ、好ましくは、約４５℃または５０℃より高い結合Ｔｍを有し得る。６０〜８０℃の範囲内またはそれ以上のＴｍが好ましい。周知の原理に従って、オリゴマー化合物のＴｍは、相補性に基づくＲＮＡハイブリッドに関して、二重鎖内の対になっているＣ：Ｇ塩基の比を高めることによって、および／またはヘテロ二重鎖の長さ（塩基対）を伸ばすことによって、上昇し得る。同時に、細胞の取り込みを最適化する目的で、オリゴマーのサイズを限定することも有益であり得る。このため、２５塩基以下の長さで高いＴｍ（４５〜５０℃またはそれ以上）を示す化合物が、高いＴｍ値のために２５塩基より長い長さを求める化合物よりも一般に好ましい。
ＰＭＯオリゴマーなどのある特定の実施形態において、オリゴマーのアンチセンス活性は、図１Ｂに例証されるような、非荷電のホスホロジアミデート結合とカチオン性のホスホロジアミデート結合との混合物を用いることによって、増大され得る。オリゴマー内のカチオン性結合の総数は、１〜１０個と様々であり得（これらの間のすべての整数を含む）、オリゴマー全体にわたって散在し得る。好ましくは、荷電結合の数は、少なくとも２つ、かつ骨格結合の総数の半数以下であり、例えば、２、３、４、５、６、７または８つの正に帯電した結合であり、好ましくは、各荷電結合は、骨格に沿って、少なくとも１、２、３、４または５つの非荷電結合によって分断される。様々なオリゴマーのアンチセンス活性は、オリゴマー標的領域を５’末端のレポーター遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ）に融合し、次いで、無細胞翻訳アッセイにおいてその融合遺伝子のｍＲＮＡ転写物の翻訳の阻害を測定することによって、インビトロにおいて測定され得る。非荷電結合とカチオン性結合との混合物を含むオリゴマーの阻害特性は、無細胞翻訳アッセイにおいて約５〜１００倍増大され得る。オリゴマー全体にわたって散在する、図１Ｂおよび図２に例証されるような３つのカチオン性結合を含む形態の本発明の好ましいアンチセンスオリゴマー（Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ）は、下記の表２において配列番号１３として示されている。Ｍ１／Ｍ２ＡＵＧを標的にし、かつ散在する３つのカチオン性結合を含む一連の例示的なアンチセンスオリゴマーは、配列番号３４〜４７として示されている。
下記の表２は、インフルエンザＡウイルスと相補的である例示的な標的化配列を、５’から３’への向きで示している。列挙される配列は、上で述べられた一般的な分類規則に従って、標的化配列が選択され得る標的化配列のコレクションを提供する。列挙される標的化配列は、任意のアンチセンスアナログオリゴヌクレオチド化学（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡまたは２’−ＯＭｅ）について使用され得るが、表２の配列は、ＰＭＯアンチセンスオリゴマーとして使用するために好ましい。配列番号１２〜２２、２５〜２９および３４〜４７は、そのウイルスのプラス鎖（ｍＲＮＡまたはｖｃＲＮＡ）に対するアンチセンスであるのに対し、配列番号２３および２４は、マイナス鎖（ｖＲＮＡ）に対するアンチセンスである。したがって、例えば、Ｍ１／Ｍ２をコードするセグメント（インフルエンザＡのセグメント７）のマイナス鎖の３’末端に対して標的を選択する際、配列番号４、またはそのマイナス鎖の３’末端の機能を阻止するのに有効な配列の一部が選択され得る。配列番号１２〜２９および３４〜４７は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）のＭ１／Ｍ２セグメントを標的にするのに対し、配列番号３０〜３３は、示されるようにＰＢ１またはＮＰセグメントを標的にする。
表２．例示的なアンチセンス標的化配列
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 アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物
上で詳述されたように、アンチセンスオリゴヌクレオチド（用語「アンチセンス」は、その化合物がウイルスのプラスセンス鎖ＲＮＡまたはマイナスセンス鎖もしくはマイナス鎖を標的にしていることを示す）は、代表的には、以下のうちの１つ以上；１）マイナスセンスウイルスＲＮＡの５’もしくは３’末端の２５塩基；２）プラスセンスｖｃＲＮＡの５’もしくは３’末端の末端の３０塩基；３）ウイルスｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基、および／または；４）選択的スプライシングに供されるインフルエンザｍＲＮＡのスプライス供与部位もしくはスプライス受容部位の周辺の５０塩基を含む領域を標的にする塩基配列を含む。さらに、そのオリゴマーは、宿主細胞、例えば、感染した哺乳動物被験体内の宿主細胞に投与されたとき、例えば、標的タンパク質の発現（例えば、Ｍ１もしくはＭ２または両方）を減少させるか、ウイルスの複製を減少させるか、またはその両方によって、感染しているウイルスを効果的に標的にすることができる。この要件は、代表的には、オリゴマー化合物が、（ａ）哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる能力を有するとき、および（ｂ）いったん取り込まれると、約４５℃より高いＴｍで標的ＲＮＡと二重鎖を形成するときに満たされる。
ある特定の実施形態において、オリゴマー骨格は、実質的に非荷電であり得、好ましくは、細胞膜を越えた能動輸送または促進輸送に対する基質として認識され得る。オリゴマーが標的ＲＮＡと安定な二重鎖を形成する能力は、オリゴマー骨格の他の特徴（アンチセンスオリゴマーの長さおよび標的に対する相補性の程度、Ｇ：Ｃ塩基マッチとＡ：Ｔ塩基マッチとの比、ならびに任意のミスマッチしている塩基の位置を含む）にも関し得る。アンチセンスオリゴマーが細胞のヌクレアーゼに抵抗する能力は、その物質の残存および細胞質への最終的な送達を促進し得る。ＰＭＯ骨格化学を使用する本発明の例示的なアンチセンスオリゴマー標的化配列は、上記の表２に列挙されている。代替化学を使用する標的化配列が、ＰＮＡおよびＬＮＡ化学について、それぞれ下記の表３および４に列挙される。一般に、ＰＮＡおよびＬＮＡ化学は、ＰＭＯおよび２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーと比べて相対的に高い標的結合強度に起因して、より短い標的化オリゴマーを利用する。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡのアナログであり、その骨格は、ピリミジンまたはプリン塩基が付着されたＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットからなるデオキシリボース骨格と構造的に同形である。天然のピリミジンおよびプリン塩基を含むＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成の法則に従って、相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、また、塩基対認識に関してＤＮＡによく似ている（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって形成され、そのおかげでアンチセンスの用途にとって適切になる（下記の構造を参照のこと）。その骨格は、非荷電であり、その結果、通常の熱安定性よりも高い熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖が生じる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない。
ＰＮＡは、当該分野で公知の任意の手法を用いて合成的に生成され得る。ＰＮＡは、下記に例証されるような、従来のＤＮＡのリン酸リボース環をポリアミド骨格が置き換えているＤＮＡアナログである。
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 天然の構造に対してラジカル構造が変化しているにもかかわらず、ＰＮＡは、らせん型でＤＮＡまたはＲＮＡに配列特異的に結合することができる。ＰＮＡの特徴としては、相補ＤＮＡまたは相補ＲＮＡに対する高い結合親和性、一塩基のミスマッチによって引き起こされる不安定化作用、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する抵抗性、塩濃度と無関係なＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション、ならびにホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が挙げられる。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（商標）は、その専売のＢｔｓ ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール−２−スルホニル基）および専売のオリゴマー化プロセスを開発した。Ｂｔｓ ＰＮＡモノマーを用いるＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、結合およびキャッピングの反復サイクルから構成される。この技術に対する例示的な特許としては、米国特許第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号および同第７，１７９，８９６号が挙げられる。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号（これらの各々が本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物に関するさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００，１９９１に見られ得る。
本発明を実施するための例示的なＰＮＡ化合物は、下記の表３に列挙される。これらのオリゴヌクレオチドは、本明細書中で引用される参考文献に示される手順に本質的に従って調製され得る。
表３．例示的なＰＮＡアンチセンス標的化配列
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 本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、「ロックト核酸」サブユニット（ＬＮＡ）も含み得る。ＬＮＡの構造は、例えば、Ｗｅｎｇｅｌら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４：３６０７およびＡｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２：３０１）；Ｏｂｉｋａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８：８７３５；（１９９８）３９：５４０１およびＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６：９２３０に見られ得る。非限定的で例示的なＬＮＡ構造を下記に例証する：
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 本発明の化合物は、１つ以上のＬＮＡを組み込み得；場合によっては、本化合物は、完全にＬＮＡから構成され得る。個別のＬＮＡヌクレオシドサブユニットを合成するための方法およびそのサブユニットをオリゴヌクレオチドに組み込むための方法は、当該分野で公知である：米国特許第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号および同第６，６７０，４６１号。代表的なサブユニット間リンカーとしては、ホスホジエステル部分およびホスホロチオエート部分が挙げられる；あるいは、リン（ＩＩＩ）非含有リンカーを使用してもよい。好ましい実施形態は、各ＬＮＡサブユニットがＤＮＡサブユニットによって分断されているＬＮＡ含有化合物である。さらに好ましい化合物は、ＬＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットとの交互のものから構成され、ここで、そのサブユニット間リンカーは、ホスホロチオエートである。
以下の化合物は、上で引用された参考文献に示される手順に本質的に従って調製される。ＬＮＡサブユニットを含む例示的な化合物を下記の表４に示す（ＬＮＡは大文字で書かれており、ＤＮＡは小文字であり、配列は５’から３’の向きである）。
表４．例示的なＬＮＡアンチセンス標的化配列
Figure 2013510584
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 好ましいオリゴマー構造は、上に記載されたような、非荷電結合によって結合される塩基対形成部分を有するモルホリノベースのサブユニットを使用する。実質的に非荷電のホスホロジアミデートによって連結されたモルホリノオリゴマーが、特に好ましい。アンチセンスオリゴマーを含むモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、共同所有の米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号、ならびにＰＣＴ出願番号ＵＳ２００８／０１２８０４（これらのすべてが明確に参考として援用される）に詳述されている。
モルホリノベースのサブユニットのある特定の特性としては：安定な非荷電の骨格結合によって、オリゴマー型として連結されることが可能であること；形成されたポリマーが、１０〜１４塩基もの短いオリゴマーでさえも高いＴｍで相補的な塩基標的核酸（標的ＲＮＡを含む）とハイブリダイズすることができるように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニンまたはウラシル）を支持することが可能であること；そのオリゴマーが能動的に哺乳動物細胞内に運搬されることが可能であること；およびそのオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖がＲＮａｓｅ分解に抵抗することが可能であることが挙げられる。
リン含有骨格結合を有するモルホリノオリゴヌクレオチドの例は、図１Ａ〜１Ｃに例証される。好ましくはその骨格結合の１０％〜５０％において正に帯電した基を含むように本発明の１つの態様に従って改変される、図１Ｂに示されるようなホスホロジアミデートによって連結されたモルホリノオリゴヌクレオチドが、特に好ましい。非荷電の骨格結合を有するモルホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）は、例えば、（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，１９９７）ならびに共同所有の米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号、ならびにＰＣＴ出願番号ＵＳ２００８／０１２８０４（これらのすべてが参考として援用される）に詳述されている。荷電骨格結合および／または改変された末端基を有する例示的なモルホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）は、ＰＣＴ出願番号ＵＳ２００７／０１１４３５；同時係属中の米国仮出願番号６１／３４９，７８３；および同時係属中の米国仮出願番号６１／３６１，８７８（これらの各々はその全体が参考として援用される）に詳述されている。
モルホリノベースのサブユニットの特性としては：１）安定な非荷電のまたは正に帯電した骨格結合によって、オリゴマー型として連結されることが可能であること；２）形成されたポリマーが、比較的短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜１５塩基）において約４５℃より高いＴｍ値で相補的な塩基標的核酸（標的ＲＮＡを含む）とハイブリダイズすることができるように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシルおよびヒポキサンチン）を支持することが可能であること；３）そのオリゴヌクレオチドが能動的または受動的に哺乳動物細胞内に運搬されることが可能であること；および４）そのアンチセンスオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二重鎖がそれぞれＲＮａｓｅ分解およびＲＮａｓｅＨ分解に抵抗することが可能であることが挙げられる。
特許請求される主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する例示的な骨格構造としては、図１Ｄ〜１Ｇに示されるモルホリノサブユニットタイプが挙げられ、それらの各々は、非荷電のまたは正に帯電したリン含有サブユニット結合によって連結される。図１Ｄは、５原子反復単位骨格を形成するリン含有結合を示しており、ここで、モルホリノ環は、１原子ホスホアミド結合によって連結されている。図１Ｅは、６原子反復単位骨格を生成する結合を示している。この構造では、５’モルホリノ炭素をリン基に連結している原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素または好ましくは酸素であり得る。リンにぶら下がっているＸ部分は、フッ素、アルキルもしくは置換アルキル、アルコキシもしくは置換アルコキシ、チオアルコキシもしくは置換チオアルコキシ、または非置換、一置換もしくは二置換の窒素（モルホリンまたはピペリジンなどの環状構造を含む）であり得る。アルキル、アルコキシおよびチオアルコキシは、好ましくは、１〜６個の炭素原子を含む。Ｚ部分は、硫黄または酸素であり、好ましくは、酸素である。
図１Ｆおよび１Ｇに示される結合は、７原子単位長骨格となるように設計されている。構造１Ｆでは、Ｘ部分は、構造１Ｅにおけるとおりであり、Ｙ部分は、メチレン、硫黄または好ましくは酸素であり得る。構造１Ｇでは、ＸおよびＹ部分は、構造１Ｅにおけるとおりである。特に好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドとしては、図１Ｅに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成されるものが挙げられ、ここで、Ｘ＝ΝＨ２、Ｎ（ＣＨ３）２もしくは１−ピペラジンまたは他の荷電基であり、Ｙ＝Ｏであり、かつＺ＝Ｏである。
上で述べたように、実質的に非荷電のオリゴヌクレオチドは、荷電結合、例えば、２〜５個の非荷電結合ごとに最大約１個（例えば、１０個の非荷電結合ごとに約４〜５個）を含むように、本発明の態様に従って改変され得る。ある特定の実施形態において、アンチセンス活性の最適な改善は、骨格結合の約２５％がカチオン性であるときに見られ得る。ある特定の実施形態において、より少数の、例えば、１０〜２０％のカチオン性結合のとき、またはカチオン性結合の数が５０〜８０％の範囲内（例えば、約６０％）である場合に、増強が見られ得る。
本発明を支持して行われた追加実験は、カチオン性骨格の電荷が加えられたときに見られた増強が、場合によっては、その電荷の大部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドの「中心領域」の骨格結合の近くに分布させることによって、例えば、８つのカチオン性骨格結合を含む２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドにおいて、これらの荷電結合の少なくとも７０％を真ん中の１０個の結合に局在させることによって、さらに増大され得ることを示唆している。
ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、上で引用された参考文献において詳述される方法、ならびに混合物または非荷電およびカチオン性の骨格結合を有するオリゴヌクレオチドの合成に関して下で詳述される方法を用いる、段階的な固相合成によって調製され得る。場合によっては、例えば、薬物動態を高めるためまたはその化合物の捕捉もしくは検出を容易にするために、追加の化学部分をアンチセンス化合物に付加することが望ましいことがある。そのような部分は、標準的な合成方法に従って、代表的にはオリゴマーの末端に共有結合的に付着され得る。例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー、例えば、１０〜１００個のモノマーサブユニットを有するものの付加は、溶解性を高める際に有用であり得る。１つ以上の荷電基、例えば、有機酸などのアニオン性荷電基は、細胞の取り込みを増大させ得る。
レポーター部分（例えば、フルオレセインまたは放射性標識基）が、検出の目的のために付着され得る。あるいは、オリゴマーに付着されるレポーター標識は、標識された抗体またはストレプトアビジンに結合することができるリガンド（例えば、抗原またはビオチン）であり得る。アンチセンス化合物の付着または改変のための部分を選択する際、当然のことながら、通常、生体適合性である基の化合物を選択すること、および望ましくない副作用なく被験体が許容する見込みがあることが望ましい。
上で述べたように、ある特定のアンチセンス化合物は、上に記載されたタイプの非荷電結合の間に散在する、選択された数のカチオン性結合を含むように構築され得る。非荷電とカチオン性の両方のサブユニット間結合は、好ましくは、以下の構造：
Figure 2013510584
 を有するリン含有結合であり、
ここで、
Ｗは、ＳまたはＯであり、好ましくは、Ｏであり、
Ｘ＝ＮＲ１Ｒ２またはＯＲ６であり、
Ｙ＝ＯまたはＮＲ７であり、
そしてオリゴマー内の前記結合の各々は：
（ａ）非荷電結合（ａ）（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６およびＲ７の各々は、独立して、水素および低級アルキルから選択される）；
（ｂ１）カチオン性結合（ｂ１）（ここで、Ｘ＝ＮＲ１Ｒ２かつＹ＝Ｏであり、ＮＲ１Ｒ２は、必要に応じて置換されるピペラジノ基を表し、Ｒ１Ｒ２＝−ＣＨＲＣＨＲＮ（Ｒ３）（Ｒ４）ＣＨＲＣＨＲ−であり、
ここで、
各Ｒは、独立して、ＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３または電子対であり、そして
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、例えば、ＣＨ３、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、Ｚ−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２および［Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ’ＮＨ］ｍＨから選択され、ここで：Ｚは、Ｃ（Ｏ）または直接の結合であり、Ｌは、アルキル、アルコキシおよびアルキルアミノから選択される結合を有する、最大１８原子長、好ましくは、最大１２原子長、より好ましくは、最大８原子長の随意のリンカーであり、Ｒ’は、天然に存在するアミノ酸の側鎖またはその１炭素もしくは２炭素のホモログであり、ｍは、１〜６、好ましくは、１〜４である）；
（ｂ２）カチオン性結合（ｂ２）（ここで、Ｘ＝ＮＲ１Ｒ２かつＹ＝Ｏであり、Ｒ１＝ＨまたはＣＨ３であり、Ｒ２＝ＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３およびＲ４は、上で定義されたとおりであり、Ｒ５は、Ｈ、低級アルキルまたは低級（アルコキシ）アルキルである）；および
（ｂ３）カチオン性結合（ｂ３）（ここで、Ｙ＝ＮＲ７かつＸ＝ＯＲ６であり、Ｒ７＝ＬＮＲ３Ｒ４Ｒ５であり、ここで、Ｌ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、上で定義されたとおりであり、Ｒ６は、Ｈまたは低級アルキルである）；
から選択され、そして少なくとも１つの前記結合は、カチオン性結合（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）から選択される。
ある特定の実施形態において、オリゴマーは、少なくとも２つの連続したタイプ（ａ）の結合（すなわち、非荷電結合）を含み得る。さらなる実施形態において、オリゴマー内の結合の少なくとも５％は、カチオン性結合（すなわち、タイプ（ｂ１）、（ｂ２）または（ｂ３））であり；例えば、１０％〜６０％、好ましくは、２０〜５０％の結合が、カチオン性結合であり得る。
１つの実施形態において、少なくとも１つの結合は、タイプ（ｂ１）であり、ここで、好ましくは、各Ｒは、Ｈであり、Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３または電子対であり、Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、例えば、ＣＨ３、Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２およびＣ（Ｏ）−Ｌ−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２から選択される。Ｒ３の後者の２つの実施形態は、それぞれ、ピペラジン環に直接付着されるかまたはリンカー基Ｌにぶら下がる、グアニジノ部分を提供する。合成を容易にするために、Ｒ３中の可変部Ｚは、好ましくは、示されるようにＣ（Ｏ）（カルボニル）である。
上で述べたようなリンカー基Ｌは、アルキル（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）、アルコキシ（−Ｃ−Ｏ−）およびアルキルアミノ（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−）から選択される結合をその骨格内に含むが、ただし、Ｌ内の末端の原子（例えば、カルボニルまたは窒素に隣接する原子）は、炭素原子である。分枝状の結合（例えば、−ＣＨ２−ＣＨＣＨ３−）が可能であるが、リンカーは、好ましくは、非分枝状である。１つの実施形態において、リンカーは、炭化水素リンカーである。そのようなリンカーは、構造−（ＣＨ２）ｎ−を有し得、ここで、ｎは、１〜１２、好ましくは、２〜８、より好ましくは、２〜６である。
モルホリノサブユニットは、以下の構造：
Figure 2013510584
 を有し、ここで、Ｐｉは、塩基対形成部分であり、上で示された結合は、（ｉ）の窒素原子を隣接サブユニットの５’炭素に接続する。塩基対形成部分Ｐｉは、同じであってもよいし、異なってもよく、通常、標的核酸に結合する配列を提供するように設計される。
モルホリノサブユニットを連結する上記の結合タイプ（ｂ１）、（ｂ２）および（ｂ３）の実施形態の使用は、以下のとおり図式的に例証され得る：
Figure 2013510584
 好ましくは、オリゴマー内のすべてのカチオン性結合が同じタイプである；すなわち、すべてタイプ（ｂ１）、すべてタイプ（ｂ２）またはすべてタイプ（ｂ３）である。
さらなる実施形態において、カチオン性結合は、下に示されるような結合（ｂ１’）および（ｂ１”）から選択され、ここで、（ｂ１”）は、本明細書中で「Ｐｉｐ」結合と呼ばれ、（ｂ１”）は、本明細書中で「ＧｕＸ」結合と呼ばれる：
Figure 2013510584
Figure 2013510584
 上記の構造において、Ｗは、ＳまたはＯであり、好ましくは、Ｏであり；Ｒ１およびＲ２の各々は、独立して、水素および低級アルキルから選択され、好ましくは、メチルであり；Ａは、（ｂ１’）および（ｂ１”）中の１つ以上の炭素原子上の水素または非干渉置換基を表す。好ましくは、ピペラジン環における環炭素は、非置換である；しかしながら、それらは、メチルまたはフッ素などの非干渉置換基を含み得る。好ましくは、多くても１つまたは２つの炭素原子がそのように置換される。さらなる実施形態において、結合の少なくとも１０％が、タイプ（ｂ１’）または（ｂ１”）であり；例えば、結合の１０％〜６０％、好ましくは、２０％〜５０％が、タイプ（ｂ１’）または（ｂ１”）であり得る。
ある特定の実施形態において、オリゴマーは、上記のタイプ（ｂ１’）の結合を含まない。あるいは、オリゴマーは、タイプ（ｂ１）の結合（各Ｒは、Ｈであり、Ｒ３は、ＨまたはＣＨ３であり、Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３または電子対である）を含まない。
モルホリノサブユニットは、少なくとも１つの結合が、上に記載されたようなペンダントカチオン基で改変された、下記でさらに記載されるようなリンベースでないサブユニット間結合によっても連結され得る。
未改変の状態では非荷電であるがペンダントアミン置換基も有し得る他のオリゴヌクレオチドアナログ結合が使用され得る。例えば、モルホリノ環上の５’窒素原子は、スルファミド結合または尿素結合（それぞれ、リンが炭素または硫黄で置き換えられている）において使用され得、上記の構造（ｂ３）内の５’窒素原子に類似の様式で改変され得る。
任意の数のカチオン性結合を有するオリゴマー（完全にカチオン性結合によって連結されたオリゴマーを含む）が提供される。しかしながら、好ましくは、それらのオリゴマーは、部分的に、例えば、１０％〜８０％が帯電している。好ましい実施形態において、結合の約１０％〜６０％、好ましくは、２０％〜５０％が、カチオン性である。
１つの実施形態において、カチオン性結合は、骨格に沿って散在する。部分的に帯電したオリゴマーは、好ましくは、少なくとも２つの連続した非荷電結合を含む；すなわち、そのオリゴマーは、好ましくは、その長さ全体にわたって厳密に交互のパターンを有しない。
カチオン性結合のブロックおよび非荷電結合のブロックを有するオリゴマーも考えられる；例えば、非荷電結合の中央のブロックが、カチオン性結合のブロックに隣接し得るか、またはその逆であり得る。１つの実施形態において、そのオリゴマーは、ほぼ等しい長さの５’領域、３’領域および中心領域を有し、その中心領域内のカチオン性結合のパーセンテージは、約５０％より高く、好ましくは、約７０％より高い。
アンチセンスの用途で使用するためのオリゴマーは、通常、約１０〜約４０個のサブユニット、より好ましくは、約１０〜３０個のサブユニット、代表的には、１５〜２５塩基の長さの範囲である。例えば、アンチセンス化合物にとって有用な長さである１９〜２０個のサブユニットを有する本発明のオリゴマーは、理想的には、２〜１０個、例えば、４〜８個のカチオン性結合を有し得、残りは、非荷電結合であり得る。１４〜１５個のサブユニットを有するオリゴマーは、理想的には、２〜７個、例えば、３、４または５個のカチオン性結合を有し得、残りは、非荷電結合であり得る。
各モルホリノ環構造は、代表的には、処置される細胞内または被験体内において選択されたアンチセンス標的にハイブリダイズするように設計された塩基対形成部分の配列を形成する塩基対形成部分を支持する。その塩基対形成部分は、天然のＤＮＡもしくはＲＮＡに見られるプリンもしくはピリミジン（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）、またはアナログ（例えば、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基構成要素）または５−メチルシトシン）であり得る。
ペプチドトランスポーター
ある特定の実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、細胞内への化合物の輸送を増大するのに有効なアルギニンリッチペプチド輸送部分に結合体化されたオリゴヌクレオチド部分を含み得る。その輸送部分は、例えば、図１Ｃに示されるように、オリゴマーの末端に付着され得る。そのペプチド輸送部分は、好ましくは、Χ’サブユニット、Ｙ’サブユニットおよびＺ’サブユニットから選択される６〜１６個のサブユニットを含み、ここで、
（ａ）各Χ’サブユニットは、独立して、リジン、アルギニンまたはアルギニンアナログを表し、前記アナログは、構造Ｒ１Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｒ２（ここで、Ｒ１は、ＨまたはＲであり；Ｒ２は、Ｒ、ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲ２であり、Ｒは、低級アルキルまたは低級アルケニルであり、かつ酸素または窒素をさらに含み得；Ｒ１およびＲ２は、一体となって環を形成し得；側鎖は、Ｒ１またはＲ２を介して前記アミノ酸に連結される）の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり；
（ｂ）各Ｙ’サブユニットは、独立して、中性のアミノ酸−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨＲ）ｎ−ＮＨ−（ここで、ｎは、２〜７であり、各Ｒは、独立して、Ｈまたはメチルである）を表し；そして
（ｃ）各Ｚ’サブユニットは、独立して、中性のアラルキル側鎖を有するα−アミノ酸を表し；
ここで、そのペプチドは、（Χ’Ｙ’Χ’）ｐ、（Χ’Ｙ’）ｍ、（Χ’）ｍおよび（Χ’Ｚ’Ｚ’）ｐのうちの１つによって表される配列を含み、ここで、ｐは、２〜５であり、ｍは、２〜９である。ある特定の実施形態は、（Χ’Ｙ’Χ’）ｐ、（Χ’Ｙ’）ｍ、（Χ’）ｍおよび／または（Χ’Ｚ’Ｚ’）ｐから独立して選択される様々な組み合わせ（例えば、配列（Χ’Ｙ’Χ’）（Χ’Ζ’Ζ’）（Χ’Ｙ’Χ’）（Χ’Ζ’Ζ’）（配列番号１２９）を有するペプチドを含む）を含む。
選択された実施形態において、各Χ’について、側鎖部分は、アミノ酸サブユニットアルギニン（Ａｒｇ）におけるようなグアニジルである。さらなる実施形態において、各Ｙ’は、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ−ＮＨ−であり、ここで、ｎは、２〜７であり、Ｒは、Ｈである。例えば、ｎが５であり、かつＲがＨであるとき、Ｙ’は、Ａｈｘと本明細書中で省略される６−アミノヘキサン酸サブユニットであり；ｎが２であり、かつＲがＨであるとき、Ｙ’は、Ｂと本明細書中で省略されるβ−アラニンサブユニットである。ある特定の実施形態は、種々の中性のアミノ酸の組み合わせを有するキャリアペプチド（例えば、β−アラニンと６−アミノヘキサン酸の両方を含む配列−ＲＡｈｘＲＲＢＲＲＡｈｘＲＲＢＲＡｈｘＢ−（配列番号１２４）を含むペプチドを含む）に関する。
このタイプの好ましいペプチドは、単一のＹ’サブユニット（ここで、Ｙ’は好ましくはＡｈｘである）と交互に現れるアルギニンダイマーを含むペプチドを含む。例としては、式（ＲＹ’Ｒ）ｐまたは式（ＲＲＹ’）ｐを有するペプチドが挙げられ、ここで、Ｙ’は、好ましくはＡｈｘである。１つの実施形態において、Ｙ’は、６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、Ｒは、アルギニンであり、ｐは、４である。
ある特定の実施形態は、（ＲＹ’Ｒ）ｐおよび（ＲＲＹ’）ｐのうちの少なくとも２つの様々な直鎖状の組み合わせを含み、その組み合わせとしては、例えば、配列（ＲＹ’Ｒ）（ＲＲＹ’）（ＲＹ’Ｒ）（ＲＲＹ’）（配列番号１３０）または（ＲＲＹ’）（ＲＹ’Ｒ）（ＲＲＹ’）（配列番号１３１）を有する例証的なペプチドが挙げられる。他の組み合わせも企図される。さらなる例証的な実施形態では、各Ｚ’は、フェニルアラニンであり、ｍは、３または４である。
結合体化されたペプチドは、好ましくは、リンカーＡｈｘ−Ｂを介してオリゴマーの末端に連結され、ここで、Ａｈｘは、例えば図１Ｃに示されるような、６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、Ｂは、β−アラニンサブユニットである。ペプチドとオリゴマーとの間の代替のリンカーとしては、グリシンおよびシステインが挙げられる。これらのリンカーおよび関連するリンカーは、アミド結合またはジスルフィド結合を介して結合体化され得る。
選択された実施形態において、各Χ’について、側鎖部分は、独立して、グアニジル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）ＮＨ−）、アミジニル（ＨＮ＝Ｃ（ＮＨ２）Ｃ＜）、２−アミノジヒドロピリミジル、２−アミノテトラヒドロピリミジル、２−アミノピリジニルおよび２−アミノピリミドニルからなる群から選択され、好ましくは、グアニジルおよびアミジニルから選択される。１つの実施形態において、側鎖部分は、アミノ酸サブユニットアルギニン（Ａｒｇ）におけるようなグアニジルである。
ある特定の実施形態において、Ｙ’サブユニットは、Ｙ’サブユニット間に介在するΧ’サブユニットがないという点で連続していてもよいし、Χ’サブユニット間に１つずつ散在していてもよい。ある特定の実施形態において、連結サブユニットは、Ｙ’サブユニット間に存在し得る。１つの実施形態において、Ｙ’サブユニットは、トランスポーターの末端に存在する；他の実施形態において、それらのＹ’サブユニットは、Χ’サブユニットによって隣接されている。さらに好ましい実施形態において、各Ｙ’は、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨＲ−ＮＨ−であり、ここで、ｎは、２〜７であり、Ｒは、Ｈである。例えば、ｎが５であり、ＲがＨであるとき、Ｙ’は、Ａｈｘと本明細書中で省略される６−アミノヘキサン酸サブユニットである。
この基の選択される実施形態において、各Χ’は、アルギニンサブユニットにおけるようなグアニジル側鎖部分を含む。このタイプの好ましいペプチドは、単一のＹ’サブユニット（ここで、Ｙ’は好ましくはＡｈｘである）と交互に現れるアルギニンダイマーを含むペプチドを含む。例としては、式（ＲＹ’Ｒ）４（配列番号１３２）または式（ＲＲＹ’）４（配列番号１３３）を有するペプチドが挙げられ、ここで、Ｙ’は、好ましくはＡｈｘである。後者の場合、核酸アナログは、例えば、図１Ｃに示されるように、好ましくはＣ末端において、好ましくは末端のＹ’サブユニットに連結される。１つの例示的なリンカーは、構造ＡｈｘＢであり、ここで、Ａｈｘは、６−アミノヘキサン酸サブユニットであり、Ｂは、β−アラニンサブユニットである。代替のリンカーとしては、システインおよびグリシンが挙げられる。
本明細書中に記載されるような輸送部分は、付着された輸送部分の非存在下でのオリゴマーの取り込み、および疎水性サブユニットＹ’を欠く付着された輸送部分による取り込みと比べて、付着されたオリゴマーの細胞への侵入を大きく増大させると示されている。そのような取り込みの増大は、好ましくは、疎水性サブユニットＹ’を欠く付着された輸送部分による化合物の取り込みと比べて、哺乳動物細胞内へのその物質の取り込みの少なくとも２倍の増加、好ましくは、４倍の増加によって証明される。取り込みは、好ましくは、結合体化されていない化合物と比べて、少なくとも２０倍、より好ましくは、４０倍増大される。
輸送部分のさらなる利点は、おそらく、正に帯電した輸送部分と負に帯電した核酸との間の静電相互作用のおかげで、アンチセンス化合物とその標的核酸配列との間の二重鎖を安定化することが可能であると予想される点である。トランスポーター内の荷電サブユニットの数は、上で述べたように１４未満であり、好ましくは、８〜１１である。
アルギニンリッチペプチドトランスポーター（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本発明のある特定の実施形態を実施する際に特に有用である。ある特定のペプチドトランスポーターは、造血細胞および筋細胞を含む一次細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ）へのアンチセンス化合物の送達において高度に有効であると示されている（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｏｄａら、２００７；Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８；Ｗｕ，Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８）。さらに、他の公知のペプチドトランスポーター（例えば、ＰｅｎｅｔｒａｔｉｎおよびＴａｔペプチド）と比べて、本明細書中に記載されるペプチドトランスポーターは、アンチセンスＰＭＯと結合体化されるとき、いくつかの遺伝子転写物のスプライシングを変更する能力の増大を示す（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｏｄａら、２００７）。これらの研究における例示的なペプチドとしては、Ｐ００７（配列番号１１８）、ＣＰ０４０５７（配列番号１２３）およびＣＰ０６０６２（配列番号１２４）が挙げられる。
リンカー（Ｂ、ＡｈｘＢ、ＣまたはＧ）を含む例示的なペプチドトランスポーターは、下記の表５に与えられる。ある特定の実施形態において、表５に列挙される例示的なペプチドトランスポーターは、ジスルフィド結合またはアミド結合を介してＰＭＯに結合体化され得る。
表５．例示的なペプチドトランスポーター
Figure 2013510584
Figure 2013510584
 ＲＮＡ干渉物質
本明細書中に記載されるインフルエンザ標的領域（例えば、Ｍ１、Ｍ２；配列番号１〜１１）は、種々のＲＮＡ干渉に基づく方法によっても標的にされ得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、そもそも、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの研究において発見された進化的に保存された遺伝子サイレンシング機構である（Ｌｅｅら、Ｃｅｌｌ ７５：８４３，１９９３；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ ４０３：９０１，２０００）。ＲＮＡｉは、適切な分子機構を発現している細胞内にｄｓＲＮＡを導入することによって引き起こされ得、次いで、そのｄｓＲＮＡが、対応する内因性のｍＲＮＡを分解する。この機構は、ｄｓＲＮＡから短いＲＮＡ（リボヌクレアーゼを相同のｍＲＮＡ標的に導く）への変換を含む（例えば、Ｒｕｖｋｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９４：７９７，２００１によって要約されている）。
ある特定の実施形態において、本明細書中に提供される方法は、Ｍ１またはＭ２タンパク質の発現を干渉することなどによって、インフルエンザウイルスの複製を減少させるために、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を調節物質として利用し得る。ｄｓＲＮＡは、一般に、２本の一本鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、標的遺伝子または標的領域（「センス」鎖）の一部と実質的に同一のヌクレオチド配列を含み、他方の鎖（「相補」鎖または「アンチセンス」鎖）は、標的領域の一部と実質的に相補的な配列を含む。それらの鎖は、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的である。ある特定の実施形態において、それらの相補的なＲＮＡ鎖は、３０ヌクレオチド長未満、２５ヌクレオチド長未満、または１９〜２４ヌクレオチド長であり得る。ある特定の態様において、相補的なヌクレオチド配列は、２０〜２３ヌクレオチド長、または２２ヌクレオチド長であり得る。
ある特定の実施形態において、ＲＮＡ鎖の少なくとも一方は、１〜４ヌクレオチド長のヌクレオチドオーバーハングを含む。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に改変されたヌクレオチドをさらに含み得る。ある特定の態様において、１〜４ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含むｄｓＲＮＡは、末端のヌクレオチド対に直接隣接する一本鎖オーバーハングの対になっていないヌクレオチドがプリン塩基を含む分子を含み得る。他の態様において、ｄｓＲＮＡの両端における最後の相補的なヌクレオチド対は、Ｇ−Ｃ対であるか、または最後の４つの末端ヌクレオチド対の少なくとも２つは、Ｇ−Ｃ対である。
ある特定の本発明の実施形態は、マイクロＲＮＡを含み得る。マイクロＲＮＡは、生物内において天然に生成される低分子ＲＮＡの大集団であり、その一部は、標的遺伝子の発現を制御する。マイクロＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって約７０ヌクレオチドの一本鎖ヘアピン前駆体転写物から形成される（Ｖ．Ａｍｂｒｏｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：８０７，２００３）。マイクロＲＮＡは、タンパク質に翻訳されないが、その代わりに、特異的なメッセンジャーＲＮＡに結合し、それにより、翻訳を阻止する。マイクロＲＮＡは、その標的と不正確に塩基対形成することにより、翻訳を阻害すると考えられている。ある特定のマイクロＲＮＡは、ヘアピンＲＮＡ前駆体として転写され得、次いでそれは、Ｄｉｃｅｒ酵素によって成熟型にプロセシングされ得る。
ある特定の実施形態において、上記調節物質、すなわちＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。他の実施形態において、その調節物質、すなわちＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、二本鎖である。ある特定の実施形態は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も使用し得る。ある特定の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドの第１鎖は、第２鎖よりも２ヌクレオシド残基多く含む。他の実施形態において、第１鎖および第２鎖は、同じ数のヌクレオシドを有する；しかしながら、第１鎖および第２鎖は、第１鎖上および第２鎖上の２つの末端のヌクレオシドが、相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）上の残基と対を形成しないように食い違っている。ある特定の場合において、その対形成しない２つのヌクレオシドは、チミジン残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）である。
上記調節物質がｓｉＲＮＡを含む場合、その物質は、標的領域と十分に相同性である領域を含むべきであり、かつ、ｓｉＲＮＡ物質またはそのフラグメントが標的ＲＮＡのダウンレギュレーションを媒介し得るようにヌクレオチドに関して十分な長さであるべきである。用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、改変されたＲＮＡまたはヌクレオチド代理物の場合、１つ以上の位置における改変されたヌクレオチドまたは代理物置換部分のことも指し得ることが理解されるだろう。したがって、ｓｉＲＮＡ物質は、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な領域であるか、またはそのような領域を含む。ｓｉＲＮＡ物質と標的との間に完璧な相補性が存在する必要はないが、その対応は、ｓｉＲＮＡ物質またはその切断産物が、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などによる配列特異的サイレンシングを指示するのを可能にするのに十分でなければならない。標的鎖との相補性、すなわち相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重大である。特にアンチセンス鎖において完璧な相補性が望まれることが多いが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して１つ以上であるが、好ましくは、１０、８、６、５、４、３、２個またはそれより少ないミスマッチを含む。それらのミスマッチは、末端の領域において最も許容され、存在する場合、好ましくは、末端の領域、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４または３ヌクレオチド以内に存在する。センス鎖は、その分子の全体的な二本鎖の特性を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的であることだけが必要である。
さらに、ｓｉＲＮＡ調節物質は、改変され得るか、またはヌクレオシド代理物を含み得る。ｓｉＲＮＡ物質の一本鎖領域は、改変され得るかまたはヌクレオシド代理物を含み得、例えば、対になっていない領域またはヘアピン構造の領域、例えば、２つの相補的な領域を連結する領域が、改変またはヌクレオシド代理物を有し得る。例えばエキソヌクレアーゼに対してｓｉＲＮＡ物質の１つ以上の３’末端または５’末端を安定化する改変、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ物質がＲＩＳＣ内に入るのを促す改変もまた、有用である。改変としては、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、ホスホルアミダイトを与え、かつ別のＤＭＴ保護ヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成中に複数の結合を可能にする、特殊なビオチンまたはフルオレセイン試薬が挙げられ得る。
ｓｉＲＮＡ物質は、インターフェロン応答を引き起こさない十分短い分子（Ｄｉｃｅｒによって切断され得かつ／またはＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体）に入り得る分子）、例えば、ＲＩＳＣに入るのを可能にするサイズである分子、例えば、Ｄｉｃｅｒ切断産物に似ている分子に加えて、例えば、インターフェロン応答を引き起こすほど長い分子（Ｄｉｃｅｒによって切断され得（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６，２００１）かつＲＩＳＣに入り得る、分子）を含み得る。インターフェロン応答を引き起こさない程度に十分短い分子は、本明細書中でｓｉＲＮＡ物質またはより短いＲＮＡｉ物質と呼ばれる。使用される「ｓｉＲＮＡ物質またはより短いＲＮＡｉ物質」とは、ヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘導しない程度に十分短いｓｉＲＮＡ物質のことを指し、例えば、それは、６０ヌクレオチド対未満であるが、好ましくは、５０、４０または３０ヌクレオチド対未満の二重鎖の領域を有する。ｓｉＲＮＡ調節物質またはその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡ、好ましくは、Ｍ１またはＭ２などのインフルエンザ標的ＲＮＡに対するＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子をダウンレギュレートし得る。
ｓｉＲＮＡ調節物質の各鎖は、３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０ ヌクレオチド長以下であり得る。その鎖は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド長である。例えば、各鎖は、２１〜２５ヌクレオチド長であり得る。好ましいｓｉＲＮＡ物質は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド対の二重鎖領域、および１つ以上のオーバーハング、好ましくは、２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’オーバーハングを有する。
標的ＲＮＡに対する相同性および標的遺伝子をダウンレギュレートする能力に加えて、ｓｉＲＮＡ調節物質は、以下の特性のうちの１つ以上を有し得る：ｓｉＲＮＡ調節物質は、そのヌクレオシドの非常に多数またはすべてに対する改変にもかかわらず、正しい塩基対を形成することができるように、および例えば、標的ＲＮＡの切断による、標的のダウンレギュレーションを可能にするのに十分相同な標的ＲＮＡと二重鎖構造を形成することができるように、適切な３次元フレームワークにおいて塩基（または改変された塩基）をもたらし得るアンチセンス鎖を有し得る；ｓｉＲＮＡ調節物質は、そのヌクレオシドの非常に多数またはすべてに対する改変にもかかわらず、なおも「ＲＮＡ様」の特性を有し得、すなわち、それは、リボヌクレオチドベースの内容物のＲＮＡ分子の全体としての構造的、化学的および物理的な特性を（専らではないにしても、部分的にさえ）有し得る。例えば、ｓｉＲＮＡ物質は、ヌクレオチド糖のすべてが、例えば、２’ヒドロキシルの代わりに２’フルオロを含む、例えば、センス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み得る。このデオキシリボヌクレオチド含有物質は、なおもＲＮＡ様特性を示すと予想され得る。理論に拘束されることを望むものではないが、電気陰性フッ素は、リボースのＣ２’位に付着されたとき、軸方向の配向を好む。そして、このフッ素の空間的な好みによって、糖はＣ３’−エンドパッカー（ｅｎｄｏ ｐｕｃｋｅｒ）の形を取らざるを得なくなり得る。これは、ＲＮＡ分子において観察されるのと同じパッカリング様式であり、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型らせんを生じる。さらに、フッ素は、好適な水素結合アクセプターであるので、フッ素は、ＲＮＡ構造を安定化させると知られている水分子と同じ水素結合相互作用に関与し得る。一般に、２’糖の位置における改変された部分が、デオキシリボヌクレオチドのＨ部分よりもリボヌクレオチドのＯＨ部分により特徴的な水素結合に入ることができることが好ましい。
本明細書中で使用されるとき、「一本鎖ＲＮＡｉ物質」は、単一分子で構成されるＲＮＡｉ物質である。一本鎖ＲＮＡｉ物質は、鎖内の対形成によって形成される二重鎖の領域を含み得、例えば、ヘアピン構造もしくはパンハンドル（ｐａｎ−ｈａｎｄｌｅ）構造であり得るか、またはそれらを含み得る。一本鎖ＲＮＡｉ調節物質は、好ましくは、標的分子に対してアンチセンスである。一本鎖ＲＮＡｉ物質は、ＲＩＳＣに入り、ＲＩＳＣ媒介性の標的ｍＲＮＡ切断に関与し得るのに十分に長くあるべきである。一本鎖ＲＮＡｉ物質は、少なくとも１４ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０または５０ヌクレオチド長である。一本鎖ＲＮＡｉ物質は、好ましくは、２００、１００または６０ヌクレオチド長未満である。
ヘアピンＲＮＡｉ調節物質は、少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４もしくは２５ヌクレオチド対であるかまたはそれらに等しい二重鎖領域を有し得る。その二重鎖領域は、好ましくは、２００、１００または５０ヌクレオチド対の長さ以下であり得る。二重鎖領域に対するある特定の範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。ヘアピンは、一本鎖オーバーハング、または末端の対になっていない領域、好ましくは、そのヘアピンの３’、好ましくは、そのアンチセンス側の３’の対になっていない領域を有し得る。ある特定の実施形態において、オーバーハングは、２〜３ヌクレオチド長である。
本明細書中に提供される方法に従って利用されるある特定の調節物質は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（例えば、キメラオリゴヌクレオチド、すなわち、２つ以上の化学的に異なる領域を含み、その各々が少なくとも１つのモノマー単位（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合のヌクレオチド）で構成されている「キメラ」）を含み得る。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的には、少なくとも１つの領域を含み、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する高い抵抗性、高い細胞取り込みおよび／または標的核酸に対する高い結合親和性をオリゴヌクレオチドに付与するように、改変されている。その結果として、キメラオリゴヌクレオチドを使用したより短いオリゴヌクレオチドを用いるとき、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドと比べて、同等の結果を得ることができることが多い。キメラオリゴヌクレオチドは、上に記載されたように、２つ以上のオリゴヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成され得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、当該分野においてハイブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）とも呼ばれている。そのようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０１３，８３０号、同第５，１４９，７９７号、同第５，２２０，００７号、同第５，２５６，７７５号、同第５，３６６，８７８号、同第５，４０３，７１１号、同第５，４９１，１３３号、同第５，５６５，３５０号、同第５，６２３，０６５号、同第５，６５２，３５５号、同第５，６５２，３５６号、同第５，７００，９２２号および同第５，９５５，５８９号（これらの各々が本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、キメラオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡであり、ここで、そのオリゴヌクレオチドは、５〜６０ヌクレオチド長である。
本発明の１つの態様において、ＲＮＡｉ物質などの調節物質は、変更された核酸塩基または非天然の核酸塩基に繋ぎ止められた少なくとも１つのリガンドを含むオリゴヌクレオチドに関する。多数の化合物が、変更された塩基として機能し得る。変更された塩基の構造は、オリゴヌクレオチドがその標的（例えば、ｍＲＮＡ）に結合するのをその変更された塩基が実質的に妨害しないであろう範囲において重要である。ある特定の実施形態において、変更された塩基は、ジフルオロトリル、ニトロピロリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインドリル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル（ａｎｔｈｒａｎｃｅｎｙｌ）、ピリジニル、キノリニル、ピレニル、または本明細書中に記載される非天然核酸塩基のうちのいずれか１つの二価のラジカルである。ある特定の実施形態において、非天然核酸塩基は、ジフルオロトリル、ニトロピロリルまたはニトロイミダゾリルである。ある特定の実施形態において、非天然核酸塩基は、ジフルオロトリルである。多種多様のリガンドが、当該分野で公知であり、本発明に適している。例えば、リガンドは、ステロイド、胆汁酸、脂質、葉酸、ピリドキサール、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、芳香族化合物、多環式化合物、クラウンエーテル、インターカレーター、切断分子（ｃｌｅａｖｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、タンパク質結合物質または炭水化物であり得る。ある特定の実施形態において、リガンドは、ステロイドまたは芳香族化合物である。ある特定の場合において、リガンドは、コレステリルである。
他の実施形態において、ＲＮＡｉ物質は、細胞標的化および細胞取り込みを改善する目的でリガンドに繋ぎ止められたオリゴヌクレオチドである。例えば、ＲＮＡｉ物質は、抗体またはその抗原結合フラグメントに繋ぎ止められ得る。追加の例として、ＲＮＡｉ物質は、特異的なリガンド結合分子（例えば、特定の細胞表面レセプターに特異的に結合するポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント）に繋ぎ止められ得る。
他の実施形態において、調節物質は、非天然核酸塩基を含む。ある特定の実施形態において、その非天然核酸塩基は、ジフルオロトリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインドリルまたはニトロピロリルである。ある特定の実施形態において、本明細書中に提供される調節物質は、２本の鎖のうちの１本だけが非天然核酸塩基を含む二本鎖オリゴヌクレオチド配列に関する。ある特定の実施形態において、本明細書中で使用される調節物質は、両方の鎖が独立して少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む二本鎖オリゴヌクレオチド配列に関する。
ある特定の場合において、ヌクレオシド中に天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖で置き換えられる。ある特定の態様において、そのヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。好ましい実施形態において、ヘキソースは、Ｄ−ヘキソースである。ある特定の場合において、ヌクレオシド中に天然に存在するリボース糖部分は、多環式のヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、多環式のヘテロアルキル基は、その環に１つの酸素原子を含む二環式の環である。ある特定の場合において、多環式のヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの骨格は、そのオリゴヌクレオチド化合物の治療的特性または診断的特性を改善するように改変されている。ある特定の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドの塩基の少なくとも１つまたは糖の少なくとも１つが、そのオリゴヌクレオチド化合物の治療的特性または診断的特性を改善するように改変されている。オリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、その２本の鎖は、相補的であるか、部分的に相補的であるか、またはキメラオリゴヌクレオチドである。
本発明の方法において使用するために想定されている改変されたＲＮＡｉ物質の例としては、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書中で定義されるように、改変された骨格またはヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保持するオリゴヌクレオチドおよび骨格中にリン原子を有しないオリゴヌクレオチドが含まれる。糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）骨格中にリン原子を有しない改変されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオチドであると考えられ得る。特定のオリゴヌクレオチド化学的改変が下に記載される。所与の化合物中のすべての位置が均一に改変される必要はなく、実際に、下記の改変の２つ以上が、単一のオリゴヌクレオチド化合物中に、またはその単一のヌクレオチド中にさえ、組み込まれ得る。
改変されたヌクレオシド間結合または改変された骨格の例としては、例えば、通常の３’−５’結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルのホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｌｙｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）およびボラノホスフェート、これらの２’−５’連結型のアナログ、ならびに逆の極性を有するもの（隣接するヌクレオシド単位の対が、３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’とで連結している）が挙げられる。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態もまた含まれる。
上記のリン原子含有結合の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，６２５，０５０号および同第５，６９７，２４８号（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
改変されたヌクレオシド間結合、またはその中にリン原子を含まない骨格（すなわち、オリゴヌクレオチド）の例は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、ヘテロ原子糖間結合とアルキルまたはシクロアルキル糖間結合とが混合されたもの、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子糖間結合もしくは複素環式糖間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の構成部分が混合されたものを有するその他のものが含まれる。
上記のオリゴヌクレオチドの調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号および同第５，６７７，４３９号（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
オリゴヌクレオチド模倣物の他の例において、ヌクレオシド単位の糖とヌクレオシド間結合（すなわち骨格）の両方が、新規の基で置き換えられ得る。その核酸塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴヌクレオチドの１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。その核酸塩基は、その骨格のアミド部分の原子に直接または間接的に保持され、結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号および同第５，７１９，２６２号（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物に関するさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７に見られ得る。
本発明はさらに、リボザイムを利用するオリゴヌクレオチドを包含する。高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を触媒する合成ＲＮＡ分子およびその誘導体は、リボザイムとして公知である（一般に、Ｈａｓｅｌｏｆｆらに対する米国特許第５，５４３，５０８号およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄらに対する米国特許第５，５４５，７２９号を参照のこと）。その切断反応は、ＲＮＡ分子自体によって触媒される。天然に存在するＲＮＡ分子において、自己触媒される切断の部位は、ＲＮＡ二次構造の高度に保存された領域内に位置している（Ｂｕｚａｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：８８５９−６２，１９８６；Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ．５０：９−１６，１９８７）。天然に存在する自己触媒ＲＮＡ分子は、高い特異性の程度で特定の細胞のＲＮＡ分子または特定の病原体のＲＮＡ分子を標的にし得るリボザイムを生成するように改変されてきた。したがって、リボザイムは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ通常の目的（すなわち、特異的な遺伝子の発現の調節）に適合し、そしてオリゴヌクレオチドと同様に、一本鎖の部分をかなり有する核酸である。
ある特定の場合において、本明細書中に提供される方法とともに使用するためのＲＮＡｉ物質は、非リガンド基によって改変され得る。オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞標的化または細胞取り込みを増大させるために、いくつかの非リガンド分子が、オリゴヌクレオチドに結合体化されており、そのような結合体化を行うための手順は、科学文献において入手可能である。そのような非リガンド部分は、脂質部分、例えば、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−５６，１９８９）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０５３，１９９４）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６，１９９２；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５，１９９３）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３，１９９２）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯＪ．１０：１１１，１９９１；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５９：３２７，１９９０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．７５：４９，１９９３）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，３６：３６５１，１９９５；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３７７７，１９９０）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．１４：９６９，１９９５）またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：３６５１，１９９５）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２６４：２２９，１９９５）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７７：９２３，１９９６））を含んでいる。そのようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示している代表的な米国特許は、上に列挙されている。代表的な結合体化プロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を含む。次いで、そのアミノ基は、適切なカップリング試薬または活性化試薬を用いて、結合体化される分子と反応される。その結合体化反応は、オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合したままで、または溶液相においてオリゴヌクレオチドを切断した後に、行われ得る。代表的には、ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチド結合体の精製によって、純粋な結合体がもたらされる。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドなどの調節物質の追加の例は、米国出願公開番号２００７／０２７５４６５、２００７／００５４２７９、２００６／０２８７２６０、２００６／００３５２５４、２００６／０００８８２２（これらは参考として援用される）に見られ得る。
インフルエンザウイルスの複製の阻害
上で詳述されたアンチセンス化合物は、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の一本鎖マイナスセンス分節型ＲＮＡウイルスの複製を阻害する際に有用である。１つの実施形態において、そのような阻害は、これらのウイルスによる宿主動物の感染を処置する際に有効である。したがって、本方法は、１つの実施形態において、特定のウイルスの複製を阻害するのに有効なアンチセンス物質と、そのウイルスに感染した細胞とを接触させる工程を包含する。この実施形態において、そのアンチセンス物質は、適当な薬学的キャリア中において、所与のウイルスに感染した哺乳動物被験体、例えば、ヒトまたは飼育されている動物に投与される。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主内でＲＮＡウイルスの増殖を停止すると企図される。宿主の正常な成長または発生に対して有害な影響がほとんどまたはまったくなく、そのＲＮＡウイルスは、数が減少し得るか、または排除され得る。
実施例に記載されるような本発明では、インフルエンザＡウイルスのＭ１／Ｍ２遺伝子セグメント（すなわち、セグメント７）にハイブリダイズするように設計されたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を、そのインフルエンザウイルス産生を阻害する能力について２つの動物モデルにおいて評価した。それらのＰＭＯは、細胞内への侵入を促進する短いアルギニンリッチペプチドに結合体化されたか、またはカチオン性結合を含むＰＭＯｐｌｕｓ（商標）化合物として生成された。それらの化合物は、Ｍ１マトリックスタンパク質（Ｍ１）およびイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）（この両方が、Ｍ１／Ｍ２ ｍＲＮＡの選択的スプライシング型を用いて同じＡＵＧ開始コドンから発現される）のＡＵＧ翻訳開始部位を標的にした。
本発明のＭ１／Ｍ２−ＡＵＧを標的にしているアンチセンス化合物は、実施例１に記載されるようなＨ３Ｎ２のマウスモデルにおいてウイルス力価を阻害した。本発明のＭ１／Ｍ２−ＡＵＧを標的にしている化合物は、実施例２に記載されるような２００９Ｈ１Ｎ１（Ｓ−ＯＩＶ）汎発性ブタインフルエンザのフェレットモデルにおいて、インフルエンザ感染の臨床的徴候の減少および鼻洗浄液（ｎａｓａｌ ｗａｓｈｅｓ）中のウイルス力価の減少も示した。したがって、本明細書中で例証されるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉ物質は、ウイルス感染、主に、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の一本鎖マイナスセンス分節型ＲＮＡウイルスに起因し得る感染の処置において使用され得る。
本発明の実施形態は、併用療法および関連の組成物も含む。例えば、本明細書中に提供される抗ウイルス性（すなわち、ウイルスを標的にしている）アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉ物質は、宿主分子を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ物質と組み合わせて使用され得る。この点について、宿主の免疫応答遺伝子および／またはそのレセプターのアンチセンスまたはＲＮＡｉ標的化は、免疫応答を改善するために使用され得、それにより、ウイルスの感染か細菌の感染（例えば、二次的細菌感染）かに関係なく、その後の感染を予防し得るかまたは減少させ得る。１つの例として、ＣＤ２００／Ｒ−／−マウスは、インフルエンザ感染後に敗血症を発症しないことが示されている。ＣＤ２００は、通常は自然免疫反応のダウンレギュレートをもたらす自然免疫反応の負の制御因子である。ゆえに、ある特定の処置方法は、本明細書中に記載されるインフルエンザを標的にするアンチセンス物質のうちのいずれか１つ以上の投与と組み合わせた（同時にまたは別個に）、ＣＤ２００および／またはＣＤ２００レセプターをコードする宿主ＲＮＡ分子を標的にするアンチセンスおよび／またはＲＮＡｉ物質の投与（例えば、Ｈａｔｈｅｒｌｙら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１６８８−９４，２００４を参照のこと）を包含し得る。本明細書中に記載されるようなインフルエンザウイルスを標的にするアンチセンスまたはＲＮＡｉ物質と組み合わせた、ＣＤ２００および／またはＣＤ２００レセプターを標的にするアンチセンスまたはＲＮＡｉ物質（例えば、そのＡＵＧ開始コドンまたはスプライス部位を標的にするもの）を含む組成物もまた含まれる。これらの方法および組成物は、独立したインフルエンザウイルス感染、および／またはインフルエンザウイルス感染に付随する二次的細菌感染（例えば、連鎖球菌性肺炎）を処置するために使用され得る。
本発明の実施形態は、二次的細菌感染に伴うウイルス感染（例えば、インフルエンザ感染）を処置するための併用療法も含む。１９１８〜１９１９年のインフルエンザ大流行における死亡の大部分は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの通常の上気道細菌によって引き起こされる続発性細菌性肺炎に起因したとみられ、２００９年のＨ１Ｎ１大流行からの最近の証拠は、二次的細菌感染が未だに重要な死因であることを示唆している（例えば、Ｌｏｕｉｅら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅ．５０：ｅ５９−６２，２０１０；Ｊａｉｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６１：１９３５−４４，２００９；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．７：１０３−１４，２０１０を参照のこと）。連鎖球菌性肺炎に対する患者管理標準は、抗生物質を含む。第１の抗生物質としては、ペニシリンおよびアモキシシリンなどの殺菌性のベータ−ラクタム剤が挙げられ、第２選択薬としては、セファロスポリンが挙げられ、第３選択薬としては、クロラムフェニコールまたはクリンダマイシンが挙げられる。したがって、本発明の実施形態は、本明細書中に提供されるインフルエンザを標的にしている１つ以上のアンチセンスまたはＲＮＡｉ物質と組み合わせた、主に、インフルエンザウイルス感染に付随する二次的細菌感染を処置するためまたは管理する１つ以上の静菌性（ｂａｃｔｅｒｉｓｔａｔｉｃ）または殺菌性の抗生物質（例えば、ペニシリン、アモキシシリン、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン）の投与（同時にまたは別個に）に関する方法および組成物を含む。
別の例として、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉ物質は、インフルエンザウイルスを標的にする他の治療（例えば、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））と組み合わせて（同時にまたは別個に）投与され得る。ある特定の態様において、１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＶＩ−７１００）とオセルタミビルとの併用は、オセルタミビル単独または抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチド単独の使用と比べて、インフルエンザウイルス力価および／またはインフルエンザウイルス感染の他の症状（例えば、肺胞炎、浸潤性免疫細胞）の減少において相乗効果をもたらし得る。本明細書中に記載されるようなインフルエンザウイルスを標的にする抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ物質と組み合わせてオセルタミビルを含む組成物もまた含まれる。特定の実施形態において、これらの組成物および方法は、別途オセルタミビル耐性のインフルエンザウイルス感染の処置において使用され得る。
感染性物質の同定
感染を引き起こしている特定のウイルスは、当該分野で公知の方法、例えば、血清学的方法または培養法によって決定され得る。
血清学的な同定では、被験体の生物学的検体、例えば、唾液、便、尿、脳脊髄液、血液などから単離されたウイルスサンプルまたはウイルス培養物を使用する。ウイルスを検出するためのイムノアッセイは、一般に、当業者が日常的に使用する方法、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって行われる。さらに、特定のウイルス株またはウイルス種に特異的なモノクローナル抗体が、商業的に入手可能であることが多い。
培養法は、様々な培養条件下での増殖速度および形態などの特徴の比較を含むがこれに限定されない手法を使用することによって、特定のタイプのウイルスを単離するためおよび同定するために使用され得る。
感染した被験体内のウイルス感染性物質を同定するための別の方法は、生物学的検体からＲＮＡを単離した後に、疑わしいウイルス物質、例えば、季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザ、汎発性Ｈ１Ｎ１ Ｓ−ＯＩＶ、Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザまたはＨ３Ｎ２ブタインフルエンザを標的にする特異的ＰＣＲプライマーを用いた核酸増幅を使用する。
製剤化および投与
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるようなアンチセンスオリゴマーの治療上の送達に適した製剤または組成物を提供する。ゆえに、ある特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の薬学的に許容され得るキャリア（添加剤）および／または希釈剤とともに製剤化される、本明細書中に記載される治療有効量のオリゴマーの１つ以上を含む薬学的に許容され得る組成物を提供する。本発明のオリゴマーは、単独で投与されることが可能であるが、薬学的製剤（組成物）としてその化合物を投与することが好ましい。
核酸分子を送達するための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒら、１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２：１３９；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５に記載されている。これらおよび他のプロトコルが、本発明の単離されたオリゴマーを含む実質的に任意の核酸分子の送達のために利用され得る。
下で詳述されるように、本発明の薬学的組成物は、以下に適合された形態を含む固体または液体の形態で投与するために特別に製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下および全身での吸収を目標にしている錠剤、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト；（２）非経口投与、例えば、滅菌された溶液もしくは懸濁液または徐放製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏または制御放出パッチもしくはスプレーとしての、局所的適用；（４）例えば、ペッサリー、クリームまたは泡沫としての、膣内または直腸内；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮；または（８）経鼻。
句「薬学的に許容され得る」は、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比に比例した他の問題もしくは合併症なしに、まっとうな医学的判断の範囲内でヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した、化合物、材料、組成物および／または剤形のことを指すために本明細書中で使用される。
本明細書中で使用されるとき、句「薬学的に許容され得るキャリア」は、薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル（例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｉｄ）（例えば、滑沢剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛またはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、または１つの器官もしくは身体の一部から別の器官もしくは身体の別の部分への主題の化合物の輸送もしくは運搬に関わる溶媒被包材料のことを意味する。各キャリアは、その製剤の他の成分と適合性であり、かつ患者にとって有害でないという意味において、「許容され得」なければならない。
薬学的に許容され得るキャリアとして働き得る材料のいくつかの例としては：（１）糖（例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース）；（２）デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン）；（３）セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤（例えば、カカオバターおよび坐剤用ろう）；（９）油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油）；（１０）グリコール（例えば、プロピレングリコール）；（１１）ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；（１２）エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）；（１３）寒天；（１４）緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；ならびに（２２）薬学的製剤において使用される他の無毒性の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアンチセンスオリゴマーを用いた製剤化に適した薬剤の追加の非限定的な例としては：ＰＥＧ結合体化核酸、リン脂質結合体化核酸、親油性部分を含む核酸、ホスホロチオエート、様々な組織内への薬物の侵入を増大させ得るＰ−糖タンパク質インヒビター（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５）；生分解性ポリマー、例えば、埋め込み後の徐放送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．８：４７−５８，１９９９）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；および充填されたナノ粒子、例えば、血液脳関門を越えて薬物を送達し得、かつニューロンの取り込み機構を変化させ得る、ポリブチルシアノアクリレートから生成されたナノ粒子（Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）が挙げられる。
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む、表面が改変されたリポソーム（分枝状および非分枝状もしくはそれらの組み合わせのＰＥＧで改変された、または長期循環の（ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）リポソームもしくはステルスリポソーム）を含む組成物の使用も特徴とする。本発明のオリゴマーは、共有結合的に付着された様々な分子量のＰＥＧ分子も含み得る。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させるための方法を提供する。このクラスの薬物キャリアは、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン化および排除に抵抗し、それにより、被包された薬物の血液循環時間をより長くし、また、その薬物の組織曝露を増大させる（Ｌａｓｉｃら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは、おそらく血管新生した標的組織における血管外遊出および捕捉によって、腫瘍内に選択的に蓄積すると示されている（Ｌａｓｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６７：１２７５−１２７６，１９９５；Ｏｋｕら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２３８：８６−９０，１９９５）。その長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳの組織内に蓄積すると知られている従来のカチオン性リポソームと比べて、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増大させる（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２：２４８６４−２４８７０，１９９５；Ｃｈｏｉら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９２）。長期循環リポソームは、肝臓および脾臓などの代謝的に活動的なＭＰＳ組織における蓄積を回避する能力に基づいて、カチオン性リポソームと比べて大幅にヌクレアーゼ分解から薬物を保護する可能性もある。
さらなる実施形態において、本発明は、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，１６３，６９５号および同第７，０７０，８０７号に記載されているような送達のために調製されるオリゴマー組成物を含む。この点について、１つの実施形態において、本発明は、米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号および同第６，６９２，９１１号に記載されているようなリジンおよびヒスチジンの共重合体（ＨＫ）を、単独で、またはＰＥＧ（例えば、分枝状もしくは非分枝状のＰＥＧまたはその両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧおよび標的化部分と組み合わせて、もしくは架橋剤と組み合わせた前述のいずれかで含む組成物中の本発明のオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、グルコン酸で改変されたポリヒスチジンまたはグルコニル化された（ｇｌｕｃｏｎｙｌａｔｅｄ）ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリジンを含む組成物として、アンチセンスオリゴマーを提供する。当業者は、ＨｉｓおよびＬｙｓに類似の特性を有するアミノ酸が、その組成物中において置換され得ることも認識するだろう。
本明細書中に記載されるオリゴマーのある特定の実施形態は、塩基性の官能基（例えば、アミノまたはアルキルアミノ）を含み得るので、薬学的に許容され得る酸と薬学的に許容され得る塩を形成することができる。この点において、用語「薬学的に許容され得る塩」は、本発明の化合物の比較的無毒性の無機酸付加塩および有機酸付加塩のことを指す。これらの塩は、投与ビヒクルもしくは剤形の製造プロセスにおいてインサイチュで調製され得るか、または遊離塩基の形態での本発明の精製された化合物を適当な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、そしてそのように形成された塩をその後の精製中に単離することによって調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９，１９７７を参照のこと）。
主題オリゴマーの薬学的に許容され得る塩には、それらの化合物の従来の無毒性の塩または第四アンモニウム塩、例えば、無毒性の有機酸または無機酸からの塩が含まれる。例えば、そのような従来の無毒性の塩としては、無機酸（例えば、塩酸塩、臭化水素酸、硫酸酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）から得られる塩；および有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸塩、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸酸、イセチオン（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）酸など）から調製される塩が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本発明のオリゴマーは、１つ以上の酸性官能基を含み得るので、薬学的に許容され得る塩基と薬学的に許容され得る塩を形成することができる。これらの場合における用語「薬学的に許容され得る塩」とは、本発明の化合物の比較的無毒性の無機塩基付加塩および有機塩基付加塩のことを指す。これらの塩は、同様に、投与ビヒクルもしくは剤形の製造プロセスにおいてインサイチュで調製され得るか、または遊離酸の形態での精製された化合物を適当な塩基と別々に反応させることによって、調製され得る（例えば、薬学的に許容され得る金属カチオンと、アンモニアまたは薬学的に許容され得る有機第一級アミン、有機第二級アミンもしくは有機第三級アミンとの、水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩）。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられ得る（例えば、Ｂｅｒｇｅら、前出を参照のこと）。
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、保存剤および酸化防止剤もまた、本組成物中に存在し得る。
薬学的に許容され得る酸化防止剤の例としては：（１）水溶性酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）；（２）油溶性酸化防止剤（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど）；および（３）金属キレート剤（例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など）が挙げられる。
本発明の製剤は、経口、経鼻、局所的（頬側および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適した製剤を含む。それらの製剤は、単位剤形で都合よく提供され得、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。１つの剤形を生成するためにキャリア材料と組み合され得る活性成分の量は、処置される宿主、特定の投与様式に応じて変動し得る。１つの剤形を生成するためにキャリア材料と組み合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量であり得る。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲であり得る。
ある特定の実施形態において、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸および高分子キャリア、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物から選択される賦形剤；ならびに本発明のオリゴマーを含む。ある特定の実施形態において、上述の製剤は、本発明のオリゴマーを経口的に生体利用可能にする。
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明のオリゴマーを、キャリアおよび必要に応じて１つ以上の副成分と会合させる工程を包含する。通常、それらの製剤は、本発明の化合物を液体キャリアもしくは微粉化された固体キャリアまたはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要であれば、その生成物を成形することによって、調製される。
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味がつけられた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガントを用いる）、散剤、顆粒剤の形態、あるいは水性液体中もしくは非水液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または香錠（不活性な基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）を用いる）として、および／または口腔洗浄薬などとしてであり得、各々は、所定量の本発明の化合物を活性成分として含む。本発明のオリゴマーは、ボーラス、舐剤またはペーストとしても投与され得る。
経口投与用の本発明の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤、トローチ（ｔｒｏｕｃｈｅｓ）など）において、活性成分は、１つ以上の薬学的に許容され得るキャリア（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸カルシウム）および／または以下のうちのいずれかと混合され得る：（１）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸）；（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア）；（３）吸湿剤（例えば、グリセロール）；（４）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム）；（５）溶解遅延剤（例えば、パラフィン）；（６）吸収促進物質（例えば、四級アンモニウム化合物および界面活性剤、例えば、ポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウム）；（７）湿潤剤（例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールおよび非イオン性界面活性剤）；（８）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）；（９）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、およびそれらの混合物）；（１０）着色剤；および（１１）放出制御剤（例えば、クロスポビドンまたはエチルセルロース）。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、薬学的組成物は、緩衝剤も含み得る。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などのような賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、軟殻および硬殻ゼラチンカプセル内の充填剤としても使用され得る。
錠剤は、必要に応じて１つ以上の副成分とともに、圧縮または成型によって生成され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を用いて調製され得る。成型錠剤は、適当な機械において、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末の化合物の混合物を成型することによって生成され得る。
本発明の薬学的組成物の錠剤および他の固体剤形（例えば、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤）は、必要に応じて、溝がつけられ得るか、またはコーティングおよび殻（例えば、腸溶コーティングおよび薬学的製剤化分野において周知の他のコーティング）を用いて調製され得る。それらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供する様々な比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、その中の活性成分の緩徐な放出または制御された放出を提供するようにも製剤化され得る。それらは、迅速な放出のために製剤化され得、例えば、フリーズドライにされ得る。それらは、例えば、細菌保持フィルター（ｂａｃｔｅｒｉａ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）による濾過によって、または滅菌水に溶解され得る滅菌された固体組成物の形態の滅菌剤、もしくは他のいくつかの滅菌された注射可能な媒質を、使用の直前に組み込むことによって、滅菌され得る。これらの組成物は、必要に応じて不透明化剤も含み得、また、それらの組成物が、消化管のある特定の部分だけでまたは優先的にその部分において活性成分を必要に応じて遅延様式で放出する組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、重合体の物質およびろうが挙げられる。その活性成分は、適切な場合、上に記載した賦形剤の１つ以上を用いた、マイクロカプセル化された形態でもあり得る。
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容され得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。その液体剤形は、活性成分に加えて、当該分野において通常使用される不活性な希釈剤（例えば、水または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含み得る。
不活性な希釈剤のほかにも、経口組成物は、佐剤（例えば、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存剤）も含み得る。
懸濁液は、活性な化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにそれらの混合物を含み得る。
直腸または膣への投与用の製剤は、１つ以上の適当な非刺激性の賦形剤またはキャリア（例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤用のろうまたはサリチレートを含み、室温では固体であるが体温では液体であるがゆえに、直腸腔または膣腔において融解して、活性な化合物を放出する）と本発明の１つ以上の化合物を混合することによって調製され得る坐剤として提供され得る。
本明細書中に提供されるようなオリゴマーの局所的投与用または経皮的投与用の製剤または剤形としては、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が挙げられる。活性なオリゴマーは、薬学的に許容され得るキャリア、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤または噴霧剤と滅菌条件下で混合され得る。その軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性な化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物性脂肪および植物性脂肪、油、ろう、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクならびに酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含み得る。
散剤およびスプレー剤は、本発明のオリゴマーに加えて、賦形剤（例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物）を含み得る。スプレー剤は、クロロフルオロハイドロカーボンなどの通例の噴霧剤、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素をさらに含み得る。
経皮パッチは、本発明のオリゴマーの身体への制御された送達を提供するという追加の利点を有する。そのような剤形は、そのオリゴマーを適切な媒質に溶解するかまたは分散させることによって、作製され得る。皮膚を越えた薬剤の流入を増加させるために、吸収促進剤も使用され得る。そのような流入の速度は、当該分野で公知の他の方法の中でも、律速膜を提供すること、またはその薬剤をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散させることによって、制御され得る。
非経口投与に適した薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容され得る滅菌された等張性の水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、あるいは滅菌された注射可能な溶液または分散液に使用の直前に再構成され得る滅菌された粉末（それらは、糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、意図されるレシピエントの血液と製剤とを等張性にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る）と組み合わせて本発明の１つ以上のオリゴマーを含み得る。本発明の薬学的組成物において使用され得る適当な水性および非水性のキャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用すること、分散液の場合は、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することによって、維持され得る。
これらの組成物は、佐剤（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤）も含み得る。主題のオリゴマーに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって、確実にされ得る。その組成物に等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を含めることによって生じ得る。
場合によっては、薬物の作用を延長するために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、当該分野で公知の他の方法の中でも、不良な水溶性を有する結晶性またはアモルファスの材料の液体懸濁液を使用することによって達成され得る。そして、その薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、そしてその溶解速度は、結晶サイズおよび結晶の形状に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される薬物の形態の吸収の遅延は、その薬物を油性ビヒクルに溶解するかまたは懸濁することによって、達成される。
注射可能なデポー型は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーにおいて主題のオリゴマーのマイクロカプセル（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ）マトリックスを形成することによって作製され得る。オリゴマーとポリマーとの比および使用される特定のポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射可能製剤は、体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルジョン内に薬物を封入することによっても調製され得る。
本発明のオリゴマーが、ヒトおよび動物に医薬として投与されるとき、それらは、それ自体で投与され得るか、または例えば、薬学的に許容され得るキャリアと組み合わせて０．１〜９９％（より好ましくは、１０〜３０％）の活性成分を含む薬学的組成物として投与され得る。
上で述べたように、本発明の製剤または調製物は、経口的、非経口的、局所的、または直腸に投与され得る。それらは、代表的には、各投与経路に適した形態で投与される。例えば、それらは、錠剤またはカプセル剤の形態で、注射、吸入、眼用のローション、軟膏、坐剤などによって、注射、注入または吸入による投与；ローションまたは軟膏による局所的な投与；および坐剤による直腸への投与によって投与される。
本明細書中で使用されるとき、句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、経腸および局所的投与以外の、通常、注射による投与様式のことを意味し、そのような投与としては、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒｅ）、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中で使用されるとき、句「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」は、化合物、薬物または他の材料が患者の系に入り、ひいては代謝および他の同様のプロセスに供されるような、中枢神経系への直接的な投与以外の投与、例えば、皮下投与のことを意味する。
選択される投与経路に関係なく、適当な水和型で使用され得るおよび／または本発明の薬学的組成物において使用され得る本発明のオリゴマーは、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容され得る剤形に製剤化され得る。本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって容認しにくいほど有毒でなく、特定の患者、組成物および投与様式に対して所望の治療的な応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変更され得る。
選択される投薬量レベルは、使用される本発明の特定のオリゴマーまたはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定のオリゴマーの排出または代謝の速度、吸収の速度および程度、処置の持続時間、使用される特定のオリゴマーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子をはじめとした種々の因子に依存し得る。
当該分野における通常の技量を有する医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定することができるし、処方することができる。例えば、その医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために、薬学的組成物において使用される本発明の化合物の用量を、必要とされるレベルよりも低いレベルで開始し得、そして所望の効果が達成されるまでその投薬量を徐々に増加させ得る。通常、本発明の化合物の適当な１日量は、治療効果をもたらすのに有効な最低の用量である化合物の量であり得る。そのような有効量は、一般に、上に記載された因子に依存し得る。一般に、示される効果のために使用されるとき、患者に対する本発明の化合物の経口、静脈内、脳室内および皮下における用量は、１日あたり体重１キログラムあたり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲であり得る。
所望であれば、活性な化合物の有効な１日量は、必要に応じて単位剤形で、その日中に適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）で投与されてもよい。ある特定の状況において、投薬は、１日あたり１回の投与である。ある特定の実施形態において、投薬は、インフルエンザウイルスの複製を減少させるために、必要に応じ、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日ごとまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週ごと、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月ごとに１回以上の投与である。
核酸分子は、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、その方法としては、リポソーム内へのカプセル化、イオン導入、または他のビヒクル（例えば、本明細書中に記載されるような、および当該分野で公知の、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフェア）内への組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、親油性（水不溶性）医薬品のバイオアベイラビリティを改善するためにマイクロ乳化技術が利用され得る。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７：１６８５−１７１３，１９９１）およびＲＥＶ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ，ら、Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８０：７１２−７１４，１９９１）が挙げられる。他の利点の中でも、マイクロ乳化は、循環器系ではなくリンパ系への吸収を優先的に指示すること（それにより、肝臓を迂回し、肝胆循環における化合物の破壊を防ぐ）によってバイオアベイラビリティを増大させる。
本発明の１つの態様において、製剤は、本明細書中に提供されるようなオリゴマーおよび少なくとも１つの両親媒性キャリアから形成されるミセルを含み、ここで、そのミセルは、約１００ｎｍ未満の平均直径を有する。より好ましい実施形態は、約５０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供し、なおもより好ましい実施形態は、約３０ｎｍ未満、またはさらには約２０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルを提供する。
適当な両親媒性キャリアのすべてが企図されるが、現在好ましいキャリアは、一般に、Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ−Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ−ａｓ−Ｓａｆｅ（ＧＲＡＳ）のステータスを有し、本発明の化合物を可溶化することができ、かつそれを、その溶液が複雑な水相（例えば、ヒト胃腸管において見られるもの）と接触した状態になった後期においてマイクロ乳化する（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｆｙ）ことができる、キャリアである。通常、これらの要件を満たす両親媒性の成分は、２〜２０というＨＬＢ（親水性と親油性とのバランス）値を有し、それらの構造は、Ｃ−６〜Ｃ−２０の範囲内の直鎖脂肪族ラジカルを含む。例は、ポリエチレングリコール化された（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）脂肪グリセリドおよびポリエチレングリコールである。
両親媒性キャリアの例としては、飽和および一不飽和のポリエチレングリコール化された（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｙｚｅｄ）脂肪酸グリセリド（例えば、完全にまたは部分的に水素化された様々な植物油から得られるもの）が挙げられる。そのような油は、好都合にも、脂肪酸トリグリセリド、脂肪酸ジグリセリドおよび脂肪酸モノグリセリド、ならびに対応する脂肪酸のジ−およびモノ−ポリエチレングリコールエステルからなり得、特に好ましい脂肪酸組成物は、カプリン酸４〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、パルミチン酸４〜１４％およびステアリン酸５〜１５％を含む。両親媒性キャリアの別の有用なクラスとしては、部分的にエステル化されたソルビタンおよび／またはソルビトールが挙げられ、飽和脂肪酸もしくは一不飽和脂肪酸（ＳＰＡＮシリーズ）または対応するエトキシ化アナログ（ＴＷＥＥＮシリーズ）が挙げられる。
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、ＬａｂｒａｓｏｌまたはＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（すべてがＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｉｎｔ Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅによって製造され、流通されている）、ＰＥＧ−モノ−オレエート、ＰＥＧ−ジ−オレエート、ＰＥＧ−モノ−ラウレートおよびジ−ラウレート、Ｌｅｃｉｔｈｉｎ、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０など（米国および世界中のいくつかの会社によって生産され、流通されている）をはじめとした、商業的に入手可能な両親媒性のキャリアが特に有用であり得る。
ある特定の実施形態において、送達は、本発明の組成物を適当な宿主細胞に導入するためのリポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどの使用によって行われ得る。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、ナノ粒子などに被包された送達のために製剤化され得る。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、公知および従来の手法を用いて行われ得る。
本発明における使用に適した親水性ポリマーは、直ちに水溶性であり、ベシクル形成脂質に共有結合的に付着され得、かつ、有毒作用なくインビボにおいて許容される（すなわち、生体適合性である）、ポリマーである。適当なポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、およびポリビニルアルコールが挙げられる。ある特定の実施形態において、ポリマーは、約１００もしくは１２０ダルトンから約５，０００もしくは１０，０００ダルトンまでの分子量、または約３００ダルトン〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。他の実施形態において、ポリマーは、約１００〜約５，０００ダルトンの分子量、または約３００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。ある特定の実施形態において、ポリマーは、７５０ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ（７５０））である。ポリマーは、その中のモノマーの数によっても定義され得る；本発明の好ましい実施形態は、３つのモノマーからなるＰＥＧポリマー（約１５０ダルトン）のような少なくとも約３つのモノマーのポリマーを使用する。
本発明における使用に適し得る他の親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドおよび誘導体化セルロース（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本発明の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびその共重合体、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸とグリコール酸とのポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸（ｂｕｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそれらの混和物、混合物または共重合体からなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。
シクロデキストリンは、ギリシャ文字α、βまたはγによって指し示されるそれぞれ６、７または８つのグルコース単位からなる環状オリゴ糖である。それらのグルコース単位は、α−１，４グルコシド結合によって連結される。糖単位の椅子形配座の結果として、すべての二級ヒドロキシル基（Ｃ−２、Ｃ−３におけるもの）が、その環の片側に位置し、Ｃ−６におけるすべての一級ヒドロキシル基が、他方の側に位置する。結果として、外面は親水性であり、それにより、シクロデキストリンは水溶性である。対照的に、シクロデキストリンのくぼみは、原子Ｃ−３およびＣ−５の水素によって、ならびにエーテル様酸素によって裏打ちされているので、疎水性である。これらのマトリックスは、種々の比較的疎水性の化合物（例えば、１７α−エストラジオールなどのステロイド化合物を含む）との錯体形成を可能にする。その錯体形成は、ファンデルワールス相互作用および水素結合の形成によって起こる。シクロデキストリンの化学に関する一般的な概説については、Ｗｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ，３３：８０３−８２２，１９９４を参照のこと。
シクロデキストリン誘導体の物理化学的特性は、置換の種類および程度に強く依存する。例えば、それらの水溶解性は、不溶性（例えば、トリアセチル−ベータ−シクロデキストリン）から１４７％溶解性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−ベータ−シクロデキストリン）までに及ぶ。さらに、それらは、多くの有機溶媒にも可溶性である。これらのシクロデキストリンの特性のおかげで、様々な製剤の構成要素の溶解性を増加させるかまたは減少させることによって、それらの溶解性の制御が可能になる。
数多くのシクロデキストリン、およびそれらを調製するための方法が、記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ら（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａら（米国特許第３，４５９，７３１号）は、電気的中性のシクロデキストリンを記載した。他の誘導体としては、カチオン特性を有するシクロデキストリン（Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ）、米国特許第３，４５３，２５７号）、不溶性の架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ、米国特許第３，４２０，７８８号）およびアニオン特性を有するシクロデキストリン（Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、米国特許第３，４２６，０１１号）が挙げられる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体に共通して、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸およびスルホン酸が、親シクロデキストリンに付加されている（Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ），前出を参照のこと）。さらに、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体が、Ｓｔｅｌｌａらによって記載されている（米国特許第５，１３４，１２７号）。
リポソームは、水性の内部コンパートメントを囲い込んでいる少なくとも１つの脂質二重層膜からなる。リポソームは、膜のタイプおよびサイズによって特徴付けられ得る。小型単層ベシクル（ＳＵＶ）は、単一の膜を有し、代表的には、直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり；大型単層ベシクル（ＬＵＶＳ）は、代表的には、０．０５μｍより大きい。オリゴラメラの大型ベシクルおよび多層ベシクルは、複数の、通常、同心円状の膜の層を有し、代表的には、０．１μｍより大きい。いくつかの非同心円状の膜を有するリポソーム、すなわち、より大きなベシクル内に含まれるいくつかのより小型のベシクルは、多胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ）ベシクルと呼ばれる。
本発明の１つの態様は、本発明のオリゴマーを含むリポソームを含む製剤に関し、ここで、そのリポソーム膜は、高い運搬能を有するリポソームを提供するように製剤化される。二者択一的または追加的に、本発明の化合物は、リポソームのリポソーム二重層内に含められ得るか、またはリポソーム二重層上に吸着され得る。本発明のオリゴマーは、脂質界面活性剤とともに凝集され得、リポソームの内部空間の中に保持され得る；これらの場合、リポソーム膜は、活性な薬剤−界面活性剤の凝集物の崩壊作用に抵抗するように製剤化される。
本発明の１つの実施形態においては、リポソームの脂質二重層は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質を含み、そのＰＥＧ鎖は、脂質二重層の内側の表面から、リポソームによって被包されている内側の空間内に伸び、かつ、脂質二重層の外面から周辺の環境に向かって伸びている。
本発明のリポソーム内に含められる活性な薬剤は、可溶化型である。界面活性剤と活性な薬剤との凝集物（例えば、目的の活性な薬剤を含むエマルジョンまたはミセル）は、本発明におけるリポソームの内部空間内に封入され得る。界面活性剤は、その活性な薬剤を分散させるようにおよび可溶化するように作用し、任意の適当な脂肪族、脂環式または芳香族の界面活性剤（様々な長さの鎖の（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０の）生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）が挙げられるがこれに限定されない）から選択され得る。ＰＥＧ−脂質などのポリマーによって誘導体化された脂質は、ミセル／膜融合を阻害するように作用するので、および界面活性剤分子へのポリマーの付加が、界面活性剤のＣＭＣを減少させ、ミセル形成を助けるので、そのような脂質もまたミセル形成のために利用され得る。マイクロモル濃度の範囲内のＣＭＣを有する界面活性物質が好ましい；それより高いＣＭＣの界面活性剤も、本発明のリポソーム内に封入されるミセルを調製するために利用され得る。
本発明におけるリポソームは、当該分野で公知の種々の手法のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９６／１４０５７；Ｎｅｗ ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ ３３−１０４；Ｌａｓｉｃ ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照のこと。例えば、本発明のリポソームは、そのリポソーム中において望まれる誘導体化された脂質の最終モルパーセントに対応する濃度において、親水性ポリマーで誘導体化された脂質を予め成形されたリポソーム中に拡散することによって（例えば、予め成形されたリポソームを、脂質グラフトポリマーから構成されるミセルに曝露することによって）調製され得る。親水性ポリマーを含むリポソームは、当該分野で公知であるように、均質化、脂質フィールド水和（ｌｉｐｉｄ−ｆｉｅｌｄ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）または押出法によっても形成され得る。
別の例示的な製剤化手順において、活性な薬剤は、まず、リゾホスファチジルコリン中、または疎水性分子を容易に可溶化する他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）中における超音波処理によって分散される。次いで、得られた活性な薬剤のミセル懸濁液を用いることにより、適当なモルパーセントのポリマーグラフト脂質またはコレステロールを含む乾燥された脂質サンプルを再水和する。次いで、当該分野で公知であるような押出法を用いて、脂質および活性な薬剤の懸濁液をリポソーム中に形成し、得られたリポソームを、標準的なカラム分離によって、被包されていない溶液から分離する。
本発明の１つの態様において、選択されたサイズ範囲内の実質的に均一なサイズを有するリポソームが調製される。１つの有効なサイジング方法は、リポソームの水性懸濁液を、選択された均一のポアサイズを有する一連のポリカーボネート膜に通過させて押し出す工程を包含する；その膜のポアサイズは、その膜を通過する押し出しによって生成されたリポソームの最も大きいサイズにおおよそ対応し得る。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号を参照のこと。ある特定の実施形態において、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）などの試薬が、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を細胞内に導入するために利用され得る。
本発明の製剤の放出の特徴は、被包材料、被包される薬物の濃度、および放出改変物質（ｒｅｌｅａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）の存在に依存する。例えば、放出は、例えば、胃におけるような低ｐＨまたは腸におけるようなより高いｐＨのときだけ放出するｐＨ感受性コーティングを用いて、ｐＨ依存性であるように操作され得る。腸溶コーティングは、胃を通過した後まで放出が起きるのを妨げるために使用され得る。種々の材料に被包されたシアナミドの複数のコーティングまたは混合物が、胃における最初の放出、それに続く、腸における後の放出をもたらすために使用され得る。放出は、塩またはポア形成剤を含めること（これにより、水の取り込み、またはカプセルからの拡散による薬物の放出が増加され得る）によっても操作され得る。薬物の溶解性を改変する賦形剤は、放出速度を制御するためにも使用され得る。マトリックスの分解またはマトリックスからの放出を増大する薬剤もまた、組み込まれ得る。それらは、その化合物に応じて、薬物に付加され得るか、別個の相として（すなわち、微粒子として）加えられ得るか、またはポリマー相に同時に溶解され得る。ほとんどの場合、その量は、０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）であるべきである。分解促進物質のタイプとしては、無機塩（例えば、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウム）、有機酸（例えば、クエン酸、安息香酸およびアスコルビン酸）、無機塩基（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛および水酸化亜鉛）および有機塩基（例えば、硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミン）、ならびに界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））が挙げられる。マトリックスに微細構造を付加するポア形成剤（すなわち、無機塩および糖などの水溶性化合物）が、微粒子として加えられる。その範囲は、代表的には、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
取り込みは、腸内における粒子の滞留時間を変更することによっても操作され得る。これは、例えば、その粒子を粘膜接着性ポリマーでコーティングするか、または被包材料として粘膜接着性ポリマーを選択することによって、達成され得る。例としては、遊離カルボキシル基を有するほとんどのポリマー（例えば、キトサン、セルロース、および特にポリアクリレート）が挙げられる（本明細書中で使用されるとき、ポリアクリレートとは、アクリレート基および改変されたアクリレート基（例えば、シアノアクリレートおよびメタクリレート）を含むポリマーのことを指す）。
オリゴマーは、外科的もしくは医学的なデバイスもしくは埋没物の中に含められるように製剤化されるか、またはそれらによる放出に適応されるように製剤化され得る。ある特定の態様において、埋没物は、オリゴマーでコーティングされ得るか、またはオリゴマーで別途処理され得る。例えば、ヒドロゲルまたは他のポリマー（例えば、生体適合性および／または生分解性のポリマー）を用いて、埋没物が本発明の組成物でコーティングされ得る（すなわち、その組成物は、ヒドロゲルまたは他のポリマーを使用することによる、医学的デバイスを用いた使用に対して適合され得る）。医学的デバイスをある薬剤でコーティングするためのポリマーおよび共重合体は、当該分野で周知である。埋没物の例としては、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、プロステーシス、血管カテーテル、透析カテーテル、血管移植片、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植え込み型除細動器、ＩＶ針、骨の整復および形成のためのデバイス（例えば、釘、ねじ、プレートおよび他のデバイス）、ならびに創傷治癒のための人工組織マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に提供される方法に加えて、本発明に従って使用するためのオリゴマーは、他の医薬から類推して、ヒトまたは獣医学において使用するための任意の好都合な方法での投与用に製剤化され得る。それらのアンチセンスオリゴマーおよび対応する製剤は、単独で、またはインフルエンザウイルス感染の処置における他の治療ストラテジー（例えば、商品名ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標）として売買されているＯｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）と組み合わせて、投与され得る。
本発明においては、アンチセンスオリゴマーの送達経路としては、経口および非経口の経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内および筋肉内をはじめとした様々な全身性の経路、ならびに吸入、経皮的、肺および局所的の送達が挙げられるが、これらに限定されない。適切な経路は、処置中の被験体の状態にとって適切であるように当業者によって決定され得る。例えば、皮膚のウイルス感染の処置におけるアンチセンスオリゴマーの送達にとって適切な経路は、局所的送達であり、ウイルス呼吸器感染症（例えば、インフルエンザＡ）を処置するためのアンチセンスオリゴマーの送達は、吸入、鼻腔内または肺送達による送達である。オリゴマーはまた、ウイルス感染部位または血流に直接送達されてもよい。
アンチセンスオリゴマーは、生理的に許容され得る任意の好都合なビヒクルにおいて投与され得る。そのような組成物は、当業者によって使用される種々の標準的な薬学的に許容され得るキャリアのいずれかを含み得る。例としては、食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョンまたはトリグリセリドエマルジョン）、錠剤およびカプセルが挙げられるが、これらに限定されない。適当な生理的に許容され得るキャリアの選択は、選択される投与様式に依存して変動し得る。
場合によっては、上で述べたように、細胞内へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するためにリポソームが使用され得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１０（１２）：１９８０−１９８９，１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２３：１１９，１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ９０，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ５４４−５８４，１９９０；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｐ．２８７−３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７９を参照のこと）。ヒドロゲルは、例えば、ＷＯ９３／０１２８６またはＰＣＴ出願番号ＵＳ１９９２／００５３０５に記載されているように、アンチセンスオリゴマー投与に対するビヒクルとしても使用され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェアまたは微小粒子として投与され得る（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ａｎｄ Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７を参照のこと）。あるいは、米国特許第６，２４５，７４７号に記載されているように、アンチセンスオリゴマーと複合体化された、ガスで満たされた微小気泡の使用によって、標的組織への送達が増大し得る。
徐放組成物もまた使用され得る。これらは、成形された物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透性のポリマーマトリックスを含み得る。
本方法の１つの態様において、被験体は、ヒト被験体、例えば、局在性または全身性のウイルス感染を有すると診断された患者である。例えば、（１）免疫無防備状態の患者；（２）熱傷被害者の患者；（３）留置カテーテルを有する患者；または（４）外科術をまさに受けようとしている患者もしくは最近外科術を受けた患者の場合、患者の状態は、本発明のアンチセンスオリゴマーの予防的投与を要求することもある。１つの好ましい実施形態において、オリゴマーは、薬学的に許容され得るキャリア中に含められたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、経口的に送達される。別の好ましい実施形態において、オリゴマーは、薬学的に許容され得るキャリア中に含められたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーであり、静脈内（ｉ．ｖ．）送達される。
本アンチセンス化合物は、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーというピーク血中濃度もたらすのに有効な量および様式で投与され得る。代表的には、アンチセンスオリゴマーは、一般に、約１〜２週間にわたって、一定間隔で１回以上投与される。経口投与にとって好ましい用量は、約１〜１００ｍｇオリゴマー／７０ｋｇである。場合によっては、１００ｍｇオリゴマー／患者より多い用量が必要であり得る。ｉ．ｖ．投与の場合、好ましい用量は、約１ｍｇ〜５００ｍｇオリゴマー／７０ｋｇである。アンチセンスオリゴマーは、短い期間にわたって一定間隔で、例えば、２週間またはそれより短い期間にわたって毎日、投与され得る。しかしながら、場合によっては、オリゴマーは、それよりも長い期間にわたって断続的に投与される。投与は、抗生物質の投与または他の治療的な処置の前に、またはそれらと同時に、行われ得る。その処置レジメンは、処置中の被験体のイムノアッセイ、他の生化学的試験および生理学的検査の結果に基づいて、示されるように調整され得る（用量、頻度、経路など）。
処置のモニタリング
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる有効なインビボ処置レジメンは、投与の持続時間、用量、頻度および経路、ならびに処置中の被験体の状態（すなわち、局在性または全身性の感染に応答した投与に対する予防的投与）に応じて、変動し得る。したがって、そのようなインビボ治療は、処置中のウイルス感染の特定のタイプにとって適切な試験によってモニターすること、および最適な治療成績を達成するために用量または処置レジメンの調整を対応させることを必要とすることが多い。処置は、例えば、一般的な感染指標（例えば、全血球計算値（ＣＢＣ）、核酸検出法、免疫診断試験、ウイルス培養、またはヘテロ二重鎖の検出）によってモニターされ得る。
インビボで投与された本発明のアンチセンスオリゴマーの、１つ以上のタイプのＲＮＡウイルスの増殖の阻害または排除における有効性は、そのアンチセンスオリゴマーの投与前、投与中および投与後に被験体から採取された生物学的サンプル（組織、血液、尿など）から測定され得る。そのようなサンプルのアッセイとしては、（１）当業者に公知の手順（例えば、電気泳動的ゲル移動度アッセイ）を用いて、標的配列および非標的配列とのヘテロ二重鎖の形成の有無をモニターすること；（２）ＥＬＩＳＡもしくはウエスタンブロッティングなどの標準的な手法によって測定される、ウイルスタンパク質の産生量をモニターすること、または（３）例えばＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法によって、ウイルス力価に対する作用を測定することが挙げられる（例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．３９（５）：１１５７−１１６１，１９９５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．４０：２００４−２０１１，１９９６；Ｃｏｔｔｒａｌ，Ｇ．Ｅ．（ｅｄ）：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６０−９３，１９７８を参照のこと）。
参考文献
Figure 2013510584
Figure 2013510584
 本明細書中で引用される各個別の刊行物または特許出願が、参考として援用されると具体的かつ個別に示されたかのように、それらの刊行物および特許出願のすべてが、本明細書中で参考として援用される。
前述の本発明は、理解を明確にする目的での例証および例示を意図していくらか詳細に記載されてきたが、本発明の教示に鑑みて、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および改変がそれらに対して行われ得ることが当業者に直ちに明らかになるだろう。以下の実施例は、限定を意図せずに例証だけを意図して提供される。当業者は、本質的に類似の結果をもたらすために、変更され得るかまたは改変され得る種々の重大でないパラメータを直ちに認識するだろう。
Ａ．材料および方法
すべてのペプチドが、Ｇｌｏｂａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）またはＡＶＩ ＢｉｏＰｈａｒｍａ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯＲ）によってカスタム合成され、＞９０％の純度に精製された（下記の実施例２を参照のこと）。ＰＭＯは、例えば、（（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ １９９７）および米国特許第５，１８５，４４４号に記載され、さらにＰＣＴ出願番号ＵＳ０８／０１２８０４に記載されているような公知の方法に従って、ＡＶＩ ＢｉｏＰｈａｒｍａにおいて合成された。そのＰＭＯの例示的な構造は、図１Ａ〜Ｃに示されているとおりである。２’−ＯＭｅオリゴマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬが合成した。ＬＮＡオリゴマーは、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸが生成した。
記載されているように（米国特許第７，４６８，４１８号、ＰＣＴ出願番号ＵＳ０８／００８１６８および（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｏｄａら、２００７；Ａｂｅｓ，Ｍｏｕｌｔｏｎら、２００８））、細胞取り込みを増大するために、ＰＭＯオリゴマーのいくつかを３’末端においてアルギニンリッチペプチド（（ＲＡｈｘＲＲＢＲ）２ＡｈｘＢまたは（ＲＡｈｘＲ）４ＡｈｘＢ；それぞれ配列番号１２４および１１８）と結合体化することにより、ペプチド結合体化ＰＭＯ（ＰＰＭＯ）を形成した。
（１−ピペラジノ）ホスフィニリデンオキシ結合を含むモルホリノサブユニットを生成するために使用され得る合成経路は、ＰＣＴ出願番号ＵＳ０７／０１１４３５に記載されており、代表的な合成についてのさらなる実験上の詳細は下記に提供される。ピペラジンと塩化トリチルとの反応により、トリチルピペラジンが得られ、それをコハク酸塩として単離した。弱塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミンまたはＤＩＥＡ）の存在下におけるトリフルオロ酢酸エチルとの反応により、１−トリフルオロアセチル−４−トリチルピペラジンが提供され、それを直ちにＨＣｌと反応させることにより、その塩を良好な収量で得た。ジクロロホスホリル部分の導入を、トルエン中のオキシ塩化リンを用いて行った。
その酸塩化物を、米国特許第５，１８５，４４４号またはＳｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，１９９７（上で引用された）に記載され、さらにＰＣＴ出願番号ＵＳ０８／０１２８０４に記載されているように調製され得るモルホリノサブユニット（ｍｏＮ）と反応させることにより、活性化されたサブユニットが得られる。必要であれば、ヌクレオシド塩基に対して適当な保護基を使用する；例えば、アデニンおよびシトシンに対してはベンゾイル、グアニンに対してはフェニルアセチル、ならびにイノシンに対してはピバロイルメチル。（１−ピペラジノ）ホスフィニリデンオキシ結合を含むサブユニットが、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）に記載されているような既存のＰＭＯ合成プロトコルに、改変なしで組み込まれ得る。
実施例１
マウスモデル系におけるインフルエンザＡウイルスの阻害
インフルエンザＡウイルス感染のマウスモデルを用いて、その感染に関する代表的なアンチセンスオリゴマーのインビボでの有効性を測定した。インフルエンザＡ亜型Ｈ２Ｎ３（Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３）を用いて、５０マイクロリットル体積中約４×１０４プラーク形成単位の鼻腔内投与により、Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスに感染させた。この研究では、１群あたり１２匹のマウスを使用し、２日目にウイルス力価の測定のために６匹を取り出し、６日目にウイルス力価の測定のために６匹を取り出した。副次エンドポイントには、体重減少の防止および生存が含まれた。
表１および下記の表６に列挙されているような３つの試験アンチセンスオリゴマー化合物、ＰＢ１−ＡＵＧ＋１５、Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧおよびＮＰ−ｖ３’（配列番号１２、１３および３０〜３３）を、ペプチド結合体化（ＰＰＭＯ）および正電荷結合化学（ＰＭＯｐｌｕｓ（商標））の両方として評価した。ＰＭＯの３’末端に結合体化されたＣＰ０６０６２ペプチド（配列番号１２４）を用いて、そのＰＰＭＯを合成した。用量依存的関係を確立するために、各試験薬剤を３つの用量レベル（１０、３０および１００マイクログラム）において評価した。投薬は、０日目における感染の４時間前から開始して、次いで４日目まで毎日、合計５回、鼻腔内経路を介して行われた。この研究の主要エンドポイントは、肺組織１グラムあたりのプラーク形成単位として測定される、肺におけるウイルス力価の減少だった。
表６．Ｈ３Ｎ２マウスモデルにおいて使用されたアンチセンスオリゴマー
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 図６は、感染後６日目におけるウイルス力価に対する効果を示している。各ウイルス力価は、６種のＰＰＭＯおよび６種のＰＭＯｐｌｕｓ（商標）で処置された動物の平均である。Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧを標的にする化合物（配列番号１２および１３）は、試験された他の化合物と比べて実質的に高い活性を示した。図６に示される、ネガティブコントロールのデングによる処置からのウイルス力価は、デングウイルスを標的にしている無関係のＰＰＭＯおよびＰＭＯｐｌｕｓ（商標）配列を用いて得られた。
実施例２
フェレットモデル系におけるインフルエンザＡウイルスの阻害
本発明を支持する１つの所見は、新規Ｈ１Ｎ１２００９（Ｓ−ＯＩＶ）ウイルスを用いたときの、飼育されているフェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ）動物モデル系における本発明の化合物の抗ウイルスの有効性の立証だった。フェレットモデルの利点としては、マウス馴化株とは対照的にインフルエンザウイルスの天然のヒト単離株を使用できること、および発熱および鼻汁などのヒトにおいて観察されるほとんどの臨床的徴候の発症が挙げられる（Ｍｕｎｓｔｅｒ，ｄｅ Ｗｉｔら、２００９）。
６匹のフェレットを、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌから入手した２００９年のＴａｍｉｆｌｕ耐性Ｈ１Ｎ１株（汎発性ブタインフルエンザ）に感染させた。ウイルス感染の経路は、１日目において鼻腔内（４×１０４プラーク形成単位）であり、投薬は、ＰＭＯｐｌｕｓ（商標）化合物に対しては腹腔内（ｉｐ）注射、またはＰＰＭＯ化合物に対しては鼻腔内（ｉｎ）によって行われた。デングを標的にするネガティブコントロールＰＭＯｐｌｕｓ（商標）（３０ｍｇ／ｋｇ ｉｐ用量）およびＰＰＭＯ（１．５ｍｇ／ｋｇ用量）化合物を、上記の実施例１に記載されたように投与した。ＰＭＯｐｌｕｓ（商標）化合物に対する用量は、Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧｐｌｕｓ（配列番号１３；ＡＶＩ−７１００）に対しては１０および３０ｍｇ／ｋｇであり、３’末端において配列番号１２４に結合体化されたＭ１／Ｍ２−ＡＵＧ ＰＰＭＯ（配列番号１２）に対しては０．５および１．５ｍｇ／ｋｇだった。投薬は、感染の４時間前、ならびに１、３および５日目に行われた。アンチセンス化合物と並行して、Ｔａｍｉｆｌｕ（Ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）を抗ウイルス薬のポジティブコントロールとして投与した（１０ｍｇ／ｋｇ用量）。ネガティブコントロールとして食塩水も含めた。
生存中の所見には、体重増加（図７Ａ）、くしゃみ（図７Ｂ）、鼻汁（図７Ｃ）および呼吸窮迫（図７Ｄ）が含まれた。Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧを標的にする化合物は、体重減少を防ぎ、くしゃみ、鼻汁および呼吸窮迫を減少させた。感染後の１日目〜５日目における鼻洗浄液からのウイルス力価を、図７Ｅに曲線下面積（ＡＵＣ）組織培養感染量（ＴＣＩＤ）として示す。Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ ＰＰＭＯは、食塩水と比べて２．３ｌｏｇの減少（９９．６％減少）およびＴａｍｉｆｌｕに対して１．１ｌｏｇ超の減少（９４．４％超）を示した。
ＡＶＩ−７１００（配列番号１３）の有効性をさらに評価するために、インフルエンザＭ１／Ｍ２セグメントの翻訳開始部位を標的にするＰＭＯｐｌｕｓを、オセルタミビル耐性非馴化Ｈ１Ｎ１（ＳＯＩＶ）汎発性インフルエンザウイルスに感染したフェレットにおいて試験した。合計３６匹の雄フェレットを本研究において使用した。研究の開始時に約７００ｇという一致した体重を有した雄フェレットを５つの処置群（下記の表７に示される）のうちの１つに無作為化し、ウイルスがケージ間で伝染するのを最小にするために、Ｈｅｐａフィルター付きケージ（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｃａｇｅｓ）に収容した（１ケージあたり４匹）。それらのケージは、Ｔｕｌａｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ＢＳＬ−２研究室内で維持された。
表７．フェレット研究デザイン
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 ウイルス負荷の１〜４時間前にフェレットをＡＶＩ−７１００で処置した。投与経路は、群２、３および５については腹腔内であり；群１については経口だった。投薬間隔は、ウイルス負荷の−４時間後、２４、４８、７２、９６および１２０時間後だった。５つの群を以下のとおり処置した：群１には、オセルタミビルを経口経路によって１２時間ごとに５ｍｇ／ｋｇで投与し、群２には、ＡＶＩ−７１００（ＰＭＯｐｌｕｓ化合物；５’−ＣＧＧＴ＋ＴＡＧＡＡＧＡＣ＋ＴＣＡＴＣ＋ＴＴＴ−３’）をｉ．ｐ．経路によって１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、群３には、ＡＶＩ−７１００（ＰＭＯｐｌｕｓ化合物）をｉ．ｐ．経路によって３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、群４には、滅菌された食塩水コントロールをｉ．ｐ．経路によって投与し、群５には、ｉ．ｐ．経路によってＡＶＩ−７１００を１日に１回、１０ｍｇ／ｋｇで、およびオセルタミビルを１日に２回、５ｍｇ／ｋｇで投与した。群１〜２（各々８匹のフェレット）と群４〜５（各々６匹のフェレット）との間で群サイズが異なることについての理由は、研究開始時におけるインフルエンザＡ血清陰性フェレットの入手可能性が限られていたことに起因した。
本研究に含められたすべてのフェレットが、感染後８日目の研究の終了時まで生存していたことから、これらの動物が非常に健常だったか、またはこの特定のウイルスがこのモデルにおいて非常に病原性でなかったことが示唆される。それにもかかわらず、下記に示されるように、これらの結果は、ＡＶＩ−７１００による処置が、未処置のコントロールまたはオセルタミビルで処置されたコントロールと比べてインフルエンザウイルス感染の症状を有意に減少させることを示すだけでなく、ＡＶＩ−７１００とオセルタミビルとの併用によって達成され得る相乗効果も明示する。臨床所見（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖｉａｔｉｏｎｓ）の要旨を下記の表８に示す。
表８：臨床所見
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 さらなる指標として、上気道に浸潤する細胞の所見が、感染の重症度の尺度である。鼻洗浄液中のマクロファージの細胞性の要旨を下記の表９に含める。さらに、未処置のフェレットおよびオセルタミビルだけで処置されたフェレットは、顕著な肺胞炎（肺の炎症）、大量の浸潤細胞（リンパ球および好中球を含む）および肺胞壁の中程度の肥厚とともに、肺において有意なうっ血を示した。対照的に、ＡＶＩ−７１００で処置された（オセルタミビルありまたはなし）フェレットは、肺におけるうっ血を示さず、軽度の肺胞炎およびわずかな浸潤細胞を示しただけだった。
表９．上気道におけるマクロファージの細胞性
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 下記の表１０に示されるように、鼻洗浄液中のウイルス血症のピークは、１日目に観察された。ウイルス感染の進行に対する鼻洗浄液回収の有害な影響を最小にするために、２、４、６および７日目には鼻洗浄液を回収しなかった。ＡＶＩ−７１００処置群において、食塩水またはオセルタミビルよりも有意な利益が観察された。ＡＶＩ−７１００のみ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびオセルタミビルのみの処置と比べて、ＡＶＩ−７１００（１０ｍｇ／ｋｇ）とオセルタミビルとの併用によって相乗効果も観察された。ここで、併用（ＡＶＩ−７１００およびオセルタミビル）についての鼻洗浄液中のウイルス力価に対するＡＵＣは、ｔａｍｉｆｌｕのみの群と比べて４ｌｏｇ超の減少および食塩水群と比べて３ｌｏｇ超の減少を示す。その併用は、等量のＡＶＩ−７１００単独と比べてウイルス力価のいっそう大きな減少（５．５１５というＡＵＣから２．９９９というＡＵＣへの減少）も示すことから、ＡＶＩ−７１００が、オセルタミビルの抗ウイルス作用を増大させ得ると示唆される。本研究において使用されたウイルスが、別途オセルタミビルに耐性であるので、この結果は、驚くべきものである。
表１０：ウイルス力価
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 実施例３
スプライス部位を標的にするアンチセンスオリゴマーを用いた、組織培養物中のインフルエンザＡウイルスの阻害
本発明のある態様は、Ｍ１／Ｍ２セグメント内の複数の部位のアンチセンス標的化によるインフルエンザＡウイルス複製の阻害である。通常のＭ１／Ｍ２ ＡＵＧ開始部位を標的にすることによる翻訳の阻害に加えて、スプライス供与部位およびスプライス受容部位もまた、本発明の化合物を用いて標的にされ得る。７４０位のスプライス受容部位を標的にする２つのＰＭＯを、ペプチド結合体化ＰＰＭＯであるＳＡ７４０およびＳＡ７４６（それぞれ配列番号２６および２９）として合成し、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８株に対するインビトロ組織培養物複製系に入れた。そのＰＭＯの３’末端に、Ｐ００７細胞透過性ペプチド（配列番号１１８）を結合体化した。
マウス肺胞マクロファージ細胞株（ＡＴＣＣ；ＡＭＪ２−Ｃ１１）を０．１ＭＯＩでＨ１Ｎ１（ＰＲ８株）に感染させ、感染の１時間後にＰＰＭＯを加えた。細胞を３５℃で一晩インキュベートした。次いで、ウイルス上清を取り、ＶＮＡＲプロテアーゼとともにインキュベートすることにより、ウイルスＲＮＡを放出させた。ＨＡ ＲＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって定量した。細胞を洗浄し、固定し、透過処理した。次いで、Ｍ１およびＭ２タンパク質を３７℃において３０分間、モノクローナル抗体でプロービングした。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ６４６に結合体化された抗マウスＩｇＧを室温において１５分間加えた。次いで、Ｍ１およびＭ２をフローサイトメトリーによってアッセイした。Ｍ１およびＭ２タンパク質のレベルを測定するために、Ｍ１またはＭ２陽性細胞のパーセントに、Ｍ１またはＭ２の平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を乗じた。次いで、各サンプルを未処置コントロールで除することにより、未処置のスクランブルコントロールに対するＭ１またはＭ２のパーセントを得た。
図８Ａは、ウイルスのＨＡ ＲＮＡレベルの減少（ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した）を示している。ＳＡ７４０とＳＡ７４６の両方ともが、ＨＡ ＲＮＡ生成を阻害したことから、スクランブルコントロールと比べてウイルス複製の阻害が示唆される。最も著明な作用は、１０マイクロモル濃度において観察された（ＳＡ７４６を用いたときのおよそ２ｌｏｇの減少およびＳＡ７４０を用いたときの１ｌｏｇの減少）。図８Ｂおよび８Ｃは、それぞれＭ１およびＭ２タンパク質レベルに対する、ＳＡ７４０およびＳＡ７４６の作用を示している。上に記載されたフローサイトメトリー法を用いることにより、相対的なタンパク質レベルを測定した。両方のオリゴマーが、Ｍ２タンパク質の産生を阻害したのに対し、Ｍ１タンパク質のレベルは、ＳＡ７４０によって減少した。
実施例４
ロックト核酸（ＮＵＬＣＥＩＣ ＡＣＩＤ）オリゴマーを用いた、組織培養物中のインフルエンザＡウイルスの阻害
本発明の化合物は、ＰＭＯとは異なる化学実体を含むオリゴヌクレオチドアナログを含む。Ｍ１／Ｍ２セグメントＡＵＧ開始部位領域を標的にする一連のロックト核酸を合成し（ＬＮＡ−ＡＵＧ１、ＬＮＡ−ＡＵＧ１２、ＬＮＡ−ＡＵＧ１３およびＬＮＡ−ＡＵＧ１０；それぞれ配列番号６３、７４、７５および７２）、上記の実施例３に記載されたようなウイルスＲＮＡおよびＭ２タンパク質発現に対するアッセイと同じアッセイにおいて試験した。ＬＮＡオリゴマーの細胞内送達は、裸の（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）送達（Ｓｔｅｉｎ，Ｈａｎｓｅｎら、２０１０）を介した。ＡＭＪ２−Ｃ１１細胞を、ＰＲ８に１時間感染させ、次いで、洗浄した。次いで細胞を、ＬＮＡまたは２’ＯＭｅ化合物とともに９６ウェルプレートにプレーティングし、３５℃で一晩インキュベートした。ウイルスのＲＮＡレベルおよびＭ２タンパク質の発現をその時点で評価した（約１８時間という総インキュベーション時間）。図９Ａは、ウイルスのＲＮＡレベル（ＨＡセグメント）に対する４つの異なるＬＮＡの作用を示している。７．５マイクロモル濃度において、ウイルスのＨＡ ＲＮＡレベルが、ＬＮＡ−ＡＵＧ１２化合物の場合の約１．５ｌｏｇ減少に対して、ＬＮＡ−ＡＵＧ１オリゴマーの場合、約３ｌｏｇ減少した（それぞれ配列番号７４および６３）。ＬＮＡ−ＡＵＧ１は、２０ｍｅｒであるのに対し、ＬＮＡ−ＡＵＧ１２は、１６ｍｅｒである。４つすべてのＬＮＡオリゴマーに対して、長さに従った有効性の順位が存在することから、より長いＬＮＡが、本発明の好ましい実施形態であることが示唆される。この関係性は、ＬＮＡ−ＡＵＧ１オリゴが、７．５マイクロモル濃度においてＬＮＡ−ＡＵＧ１０化合物と比べて最も有効である（それぞれ配列番号６３および７２）という、図９Ｂに示されるＭ２タンパク質発現の測定結果においても観察される。１０塩基の標的化配列からなる相対的に短いＬＮＡ−ＡＵＧ１０化合物が、ウイルスのＨＡ ＲＮＡアッセイとＭ２タンパク質発現アッセイの両方において最も有効性が低かった。
実施例５
２’ＯＭＥオリゴマーを用いた、組織培養物中のインフルエンザＡウイルスの阻害
本発明の化合物は、ホスホロチオエート結合によって連結された２’ＯＭｅ残基からなるアンチセンスアナログオリゴマーも含む。３種の２’ＯＭｅオリゴである２’ＯＭｅ−ＡＵＧ１、２’ＯＭｅ−ＡＵＧ２および２’ＯＭｅ−ＳＡ１；それぞれ配列番号１２、２０および２６がＩＤＴによって作製された。これらのオリゴマーは、Ｍ１／Ｍ２セグメントのＡＵＧ開始コドンまたはヌクレオチド７４０に位置するスプライス受容部位のいずれかを標的にするように設計された。２’ＯＭｅ−ＳＡ１配列（配列番号２６）は、上記の実施例３にＳＡ７４０と記載されたＰＰＭＯ化合物の配列と一致する。それらの２’ＯＭｅ化合物を、上記の実施例３および４に記載されたようなウイルスのＨＡ ＲＮＡレベルおよびＭ２タンパク質発現を阻害する能力に対するアッセイと同じアッセイにおいて試験した。細胞内送達は、上記の実施例４においてＬＮＡについて記載されたようなジムノシス（ｇｙｍｎｏｓｉｓ）によって行われた。
３種すべての２’ＯＭｅ化合物が、図１０Ａに示されるように、７．５マイクロモル濃度における２．５〜４．５ｌｏｇというウイルスのＨＡ ＲＮＡレベルの減少に有効だった。図１０Ｂに示されるＭ２タンパク質測定アッセイにおいて、３種の化合物の相対的な有効性も観察された。最も有効な化合物は、ＡＵＧ開始部位領域を標的にする２’ＯＭｅ−ＡＵＧ２の２４ｍｅｒ（配列番号２０）だった。下流のＭ１／Ｍ２スプライス受容部位を標的にする２’ＯＭｅ−ＳＡ１オリゴマー（配列番号２６）が同様に有効だった。
実施例６
インビトロでのＭ１およびＭ２タンパク質発現の阻害
Ｍ１およびＭ２タンパク質の発現に対する本発明の例示的な化合物の作用を、処置され感染されたＡＭＪ２−Ｃ１１細胞のウエスタンブロット解析を用いて評価した。本発明の例示的なＰＰＭＯ化合物（Ｍ１／Ｍ２ＰＰＭＯ；Ｐ００７−Ｍ１／Ｍ２−ＡＵＧ；３’末端において配列番号１１８に結合体化された配列番号１２）を３マイクロモル濃度で用いて、ＭＤＣＫ細胞を一晩処置した。続いて、それらの細胞をＨ１Ｎ１−ＰＲ８に０．０１ＭＯＩで１時間感染させ、洗浄した。感染の１８時間後に、細胞を溶解し、タンパク質を抽出した。Ｍ１、Ｍ２およびアクチンタンパク質と反応するモノクローナル抗体を用いる標準的な免疫ブロット（ウエスタン）アッセイによるその後の解析にむけて、等量のタンパク質をゲル上に充填した。図１１に示されるように、Ｍ１タンパク質とＭ２タンパク質の両方の発現が、未処置コントロールおよび無関係のコントロールＰＰＭＯ（デング）と比べて減少した。シグナル強度の解析から、図１１に示されるように、Ｍ１タンパク質の発現よりもＭ２タンパク質の発現がＭ１／Ｍ２ＰＰＭＯによって大きく阻害されることが示唆された（すなわち、Ｍ１の２７％に対するＭ２の９％）。Ｍ１およびＭ２に対するシグナルの比較は、アクチンコントロールに対して正規化された。
配列表
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Claims (31)

  1. 単離された抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
    ａ）ヌクレアーゼ抵抗性骨格；
    ｂ）１２〜４０ヌクレオチド塩基、ならびに
    ｃ）ｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのマイナスセンスウイルスＲＮＡセグメントの５’または３’末端の２５塩基
    ｉｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのプラスセンスｃＲＮＡの５’または３’末端の末端の３０塩基
    ｉｉｉ）インフルエンザウイルスのｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基、および
    ｉｖ）選択的スプライシングに供されるインフルエンザｍＲＮＡのスプライス供与部位またはスプライス受容部位の周辺の５０塩基
    から選択される標的領域にハイブリダイズする少なくとも１０塩基長の標的化配列
    を含む、単離された抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 前記オリゴヌクレオチドが、ウイルス標的領域とヘテロ二重鎖構造を形成する能力により特徴付けられ、ここで、前記ヘテロ二重鎖構造が：
    ａ）前記ウイルスのプラスセンス鎖またはマイナスセンス鎖および前記オリゴヌクレオチド化合物から構成され、そして
    ｂ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍにより特徴付けられる、
    請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 前記オリゴヌクレオチドが、
    ｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのＭ１またはＭ２領域のマイナスセンスウイルスＲＮＡセグメントの５’または３’末端の２５塩基、
    ｉｉ）インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢおよびインフルエンザウイルスＣのＭ１またはＭ２領域のプラスセンスｃＲＮＡの５’または３’末端の末端の３０塩基
    ｉｉｉ）インフルエンザのＭ１またはＭ２ ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドンの周辺の４５塩基、および
    ｉｖ）インフルエンザＭ１またはＭ２ ＲＮＡのスプライス供与部位またはスプライス受容部位の周辺の５０塩基
    から選択される標的領域と相補的な少なくとも１０塩基を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 前記オリゴヌクレオチドが、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に結合する非荷電のリン（ＩＩＩ）含有サブユニット間結合によって連結されたモルホリノサブユニットを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 前記モルホリノサブユニットが、以下の構造：
    Figure 2013510584
     に従うホスホロジアミデート結合によって結合されており、
    ここで、Ｙ１＝Ｏであり、Ｚ＝Ｏであり、Ｐｊは、塩基特異的な水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対形成部分であり、そしてＸは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシまたはアルキルアミノである、
    請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. Ｘ＝ＮＲ２であり、各Ｒは、独立して水素またはメチルであり、正に帯電した結合の場合、Ｘは、１−ピペラジンである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 少なくとも２つかつサブユニット間結合の総数の半数以下が、正に帯電している、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 前記モルホリノオリゴマーが、配列番号１３に示されるような正に帯電したサブユニット間結合を含む、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 前記ウイルス標的領域が、配列番号１〜１１のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 前記ウイルス標的領域が、配列番号２または４を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１２〜４７のうちのいずれか１つ以上の少なくとも１０個連続した塩基を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１２または１３を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 前記オリゴヌクレオチドが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. 配列番号４８〜６２のうちのいずれか１つ以上の少なくとも１０個連続した塩基を含む、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴヌクレオチド。
  15. 配列番号４８〜６２のうちの１つ以上から本質的になる、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  16. １つ以上のロックト核酸（ＬＮＡ）サブユニットを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  17. ＬＮＡサブユニットから本質的になる、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
  18. 配列番号６３〜１１４のうちのいずれか１つ以上の少なくとも１０個連続した塩基を含む、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
  19. 配列番号６３〜１１４のうちの１つ以上から本質的になる、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
  20. 前記オリゴヌクレオチドが、宿主細胞内への前記化合物の取り込みを増大させるアルギニンリッチポリペプチドに結合体化されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. 前記アルギニンリッチポリペプチドが、配列番号１１５〜１２８からなる群から選択される、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
  22. インフルエンザウイルスの複製を減少させる方法であって、前記方法は、インフルエンザウイルスに感染した細胞を、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる工程を包含する、方法。
  23. 前記細胞が、被験体内の細胞であり、前記方法が、前記被験体に前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記被験体が、二次的細菌感染を有し、細菌用抗生物質を、前記抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドと別個に、またはそれと同時に併用して投与する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記二次的細菌感染が、連鎖球菌性肺炎への感染である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記抗生物質が、ベータ−ラクタムである、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記抗生物質が、ペニシリン、アモキシシリン、セファロスポリン、クロラムフェニコールおよびクリンダマイシンから選択される、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記抗ウイルス性アンチセンスオリゴヌクレオチドと別個に、またはそれと同時に併用して、ＣＤ２００またはＣＤ２００レセプターをコードするＲＮＡ分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程をさらに包含する、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
  29. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
  30. 細菌用抗生物質をさらに含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。
  31. ＣＤ２００またはＣＤ２００レセプターをコードするＲＮＡ分子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。
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