JP2024501800A - 筋ジストロフィーを治療するためのエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む組成物 - Google Patents

筋ジストロフィーを治療するためのエクソンスキッピングオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書には、（ａ）核酸類似体に共有結合した細胞膜透過性ペプチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、細胞膜透過性ペプチドが少なくとも二つの正に荷電したアミノ酸を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩、（ｂ）一つまたは複数の界面活性剤、（ｃ）一つまたは複数の糖、および（ｄ）一つまたは複数の緩衝剤を含む、組成物が提供されている。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１２月２３日に出願された米国仮出願第６３／１２９，７５２号の利益を主張する。上記の出願の教示全体は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表が含まれ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月２１日に作成され、名称が８１６９＿５１＿ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズが１６，６１８バイトである。
本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングに好適なアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物に関する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥によって引き起こされる。タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２００万を超えるヌクレオチドにわたって拡散された７９個のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させるか、または停止コドンを導入するか、または全アウトオブフレームエクソンの除去もしくは一つまたは複数のエクソンの重複を特徴とする、任意のエクソンの変異は、機能性ジストロフィンの産生を妨げ、ＤＭＤをもたらす可能性がある。
変異、典型的には一つまたは複数のエクソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿った正しいリーディングフレームをもたらし、これにより、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早期に終結されない場合、より重症度の低い形態の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）が生じることが分かっている。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおける上流および下流のエクソンの結合が、遺伝子の正しいリーディングフレームを維持する場合、結果は、ある程度の活性を保持する短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型がもたらされる。
ジストロフィンを産生し、ＤＭＤを治療するための治療方法に有用である、エクソンスキッピングに好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む医薬組成物のニーズが存在する。
（ａ）核酸類似体に共有結合した細胞膜透過性ペプチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、細胞膜透過性ペプチドが少なくとも二つの正に荷電したアミノ酸を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩、（ｂ）一つまたは複数の界面活性剤、（ｃ）一つまたは複数の糖、および（ｄ）一つまたは複数の緩衝剤を含む、組成物。
一部の態様では、組成物は、約５０ｍｇ～約５００ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、選択された標的に結合して、ヒトジストロフィン遺伝子内のエクソンスキッピングを誘導することができる。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、アルギニンリッチペプチドである細胞膜透過性ペプチドを含む。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５４）、Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５５）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５６）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５７）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５８）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号５９）、－Ｒ５－Ｒａ、（配列番号６０）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）、および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）からなる群から選択されるアルギニンリッチペプチドである細胞膜透過性ペプチドを含み、ＲａはＨ、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒはアルギニンであり、Ｘは６‐アミノヘキサン酸であり、Ｂはβ－アラニンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）はグリシンである。一部の態様では、アルギニンリッチペプチドは、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号５９）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号６０）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）、または－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）であり、Ｒはアルギニンであり、Ｒａは水素またはアシル基である。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の標的領域の１５～３５個の核酸塩基に相補的な配列を含む。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式（Ｉ）：
または組成物中の、その薬学的に許容可能な塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
および
から選択される部分であり、
Ｒ１００が、細胞膜透過性ペプチドであり、
１～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、以下のうちの一つにおける核酸塩基に対応し、
Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
であり、Ｕは
であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
である。
一部の態様では、組成物中の式（Ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（Ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（Ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（Ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（Ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号５１に対応する。
一部の態様では、組成物中の式（Ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートのＴ’は、
である。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式（ＩＩ）：
またはその薬学的に許容可能な塩であり、１～（ｎ＋１）個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの一つにおける核酸塩基に対応し、
Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
であり、Ｕは
であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
である。
一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号５１に対応する。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）：
またはその薬学的に許容可能な塩であり、１～（ｎ＋１）個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの一つにおける核酸塩基に対応し、
Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
であり、Ｕは
であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
である。
一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号５１に対応する。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃１、ＰＰＭＯ＃２、ＰＰＭＯ＃３、またはＰＰＭＯ＃４、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃１、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃２、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃３、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃４、またはその薬学的に許容可能な塩である。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、遊離塩基形態である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ハロゲン塩である。一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＨＣｌ塩である。一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートのＨＣｌ塩は、１ＨＣｌ、２ＨＣｌ、３ＨＣｌ、４ＨＣｌ、５ＨＣｌ、または６ＨＣｌ塩である。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃１、ＰＰＭＯ＃２、ＰＰＭＯ＃３、またはＰＰＭＯ＃４の６ＨＣｌ塩形態である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃１の６ＨＣｌ塩形態である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃２の６ＨＣｌ塩形態である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃３の６ＨＣｌ塩形態である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃４の６ＨＣｌ塩形態である。
一部の態様では、一つまたは複数の界面活性剤は、組成物の約０．００１重量％～約２重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、一つまたは複数の界面活性剤は、組成物の約０．００２重量％～約１重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、組成物中の一つまたは複数の界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、ポビドン、ポロクサマー、ポロクサマーＦ１８８）、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
一部の態様では、一つまたは複数の糖は、組成物の約０．１重量％～約１１重量％の量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の糖は、約６重量％の量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の糖は、トレハロース、マンニトール、ショ糖、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一部の態様では、糖はマンニトールとショ糖との混合物である。一部の態様では、糖はマンニトールである。一部の態様では、糖はショ糖である。
一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約６．０～約７．０のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、約６．３～約６．５のｐＨを提供する量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲内で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、マレイン酸塩、アルギニン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一部の態様では、緩衝剤はクエン酸塩である。
一部の態様では、組成物は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の態様では、組成物は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の態様では、組成物は、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
一部の態様では、組成物は凍結乾燥形態である。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後３０分以内に溶解する。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後１５分以内に溶解する。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後３分以内に溶解する。
一部の態様では、組成物を溶解するために使用される水性溶媒は、滅菌水である。
本明細書に開示される組成物を水性溶媒中に溶解または分散させることを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有するヒト患者を治療する方法も本明細書に開示される。
一部の態様では、組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である。一部の態様では、組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である。一部の態様では、組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量は、約５０ｍｇ／ｍＬのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である。一部の態様では、組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量は、約１００ｍｇ／ｍＬのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である。
本開示の態様は、概して、ヒトジストロフィン遺伝子においてエクソンスキッピングを誘導するように特異的に設計されている、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む医薬組成物、およびその使用方法に関する。ジストロフィンは筋機能に重要な役割を果たしており、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）やベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）に見られる変異ジストロフィン遺伝子など、様々な筋肉関連疾患がこの遺伝子の変異型によって特徴付けられる。
変異によって引き起こされる異常なｍＲＮＡスプライシング事象により、これらの変異ヒトジストロフィン遺伝子は、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、または測定可能なジストロフィンを全く発現しないかのいずれかであり、これは様々な形態の筋ジストロフィーを引き起こす状態である。この状態を治療するために、本開示の医薬組成物におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、変異ヒトジストロフィン遺伝子の予めプロセシングされたｍＲＮＡの選択された領域にハイブリダイズし、そうでなければ異常にスプライシングされたジストロフィンｍＲＮＡにおいてエクソンスキッピングおよび差次的スプライシングを誘導し、それにより、筋細胞が機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生することを可能にする。特定の態様では、結果として生じるジストロフィンタンパク質は、必ずしも「野生型」の形態のジストロフィンではなく、むしろ、先端を切断されたが機能的な形態のジストロフィンである。
筋細胞における機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを高めることによって、これらおよび関連する態様は、筋ジストロフィー、特にそのような形態の筋ジストロフィー、例えばＤＭＤおよびＢＭＤなどの予防および治療に有用であり、これらは、異常なｍＲＮＡスプライシングによる欠陥のあるジストロフィンタンパク質の発現を特徴とする。本明細書に記載される医薬組成物に含まれる特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、他のオリゴヌクレオチドを超えるジストロフィン－エクソン特異的標的化をさらに提供する。
したがって、本開示は、（ａ）核酸類似体に共有結合した細胞膜透過性ペプチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、細胞膜透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）が少なくとも二つの正に荷電したアミノ酸を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩、（ｂ）一つまたは複数の界面活性剤、（ｃ）一つまたは複数の糖、および（ｄ）一つまたは複数の緩衝剤を含む、医薬組成物に関する。
一部の態様では、ＣＰＰは、アルギニンリッチペプチドである。「アルギニンリッチ」という用語は、少なくとも２個、好ましくは２、３、４、５、６、７、または８個のアルギニン残基を有するＣＰＰを指し、各々が任意に一つまたは複数の非荷電疎水性残基によって分離され、任意に約６～１４個のアミノ酸残基を含有する。以下に説明されるように、ＣＰＰは、そのカルボキシ末端でリンカーを介してアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、リンカーはまた、一つまたは複数のアミノ酸であり得、かつ好ましくは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、またはステアロイルから選択されるＲａを含む置換基Ｒａによってそのアミノ末端でキャップされる。一部の態様では、Ｒａはアセチルである。
以下の表に見られるように、本明細書で使用するためのＣＰＰの非限定的な例としては、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５４）、Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５５）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５６）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５７）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５８）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号５９）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号６０）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）が挙げられ、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒは、アルギニンであり、Ｘは、６－アミノヘキサン酸であり、Ｂは、β－アラニンであり、Ｆは、フェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）は、グリシンである。ＣＰＰ「Ｒ５」は、アミド結合を介して一緒に連結された５個のアルギニン残基のペプチドを示すことを意味する（単一の置換基、例えば、Ｒ５ではない）（「Ｒ５」は配列番号６０として開示される）。ＣＰＰ「Ｒ６」は、アミド結合を介して一緒に連結された６個のアルギニン残基のペプチドを示すことを意味する（単一の置換基、例えば、Ｒ６ではない）（「Ｒ６」は配列番号５３として開示される）。一部の態様では、Ｒａはアセチルである。
例示的なＣＰＰを表１（配列番号５２～６０）に示す。
ＣＰＰ、それらの合成、およびオリゴヌクレオチドにコンジュゲートする方法は、米国出願公開第ＵＳ２０１２／０２８９４５７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０９７０１７号、同第ＷＯ２００９／００５７９３号、および同第ＷＯ２０１２／１５０９６０号にさらに記載されており、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＰＰとリンカーの組み合わせとして定義される置換基「Ｚ」を含む。リンカーは、そのカルボキシ末端でＣＰＰをオリゴヌクレオチドの３’末端に架橋する。
Ｚ内のリンカーは、例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含み得る。
特定の態様では、Ｚは、
‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ‐ＣＰＰ、
‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ‐ＣＰＰ、
‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ‐ＣＰＰ、
‐Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ‐ＣＰＰ、および以下の式から選択され、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰカルボキシ末端でのアミド結合によってリンカー部分に結合される。
様々な態様では、ＣＰＰは、本明細書に記載され、かつ表１に示される、アルギニンリッチペプチドである。特定の態様では、アルギニンリッチＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）（すなわち、６個のアルギニン残基、配列番号５３）であり、式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。特定の態様では、Ｒａはアセチルである。様々な態様では、ＣＰＰは、配列番号５３、５４、または５５から選択され、リンカーは、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ－、
－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－、および
からなる群から選択される。一部の態様では、リンカーは、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含む。
一部の態様では、ＣＰＰは配列番号５３であり、リンカーはＧｌｙである。一部の態様では、ＣＰＰは配列番号５２である。
特定の態様では、Ｚは、オリゴヌクレオチドの３’末端でアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合している－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）であり、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、またはステアロイルであり、Ｒ６（配列番号５３）のアミノ末端をキャップする。特定の態様では、Ｒａはアセチルである。これらの非限定的な例において、ＣＰＰは－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）であり、リンカーは－Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－、（すなわち、ＧＬＹ）である。Ｚ＝‐Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）のこの特定の例もまた、以下の構造によって例示され、
式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。
様々な態様では、ＣＰＰは、－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）であり、以下の式としても例示され、
式中、Ｒａは、Ｈ、アシル、アセチル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択される。特定の態様では、ＣＰＰは配列番号５２である。一部の態様では、Ｒａはアセチルである。
一部の態様では、ＣＰＰは、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５４）であり、以下の式としても例示される。
様々な態様では、ＣＰＰは、－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５５）であり、以下の式としても例示される。
様々な態様では、Ｚは、
‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ‐ＣＰＰ、
‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨ‐ＣＰＰ、
‐Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨ‐ＣＰＰ、
‐Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＮＨ‐ＣＰＰ、および以下の式から選択され、
式中、ＣＰＰは、ＣＰＰカルボキシ末端でのアミド結合によってリンカー部分に結合され、かつＣＰＰは、
（－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ）（配列番号５５）、
（－（ＲＸＲ）４－Ｒａ）（配列番号５４）、
または（－Ｒ６－Ｒａ）（配列番号５３）から選択される。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当該分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験で使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本開示の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、別段の定めがない限り、飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。特定の態様では、アルキル基は、第一級、第二級、または第三級炭化水素である。特定の態様では、アルキル基は、１～１０個の炭素原子、すなわち、Ｃ１～Ｃ１０アルキルを含む。特定の態様では、アルキル基は、１～６個の炭素原子、すなわち、Ｃ１～Ｃ６アルキルを含む。この用語は、ハロゲン化アルキル基を含む、置換アルキル基および非置換アルキル基の両方を含む。特定の態様では、アルキル基は、フッ素化アルキル基である。アルキル基が置換され得る部分の非限定的な例は、当業者に既知であるように、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１で教示されるように、保護されていないか、または必要に応じて保護されているかのいずれかの、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、ヒドロキシル，アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸塩、ホスホン酸、リン酸塩、またはホスホン酸塩からなる群から選択される。特定の態様では、アルキル基は、メチル、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、エチル、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、３－メチルペンチル、２，２－ジメチルブチル、および２，３－ジメチルブチルからなる群から選択される。
「エクソンスキッピングに適している」とは、対象または患者に関して本明細書で使用される場合、ジストロフィンプレｍＲＮＡの特定のエクソンまたはイントロンのスキッピングがないことにより、リーディングフレームがアウトオブフレームとなり、それによりプレｍＲＮＡの翻訳が妨げられて、対象または患者が機能性または半機能性ジストロフィンを産生することができなくなる、ジストロフィン遺伝子の一つまたは複数の変異を有する対象および患者を含むことが意図される。患者がエクソンスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するかどうかを決定することは、十分に当業者の理解の範囲内である（例えば、Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．３０：２９３－２９９、Ｇｕｒｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３－６４０、およびＦｌｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（６）１２１８－１２２３を参照）。
本明細書で使用される場合、用語「核酸類似体」または「ポリ核酸類似体」は、天然ＲＮＡと構造的に類似している化合物である。核酸類似体またはポリ核酸類似体は、天然ＲＮＡと比較して、リン酸骨格、ペントース糖、および／または核酸塩基が修飾されたヌクレオチドの鎖である。例示的な核酸類似体には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、およびロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、サブユニット間連結によって結合されるサブユニットの配列を指す。ある特定の事例において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」に関連して使用される。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」について、各サブユニットは、（ｉ）リボース糖またはその誘導体と、（ｉｉ）それらに結合した核酸塩基とからなり、これにより、塩基対合部分の順序は、サブユニット、サブユニット間連結、またはそれらの両方のいずれかが自然発生的ではないという条件で、標的配列内で核酸：オリゴヌクレオチドヘテロ二本鎖を形成するために、ワトソン－クリック塩基対合によって核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列に相補的である塩基配列を形成する。特定の態様では、「アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート」は、ＣＰＰがアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合されるホスホロジアミデートモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＰＰＭＯ」）である。
「相補的な」および「相補性」という用語は、ワトソン－クリック塩基対合則によって互いに関連する二つ以上のオリゴヌクレオチド（すなわち、各々が核酸塩基配列を含む）を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ－Ｇ－Ａ（５’→３’）」は、核酸塩基配列「Ａ－Ｃ－Ｔ（３’→５’）」に相補的である。相補性は、「部分的」であり得、所与の核酸塩基配列の全てには満たない核酸塩基が、塩基対合則に従って他の核酸塩基配列とマッチされる。例えば、一部の態様では、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であり得る。あるいは、例を続けると、所与の核酸塩基配列と別の核酸塩基配列との間に「完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」または「完全な（ｐｅｒｆｅｃｔ）」（１００％）相補性が存在し得る。核酸塩基配列間の相補性の程度は、配列間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を与える。
「増強する」もしくは「増強すること」、または「増加させる」もしくは「増加させること」、または「刺激する」もしくは「刺激すること」は、概して、前述のうちのいずれかの一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートなし、または対照化合物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、細胞または対象においてより大きい生理学的応答（すなわち、下流効果）をもたらすまたは引き起こす能力を指す。より大きい生理学的応答は、当該技術分野における理解および本明細書の記載から明らかな応答の中でも特に、機能的な形態のジストロフィンタンパク質の発現の増加、または筋組織におけるジストロフィン関連生物活性の増加を含み得る。
本明細書で使用される場合、「機能」および「機能性」などという用語は、生物学的、酵素的、または治療的機能を指す。
「機能性」ジストロフィンタンパク質は、概して、典型的には、ＤＭＤまたはＢＭＤを有するある特定の対象に存在する、改変されたかまたは「欠陥のある」形態のジストロフィンタンパク質と比較して、そうでなければ筋ジストロフィーに特徴的である筋組織の進行性分解を低減するのに十分な生物学的活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。一例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの筋培養におけるジストロフィン関連活性は、筋管のサイズ、筋原線維の組織化（または崩壊）、収縮活性、およびアセチルコリン受容体の自発的クラスター化に従って測定することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９－２１６、１９９９を参照）。また、動物モデルは、疾患の病因を研究するための貴重なリソースであり、ジストロフィン関連活性を試験するための手段を提供する。ＤＭＤ研究に最も広く使用されている動物モデルのうちの二つは、ｍｄｘマウスおよびゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、それらの両方がジストロフィン陰性である（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ＆Ｍｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ ８４：１６５－１７２，２００３を参照）。これらおよび他の動物モデルが使用されて、様々なジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。先端を切断された形態のジストロフィン、例えば、本開示のある特定のエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの投与後に産生されるそのような形態が含まれる。
「ミスマッチ」という用語は、塩基対合則に従って標的プレｍＲＮＡにマッチしないオリゴヌクレオチド核酸塩基配列中の一つまたは複数の核酸塩基（連続的であるか分離しているかにかかわらず）を指す。多くの場合、完全相補性が望ましいが、一部の態様では、標的プレｍＲＮＡに対して一つまたは複数、ただし好ましくは６、５、４、３、２、または１つのミスマッチを含み得る。オリゴヌクレオチド内の任意の位置における変動が含まれる。特定の態様では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、末端付近の核酸塩基配列の変動、内部の変動を含み、存在する場合、典型的には、５’および／または３’末端の約６、５、４、３、２、または１つのサブユニット内にある。特定の態様では、一つ、二つ、または三つの核酸塩基を除去し、なお標的上の結合を提供することができる。
特定の態様では、モルホリノは、オリゴヌクレオチドの５’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、
および
を含む。上記の例示的なテール部分のうち、「ＴＥＧ」または「ＥＧ３」は、以下のテール部分を指す。
上記の例示的なテール部分のうち、「ＧＴ」は、以下のテール部分を指す。
本明細書で使用される場合、「－Ｇ－Ｒ５（配列番号５９）」および「－Ｇ－Ｒ５－Ａｃ（配列番号５９）」という用語は、互換的に使用され、アンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた細胞膜透過性ペプチド部分を指す。様々な態様では、「Ｇ」は、アミド結合によって「Ｒ５」にコンジュゲートされたグリシン残基を表し、各「Ｒ」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされたアルギニン残基を表し、これにより「Ｒ５」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされた５個のアルギニン残基を意味する（「Ｒ５」は配列番号６０として開示される）。アルギニン残基は、任意の立体配置を有することができ、例えば、アルギニン残基は、Ｌ－アルギニン残基、Ｄ－アルギニン残基、またはＤ－アルギニン残基とＬ－アルギニン残基の混合物であり得る。一部の態様では、「－Ｇ－Ｒ５（配列番号５９）」または「－Ｇ－Ｒ５－Ａｃ（配列番号５９）」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合され、以下の式：
もしくはその薬学的に許容可能な塩、または以下の式である。
本明細書で使用される場合、「－Ｇ－Ｒ６（配列番号５２）」および「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ（配列番号５２）」および「Ｒ６Ｇ（配列番号５２）」という用語は、互換的に使用され、アンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた細胞膜透過性ペプチド部分を指す。様々な態様では、「Ｇ」は、アミド結合によって「Ｒ６」にコンジュゲートされたグリシン残基を表し、各「Ｒ」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされたアルギニン残基を表し、これにより「Ｒ６」は、アミド結合によって一緒にコンジュゲートされた６個のアルギニン残基を意味する（「Ｒ６」は配列番号５３として開示される）。アルギニン残基は、任意の立体配置を有することができ、例えば、アルギニン残基は、Ｌ－アルギニン残基、Ｄ－アルギニン残基、またはＤ－アルギニン残基とＬ－アルギニン残基の混合物であり得る。一部の態様では、「－Ｇ－Ｒ６（配列番号５２）」または「－Ｇ－Ｒ６－Ａｃ（配列番号５２）」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にコンジュゲートされ、以下の式：
または以下である。
「核酸塩基」（Ｎｕ）、「塩基対合部分」、または「塩基」という用語は、互換的に使用され、自然発生または「天然」ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、およびグアニン）で見られるプリンまたはピリミジン塩基、ならびにこれらの自然発生的プリンおよびピリミジンの類似体を指す。これらの類似体は、結合親和性などの改善された特性をオリゴヌクレオチドに付与し得る。例示的な類似体としては、ヒポキサンチン（イノシンの塩基構成成分）、２，６－ジアミノプリン、５－メチルシトシン、Ｃ５－プロピニル修飾ピリミジン、１０－（９－（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ－クランプ）などが挙げられる。
塩基対合部分のさらなる例としては、ウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン、およびヒポキサンチン（イノシン）（アシル保護基によって保護されたそれらのそれぞれアミノ基を有する）、２－フルオロウラシル、２－フルオロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、２，６－ジアミノプリン、アザシトシン、偽イソシトシンおよび偽ウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８－置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（後者の二つは自然分解生成物である）などの他の修飾核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４－１０４８；Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３－２１９６、およびＲｅｖａｎｋａｒ ａｎｄ Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示される修飾核酸塩基もまた企図され、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
塩基対合部分のさらなる例としては、一つまたは複数のベンゼン環が付加された拡大サイズの核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、Ｋｒｕｅｇｅｒ ＡＴ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１－１５０；Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６－９４３；Ｂｅｎｎｅｒ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３－５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３－７３３；ａｎｄ Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２－６２７（これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される核酸塩基置換は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートにおいて有用であると企図される。拡大サイズの核酸塩基の例としては、以下に示されるもの、ならびにその互変異性体が挙げられる。
本明細書で使用される場合、構造式内で使用される一組の括弧は、括弧間の構造特徴が繰り返されることを示す。一部の態様では、使用される括弧は、「［」および「］」であり得、特定の態様では、繰り返す構造特徴を示すために使用される括弧は、「（」および「）」であり得る。一部の態様では、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、括弧の外側に示される数、例えば、２、３、４、５、６、７などである。様々な態様では、括弧間の構造特徴の繰り返し反復数は、「Ｚ」などの括弧の外側に示される変数によって示される。
本明細書で使用される場合、構造式内のキラル炭素またはリン原子に引き寄せられた直鎖結合または曲がりくねった（ｓｑｕｉｇｇｌｙ）結合は、キラル炭素またはリンの立体化学が未定義であり、キラル中心の全ての形態および／またはそれらの混合物を含むことが意図されていることを示す。そのような図の例が以下に示される。
「薬学的に許容可能な」という語句は、物質または組成物が、製剤を含む他の成分および／またはそれを用いて治療される対象と、化学的および／または毒性学的に適合性がなければならないことを意味する。
ジストロフィン合成または産生に関する「修復」という用語は、概して、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療後の筋ジストロフィー患者における、先端を切断された形態のジストロフィンを含むジストロフィンタンパク質の産生を指す。治療後の患者のジストロフィン陽性線維の割合は、既知の技術を使用して筋生検によって決定され得る。例えば、筋生検は、患者の上腕二頭筋などの好適な筋肉から採取され得る。
陽性ジストロフィン線維の割合の分析は、治療前および／もしくは治療後、または治療過程全体を通した時点において実施され得る。一部の態様では、治療後の生検は、治療前の生検と対側の筋肉から採取される。治療前および治療後のジストロフィン発現分析は、ジストロフィンのための任意の好適なアッセイを使用して実施され得る。一部の態様では、免疫組織化学的検出は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などのジストロフィンのためのマーカーである抗体を使用して、筋生検からの組織切片上で実施される。例えば、ジストロフィンのための高感度マーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体が使用され得る。任意の好適な二次抗体が使用され得る。
一部の態様では、ジストロフィン陽性線維の割合は、陽性線維数を、カウントした総線維数で割ることによって計算される。正常な筋肉試料は、１００％のジストロフィン陽性線維を有する。したがって、ジストロフィン陽性線維の割合は、正常の割合として表され得る。治療前の筋肉ならびに復帰突然変異線維におけるジストロフィンの微量レベルの存在を制御するために、治療後の筋肉におけるジストロフィン陽性線維をカウントする場合、ベースラインは、患者からの治療前の筋肉切片を使用して設定され得る。これは、その患者の治療後の筋肉切片におけるジストロフィン陽性線維をカウントするための閾値として使用され得る。他の態様では、抗体で染色された組織切片は、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用したジストロフィン定量化にも使用され得る。総ジストロフィン蛍光シグナル強度は、正常の割合として報告され得る。さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用して、ジストロフィン陽性線維の割合を決定することができる。例えば、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ－Ｄｙｓ１が使用され得る。また、ジストロフィン陽性線維の割合は、サルコグリカン複合体（β、γ）および／または神経ＮＯＳの構成成分の発現を決定することによっても分析され得る。
一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート含む医薬組成物を用いた治療は、治療なしで予想されるＤＭＤ患者における進行性呼吸筋機能障害および／または不全を遅らせるか、または低減する。一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む医薬組成物を用いた治療は、治療なしで予想される換気補助の必要性を低減または排除することができる。一部の態様では、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、ならびに可能性のある治療介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、および努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。ＭＩＰおよびＭＥＰは、それぞれ、吸入中および呼気中に人が発生させることができる圧力レベルを測定し、かつ呼吸筋力の感度尺度である。ＭＩＰは、横隔膜の筋力低下の尺度である。
一部の態様では、ＭＥＰは、ＭＩＰおよびＦＶＣを含む他の肺機能検査における変化の前に低下し得る。特定の態様では、ＭＥＰは、呼吸機能障害の早期指標であり得る。特定の態様では、ＦＶＣは、最大吸気後の努力呼気中に排出される空気の総体積を測定するために使用され得る。ＤＭＤ患者において、ＦＶＣは、１０代前半まで身体的成長と同時に増加する。しかしながら、成長が病気の進行によって遅くなるまたは不良になり、筋力低下が進行すると、肺活量は下降期に入り、１０～１２歳の後、年間約８～８．５パーセントの平均速度で低下する。特定の態様では、予測ＭＩＰパーセント（ＭＩＰは体重で調整）、予測ＭＥＰパーセント（ＭＥＰは年齢で調整）、および予測ＦＶＣパーセント（ＦＶＣは年齢および身長で調整）は、支持的分析である。
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、ＤＭＤもしくはＢＭＤ、またはこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の消失）を有する、またはそのリスクがある対象（または患者）など、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む医薬組成物を用いて治療され得る症状を示す、または症状を示すリスクがある任意の動物を含む。好適な対象（または患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および家庭用動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者（または対象）が含まれる。また、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象（または患者）においてジストロフィンを産生する方法も含まれる。
「標的化配列」または「塩基配列」という語句は、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列に相補的であるオリゴヌクレオチドの核酸塩基の配列を指す。本開示の一部の態様では、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の標的領域である。
「ＰＰＭＯ＃１」は以下の構造：
またはその薬学的に許容可能な塩を有する。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃１は、ハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃１は、ヘキサハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃１は、ＨＣｌ（塩酸）塩の形態である。特定の態様では、ＨＣｌ塩は、・６ＨＣｌ塩である。
「ＰＰＭＯ＃２」は以下の構造：
またはその薬学的に許容可能な塩を有する。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃２は、ハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃２は、ヘキサハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃２は、ＨＣｌ（塩酸）塩の形態である。特定の態様では、ＨＣｌ塩は、・６ＨＣｌ塩である。
「ＰＰＭＯ＃３」は以下の構造：
またはその薬学的に許容可能な塩を有する。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃３は、ハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃３は、ヘキサハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃３は、ＨＣｌ（塩酸）塩の形態である。特定の態様では、ＨＣｌ塩は、・６ＨＣｌ塩である。
「ＰＰＭＯ＃４」は以下の構造：
またはその薬学的に許容可能な塩を有する。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃４は、ハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃４は、ヘキサハロゲン塩の形態である。一部の態様では、ＰＰＭＯ＃４は、ＨＣｌ（塩酸）塩の形態である。特定の態様では、ＨＣｌ塩は、・６ＨＣｌ塩である。
対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」は、対象または細胞の自然経過を変化させる試みにおいて使用される任意の種類の介入である。治療は、限定するものではないが、オリゴヌクレオチドまたはその医薬組成物の投与を含み、予防的に、または病理学的事象の開始もしくは病原体との接触の後のいずれかに実施され得る。治療は、ある特定の形態の筋ジストロフィーにおけるような、ジストロフィンタンパク質に関連した疾患または状態の症状または病理に対する任意の望ましい効果を含み、例えば、治療されている疾患または状態の、一つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善を含み得る。また、治療されている疾患もしくは状態の進行速度を低下させること、その疾患もしくは状態の発症を遅延させること、またはその発症の重症度を低減することを対象とし得る、「予防的」治療も含まれる。「治療」または「予防」は、必ずしも疾患もしくは状態またはその随伴症状の完全な根絶、治癒、または予防を示すものではない。
一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む医薬組成物を用いた治療は、治療なしで予想され得る、新規のジストロフィン産生を増加させ、疾患進行を遅延させ、歩行不能を遅らせるかもしくは低減し、筋肉の炎症を低減し、筋肉損傷を低減し、筋機能を改善し、肺機能の喪失を低減し、かつ／または筋肉再生を増強する。一部の態様では、治療は、疾患進行を維持するか、遅延させるか、または遅らせる。一部の態様では、治療は、歩行を維持するか、または歩行不能を低減する。一部の態様では、治療は、肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減する。一部の態様では、治療は、例えば、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。一部の態様では、治療は、１０メートルを歩行／走行する時間（すなわち、１０メートル歩行／走行試験）を維持するか、または減少させる。一部の態様では、治療は、仰臥位から起立するまでの時間を維持するか、または低減する（すなわち、起立時間試験）。一部の態様では、治療は、四つの標準階段を上る時間（すなわち、四階段上昇試験）を維持するか、または低減する。一部の態様では、治療は、例えば、ＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）によって測定されるように、患者の筋肉の炎症を維持するか、または低減する。一部の態様では、ＭＲＩは、Ｔ２および／または脂肪画分を測定して、筋変性を特定する。ＭＲＩは、炎症、浮腫、筋肉損傷、および脂肪浸潤によって引き起こされる筋肉の構造および組成の変化を特定することができる。
一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む医薬組成物を用いた治療は、新規のジストロフィン産生を増加させ、治療なしで予測され得る歩行不能を遅らせるか、または低減する。例えば、治療は、対象の歩行能力（例えば、歩行の安定化）を安定化するか、維持するか、改善するか、または増加させ得る。一部の態様では、治療は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６－７４、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載される６分間歩行試験（６ＭＷＴ）によって測定されるように、患者の安定した歩行距離を維持するか、または増加させる。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は、絶対値、変化率、または％予測値の変化として表され得る。健康な同等者の典型的なパフォーマンスと比較した６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者のパフォーマンスは、％予測値を計算することによって決定することができる。例えば、％予測６ＭＷＤは、男性の場合、以下の方程式を使用して計算され得る：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）－（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））。女性の場合、％予測６ＭＷＤは、以下の方程式を使用して計算され得る：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）－（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ ２、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＤＭＤ患者の筋機能の喪失は、正常な小児の成長および発達の背景に反して起こり得る。実際に、ＤＭＤを有する小児は、進行性筋肉障害にもかかわらず、約１年の過程にわたって６ＭＷＴ中の歩行距離の増加を示し得る。一部の態様では、ＤＭＤ患者からの６ＭＷＤは、定型発達の対照対象、ならびに年齢および性別が一致した対象からの既存の標準データと比較される。一部の態様では、正常な成長および発達は、標準データにフィッティングされた年齢および身長に基づく方程式を使用して説明され得る。そのような方程式を使用して、ＤＭＤを有する対象における６ＭＷＤをパーセント予測（％予測）値に変換することができる。一部の態様では、％予測６ＭＷＤデータの分析は、正常な成長および発達を説明する方法を表し、若年齢（例えば、７歳以下）における機能の増加が、ＤＭＤ患者における能力の改善ではなく安定を表すことを示し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ ２（参照により本明細書に組み込まれる））。
異なるアンチセンス分子を区別するために、アンチセンス分子の命名法システムが提案および公開された（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｍｅｄ ４，６４４－６５４を参照）。この命名法は、以下に示されるように、全てが同じ標的領域に向けられたいくつかのわずかに異なるアンチセンス分子を試験する場合に、特に適切なものとなった。
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）
最初の文字は、種を示す（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）。「＃」は、標的ジストロフィンエクソン番号を示す。「Ａ／Ｄ」は、それぞれエクソンの始点および終点におけるアクセプターまたはドナースプライス部位を示す。（ｘ ｙ）は、アニーリング座標を表し、「－」または「＋」は、それぞれイントロンまたはエクソン配列を示す。例えば、Ａ（－６＋１８）は、標的エクソンの前にあるイントロンの最後の６塩基、および標的エクソンの最初の１８塩基を示す。最も近いスプライス部位がアクセプターになるため、これらの座標の前に「Ａ」が付く。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載は、Ｄ（＋２－１８）であり得、最後の２エクソン塩基および最初の１８イントロン塩基が、アンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。エクソンアニーリング座標全体は、Ａ（＋６５＋８５）、つまり、そのエクソンの始点から６５番目～８５番目のヌクレオチドの部位によって表される。
ＩＩ．組成物
本開示は、（ａ）核酸類似体に共有結合した細胞膜透過性ペプチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、細胞膜透過性ペプチドが少なくとも二つの正に荷電したアミノ酸を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩、（ｂ）一つまたは複数の界面活性剤、（ｃ）一つまたは複数の糖、および（ｄ）一つまたは複数の緩衝剤を含む、組成物に関する。
Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート
１．エクソンスキッピングを誘導するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート
特定の態様では、本開示の組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の標的領域に相補的である。一部の態様では、本開示の組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の標的領域の１５～３５の核酸塩基に相補的である。一部の態様では、本開示の組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の標的領域の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の核酸塩基に相補的である。
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的化し、標的エクソンのスキッピングを誘導するため、成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ転写物から除外またはスキップされる。標的エクソンをスキッピングすることによって、破壊されたリーディングフレームは、インフレーム変異に修復される。
標的エクソンのスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの核酸塩基配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡ内の特定の標的配列に相補的であるように設計されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯであり、ＰＭＯの各モルホリノ環は、例えば、ＤＮＡ中に見られる核酸塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）および細胞膜透過性ペプチドを含む核酸塩基に連結される。
本開示の例示的な態様は、以下の一般構造の、
かつＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７－１９５（１９９７）の図２に記載されるような、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドに関する。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体および互変異性体を含むことが意図されている。モルホリノオリゴヌクレオチドの合成、構造、および結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号、および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の態様では、モルホリノは、オリゴヌクレオチドの５’末端で「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性および／または溶解性を高める。例示的なテールは、
および
を含む。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式（Ｉ）：
またはその薬学的に許容可能な塩であり、式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
Ｔが、
および
から選択される部分であり、
Ｒ１００は、細胞膜透過性ペプチドであり、
１～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、以下のうちの一つにおける核酸塩基に対応し、
Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
であり、Ｕは
であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
である。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１に対応する。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号７に対応する。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１７に対応する。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号５１に対応する。
一部の態様では、組成物中の式（Ｉ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩のＴ’は、
である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩は、アルギニンリッチペプチドである細胞膜透過性ペプチドを含む。一部の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５４）、Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５５）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５６）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５７）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５８）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号５９）、－Ｒ５－Ｒａ、（配列番号６０）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）、および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）からなる群から選択されるアルギニンリッチペプチドである細胞膜透過性ペプチドを含み、ＲａはＨ、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒはアルギニンであり、Ｘは６‐アミノヘキサン酸であり、Ｂはβ－アラニンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）はグリシンである。一部の態様では、アルギニンリッチペプチドは、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号５９）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号６０）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）、または－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）であり、Ｒはアルギニンであり、Ｒａは水素またはアシル基である。一部の態様では、アルギニンリッチペプチドである。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式（ＩＩ）：
またはその薬学的に許容可能な塩であり、１～（ｎ＋１）個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの一つにおける核酸塩基に対応し、
Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
であり、Ｕは
であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
である。
一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号５１に対応する。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）：
またはその薬学的に許容可能な塩であり、１～（ｎ＋１）個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの一つにおける核酸塩基に対応し、
Ａは
であり、Ｃは
であり、Ｇは
であり、Ｔは
であり、Ｕは
であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
である。
一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号１７に対応する。一部の態様では、組成物中の式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個の各Ｎｕは、５’から３’に、配列番号５１に対応する。
一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃１、ＰＰＭＯ＃２、ＰＰＭＯ＃３、またはＰＰＭＯ＃４、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃１、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃２、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃３、またはその薬学的に許容可能な塩である。一部の態様では、組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＰＰＭＯ＃４、またはその薬学的に許容可能な塩である。
一部の態様では、組成物は、約５０ｍｇ～約５００ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の態様では、組成物は、約５０ｍｇ～約４５０ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の態様では、組成物は、約５０ｍｇ～約４００ｍｇ、約５０ｍｇ～約３５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約３００ｍｇ、約５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約２００ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ、約７５ｍｇ～約５００ｍｇ、約７５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約７５ｍｇ～約４００ｍｇ、約７５ｍｇ～約３５０ｍｇ、約７５ｍｇ～約３００ｍｇ、約７５ｍｇ～約２５０ｍｇ、約７５ｍｇ～約２００ｍｇ、約７５ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約５００ｍｇ、約１００ｍｇ～約４５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約４００ｍｇ、約１００ｍｇ～約３５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約３００ｍｇ、約１００ｍｇ～約２００ｍｇ、約１００ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１２５ｍｇ～約５００ｍｇ、約１２５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約１２５ｍｇ～約４００ｍｇ、約１２５ｍｇ～約３５０ｍｇ、約１２５ｍｇ～約３００ｍｇ、約１２５ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約４５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約４００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約３５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約３００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２００ｍｇ、約１７５ｍｇ～約５００ｍｇ、約１７５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約１７５ｍｇ～約４００ｍｇ、約１７５ｍｇ～約３５０ｍｇ、約１７５ｍｇ～約３００ｍｇ、約１７５ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約５００ｍｇ、約２００ｍｇ～約４５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約４００ｍｇ、約２００ｍｇ～約３５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約３００ｍｇ、約２００ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２２５ｍｇ～約５００ｍｇ、約２２５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約２２５ｍｇ～約４００ｍｇ、約２２５ｍｇ～約３５０ｍｇ、約２２５ｍｇ～約３００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約４５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約４００ｍｇ、約２５０ｍｇ～約３５０ｍｇ、約２７５ｍｇ～約５００ｍｇ、約２７５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約２７５ｍｇ～約４００ｍｇ、約２７５ｍｇ～約３５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約５００ｍｇ、約３００ｍｇ～約４５０ｍｇ、約３００ｍｇ～約４００ｍｇ、約３００ｍｇ～約３５０ｍｇ、約３２５ｍｇ～約５００ｍｇ、約３２５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約３２５ｍｇ～約４００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約５００ｍｇ、約３５０ｍｇ～約４５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、約４００ｍｇ～約４５０ｍｇ、または約４５０ｍｇ～約５００ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。一部の態様では、組成物は、遊離塩基の重量に基づいて、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４７５ｍｇ、または約５００ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。組成物に含まれる特定の薬学的に許容可能な塩としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの重量は、調整されるであろう。例えば、その六塩化物（６ＨＣｌ）塩形態としての１０２ｍｇのＰＰＭＯ＃１は、その遊離塩基としての１００ｍｇのＰＰＭＯ＃１に相当する。
Ｂ．アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの薬学的に許容可能な塩
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドのある特定の態様は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有し得、ひいては薬学的に許容可能な酸と薬学的に許容可能な塩を形成することができる。この点における「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの比較的非毒性の無機酸および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製される得か、または本開示の精製されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、その遊離塩基形態で、好適な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、その後の精製中にそのようにして形成された塩を単離することによって調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９を参照）。
主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩は、例えば、非毒性の有機酸または無機酸からの、アンチセンスオリゴヌクレオチドの従来的な非毒性塩または第四級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来的な非毒性塩としては、無機酸に由来するもの、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など；ならびに有機酸から調製された塩、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などが挙げられる。
特定の態様では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数の酸性官能基を含有し得、ひいては薬学的に許容可能な塩基と薬学的に許容可能な塩を形成することができる。これらの事例において、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの比較的非毒性の無機塩基および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は同様に、投与ビヒクルまたは剤形製造プロセスにおいて原位置で調製され得るか、または精製されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、その遊離酸形態で、好適な塩基、例えば、薬学的に許容可能な金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、もしくは重炭酸塩と、アンモニアと、または薬学的に許容可能な有機第一級アミン、第二級アミン、もしくは第三級アミンと別々に反応させることによって調製され得る。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる。（例えば、上記のＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌを参照）。
塩形態は、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを有する複数のカチオンまたはアニオンの複合体であってもよい。例えば、塩形態は、モノハロゲン化物（１ＨＣｌ）、ジハロゲン化物（２ＨＣｌ）、トリハロゲン化物（３ＨＣｌ）、テトラハロゲン化物（４ＨＣｌ）、ペンタハロゲン化物（５ＨＣｌ）、またはヘキサハロゲン化物（６ＨＣｌ）であってもよい。
Ｂ．界面活性剤
本開示の組成物は、一つまたは複数の界面活性剤を含む。一部の態様では、一つまたは複数の界面活性剤は、組成物の約０．００１重量％～約２重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、一つまたは複数の界面活性剤は、組成物の約０．００２重量％～約１重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、一つまたは複数の界面活性剤は、組成物の約０．０１重量％～約１重量％の量で組成物中に存在する。
一部の態様では、組成物中の一つまたは複数の界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、ポビドン、ポロクサマー、ポロクサマーＦ１８８）、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一部の態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）である。一部の態様では、界面活性剤はポリビニルピロリドンである。
一部の態様では、組成物は、組成物の約０．００１重量％～約２重量％の量でポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）を含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の約０．００１重量％～約２重量％の量でポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）を含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の約０．００２重量％～約１重量％の量でポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）を含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の約０．０１重量％～約１重量％の量でポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）を含有する。
一部の態様では、組成物は、組成物の約０．００１重量％～約２重量％の量でポリビニルピロリドンを含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の約０．００１重量％～約２重量％の量でポリビニルピロリドンを含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の約０．００２重量％～約１重量％の量でポリビニルピロリドンを含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の約０．０１重量％～約１重量％の量で含有する。
Ｃ．糖類
本開示の組成物は、一つまたは複数の糖を含む。一部の態様では、一つまたは複数の糖は、組成物の約０．１重量％～約１１重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、一つまたは複数の糖は、組成物の約０．５重量％～約７重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、一つまたは複数の糖は、組成物の最大６重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、一つまたは複数の糖は、組成物の約６重量％の量で組成物中に存在する。
一部の態様では、一つまたは複数の糖は、トレハロース、マンニトール、ショ糖、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一部の態様では、糖はマンニトールとショ糖との混合物である。一部の態様では、糖はマンニトールである。一部の態様では、糖はショ糖である。
一部の態様では、組成物は、組成物の約０．１重量％～約１１重量％の量でマンニトールとショ糖の混合物を含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の約０．５重量％～約７重量％の量でマンニトールとショ糖の混合物を含有する。一部の態様では、組成物は、組成物の最大６重量％の量でマンニトールとショ糖の混合物を含有する。一部の態様では、一つまたは複数の糖は、組成物の約６重量％の量で組成物中に存在する。
一部の態様では、糖はマンニトールであり、組成物の約０．１重量％～約１１重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、糖はマンニトールであり、組成物の約０．５重量％～約７重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、糖はマンニトールであり、組成物の最大６重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、糖はマンニトールであり、組成物の約６重量％の量で組成物中に存在する。
一部の態様では、糖はショ糖であり、組成物の約０．１重量％～約１１重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、糖はショ糖であり、組成物の約０．５重量％～約７重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、糖はショ糖であり、組成物の最大６重量％の量で組成物中に存在する。一部の態様では、糖はショ糖であり、組成物の約６重量％の量で組成物中に存在する。
Ｄ．緩衝剤
本開示の組成物は、一つまたは複数の緩衝剤を含む。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約６．０～約７．０のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、約６．３～約６．５のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、または約７．０のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、約６．３のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、約６．４のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、約６．５のｐＨを提供するのに十分な量で存在する。
一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲内で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約１０ｍＭ～約４０ｍＭの範囲内で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの範囲内で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約２０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲内で存在する。一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約２０ｍＭ～約４０ｍＭの範囲内で存在する。一部の態様では、組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、一つまたは複数の緩衝剤は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、または約５０ｍＭで存在する。
一部の態様では、一つまたは複数の緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、マレイン酸塩、アルギニン、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一部の態様では、緩衝剤はクエン酸塩である。
一部の態様では、組成物は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の態様では、組成物は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の態様では、組成物は、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。一部の態様では、組成物は、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
一部の態様では、組成物は凍結乾燥形態である。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後３０分以内に溶解する。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後２０分以内に溶解する。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後１５分以内に溶解する。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後１０分以内に溶解する。一部の態様では、組成物は、水性溶媒の添加後、９分、約８分、約７分、約６分、約５分、約４分、または約３分以内に溶解する。
一部の態様では、組成物を溶解するために使用される水性溶媒は、滅菌水である。
ＩＩＩ．使用方法
エクソンスキッピングを使用したジストロフィンリーディングフレームの修復
ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム変異によって引き起こされるＤＭＤの治療に対する潜在的な治療アプローチは、インフレーム変異によって引き起こされるＢＭＤとして既知である、より軽度な形態のジストロフィン異常症によって示唆される。アウトオブフレーム変異をインフレーム変異に変換する能力は、仮定では、ｍＲＮＡリーディングフレームを保持し、内部で短縮されたが機能的なジストロフィンタンパク質を産生する。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、これを達成するように設計した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート（例えば、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート）の標的化プレｍＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションは、プレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成を阻害し、成熟ｍＲＮＡからエクソン５０を欠失させる。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造および立体構造により、相補的配列に対する配列特異的塩基対合が可能となる。
７９個のエクソンを全て含有する正常なジストロフィンｍＲＮＡは、正常なジストロフィンタンパク質を産生する。各エクソンの形状は、コドンがどのようにエクソン間で分割されるかを示す。注目すべきことに、一つのコドンは、三つのヌクレオチドからなる。長方形のエクソンは、完全なコドンで始まり、終わる。矢印形状のエクソンは、完全なコドンで始まるが、コドンのヌクレオチド＃１のみを含有する分割コドンで終わる。このコドンのヌクレオチド＃２および＃３は、シェブロン形状で始まる後続のエクソンに含有される。
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の標的領域に相補的であり、エクソンスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの効果を分析するための臨床転帰は、ジストロフィン陽性線維（ＰＤＰＦ）の割合、六分間歩行試験（６ＭＷＴ）、歩行不能（ＬＯＡ）、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外部の支持なしで（仰臥位から）立ち上がる能力、デノボジストロフィン産生、および他の機能的尺度を含む。
一部の態様では、本開示は、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有する対象においてジストロフィンを産生するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を投与することによって、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象において、ジストロフィンタンパク質産生を誘導するためにｍＲＮＡリーディングフレームを修復するための方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ウェスタンブロット分析、または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって測定され得る。
一部の態様では、本開示は、その必要がある対象におけるＤＭＤを治療するための方法を提供し、この対象は、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３のスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の変異を有し、この方法は、本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。一部の態様では、それを必要とする対象は、ＤＭＤを有するヒト患者である。
様々な態様では、対象の治療は、疾患進行の遅延によって測定される。一部の態様では、対象の治療は、対象における歩行の維持、または対象における歩行不能の低減によって測定される。一部の態様では、歩行は、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）を使用して測定される。特定の態様では、歩行は、ノーススタート歩行評価（ＮＳＡＡ）を使用して測定される。
様々な態様では、本開示は、ＤＭＤを有する対象において肺機能を維持するか、または肺機能の喪失を低減するための方法を提供し、対象は、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３のスキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む。一部の態様では、肺機能は、最大呼気圧（ＭＥＰ）として測定される。特定の態様では、肺機能は、最大吸気圧（ＭＩＰ）として測定される。一部の態様では、肺機能は、努力肺活量（ＦＶＣ）として測定される。
様々な態様では、本開示の組成物は、治療有効量の非ステロイド性抗炎症化合物と同時投与される。一部の態様では、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＮＦ－ｋＢ阻害剤である。例えば、一部の態様では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ－１００４またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。様々な態様では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩とＤＨＡのコンジュゲートであり得る。一部の態様では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＣＡＴ－１０４１またはその薬学的に許容可能な塩である。特定の態様では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、サリチル酸塩とＥＰＡのコンジュゲートである。様々な態様では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、
またはその薬学的に許容可能な塩である。
一部の態様では、非ステロイド性抗炎症化合物は、ＴＧＦ－ｂ阻害剤である。例えば、特定の態様では、ＴＧＦ－ｂ阻害剤は、ＨＴ－１００である。
特定の態様では、療法に使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物が記載されている。特定の態様では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するための、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物が記載されている。
Ｖ．キット
本開示はまた、遺伝的疾患を有する患者の治療のためのキットを提供し、そのキットは、好適な容器に包装された、少なくともアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物を、その使用のための説明書と共に含む。キットはまた、緩衝液、安定剤などの周辺試薬も含有し得る。当業者であれば、上記方法の用途が、多くの他の疾患の治療に使用するのに好適なアンチセンス分子を特定するために幅広い用途を有することを理解するべきである。一態様では、キットは、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）によるアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩を含む。
上記の開示は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によってある程度詳細に記載されてきたが、本開示の教示を踏まえて、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および修正がそれに対して成され得ることは、当業者に容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、例示としてのみ提供されるものであり、限定するものではない。当業者であれば、実質的に類似した結果をもたらすように変更または修正され得る様々な重要ではないパラメーターを容易に認識するであろう。
実施例１（１００ｍｇ／バイアル構成）
ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の調製
注射用の１Ｌの水に、５．６７ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、および０．２４ｇのクエン酸および一水和物を添加した。このクエン酸緩衝液に、４０ｇのＤ－マンニトール、３８ｇのショ糖、および０．０２ｇのポリソルベート８０を添加した。５１．０ｇのＰＰＭＯ＃１塩酸塩（６ＨＣｌ塩、５０．０ｇのＰＰＭＯ＃１遊離塩基に相当）を加え、よく混合した。完全に溶解すると、溶液のｐＨは６．０～７．０、オスモル濃度が３００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが確認され、ＰＰＭＯ＃１の濃度は、１％の水酸化アンモニウム中で２６０ｎｍでの吸光係数２３．１を使用して測定される。最終溶液を、０．２μｍのバイオバーデン還元フィルターで濾過する。この溶液２ｍＬをバイアルに充填し、凍結乾燥および栓をし、密封して、最終製剤バイアルを生成する。
ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の再構成
各ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤バイアルについて、注射用滅菌水２ｍＬを、針／シリンジを使用して、シール／ストッパーなしで、ストッパーを通して添加する。各バイアルの内容物は、振らずに穏やかに旋回させることによって混合する。各バイアルの内容物が完全に溶解していることを確認するために、各バイアルを視覚的に検査する。均質性を確保するために、５～１０回穏やかに反転することが推奨される。再構成すると、ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩は、無色透明の溶液となり、いくらかの乳白光を有し得る。次いで、再構成された製剤を個々のバイアルから採取し、０．９％塩化ナトリウム注射液（生理食塩水）で希釈して、点滴用に約２０ｍｇ／ｍＬの濃度にする。
分析
試料を、外観、水分含量、再構成時間、および肉眼では見えない粒子分析について分析した。凍結乾燥ケーキおよび再構成溶液の外観を、透明性および任意の目に見える粒子の有無を視覚的に確認した。凍結乾燥ケーキ中の水分含量は、電量カールフィッシャー滴定により測定され、二重測定に基づいて１％未満であることが分かった。バイアルの内容物を注射用の２ｍＬの水に溶解することによって、再構成時間を決定した。溶解は、注射用水を加えた後、バイアルを穏やかに旋回させ（振とうしない）、反転させることによって達成され、５分以内であることが分かった。光遮蔽法ＵＳＰ＜７８８＞方法１を使用して、肉眼では見えない粒子分析を実施した。この分析には低容量（１ｍＬ）法を使用し、すべての分析は、＞１０μｍでは＜６０００粒子／容器、および＞２５μｍでは＜６００粒子／容器というＵＳＰ基準を満たした。
実施例２（４００ｍｇ／バイアル構成）
ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の調製
注射用の１Ｌの水に、５．６７ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、および０．２４ｇのクエン酸および一水和物が加えられる。このクエン酸緩衝液に、４０ｇのＤ－マンニトール、３８ｇのショ糖、および０．０２ｇのポリソルベート８０を添加した。１０２．０ｇのＰＰＭＯ＃１六塩酸塩（６ＨＣｌ塩、１００．０ｇのＰＰＭＯ＃１遊離塩基に相当）を加え、よく混合した。完全に溶解すると、溶液のｐＨは６．０～７．０、オスモル濃度が３００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが確認され、ＰＰＭＯ＃１の濃度は、１％の水酸化アンモニウム中で２６０ｎｍでの吸光係数２３．１を使用して測定される。最終溶液を、０．２μｍのバイオバーデン還元フィルターで濾過した。この溶液４ｍＬをバイアルに充填し、凍結乾燥し、栓をし、密封して、最終製剤バイアルを生成した。
ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の再構成
各ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤バイアルについて、注射用滅菌水４ｍＬを、針／シリンジを使用して、シール／ストッパーなしで、ストッパーを通して添加した。各バイアルの内容物は、振らずに穏やかに旋回させることによって混合した。各バイアルの内容物が完全に溶解していることを確認するために、各バイアルを視覚的に検査した。均質性を確保するために、５～１０回穏やかに反転することが推奨された。再構成すると、ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩は、無色透明の溶液となり、いくらかの乳白光を有し得た。次いで、再構成された製剤を個々のバイアルから採取し、点滴用に０．９％塩化ナトリウム注射液（生理食塩水）で希釈した。
分析
試料を、外観、水分含量、再構成時間、および肉眼では見えない粒子分析について分析した。凍結乾燥ケーキおよび再構成溶液の外観を、透明性および任意の目に見える粒子の有無を視覚的に確認した。凍結乾燥ケーキ中の水分含量は、電量カールフィッシャー滴定により測定され、二重測定に基づいて１％未満であることが分かった。バイアルの内容物を注射用の４ｍＬの水に溶解することによって、再構成時間を決定した。溶解は、注射用水を加えた後、バイアルを穏やかに旋回させ（振とうしない）、反転させることによって達成され、１５分以内であることが分かった。光遮蔽法ＵＳＰ＜７８８＞方法１を使用して、肉眼では見えない粒子分析を実施した。この分析には低容量（１ｍＬ）法を使用し、すべての分析は、＞１０μｍでは＜６０００粒子／容器、および＞２５μｍでは＜６００粒子／容器というＵＳＰ基準を満たした。
実施例３（１００ｍｇ／バイアル、ポリソルベート８０のバリエーション）
ポリソルベート８０の様々な量を有するＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の調製
注射用の１Ｌの水に、５．６７ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、および０．２４ｇのクエン酸および一水和物を添加した。このクエン酸緩衝液に、４０ｇのＤ－マンニトール（約４重量％）および３８ｇのショ糖（約３．８重量％）を加えた。この溶液に、四つの異なるレベルのポリソルベート８０、０ｇ（ポリソルベート８０なし）、０．００２ｇ（約０．０００２重量％）、０．０２ｇ（約０．００２重量％）、および０．２ｇ（約０．０２重量％）のポリソルベート８０を添加して、四つの異なる溶液を調製した。５１．０ｇのＰＰＭＯ＃１六塩酸塩（６ＨＣｌ塩、５０．０ｇのＰＰＭＯ＃１遊離塩基に相当）を個々の溶液に加え、よく混合した。個々の溶液の最終成分を
表に示す。完全に溶解すると、溶液のｐＨは６．０～７．０、オスモル濃度が４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが確認され、ＰＰＭＯ＃１の濃度は、１％の水酸化アンモニウム中で２６０ｎｍでの吸光係数２３．１を使用して測定された。最終溶液を、０．２μｍのバイオバーデン還元フィルターで濾過した。この溶液２ｍＬをバイアルに充填し、凍結乾燥し、栓をし、密封して、最終製剤バイアルを生成した。
ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の再構成
実施例３からの各ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤バイアルについて、注射用滅菌水４ｍＬを、針／シリンジを使用して、シール／ストッパーなしで、ストッパーを通して添加した。各バイアルの内容物は、振らずに穏やかに旋回させることによって混合した。各バイアルの内容物が完全に溶解していることを確認するために、各バイアルを視覚的に検査した。均質性を確保するために、５～１０回穏やかに反転することが推奨される。再構成すると、ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩は、無色透明の溶液となり、いくらかの乳白光を有し得た。次いで、再構成された製剤を個々のバイアルから採取し、０．９％塩化ナトリウム注射液（生理食塩水）で希釈して、点滴用に約２０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。
分析
実施例３からの試料を、外観、水分含量、再構成時間、および肉眼では見えない粒子分析について分析した。凍結乾燥ケーキおよび再構成溶液の外観を、透明性および任意の目に見える粒子の有無を視覚的に確認した。凍結乾燥ケーキ中の水分含量は、電量カールフィッシャー滴定により測定された。バイアルの内容物を注射用の２ｍＬの水に溶解することによって、再構成時間を決定した。溶解は、水を加えた後、バイアルを穏やかに旋回させ（振とうしない）、反転することによって達成された。光遮蔽法ＵＳＰ＜７８８＞方法１を使用して、肉眼では見えない粒子分析を実施した。この分析には、低容量（１ｍＬ）の方法を使用した。
これらのサンプルを、８週間、加速安定性条件（４０℃、７５％ＲＨ）にかけた。凍結乾燥ケーキの外観および水分含量に影響はなかったが、再構成時間の有意差および肉眼では見えない粒子の中程度の差が経時的に観察された。再構成時間が短く、時間が経過しても肉眼では見えない粒子が形成されないのは、それらの溶液中に存在するポリソルベートのレベルに起因し得る。加速安定性条件からの結果を、以下
実施例４（１００ｍｇ／バイアル、ショ糖およびマンニトールのバリエーション）
ショ糖およびＤ－マンニトールの様々な量を有するＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の調製
注射用の１Ｌの水に、５．６７ｇのクエン酸ナトリウム二水和物、および０．２４ｇのクエン酸および一水和物を添加した。このクエン酸緩衝液に、様々な量のＤ－マンニトールおよびショ糖を添加して、四つの異なる溶液を調製した。各溶液に、０．０２ｇのポリソルベート８０（約０．００２重量％）を添加した。５１．０ｇのＰＰＭＯ＃１六塩酸塩（６ＨＣｌ塩、５０．０ｇのＰＰＭＯ＃１遊離塩基に相当）を個々の溶液に加え、よく混合した。実施例４の個々の溶液の最終成分を表に示す。完全に溶解すると、溶液のｐＨは、６．０～７．０として、オスモル濃度は、４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇとして確認された。ＰＰＭＯ＃１の濃度を、１％の水酸化アンモニウム中で２６０ｎｍでの吸光係数２３．１を使用して測定した。最終溶液を、０．２μｍのバイオバーデン還元フィルターで濾過した。次いで、この溶液２ｍＬをバイアルに充填し、凍結乾燥し、栓をし、密封して、最終製剤バイアルを生成した。
実施例４のＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤の再構成
実施例４からの各ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩製剤バイアルについて、注射用滅菌水４ｍＬを、針／シリンジを使用して、シール／ストッパーなしで、ストッパーを通して添加した。各バイアルの内容物は、振らずに穏やかに旋回させることによって混合した。各バイアルの内容物が完全に溶解したことを確認するために、各バイアルを視覚的に検査した。均質性を確保するために、５～１０回穏やかに反転することが推奨される。再構成すると、ＰＰＭＯ＃１六塩酸塩は、無色透明の溶液となり、いくらかの乳白光を有し得た。次いで、再構成された製剤を個々のバイアルから採取し、０．９％塩化ナトリウム注射液（生理食塩水）で希釈して、点滴用に約２０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。
分析
実施例４の試料を、外観、水分含量、再構成時間、および肉眼では見えない粒子分析について分析した。凍結乾燥ケーキおよび再構成溶液の外観を、透明性および任意の目に見える粒子の有無を視覚的に確認した。凍結乾燥ケーキ中の水分含量は、電量カールフィッシャー滴定により測定された。バイアルの内容物を注射用の２ｍＬの水に溶解することによって、再構成時間を決定した。溶解は、水を加えた後、バイアルを穏やかに旋回させ（振とうしない）、反転することによって達成された。光遮蔽法ＵＳＰ＜７８８＞方法１を使用して、肉眼では見えない粒子分析を実施した。この分析には、低容量（１ｍＬ）の方法を使用した。
実施例４のこれらのサンプルを、４週間、加速安定性条件（４０℃、７５％ＲＨ）にかけた。凍結乾燥ケーキの外観、水分含量、再構成時間に影響はなく、経時的に肉眼では見えない粒子が観察された。水分データを９に示す。

Claims (63)

  1. 組成物であって、
    ａ．核酸類似体に共有結合した細胞膜透過性ペプチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩であって、前記細胞膜透過性ペプチドが少なくとも二つの正に荷電したアミノ酸、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩と、
    ｂ．一つまたは複数の界面活性剤と、
    ｃ．一つまたは複数の糖と、
    ｄ．一つまたは複数の緩衝剤と、を含む、組成物。
  2. 前記一つまたは複数の界面活性剤が、前記組成物の約０．００１重量％～約２重量％の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記一つまたは複数の界面活性剤が、前記組成物の約０．００２重量％～約１重量％の量で存在する、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記一つまたは複数の界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、ポビドン、ポロクサマー、ポロクサマーＦ１８８）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２または３に記載の組成物。
  5. 前記一つまたは複数の糖が、前記組成物の約０．１重量％～約１１重量％の量で存在する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記一つまたは複数の糖が、約６重量％の量で存在する、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記一つまたは複数の糖が、トレハロース、マンニトール、ショ糖、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５または６に記載の組成物。
  8. 前記糖が、マンニトールとショ糖との混合物である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記糖がショ糖である、請求項７に記載の組成物。
  10. 前記一つまたは複数の緩衝剤が、前記組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約６．０～約７．０のｐＨを提供するのに十分な量で存在する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記一つまたは複数の緩衝剤が、約６．３～約６．５のｐＨを提供するのに十分な量で存在する、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記一つまたは複数の緩衝剤が、前記組成物が水性溶媒中に溶解または分散されるとき、約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲内で存在する、請求項１０または１１に記載の組成物。
  13. 前記一つまたは複数の緩衝剤が、ヒスチジン、クエン酸塩、マレイン酸塩、アルギニン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記緩衝剤がクエン酸塩である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記組成物が、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６５０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記組成物が、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記組成物が、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約６００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１５に記載の組成物。
  18. 前記組成物が凍結乾燥形態である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記組成物が、水性溶媒の添加後３０分以内に溶解する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記組成物が、水性溶媒の添加後１５分以内に溶解する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記組成物が、水性溶媒の添加後３分以内に溶解する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記組成物を溶解するために使用される前記水性溶媒が滅菌水である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記組成物が、約５０ｍｇ～約５００ｍｇの前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、選択された標的に結合して、ヒトジストロフィン遺伝子内のエクソンスキッピングを誘導することができる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、アルギニンリッチペプチドである細胞膜透過性ペプチドを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記アルギニンリッチペプチドが、－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５４）、Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５５）、－Ｂ－Ｘ－（ＲＸＲ）４－Ｒａ（配列番号５６）、－Ｂ－Ｘ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５７）、－ＧＬＹ－Ｒ－（ＦＦＲ）３－Ｒａ（配列番号５８）、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号５９）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号６０）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）および－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）からなる群から選択され、ＲａはＨ、アシル、ベンゾイル、およびステアロイルから選択され、Ｒはアルギニンであり、Ｘは６－アミノヘキサン酸であり、Ｂはβ－アラニンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、ＧＬＹ（またはＧ）はグリシンである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記アルギニンリッチペプチドが、－ＧＬＹ－Ｒ５－Ｒａ（配列番号５９）、－Ｒ５－Ｒａ（配列番号６０）、－ＧＬＹ－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５２）、または－Ｒ６－Ｒａ（配列番号５３）であり、Ｒはアルギニンであり、Ｒａは水素またはアシル基である、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、またはエクソン５３の標的領域の１５～３５個の核酸塩基に対して相補的な配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、式（Ｉ）：
    またはその薬学的に許容可能な塩であり、式中、
    各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり、
    Ｔが、
    および
    から選択される部分であり、
    Ｒ１００が、前記細胞膜透過性ペプチドであり、
    １～ｎ個の各Ｎｕが、５’から３’に、以下のうちの一つにおける前記核酸塩基に対応し、
    Ａは
    であり、Ｃは
    であり、Ｇは
    であり、Ｔは
    であり、Ｕは
    であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
    である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１に対応する、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号７に対応する、請求項３０に記載の組成物。
  33. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１７に対応する、請求項３０に記載の組成物。
  34. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～ｎ個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号５１に対応する、請求項３０に記載の組成物。
  35. 式（Ｉ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートのＴ’が、
    である、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、式（ＩＩ）：
    またはその薬学的に許容可能な塩であり、１～（ｎ＋１）個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの一つにおける前記核酸塩基に対応し、
    Ａは
    で
    あり、Ｃは
    であり、Ｇは
    であり、Ｔは
    であり、Ｕは
    であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
    である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 式（ＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個の各Ｎｕが、５’から３’に、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する、請求項３６に記載の組成物。
  38. 式（ＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１に対応する、請求項３７に記載の組成物。
  39. 式（ＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号７に対応する、請求項３７に記載の組成物。
  40. 式（ＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１７に対応する、請求項３７に記載の組成物。
  41. 式（ＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号５１に対応する、請求項３７に記載の組成物。
  42. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、式（ＩＩＩ）：
    またはその薬学的に許容可能な塩であり、１～（ｎ＋１）個の各Ｎｕは、５’から３’に、以下のうちの一つにおける前記核酸塩基に対応し、
    Ａは
    であり、Ｃは
    であり、Ｇは
    であり、Ｔは
    であり、Ｕは
    であり、Ｇｍはメチル化グアニンであり、Ａｍはメチル化アデニンであり、ｍ５Ｃは
    である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 式（ＩＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１、配列番号７、配列番号１７、または配列番号５１に対応する、請求項４２に記載の組成物。
  44. 式（ＩＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１に対応する、請求項４３に記載の組成物。
  45. 式（ＩＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号７に対応する、請求項４３に記載の組成物。
  46. 式（ＩＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号１７に対応する、請求項４３に記載の組成物。
  47. 式（ＩＩＩ）の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な塩の１～（ｎ＋１）個および５’から３’の各Ｎｕが、配列番号５１に対応する、請求項４３に記載の組成物。
  48. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＰＰＭＯ＃１、ＰＰＭＯ＃２、ＰＰＭＯ＃３、またはＰＰＭＯ＃４、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、遊離塩基形態である、請求項１～４８いずれか一項に記載の組成物。
  50. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが薬学的に許容可能な塩である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の組成物。
  51. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートがハロゲン塩である、請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートがＨＣｌ塩である、請求項５０または５１に記載の組成物。
  53. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記ＨＣｌ塩が、１ＨＣｌ、２ＨＣｌ、３ＨＣｌ、４ＨＣｌ、５ＨＣｌ、または６ＨＣｌ塩である、請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＰＰＭＯ＃１、ＰＰＭＯ＃２、ＰＰＭＯ＃３、またはＰＰＭＯ＃４の前記６ＨＣｌ塩形態である、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＰＰＭＯ＃１の前記６ＨＣｌ塩形態である、請求項５４に記載の組成物。
  56. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＰＰＭＯ＃２の前記６ＨＣｌ塩形態である、請求項５４に記載の組成物。
  57. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＰＰＭＯ＃３の前記６ＨＣｌ塩形態である、請求項５４に記載の組成物。
  58. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートが、ＰＰＭＯ＃４の前記６ＨＣｌ塩形態である、請求項５４に記載の組成物。
  59. 請求項１～５８のいずれか一項に記載の組成物を水性溶媒中に溶解または分散させることを含む、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有するヒト患者を治療する方法。
  60. 前記組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量が、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬの前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量が、約２０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬの前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量が、約５０ｍｇ／ｍＬの前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記組成物を溶解または分散するために使用される水性溶媒の量が、約１００ｍｇ／ｍＬの前記アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの濃度を提供するのに十分である、請求項６１に記載の方法。
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