CN110461351B - 用tlr2激动剂治疗呼吸道感染 - Google Patents

用tlr2激动剂治疗呼吸道感染 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防呼吸道病症的方法、组合物和试剂盒。具体地讲，这些方法、组合物和试剂盒特别可用于，但不限于预防和/或治疗鼻病毒感染以及预防和/或治疗哮喘恶化。本发明提供了一种抑制受试者中的鼻病毒感染的方法，该方法包括施用由包含TLR2激动剂的化合物和药学上可接受的载体组成的组合物。

Description

用TLR2激动剂治疗呼吸道感染
在先申请的交叉引用
本申请要求澳大利亚临时申请AU 2017901180、AU 2017905124、AU 2017905128和AU 2018900409的优先权，每篇临时申请的全部内容通过援引以其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗呼吸道病症的方法、化合物、组合物和试剂盒。具体地讲，这些方法、化合物、组合物和试剂盒特别可用于但不限于预防和/或治疗鼻病毒感染和预防和/或治疗呼吸道恶化。
背景技术
呼吸道感染是全世界人类疾病中最常见的病因，且通常由病毒引起。鼻病毒(RV)是感染人类的最常见病毒类型之一，且已知会引起普通感冒。与散发性流行的和季节性的流感爆发不同，鼻病毒感染由于多种不同的血清型全年都会发生。平均而言，儿童每年感冒5-10次，并且所有感冒中超过一半都是由RV感染引起的。
病毒性呼吸道感染会加剧呼吸道病症的疾病严重性，从而导致恶化(发作)。哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)等病症可能会发生恶化。哮喘和COPD恶化是这些疾病中临床和经济上最重要的形式。鼻病毒是与哮喘恶化相关联的最常见的病毒感染，并且因此在发病率、死亡率和保健成本方面造成最大负担。
尽管使用了目前最好的治疗方法，但绝大多数恶化(特别是哮喘)仍在发生。当恶化确实发生时，治疗选择是有限的，并且近年来几乎没有发展。治疗涉及增加吸入性支气管扩张剂和全身性或口服皮质类固醇的剂量，这些药物与起初未能预防恶化发生的药物相同。
因此，需要用于治疗和/或预防鼻病毒介导的呼吸道病症的新的或改善的治疗方法。此外，需要用于治疗和/或预防病毒介导的恶化的新的或改善的治疗方法。
在本说明书中对任何现有技术的提及并不是承认或暗示此现有技术形成任何管辖权的公知常识的一部分，或者此现有技术可合理地预期被理解为被认为与本领域技术人员已知的其他现有技术是相关的和/或与之组合。
发明内容
本发明提供了一种治疗或预防受试者中与鼻病毒相关的呼吸道病症的方法，该方法包括施用包含TLR2激动剂的化合物，从而治疗或预防该受试者中与鼻病毒相关的呼吸道病症。
优选地，该方法包括仅施用包含TLR2激动剂的化合物。换句话说，该方法不包括施用除TLR2同二聚体或异二聚体之外的TLR的激动剂。
该化合物可以以组合物形式施用。典型地，该组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。该组合物可以配制用于向呼吸道施用，例如通过吸入或经鼻内。该组合物可以不含除TLR2同二聚体或异二聚体之外的作为TLR激动剂的化合物。优选地，该组合物基本上由或由包含TLR2激动剂的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组成。
本发明提供了一种治疗或预防受试者中的鼻病毒感染的方法，该方法包括施用包含TLR2激动剂的化合物，从而治疗或预防该受试者中的鼻病毒感染。优选地，该方法进一步包括鉴定患有鼻病毒感染的受试者的步骤。
本发明提供了一种用于减少受试者中鼻病毒诱导的气道炎症的方法，该方法包括施用包含TLR2激动剂的化合物，从而减少鼻病毒诱导的气道炎症。
本发明进一步提供了包含TLR2激动剂的化合物在制备用于治疗或预防受试者中与鼻病毒相关的呼吸道病症的药物中的用途。在任何实施例中，本发明还提供了包含TLR2激动剂的化合物用于治疗或预防受试者中与鼻病毒相关的呼吸道病症的用途。
本发明进一步提供了包含TLR2激动剂的化合物在制备用于治疗或预防受试者中的鼻病毒感染的药物中的用途。
本发明还提供了包含TLR2激动剂的化合物在预防受试者中的鼻病毒感染中的用途。
本发明提供了一种治疗或预防受试者中病毒介导的呼吸道病症恶化的方法，该方法包括向受试者施用包含TLR2激动剂的化合物，从而治疗或预防该受试者中病毒介导的呼吸道病症恶化。优选地，该方法进一步包括鉴定患有如本文所述的呼吸道病症的受试者的步骤。例如，该呼吸道病症可以是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化或与肺移植或长期糖皮质激素使用相关的肺部病症。
本发明还提供了一种改善受试者在呼吸道病毒感染期间控制呼吸道疾病的能力的方法，该方法包括向该受试者施用包含TLR2激动剂的化合物，从而改善该受试者控制该呼吸道疾病或呼吸道病毒感染的能力。优选地，该感染是鼻病毒感染。
本发明进一步提供了包含TLR2激动剂的化合物在制备用于治疗或预防受试者中病毒介导的呼吸道病症恶化的药物中的用途。
本发明进一步提供了包含TLR2激动剂的化合物用于治疗或预防受试者中病毒介导的呼吸道病症恶化的用途。
在本发明的任何方面，该呼吸道病症是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化或与肺移植或长期糖皮质激素使用相关的肺部病症。优选地，该呼吸道病症是哮喘或COPD。
在本发明的任何方面，该病症可由鼻病毒引起。此外，在本发明的任何方面，病毒介导的恶化是鼻病毒介导的。例如，病毒介导的哮喘恶化由鼻病毒引起。该鼻病毒可以是如本文所述的任何血清型。典型地，该鼻病毒是鼻病毒血清型1B(RV1B)。
在本发明的任何方面，该TLR2激动剂包括脂质、肽聚糖、脂蛋白或脂多糖。优选地，该TLR2激动剂包括棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、月桂酰、辛酰或癸酰。该TLR2激动剂可以选自由以下项组成的组：Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys和Oct2Cys。在优选的实施例中，TLR2激动剂包括Pam2Cys。
在本发明的任何方面，该化合物包含可溶性TLR2激动剂。
在本发明的任何方面，该TLR2激动剂可以与其他化合物或官能团缀合。其他化合物或官能团是本文所述的那些中的任一种。基于帮助将该TLR2激动剂溶解在载体、稀释剂、赋形剂或溶剂中来选择优选的化合物。
根据溶剂的极性，该TLR2激动剂的溶解度可以通过增溶剂增加。因此，该化合物可包含TLR2激动剂和增溶剂。优选地，该TLR2激动剂与增溶剂连接。该TLR2激动剂可以是聚乙二醇化的。优选地，该增溶剂是如本文所述的任何分子。
该增溶剂可包含带正电荷或带负电荷的基团、基本上由或由带正电荷或带负电荷的基团组成。优选地，带电荷的基团是支链或直链肽。优选地，带正电荷的基团包含至少一种带正电荷的氨基酸，诸如精氨酸或赖氨酸残基。优选地，带负电荷的基团包含至少一种带负电荷的氨基酸，诸如谷氨酸或天冬氨酸。带电荷的氨基酸可以在末端，优选N-末端。
典型地，该增溶剂包括聚乙二醇(PEG)或R4。在本发明的任何方面，该增溶剂包括聚乙二醇(PEG)和R4。
在本发明的任何方面，该化合物包括与PEG11缀合的Pam2Cys。优选地，Pam2Cys和PEG11分子被两个丝氨酸分开(PEG11-SS-Pam2Cys)。
在本发明的任何方面，该TLR2激动剂不是Pam3Cys。
设想用于本发明任何方面的包含TLR2激动剂的化合物是本文所述的任一种。
在本发明的任何方面，该TLR2激动剂每天施用一次、每周施用一次或每周施用两次。
在打算或需要预防或防止的本发明的任何方面，在出现病毒感染(优选鼻病毒感染)的任何临床或生物化学可检测的症状之前，将该化合物施用给受试者。
在本发明的任何方面，该化合物以组合物形式施用。典型地，该组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。该组合物可以不含除TLR2同二聚体或异二聚体之外的作为TLR激动剂的化合物。优选地，该组合物基本上由或由包含TLR2激动剂的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组成。
在本发明的任何方面，将该化合物或组合物施用于呼吸道。典型地，将该化合物或组合物施用于上呼吸道和/或下呼吸道。例如，该化合物或组合物可以通过吸入或经鼻内施用给受试者。
在本发明的任何方面，向受试者施用该TLR2激动剂降低受试者中的病毒载量。优选地，该病毒载量在呼吸道例如上呼吸道和/或下呼吸道中降低。优选地，该病毒载量在肺中降低。
在本发明的任何方面，向受试者施用该TLR2激动剂降低CXCL1或TNFα的水平。
在本发明的任何方面，治疗或预防病毒介导的哮喘恶化不会显著诱导干扰素表达。
在本发明的任何方面，该受试者患有轻度或中度哮喘。哮喘可能发作于儿童或成人。哮喘患者可具有如图12a所示的任何病症特征。
在本发明的任何方面，该化合物或组合物可以与皮质类固醇一起施用。具体地讲，本发明的任何方法或用途可进一步包括施用皮质类固醇。该化合物或组合物可以与该皮质类固醇同时或按顺序施用。在一个实施例中，该化合物或组合物可在施用该皮质类固醇之前的24小时或7天期间施用一次、两次或更多次。
在本发明的任何方面，施用该化合物或组合物的受试者可能正在接受或已经接受皮质类固醇。
在本发明的任何方面，该皮质类固醇可以是糖皮质激素。优选地，该糖皮质激素是糖皮质激素受体的激动剂、部分激动剂或别构调节剂。优选地，该糖皮质激素是可吸入的糖皮质激素。甚至更优选地，该糖皮质激素是布地奈德、赛克罗西奈德(ciclosenide)、莫米松、倍氯米松、倍他米松、地塞米松、泼尼松龙、泼尼松或本文所述的任何其他糖皮质激素，诸如丙酸氟替卡松。
在另一方面，本发明还提供了一种组合物，该组合物包含：包含TLR2激动剂的化合物和皮质类固醇、基本上由其组成、或由其组成。
优选地，该化合物是本文所述的任一种，甚至更优选地是INNA-001至INNA-015中的任一种。
优选地，该皮质类固醇是糖皮质激素。优选地，该糖皮质激素是糖皮质激素受体的激动剂、部分激动剂或别构调节剂。优选地，该糖皮质激素是可吸入的糖皮质激素。甚至更优选地，该糖皮质激素是布地奈德、赛克罗西奈德(ciclosenide)、莫米松、倍氯米松、倍他米松、地塞米松、泼尼松龙、泼尼松或本文所述的任何其他糖皮质激素，诸如丙酸氟替卡松。
在这方面，该组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。典型地，该稀释剂、载体或赋形剂适于吸入或鼻内递送。
在一个实施例中，该组合物中仅有的活性剂是包含TLR2激动剂的化合物和皮质类固醇。
该组合物可以被配制成或适于施用于呼吸道，例如上呼吸道或下呼吸道。优选地，该组合物被配制成或适于吸入或鼻内施用。在一个实施例中，该组合物是吸入剂组合物并被配制成适用于干粉吸入器装置的干粉。替代性地，该组合物可以被配制成喷剂、雾剂或气雾剂。
在优选的实施例中，该组合物被配制成喷鼻剂或滴鼻剂。
在一方面，本发明提供了一种化合物，该化合物包含以下结构：
A-Y-B
其中A包含以下项或由以下项组成：
其中每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
Y为
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
并且
B包含聚乙二醇(PEG)或由聚乙二醇(PEG)组成，
或其药学上可接受的盐或前药。
本发明还提供了一种包含Pam2Cys和PEG的化合物，其中Pam2Cys和PEG通过丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸或磷酸丝氨酸残基连接，
其中
该化合物中的Pam2Cys具有以下结构：
在一方面，本发明提供一种化合物，该化合物包含：
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
与聚乙二醇(PEG)共价连接，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一方面，本发明提供了式(I)的化合物：
其中
n为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
q为零或1；
R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施例中，本发明提供了式(II)的化合物：
A-Y-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(II)
其中
A具有以下结构：
Y为
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
n为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施例中，该化合物具有式(III)：
Pam2Cys-Y-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(III)
其中
Pam2Cys具有以下结构：
Y为：
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
n为3至100；
m为1、2、3或4；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q＝1时，R3为H、-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施例中，该化合物具有式(IV)：
Pam2Cys-Ser-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(IV)
其中
Pam2Cys-Ser具有以下结构：
n为3至100；
m为1、2、3或4；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施例中，该化合物具有式(V)：
其中
n为3至100；
k为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
t为2、3或4；
h为1、2、3或4；
q为零或1；
R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个优选的实施例中，该化合物具有化合物(1)的结构：
或其药学上可接受的盐或前药。
该化合物在本文中也可称为‘Pam2Cys-Ser-PEG’或‘INNA-006’。
在其他优选的实施例中，该化合物选自由以下项组成的组：
/>
以及
在一个特别优选的实施例中，该化合物是：
如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含”及该术语的变型诸如“包括”和“含有”并不旨在排除进一步的添加物、组分、整体或步骤。
前述段落中所述的本发明的进一步方面和这些方面的进一步实施例将从以举例方式给出并参考附图的以下描述中变得清楚。
附图说明
图1：用高剂量TLR-2激动剂处理在感染后2天减少病毒RNA。(a)示意图，示出了使用代表性TLR-2激动剂PEG-Pam2Cys-R4或Pam2Cys-R4的处理方案。(b)对病毒RNA的定量，示出了代表性TLR-2激动剂PEG-Pam2Cys-R4和Pam2Cys-R4在RV感染的小鼠中在指示的剂量下减少病毒RNA。在感染后第2天采集肺，提取总RNA并通过qPCR测量病毒RNA。当通过单因素方差分析评估时，与盐水处理的RV感染小鼠相比，平均值+/-SEM****p<0.0001，**p<0.01减少了病毒RNA。
图2：在用RV感染小鼠前7天用高剂量TLR-2激动剂处理的有效抗病毒作用。(a)示意图，示出了使用代表性TLR-2激动剂PEG-Pam2Cys-R4或Pam2Cys-R4的处理方案。(b)在存在代表性TLR-2激动剂PEG-Pam2Cys-R4或Pam2Cys-R4的情况下，与盐水处理的RV感染对照相比，所有剂量的激动剂处理均导致病毒载量的高度显著降低。感染后两天通过qPCR测量肺中的病毒RNA。当通过单因素方差分析测量时，与盐水处理的RV感染小鼠相比，****p<0.0001减少了病毒RNA。
图3：在用RV感染小鼠前7天用高剂量TLR-2激动剂处理时的气道细胞炎症表达。(a-b)感染后第2天对支气管肺泡灌洗(BAL)细胞的分析表明，所有处理均显著增加了免疫细胞(其中大部分是巨噬细胞)的总数量。在较低激动剂处理剂量下观察到淋巴细胞数量增加。在感染后2天，对BAL中的炎症细胞进行计数，并通过差异染色鉴定群体。与盐水处理的RV感染小鼠相比，处理组中的平均值+/-SEM**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001增加了BAL细胞。
图4：在RV感染前七天用高剂量TLR-2激动剂处理抑制炎症细胞因子的表达。通过ELISA测量支气管肺泡灌洗(BAL)中的炎症细胞因子。(a)与盐水处理的RV感染小鼠相比，所有处理组均观察到中性粒细胞募集趋化因子CXCL1的产生显著减少。(b)与盐水处理的RV感染小鼠相比，以及响应于1nmol Pam2Cys-R4，较高剂量的激动剂处理组还观察到TNFα的表达降低。当通过单因素方差分析评估时，与盐水处理的RV感染小鼠相比，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01降低了蛋白质水平。
图5：低剂量PEG-Pam2Cys-R4处理降低病毒载量。(a，b)所有剂量的PEG-Pam2Cys-R4均显著抑制了RV复制。与未处理的盐水RV感染对照相比，指示剂量的Pam2Cys-R4还引起了病毒RNA的显著减少。在感染后2天通过qPCR评估肺组织中的病毒RNA。当通过单因素方差分析评估时，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01。
图6：用低剂量TLR-2激动剂处理增加了BAL巨噬细胞和淋巴细胞。(a，d)与未处理的盐水RV感染对照相比，用指示剂量处理后，Pam2Cys-R4引起免疫细胞数量的显著增加。(b，e)增加的BAL细胞主要由数量增加的巨噬细胞驱动。(c，f)在指示剂量下还观察到淋巴细胞数量的显著增加。在感染后2天将细胞染色并计数。当通过单因素方差分析评估时，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图7：低剂量TLR-2激动剂处理减少病毒性中性粒细胞炎症。(a-b)在指示剂量下还观察到表示为总BAL细胞或总中性粒细胞数量的百分比的中性粒细胞显著减少。在感染后2天，将中性粒细胞通过差异染色鉴定，并表示为总BAL细胞的百分比。(c)与盐水处理的RV感染小鼠相比，当表示为总BAL细胞的绝对数量时，观察到指示剂量下中性粒细胞数量的显著降低。平均值+/-SEM，*＝P<0.05。
图8：低剂量TLR-2激动剂处理引起中性粒细胞趋化因子CXCL1的高度显著降低。(a，b)与未处理的盐水RV感染对照相比，响应于所有剂量的Pam2Cys-R4和PEG-Pam2Cys-R4，观察到CXCL1表达的高度显著降低。(c，d)处理对TNFα产生没有影响。在感染后2天通过ELISA测量BAL中的蛋白质介质。当通过单因素方差分析评估时，平均值+/-SEM****p<0.0001。通过霍尔姆-斯达克(Holm-Sidak)检验评估多重比较。
图9：对在感染前7天用(i)Peg-SS-Pam2Cys、Peg-S-Pam2Cys和Pam2CysSK4与(ii)INNA-011和Peg-S-Pam2Cys(INNA-006)进行的处理的比较(剂量范围1pmol-10pmol)(a)TLR2激动剂处理引起肺中RV1B拷贝数量的高度显著减少。在感染后第2天通过qPCR评估肺组织中的病毒RNA。当通过单因素方差分析评估时，与未处理的(盐水)RV感染对照(vRNA拷贝数量)、10pmol Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys(鼻病毒减少组)、或2pmol INNA-011相比，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01，***p＝0.001，****p<0.0001减少了病毒RNA。(b)通过TLR激动剂处理，BAL白细胞未显著增加。在感染后2天，通过台盼蓝排除染料在血球计上评估总BAL白细胞。使用单因素方差分析评估平均值+/-SEM。(c)炎症细胞分析表明，当通过单因素方差分析评估时，Peg-S-Pam2Cys和INNA-011减少了RV诱导的BAL中性粒细胞炎症。对细胞进行差异染色并通过光学显微镜计数。与盐水/RV1B相比，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.001显著不同的细胞数量。(d-e)用TLR-激动剂处理减少了BAL CXCL1但未改变TNF-α的水平。在感染后第2天通过ELISA测量BAL中的蛋白质介质。通过单因素方差分析，与盐水RV组相比，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001减少了CXCL1。
图10：组合药物定时相互作用和对感染的影响(a-b)在不同的时间点和施用时间的组合下，TLR2激动剂处理引起肺中RV1B拷贝数量的显著减少。在感染后第2天通过qPCR评估肺组织中的病毒RNA。通过单因素方差分析，与未处理的(盐水)RV1B感染对照(除非另有说明)相比，平均值+/-SEM*p<0.05，****p<0.0001减少了病毒RNA。(c-d)通过TLR2激动剂处理，BAL中性粒细胞和淋巴细胞显著增加。感染后2天对BAL细胞进行差异染色。与盐水第-7天+第-1天/模拟物相比，平均值+/-SEM#p<0.05，###p<0.001，####p<0.0001。通过单因素方差分析，与盐水第-7天+第-1天/RV1B组相比(除非另有说明)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001显著不同的细胞数量。(e-f)通过TLR2激动剂处理，BAL白细胞显著增加。在感染后2天，通过台盼蓝排除染料在血球计上评估总BAL白细胞，并通过差异细胞计数评估BAL巨噬细胞。通过单因素方差分析，与盐水第-7天+第-1天/模拟物相比，平均值+/-SEM，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。(g-h)在第-1天用TLR2-激动剂处理增加了RV感染小鼠中的BAL CXCL1，但在第-7天的预先处理没有增加。在感染后第2天通过ELISA测量BAL中的蛋白质介质。通过单因素方差分析所确定，除非另外示出，否则与盐水RV组相比，平均值+/-SEM****p<0.0001。
图11：在RV感染期间的研究1G处理(a)在已确立的感染期间用Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys处理减少了肺中的RV1B拷贝数量。用RV1B经鼻内感染小鼠，并在第二天经鼻内施用Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys。在感染后第2天通过qPCR评估肺组织中的病毒RNA。与未处理的(盐水)RV1B感染组相比，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01减少了病毒RNA。(b-e)在活性感染期间(感染后第1天)用Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys处理显著增加了BAL中的中性粒细胞数量。感染后2天对BAL细胞进行差异染色。结果绘制为平均值+/-SEM。通过单因素方差分析，与盐水RV组相比，***p<0.001，****p<0.0001显著不同的细胞数量。(f-g)在感染后第1天用Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys处理引起剂量依赖性炎症细胞因子产生。在感染后第2天通过ELISA测量BAL中的蛋白质介质。结果绘制为平均值+/-SEM。通过单因素方差分析，与盐水RV组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图12：TLR-2激动剂处理降低哮喘上皮细胞中鼻病毒复制的水平。(a)患有轻度持续性或中度持续性哮喘的受试者的患者概况。从这些哮喘供体的支气管上皮细胞制备哮喘上皮气液界面(ALI)培养物，用鼻病毒(RV)感染并用Pam2Cys-R4处理；(b)RV感染前24小时(预处理)，其中在0.02μM下，Pam2Cys-R4在96小时后显著降低了病毒载量；或(c)RV感染后2小时(后处理)，其中在0.2μM下，Pam2Cys-R4在96小时后显著降低了病毒载量。纯化总细胞RNA，并在感染后48小时和96小时通过qRT-PCR测量病毒RNA的水平。当通过配对t检验评估时，与RV组相比，平均值+/-SEM*＝p<0.05。
图13：减少的病毒复制与减少的干扰素产生有关。在(a，b)n＝5(IFNβ)或(c，d)n＝6(IFNλ)哮喘上皮气液界面(ALI)培养物中通过ELISA测量顶部培养基中IFNβ和IFNλ1/3蛋白的水平，该哮喘上皮气液界面培养物用鼻病毒(RV)感染并在之前(预处理)或之后(后处理)用指定浓度的Pam2Cys-R4处理。数据平均值+/-SEM。对于指示的时间点，将所有p值单独地与RV感染进行比较。当通过弗里德曼(Friedman)检验评估时，*p<0.05，**p<0.01。
图14：TLR-2激动剂可以增加促炎介质的表达。(a，b)IP-10(CXCL10)、(c，d)IL-6、(e，f)IL-8和(g，h)CCL22蛋白的水平表示为n＝6哮喘上皮培养物的平均值+/-SEM，通过ELISA测量。与未处理的RV感染细胞相比，经Pam2Cys-R4处理的RV感染细胞p<0.05、**p<0.01增加了介质表达；当使用弗里德曼检验评估时，与未处理的细胞相比，经Pam2Cys-R4处理的细胞#p<0.05、##p<0.01增加了介质表达。
图15：TLR2激动剂和Pam2CSK4的抗病毒活性(a-b)在ALI中培养BCi-NS1细胞以实现分化。然后用浓度范围为20nM至0.2nM的Pam2Cys-R4(INNA-001)、Peg-SS-Pam2Cys(INNA-003)、Peg-S-Pam2Cys(INNA-006)或Pam2CSK4对细胞进行预处理。在处理后24小时，用moi0.1的RV1B感染细胞并在感染后96小时收获。提取总RNA并使用随机六聚体引物将其逆转录成cDNA。通过qPCR评估病毒载量，并将其表示为拷贝数和RV(未处理)孔中病毒RNA的百分比。与RV(未处理)组相比，*p<0.05，**p<0.01降低了病毒RNA。n＝2-5个平行孔。
图16：INNA-006预防RV诱导的和类固醇抵抗的中性粒细胞炎症。对细胞进行差异染色并通过光学显微镜计数。与盐水Veh PBS(单行星号)、盐水Veh RV(双层星号的底部)或盐水FP RV(双层星号的顶部)RV相比，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001增加了BAL细胞。单因素方差分析。
图17：INNA-006抑制了RV诱导的、类固醇抵抗的中性粒细胞趋化因子产生。在感染后第2天通过ELISA测量BAL中的CXCL1蛋白质水平。与盐水Veh PBS(黑色星号)、盐水Veh RV(红色星号)、盐水FP RV(蓝色星号)相比，****p<0.0001增加了介质。单因素方差分析。
图18：在媒介物对照小鼠中通过FP处理增加了肺部病毒载量，但FP增强了重复INNA-006处理的抗病毒功效。在感染后第2天采集肺，提取总RNA并通过qPCR测量病毒RNA。与盐水Veh RV(单或双星号)或盐水FP RV(线上方的星号)相比，平均值+/-SEM*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001增加了BAL细胞。与盐水Veh RV组相比，#p<0.05增加了病毒载量。单因素方差分析。
图19.各种化合物在基于NF-κB细胞的报告基因系统中刺激萤光素酶活性的能力的比较。从左到右的柱为：INNA-006(或化合物(1))；INNA-013(或化合物(4))；INNA-014(或化合物(3))；INNA-015(或化合物(2))；INNA-010；INNA-011(或化合物(5))；INNA-012(或化合物(6))；以及INNA-009。
图20：INNA-006或Pam3Cys-Ser-PEG3000在基于NF-κB细胞的报告基因系统中刺激萤光素酶活性的能力的比较。
图21：指示INNA-006特异性激活TLR-2的代表性数据。
具体实施方式
应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。所有这些不同组合构成本发明的多个可替代方面。
现在将详细地参照本发明的某些实施例。虽然本发明将结合实施例来进行描述，但是应当理解的是，不意图将本发明限于那些实施例。相反，本发明意图涵盖可以包括在如权利要求书所限定的本发明的范围内的所有替代方案、修改方案以及等效方案。
本领域技术人员应认识到类似于或等同于本文所述的那些的可以在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。所有这些不同组合构成本发明的多个可替代方面。
本文提及的所有专利和公开物均通过援引以其全文并入本文。
出于解释本说明书的目的，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。
病毒性呼吸道感染是呼吸道恶化(例如哮喘恶化)最重要的诱因。哮喘患者容易受到通常引起普通感冒的病毒诸如鼻病毒(RV)的更严重影响。气道上皮中的病毒复制导致炎症介质的产生，这些炎症介质可能触发加剧哮喘恶化的免疫级联反应。发明人假设通过施用有效量的TLR2激动剂激活先天上皮免疫和/或其他细胞内细胞信号传导机制将抑制RV复制和炎症介质的相关产生。发明人首先通过在RV感染的体内模型中在用RV处理之前施用许多不同剂量的TLR2激动剂来检验该假设。通过测量包括体重减轻、病毒载量和炎症介质的表达的参数来评估。在该研究中，发明人发现施用TLR2激动剂未引起体重减轻，但降低了肺病毒载量并减少了病毒诱导的炎症。
发明人在来自哮喘患者的支气管上皮的离体气液界面(ALI)培养物的治疗模型中进一步检验了上述假设。在该模型中，施用TLR2激动剂在用RV感染上皮之前或之后进行。发明人发现用TLR2激动剂刺激降低了哮喘支气管上皮中的病毒载量。
本发明一个方面的优点是如下令人惊讶的发现：在确立RV感染时用TLR2激动剂处理使得RV感染受到抑制。因此，本发明特别适用于被诊断为患有呼吸道感染和在临床上已被诊断为患有呼吸道病症(诸如哮喘)和/或有呼吸道恶化倾向的受试者。本发明一个方面的另一个优点是如下令人惊讶的发现：用较低剂量的TLR2激动剂处理至少与所测试的较高剂量的TLR2激动剂一样有效(如果不是更有效的话)。因此，本发明特别适用于需要或期望低水平激活先天免疫系统的应用。本发明一个方面的另一个优点是如下令人惊讶的发现：TLR2激动剂PEG-Pam2Cys-R4在RV介导的感染模型中展示出优异的抗病毒和抗炎作用。具有类似功能特征的激动剂因此可能在抑制RV介导的感染并因此在预防和/或治疗哮喘恶化方面展示出类似的特性。本发明一个方面的又一个优点是如下令人惊讶的发现：本文所述的抗病毒反应不依赖于IFN介导的反应。这是重要的，因为干扰素表达是极其多变的，特别是在更严重的哮喘形式中，并且依赖于IFN的调节的治疗机制可能并不可靠并因此存在没有治疗效果或诱导过度炎症的问题。
Toll样受体(TLR)是由在先天免疫和适应性免疫中均起重要作用的不同细胞类型表达的模式识别受体(PRR)。先天免疫系统的细胞通过产生促炎细胞因子和趋化因子来响应TLR激活，这些促炎细胞因子和趋化因子发送清除病原体和受损自身的信号。与特定配体接合后，TLR激活通过包括髓样分化初级反应基因88(MyD88)、含有Toll-白介素1受体(TIR)结构域的衔接子蛋白TIRAP和含有TIR结构域的衔接子诱导干扰素-βTRIF的几种衔接子分子引起转录因子诸如核因子κB(NF)-kB、激活蛋白-1(AP-1)和干扰素调节因子(IRF)的激活，从而调节细胞因子表达。
存在许多属于该膜受体蛋白质家族的TLR，包括TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。
如本文所用，术语“TLR2”旨在意指Toll样受体2蛋白质。在人类中，TLR2由TLR2基因编码。TLR2在某些细胞的表面上表达，并在病原体识别和先天免疫激活中起基础性作用。
TLR2激动剂是结合Toll样受体2的药剂。TLR2激动剂可以作为同二聚体或异二聚体结合并激活TLR2。
在本发明的任何实施例中，TLR2激动剂包括脂质、肽聚糖、脂蛋白或脂多糖。优选地，该TLR2激动剂包括棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、月桂酰、辛酰或癸酰。该TLR2激动剂可以选自由以下项组成的组：Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys和Oct2Cys。在优选的实施例中，TLR2激动剂包括Pam2Cys。
根据本发明任何实施例的示例性脂肽是脂肽“Pam2Cys”。本领域技术人员应当理解，术语“脂肽”意指包含缀合的一个或多个脂质部分和一个或多个氨基酸序列的任何物质组合物。已合成了Pam2Cys(也称为二棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸或S-[2,3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸)，并且其对应于MALP-2的脂质部分，MALP-2是从(Mycoplasmafermentans)中分离的巨噬细胞活化脂肽。Pam2Cys被认为是TLR2的配体。
Pam2Cys具有以下结构：
如本文所用，对上述化学结构中表示的“S”的提及定义硫原子。
另一种示例性脂肽是脂氨基酸N-棕榈酰基-S-[2,3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸，也称为Pam3Cys，或者Pam3Cys-OH是跨越革兰氏阴性细菌的内膜和外膜的博朗脂蛋白(Braun's lipoprotein)的N-末端部分的合成形式，Pam3Cys具有以下结构：
美国专利号5,700,910描述了用作脂肽制备中的中间体的几种N-酰基-S-(2-羟烷基)半胱氨酸，这些脂肽用作合成佐剂、B淋巴细胞刺激剂、巨噬细胞刺激剂或合成疫苗。US5,700,910还传授了此类化合物作为中间体在合成Pam3Cys-OH和在N-末端包含该脂氨基酸或其类似物的脂肽中的用途。
可用于靶向细胞表面TLR的其他脂质部分包括棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、月桂酰、辛酰或癸酰。
除了Pam2Cys和Pam3Cys之外，本发明还设想了根据本发明使用Ste2Cys、Lau2Cys和Oct2Cys。本领域技术人员应当知道，Ste2Cys也称为S-[2,3-双(硬脂酰氧基)丙基]半胱氨酸或二硬脂酰基-S-甘油基-半胱氨酸；Lau2Cys也称为S-[2,3-双(月桂酰氧基)丙基]半胱氨酸或二月桂酰基-S-甘油基-半胱氨酸；并且Oct2Cys也称为S-[2,3-双(辛酰氧基)丙基]半胱氨酸或二辛酰基-S-甘油基-半胱氨酸。
其他合适的TLR2激动剂包括但不限于合成的三酰化和二酰化脂肽、FSL-1(衍生自唾液支原体(Mycoplasma salivarium)1的合成脂蛋白)、Pam3Cys(三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸)和S-[2,3]-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸，其中“Pam3”是“三棕榈酰基-S-甘油基”。Pam3Cys的衍生物也是合适的TLR2激动剂，其中衍生物包括但不限于：S-[2,3-双(棕榈酰氧基)-(2-R,S)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4-羟基三氢氯化物、Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala、Pam3Cys-Ser-(Lys)4、Pam3Cys-Ala-Gly、Pam3Cys-Ser-Gly、Pam3Cys-Ser、Pam3Cys-OMe、Pam3Cys-OH、PamCAG、棕榈酰基-Cys((RS)-2,3-二(棕榈酰氧基)-丙基)-Ala-Gly-OH等。
合适的TLR2激动剂的其他非限制性实例是Pam2CSK4，Pam2CysSK4(二棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸-丝氨酸-(赖氨酸)4、或Pam2Cys-Ser-(Lys)4)是合成的二酰化脂肽。其他合成的TLR激动剂包括例如在以下文献中描述的那些：Kellner等人(1992)Biol.Chem.[生物化学杂志]373:1:51-5；Seifer等人(1990)Biochem.J[生物化学杂志]26:795-802；以及Lee等人(2003)J.Lipid Res.[脂质研究杂志]44:479-486。
TLR2激动剂可以与一种或多种化合物或官能团缀合。以下给出了具体化合物或官能团的实例。一种形式的化合物或官能团可用于增加TLR2激动剂的溶解度。如本领域技术人员所理解的，TLR2激动剂典型地是非极性的，因此，虽然可溶于非极性溶剂，但在极性溶剂和水性溶剂中仅有少量溶解。当期望在极性溶剂或水性溶剂中使用TLR2激动剂时，可将TLR2激动剂与增溶剂缀合。
增溶剂可包括一种或多于一种增溶剂，该增溶剂可与TLR2激动剂缀合以改善TLR2部分的溶解度。增溶剂通常是增加TLR2部分在极性溶剂或水性溶剂中的溶解度的极性部分。
在本发明的任何方面，增溶剂可以是带正电荷的基团。本发明的带正电荷的基团包括但不限于穿膜肽、HIV Tat 48-60、HIV Rev 34-50、转运素(transportan)、寡聚精氨酸肽(直链和支链)、寡聚赖氨酸肽、红蝽素(pyrrrochoricin)、α-螺旋两亲模型肽、聚赖氨酸、鱼精蛋白、FL17、Magnafloc 1697，以及US 6,689,478和US 4,035,558中描述的聚阳离子化合物。
在本发明的又一个实施例中，增溶剂包含直链或支链肽、基本上由或由直链或支链肽组成。典型地，直链或支链肽包含带正电荷或带负电荷的氨基酸。带正电荷的氨基酸可以是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸或其组合。支链或直链肽可以包含至少一个赖氨酸或精氨酸残基。优选地，带电荷的氨基酸在末端，例如N-末端。支链肽可具有以下结构之一。
在上述结构中，X可独立地为带电荷的残基(带正电荷或带负电荷的残基)。优选地，带正电荷的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸或鸟氨酸。优选地，带负电荷的氨基酸是谷氨酸或天冬氨酸。
如本文所用，“PEG”是指聚合物化合物聚乙二醇。除非另有定义，否则提及'PEG'包括任何长度的环氧乙烷聚合物。提及PEG还包括取代的PEG。
可用作增溶剂的化合物或官能团可以是由“PEG”(或聚乙二醇)和极性多肽组成的组中的一种或多种，该极性多肽诸如为“R4”，一种超支化四精氨酸复合物；“H4”，一种超支化四组氨酸复合物；“H8”，一种含有组氨酸残基的直链肽；以及“E8”，一种含有谷氨酸残基的直链肽。还设想了其他直链和支链脂质增溶剂，包括含有谷氨酸残基的超支化肽(参见例如下文的“支链E8”)。在本发明的又一个实施例中，增溶剂包含PEG和由R4、H4、H8和E8(直链或支链的)组成的组中的一种或多种。R4、H4、H8和E8先前已在PCT/AU 2009/000469(WO/2010/115230)中有所描述，并且具有以下结构：
示例性R4
示例性H4
示例性H8/>
示例性E8
示例性支链E8
示例性PEG
以下是支链(结构1-5)和直链(结构6-8)免疫原性组合物的一些实例的示意图，这些免疫原性组合物在末端位置包含带正电荷(精氨酸，R；赖氨酸，K)或带负电荷(天冬氨酸，D；谷氨酸，E)的氨基酸，使得它们各自的静电荷显示在环境中。每种免疫原性组合物还含有二棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸(Pam2Cys)，它是Toll样受体2的配体。还掺入了两个丝氨酸残基(Ser)。就构建体2而言，肽结构在N→C方向上组装，图中所示的所有其他结构在C→N方向上组装。根据电荷的大小，正静电电荷和负静电电荷示为2-、2+、1-、1+等。Ac＝就位于N-末端的谷氨酸而言用于抑制α氨基的正电荷的乙酰基。
本领域的技术人员应当理解，本发明不限于可用作增溶剂的特定示例性化合物或官能团，并且其他合适的化合物或官能团(包括可用作本领域已知的增溶剂的那些)也可以根据本发明使用，诸如碳水化合物。
一种或多种化合物或官能团(诸如增溶剂)根据本发明可与脂质缀合的方式对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，设想了经由Fmoc化学、通过二硫化物或硫醚桥或经由肟化学进行缀合。在本发明的特定实施例中，通过向Pam2Cys添加O-(N-Fmoc-2-氨基乙基)-O'-(2-羧乙基)-十一乙二醇(Fmoc-PEOn-OH，默克有限公司(Merck Ltd))制备可溶形式的Pam2Cys。这导致形成聚乙二醇化形式的脂质Pam2Cys-PEG11，它然后适合施用于受试者。
在本发明的另一种形式中，TLR2部分包含缀合物，该缀合物包含与悬垂R4形式缀合的Pam2Cys。在优选的形式中，根据以下结构，悬垂-Pam2Cys与R4缀合：
在根据本发明的任何实施例的优选形式中，TLR2部分包含缀合物，该缀合物包含与PEG缀合的Pam2Cys。在根据本发明的任何实施例的优选形式中，TLR2部分包含缀合物，该缀合物包含与PEG11或PEG12缀合的Pam2Cys。优选地，Pam2Cys与PEG11或PEG12分子被至少两个丝氨酸分开(PEG11-SS-Pam2Cys或PEG12-SS-Pam2Cys)。
如本文所用，提及TLR2激动剂还包括其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物或前药。
包含可用于本发明的任何方面的TLR2激动剂的其他化合物如下所述。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物包含以下结构：
A-Y-B
其中A包含以下项或由以下项组成：
其中每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
Y为
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
并且
B包含聚乙二醇(PEG)或由聚乙二醇(PEG)组成，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物包含Pam2Cys和PEG，其中Pam2Cys和PEG通过丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸或磷酸丝氨酸残基连接，
其中
该化合物中的Pam2Cys具有以下结构：
在一方面，本发明提供一种化合物，该化合物包含：
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
与聚乙二醇(PEG)共价连接，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(I)的化合物：
其中
n为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
q为零或1；
R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(II)的化合物：
A-Y-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(II)
其中
A具有以下结构：
Y为
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
n为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(III)的化合物：
Pam2Cys-Y-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(III)
其中
Pam2Cys具有以下结构：
Y为：
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
n为3至100；
m为1、2、3或4；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q＝1时，R3为H、-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(IV)的化合物：
Pam2Cys-Ser-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(IV)
其中
Pam2Cys-Ser具有以下结构：
n为3至100；
m为1、2、3或4；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施例中，该化合物具有式(V)：
其中
n为3至100；
k为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
t为2、3或4；
h为1、2、3或4；
q为零或1；
R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
其中当q＝1时，R3为-NH2或-OH；
其中当q＝0时，R3为H；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个优选的实施例中，该化合物具有化合物(1)的结构：
或其药学上可接受的盐或前药。
该化合物在本文中也可称为“Pam2Cys-Ser-PEG”或“INNA-006”。
在其他优选的实施例中，该化合物选自由以下项组成的组：
/>
以及
/>
在一个特别优选的实施例中，该化合物是：
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(Ia)的化合物：
其中
n为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
q为零或1；
R1、R1’、R2和R2’独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R1’均不是H，并且R2和R2’均不是H；
其中当q为零时，R3为H；
其中当q为1时，R3为-NH2或-OH；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(IIa)的化合物：
A-Y-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(IIa)
其中
A具有以下结构：
Y为
其中R1、R1’、R2和R2’独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R1’均不是H，并且R2和R2’均不是H；
n为3至100；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q为零时，R3为H；
其中当q为1时，R3为-NH2或-OH；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(IIIa)的化合物：
Pam2Cys-Y-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(IIIa)
其中
Pam2Cys具有以下结构：
Y为
其中R1、R1’、R2和R2’独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R1’均不是H，并且R2和R2’均不是H；
n为3至100；
m为1、2、3或4；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q为零时，R3为H；
其中当q为1时，R3为-NH2或-OH；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(IVa)的化合物：
Pam2Cys-Ser-Ser-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3
(IVa)
其中
Pam2Cys具有以下结构：
n为3至100；
m为1、2、3或4；
p为2、3或4；
q为零或1；
R1、R1’、R2和R2’独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R1’均不是H，并且R2和R2’均不是H；
其中当q为零时，R3为H；
其中当q为1时，R3为-NH2或-OH；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在本发明的任何方面，包含TLR2激动剂的化合物是式(Va)的化合物：
其中
n为3至100；
k为3至100；
h为1、2、3或4；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
p为2、3或4；
t为2、3或4；
q为零或1；
R1、R1’、R2和R2’独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R1’均不是H，并且R2和R2’均不是H；
其中当q为零时，R3为H；
其中当q为1时，R3为-NH2或-OH；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
在一个实施例中，该化合物具有以下结构：
在本发明特别优选的实施例中，该化合物具有化合物(1a)的结构：
或其药学上可接受的盐或前药。
在其他优选的实施例中，该化合物选自由以下项组成的组：
/>
/>
作为本发明的化合物还包括上述化合物(1)至(6)或(1a)至(6a)的药学上可接受的盐或前药。
对于所有上述结构，如果存在，则优选一个或多个以下特征：
n在10-14之间，甚至更优选地，n为11。
n为3或5。
n在24-30之间，甚至更优选地，n为27。
k在24-30之间，甚至更优选地，k为27。
m为1-3，甚至更优选地，m为2。
h为1-3，甚至更优选地，h为2。
g在10-16之间，甚至更优选地，g在12-14之间，最优选地，g为14。
R1和R2中的一个为氢。
p为2。
t为2。
术语“药学上可接受的”可用于描述任何药学上可接受的盐、水合物或前药，或在向受试者施用时能够(直接或间接地)提供如本文所述的本发明化合物的任何其他化合物，或其药学上可接受的盐、前药或酯，或其活性代谢物或残留物。
合适的药学上可接受的盐可包括但不限于药学上可接受的无机酸诸如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨磺酸和氢溴酸的盐；或药学上可接受的有机酸诸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、软脂酸、油酸、月桂酸、泛酸、单宁酸、抗坏血酸和缬草酸的盐。
碱盐可包括但不限于与药学上可接受的阳离子诸如钠、钾、锂、钙、镁、锌、铵、烷基铵(诸如由三乙胺形成的盐)、烷氧基铵(诸如与乙醇胺形成的那些)形成的那些，以及由乙二胺、胆碱或氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸或组氨酸形成的盐。关于药学上可接受的盐的类型及其形成的一般信息是本领域技术人员已知的，并且如一般文本诸如“Handbook ofPharmaceutical salts”[药用盐手册]P.H.Stahl、C.G.Wermuth，第1版，2002，Wiley-VCH中所述。
在化合物是固体的情况下，本领域技术人员应当理解，本发明的化合物、药剂和盐可以以不同的晶体或多晶型形式存在，所有这些形式都在本发明和指定的化学式的范围内。
术语“多晶型物”包括如本文所述的本发明化合物的任何晶体形式，诸如无水形式、含水形式、溶剂化物形式和混合溶剂化物形式。
在适用的情况下，本文所述的本发明化合物旨在涵盖溶剂化形式以及非溶剂化形式的化合物。因此，本文所述的本发明化合物包括具有所示结构的化物，包括水合形式或溶剂化形式以及非水合形式和非溶剂化形式。
如本文所用，术语“溶剂化物”是指由溶质(在本发明中，本文所述的本发明化合物或其药学上可接受的盐、前药或酯)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。用于本发明目的的此类溶剂不可以干扰溶质的生物活性。合适的溶剂的实例包括但不限于水、甲醇、乙醇和乙酸。优选地，所用的溶剂是药学上可接受的溶剂。合适的药学上可接受的溶剂的实例包括但不限于水、乙醇和乙酸。最优选的是，所用的溶剂是水。
碱性含氮基团可用诸如以下试剂季铵化：低级烷基卤化物，诸如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯如硫酸二甲酯和硫酸二乙酯；等等。
如本文所述的化合物还包括同位素变型形式，诸如用氘取代氢。
本发明的化合物可以以光学活性形式和外消旋形式存在并分离。如本领域技术人员所理解的，本发明旨在涵盖具有本文所述的有用性质的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)和/或(Va)的化合物的任何外消旋、光学活性或立体异构形式，或其混合物。制备这些形式的方法(例如，通过重结晶拆分外消旋混合物、通过由光学活性起始物质合成、通过手性合成、或通过手性色谱分离)是本领域所熟知的。在一个优选的实施例中，对于下面用*示出的碳，本发明的化合物以外消旋混合物形式提供。在另一个优选的方面，本发明的化合物具有过量的L-构型的天然存在的氨基酸或仅具有L-构型的天然存在的氨基酸：
“前药”是可能不完全满足本文提供的化合物的结构要求的化合物，但在向受试者或患者施用后在体内被修饰，以产生如本文所述的本发明的化合物。例如，前药可以是如本文提供的化合物的酰化衍生物。前药包括其中羟基、羧基、胺基或巯基与下述任何基团键合的化合物，当向哺乳动物受试者施用时，该基团裂解以分别形成游离的羟基、羧基、氨基或巯基。前药的实例包括但不限于本文提供的化合物中的醇和胺官能团的乙酸酯(盐)、甲酸酯(盐)、磷酸酯(盐)和苯甲酸酯(盐)衍生物。本文提供的化合物的前药可以以这样的方式来制备：对化合物中存在的官能团进行修饰，使得修饰物在体内裂解以产生母体化合物。
前药包括其中氨基酸残基、或两个或更多个(例如，两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链与式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)和/或(Va)的化合物的游离氨基、和酰胺基共价连接的化合物。氨基酸残基包括通常由三个字母符号表示的20种天然存在的氨基酸，并且还包括4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链赖氨酸(demosine)、异锁链赖氨酸(isodemosine)、3-甲基组氨酸、正缬氨酸(norvlin)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和蛋氨酸砜。前药还包括其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯与式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(IVa)和/或(Va)的上述取代基或本文所述的其他结构共价键合的化合物。
术语“呼吸”是指通过包括鼻子、咽喉、喉、气管、支气管和肺的身体系统将氧气带入体内并排出二氧化碳的过程。
如本文所用，呼吸道包括上呼吸道和下呼吸道。典型地，上呼吸道包括鼻和鼻通道、鼻旁窦、咽，以及在声襞(声带)上方的喉部分。典型地，下呼吸道包括在声襞下方的喉部分、气管、支气管和细支气管。肺可包括在下呼吸道中或作为单独的实体并且包括呼吸细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡。
术语“呼吸道疾病”或“呼吸道病症”是指涉及炎症并影响呼吸系统组成部分的几种疾病中的任一种，该呼吸系统包括上呼吸道(包括鼻腔、咽和喉)和下呼吸道(包括气管、支气管和肺)。优选地，呼吸道疾病是阻塞性气道疾病，此类疾病包括：哮喘病症，包括花粉病、过敏原诱导的哮喘、运动诱导的哮喘、污染诱导的哮喘、感冒诱导的哮喘、压力诱导的哮喘和病毒诱导的哮喘；慢性阻塞性肺病，包括气流正常的慢性支气管炎、气道阻塞的慢性支气管炎(慢性阻塞性支气管炎)、肺气肿、哮喘性支气管炎和大疱性疾病；以及涉及炎症的其他肺病，包括囊性纤维化、养鸽者病(pigeon fancier's disease)、农民肺、急性呼吸窘迫综合征、肺炎、吸入或吸入性损伤、肺部脂肪栓塞、肺部酸中毒炎症、急性肺水肿、急性高山病、心脏手术后综合征、急性肺动脉高压、新生儿持续性肺动脉高压、透明膜病、急性肺血栓栓塞、败血症、哮喘持续状态和缺氧。上呼吸道和下呼吸道中的炎症可能与病毒感染或过敏原相关或者由病毒感染或过敏原引起。预期将化合物单独施用或与糖皮质激素共同施用时，其抗炎活性将使它们特别适合于治疗这些疾病或病症。
呼吸道疾病的症状可包括咳嗽、痰液过多、呼吸困难或胸闷，伴有可听到的喘息声。运动能力可能大大受限。在哮喘中，作为基于体重、身高和年龄通过诺谟图预测的值的百分比的FEV1.0(一秒用力呼气容积)可能降低，因为用力呼气时可能具有峰值呼气流速。在COPD中，作为FVC的比率的FEV1.0典型地降低至小于0.7。每种这些病症的影响也可以通过未去工作/上学的天数、睡眠不安、对支气管扩张剂药物的需要、对糖皮质激素(包括口服糖皮质激素)的需要来度量。
呼吸道疾病的存在、改善、治疗或预防可通过受试者的任何临床或生物化学相关方法或其活组织检查来确定。例如，所测量的参数可以是肺功能的存在或程度、阻塞的体征和症状；运动耐力；夜间觉醒；未去上学或工作的天数；支气管扩张剂的使用；ICS剂量；口服GC的使用；对其他药物的需要；对医学治疗的需要；入院。
如本文所用，术语“呼吸道感染”是指呼吸道中任何地方的感染。呼吸道感染的实例包括但不限于感冒、鼻窦炎、咽喉感染、扁桃体炎、喉炎、支气管炎、肺炎或细支气管炎。优选地，在本发明的任何实施例中，呼吸道感染是感冒。个体可通过病毒测试被确定为患有呼吸道感染，并且可能表现出眼睛发痒、流鼻涕、鼻塞、打喷嚏、咽喉痛、咳嗽、头痛、发烧、不适、疲劳和虚弱的症状。在一方面，患有呼吸道感染的受试者可能没有任何其他呼吸道病症。检测病毒(优选鼻病毒)的存在或量可以通过对从临床样品(洗鼻液、痰液、BAL)分离的RNA进行PCR/测序或通过血清学而进行。
与鼻病毒相关的呼吸道病症可能是由鼻病毒引起的病症。优选地，该病症与鼻病毒感染相关或由鼻病毒感染引起。鼻病毒感染可以通过取自受试者呼吸道的样品中存在鼻病毒来确定。通过血清学病毒测试或对从临床样品(洗鼻液、痰液、BAL)分离的RNA进行PCR/测序，可以将个体确定为患有RV感染。RV感染的症状包括但不限于咽喉痛、流鼻涕、鼻塞、打喷嚏和咳嗽；有时伴有肌肉酸痛、疲劳、不适、头痛、肌肉无力或食欲不振。
在本发明的任何实施例中，呼吸道感染由鼻病毒(RV)引起。如本文所用，术语“RV”是指包含任何单链正义RNA的小核糖核酸病毒，该单链正义RNA在5'区域具有基因组病毒编码的蛋白质和3'聚A尾。应当理解，病毒颗粒本身不是包膜的并且在结构上是二十面体。还应当理解，人鼻病毒由含有四种病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的衣壳组成。VP1、VP2和VP3形成蛋白质衣壳的主要部分。人鼻病毒的实例可包括以下任一种：统称为鼻病毒A病毒的HRV-A1、HRV-A2、HRV-A7、HRV-A8、HRV-A9、HRV-A10、HRV-A11、HRV-A12、HRV-A13、HRV-A15、HRV-A16、HRV-A18、HRV-A19、HRV-A20、HRV-A21、HRV-A22、HRV-A23、HRV-A24、HRV-A25、HRV-A28、HRV-A29、HRV-A30、HRV-A31、HRV-A32、HRV-A33、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A38、HRV-A39、HRV-A40、HRV-A41、HRV-A43、HRV-A44、HRV-A45、HRV-A46、HRV-A47、HRV-A49、HRV-A50、HRV-A51、HRV-A53、HRV-A54、HRV-A55、HRV-A56、HRV-A57、HRV-A58、HRV-A59、HRV-A60、HRV-A61、HRV-A62、HRV-A63、HRV-A64、HRV-A65、HRV-A66、HRV-A67、HRV-A68、HRV-A71、HRV-A73、HRV-A74、HRV-A75、HRV-A76、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A80、HRV-A81、HRV-A82、HRV-A85、HRV-A88、HRV-A89、HRV-A90、HRV-A94、HRV-A95、HRV-A96、HRV-A98、HRV-A100、HRV-A101、HRV-A102和HRV-A103；统称为鼻病毒B病毒的HRV-B3、HRV-B4、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-B26、HRV-B27、HRV-B35、HRV-B37、HRV-B42、HRV-B48、HRV-B52、HRV-B69、HRV-B70、HRV-B72、HRV-B79、HRV-B83、HRV-B84、HRV-B86、HRV-B91、HRV-B92、HRV-B93、HRV-B97和HRV-B99；以及统称为鼻病毒C病毒的HRV-C1、HRV-C2、HRV-C3、HRV-C4、HRV-C5、HRV-C6、HRV-C7、HRV-C8、HRV-C9、HRV-C10、HRV-C11、HRV-C12、HRV-C13、HRV-C14、HRV-C15、HRV-C16、HRV-C17、HRV-C18、HRV-C19、HRV-C20、HRV-C21、HRV-C22、HRV-C23、HRV-C24、HRV-C25、HRV-C26、HRV-C27、HRV-C28、HRV-C29、HRV-C30、HRV-C31、HRV-C32、HRV-C33、HRV-C34、HRV-C35、HRV-C36、HRV-C37、HRV-C38、HRV-C39、HRV-C40、HRV-C41、HRV-C42、HRV-C43、HRV-C44、HRV-C45、HRV-C46、HRV-C47、HRV-C48、HRV-C49、HRV-C50和HRV-C51。
在本发明的任何方面，TLR2激动剂的施用可以引发先天免疫反应。
在哮喘中，人鼻病毒与大多数哮喘恶化相关，目前对哮喘恶化的疗法还不充分。因此，在本发明的任何实施例中，提供了一种治疗或预防病毒介导的哮喘恶化的方法，该方法包括向受试者施用TLR2激动剂。优选地，病毒介导的恶化由鼻病毒感染引起。
如本文所用，术语“哮喘”是指呼吸障碍，其特征在于由以下三种主要因素中的任一种或以下三种主要因素的组合引起的偶发性呼吸困难：1)支气管痉挛(即，由于气道肌肉收缩引起的可变和可逆的气道阻塞)，2)气道内膜炎症，以及3)导致气道中粘液过多的支气管高反应性，这可能由接触一种过敏原或多种过敏原的组合(即，尘螨和霉菌)、病毒或细菌感染(即，普通感冒病毒)、环境污染物(即，化学烟气或烟雾)、身体过度劳累(即，运动期间)、压力或吸入冷空气而引发。个体可以被表征为患有例如过敏原诱发的哮喘、运动诱发的哮喘、污染诱发的哮喘、病毒诱发的哮喘或感冒诱发的哮喘。应当理解，哮喘会引起喘息(呼吸时发出哨声)、胸闷、呼吸短促和咳嗽反复发生。
如本文所用，术语“哮喘恶化”是指逐渐加剧的呼吸短促、咳嗽、喘息和胸闷或其任何组合的急性或亚急性发作，并且可伴有呼气流量减少。恶化的强度是可变的。有时症状很轻微，患者无法察觉，有时则是非常严重的危及生命的发作。在本发明的任何实施例中，优选的是，哮喘恶化由鼻病毒感染引起。
可通过确定FEV1或PEF及其对换气的反应，根据气流阻塞的程度确定个体患有哮喘恶化。应当理解，FEV1和PEF是用于评估呼气流量的测量值。取决于所获得的值，如果FEV1或PEF值分别等于或高于其理论值或个人最佳先前值的70％，则恶化将被认为是轻度的，如果FEV1或PEF测量值在70％至50％之间则是中度的，并且如果这些值低于50％则是严重的。据估计，当FEV1或PEF值高于预定值的45％且治疗开始后30分钟PEF增加至少50l/min时，对治疗的功能反应是令人满意的。最初的治疗气流阻塞反应是评估发作的关键预后因素。表1(J Investig Allergol Clin Immunol[变态反应与临床免疫学杂志]，第20卷，增刊，1:27-31(2010))概述了用于确定某人是否患有轻度或中度-重度哮喘恶化的那些诊断指标。
表1：哮喘恶化的严重度分类
缩略词：FEV1：第一秒用力呼气容积；PEF：呼气流量峰值；X'：每分钟；SaO2：氧合血红蛋白饱和度；PaO2：动脉血氧分压；PaCO2：动脉血二氧化碳分压。
在许多情况下，由鼻病毒感染引起的哮喘恶化可导致慢性阻塞性肺病(COPD)。因此，人鼻病毒与COPD相关，目前对COPD的治疗还不充分。因此，在本发明的任何实施例中，提供了一种治疗或预防病毒介导的COPD的方法，该方法包括向受试者施用TLR2激动剂。优选地，病毒介导的COPD由鼻病毒引起。优选地，该方法用于治疗或预防病毒介导的COPD恶化。
本文中可互换使用的术语“慢性阻塞性肺病”和“COPD”是指一种慢性障碍或多种障碍的组合，这些障碍的特征在于最大呼气流量减小和肺部用力排空缓慢，该症状在几个月内没有显著变化，并且使用传统支气管扩张剂是不可逆的或仅是最低限度可逆的。最常见的是，COPD是慢性支气管炎(即连续约两年存在咳嗽和痰液超过三个月)和肺气肿(即肺泡损伤)的组合。然而，COPD可能涉及具有正常气流的慢性支气管炎、具有气道阻塞的慢性支气管炎(慢性阻塞性支气管炎)、肺气肿、哮喘性支气管炎和大疱性疾病，以及它们的组合。慢性阻塞性肺病是通常但不仅仅是由接触烟草烟雾诱发的慢性肺损伤导致的病症。其他有害的空气污染物，诸如室内烹饪排气和汽车尾气可能会长期引起或增加COPD的风险。因此，COPD应当被理解为可与诸如“慢性支气管炎”和“肺气肿”的术语互换。
COPD的症状逐渐加剧，并且在运动时出现持续性呼吸困难，最终导致休息时出现呼吸困难。COPD最常见的症状是呼吸困难(或“需要空气”)、慢性咳嗽和痰液(粘液)产生。随着病症逐渐加剧，日常活动诸如走上一小段楼梯甚至日常例行活动都会变得非常困难。患者还经常出现恶化，即呼吸困难、咳嗽和痰液产生增加的严重发作，持续数天至几周。这些发作可能严重致残，并导致需要紧急医疗护理(包括住院治疗)，有时导致死亡。
经历上述症状的人通常被怀疑患有慢性阻塞性肺病，并且慢性阻塞性肺病可以通过称为“肺量测定法”的呼吸测试来确认，该肺活量测定法测量人可以用力呼出空气的量和速度。
呼吸道病毒也会加重囊性纤维化病情。例如，被诊断为患有囊性纤维化的受试者的病毒感染可能增加对细菌感染的易感性。因此，在本发明的任何实施例中，提供了一种治疗或预防病毒介导的囊性纤维化恶化的方法，该方法包括向受试者施用TLR2激动剂。优选地，病毒介导的恶化由鼻病毒感染引起。
应当理解，囊性纤维化是一种遗传性障碍，它影响呼吸、消化和生殖系统，涉及在肺中产生异常厚的粘液内膜，并且可能导致致命的肺部感染。应当理解，患有囊性纤维化的受试者可能表现出各种症状，包括皮肤非常咸，持续咳嗽，可能伴有痰，喘息或呼吸短促，胃口过大但体重增加缓慢，以及粪便油腻、大块。还应当理解，汗液测试是针对囊性纤维化的标准诊断测试。该程序测量汗液中的盐量。高盐水平表明患有囊性纤维化。
呼吸道病毒也会加重移植接受患者的疾病。例如，肺移植受者中的病毒感染可增加对肺炎、急性排斥反应和慢性同种异体移植物功能障碍的易感性。因此，在本发明的任何实施例中，提供了一种治疗或预防肺移植受者中病毒感染的方法，该方法包括向受试者施用TLR2激动剂。优选地，病毒感染是鼻病毒感染。
本发明还可用于在长期糖皮质激素使用的情况下恢复抗病毒免疫。应当理解，糖皮质激素是对糖皮质激素受体具有皮质醇样激动剂作用，从而产生一系列内分泌和抗炎作用的药剂。大多数患有严重哮喘和COPD的患者服用类固醇或糖皮质激素。在病毒恶化期间使用类固醇会延长病毒感染并增加对继发细菌感染的易感性。
因此，在本发明的任何实施例中，提供了一种治疗或预防用糖皮质激素治疗的受试者中的病毒感染的方法，该方法包括向受试者施用TLR2激动剂。优选地，病毒感染是鼻病毒感染。优选地，糖皮质激素施用是长期的。
如本文所用，“预防”或“防止”意指至少降低患上疾病或障碍的风险(或易感性)的可能性(即，使得在可能暴露于或易遭受该疾病但尚未患上或表现出该疾病的症状的患者体内不发展该疾病的临床症状中的至少一种)。本文提供了用于鉴定此类患者的生物学和生理学参数，并且这些参数也是医生所熟知的。例如，预防病毒诱导的呼吸道感染或病毒诱导的哮喘恶化可以通过病毒载量的降低或不存在、或炎症细胞介质或细胞因子增加的减少来表征。在一些实施例中，化合物的施用可以使感染的发展最小化从而使病毒载量最小化。优选地，这降低病毒载量。
在本发明的任何预防或防止方面，在施用化合物时，受试者可能没有任何可检测的病毒感染(特别是鼻病毒感染)症状。
术语“治疗”或“处理”受试者包括向受试者应用或施用本发明化合物(或向受试者的细胞或组织应用或施用本发明的化合物)，目的是延迟、减缓、稳定、治愈、愈合、减轻、缓解、改变、纠正、减少恶化、减轻、改善或影响疾病或病症、疾病或病症的症状、或者疾病或病症的风险(或易感性)。术语“治疗”是指成功治疗或改善损伤、病变或病症的任何迹象，包括任何客观或主观参数，诸如消除；缓解；减缓加剧的速度；减轻疾病的严重性；稳定、减轻症状或使受试者更能忍受损伤、病变或病症；减慢退化或衰退的速度；使退化终点不那么令人虚弱；或改善受试者的身体或心理健康。
呼吸道感染或恶化(例如哮喘恶化)的存在、改善、治疗或预防可通过本文所述或本领域已知的任何临床或生物化学相关方法来确定。相关方法可以是经由支气管肺泡灌洗(BAL)测量病毒载量、干扰素表达或炎症细胞数量，在支气管肺泡灌洗中，支气管镜穿过口腔或鼻子进入肺部并将流体喷射到肺的一小部分中然后收集以进行检查。改善或治疗或预防可直接从受试者或其样品或活检组织确定。样品或活检组织可以是上呼吸道或下呼吸道。此外，在呼吸道感染或哮喘恶化中，可以通过如本文所示的已知测定法诸如ELISA测量趋化因子和细胞因子的水平来确定对治疗的阳性反应。
此外，例如，在呼吸道感染或哮喘恶化中，对治疗的阳性反应将是防止肺功能的进一步下降，如通过肺量测定法、身体体积描记法和肺弥散量所测量。特别是对于哮喘恶化，对治疗的阳性反应将是从最初诊断的严重性(如表1中所概述)的改善。例如，当FEV1或PEF值高于预定值的45％且治疗开始后30分钟PEF增加至少50l/min时，被诊断为中度恶化(FEV1或PEF测量值在70％至50％之间)的受试者将显示对治疗的阳性反应。
对治疗的阳性反应还可以是预防或减轻呼吸道病毒感染后的呼吸症状的加剧，例如哮喘症状(恶化)。这可以通过比较根据Juniper哮喘控制问卷(ACQ-6)从基线到研究结束时疾病评分的平均变化来评估，并且也可以在感染/感冒症状发作后每天评估下呼吸道症状评分(LRSS-胸闷、喘息、呼吸短促和咳嗽的症状)。还可以评估从基线肺功能(呼气流量峰值PEF)的变化，并且对治疗的阳性反应可以是减小的PEF中的显著衰减。例如，安慰剂处理组在恶化达到峰值时将显示出早晨PEF显著减小15％，而治疗组显示出非显著的PEF减小，相比基线小于15％。
本发明还提供了一种改善或维持受试者在呼吸道病毒感染期间控制呼吸道疾病的能力的方法，该方法包括向受试者施用包含TLR2激动剂的化合物，从而改善受试者控制呼吸道疾病或呼吸道病毒感染的能力。优选地，该感染是鼻病毒感染。改善或维持控制呼吸道疾病的能力可以是受试者不需要对通常针对现有呼吸道疾病施用的治疗进行任何额外干预。换句话说，受试者所需的唯一治疗是通常针对潜在呼吸道病症进行(即，当受试者没有受到病毒感染时)的治疗和如本文所述的包含TLR2激动剂的化合物。
典型地，将治疗有效剂量配制成含有至少约0.1％直至约50％或更高的浓度(按重量计)，以及其中范围的所有组合和子组合。组合物可以被配制成含有一种或多种化合物或其药学上可接受的盐、多晶型物或前药，其浓度为从约0.1％至小于约50％(例如约49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％或40％)，包括从大于约0.1％(例如，约0.2％、0.3％、0.4％或0.5％)至小于约40％(例如，约39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％或30％)的浓度。示例性组合物可包含从约0.5％至小于约30％(例如，约29％、28％、27％、26％、25％、25％、24％、23％、22％、21％或20％)，包括从大于约0.5％(例如，约0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)至小于约20％(例如，约19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％或10％)的浓度。组合物可包含大于约1％(例如，约2％)至小于约10％(例如约9％或8％)，包括大于约2％(例如，约3％或4％)至小于约8％(例如，约7％或6％)的浓度。活性剂可以例如以约5％的浓度存在。在所有情况下，可以调整量以补偿实际递送至经处理的细胞或组织的活性成分的量的差异。
虽然本发明可用于人类中，但是本发明对于治疗性兽用目的也是有用的。本发明可用于家畜或农场动物，诸如牛、羊、马和家禽；宠物，诸如猫和狗；以及动物园的动物。
根据本发明的组合物以有效量施用。短语“治疗有效量”或“有效量”通常是指本发明的TLR2激动剂、其药学上可接受的盐、多晶型物或前药的起到以下作用的量：(i)治疗特定疾病、病症或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状，或(iii)延迟本文所述的特定疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发作。有时会出现不期望的效果(例如副作用)以及所需的治疗效果；因此，执业医生在确定什么是适当的“有效量”时，将对潜在益处与潜在风险进行平衡。
所需的确切量将因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄和一般状况、施用方式等。因此，可能无法指定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员仅使用常规实验即可确定任何个体情况下的适当“有效量”。在一方面，向受试者施用的剂量是降低病毒载量的任何剂量。优选地，该剂量不会显著增加炎症，例如不会显著增加肺中的绝对中性粒细胞数量或中性粒细胞占总BAL细胞的比例。
在一些实施例中，对于人受试者的有效量在约250nmol/kg体重/剂至0.005nmol/kg体重/剂的范围内。优选地，该范围为约250nmol/kg体重/剂至0.05nmol/kg体重/剂。在一些实施例中，体重/剂范围为约250nmol/kg至0.1nmol/kg、约50nmol/kg至0.1nmol/kg、约5nmol/kg至0.1nmol/kg、约2.5nmol/kg至0.25nmol/kg、或约0.5nmol/kg至0.1nmol/kg体重/剂。在一些实施例中，该量为或约为250nmol、50nmol、5nmol、2.5nmol、0.5nmol、0.25nmol、0.1nmol或0.05nmol/kg体重/剂的化合物。对剂量方案进行调整以适应紧急情况，并且可以调整以得到最佳治疗剂量。
如本文所述的TLR2激动剂可以是配制成吸入制剂的组合物，包括干粉、喷剂、雾剂或气雾剂。这对于治疗呼吸道感染可能是特别优选的。对于吸入制剂，本文提供的组合物或组合可以经由本领域技术人员已知的任何吸入方法递送。此类吸入方法和装置包括但不限于具有诸如CFC或HFA的推进剂或生理上和环境上可接受的推进剂的定量吸入器。其他合适的装置是呼吸操作吸入器、多剂量干粉吸入器和气雾剂雾化器。用于主题方法的气雾剂制剂典型地包含推进剂、表面活性剂和共溶剂，并且可以灌装到由合适的计量阀关闭的常规气雾剂容器中。
吸入剂组合物可以包括适于雾化和支气管内使用的含有活性成分的液体或粉末组合物，或经由分配计量剂量的气雾剂单元施用的气雾剂组合物。合适的液体组合物包含在水性、药学上可接受的吸入溶剂诸如等渗盐水或抑菌水中的活性成分。借助泵或挤压致动的雾化喷雾分配器或通过任何其他常规装置施用溶液，以促使或使得所需剂量的液体组合物被吸入患者的肺部。适于例如作为喷鼻剂或作为滴鼻剂而施用的制剂(其中载体是液体)包括活性成分的水性或油性溶液。替代性地，组合物可以是干粉并且可施用于如本文所定义的呼吸道。
应当理解，针对任何具体患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率、药物组合(即用于治疗患者的其他药物)以及正被治疗的具体障碍的严重性。
在另一个实施例中，提供了一种试剂盒或制品，该试剂盒或制品包含一种或多种如本文所述的TLR2激动剂、如上所述的药学上可接受的盐、稀释剂或赋形剂和/或药物组合物。该试剂盒可进一步包含如本文所述的皮质类固醇。此外，该试剂盒可包含用于如本文所述的本发明的任何方法或用途的说明。
在其他实施例中，提供了一种用于上述治疗和/或预防应用的试剂盒，该试剂盒包含：
-容纳如本文所述的一种或多种TLR2激动剂形式的治疗组合物、或药学上可接受的盐、稀释剂或赋形剂或药物组合物的容器；
-带有使用说明的标签或包装说明书。
在某些实施例中，试剂盒可含有用于治疗呼吸道病症的一种或多种其他活性要素或成分。
试剂盒或“制品”可包含容器和在该容器上或与该容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。这些容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳有效治疗病症的治疗组合物，并且可具有无菌进入孔(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装说明书指示治疗组合物用于治疗所选的病症。在一个实施例中，标签或包装说明书包括使用说明，并且指示治疗或预防组合物可用于治疗本文所述的呼吸道病症。
试剂盒可包含(a)治疗或预防组合物；以及(b)第二容器，其中含有第二活性要素或成分。本发明该实施例中的试剂盒可进一步包含包装说明书，该包装说明书指示组合物和其他活性要素可用于治疗障碍或预防源自本文所述的呼吸道病症的并发症。
应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。所有这些不同组合构成本发明的多个可替代方面。
应当理解，这些实例旨在说明本发明的这些和其他方面，尽管这些实例描述了本发明的某些实施例，但应当理解，这些实例不将这些实施例限制于这些方面。在不脱离上述本发明的方面和/或原理的情况下，可以做出各种改变、可以替换等同物并做出修改。所有这些改变、等同物和修改旨在落入本文所述的权利要求的范围内。
实例
如本文(包括以下实例)所用，以下化合物描述于下表中，并且具体结构如本文其他地方所示：
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实例1
在小鼠模型中抑制鼻病毒感染
进行该研究以确定TLR2激动剂对先天免疫系统的激活是否在小鼠鼻病毒感染期间减少病毒载量和病毒诱导的炎症。
动物
使用雌性6-8周龄的BALB/c小鼠进行所有研究。每组包含5只小鼠。在治疗或挑战程序之后，每天监测小鼠的体重变化以及行为或身体变化，如在项目A-2016-605的动物伦理批准中所规定。在采集样品时，所有小鼠均通过腹膜内施用戊巴比妥钠而处死。将所有小鼠圈养在HMRI Bioresources设施中的单独通风笼中，每只笼不超过四只小鼠。从每次研究开始每天观察小鼠并维护健康检查表。
小鼠外科手术和治疗
鼻病毒血清型1B最初从临床分离物中纯化，在RD-ICAM细胞中生长并如前所述进行纯化(Bartlett等人，Nat Med[自然医学](2008)14，199-204；Bartlett等人，MethodsMol Biol[分子生物学方法](2015)1221，181-188)。在II级生物安全柜内的诱导室中，在轻度异氟烷麻醉下向小鼠鼻内给药50μl激动剂分子。在TLR-2激动剂PEG-Pam2Cys-R4和Pam2Cys-R4后的指示时间，使用相同的程序经鼻内向小鼠施用含有5×106TCID50 RV1B的50μl。在感染后第2天，进行支气管肺泡灌洗(BAL)以对炎症细胞浸润进行计数并测量免疫介质蛋白质表达。收获肺的总RNA以评估病毒载量。先前已经开发了小鼠RV感染模型和相关技术(Bartlett等人，Nat Med[自然医学](2008)14，199-204；Bartlett等人，Methods MolBiol[分子生物学方法](2015)1221，181-188)。实验组如表2所示。
表2：实验组
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支气管肺泡灌洗(BAL)细胞分析
处死后，将小鼠气管插管并将1ml汉克氏缓冲盐水溶液(HycloneTM，GE生命科学公司(GE Life Sciences))冲洗通过气道3-5次。通过离心来沉淀BAL细胞，收集上清液并在-80℃下储存以用于ELISA。沉淀的细胞是经裂解的红细胞，通过台盼蓝排除法在血球计上对剩余的细胞计数。然后将细胞悬液细胞离心到载玻片上并固定，再用迪夫快速(DiffQuick)(POCD)溶液根据制造商的建议染色。计数得出每个载玻片至少200个总细胞，并测定中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的数量。
RNA提取和qRT-PCR
将来自每只小鼠的顶端肺叶收集到RNA-later(艾莫宾公司(Ambion))中。对于处理，将肺叶转移到RLT(凯杰公司(Qiagen))/2ME缓冲液中，通过TissueLyser II(凯杰公司)以25Hz进行组织解离，该过程进行两次，每次2分钟(样品旋转)。通过离心来沉淀细胞碎片，并使用miRNeasy试剂盒(凯杰公司)按照推荐的用于提取总RNA(包括来自动物和人细胞及组织的miRNA)的供应商方案手动提取RNA。提取后，使用分光光度计(Nanodrop)测定RNA浓度，将200ng RNA用于通过随机引物和RNA酶抑制剂(应用生物系统公司(AB,AppliedBiosystems))进行逆转录。然后使用TaqMan、FAM-TAMRA化学法(生命科技公司(LifeTechnologies))，用含有ROX(凯杰公司)的主混合物、表3中概述的引物和探针在ABI700上对cDNA进行qPCR分析。感兴趣的基因的Ct值参考已知浓度的七种标准品，这些标准品从107个拷贝开始并以1:10稀释系列进行。将所有感兴趣的基因的拷贝数量归一化为参考基因18s。
通过ELISA定量细胞因子
将剩余的肺叶在液氮中快速冷冻，通过TissueLyser II在含有蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche))的600μl PBS中以30Hz均化，运行两次，每次4分钟。通过离心来沉淀细胞碎片，将样品用PBS以1:2稀释并储存在-80℃下。然后通过Duoset ELISA(R&D系统公司(R&DSystems))根据制造商的说明分析BAL液的KC/IL-8(CXCL1)和TNF-α的产生。
表3.用于qPCR的引物和探针序列
对于从每只小鼠的顶端肺叶提取的RNA产生的cDNA，使用TaqMan化学以最佳的定制正向/反向引物比率进行qPCR分析，每个反应总体积为12.5μl。
统计分析
对于用盐水RV对照、Pam2Cys-R4或PEG-Pam2Cys-R4处理的小鼠队列之间的比较，进行单因素方差分析。P值<0.05被认为是显著的。
结果
如所示的(参见表2)，用一系列剂量的PEG-Pam2Cys-R4和Pam2Cys-R4经鼻内向小鼠总呼吸道给药(50μl)。处理后，用RV1B经鼻内感染小鼠。通过由对BAL炎症细胞的差异染色和对BAL液中蛋白质免疫介质的测量确定的病毒RNA和肺部炎症的qPCR分析来确定呼吸道中的病毒载量。
研究1A感染前1天的处理
在用RV经鼻内感染前一天，用指示量的PEG-Pam2Cys-R4和Pam2Cys-R4处理小鼠。未用TLR激动剂给药的对照用盐水处理(图1a)。通过qPCR评估肺部病毒载量。我们观察到所有测试剂量的病毒载量显著降低(图1b)。
研究1C感染前7天的处理
研究1C与1A同时完成。在用RV经鼻内感染前七天，用指示量的PEG-Pam2Cys-R4和Pam2Cys-R4处理小鼠(图2a)。未用TLR-2激动剂给药的对照用盐水处理。与盐水处理的RV感染对照相比，所有剂量的激动剂处理均导致病毒载量的显著降低(图2b)。
在感染后第2天对BAL细胞的分析表明，所有处理均显著增加了炎症细胞(其中大多数是巨噬细胞)的总数量，但是在较低的激动剂处理剂量下观察到淋巴细胞数量增加(图3a-b)。通过ELISA测量BAL中的炎症细胞因子。与盐水处理的感染小鼠相比，所有处理组均观察到中性粒细胞募集趋化因子CXCL1的产生显著减少(图4a)。与盐水处理的感染对照相比，较高剂量的激动剂处理组还观察到TNFα的表达降低(图4b)。
研究1B和1D感染前7天的低剂量处理
已经证明了与炎症细胞因子表达降低相关的有效、持久的抗病毒作用，对研究1C的设计进行修改以确定在较低剂量下是否可维持抗病毒功效。从先前研究的最低剂量(0.1nmol/小鼠)开始，在病毒处理前7天用0.05nmol/小鼠和0.01nmol/小鼠的Pam2Cys-R4或PEG-Pam2Cys-R4(研究1B)，或在病毒处理前7天用10pmol/小鼠、5pmol/小鼠、2pmol/小鼠或1pmol/小鼠的Pam2Cys-R4或PEG-Pam2Cys-R4处理另外的组(研究1D)。研究1B或1D结束时未观察到体重减轻。我们对肺组织RV RNA进行了测量以确定减少的炎症是否与较低的病毒载量相关(图5a-b)。所有剂量的PEG-Pam2Cys-R4均抑制了RV复制。Pam2Cys-R4还在指示剂量下引起病毒RNA的显著减少。
对于免疫细胞，在用指示剂量处理后，Pam2Cys-R4和PEG-Pam2Cys-R4引起细胞募集的显著增加(图6a、d)。增加的BAL细胞主要由数量增加的巨噬细胞驱动(图6b、e)。在指示剂量下，还观察到淋巴细胞的数量显著增加(图6c、f)。如图6c所示，响应于指示剂量，淋巴细胞占总BAL细胞的约10％。中性粒细胞炎症是病毒性哮喘恶化的一个标志性特征，且与疾病严重性有关。预计病毒载量的临床显著降低与病毒性气道中性粒细胞炎症减轻有关。与盐水处理的RV感染的小鼠相比，在指示剂量下，当表示为总BAL细胞的百分比、或总BAL细胞的绝对数量时，中性粒细胞显著减少(图7a-c)。为了提供TLR-2激动剂介导的对病毒诱导炎症的抑制的进一步证据，我们测量了研究1B和1D的BAL中的中性粒细胞募集趋化因子(CXCL1)和炎症细胞因子TNFα的水平。病毒复制驱动CXCL1表达，因此该数据支持病毒复制因TLR-2激动剂处理而受到抑制。对于所有剂量的TLR-2激动剂，与未处理的RV感染对照相比时，观察到CXCL1表达的高度显著降低(图8a、b)。处理对TNFα产生没有影响，这证实了处理不引起炎症途径的激活(图8c、d)。
研究1E对在感染前7天用(i)Peg-SS-Pam2Cys、Peg-S-Pam2Cys和Pam2CysSK4与(ii)INNA-011和Peg-S-Pam2Cys进行的处理的比较(剂量范围1pmol-10pmol)。
接下来对另外的TLR2-激动剂(Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys)进行了评估。已经证明了在最低剂量的Pam2Cys-R4和Peg-Pam2Cys-R4下与炎症细胞因子表达降低相关的有效、持久的抗病毒作用，我们试图以相似的剂量评估Peg-SS-Pam2Cys、Peg-S-Pam2Cys和INNA-011。因此，我们在感染前7天用10pmol/小鼠、5pmol/小鼠、2pmol/小鼠和/或1pmol/小鼠处理小鼠组(或在INNA-011的情况下为2pmol)。还使用相同的剂量与市售Pam2CysSk4分子进行了比较。
然后评估小鼠随时间而变化的体重。随着时间的推移，各组之间的小鼠体重数据明显地聚类。在处理时，在基线处(第-7天)，盐水RV对照与1pmol Peg-SS-Pam2Cys组之间存在显著差异(p＝0.046，单因素方差分析)，并且在1pmol Peg-S-Pam2Cys组内存在体重降低的趋势(p＝0.091，单因素方差分析)。除1pmol剂量的Pam2CysSK4外，所有小鼠组均显示出体重增加的趋势，或未观察到体重变化(数据未示出)。在第-4天和感染后第1天1pmol Peg-S-Pam2Cys与盐水RV对照小鼠之间存在显著差异，但是，这可能是由于小鼠体重紧密聚类而不是由于药物处理引起的体重减轻(数据未显示)。
为了评估所限定的TLR-激动剂的抗病毒功效，通过Taqman qPCR在来自三肺叶的顶端肺叶的肺裂解物中对RV拷贝数量进行定量。每种剂量的TLR激动剂均导致RV感染显著减少。Peg-S-Pam2Cys抑制似乎是剂量依赖性的。在10pmol剂量下，与Pam2CysSK4相比，Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys具有更好的抗病毒功效。Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys使RV感染减少～85％(10pmol Peg-SS-Pam2Cys使其减少84.82％，Peg-S-Pam2Cys使其减少86.76％)，而相比之下，相同剂量的Pam2CysSK4仅使其减少58％(通过单因素方差分析，p＝0.0246)(图9a)。值得注意的是，用INNA-011处理使RV肺RNA降低至与用Peg-S-Pam2Cys(INNA-006)相同的程度(9(a)(ii))。
通过BAL中的总白细胞评估的肺部炎症显示，与盐水RV对照相比，任何药物处理之间均没有显著差异(图9b)。在该实验中，由于细胞离心涂片机(cytospin)准备时(细胞未附着于载玻片)或染色时(当浸没在固定或染色溶液中时细胞从载玻片上分离)的细胞损失，因此不可能进行差异细胞计数。因此，丢弃并更换这些固定和染色溶液。还改变了细胞离心机(cytocentrifuge)设置以增加相对离心力(300rpm至500rpm)，从而确保在将来的实验中实现成功的差异BAL白细胞。在感染后2天对BAL细胞中的中性粒细胞的评估证明，INNA-011和Peg-S-Pam2Cys(INNA-006)减少了RV诱导的神经炎症(图9c)。
用Peg-SS-Pam2Cys、Peg-S-Pam2Cys或Pam2CysSK4处理降低了CXCL1的水平，CXCL1是响应RV感染而产生的关键中性粒细胞趋化因子(图9d-e)。每种剂量的Peg-SS-Pam2Cys以及10pmol和5pmol剂量的Peg-S-Pam2Cys和Pam2CysSK4化合物均有效降低了CXCL1水平。此外，INNA-011和Peg-S-Pam2Cys(INNA-006)降低了RV诱导的CXCL1表达。在此，这些化合物中的任一种都没有增加TNF-α，从而提供了限定的TLR-激动剂不会促进炎症的证据。
研究1F组合药物定时相互作用和对感染的影响。
为了确定对抗病毒反应和炎症是否存在协同效应，在感染前7天和/或1天用2pmolPeg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys对小鼠预防性给药。一组具体地讲在感染前7天和1天给药。一次或多次处理后，用RV1B经鼻内感染小鼠(或用模拟物处理)，并记录小鼠体重(测量值以克数或相对于基线的百分比变化计)，评估BAL中的炎症并对呼吸道中的病毒载量定量。与基线(第-7天)相比，小鼠体重测量值和体重变化表明，如先前所观察到的，2pmol剂量的任一化合物在任一时间点均未引起体重减轻(数据未显示)。更重要的是，当用第二剂TLR-激动剂(在感染前一天第一次给药后6天)处理小鼠时，没有观察到体重减轻。
为了测试这些TLR激动剂施用时间的影响，在感染后7天、感染后1天或感染前7天和1天的组合用2pmol Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys经鼻内处理单独的小鼠组。然后用模拟物或RV1B经鼻内接种小鼠。在感染后2天评估BAL中的肺部炎症。
为了测试肺部炎症的增加是归因于病毒载量的增加，还是由药物引起，通过qPCR评估肺中的RV拷贝数量。与仅在第7天给药的小鼠相比，每个药物处理组具有非常显著的病毒拷贝数量降低并且用Peg-S-Pam2Cys在第-7天和第-1天的组合处理增强了病毒清除(图10a-b)。
在RV或模拟物感染前1天，用Peg-SS-Pam2Cys处理的小鼠中仅BAL中性粒细胞显著增加。然而，在所有处理时间(除在第-7天用RV1B感染处理之外)，Peg-SS-Pam2Cys诱导了淋巴细胞数量。在感染前7天与前1天用Peg-S-Pam2Cys处理的组合也促进了BAL中的淋巴细胞募集(图10c-d)。
与盐水模拟物对照相比，在第-1天给予Peg-SS-Pam2Cys剂量的模拟物对照小鼠中，在第-7天和第-1天时间点均给予Peg-SS-Pam2Cys的模拟物小鼠中，以及在第-7天给予Peg-S-Pam2Cys处理的小鼠中，总白细胞增加(图10e-f)。有趣的是，与盐水RV对照相比，用RV1B感染的小鼠中相同的剂量方案不会诱导显著更高的白细胞募集。与先前的实验相反，总BAL白细胞的增加不是由于巨噬细胞募集。只有第-7天Peg-S-Pam2Cys模拟物组与其盐水模拟物对照组相比具有更高数量的巨噬细胞。
有趣的是，尽管Peg-SS-Pam2Cys第-7天/模拟物组中有明显的中性粒细胞炎症，但CXCL1的产生仅在Peg-SS-Pam2Cys第-1天/RV1B和Peg-S-Pam2Cys第-1天/RV1B组中增加。还值得注意的是，在第-7天已经过处理的小鼠未发生因在第-1天施用Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys而诱导的肺部炎症(图10g-h)。与先前的实验一致，Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys在任何组中均未诱导TNF-α。
研究1G在RV感染期间的处理
用RV1B经鼻内感染小鼠，并在感染后1天用10、5、2或1pmol剂量的Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys处理小鼠，以评估治疗性抗病毒功效和与已确立的RV感染对肺部炎症的相互作用。在RV感染后，记录小鼠体重并确定呼吸道中的病毒载量和炎症。
在感染期间施用TLR-激动剂显著降低了肺中的RV拷贝数量(图11a)。研究1G和1F(在第-1天和感染后第1天进行TLR-激动剂给药)因此描绘了病毒载量引起的炎症。
与用盐水(盐水RV)或RV和模拟物对照处理的感染小鼠相比，在活性感染期间用Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys处理的小鼠中总白细胞数量之间没有显著差异。然而，Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys均改变了BAL白细胞的分布，显著减少了巨噬细胞数量并增加了中性粒细胞募集(图11b-e)。与先前的研究不同，淋巴细胞数量没有变化。
BAL中的中性粒细胞炎症也与中性粒细胞趋化因子CXCL1和炎症细胞因子TNF-α的产生有关，两者均剂量依赖于药物处理(图11f-g)。重要的是，最低剂量的Peg-SS-Pam2Cys或Peg-S-Pam2Cys不会增加CXCL1和TNF-α。
讨论
这种体内工作程序与RV感染的原代支气管上皮细胞中的体外实验并行进行。体外数据提供了限定的TLR2激动剂的抗病毒作用的证据。小鼠研究的目的是确定候选TLR2激动剂(Pam2Cys-R4、Peg-Pam2Cys-R4、Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys)在施用于下呼吸道时是否在体内抗RV病毒，以及对病毒感染的抑制是否通过减少病毒诱导的气道炎症提供了临床受益的证据。
在研究1A小鼠和研究1B小鼠中，每只小鼠给药0.1nmol、1.0nmol和5nmol。在感染前7天给药(研究1B)最低剂量(0.1nmol)的Peg-Pam2Cys-R4未引起显著的体重减轻，从而确定了聚乙二醇化对Pam2Cys的系统性作用的潜在积极影响。对于两种给药方案(第-1天和第-7天)，存在激动剂诱导的细胞炎症的证据，然而这与两项研究中的病毒载量降低相关。在感染前7天进行处理使病毒载量显著降低(病毒RNA减少>90％)。
研究1B的所有剂量均引起免疫激活。这主要由可能参与中性粒细胞炎症消退的巨噬细胞组成。对于较低的剂量(1和0.1nmol)，有证据表明淋巴细胞募集增加，从而指示这些组中中性粒细胞数量减少和中性粒细胞炎症消退。细胞因子数据支持这一点。在感染前7天进行TLR2激动剂处理降低了病毒诱导的中性粒细胞趋化因子CXCL1的水平。较高剂量也降低了TNFα的表达。该研究首次表明用TLR2激动剂进行预防性处理(在感染前7天)可抑制感染，这与病毒诱导的炎症介质的减少相关。
用相同组的小鼠进行了研究1A(在感染前1天给药)和1B(在感染前7天给药)。基于体重减轻和炎症分布，我们决定对于研究1C在用鼻病毒感染前7天减小给药范围(0.1至0.01nmol/小鼠)。当给予0.01nmol/小鼠时，药物均未引起体重减轻。数据表明聚乙二醇化形式在对体重减轻的影响方面具有更好的耐受性。
在研究1C中对炎症细胞的评估揭示了总BAL细胞(主要是巨噬细胞)的适度的达两倍或更少的增加。巨噬细胞在中性粒细胞炎症消退中具有重要作用，并且可能在该模型中在机理上参与对病毒诱导的炎症的激动剂介导的控制。再次，用0.05nmol/小鼠和0.01nmol/小鼠处理后，Peg-Pam2Cys-R4的炎症较少，总BAL细胞没有增加。除最低剂量的Peg-Pam2Cys-R4处理组之外，低水平但显著的淋巴细胞信号是明显的。中性粒细胞是病毒性炎症的关键表现(readout)。我们观察到激动剂处理后BAL中性粒细胞几乎显著减少。鉴于中性粒细胞减少趋势的一致性，我们相信，增加数据集大小的重复研究将显示这种作用(>50％减少)具有统计学显著性。小鼠RV感染模型中BAL中性粒细胞的峰值是在感染后1天，因此，如果在前一天评估，则关注TLR2激动剂控制病毒性中性粒细胞炎症的将来研究可能获得更清晰的信号。
与中性粒细胞减少一致，激动剂处理在抑制CXCL1表达方面非常有效。对TNFα没有影响，这证实了处理不引起炎症途径的显著激活。病毒复制驱动先天免疫激活和CXCL1表达，因此该数据支持病毒复制和感染诱导的炎症被TLR2激动剂处理抑制。对病毒RNA的分析证实了这一点，其中Peg-Pam2Cys-R4处理在所有剂量下均引起了病毒载量的显著降低。仅最高剂量(0.1nmol/小鼠)的Pam2Cys-R4显著降低了病毒载量。
在完成Pam2Cys-R4和Peg-Pam2Cys-R4的概念验证研究之后，我们接下来关注Peg-SS-Pam2Cys、Peg-S-Pam2Cys和INNA-011。除了最高处理剂量(每只小鼠10pmol)造成体重增加短暂减小外，Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys未影响小鼠体重。缺乏临床上有害的炎症与缺乏诱导TNFα和显著减少的中性粒细胞炎症一致-由病毒载量的显著降低(>80％)引起。Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys在抗病毒作用方面的效力与Pam2CSK4相似且更优，后者使肺部病毒载量降低50％。这些数据证实，当在用RV感染前七天施用时，Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys有效地抑制了病毒炎症。此外，INNA-011也对病毒性炎症产生了显著的抑制作用。
我们接下来研究了多剂量Peg-SS-Pam2Cys和-Peg-S-Pam2Cys与相近给药对RV感染的相互作用。就给药后三天未感染小鼠(第-1天组)中的肺部炎症(仅检查对药物处理的反应)而言，对Peg-SS-Pam2Cys(不是Peg-S-Pam2Cys)存在中性粒细胞性反应。如果在六天前进行处理，则该反应减少。因此，该实验确定了多剂量的意外效果，其中主要剂量减少了对次要剂量的炎症反应。对此的一种可能解释是诱导炎症消退途径，诸如当给予第二激动剂时，抗炎巨噬细胞吞噬凋亡中性粒细胞。该相同实验还鉴定了Peg-SS-Pam2Cys与Peg-S-Pam2Cys之间在炎症效力方面的差异(Peg-SS-Pam2Cys炎症更多)。在感染前一天处理的小鼠中CXCL1水平显著增加，但如果小鼠在第-7天接受了预先处理，则该作用完全消失。尽管在多次处理后抑制了炎症，但没有损失抗病毒免疫力。事实上，在第-7天和第-1天进行处理(病毒RNA减少约90％)比第-7天进行单次处理(病毒RNA减少70％)更有效。
在最后的研究中，我们检查了RV1B感染后一天给予Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys的治疗功效(处理方案)。在较高剂量下，在体重减轻方面存在炎症加重的临床证据。这通过炎症介质和中性粒细胞募集的剂量依赖性表达来反映。对于较低剂量(2pmol和1pmol)，KC或TNFα未显著增加到无处理时由RV感染诱导的值以上。对于每只小鼠5pmol和更低的剂量，肺病毒载量显著降低。对于Peg-S-Pam2Cys而言，最高剂量(每只小鼠10pmol)效果较差且不显著。该数据与研究1A病毒载量数据(图4)一致，这也表明最高剂量失去了抗病毒作用。这是钟形剂量反应曲线的典型特征，常见于混合型激动剂-拮抗剂。
总的来说，本研究首次表明，用代表性TLR-2激动剂进行预防性处理可以抑制与病毒载量和病毒诱导的炎症介质(包括趋化因子CXCL1)减少相关的病毒介导的感染。这些研究证明了在结构上不同的包含TLR2激动剂的化合物对RV感染具有有效的抗病毒活性。此外，可以在不引起临床或免疫病理学信号的激动剂剂量下实现针对鼻病毒感染的抗病毒活性。这些数据还表明，多剂量的TLR激动剂在不损失抗病毒活性的情况下避免了对激动剂处理的初级反应的急性炎症作用。此外，感染后以每只小鼠低至1pmol的剂量处理抑制了病毒复制，诱导了中性白细胞增多，但在低剂量下不会增加炎症细胞因子。
不受任何理论或作用模式的束缚，似乎避免感染的机制可能涉及非免疫(气道上皮)和低水平巨噬细胞及淋巴细胞激活两者。
实例2
TLR2激动剂对原代哮喘支气管上皮细胞中的鼻病毒感染的保护和治疗作用
进行该研究以确定TLR2激动剂治疗或预防是否在鼻病毒感染期间在气-液界面(ALI)-分化的人哮喘支气管上皮细胞中减少病毒载量和病毒诱导的免疫介质。
COPD患者原代支气管上皮细胞的气-液界面分化
从6名轻度至中度持续性哮喘患者获取的原代支气管上皮细胞(图12a)在T75烧瓶中生长至汇合(第3代)并在气-液界面(ALI)处分化。简而言之，使原代细胞在具有生长因子补充剂的完全BEGM(龙沙集团(Lonza))中在浸没的单层培养物中生长，然后在具有ALI-初始培养基的12孔板中的Transwell(康宁公司(Corning)目录号3460)中以2×105个细胞接种直至汇合(在顶部和底部隔室中均至少三天)，该ALI-初始培养基由含有0.1％氢化可的松、0.1％牛胰岛素、0.1％肾上腺素、0.1％转铁蛋白、0.4％牛垂体提取物(均来自龙沙集团Singlequots，目录号CC-3171)和乙醇胺(终浓度80μM)、MgCl2(终浓度0.3mM)、MgSO4(终浓度0.4mM)、牛血清白蛋白(终浓度0.5mg/ml)、两性霉素B(终浓度250ug/ml)、全反式视黄酸(30ng/ml)和2％青霉素链霉素的50％BEBM/50％DMEM与10ng/ml重组人上皮生长因子(rhEGF)组成。一旦汇合，便在ALI相期间将rhEGF浓度变为0.5ng/ml，用于在没有顶部培养基的底部隔室(在Transwell插入物下方)中分化直到初始接种后21天。
跨上皮电阻读数
跨上皮电阻使用WPI EVOM-上皮伏特欧姆计测量，其中AC电流通过STX2筷状电极组，该电极组同时置于顶部培养基和底部培养基中。记录每个时间点的三个读数的平均值，从第零天(当接种的细胞变得汇合时)开始，在整个生长和分化期间每周记录一次(第7天、第14天和第21天)，然后在分化后相对于感染时间(感染后-2小时、0小时、24小时、48小时、72小时和96小时)记录，并将电阻表示为欧姆(Ω)/cm2。
从ALI培养物采集样品
在感染后48和96小时采集ALI培养物样品。在每个时间点，将顶部培养基从培养物中取出并储存在-80℃下以用于蛋白质表达分析，将一半Transwell膜从插入物中小心地切下并收集到含有1％2-巯基乙醇(2ME)的350μl RLT缓冲液(凯杰公司)中以用于通过RT-qPCR进行下游分子分析，同时保留剩余的Transwell膜以用于蛋白质分析。
RNA提取和qRT-PCR
将RLT/2ME缓冲液中的Transwell膜脉冲涡旋以从膜上除去并裂解细胞。除去膜并使用miRNeasy试剂盒(凯杰公司)按照推荐的用于在半自动化Qiacube平台上提取总RNA(包括来自动物和人细胞及组织的miRNA)的供应商方案提取RNA。提取后，使用分光光度计(Nanodrop)测定RNA浓度，将200ng RNA用于通过随机引物和RNA酶抑制剂(应用生物系统公司)进行逆转录。然后使用TaqMan、FAM-TAMRA化学法(生命科技公司(LifeTechnologies))，用含有ROX(凯杰公司)的主混合物、表3中概述的引物和探针在ABI700上对cDNA进行qPCR分析。感兴趣的基因的Ct值参考已知浓度的七种标准品，这些标准品从107个拷贝开始并以1:10稀释系列进行。将所有感兴趣的基因的拷贝数量归一化为参考基因18s。
对于从由一半气-液界面Transwell膜的细胞裂解物提取的RNA产生的cDNA，使用TaqMan化学法以最佳的定制正向/反向引物比率进行qPCR分析，每个反应总体积为12.5μl。
病毒储备液
以MOI 0.1 2小时吸附进行病毒感染
RV1-B(2010年5月储备液1.55×108TCID/ml)
MOI 1＝6.45μl RV1B+243.55μl最小
MOI 0.1＝MOI 1的1/10
准备7W(各250μl)＝175μl MOI 1RV1B+1575μl最小
感染收获时间
在时间点：
重新读取TEER(确保不会交叉污染经病毒处理的样品)
移除顶部上清液
收集500μl并储存在-80℃下
将Transwell移入含有1ml PBS的收集板中。
蛋白质：按照GLP855和AR方法并在200μl蛋白质裂解缓冲液中提取一半膜中的蛋白质(储存在-80℃下)
RNA：按照GLP855并在350μl RLT裂解缓冲液中提取一半膜中的RNA(储存在-80℃下)
对细胞因子和干扰素产生的定量
用BD CBA Flex套组(BD公司)根据制造商的说明通过多重流式细胞微珠阵列法(CBA)分析来自ALI培养物的顶部上清液的IL-6和IP-10(CXCL10)产生。简而言之，将样品置于室温下，将50μl样品与涂有抗人IL-6或IP-10的多重微珠混合，随后与藻红蛋白(PE)缀合的检测抗体一起温育。将样品在96孔板格式上运行，在FACS Canto-II上分析，并使用FCAP-Array(版本3)软件基于APC和APC-Cy7聚类以及参考已知浓度的标准品曲线的未知物的PE强度来区分IL-6和IP-10包被的微珠。使用ELISA根据制造商的说明对IFN-λ、IL-8和CCL22(R&D系统公司Duoset)和IFN-β(PBL测定)进行定量。
统计分析
将非配对T检验非参数(曼-惠特尼(Mann Whitney))用于所有统计，将处理与盐水RV对照进行比较。P值<0.05被认为是显著的。将弗里德曼检验用于评估盐水RV对照组与用指示剂量的Pam2Cys-R4处理之间的干扰素表达和炎症介质表达。
结果
为了确定Pam2Cys-R4是否可以在哮喘气道上皮细胞中诱导抗病毒反应，我们从五名哮喘患者中获取了完全分化的上皮培养物。在感染前24小时(预处理；预防模型)或RV感染后2小时(后处理；治疗模型)，在饥饿培养基中用两剂量的Pam2Cys-R4(0.2μM或0.02μM)处理这些培养物。将培养基添加到未处理的细胞中。在经处理的培养物中观察到病毒RNA减少的一致趋势，并且这在感染后96小时达到0.02μM预处理组和0.2μM后处理组的统计学显著性(图12b-e)。这些数据表明抗病毒反应的动力学可以用剂量来操纵。
RV复制产生病毒RNA，该病毒RNA激活病原体模式识别受体(PRR)、先天免疫和I/III型干扰素(IFNβ/IFNλ)的产生。已经证明该过程在哮喘中特别是在更严重的疾病形式中受损。为了确定Pam2Cys-R4处理是否抑制病毒复制，我们测量了病毒诱导的IFN产生。我们测量了顶部培养基中的I型(IFNβ)和III型(IFNλ)蛋白质水平(图13a-d)。对于所有处理条件，存在TLR-2激动剂处理降低IFN表达的趋势，这与图12中所示的后处理0.2μM 96h组的病毒复制显著减少相对应。
激动剂确实诱导了未感染细胞和经感染细胞产生炎症介质IP-10、IL-6、IL-8和CCL22(图14a-h)。IL-6表现出促炎和抗炎两种特性，它在哮喘中的作用存在一些争议。人们普遍认为，高水平与哮喘严重性有关。IL-8是一种中性粒细胞趋化因子，并且是重度急性哮喘的另一种生物标志物。CCL22是一种趋化因子，它与Th2细胞和2型先天性淋巴样细胞表面上的CCR4受体结合，并且与哮喘中的2型炎症相关。这些数据表明TLR-2激动剂处理可以降低感染的峰值并缩短持续时间而不会引起炎症的显著增加，如通过测量限定的炎症标志物所证明的。临床研究已表明，病毒载量的峰值和持续时间与哮喘的疾病严重性相关，这支持减少病毒复制将降低疾病严重性的观点。
我们接下来开展了实验以评估Pam2Cys-R4、Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys的TLR2激动剂变体与市售的Pam2CSK4相比的抗病毒活性。使用人支气管上皮BCi-NS1细胞系进行初步实验。这是组成性表达人端粒酶逆转录酶的最低永生化人支气管上皮细胞系。该细胞系源自健康志愿者的刷气道上皮，并保留原始原代细胞的特征超过40代。这些细胞保留的关键特征是它们可以在ALI处分化。细胞未经处理或用指示剂量的Pam2Cys-R4、Peg-SS-Pam2Cys和Peg-S-Pam2Cys或Pam2CysSK4(CSK4)预处理。然后用RV1B感染细胞，并在感染后96小时测量病毒RNA水平(图15a-b)。与对照相比，用Peg-S-Pam2Cys(20nM和2nM)处理在感染后96小时将病毒RNA水平显著降低约50％。
总的来说，该研究表明对取自患有不同严重程度哮喘的人类患者的完全分化的哮喘上皮进行TLR-2激动剂处理抑制了病毒复制和由病毒复制诱导的先天性抗病毒介质的相关产生。这些结果很重要，因为它们首次表明了TLR2激动剂可以抑制鼻病毒复制，而不需要首先触发IFN产生和IFN介导的抗病毒反应。
已获取了用于本研究的患有轻度至中度持续性哮喘的患者的上皮细胞。与来自患有严重疾病的患者的细胞相比，这些细胞更可能具有干扰素表达“正常”的完全功能性抗病毒反应。即使如此，我们也能够观察到激动剂处理对感染的增强控制。
值得注意的是，抗病毒反应不依赖于IFN介导的反应。这是重要的，因为干扰素表达变化极大，特别是在更严重的哮喘形式中。因此，控制对诱导IFN的TLR激动剂(例如TLR3-或TLR7激动剂)的治疗反应可能是有问题的，并且可能导致临床试验中没有治疗效果或过度炎症及相关副作用。在先前的临床试验中已经观察到在哮喘中对重组IFN的响应的变异性。仅在严重亚组的那些试验中观察到恶化的减少，这限制了该处理在哮喘中的应用。由于在本实验中观察到轻度和中度持续性哮喘患者的细胞中的病毒载量降低，这表明靶向不依赖于干扰素的抗病毒途径可以在哮喘表型中具有更广泛的应用。
Pam2Cys-R4在经感染和未感染的细胞中均诱导产生炎症介质IL-6、IL-8和CCL22但不产生IP-10。与我们的结果一致，据报道TLR2激活在其他系统中诱导炎症细胞因子和趋化因子的上皮表达。IL-6表现出促炎和抗炎两种特性，它在哮喘中的作用存在争议。人们普遍认为，高水平的IL-6与哮喘严重性有关。IL-8是一种中性粒细胞趋化因子，并且是重度急性哮喘的另一种生物标志物。CCL22是一种趋化因子，它与Th2细胞和2型先天性淋巴样细胞表面上的CCR4受体结合，并且与哮喘中的2型炎症相关。在用Pam2Cys-R4处理后，这些介质的表达增加是适度的(通常小于2倍)。
肺泡巨噬细胞是气道中主要的常驻型免疫细胞，来自健康肺的BAL细胞典型地有85％是巨噬细胞。我们评估了BAL巨噬细胞对RV和Pam2Cys-R4或Peg-Pam2Cys-R4同时刺激的反应，以鉴定所诱导的炎症细胞因子的类型和程度。我们测量了IL-6、IL-8和TNFα。CXCL10(IP10)无法检测到。对于大多数实验，单独的RV挑战未诱导IL-6、IL-8和TNFα。鉴于巨噬细胞不允许RV感染，这并不意外。
BEC和巨噬细胞均响应TLR2激活而表达IL-6、IL-8和TNFα。响应于RV感染和/或TLR2刺激，CXCL10由上皮细胞表达，但不由BAL巨噬细胞表达。这一观察结果有助于理解我们在人体临床研究中可能预期的反应-IP10的表达将可能表明上皮细胞正在被激活，而在没有CXCL10的情况下炎症细胞因子的表达可能表明上皮细胞没有被接合，并且免疫细胞(巨噬细胞)正在作出响应。
已经展示了Pam2Cys-R4和Peg-Pam2Cys-R4的概念验证实验，我们继续开展对候选选择的实验，并评估了Pam2Cys-R4和Peg-Pam2Cys-R4的结构类似物(即Peg-SS-Pam2Cys、Peg-S-Pam2Cys)的抗病毒作用。Pam2Cys-R4和市售的TLR2激动剂Pam2CSK4用作对照。
第一轮实验在健康的人支气管上皮细胞系BCi-NS1中进行。这些细胞表现得像原代细胞，因为它们能够来自ALI处的假复层上皮细胞。我们证实了结构相关的TLR2激动剂化合物表现出有效的抗病毒活性。总之，这些研究证明了代表性TLR-2激动剂在哮喘上皮细胞中充当抗RV感染的抗病毒剂的能力。
实例3
INNA-003和INNA-006的合成
INNA-003和INNA-006的合成
试剂：固相载体：TentaGel S RAM树脂(替代因子0.24mmol/g；德国蒂宾根的拉普聚合物公司(Rapp Polymere,Tübingen,Germany))。氨基酸衍生物：来自德国达姆施塔特的默克公司(Merck,Darmstadt,Germany)的Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-homo-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-NH-(PEG)3-COOH、Fmoc-NH-(PEG)5-COOH、Fmoc-NH-(PEG)11-COOH、Fmoc-NH-(PEG)27-COOH。
注意：使用默克公司目录号851024产生如下示为“INNA-003”(在本文中也可称为Pam2Cys-SS-PEG)和“INNA-006”(在本文中也可称为Pam2Cys-S-PEG)的结构。
INNA-003：
INNA-006或化合物(1)：
酰化：在所有酰化步骤中使用4倍摩尔过量的Fmoc氨基酸、O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)和6倍摩尔过量的二异丙基乙胺(DIPEA)。所有酰化反应进行60分钟，并通过三硝基苯磺酸(TNBSA)试验证实反应完成。通过将固相载体暴露于2.5％二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU；德国施泰因海姆的西格玛奥德里奇公司(Sigma,Steinheim,Germany))2×5分钟来实现从α-氨基除去Fmoc保护基。将二甲基甲酰胺(DMF；澳大利亚墨尔本的奥思佩普公司(Auspep,Melbourne,Australia))用于在每个酰化与去保护步骤之间洗涤固相载体。Fmoc-NH-(PEG)11-COOH(澳大利亚贝斯沃特的默克公司(Merck,Bayswater,Australia))的偶联以与偶联氨基酸相同的方式进行。
注意：首先将甘氨酸与TentaGel S RAM固相载体偶联，然后与Fmoc-NH-(PEG)11-COOH偶联。
肽定量
通过在密封的玻璃小瓶中在含有0.1％苯酚的6N HCl存在下在110℃下水解样品，在真空中进行氨基酸分析来确定基于肽的材料的定量。然后使用Waters AccQTag试剂根据制造商的说明进行氨基酸的衍生化，随后使用AccQTag ultra柱(2.1mm×100mm；密理博沃特世公司(Waters Millipore))在Waters Acquity UPLC系统(密理博沃特世公司)上进行分析。
INNA-003和INNA-006的制备
就INNA-003而言，在添加PEG部分后依次偶联两个丝氨酸残基，就INNA-006而言，在添加PEG部分后掺入单个丝氨酸。
脂化(添加Pam2Cys)。
S-(2,3-二羟丙基)半胱氨酸的合成：将三乙胺(6g，8.2ml，58mmol)添加到L-半胱氨酸盐酸盐(3g，19mmol)和3-溴-丙-1,2-二醇(4.2g，2.36ml，27mmol)的水溶液中，将均相溶液在室温下保持3天。将溶液在40℃下真空还原成白色残余物，然后用丙酮(300ml)沉淀，通过离心分离沉淀物。将沉淀物再用丙酮洗涤两次并干燥，得到呈白色无定形粉末的S-(2,3-二羟丙基)半胱氨酸。
N-芴甲氧羰基-S-(2,3-二羟丙基)-半胱氨酸(Fmoc-Dhc-OH)的合成：将S-(2,3-二羟丙基)半胱氨酸(2.45g，12.6mmol)溶于9％碳酸钠(20ml)中。然后添加芴甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺(3.45g，10.5mmol)的乙腈(20ml)溶液，将混合物搅拌2小时，用水(240ml)稀释，然后用乙醚(25ml×3)萃取。用浓盐酸将水相酸化至pH 2，然后用乙酸乙酯(70ml×3)萃取。将萃取液用水(50ml×2)和饱和氯化钠溶液(50ml×2)洗涤。将萃取液用无水硫酸钠干燥并蒸发至干。通过施加高真空以除去残留溶剂来获得最终产物。
Fmoc-Dhc-OH与树脂结合肽的偶联：将Fmoc-Dhc-OH(100mg，0.24mmol)用HOBt(36mg，0.24mmol)和DICI(37μL，0.24mmol)在DCM和DMF(1:1，v/v，3mL)中在0℃下活化5分钟。然后将混合物添加到含有树脂结合肽(0.04mmol，0.25g氨基-肽树脂)的容器中。震荡2小时后，在玻璃烧结漏斗(孔隙率3)上过滤除去溶液，用DCM和DMF(各3×30mL)洗涤树脂。使用TNBSA试验监测反应完成。如果需要，执行双偶联。
Fmoc-Dhc-肽树脂的两个羟基的棕榈酰化：将棕榈酸(204mg，0.8mmol)、DIPCDI(154μL，1mmol)和DMAP(9.76mg，0.08mmol)溶于2mL DCM和1mL DMF中。将树脂结合的Fmoc-Dhc-肽树脂(0.04mmol，0.25g)悬浮在该溶液中并在室温下振荡16小时。通过过滤除去溶液，然后用DCM和DMF彻底洗涤树脂以除去任何脲残余物。用2.5％DBU(2×5min)完成Fmoc基团的去除。
从固体载体中切割肽：试剂B(93％TFA、5％水和2％三异丙基硅烷)保持两小时。注意：肽不会在冷醚中沉淀。必须除去大部分TFA，然后将残余物溶于50％乙腈中并立即纯化或冷冻干燥。
INNA-003和INNA-006的纯化和表征：
在从固体载体中切割后，使用安装在Waters HPLC系统(美国马萨诸塞州米尔福德的密理博沃特世公司(Waters Millipore,Milford,MA,USA))中的C4 VYDAC柱(10mm×250mm；澳大利亚新南威尔士州的奥特奇公司(Alltech,NSW,Australia))通过反相高效液相色谱法纯化INNA-003和INNA-006。通过质谱法确定目标物质的身份，然后使用VYDAC C8柱(4.6mm×250mm)通过分析型HPLC表征纯化的物质，发现该物质大于95％。使用Agilent1100系列LC/MSD离子阱质谱仪(美国加利福尼亚州帕罗奥图的安捷伦公司(Agilent,PaloAlto,CA,USA))进行质量分析。
化合物(2)或Pam2Cys-Thr-PEG的制备，在添加PEG11部分后掺入单个苏氨酸。如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(3)或Pam2Cys-homoSer-PEG的制备，在添加PEG11部分后掺入单个高丝氨酸。如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(4)或Pam2Cys-phosphoSer-PEG的制备，在添加PEG11部分后掺入单个磷酸丝氨酸。如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
Pam2Cys-Ser-PEG3的制备，在偶联第一个氨基酸甘氨酸后偶联PEG3部分而不是PEG11。在偶联单个丝氨酸残基后，如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
Pam2Cys-Ser-PEG5的制备，在偶联第一个氨基酸甘氨酸后偶联PEG5而不是PEG11部分。在偶联单个丝氨酸残基后，如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(5)的制备，在偶联第一个氨基酸甘氨酸后偶联PEG27而不是PEG11部分。在偶联单个丝氨酸残基后，如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(6)的制备，在偶联第一个氨基酸甘氨酸后，依次偶联PEG27部分两次。在偶联单个丝氨酸残基后，如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(2a)的制备，在添加PEG11部分后掺入两个苏氨酸。如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(3a)的制备，在添加PEG11部分后掺入两个高丝氨酸。如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(4a)的制备，在添加PEG11部分后掺入两个磷酸丝氨酸。如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(5a)的制备，在偶联第一个氨基酸甘氨酸后偶联PEG27而不是PEG11部分。在偶联两个丝氨酸残基后，如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
化合物(6a)的制备，在偶联第一个氨基酸甘氨酸后，依次偶联PEG27部分两次。在偶联两个丝氨酸残基后，如上所述进行Pam2Cys的添加(脂化)。
实例4
以下研究的主要目的是确定在FP存在下包含TLR2激动剂的化合物的抗病毒作用和对随后的病毒诱导的炎症的抑制是否通过化合物处理来维持，以及化合物预防性处理是否可逆转小鼠鼻病毒感染期间对先天性抗病毒防御的FP抑制。
实验动物
使用雌性6-8周龄的BALB/c小鼠进行所有研究。每组包含8只小鼠。在治疗或挑战程序之后，每天监测小鼠的体重变化以及行为或身体变化，如在动物伦理批准中所规定。在采集样品时，所有小鼠均通过腹膜内施用戊巴比妥钠而处死。
INNA-006给药和鼻病毒血清型1B(RV1B)感染
鼻病毒血清型1B最初从临床分离物中纯化，在RD-ICAM细胞中生长并如先前在NatMed[自然医学]14，199-204(2008)和Methods Mol Biol[分子生物学方法]1221，181-188(2015)中所述进行纯化。在II级生物安全柜内的诱导室中，在轻度异氟烷麻醉下向小鼠鼻内(i.n.)给药50μl激动剂分子。在TLR-2激动剂给药后的指示时间，使用相同的程序经鼻内用含有5×106TCID50 RV1B的50μl感染小鼠。在感染后第2天，进行支气管肺泡灌洗(BAL)以对炎症细胞浸润进行计数并测量免疫介质蛋白质表达。收获肺的总RNA以评估病毒载量。小鼠RV感染模型和相关技术描述于公开的Nat Med[自然医学]14，199-204(2008)和MethodsMol Biol[分子生物学方法]1221，181-188(2015)中。
支气管肺泡灌洗(BAL)细胞分析
处死后，将小鼠气管插管并将1ml汉克氏缓冲盐水溶液(HycloneTM，GE生命科学公司(GE Life Sciences))冲洗通过气道3-5次。通过离心来沉淀BAL细胞，收集上清液并在-80℃下储存以用于ELISA。沉淀的细胞是经裂解的红细胞，通过台盼蓝排除法在血球计上对剩余的细胞计数。然后将细胞悬液细胞离心到载玻片上并固定，再用迪夫快速(DiffQuick)(POCD)溶液根据制造商的建议染色。计数得出每个载玻片至少200个总细胞，并测定中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的数量。
RNA提取和qRT-PCR
将来自每只小鼠的顶端肺叶收集到RNA-later(艾莫宾公司(Ambion))中。对于处理，将肺叶转移到RLT(凯杰公司(Qiagen))/2ME缓冲液中，通过TissueLyser II(凯杰公司)以25Hz进行组织解离，该过程进行两次，每次2分钟(样品旋转)。通过离心来沉淀细胞碎片，并使用miRNeasy试剂盒(凯杰公司)按照推荐的用于提取总RNA(包括来自动物和人细胞及组织的miRNA)的供应商方案手动提取RNA。提取后，使用分光光度计(Nanodrop)测定RNA浓度，将200ng RNA用于通过随机引物和RNA酶抑制剂(应用生物系统公司(AB,AppliedBiosystems))进行逆转录。然后使用TaqMan、FAM-TAMRA化学法(生命科技公司)，用含有ROX(凯杰公司)的主混合物、表1中概述的引物和探针在Quantstudio 6上对cDNA进行qPCR分析。感兴趣的基因的Ct值参考已知浓度的七种标准品，这些标准品从107个拷贝开始并以1:10稀释系列进行。将所有感兴趣的基因的拷贝数量归一化为参考基因18s。
通过ELISA定量细胞因子
然后通过Duoset ELISA(R&D系统公司(R&D Systems))根据制造商的说明分析BAL液的KC/IL-8(CXCL1)和TNF-α的产生。
表1.用于qPCR的引物和探针序列
对于从每只小鼠的顶端肺叶提取的RNA产生的cDNA，使用TaqMan化学以最佳的定制正向/反向引物比率进行qPCR分析，每个反应总体积为12.5μl。
研究方案
在皮质类固醇(CS)丙酸氟替卡松(FP)处理后抗病毒免疫恢复。使用先前确定的最佳给药方案预防性地向小鼠给药先导候选物。在RV1B感染(或用PBS模拟感染)前1小时用FP(对于对照用PBS)处理小鼠。在感染后24小时评估先天抗病毒免疫(BAL中的I/III型IFN蛋白)和肺组织病毒载量(病毒RNA，qPCR)。
结果
在CS(丙酸氟替卡松FP)处理后抗病毒免疫恢复。在感染前七天(或单独)预防性地向小鼠总呼吸道给药2pmol的INNA-006。第一次处理后每天监测体重减轻。然后在RV1B感染(或用PBS模拟感染)前1小时用FP(对于对照用PBS)处理小鼠。在感染后48小时评估肺组织病毒载量(病毒RNA，qPCR)，并通过对BAL炎症细胞的差异染色和对BAL液中蛋白质免疫介质的测量来确定肺部炎症。
在鼻内施用FP和用RV鼻内感染(均施用到总呼吸道)前第-7天或第-7天和第-1天的组合用2pmol INNA-006处理小鼠。未给药TLR激动剂的对照用盐水处理。作为从第一次处理当天(第-7天)的变化％对体重减轻进行评估。与相关对照相比，在INNA-006或FP处理时没有观察到显著的体重减轻(数据未显示)。
炎症细胞分析表明，当与FP联合给予时，第-7天INNA-006处理导致巨噬细胞和淋巴细胞增加。组合的第-7天和第-1天INNA-006处理增加了BAL中的巨噬细胞和淋巴细胞。在FP处理的小鼠中还观察到组合的第-7天和第-1天INNA-006增加了巨噬细胞。令人惊讶的是，INNA-006处理在RV感染的小鼠中完全减轻了RV诱导的和类固醇抵抗的中性粒细胞炎症反应(图16)。
通过ELISA测量BAL中的炎症介质CXCL1(图17)。类固醇抵抗的RV诱导的中性粒细胞炎症对应于增加的CXCL1(KC，小鼠IL-8)蛋白质产生。INNA-006抑制了CXCL1产生并防止了类固醇抗性炎症反应。
通过qPCR评估肺部病毒载量。FP处理仅增加了盐水对照小鼠中的肺病毒载量。INNA-006降低了所有组的肺病毒载量，但在FP之前重复INNA-006处理实际上增强了抗病毒功效(图18)。
得自该研究的BAL数据最显著的特征是在所有处理方案中INNA-006完全抑制了RV诱导的类固醇抗性中性粒细胞炎症。经抑制的中性粒细胞炎症对应于小鼠中性粒细胞趋化因子CXCL1(KC)水平的显著降低。
用2pmol INNA-006(第-7天和第-1天)重复处理增加了对应于巨噬细胞和淋巴细胞募集的总白细胞数量。在采用INNA-006给药方案的FP处理的小鼠中以及在FP处理的小鼠中还观察到巨噬细胞募集的增加。在第-7天INNA-006FP RV以及第-1天和第-1天INNA-006Veh RV组中，淋巴细胞数量因未知机制增加。在感染前七天2pmol INNA-006的单剂量导致BAL中显著的TNF-α产生，但是当给予重复剂量的INNA-006(第-7天和第-1天)时未观察到这种情况。FP处理还减少了由INNA-006刺激的TNF-α产生。
与中性粒细胞减少一致，激动剂处理在抑制CXCL1表达方面非常有效。病毒复制驱动先天免疫激活和CXCL1表达，因此该数据支持病毒复制和感染诱导的炎症被TLR-2激动剂处理抑制。对病毒RNA的分析证实了这一点，其中INNA-006处理用两种处理方案均引起了病毒载量的显著降低。用重复的INNA-006处理与FP相结合，实际上在小鼠中观察到对病毒性肺RNA的最佳抑制。
总之，这些研究表明，用FP处理维持甚至增强了TLR激动剂对RV感染的抗病毒活性。
实例5-各种化合物对TLR2的激活
确定了各种化合物在基于NF-κB细胞的报告基因系统中刺激萤光素酶活性的能力的比较。所测试的化合物包括INNA-006(或化合物(1))；INNA-013(或化合物(4))；INNA-014(或化合物(3))；INNA-015(或化合物(2))；INNA-010；INNA-011(或化合物(5))；INNA-012(或化合物(6))；以及INNA-009。将用人TLR2质粒和萤光素酶-NF-κB质粒报告基因系统瞬时共转染的HEK293T细胞暴露于每种化合物的各种稀释液中。通过测量由萤光素酶活性引起的发光来确定成功的受体结合和随后的信号转导事件(结果示出在图19中-每个浓度的从左至右的柱按以下顺序排列：INNA-006(或化合物(1))；INNA-013(或化合物(4))；INNA-014(或化合物(3))；INNA-015(或化合物(2))；INNA-010；INNA-011(或化合物(5))；INNA-012(或化合物(6))；以及INNA-009。
结果表明，最有效的化合物是用单个丝氨酸、苏氨酸或高丝氨酸分隔Pam2Cys与PEG、或长度为12、28个或两组28个环氧乙烷单体的那些。然而，所有化合物均导致成功的受体结合和随后的信号转导。
实例6-使用体外萤光素酶测定法比较INNA-006与Pam3Cys-Ser-PEG3000
Pam3Cys-Ser-PEG3000与INNA-006的体外TLR2激动活性的比较：将用人TLR2质粒和萤光素酶-NF-κB质粒报告基因系统瞬时共转染的HEK293T细胞暴露于INNA-006或Pam3Cys-Ser-PEG3000的各种稀释液中。
通过测量由萤光素酶活性引起的发光来确定成功的受体结合和随后的信号转导事件(图20)。结果表明，Pam3Cys-Ser-PEG3000在测试的剂量范围内(12.2pM至3.125pM)在信号传导NF-κB的能力方面不如INNA-006。
实例7-TLR结合和特异性
评估INNA-006激活一系列其他TLR模式识别受体的能力。使用人和小鼠TLR组两者进行这些评估。这些测定法检测受启动子控制的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因，该启动子在HEK293细胞中可通过NF-κB激活而诱导。
分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因受可由转录因子NF-κB诱导的启动子的控制。该报告基因允许基于NF-κB的激活监测通过TLR的信号传导。在含有适当细胞(50,000-75,000个细胞/孔)的96孔板(200μL总体积)中，向孔中添加20μL供试品或阳性对照配体。被添加到孔中的培养基设计用于检测NF-κB诱导的SEAP表达。温育16-24小时后，在分子仪器公司(Molecular Devices)SpectraMax 340PC吸光度检测器上在650nm处读取光密度(OD)。
对照配体
hTLR2：1×108个细胞/mL的HKLM(热灭活的单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes))
hTLR3：1μg/mL的Poly(I:C)HMW
hTLR4：100ng/mL的大肠杆菌(E.coli)K12 LPS
hTLR5：100ng/mL的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)鞭毛蛋白
hTLR7：1μg/mL的CL307
hTLR8：1μg/mL的CL075
hTLR9：1μg/mL的CpG ODN2006。
在测试的条件下，证实了INNA-006能够激活其提出的靶标(TLR-2)并且未显示出在这些测定中测试的任何其他TLR的激活(图21)。

Claims (15)

1.包含TLR2激动剂的化合物在制备用于治疗或预防患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者中鼻病毒介导的COPD恶化的药物中的用途，其中该化合物包含TLR2激动剂和增溶剂，该TLR2激动剂包含脂肽，脂肽包含脂质部分和一种或多种氨基酸，其中所述脂质部分选自棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、月桂酰和癸酰，其中TLR2激动剂与增溶剂连接，其中增溶剂包括聚乙二醇(PEG)。
2.根据权利要求1所述的用途，其中该药物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其中该TLR2激动剂包含脂肽，所述脂肽选自由以下项组成的组：Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys和Oct2Cys。
4.根据权利要求3所述的用途，其中脂肽为Pam2Cys。
5.根据权利要求1所述的用途，其中该包含TLR2激动剂的化合物包含以下结构：
A-Y-B
其中A包含以下项或由以下项组成：
其中每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；
Y为
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
并且
B包含聚乙二醇(PEG)或由聚乙二醇(PEG)组成，
或其药学上可接受的盐或前药。
6.根据权利要求1所述的用途，其中该包含TLR2激动剂的化合物包含Pam2Cys和PEG，其中该Pam2Cys和PEG通过丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸或磷酸丝氨酸残基连接，
其中
该化合物中的Pam2Cys具有以下结构：
7.根据权利要求1所述的用途，其中该化合物包含：
其中R1和R2独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R2均不是H；
与聚乙二醇(PEG)共价连接，
或其药学上可接受的盐或前药。
8.根据权利要求1所述的用途，其中该化合物具有化合物(1)的结构：
或其药学上可接受的盐或前药。
9.根据权利要求1所述的用途，其中该化合物具有化合物(5)的结构：
10.根据权利要求1所述的用途，其中该化合物具有式(IVa)：
Pam2Cys-Ser-Ser-NH-(CH2)p-O-(CH2-CH2-O)n-[(CH2)m-CO-L-]qR3(IVa)
其中
Pam2Cys具有以下结构：
n为3至100；
m为1、2、3或4；
p为2、3或4；
q为零或1；
其中当q为零时，R3为H；
其中当q为1时，R3为-NH2或-OH；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
11.根据权利要求1所述的用途，其中该化合物具有式(Va)：
其中
n为3至100；
k为3至100；
h为1、2、3或4；
m为1、2、3或4；
每个g独立地为10、11、12、13、14、15、16、17或18；p为2、3或4；
t为2、3或4；
q为零或1；
R1、R1’、R2和R2’独立地选自由H、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(CH3)OH和-CH2OPO(OH)2组成的组，其中烷基氢中的任一个可被卤素取代，并且其中R1和R1’均不是H，并且R2和R2’均不是H；
其中当q为零时，R3为H；
其中当q为1时，R3为-NH2或-OH；
L为零或由1至10个单元组成，其中每个单元为天然α氨基酸或衍生自天然α氨基酸，并且具有下式：
其中R4为H；并且
R5为侧链，或该氨基酸的第二个氢，
或其药学上可接受的盐或前药。
12.根据权利要求1所述的用途，其中该TLR2激动剂每天施用一次或每周施用一次。
13.根据权利要求2所述的用途，其中将药物施用于呼吸道。
14.根据权利要求13所述的用途，其中组合物通过吸入或经鼻内施用给该受试者。
15.根据权利要求13所述的用途，其中该用途进一步包括施用皮质类固醇。
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