CN118076372A

CN118076372A - 治疗和预防肺病的组合物和方法

Info

Publication number: CN118076372A
Application number: CN202280061457.6A
Authority: CN
Inventors: 朱莉·莱德福德; 莫妮卡·克拉夫特; 约瑟夫·瓦格纳
Original assignee: Redo LLC; University of Arizona
Current assignee: Redo LLC; University of Arizona
Priority date: 2021-08-23
Filing date: 2022-08-23
Publication date: 2024-05-24
Also published as: AU2022332283A1; KR20240052799A; EP4392052A1; CA3175945A1

Abstract

本文提供了用于治疗和预防肺病的组合物和方法。具体地，本文提供SP‑A肽及其在治疗和预防肺病(例如，哮喘或COPD)中的用途。所述组合物可以包含具有氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的肽。所述肽组合物还可用于治疗COVID‑19。

Description

治疗和预防肺病的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月23日提交的美国专利申请第17/409,642号的优先权，该申请的说明书通过引用整体并入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的R0I HL125602和U19 AI125357号拨款的政府支持下完成的。政府对这项发明有一定的权利。

技术领域

本文提供了用于治疗和预防肺病的组合物和方法。具体地，本文提供SP-A肽及其在治疗和预防肺病(例如，炎性肺病(例如，哮喘))中的用途。

背景技术

哮喘是儿童和成人中最常见的呼吸道疾病，影响着世界10％的人口，仅在美国就有2500万人。哮喘是一种以气道高反应性、炎症和间歇性呼吸道症状为特征的慢性综合征。哮喘造成的医疗保健负担非常巨大，如果考虑到直接护理医疗保健成本和生产力损失，美国每年的支出高达810亿美元。尽管成本高昂且患病率不断上升，但由于哮喘的异质性，人们对哮喘的了解仍然很少且难以控制。

哮喘发病和死亡的一个重要原因是急性加重，它可导致气道损伤、重塑、肺功能下降和死亡。大多数病情加重是由呼吸道感染(例如鼻病毒或肺炎支原体)引起的，对这些感染的反应很复杂，涉及先天免疫系统和适应性免疫系统。在严重哮喘患者中，病情加重与肺功能加速下降有关。由于肺功能下降是哮喘严重发作的危险因素，这种恶性循环会促进哮喘易发作的表型。因此，对哮喘加重机制的理解一直是理解哮喘病理学进展的关键障碍。哮喘恶化时的宿主反应很复杂，涉及先天免疫系统和适应性免疫系统。在现有的治疗方法中，目前还没有用于治疗哮喘的先天免疫调节剂，并且那些针对适应性免疫系统的治疗方法也无法控制该疾病。因此，非常需要开发针对治疗哮喘和其他炎性肺病的先天反应的新疗法。

发明内容

本发明的一个目的是提供允许治疗和预防肺病(例如，炎性肺病(例如，哮喘))的组合物和方法，如独立权利要求中所述的。本发明的实施方案在从属权利要求中给出。本发明的实施方案在不相互排斥的情况下可以彼此自由组合。

表面活性蛋白A(SP-A)是一种分泌性脂蛋白复合物。SP-A是一种先天免疫调节剂，由几种类型的肺细胞(肺泡II型细胞、气道分泌细胞和粘膜下腺细胞)产生和分泌，并作为抵御整个上呼吸道和下呼吸道吸入性损伤(例如感染性和/或环境损伤)的第一道防线。它充当肺部病原体吞噬作用和炎性过程的调节因子。成熟的SP-A是衍生自SP-A1基因和SP-A2基因的异源寡聚产物。

本文所述的实验证明，在哮喘患者中，SP-A野生型序列(SEQ ID NO:1)内的SP-A2Gln223Lys(即Q223K)等位基因与肺功能下降、哮喘控制下降以及BAL和血清嗜酸性粒细胞增多有关。因此，SP-A是嗜酸性粒细胞脱粒和存活以及粘蛋白分泌和2型炎症的关键调节因子，因此可能显着影响哮喘的严重程度。对分离的嗜酸性粒细胞、SP-A缺陷小鼠和含有感兴趣的特异性SP-A等位基因寡聚物的SP-A(例如，本文所述的包含SEQ ID NO:9的纯化的肽)的体外研究发现SP-A直接刺激嗜酸性粒细胞核凋亡，并且这种作用可以通过特异性的SP-A肽来概括，并且发现SP-A等位点变体差异性地调节嗜酸性粒反应。

不希望将本发明限制于任何理论或机制，据信SP-A在支气管肺泡区室中遇到嗜酸性粒细胞，并且是炎性过程消退阶段期间嗜酸性粒细胞凋亡的关键调节因子。如本文所述，SP-A在嗜酸性粒细胞中直接诱导细胞凋亡信号通路，导致过敏表型如粘蛋白产生和嗜酸性粒细胞的衰减。SP-A可减弱从患有过敏性或2型哮喘的哮喘受试者获得的气道上皮细胞中由IL-13诱导的粘蛋白和IL-6。

本发明的特征在于用于治疗和预防肺病(例如，炎性肺病)的组合物和方法。具体地，本文提供SP-A肽及其在治疗和预防肺病(例如，哮喘)中的用途。在一些实施方案中，本发明的特征在于治疗有需要的受试者的炎性肺病的方法。所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的任何一种组合物(例如，纯化的肽)。本发明的特征还在于包括氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的纯化的肽，其用于治疗有需要的受试者的炎性肺病的方法中。

在一些实施方案中，本发明的特征在于用于增强细胞中SP-A活性的方法和组合物(例如，药物组合物)。所述组合物(例如，药物组合物)可以包含本文所述的任何一种纯化的肽和药物载体。在一些实施方案中，所述组合物在用于气雾化的制剂中。所述方法可以包括将本文所述的任何一种组合物递送至细胞(例如，肺细胞)。

进一步的实施方案提供了一种系统，其包含：a)本文所述的任何一种组合物；和b)用于肺部递送所述组合物的装置。在一些实施方案中，所述装置是定量吸入器。

本发明的独特且创造性的技术特征之一是使用包含KEQCVE(SEQ ID NO:9)(即6-mer)的氨基酸序列肽。不希望将本发明限制于任何理论或机制，据信本发明的技术特征有利地提供吸入递送。另外，包含6-mer(即KEQCVE(SEQ ID NO:9))对于较大的拟肽(即10-mers或20-mers)的活性是必要的。此外，与较大的肽相比，较小的(即6-mer)肽在肺部沉积得更深处(即，肽能够进一步进入肺部)。此外，本文描述的肽能够替代和/或增强肺内的SP-A。目前已知的现有参考文献或工作均不具有本发明的独特的、创造性的技术特征。

在现有的治疗方法中，目前还没有用于治疗哮喘的先天免疫调节剂，并且那些针对适应性免疫系统的治疗方法也无法控制该疾病。因此，非常需要开发针对治疗哮喘和其他炎性肺病的先天反应的新疗法。我们发现了模拟表面活性蛋白A(SP-A)作用的小分子。SP-A是肺内壁液的天然成分，是第一道防线。一些哮喘患者没有SP-A或SP-A受损。由于全长SP-A尺寸大且结构复杂，直接递送到肺部是不可行的。我们首先开发了一系列衍生自SP-A2凝集素结构域的10-20个氨基酸肽，以确定特定的活性区域。本文所述的研究结果表明，在两种不同的临床前哮喘小鼠模型中，10-20个氨基酸的SP-A肽可，气道收缩是哮喘的基本特征。

此外，本发明的创造性技术特征促成了出人预料的结果。例如，包含6-mer(即KEQCVE(SEQ ID NO:9))的拟肽影响(即降低)嗜酸性粒细胞活力和STAT信号传导，这最终将有益于哮喘患者。另外，在临床前动物试验中，包括6-mer(即KEQCVE(SEQ ID NO:9))的拟肽在雄性和雌性中都具有活性。此外，包括6-mer(即KEQCVE(SEQ ID NO:9))的拟肽分两个阶段起作用：(1)急性期，减少气道粘液产生和对乙酰甲胆碱的高反应性；(2)晚期阶段，清除肺部的炎性嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。最后，包括6-mer(即KEQCVE(SEQ ID NO:9))的拟肽可以在更长的时间内发挥作用；例如，一剂药效可持续7-10天。在人类气道细胞中，拟肽还可以减少粘液和促炎介质。

本文描述的任何特征或特征的组合都包括在本发明的范围内，只要包括在任何这样的组合中的特征不是相互矛盾的，如从上下文、本说明书和本领域普通技术人员的知识中显而易见的。本发明的附加优点和方面在下面的详细描述和权利要求中是显而易见的。

附图简要说明

通过考虑下面结合附图给出的详细描述，本发明的特征和优点将变得显而易见，其中：

图1显示10-mer(即SEQ ID NO:4)和/或20-mer(即SEQ ID NO:8)SP-A肽以及其他肽如何形成的非限制性概述。本文所述的SP-A肽在两种不同的临床前哮喘小鼠模型中减少气道收缩，气道收缩是哮喘的基本特征。如图1所示，本文发现的保护作用机制是由于1)与嗜酸性粒细胞(哮喘中的关键炎性细胞)直接相互作用，以诱导细胞凋亡并促进其从气道中消退，以及2)与排列在肺部并参与炎性过程的上皮细胞直接相互作用以抑制粘蛋白的产生。

图2A和2B显示SP-A2的遗传变异与肺功能和哮喘控制的变化相关。在由53名哮喘受试者组成的队列中，根据SP-A2基因的rs1965708(Gln223Lys)等位基因进行分层，预测FEV1和哮喘控制问卷得分的百分比。与223Q/K杂合子和主要等位基因(223Q/Q纯合子)基因型相比，223K/K基因型的哮喘受试者表现出明显较差的哮喘控制(右图)和较低的肺功能(左图)。与Q/Q相比，*p＜0.05。

图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G和3H显示SP-A2中的遗传变异决定了人源化SP-A转基因小鼠中针对IL-13诱导的炎症的保护程度。来自IL-13攻击的小鼠的BAL细胞(图3A)，其由巨噬细胞(图3B)、嗜中性粒细胞(图3C)和嗜酸性粒细胞(图3D)组成。如图3E显示来自IL-13攻击的小鼠的PAS评分的肺组织学。N＝12WT；15SP-A-/-；8SP-A223Q/Q；每组12个SP-A223K/K，来自3次独立的实验重复。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。通过单向方差分析和Dunnett多重比较检验，****p<0.0001。图3F显示了用IL-13治疗的每种基因型的代表性PAS图像。如图3G和3H显示通过来自代表性肺样品的Western印迹和密度测定法的Stat3磷酸化；单向Anova与Tukey的多重比较，*p＜0.05。

图4A和4B显示SP-A2的遗传变异决定了哮喘参与者的支气管上皮细胞针对IL-13诱导的炎症的保护程度。图4A显示了在气液界面(ALI)培养的支气管上皮细胞(n＝3个正常细胞，n＝3个哮喘细胞)在IL-13治疗5天后，在攻击前30分钟添加全长重组SP-A2(223K)(20μg/ml)或SP-A2(223Q)(20μg/ml)的情况下MUC5AC RNA的表达。对管家基因进行标准化后，数据显示为相对于每个相应患者组的非IL-13攻击对照的倍数，并显示标准偏差。显示平均倍数变化和标准偏差。*p<0.05。图4B显示SP-A2的仅在位置223(Q和K)不同的遗传变体，相对于提取的人寡聚对照SP-A，检查其与IL-13的相对结合。

图5A、5B、5C和5D显示用SP-A肽治疗的HDM攻击的SP-A缺陷小鼠具有减少的炎症特征。图5A显示了在第0、7和14天用HDM鼻内攻击的SP-A缺陷小鼠。在第15天，将小鼠分组并通过口咽滴注以25μg/ml的浓度(约1mg/kg体重)给予载体或SP-A肽(10-mer(即SEQ ID NO:4)或20-mer(即SEQ ID NO:8))。在第19天，处死小鼠，并评估BAL中的嗜酸性粒细胞(图5B)和肺组织学切片(图5D)中的粘蛋白产生(图5C)。n＝10，10，**p<0.01，***p<0.001通过单向Anova进行多重比较。

图6A、6B和6C显示缩短的10AA肽减少小鼠HDM模型中的粘蛋白产生(图6A)和嗜酸性粒细胞增多(图6B)，并减少人原代细胞中的粘蛋白(Muc5AC RNA)(6C)。

图7A、7B、7C、7D和7E显示用SP-A肽治疗的HDM攻击的WT小鼠对乙酰甲胆碱攻击的敏感性降低。图7A显示了在第0、7和14天用HDM鼻内攻击的WT雄性小鼠。在第1、8和15天，将小鼠分组并通过口咽滴注给予载体或SP-A肽(10-mer(即SEQ ID NO:4)，25μg/ml，约1mg/kg体重)。在第19天，当小鼠处于麻醉状态时，在乙酰甲胆碱攻击期间进行肺功能测试。图7B显示总气道阻力(Rrs)。图7C显示牛顿阻力(Rn)。图7D显示总气道弹性(Ers)并且图7E显示了由flexivent评估的组织阻尼。绘制的数据为平均值+/-SEM。n＝12,12，*p<0.05，**p<0.01，通过每个指定剂量的t检验得出。

图8A和8B显示SP-A肽在IL-13模型中防止气道高反应性(AHR)。

图9显示用SP-A 10-mer肽(即SEQ ID NO:4)治疗的IL-13攻击的小鼠具有改善的肺功能。WT雄性小鼠用载体(生理盐水)或IL-13(3.9μg)通过口咽施用攻击，连续3天。每次IL-13攻击后两小时，小鼠通过口咽递送接受载体(生理盐水)或SP-A 10-mer肽(25μg/ml；约1mg/kg体重)。第4天在带有负压驱动强制呼气(NPFE)延长装置的FlexiVent机器(SCIREQ)上进行肺功能测试。IL-13攻击导致0.05秒时牛顿阻力(Rn)显著增加，用力呼气容积(FEV)降低。用SP-A 10-mer肽治疗可防止IL-13诱导的Rn增加和FEV降低。绘制平均值+/-SEM，n＝如2个独立实验所示。通过方差分析进行多重比较，*p<0.05，***p<0.001。

图10显示用SP-A肽治疗的原代人肺上皮细胞具有降低的IL-13诱导的MUC5AC基因表达。将衍生自正常和哮喘参与者的原代人支气管上皮细胞与20-mer(即SEQ ID NO:8)或10-mer(即SEQ ID NO:8)SP-A肽(20μg/ml))一起孵育30分钟，然后用IL-13(10ng/ml)刺激5天。当一起考虑时(哮喘细胞和正常细胞)，与单独使用IL-13相比，SP-A 20-mer治疗组中的MUC5AC基因表达显著降低(p＝0.004)。

图11A、11B、11C和11D显示随时间推移的BALF嗜酸性粒细胞增多的评估。图11A显示过敏性气道的OVA模型。图11B显示了最终攻击后24小时、3天和5天时BALF中的细胞分布。图11C显示嗜酸性粒细胞频率随时间的设定变化。图11D显示24小时和5天的平均值差异，未配对的Student t检验。采用Bonferonni校正进行多重比较的单向方差分析，*p<0.05，**p<0.01数据(平均值±SEM)来自至少两次独立实验，n＝3-5只小鼠/组。

图12A、12B、12C、12D和12E显示了组织嗜酸性粒细胞随时间的评估。图12A显示了通过天狼星红染色得到的肺组织中的嗜酸性粒细胞的代表性亮场图像(箭头表示代表性嗜酸性粒细胞)(上图：40倍放大倍数，下图：100倍放大倍数)。图12B显示第5天嗜酸性粒细胞计数的定量。图12C显示了嗜酸性粒细胞频率随时间的净变化。图12D显示了24小时和5天的平均值的差异，未配对的Student t检验，#p＜0.05，**p＜0.01。图12E显示了最终攻击后5天肺组织中的嗜酸性粒细胞相关核糖核酸酶(EAR)mRNA。采用Bonferonni校正进行多重比较的单向方差分析，*p<0.05。数据(平均值±SEM)来自至少两次独立实验，n＝3-5只小鼠/组。

图13A、13B、13C和13D显示了SP-A在体外诱导小鼠和人嗜酸性粒细胞中嗜酸性粒细胞凋亡的能力的评估。图13A显示了通过台盼蓝评估的活力的时间进程，图13B显示了实时细胞分析仪(RTCA)追踪和SP-A体外刺激小鼠嗜酸性粒细胞的剂量响应，AUC＝曲线下面积。图13C通过膜联蛋白V和PI的人嗜酸性粒细胞凋亡和细胞死亡以及与SP-A孵育16小时后的定量的代表性流程图；活＝膜联蛋白V-，PI-，早期凋亡＝膜联蛋白V+，PI-，晚期凋亡/死亡＝膜联蛋白V+，PI+图13D显示通过标准化为未治疗对照的小鼠嗜酸性粒细胞的Western印迹测定的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的光密度测定。多重比较校正的方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。数据(平均值±SEM)来自至少两次独立实验，n＝2-3次重复/处理。

图14A、14B和14C显示了OVA攻击后外源性SP-A施用对SP-A缺陷小鼠中嗜酸性粒细胞的影响的评估。图14A显示OVA攻击和SP-A救援的示意图。图14B显示了膜联蛋白V和PI引起的嗜酸性粒细胞凋亡和细胞死亡的代表性流程图。图14C显示了最终攻击后5天BALF中的总活嗜酸性粒细胞计数。*p<0.05。数据(平均值±SEM)代表了n＝5只小鼠/组的两个独立实验。

图15A和15B显示Ova模型中SP-A2人源化小鼠的炎症分析。在Ova模型中对小鼠进行致敏和攻击，攻击后24小时评估BAL细胞结构(左图)，攻击后7天评估粘蛋白产生(右图)。与SP-A-/-小鼠相比，人类SP-A 223Q在小鼠中的存在通过减少嗜酸性粒细胞增多和粘蛋白产生而产生更多的保护作用。Ova攻击后，与WT对照小鼠(具有正常小鼠SP-A)相比，表达SP-A 223Q的小鼠具有相似的BAL嗜酸性粒细胞增多和粘蛋白产生。

图16A和16B显示了在HDM模型中接受“治疗性”SP-A肽的小鼠的炎症分析。按照常规方法在HDM模型中对小鼠进行致敏和攻击。最后一次攻击后24小时，小鼠接受了载体、20-mer或10-mer(包含223Q活性位点)。攻击后7天评估BAL细胞结构(左图)和粘蛋白产生(右图)，以评估SP-A对过敏性气道缓解的作用。与WT小鼠相比，SP-A KO小鼠的BAL嗜酸性粒细胞增多显着增强。223Q和223K小鼠在该模型的急性期都受到一定程度的保护。

图17显示在人气道上皮细胞中IL-13暴露后SP-A 223Q 10-mer肽显着抑制MUCSAC表达。将两名哮喘参与者在气液界面培养的气道上皮细胞暴露于单独的IL-13或IL-13加SP-A2肽，其中包括凝集素结构域(223Q)223位处的Gln。在位置223Q/Q处纯合的全长寡聚SP-A用作阳性对照。孵育48小时后，通过RT-PCR测定MUCSAC表达。

图18显示肥胖的哮喘患者中SP-A显著降低。这可能是SP-A肽治疗的目标群体。

图19显示，在取自哮喘患者的人气道上皮细胞中，本文所述的肽和先导拟肽(即，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8(肽)；以及SEQ ID NO:12(拟肽))减少哮喘中激活的关键信号通路STAT3。Stat3信号的激活会导致气道炎症和粘液产生，从而使哮喘恶化。通过使用顶级候选物(例如，SEQ ID NO:12)将该关键信号通路减少40-50％和/或现在80％，这将转化为通过减少哮喘症状来显著保护哮喘患者的肺部。具体地，下图显示拟肽先导物(即SEQ IDNO:12)减少来自哮喘患者的气道上皮细胞中IL-13刺激的Stat-3信号传导。支气管上皮细胞在气液界面培养并分化14天。在用IL-13(50ng/ml)基底外侧刺激30分钟之前，用拟肽先导物867(即，SEQ ID NO:12)以增加的剂量基底外侧处理细胞1小时。通过Western印迹分析总细胞裂解物的STAT3磷酸化与总STAT3和β-肌动蛋白的比较。

图20显示拟肽先导物(例如，SEQ ID NO:25或C892)减少HEK报告细胞中IL-6刺激的STAT-3信号传导。将细胞用浓度逐渐增加的C892预处理30分钟，然后用IL-6(16ng/ml)刺激18小时。在Clariostar机器上暴露于底物一分钟后，读取通过细胞荧光测量的STAT-3激活。每个条件n＝3次重复。

图21显示拟肽先导物(例如SEQ ID NO:12或C867)减少来自4名患有2型哮喘的参与者的气道上皮细胞的MUC5AC表达。通过支气管镜检查获得的细胞在气液界面培养14天。第14天，细胞分化、表达纤毛并产生粘液。一些细胞用C867(13.08μM)预处理一小时，然后用IL-13(10ng/ml)刺激五天，IL-13对粘液和粘蛋白基因表达具有显著刺激作用。MUC5AC基因表达显著降低42％(p＝0.01)。

图22显示了在哮喘模型中，拟肽先导物(例如，SEQ ID NO:25或C892)减少对乙酰甲胆碱攻击的支气管收缩。每次攻击后第0、7、14和24小时用HDM处理WT C57BL/6雌性小鼠，一些小鼠接受先导化合物(来自表1)。在第16天对乙酰甲胆碱进行AHR。*ANOVA、HDM与生理盐水相比，p<0.05；HDM+先导化合物与盐水对照无差异。

图23显示与全长SP-A相比，拟肽先导物减少HEK报道细胞中IL-6刺激的STAT-3信号传导。将细胞用全长SP-A或先导肽以递增的浓度预处理30分钟，然后用IL-6(16ng/ml)刺激18小时。在Clariostar机器上暴露于底物一分钟后，读取通过细胞荧光测量的STAT-3激活。每个条件n＝3次重复。

图24显示包含小寡聚乙二醇接头Pego的SEQ ID NO:23的结构。具体地，SEQ IDNO:23包含3个Pego单元(即，Pego3)，每个单元3个具有通过二甘醇二酸连接的乙二醇，MW230/单元。在C末端现在存在脂质附着Hdc。

图25显示SP-A与过表达ACE2的HEK293T裂解物的结合。在存在Ca²⁺(实线)或不存在Ca²⁺(虚线)的情况下，将SP-A包被的板与不同浓度过表达ACE2的293T细胞的裂解物一起孵育。通过450nm波长处的吸光度检测与人抗ACE2的结合，并通过读板器读取。未转染的293T细胞裂解物(虚线)作为阴性对照进行测试。n＝3次实验。

图26显示SP-A 20-mer肽竞争结合ACE过表达细胞。全长SP-A或SP-A 20-mer竞争(抑制)ACE2与板结合的SP-A的结合。20-mer扰序(SCR)肽几乎没有影响。n＝3次实验。

图27A和27B显示全长SP-A减少刺突蛋白与过表达ACE2的细胞的结合。

图28显示SP-A减少S1蛋白假型慢病毒颗粒体外转导至过表达ACE2的细胞。

图29显示SP-A减弱肺泡类器官中的SARS-CoV-2感染。用SP-A预处理肺泡类器官可显著降低SARS-CoV-2N基因表达。数据表示为相对于CoV2样本的倍数变化±SEM。MOCK样品中未检测到N基因表达。使用单向方差分析和Tukey事后检验对数据进行分析***p<0.0001。n＝3次技术重复。

图30显示SP-A 20-mer肽抑制ACE-2/SPIKE介导的假病毒进入。

定义：

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指包含天然或非天然氨基酸残基的氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在定义内。该定义涵盖全长蛋白质及其片段。该术语还包括多肽的翻译后修饰，包括例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。此外，本文中的“多肽”还指修饰的蛋白质，例如对天然序列的单个或多个氨基酸残基缺失、添加和取代，只要该蛋白质保持期望的活性即可。例如，可以取代丝氨酸残基以消除单个反应性半胱氨酸或去除二硫键，或者可以进行保守氨基酸取代以消除切割位点。这些修饰可能是有意的，如通过定点突变，也可能是偶然的，如通过宿主突变，产生蛋白质或由于聚合酶链式反应(PCR)扩增而产生错误。

如本文所用，术语“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的短聚合物。与其他氨基酸聚合物(例如蛋白质、多肽等)相比，肽的长度为约50个氨基酸或更短。肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和/或修饰的氨基酸。肽可以是天然存在的蛋白质的子序列或非天然(合成)序列。

如本文所用，术语“野生型”是指基因、等位基因、基因型、多肽或表型的非突变形式、或其中任何一个的片段。它可以自然存在或重组产生。本文所用，术语“变体”是指通过单个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而与参考核酸分子或多肽不同并且基本上保留参考核酸分子或者多肽的至少一种生物活性的核酸分子或肽。

术语“肽模拟物”或“拟肽”是指模拟衍生自蛋白质或肽的序列的肽样分子。肽模拟物或拟肽可以含有氨基酸和/或非氨基酸成分。拟肽的例子包括化学修饰的肽、类肽(侧链附加到肽主链的氮原子上，而不是α-碳)、P-肽(连接到β碳而不是α碳的氨基)等。

如本文所用，“保守”氨基酸取代是指肽或多肽中的氨基酸被具有相似化学性质(例如大小或电荷)的另一氨基酸取代。为了本公开的目的，以下八组中的每一组含有彼此保守取代的氨基酸：(1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；(2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；(7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；(8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)。

天然存在的残基可以根据共同的侧链特性分为几类，例如：极性阳性(组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R))；极性阴性(天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；极性中性(丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q))；非极性脂肪族(丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M))；非极性芳香族(苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))；脯氨酸和甘氨酸；和半胱氨酸。如本文所用，“半保守”氨基酸取代是指肽或多肽中的氨基酸被同一类别内的另一个氨基酸取代。

在一些实施方案中，除非另有说明，保守或半保守氨基酸取代还可涵盖具有与天然残基相似的化学性质的非天然存在的氨基酸残基。这些非天然残基通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来掺入。这些包括但不限于拟肽和和其他反向或倒置形式的氨基酸部分。在一些实施方案中，本文的实施方案可以限于天然氨基酸、非天然氨基酸和/或氨基酸类似物。非保守取代可能涉及将一个类别的成员替换为另一类别的成员。

如本文所用，术语“序列同一性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相同的单体亚基序列组成的程度。术语“序列相似性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)仅因保守和/或半保守氨基酸取代而不同的程度。“序列同一性百分比”(或“序列相似性百分比”)通过以下方式计算：(1)在一个比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度和指定窗口等)上比较两个最佳排列的序列，(2)确定包含相同(或相似)的位置的数量单体(例如，两个序列中出现相同的氨基酸，两个顺序中出现相似的氨基酸)产生匹配位置的数量，(3)将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定的窗口)，以及(4)将结果乘100得出序列同一性百分比或序列相似性百分比。例如，如果肽A和B的长度均为20个氨基酸，并且除1个位置外的所有氨基酸均相同，则肽A和肽B具有95％的序列同一性。如果不相同位置的氨基酸具有相同的生物物理特征(例如，两者都是酸性的)，则肽A和肽B将具有100％的序列相似性。作为另一个例子，如果肽C的长度是20个氨基酸，肽D的长度是15个氨基酸，并且肽D中的15个氨基酸中的14个与肽C的一部分的氨基酸相同，则肽C和D具有70％的序列同一性，但肽D与肽C最佳比较窗口具有93.3％的序列同同一性(或“序列相似度百分比”)，在这里，对齐序列中的任何间隙都被视为该位置的失配。

受试者、“个体”、“宿主”、“动物”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于啮齿类动物、猿类、人类、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳动物实验动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。

如本文所用，术语“施用”和“给药”是指对受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官给予药物、前药或其他制剂或治疗性治疗(如SP-A肽)的行为。对人体的示例性施用途径可以是通过脑或脊髓的蛛网膜下的空间(鞘内)、眼睛(眼用)、口腔(口服)、皮肤(局部或经皮)、鼻子(鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(颊)、耳、直肠、阴道、通过注射(例如静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等)等。

如本文所用，术语“共同施用”和“联合施用”是指对受试者施用至少两种药剂(例如，多种SP-A肽或一种SP-A肽和另一种治疗剂)或疗法。在一些实施方案中，同时给予两种或多种药剂或疗法。在其他实施方案中，第一药剂/疗法在第二药剂/疗法之前施用。本领域技术人员理解，所使用的各种药剂或疗法的制剂和/或施用途径可以变化。联合施用的适当剂量可由本领域技术人员容易地确定。在一些实施方案中，当药剂或疗法联合施用时，各药剂或疗法的施用剂量低于单独施用的剂量。因此，在药剂或疗法的共同施用降低了潜在有害(例如，有毒)药剂的必需剂量的实施方案中，和/或当两种或多种药物的共同施用剂导致受试者通过共同施用另一种药物而对一种药物的有益作用敏感时，共同施用是特别可取的。

本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物(包括人类)疾病的治疗剂的任何施用或应用，并且包括抑制疾病、阻止其发展或缓解疾病，例如通过引起消退或恢复或修复丢失、缺失或有缺陷的功能；或刺激低效的过程。

“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一起施用给受试者的本领域常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制助剂或载体。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且与药物的其他成分相容。药学上可接受的载体适合于所采用的制剂。例如，如果治疗剂要口服施用，则载体可以是凝胶胶囊。如果治疗剂要皮下施用，载体理想地不会刺激皮肤并且不会引起注射部位反应。

具体实施方式

在公开和描述本发明的化合物、组合物和/或方法之前，应当理解，本发明不限于特定的合成方法或特定的组合物，因为它们当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而不是旨在进行限制。

现在参考图1至图30，本发明的特征在于用于治疗和预防肺病的组合物和方法。具体地，本文提供SP-A肽及其在治疗和预防肺病(例如，炎性肺病(例如，哮喘))中的用途。

本发明的特征在于使用肽来治疗和预防肺病(例如，炎性肺病)的组合物和方法，所述肽的序列衍生自内源性人SP-A的活性区，并且在SP-A2肽的223位包含主要Q等位基因。例如，在一些实施方案中，包含肽的组合物，所述肽包含选自例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。或具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％)的肽提供与肽的同一性(97％、98％、99％或100％)。在一些实施方案中，肽结合受体，所述受体选自例如FC(CD16/32)、Sirpα、TLR-2、EGFR或MYADM(骨髓相关分化标记物)。

在一些实施方案中，本发明的特征在于治疗有需要的受试者的炎性肺病(例如，哮喘)的方法。所述方法可以包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的纯化的肽(例如，包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的纯化的肽)。在其他实施方案中，本发明的特征在于包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的纯化的肽，其用于治疗有需要的受试者的炎性肺病的方法。

本发明的特征在于用于增强细胞中SP-A活性的方法和组合物(例如，药物组合物)。所述组合物可以包含本文所述的任何纯化的肽和药物载体。在一些实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包含纯化的肽和药物载体，所述纯化的肽包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)。在其他实施方案中，组合物(例如药物组合物)包含纯化的肽和药物载体，所述纯化的肽包含氨基酸序列KEQCVE(Xaa)n(SEQ ID NO:10)；其中n的范围是4-16个氨基酸，Xaa是任何天然或非天然氨基酸。在进一步的实施方案中，所述组合物(例如，药物组合物)包含纯化的肽和药物载体，所述纯化的肽包含氨基酸序列(Xaa)nKEQCVE(Xaa)n(SEQ IDNO:20)；其中n的范围为1至16个氨基酸，并且Xaa是任何天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述组合物在用于雾化的制剂中。用于增强细胞中SP-A活性的方法可以包括将包含如本文所述的纯化的肽(例如，包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的肽)的组合物递送至细胞(例如，肺细胞)。

在一些实施方案中，n的范围为0至20个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为0至15个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为0至10个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为0至5个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为0至1个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为1至20个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为1至15个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为1至10个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为1至5个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为4至20个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为4至15个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为4至10个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为4至5个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为5至20个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为5至15个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为5至10个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为10至20个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为10至15个氨基酸。在一些实施方案中，n的范围为15至20个氨基酸。

表1显示了可根据本文描述的组合物和方法使用的纯化的肽的非限制性实例

在一些实施方案中，上述肽(即，表1中列出的肽)包含与所提供的肽具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％)同一性的氨基酸序列，基本上由与所提供的肽具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％)同一性的氨基酸序列组成，或由与所提供的肽具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％)同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包括药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于肺部递送。在其他实施方案中，上述肽(即，表1中列出的肽)可以包含与所提供的肽具有至少95％、90％、85％、83％、80％、75％或70％同一性的氨基酸序列，基本上由与所提供的肽具有至少95％、90％、85％、83％、80％、75％或70％同一性的氨基酸序列组成，或由与所提供的肽具有至少95％、90％、85％、83％、80％、75％或70％同一性的氨基酸序列组成。

参见表1，Nle指正亮氨酸，是一种氨基酸，其化学式为CH₃(CH2)₃CH(NH2)CO₂H(或系统名称为2-氨基己酸)，Pego3指聚乙二醇化，其是生物活性分子与聚乙二醇(PEG)的生物化学修饰过程，其为被认为用于细胞的治疗或遗传修饰的蛋白质/肽、抗体和囊泡提供了一些所需的特性。聚乙二醇化通常通过将PEG的反应性衍生物与靶分子一起孵育来实现。PEG与药物或治疗蛋白的共价连接可以“掩盖”宿主免疫系统的药剂(降低免疫原性和抗原性)，并增加其流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)，从而通过减少肾脏清除率来延长其循环时间。聚乙二醇化还可以为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。聚乙二醇化技术已证明其药理优势和可接受性，是不断增长的数十亿美元产业的基础。此外，乙酰基(Ac)修饰可用于与天然蛋白质的乙酰基修饰紧密匹配，并稳定拟肽以抵抗外肽酶的酶降解。

化合物C892(即，SEQ ID NO:25)是C867(即，SEQ ID NO:12)的稳定等排体类似物，并且两者在测试它们的所有测定中显示出几乎相同的活性。化合物C939(即，SEQ ID NO:23)和C940(即，SEQ ID NO:24)是化合物C892(即，SEQ ID NO:17)之外的额外步骤，并且现在包括聚乙二醇化和脂质化(Hdc)。肽脂质化已被证明是生成新肽先导物的最稳健策略，因为这种修饰增加了肽的体内稳定性并降低了肾脏清除率。

在一些实施方案中，本文所述的肽通过向C端添加胺或酸基团以及乙酰化或向N端添加组氨酸(H)来修饰。在其他实施方案中，本文描述的肽通过向N-末端添加酸来修饰。可用于修饰本文所述肽的N端的酸的非限制性实例可包括但不限于羟基(-OH)、羧基/羧酸基团(COOH)或其组合。在进一步的实施方案中，本文描述的肽用脂质基团以及C端和/或N端修饰。

在一些实施方案中，细胞是肺细胞。在一些实施方案中，所述组合物用于肺部递送。在一些实施方案中，本发明的特征在于包括本文所述的药物组合物和用于肺部递送所述组合物的装置的系统。在一些实施方案中，所述装置是定量吸入器或喷雾器。在一些实施方案中，本文描述的组合物用于治疗或预防哮喘、COPD或COVID-19。

本发明的特征在于一种方法，其包括将包含本文所述的肽的组合物递送至受试者的细胞(例如，肺细胞)。在一些实施方案中，所述肽包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)。在其他实施方案中，所述肽包含氨基酸序列KEQCVE(Xaa)n(SEQ ID NO:10)。在进一步的实施方案中，所述肽包含氨基酸序列(Xaa)nKEQCVE(Xaa)n(SEQ ID NO:20)。将肽递送至受试者的细胞(例如，肺细胞)可以导致增强细胞中的SP-A活性和/或治疗或预防受试者(即，患者)或参与者中的哮喘、COPD或COVID-19。在一些实施方案中，通过计量吸入器或喷雾器将组合物递送至细胞(例如肺细胞)。

在一些实施方案中，本文所述的组合物减少所述细胞或肺组织中的粘蛋白产生和/或减少嗜酸性粒细胞增多。在一些实施方案中，所述受试者是肥胖的。在一些实施方案中，所述肽结合受体，例如FC(CD16/32)、Sirp-α、TLR-2或EGFR。

本发明进一步提供本文所述的SP-A肽的变体和模拟物。在一些实施方案中，SP-A肽包含相对于本文描述的肽的保守、半保守和/或非保守取代(例如，在参与SP-A信号传导的位置或不参与SP-A信号传导的位置)。

实施方案不限于特定取代。在一些实施方案中，本文描述的肽被进一步修饰(例如，标准氨基酸的取代、缺失或添加；化学修饰等)。本领域理解的修饰包括N-端修饰、C-端修饰(其保护肽免于蛋白水解降解)、酰胺基团的烷基化、碳氢化合物“钉合”(例如，以稳定α-螺旋构象)。在一些实施方案中，本文描述的肽可以通过保守残基取代进行修饰，例如带电荷残基的取代(K至R、R至K、D至E和E至D)。在一些实施方案中，此类保守取代提供了例如受体结合位点的微妙变化，目的是提高特异性和/或生物活性。末端羧基的修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、受限烷基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)烷基、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。此外，一个或多个侧基或端基可以通过本领域普通肽化学家已知的保护基团进行保护。氨基酸的α-碳可以是单甲基化的或二甲基化的。

在一些实施方案中，引入一个或多个肽内二硫键(例如，在肽内的两个半胱氨酸之间)。肽内二硫键的存在可以稳定肽。

本文描述的任何实施方案可以包含对应于本文描述的肽的拟肽，其具有本领域所理解的各种修饰。在一些实施方案中，本文描述的肽序列中的残基可以被具有相似特征(例如，疏水性到疏水性、中性到中性等)或具有其他所需特征(例如，更酸性、更疏水、体积更小、体积更大等)的氨基酸取代。在一些实施方案中，非天然氨基酸(或标准20种氨基酸之外的天然存在的氨基酸)被取代以获得期望的性质。

在一些实施方案中，具有在生理条件下带正电荷的侧链的残基或期望带正电荷的侧链的残基被以下残基取代，所述残基包括但不限于：赖氨酸、高赖氨酸、δ-羟基赖氨酸、高精氨酸、2,4-二氨基丁酸、3-高精氨酸、D-精氨酸、精氨酸(精氨酸中的-COOH被-CHO取代)、2-氨基-3-胍基丙酸、硝基精氨酸(N(G)-硝基精氨酸)、亚硝基精氨酸(N(G)-亚硝基精氨酸)、甲基精氨酸(N-甲基精氨酸)、ε-N-甲基赖氨酸、异羟基赖氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,2'-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称二甲基精氨酸、非对称二甲基精氨酸、2,6-二氨基己酸、对氨基苯甲酸和3-氨基酪氨酸以及组氨酸、1-甲基组氨酸和3-甲基组氨酸。

中性残基是具有在生理条件下不带电荷的侧链的残基。极性残基优选在侧链中具有至少一个极性基团。在一些实施方案中，极性基团选自羟基、巯基、胺、酰胺和酯基团或允许形成氢桥的其他基团。在一些实施方案中，具有在生理条件下为中性/极性的侧链的残基或其中需要中性侧链的残基被以下残基取代，所述残基包括但不限于：天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、N-甲基丝氨酸、高丝氨酸、异苏氨酸和3,5-二硝基-酪氨酸和3-高丝氨酸。

具有非极性疏水侧链的残基是在生理条件下不带电荷的残基，优选具有高于0、特别是高于3的亲水指数。在一些实施方案中，非极性疏水侧链选自具有1至10个、优选2至6个碳原子的烷基、亚烷基、烷氧基、烯氧基、烷基硫基和烯基硫基残基，或具有5至12个碳原子的芳基残基。在一些实施方案中，具有非极性、疏水性侧链的残基、或需要非极性、疏水性侧链的残基被以下残基取代，所述残基包括但不限于：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、N-甲基亮氨酸、叔丁基甘氨酸、辛基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、1-氨基环己基羧酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸和N-甲基缬氨酸。

在一些实施方案中，肽和多肽是分离的和/或纯化的(或基本上分离的和/或基本上纯化的)。因此，在此类实施方案中，肽和/或多肽以基本上分离的形式提供。在一些实施方案中，例如，作为固相肽合成的结果，肽和/或多肽与其他肽和/或多肽分离。或者，在重组生产的细胞裂解后，可以将肽和/或多肽基本上与其他蛋白质分离。可以采用蛋白质纯化的标准方法(例如，HPLC)来基本上纯化的肽和/或多肽。在一些实施方案中，本发明提供了多种制剂中的肽和/或多肽的制备，这取决于所需的用途。例如，当多肽是基本上分离的(或甚至几乎完全与其他蛋白质分离)时，可以将其配制在合适的介质溶液中以供储存(例如，在冷藏条件下或在冷冻条件下)。此类制剂可以含有保护剂，例如缓冲剂、防腐剂、冷冻保护剂(例如糖，例如海藻糖)等。此类制剂的形式可以是溶液、凝胶等。在一些实施方案中，肽和/或多肽以冻干形式制备。此外，此类制剂可以包括其他所需的试剂，例如小分子或其他肽、多肽或蛋白质。事实上，可以提供包含本文描述的肽和/或多肽的不同实施方案的混合物的此类制剂。

在一些实施方案中，本文提供本文描述的肽序列的拟肽形式或其变体。在一些实施方案中，拟肽的特征在于保留其肽等同物的极性(或非极性、疏水性等)、三维尺寸和功能性(生物活性)的实体，但其中肽的全部或一部分肽键已被取代(例如，被更稳定的联系所取代)。在一些实施方案中，“稳定”是指对化学降解或水解酶的酶促降解具有更强的抵抗力。在一些实施方案中，取代酰胺键的键(例如酰胺键替代物)保留酰胺键的一些性质(例如构象、空间体积、静电特性、氢键结合能力等)。“药物设计与开发”Krogsgaard,Larsen,Liljefors,和Madsen(Eds)1996,Horwood Acad.。出版商提供了用于拟肽的设计和合成的技术的一般性讨论，并且其全部内容通过引用并入本文。合适的酰胺键替代物包括但不限于：N-烷基化(Schmidt,R.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,1995,46,47；其全部内容通过引用并入本文)、逆反酰胺(Chorev,M.和Goodman,M.,Acc.Chem.Res,1993,26,266；其全部内容通过引用并入本文)、硫代酰胺(Sherman D.B.和Spatola,A.F.J.Am.Chem.Soc.,1990,112,433；其全部内容通过引用并入本文)、硫酯、膦酸酯、酮亚甲基(Hoffman,R.V.和Kim,H.O.J.Org.Chem.,1995,60,5107；其全部内容通过引用并入本文)、羟基亚甲基、氟乙烯基(Allmendinger,T.et al.,Tetrahydron Lett.,1990,31,7297；其全部内容通过引用并入本文)、乙烯基、亚甲基氨基(Sasaki,Y和Abe,J.Chem.Pharm.Bull.1997 45,13；其全部内容通过引用并入本文)、亚甲硫基(Spatola,A.F.,Methods Neurosci,1993,13,19；其全部内容通过引用并入本文)、烷烃(Lavielle，S等人，Int.J.Peptide Protein Res.，1993，42270；其全部内容通过引用并入本文)和磺酰胺基(Luisi，G.等人TetrahedronLett.1993，342391；其全部内容通过引用并入本文)。

除了酰胺键的取代之外，拟肽可能涉及用二肽或三肽模拟结构取代较大的结构部分，并且在这种情况下，涉及肽键的模拟部分，例如唑衍生的模拟物，可以用作二肽取代。合适的拟肽包括还原肽，其中酰胺键已通过用还原剂(例如硼烷或氢化物试剂如氢化铝锂)处理而还原为亚甲基胺；这样的还原具有增加分子的总阳离子性的附加优点。

本文公开的包含基本上α-螺旋肽区域的肽和多肽可以通过化学改变进一步衍生化，例如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。这种化学改变可以通过化学或生物化学方法以及通过体内过程或其任何组合来赋予。

其他拟肽包括通过例如酰胺官能化聚甘氨酸的逐步合成形成的类肽。一些拟肽主链将很容易从其肽前体中获得，例如已被全甲基化的肽；合适的方法描述在Ostresh,J.M.et al.in Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91,11138-11142；其全部内容通过引用并入本文。

本文所述的肽和多肽可以与各种无机和有机酸和碱制备成盐。此类盐包括用有机酸和无机酸制备的盐，例如用HCl、HBr、H₂SO₄、H₃PO₄、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸、甲苯磺酸、马来酸、富马酸和樟脑磺酸制备的盐。用碱制备的盐包括铵盐、碱金属盐，例如钠盐和钾盐，碱土金属盐，例如钙盐、镁盐和锌盐。盐可以通过常规方法形成，例如通过使产物的游离酸或碱形式与一种或多种当量的合适的碱或酸在盐不溶于其中的溶剂或介质中反应，或在溶剂如水中，然后在真空中或通过冷冻干燥或通过在合适的离子交换树脂上将现有盐的离子交换为另一离子来除去。

本文所述的肽和多肽可以配制为其药学上可接受的盐和/或复合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎宁酸盐的盐。药学上可接受的盐可以从酸例如盐酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸和奎尼酸获得。这种盐可以通过例如使产物的游离酸或碱形式与一种或多种当量的合适的碱或酸在盐不溶于其中的溶剂或介质中，或在溶剂如水中反应来制备，然后在真空中或通过冷冻干燥或通过在合适的离子交换树脂上将现有盐的离子交换为另一种离子来除去。

本文描述的肽和多肽可以配制为药物组合物以与本公开的方法结合使用。本文公开的组合物可以方便地以适合肠胃外施用的制剂形式提供，包括皮下、肌内和静脉内施用、鼻内施用、肺内施用或口服施用。用于每种此类施用途径的肽和多肽的合适制剂描述于标准制剂论文，例如E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences。另请参见Wang,Y.J.和Hanson,M.A.“Parenteral Formulations of Proteins and Peptides:Stabilityand Stabilizers,”Journal of Parenteral Science and Technology,TechnicalReport No.10,Supp.42:2S(1988)。

药物组合物可以按照良好的药学实践与药学上可接受的载体和任选的赋形剂、佐剂等配制的形式施用。基于肽的药物组合物可以是固体、半固体或液体剂型的形式：例如粉末、溶液、酏剂、糖浆、悬浮液、乳膏、滴剂、糊剂和喷雾剂。本领域技术人员将认识到，根据所选择的施用途径(例如丸剂、注射剂等)，确定组合物形式。一般而言，优选使用单位剂型，以实现活性药物肽或多肽的容易且准确的施用。一般来说，治疗有效的药物化合物以组合物总重量的约0.5％至约99％的浓度水平存在于这样的剂型中。例如以足以提供所需单位剂量的量。在一些实施方案中，药物组合物可以单剂量或多剂量施用。具体的施用途径和剂量方案将由本领域技术人员根据待治疗个体的状况和所述个体对治疗的反应来确定。在一些实施方案中，以单位剂型提供基于肽的药物组合物用于向受试者施用，其包含肽或多肽和一种或多种无毒的药学上可接受的载体、佐剂或载体。如上所述，可与此类材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据各种因素而变化。在本发明的组合物中，可以使用多种材料作为载体、佐剂和载体，如制药领域中可用的。可根据需要使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，如本领域已知的那样配制可注射制剂，例如油质溶液、混悬剂或乳液。无菌注射制剂可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如无菌无热原水或1,3-丁二醇。其他可接受的载体和溶剂包括5％葡萄糖注射液、林格注射液和等渗氯化钠注射液(如USP/NF中所述)。另外，无菌的固定油可常规地用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。脂肪酸例如油酸也可用于制备可注射组合物。

本文所述的某些肽和多肽可以基本上不溶于水并且微溶于大多数药学上可接受的质子溶剂和植物油。在某些实施方案中，可以添加环糊精作为水溶性增强剂。环糊精包括甲基、二甲基、羟丙基、羟乙基、葡糖基、麦芽糖基和α-、β-和γ-环糊精的麦芽三糖基衍生物。一种示例性环糊精溶解度增强剂是羟丙基-β-环糊精(HPBCD)，它可以添加到上述任何组合物中，以进一步改善肽或多肽的水溶性特性。在一种实施方案中，组合物包含0.1％至20％ HPBCD、1％至15％ HPBCD、或2.5％至10％ HPBCD。使用的溶解度增强剂的量将取决于组合物中本发明的肽或多肽的量。在某些实施方案中，肽可以在非水极性非质子溶剂例如DMSO、二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)中配制。

在一些情况下，在单一组合物或溶液中提供肽或多肽和另一种活性剂以便一起施用将是方便的。在其他情况下，与所述多肽分开施用另外的试剂可能更有利。为了使用，本文所述的肽和多肽的药物组合物可以单位剂型提供，其含有单次施用有效量的肽或多肽。可用于皮下施用的单位剂型包括预装注射器和注射器。

在某些实施方案中，无论施用频率如何，多肽以每天50微克(“mcg”)、每天60微克、每天70微克、每天75微克、每天75微克、每天100微克、每天150微克、每天200微克或每天250微克的量施用。在一些实施方案中，多肽以每天500mcg、每天750mcg或每天1毫克(“mg”)的量施用。在进一步的实施方案中，多肽的施用量以每日等效剂量表示，与施用频率无关，为每天1-10毫克，包括每天1毫克、每天1.5毫克、每天1.75毫克、每天2毫克、每天2.5毫克、每天3毫克、每天3.5毫克、每天4毫克、每天4.5毫克、每天5毫克、每天5.5毫克、每天6毫克、每天6.5毫克、每天7毫克、每天7.5毫克、每天8毫克、每天8.5毫克、每天9毫克、每天9.5毫克或每天10毫克。在各种实施方案中，所述多肽按每月剂量表施用。在其他实施方案中，所述多肽每两周施用一次。在另一些实施方案中，所述多肽每周施用。在某些实施方案中，多肽每天施用(“QD”)。在选择的实施方案中，多肽每天施用两次(“BID”)。在典型的实施方案中，多肽施用至少3个月、至少6个月、最少12个月或更长时间。在一些实施方案中，多肽施用至少18个月、2年、3年或更长时间。

可以提供活性肽或多肽(例如，不破坏载体内的肽或多肽)的任何载体都是合适的载体，并且这样的载体是本领域众所周知的。在一些实施方案中，组合物被配制用于通过任何合适的途径施用，包括但不限于口服(例如以片剂、胶囊、颗粒剂或粉末的形式)、舌下、口腔、肠胃外(例如通过皮下、静脉内、肌内、皮内或胸骨内注射或输注(例如，作为无菌可注射水性或非水性溶液或混悬液等))、鼻腔(包括施用至鼻膜，例如通过吸入喷雾)、局部(例如以乳膏或软膏的形式)、透皮(例如通过透皮贴剂)、直肠(例如以栓剂的形式)等。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物适合于吸入施用。用于吸入施用的合适的药物组合物通常是气雾剂或粉末的形式。此类组合物通常使用公知的递送装置施用，例如雾化吸入器、定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)或类似的递送装置。

在本发明的一个具体实施方案中，包含活性剂的药物组合物通过使用雾化吸入器吸入来施用。此类雾化器装置通常产生高速空气流，其导致包含活性剂的药物组合物以薄雾形式喷雾，其被带入患者的呼吸道中。因此，当配制用于雾化吸入器时，活性剂通常溶解在合适的载体中以形成溶液。或者，可将活性剂微粉化并与合适的载体组合以形成可呼吸尺寸的微粉化颗粒的悬浮液，其中微粉化通常定义为具有约90％或更多直径小于约10μm的颗粒。合适的喷雾器装置可商购提供，例如由PARI GmbH(Starnberg，German)提供。其他喷雾器装置包括Respimat(勃林格殷格翰)和例如Lloyd等人的美国专利号4,075,000和WO97/12687(Eicher等人)。合适的雾化器装置是商业上提供的，例如由PARI GmbH(施塔恩贝格，德国)提供。其它雾化器装置包括Respimat(Boehringer Ingelheim)和例如在美国专利号4,075,000和WO 97/12687(Eicher等人)中公开的那些。用于雾化吸入器的代表性药物组合物包含等渗水溶液，所述等渗水溶液包含SP-A肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物或立体异构体。

在本发明的另一个具体实施方案中，使用干粉吸入器通过吸入施用包含活性剂的药物组合物。这种干粉吸入器通常以自由流动的粉末形式施用活性剂，其在吸气期间分散在患者的气流中。为了获得自由流动的粉末，活性剂通常与合适的赋形剂例如乳糖或淀粉一起配制。用于干粉吸入器的代表性药物组合物包含粒度为约1μm至约100μm的干乳糖和SP-A肽的微粉化颗粒，或其药学上可接受的盐或溶剂化物或立体异构体。

例如，可以通过将乳糖与活性剂结合，然后将组分干混来制备这种干粉制剂。或者，如果需要，可以在没有赋形剂的情况下配制活性剂。然后通常将药物组合物装入干粉分配器中，或装入与干粉递送装置一起使用的吸入药筒或胶囊中。干粉吸入器递送装置的实例包括Diskhaler(GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC)(参见例如Newell等人的美国专利号5,035,237)；Diskus(GlaxoSmithKline)(参见例如Davies等人的美国专利号6,378,519)；Turbuhaler(AstraZeneca,Wilmington,Del.)(参见例如Wetterlin的美国专利号4,524,769)；Rotahaler(GlaxoSmithKline)(参见例如Hallworth等人的美国专利号4,353,365)和Handihaler(Boehringer Ingelheim)。合适的DPI装置的进一步实例描述于Casper等人的美国专利号5415162，Evans的美国专利号523993和Armstrong等人的美国专利号5715810，以及其中引用的参考文献。

在本发明的另一个具体实施方案中，使用计量吸入器通过吸入施用包含活性剂的药物组合物。此类计量吸入器通常使用压缩推进剂气体排出测量量的活性剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物或立体异构体。因此，使用定量吸入器施用的药物组合物通常包含活性剂在液化推进剂中的溶液或悬浮液。可以采用任何合适的液化推进剂，包括氯氟烃，例如CCI.sub.3F，和氢氟烷烃(HFA)，例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3-七氟正丙烷(HFA 227)。由于担心氯氟烃影响臭氧层，通常优选含有HFA的制剂。HFA制剂的另外的任选组分包括共溶剂，例如乙醇或戊烷，和表面活性剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂和甘油。参见例如，No.Purewal等人的美国专利号5,225,183、EP 0717987 A2(明尼苏达矿业和制造公司)和WO 92/22286(明尼苏达矿业和制造公司)。用于定量吸入器的代表性药物组合物包含0.01重量％至约5重量％的SP-A肽化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或立体异构体；0重量％至约20重量％的乙醇；和约0重量％至约5重量％表面活性剂；剩余部分为HFA推进剂。

此类组合物通常通过将冷却或加压的氢氟烷添加到含有活性剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的合适容器中来制备。为了制备悬浮液，将活性剂微粉化，然后与推进剂混合。然后将制剂装入气雾罐中，该气雾罐形成计量吸入器装置的一部分。专门为与HFA推进剂一起使用而开发的计量吸入器装置的实例在美国专利Marecki的美国专利号6,006,745和Ashurst等人的美国专利号6,143,277。或者，可以通过喷雾干燥活性剂微粉化颗粒上的表面活性剂涂层来制备悬浮液制剂。参见例如WO 99/53901(Glaxo Group Ltd.)和WO 00/61108(Glaxo Group Ltd.)，其公开内容通过引用整体并入本文。

对于制备可呼吸颗粒的方法以及适合吸入施用的制剂和装置的其他实例，请参见Gao等人的美国专利号6,268,533，Trofast的美国专利号5,983,956，Briggner等人的美国专利号5,874,063和Jakupovic等人的美国专利号6,221,398；以及WO 99/55519(GlaxoGroup有限公司)和WO 00/30614(AstraZeneca AB)，其公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，肽/多肽以药物组合物的形式提供和/或与一种或多种另外的治疗剂共同施用(同时或连续)。此类另外的药剂可以用于治疗或预防肺部炎症(例如，哮喘)。其他药物可包括但不限于：短效β2-肾上腺素受体激动剂(SABA)，例如沙丁胺醇(舒喘宁USAN)；长效β受体激动剂(LABA)，例如沙美特罗和福莫特罗抗胆碱能药物，例如异丙托溴铵、吸入肾上腺素、吸入皮质类固醇(例如布地奈德、氟替卡松、莫米松或环索奈德)、全身性皮质类固醇(例如泼尼松或甲泼尼龙)；白三烯受体拮抗剂(例如孟鲁司特和扎鲁司特)；或其组合。

不希望将本发明限制于任何机制理论，据信本文所述的纯化的肽与一种或多种另外的治疗剂(例如，类固醇)共同施用(同时或连续)允许较小剂量的类固醇治疗严重哮喘。因此，与单独吸入皮质类固醇或联合治疗(ICS/LABA)相比，联合治疗在不同的作用机制下可能具有保留类固醇的效果。

在一些实施方案中，本文提供了治疗患有肺病(例如哮喘)和/或需要治疗(或预防性治疗)的患者(或有肺病风险的患者)的方法。在一些实施方案中，肥胖或不肥胖的患者可以受益。在一些实施方案中，受试者被鉴定为具有与哮喘或严重哮喘风险增加相关的SP-A基因型(例如，本文所述的那些基因型)。

在一些实施方案中，将包含至少一种本文所述的SP-A肽或多肽的药物组合物以足以治疗病症的量和位置递送至此类患者。在一些实施方案中，肽和/或多肽(或包含这样的药物组合物)可以系统地或局部地递送给患者，并且确定最合适的递送途径、时间过程和治疗剂量将在治疗这种患者的医学专业人员的普通技术范围内。应当理解，治疗患者的施用方法最优选基本上减轻或甚至消除此类症状；然而，与许多医学治疗一样，如果在本发明方法期间、之后或作为本发明方法的结果，患者的疾病或病症的症状消退到可确定的程度，则认为本发明方法的应用是成功的。

本公开不限于哮喘的治疗。本领域已知的或本文另外考虑的任何炎性病症可以根据当前公开和要求保护的发明构思进行治疗。具有相关炎症的疾病病症的非限制性示例包括肺部感染相关或非感染性炎性病症(例如，哮喘、败血症、慢性阻塞性肺病(COPD)、COVID-19、肺部感染、呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良等)；其他器官的感染相关或非感染性炎性病症(例如结肠炎、炎性肠病、糖尿病肾病、失血性休克)；炎症诱发的癌症(即结肠炎或炎性肠病患者的癌症进展)；等等。

实施例

以下是本发明的非限制性实施例。应当理解，所述示例并不旨在以任何方式限制本发明。等同物或替代物在本发明的范围内。

实施例1：实施例1证明223位的SP-A基因型影响肺功能和哮喘控制。先前的研究表明，衍生自哮喘受试者的SP-A在调节炎症状况(例如IL-8和MUCSAC的产生)方面功能失调。为了确定SP-A的基因型是否影响肺功能、肺生理和哮喘控制，对53名未接受控制治疗的轻中度哮喘患者进行了SP-A基因分型和测量。图15A显示，在筛选的53名哮喘患者中，与具有Q223Q或Q223K基因型的受试者相比，那些对次要等位基因(SP-A2 K223K)纯合的患者具有更低的肺功能(FEV1％)。此外，这组哮喘受试者表现出比具有AC或CC基因型的哮喘患者更差的哮喘控制(哮喘控制问卷；ACQ)(图15B)。

此外，SP-A人源化小鼠在过敏模型中表现出不同的表型。为了更机械地研究SP-A223Q/K位点遗传变异对哮喘的影响，产生了表达SP-A223Q(主要等位基因)或SP-A223K(次要等位基因)的SP-A人源化小鼠。研究发现，当在过敏性气道疾病的ova模型中受到攻击时，与SP-A223K等位基因相比，SP-A223Q等位基因能提供更多的保护。图15A显示，与缺乏SP-A的小鼠相比，在攻击后24小时，SP-A223Q小鼠的嗜酸性粒细胞增多显著减少，并且在攻击后7天它们的粘蛋白产生(PAS评分)也显著减少(图15B)。

在过敏模型中，包含223Q活性位点的SP-A肽减弱气道嗜酸性粒细胞和粘蛋白的产生。由于与携带223Q(主要)等位基因的个体相比，携带223K(次要)等位基因的哮喘受试者的哮喘控制和肺功能较差，并且由于在过敏模型中的SP-A人源化小鼠中观察到了类似的结果，因此进行了实验寻找SP-A的活性区域。经测定，该活性肽是包含223Q位点的10个AA肽，位于内源性SP-A的碳水化合物识别结构域中。图16A和16B所示，在HDM模型中攻击SP-A缺陷小鼠，并在最后一次攻击后24小时，给予20AA SP-A(PAGRGEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8))或10AA SP-A(KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4))并与接受载体治疗的小鼠进行比较。与载体治疗的小鼠相比，接受SP-A肽的那些小鼠在灌洗隔室中具有显着较低的嗜酸性粒细胞增多(图16A)和较少的粘蛋白产生(图16B)。

包含223Q活性位点的SP-A肽(10AA)可减弱哮喘患者原代人气道上皮细胞的表型。进行实验，其中来自未接受对照治疗的两名哮喘受试者的气道上皮细胞在气液界面培养两周。在不同的条件下，将细胞暴露于20μg/ml的每种肽30分钟，然后暴露于50ng/ml的IL-13并孵育48小时。通过RT-PCR测定置于Trizol MUCSAC中的细胞。图17显示每种肽的MUCSAC表达显着降低至阴性对照的水平。10AA的长度作为治疗剂特别有用，因为它的尺寸使其能够包装到吸入器类型的装置中以递送到气道。该实验表明，223Q肽在暴露于IL-13的情况下可有效抑制人气道上皮细胞中的粘蛋白基因表达。

总之，这些实验证明223位的SP-A基因型影响肺功能和哮喘控制；SP-A人源化小鼠在依赖于223Q/K位置的过敏模型中表现出不同的表型，包含223Q活性位点的SP-A肽减弱过敏模型中的表型，包括223Q活性部位的SP-A多肽(10AA)减弱哮喘患者原代人类气道上皮细胞中的Muc5AC。

关于图5A至5D，根据标准方法在第0、7、14天对WT C57BL/6小鼠在屋尘螨(HDM)模型中进行致敏和攻击(黑色箭头)。最后一次攻击后24小时，小鼠通过口咽滴注接受乱序载体或20-mer SP-A肽(虚线箭头)，该肽包围含有223Q的活性位点(生理剂量为25μg/只小鼠，在40μl无菌盐水中递送)。通过PAS染色/评分评估肺组织切片的粘蛋白产生，以确定SP-A肽是否可以防止HDM诱导的气道粘蛋白产生。SP-A肽治疗后第5天和第7天观察到类似的保护作用。肽序列：PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)。

关于图6A和6B，根据上述段落中描述的标准方法(参见图5A)，在屋尘螨(HDM)模型中对WT C57BL/6小鼠进行致敏和攻击。最后一次攻击后24小时，小鼠通过口咽滴注接受乱序载体、20-mer或10-mer SP-A肽(虚线箭头)，该肽包围含有223Q的活性位点(生理剂量为25μg/只小鼠，在40μl无菌盐水中递送)。如图6A所示，通过PAS染色/评分评估肺组织学切片的粘蛋白产生，以确定SP-A肽是否可以保护HDM诱导的气道粘蛋白产生。SP-A肽治疗后第5天和第7天观察到类似的保护作用。如图6B所示，分析支气管肺泡灌洗样品的嗜酸性粒细胞增多，以确定SP-A肽是否可以通过降低嗜酸性粒细胞活力来防止HDM诱导的气道嗜酸性粒细胞增多。通过对细胞计数进行台盼蓝排除来评估活力。肽序列：20-merPAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)、肽1PAGRGKEQCV(SEQ ID NO:2)、肽2EMYTDGQWND(SEQ ID NO:3)、肽3KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4)。

关于图6C，通过支气管镜检查从表型良好的哮喘参与者获得的人支气管上皮细胞在实验前在ALI培养两周。对于攻击，在IL-13攻击之前至少30分钟将每种SP-A测试肽(50μg/ml)添加到心尖隔室。通过RT-PCR对细胞裂解物中的Muc5AC进行分析，并分析为对照样品的倍数。肽序列：20-mer PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)、肽1PAGRGKEQCV(SEQ IDNO:2)、肽2EMYTDGQWND(SEQ ID NO:3)、肽3KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4)FL＝从肺泡蛋白沉积个体的灌洗液中提取的全长寡聚SP-A。

关于图18，通过Western印迹分析患有和不患有哮喘的瘦、超重和肥胖个体的支气管肺泡灌洗液中的SP-A表达。

图5A至5D、6A至6C、15A至15B和18显示，在过敏模型(Ova模型；图15A至15B)中，SP-A223Q人源化小鼠比223K小鼠具有更少的粘液，SP-A223Q人源化小鼠具有比223K小鼠更少的粘液。与过敏模型(HDM(屋尘螨)模型；图5A至5D)中的223K小鼠相比，缩短的10AA肽减少小鼠HDM模型中的粘蛋白产生(图6A)，缩短的10AA肽降低小鼠HDM模式中的嗜酸性粒细胞增多(图6B)，缩短的10AA肽减少人原代细胞中的黏蛋白(Muc5AC RNA)(图6C)，并且SP-A在肥胖中显著降低(图18)。

实施例2：实施例2描述了在10至12只成年灵长类动物中使用HDM致敏和攻击模型，这些灵长类动物是通过对乙酰甲胆碱激发的基线敏感性进行预筛选来选择的，以在交叉研究设计中测试SP-A治疗肽。

首先，通过每两周皮下注射10周，对所有10只灵长类动物施用HDM过敏原，此时对动物进行HDM皮肤反应性测试。接下来，HDM掩模暴露每两周进行一次，总共8周。在HDM攻击期后，对所有12只灵长类动物的气道高反应性进行评估，并收集灌洗液和活检标本进行分析。

第一轮分析评估了每只灵长类动物对HDM模型的反应水平后，10只灵长类动物被分为随机、双盲交叉设计的两个测试组：第1组(n＝6)接受SP-A肽，然后洗脱，然后安慰剂；第2组(n＝6)首先接受安慰剂，然后接受冲洗，然后接受SP-A肽。SP-A肽和安慰剂每两周一次鼻内施用，持续四个星期，而灵长类动物仍每两周接受一次HDM掩模治疗。SP-A和安慰剂的施用时间为HDM掩模暴露后约24小时。

第一个研究期4周结束时，对灵长类动物进行气道高反应性分析。进行支气管镜检查以进行灌洗液和支气管内活检。经过4周的冲洗后，灵长类动物在第二个研究期再次接受每两周一次的HDM掩模治疗。如上所述，在HDM掩模治疗4周后，第1组(n＝6)接受安慰剂，第2组(n＝6)每两周接受SP-A肽。第二个研究期完成后，对所有灵长类动物进行气道高反应性分析，并进行支气管镜检查以进行灌洗液和支气管内活检。

统计分析：主要结果变量包括气道高反应性、灌洗和组织嗜酸性粒细胞增多以及组织粘蛋白产生。使用两期交叉方差分析模型对这些变量进行分析。残留效应在10％α水平下测试，而周期效应和治疗效应在5％α水平下测试。数据表示为平均值±SEM。

预计SP-A肽能够减轻灵长类动物HDM过敏模型中与哮喘相关的表型。到目前为止，研究表明，在最后一次HDM攻击后24小时(炎症高峰期)给小鼠注射一剂肽能够显著减少灌洗室和肺组织中的粘蛋白产生和嗜酸性粒细胞增多。与安慰剂相比，预计在4周内每两周给予一次肽可显著减少嗜酸性粒细胞增多和粘蛋白的产生。

实施例3：实施例3证明SP-A肽在HDM(屋尘螨)模型中对AHR具有保护作用。如图10所示，根据标准方法在HDM模型中对WT C57BL/6小鼠进行致敏和攻击(箭头)。每次攻击后24小时，小鼠接受乱序载体或10-mer SP-A肽(KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4))(箭头)，其包含含有223Q的活性位点(在40ml无菌盐水中递送的生理剂量为25mg/只小鼠)。HDM攻击后3至5天进行肺功能测试，以确定SP-A肽是否可以防止乙酰甲胆碱诱导的气道高反应性(AHR)。与接受载体治疗的HDM攻击小鼠相比，在HDM攻击后接受SP-A肽的小鼠的总阻力(Rs)和中央气道阻力(Rn)减弱。在SP-A肽治疗后的第3天和第5天观察到类似的保护作用。

实施例4：实施例4证明SP-A肽在IL-13模型中防止气道高反应性(AHR)。WT C57BL/6小鼠通过口咽滴注用3.9μg IL-13(箭头)攻击，每天一次，连续3天。如图7A至7E所示，每次攻击后两小时，小鼠接受乱序载体或10-mer SP-A肽(KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4))(箭头)，其包含含有223Q的活性位点(在40ml无菌盐水中递送的生理剂量为25mg/小鼠)。IL-13攻击后24小时进行肺功能测试，以确定SP-A肽是否可以防止乙酰甲胆碱诱导的气道高反应性(AHR)。与接受载体治疗的HDM攻击小鼠相比，在HDM攻击后接受SP-A肽的小鼠的总阻力(Rs)和中央气道阻力(Rn)减弱。

实施例5：实施例5证明SP-A肽防止SARS-CoV-2感染。如图25所示，全长SP-A以剂量依赖性和CaCl₂依赖性方式与ACE2结合。设计了一种96孔板测定法，其中孔涂有从肺泡蛋白沉积症患者获得的BAL中提取的全长人SP-A(500ng/孔)。接下来，添加不同浓度的转染ACE2表达质粒的HEK293T细胞的裂解物。经过剧烈洗涤后，添加抗人ACE2抗体和显色底物，检测到ACE2。通过读板器读取450nm波长下的吸光度。过表达ACE2的裂解物以剂量依赖性方式SP-A结合(图25，实线)。由于SP-A通常通过碳水化合物识别结构域(CRD)以钙依赖性方式与病原体结合，因此接下来要确定SP-A与ACE2的结合是否是钙依赖性的。当螯合剂EDTA存在时，没有可检测到的SP-A与ACE2的结合(图25，虚线)，表明结合通过SPA的凝集素结构域发生。当使用不过表达ACE2的裂解物作为阴性对照时，未检测到SP-A结合(图251，虚线)。

参考图26，衍生自CRD的SP-A肽模拟物与全长SP-A竞争ACE2结合。全长SPA和SP-A20-mer肽竞争(即抑制)ACE与板结合的SP-A的结合，而乱序20-mer肽没有效果(图26)。在普通人群中，SP-A2第223位的特定变异与肺表型相关。特别地，与当谷氨酰胺存在于该位置(223Q)时相比，在223位(223K)含有赖氨酸的SP-A优先结合呼吸道病原体肺炎支原体。另外，衍生自该区域的肽在如本文先前描述的各种感染和炎症模型中具有活性。对于这些研究，评估了全长SP-A或SPA 20-mer肽，以确定这些肽是否竞争(即抑制)ACE2与板结合的SP-A的结合。虽然全长SP-A和含有20-mer的223K有效竞争结合，但20-mer乱序(SCR)肽几乎没有影响，而含有20-mer的223Q具有中等影响(n＝3次实验)。

为了评估SP-A对SARS-CoV2 S蛋白附着的影响，使用了S1蛋白结合测定。将细胞与包含SARS-CoV-2受体结合域的重组His标记S1亚基一起孵育，然后与Alexa Fluor缀合的抗His抗体一起孵育。通过流式细胞术评估S1蛋白与细胞的结合。使用HEK293T细胞验证了该测定特异性检测ACE2介导的S1蛋白细胞结合的能力，该细胞未用人ACE2(ACE2/HEK293T)转染或稳定转染。尽管在不含与抗-His-AF孵育的S1蛋白的未转染HEK293T细胞和ACE2/HEK293T细胞中检测到不到1％的S1结合(图27A)，但在不含SP-A的情况下，约30％的ACE2/HEK293T细胞结合S1蛋白(图27A，方框)。全长SP-A的添加导致S1结合的剂量依赖性减少，最高浓度的SP-A将结合减少约70％(图27B)。

为了研究SP-A抑制SARS-CoV-2S1蛋白与HEK293T ACE过表达细胞的附着是否也会减少S蛋白介导的SARS-CoV-2进入这些细胞，直接测量复制缺陷型SARSCoV-2S1蛋白假型慢病毒颗粒进入用SP-A或PBS预孵育的细胞的情况。慢病毒颗粒携带由转导细胞转录和翻译的荧光素酶报告基因，并用SARS-CoV-2S蛋白或泛嗜VSV(阳性转导对照)的G糖蛋白进行假型化。VSV-G假型颗粒和SARS-CoV-2假型颗粒有效转导HEK293T ACE细胞。虽然SP-A对VSVG-LUC转染几乎没有影响或没有影响，但SP-A剂量依赖性地降低了SARSCoV-2S蛋白假型慢病毒颗粒的转导效率(图28)。

现在参考图29，SP-A在活体感染模型中减弱SARS-CoV-2N1基因表达。通过将分级的HTII-280+远端上皮细胞与MRC5人肺成纤维细胞以50:50(v/v)的Matrigel和PneumacultALI培养基在24孔格式的transwell插入物中重悬，建立三维(3D)肺泡类器官培养物。15-20天后，将培养物用于SARS-Co-V2感染。在感染之前，将500μL Dispase(500μg/ml)加入插入物的心尖室和基底室，并在37℃下孵育1小时，从而溶解基质胶。收获培养物，用冰冷的PBS清洗，并用P1000吸头上下移液3次轻轻分散，使类器官“弹开”，暴露细胞的顶端表面。通过在每孔100μL含有SP-A(50μg/ml)的培养基中重悬来处理类器官。预处理3小时后，将SARS-CoV-2接种物(每孔1x10^4TCID50)添加到2ml锥形管中的培养物中，并在37℃(5％ CO₂)下孵育2小时。每15分钟轻轻混合试管，以促进病毒吸附在细胞上。随后，用新鲜的PneumacultALI培养基替换接种物，并将培养物转移到100μL体积的插入物的心尖室，基底室中有500μL培养基。培养物在37℃(5％ CO₂)下孵育并在2dpi时收获。SP-A在感染后培养期间一直保留在培养基中。在存在(CoV-2)或不存在(模拟)病毒感染的情况下未经药物治疗的类器官被纳入作为对照。使用从疾病控制中心研究实验室资源获得的2019-nCoV_N1引物，通过对相对核蛋白(N)基因表达进行RT-qPCR来评估病毒感染/复制。

图30显示SP-A 223Q和223K 20-mer肽减少S1蛋白假型慢病毒颗粒在体外向过表达ACE2的细胞的转导。使用与上面图28中详细描述的相同的系统，接下来研究了SP-A衍生的20-mer肽在抑制S蛋白介导的SARS-CoV-2进入这些细胞的能力方面是否与全长SP-A表现相似。再次，直接测量了复制缺陷型SARSCoV-2S1蛋白假型慢病毒颗粒进入与SP-A、SP-A223Q和223K肽或PBS预孵育的细胞的情况。慢病毒颗粒携带荧光素酶报告基因，由转导细胞转录和翻译，并用SARS-CoV-2S蛋白或泛嗜VSV(阳性转导对照)的G糖蛋白进行假型化。VSV-G假型颗粒和SARS-CoV-2假型颗粒有效转导HEK293T ACE细胞。在每个给定浓度下，SP-A223Q和223K肽剂量依赖性地降低SARSCoV-2S蛋白假型慢病毒的转导效率，其程度比全长SP-A更大(图30)。

如本文所用，术语“约”是指参考数字的正负10％。

尽管已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员来说，可以对其进行不超出所附权利要求范围的修改是显而易见的。因此，本发明的范围仅由所附权利要求书来限定。在一些实施方案中，本专利申请中呈现的附图是按比例绘制的，包括角度、尺寸比率等。在一些实施方案中，附图仅是代表性的并且权利要求不受附图尺寸的限制。在一些实施方案中，使用短语“包括”描述的本发明的描述包括可以被描述为“基本上由......组成”或“由......组成”的实施方案，并且因此满足使用短语“基本上由...组成”或“由...组成”来要求本发明的一个或多个实施方案的书面描述要求。

Claims

1.治疗有需要的受试者的炎性肺病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的纯化的肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包含KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4)或PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQID NO:24。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述炎性肺病包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或COVID-19。

5.根据权利要求4所述的方法，其中哮喘选自2型哮喘、非2型哮喘、早发性哮喘、迟发性哮喘、肥胖相关性哮喘、运动诱发性哮喘、哮喘恶化、与香烟烟雾污染物相关的哮喘或与感染有关的哮喘。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述纯化的肽在用于雾化或皮下注射的制剂中。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述纯化的肽通过鼻吸入、皮下或口服施用。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，还包括将所述纯化的肽与一种或多种另外的治疗剂一起施用。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂与所述纯化的肽同时或连续施用。

10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂包括短效β2-肾上腺素受体激动剂(SABA)、长效β激动剂(LABA)、抗胆碱能药物、白三烯受体拮抗剂或其组合。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗胆碱能药物包括异丙托溴铵、吸入肾上腺素和吸入皮质类固醇。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述吸入皮质类固醇包括布地奈德、氟替卡松、莫米松或环索奈德。

13.用于增强细胞中SP-A活性的药物组合物，所述药物组合物包含在药物载体中的包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的纯化的肽。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述纯化的肽包含氨基酸序列KEQCVE(Xaa)_n(SEQ ID NO:10)；其中n的范围为4-16个氨基酸；其中Xaa是任何天然或非天然氨基酸。

15.根据权利要求13或权利要求14所述的组合物，其中所述肽包含KEQCVEMYTD(SEQ IDNO:4)或PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)。

16.权利要求13所述的组合物，其中所述肽选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQID NO:24。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的组合物，其中所述组合物在用于雾化、皮下注射或肺部递送的制剂中。

18.根据权利要求13-17中任一项所述的组合物，其中所述细胞是肺细胞。

19.一种系统，所述系统包括权利要求13-18中任一项所述的药物组合物和用于肺部递送所述组合物的装置。

20.根据权利要求19所述的系统，其中所述装置是定量吸入器或喷雾器。

21.治疗有需要的受试者的炎性肺病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求13-18中任一项所述的药物组合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述炎性肺病包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或COVID-19。

23.根据权利要求22所述的方法，其中哮喘选自2型哮喘、非2型哮喘、早发性哮喘、迟发性哮喘、肥胖相关性哮喘、运动诱发性哮喘或哮喘恶化。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述组合物通过鼻吸入、皮下或口服施用。

25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，还包括将所述组合物与一种或多种另外的治疗剂一起施用。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂与所述纯化的肽同时或连续施用。

27.一种方法，包括：将包含纯化的肽的组合物递送至受试者的细胞，所述肽包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)，其中所述递送导致增强细胞中的SP-A活性，治疗所述受试者的炎性肺病、或两者兼而有之。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述肽包含KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4)或PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述肽选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述炎性肺病包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或COVID-19。

31.根据权利要求30所述的方法，其中哮喘选自2型哮喘、非2型哮喘、早发性哮喘、迟发性哮喘、肥胖相关性哮喘、运动诱发性哮喘或哮喘恶化。

32.根据权利要求27-31中任一项所述的方法，其中所述纯化的肽在用于雾化或皮下注射的制剂中。

33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法，其中所述纯化的肽通过鼻吸入、皮下或口服施用。

34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法，其中所述组合物减少所述细胞中的粘蛋白产生和/或减少嗜酸性粒细胞增多。

35.根据权利要求27-34中任一项所述的方法，还包括将所述组合物与一种或多种另外的治疗剂一起施用。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂与所述纯化的肽同时或连续施用。

37.根据权利要求27-36中任一项所述的方法，其中所述受试者是肥胖的。

38.用于治疗炎性肺病的方法的纯化的肽，所述纯化的肽包含氨基酸序列KEQCVE(SEQID NO:9)。

39.根据权利要求38所述的肽，其中所述纯化的肽包含KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4)或PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)。

40.根据权利要求38所述的肽，其中所述肽选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQID NO:24。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的肽，其中所述炎性肺病包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)或COVID-19。

42.根据权利要求41所述的肽，其中哮喘选自2型哮喘、非2型哮喘、早发性哮喘、迟发性哮喘、肥胖相关性哮喘、运动诱发性哮喘、哮喘恶化、与香烟烟雾污染物相关的哮喘或与感染有关的哮喘。

43.根据权利要求38-42中任一项所述的肽，其中所述纯化的肽在用于雾化或皮下注射的制剂中。

44.根据权利要求38-43中任一项所述的肽，其中所述纯化的肽通过鼻吸入、皮下或口服施用。

45.根据权利要求38-44中任一项所述的肽，其中所述方法还包括将所述纯化的肽与一种或多种另外的治疗剂一起施用。

46.根据权利要求45所述的肽，其中所述一种或多种治疗剂与所述纯化的肽同时或连续施用。

47.根据权利要求45或权利要求46所述的肽，其中所述一种或多种治疗剂包括短效β2-肾上腺素受体激动剂(SABA)、长效β激动剂(LABA)、抗胆碱能药物、白三烯受体拮抗剂或其组合。

48.根据权利要求47所述的肽，其中抗胆碱能药物包括异丙托溴铵、吸入皮质类固醇或全身性皮质类固醇。

49.根据权利要求48所述的肽，其中吸入性皮质类固醇或全身性皮质类固醇包括布地奈德、氟替卡松、莫米松或环索奈德。

50.一种在有需要的受试者中治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)的纯化的肽。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述肽包含KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4)或PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)。

52.根据权利要求50所述的方法，其中所述肽选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。

53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述纯化的肽在用于雾化或皮下注射的制剂中。

54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述纯化的肽通过鼻吸入、皮下或口服施用。

55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，还包括将所述纯化的肽与一种或多种另外的治疗剂一起施用。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂与所述纯化的肽同时或连续施用。

57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂包括短效β2-肾上腺素受体激动剂(SABA)、长效β激动剂(LABA)、抗胆碱能药物、白三烯受体拮抗剂或其组合。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述抗胆碱能药物包括异丙托溴铵、吸入肾上腺素和吸入皮质类固醇。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述吸入皮质类固醇包括布地奈德、氟替卡松、莫米松或环索奈德。

60.用于治疗2019冠状病毒病(COVID-19)的方法的纯化的肽，所述纯化的肽包含氨基酸序列KEQCVE(SEQ ID NO:9)。

61.根据权利要求60所述的肽，其中所述肽包含KEQCVEMYTD(SEQ ID NO:4)或PAGRGKEQCVEMYTDGQWND(SEQ ID NO:8)。

62.根据权利要求60所述的肽，其中所述肽选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQID NO:24。

63.根据权利要求60-62中任一项所述的肽，其中所述纯化的肽在用于雾化或皮下注射的制剂中。

64.根据权利要求60-62中任一项所述的肽，其中所述纯化的肽通过鼻吸入、皮下或口服施用。

65.根据权利要求60-64中任一项所述的肽，其中所述方法还包括将所述纯化的肽与一种或多种另外的治疗剂一起施用。

66.根据权利要求65所述的肽，其中所述一种或多种治疗剂与所述纯化的肽同时或连续施用。

67.根据权利要求65或权利要求66所述的肽，其中所述一种或多种治疗剂包括短效β2-肾上腺素受体激动剂(SABA)、长效β激动剂(LABA)、抗胆碱能药物、白三烯受体拮抗剂或其组合。

68.根据权利要求67所述的肽，其中抗胆碱能药物包括异丙托溴铵、吸入皮质类固醇或全身性皮质类固醇。

69.根据权利要求68所述的肽，其中吸入性皮质类固醇或全身性皮质类固醇包括布地奈德、氟替卡松、莫米松或环索奈德。