BR112021004420A2 - formulação em pó seco de peptídeos de caveolina-1 e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÃO EM PÓ SECO DE PEPTÍDEOS DE CAVEOLINA-1 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS. São fornecidas neste documento composições que compreendem peptídeos de caveolina-1 (Cav-1). Além disso, são fornecidos métodos de uso de peptídeos de Cav-1 para o tratamento de infecções pulmonares ou lesão pulmonar aguda ou crônica, particularmente fibrose pulmonar.

Description

FORMULAÇÃO EM PÓ SECO DE PEPTÍDEOS DE CAVEOLINA-1 E

MÉTODOS DE USO DOS MESMOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos nº 62/729.010, depositado em 10 de setembro de 2018, cuja totalidade é incorporada neste documento por referência.

[0002] A presente invenção foi feita como resultado de atividades realizadas dentro do escopo de um acordo de pesquisa conjunta que estava em vigor no momento em que a presente invenção foi feita. As partes do referido acordo de pesquisa conjunta são The Board of Regents of the University of Texas System e Lung Therapeutics.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1. — CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção se refere geralmente ao campo da biologia molecular, farmacêutica e medicina. Mais particularmente, diz respeito a composições e métodos para a distribuição de composições polipeptídicas terapêuticas de pó seco a indivíduos, tal como por distribuição ao sistema respiratório.

2. — DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[0004] Durante a lesão pulmonar, a expressão de p53 aumenta, induzindo o inibidor 1 do ativador do plasminogênio (PAI-1) enquanto inibe a expressão do ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (uPA) e seu receptor (UPAR), resultando na apoptose das células epiteliais pulmonares (LECs). O mecanismo de lesão envolve interações de sinalização da superfície celular entre uPA, uPAR, caveolina-1 (“Cav-1”) e Bi1-integrina (Shetty et al., 2005). As composições que modulam essas interações podem ser usadas em métodos para inibir a apoptose de tecidos lesados, doentes ou danificados. Por exemplo, para o tratamento de inflamação ou condições fibróticas, como fibrose pulmonar. Assim, existe uma necessidade de polipeptídeos que possam ser usados para prevenir ou tratar lesões e doenças pulmonares e, em particular, formulações estáveis e métodos simples para a distribuição terapêutica de tais polipeptídeos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0005] De acordo com a presente divulgação, é fornecida uma composição de pó seco de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0006] Em uma primeira modalidade, uma composição farmacêutica compreendendo um pó seco de um peptídeo é fornecida, o referido peptídeo compreendendo uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-20. Em alguns aspectos, o peptídeo tem 7-20 aminoácidos de comprimento. Em um aspecto particular, o peptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em aspectos adicionais, o peptídeo compreende pelo menos um aminoácido adicionado ao N-terminal de um peptídeo da SEQ ID NO: 2. Em outros aspectos, o peptídeo compreende pelo menos um aminoácido adicionado ao C-terminal de um peptídeo da SEQ ID NO: 2. Em outros aspectos, o peptídeo compreende pelo menos um aminoácido adicionado ao N-terminal e ao C-terminal de um peptídeo da SEQ ID NO: 2. Em certos aspectos, o peptídeo pode compreender L-aminoácidos ou D-aminoácidos ou ambos L- e D- aminoácidos. Em aspectos adicionais, o peptídeo pode compreender pelo menos um aminoácido não padrão. Em vários aspectos, o peptídeo compreende 2 aminoácidos não padrão. Em um aspecto específico, o aminoácido não padrão é ornitina.

[0007] Em outros aspectos, o peptídeo pode compreender uma modificação N-terminal ou uma modificação C-terminal ou ambas as modificações N- e C-terminal. Em um aspecto particular, a modificação N- terminal é acilação. Em outro aspecto, a modificação C-terminal é amidação.

[0008] Em alguns aspectos, o peptídeo pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6,

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: ou SEQ ID NO: 20. Em vários aspectos, o peptídeo compreende pelo menos duas repetições de uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-20. Em aspectos específicos, as pelo menos duas repetições têm sequências de aminoácidos idênticas. Em outros aspectos, as pelo menos duas repetições têm sequências de aminoácidos diferentes. Em ainda outros aspectos, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um peptídeo de penetração celular (CPP). Em certos aspectos, o CPP compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que compreende: GRKKRRQORRRPPQ (SEQ ID NO: 23), RQIKIWFONRRMKWKK (SEQ ID NO: 24) e GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 25).

[0009] Em aspectos adicionais, o pó seco é produzido por um processo de moagem. Em vários aspectos, o pó seco é produzido por um processo de secagem por pulverização. Em aspectos alternativos, o pó seco é produzido por moagem a jato de ar, moagem de bolas ou moagem úmida. Em alguns aspectos, o pó seco compreende menos de 10% (em peso) de água. Em outro aspecto, o pó seco compreende menos de 1% (em peso) de água. Em certos aspectos, a composição farmacêutica é essencialmente livre de excipientes. Em um aspecto específico, a composição farmacêutica é livre de excipientes. Em aspectos particulares, a composição farmacêutica é formulada para liberação aos pulmões. Em um aspecto adicional, a composição farmacêutica é formulada para inalação de pó seco. Em outros aspectos, a composição farmacêutica é formulada para inalação por inalação de dose medida pressurizada. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é formulada para administração oral, administração tópica ou injeção.

[0010] Em certos aspectos, uma formulação de pó seco das modalidades compreende um teor de água inferior a cerca de 10%, 9%,

8%, 7%, 6% ou 5%. Em outros aspectos, uma composição compreende um teor de água de cerca de 0,01% a cerca de 10%, 0,1% a cerca de 10%, 1,0% a cerca de 8% ou 1% a cerca de 5%. Em outros aspectos, uma formulação de pó seco da modalidade compreende um tamanho médio de partícula inferior a 10 um. Em certos aspectos, o tamanho médio de partícula é de cerca de 0,01 pm a cerca de 10 um; cerca de 0,1 um a cerca de 8 um; cerca de 0,5 um a cerca de 7 um ou cerca de 1 um a cerca de 5 um. Em alguns aspectos, pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65% ou 70% de uma composição de pó seco das modalidades compreende um tamanho de partícula de cerca de 1 um a cerca de 5 um. Em certos aspectos, uma formulação de pó seco do peptídeo das modalidades (por exemplo, CSP7) é composta por pelo menos 70% (por exemplo, 70%-80%) de partículas com um tamanho de cerca de 1 um a cerca de 5 um. Em aspectos preferidos, pelo menos cerca de 70%, 75%, 80% ou 85% (por exemplo, 75% - 95%) das partículas na formulação de pó seco têm menos de 5 um de tamanho.

[0011] Uma outra modalidade da invenção fornece um dispositivo nebulizador que compreende uma composição farmacêutica da modalidade e aspectos descritos acima.

[0012] Em ainda uma outra modalidade, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da modalidade e dos aspectos descritos acima a um indivíduo. Em certos aspectos, o indivíduo tem um distúrbio inflamatório. Em outros aspectos, o indivíduo tem uma condição fibrótica. Em múltiplos aspectos, o indivíduo tem inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda, infecção pulmonar ou pulmão. Em outro aspecto, o indivíduo tem inflamação pulmonar. Em um aspecto específico, o indivíduo tem doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Em outros aspectos, o indivíduo pode ter uma lesão pulmonar aguda ou infecção, uma infecção pulmonar, uma lesão pulmonar induzida por produtos químicos, bronquite plástica, asma, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), lesão pulmonar aguda induzida por fumaça inalatória (ISALI), bronquiolite ou bronquiolite obliterante. Em aspectos particulares, a doença pulmonar é uma condição fibrótica dos pulmões, doença pulmonar intersticial ou Fibrose Pulmonar Idiopática (FPI) ou cicatrização pulmonar. Em aspectos adicionais, a administração compreende a inalação de pó seco. Em outros aspectos, a administração compreende a nebulização de uma solução compreendendo o polipeptídeo variante.

[0013] Em outros aspectos, o método compreende adicionalmente a administração de pelo menos um agente terapêutico antifibrótico adicional. Em alguns aspectos, o pelo menos um antifibrótico adicional é AINE, esteróide, DMARD, imunossupressor, moduladores de resposta biológica ou broncodilatador. Em vários aspectos, o indivíduo é um humano.

[0014] Ainda uma outra modalidade da invenção fornece uma composição farmacêutica, compreendendo um peptídeo de SEQ ID Nºs: 2- formulado em um pó seco moído tendo um tamanho de partícula respirável. Por exemplo, em certos aspectos, o pó seco moído compreende um diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) inferior a cerca de 10 mícrons. Métodos para determinar MMAD são fornecidos, por exemplo, em Carvalho et a/., 2011, que é incorporado neste documento por referência.

[0015] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método para tratar um indivíduo, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composição, de acordo com as modalidades, ao indivíduo por inalação.

[0016] Outros objetos, características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem modalidades da invenção preferidas, são dados somente a título de ilustração, uma vez que várias mudanças e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão aparentes para aqueles técnicos no assunto a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0017] As seguintes figuras fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídas para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a uma ou mais dessas figuras em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas neste documento.

[0018] Figura 1: Imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura de pó CSP7 a granel. Amostras de pó foram pulverizadas na bandeja de amostra e espalhadas por sopro de nitrogênio comprimido. As amostras foram visualizadas usando um microscópio eletrônico de varredura Hitachi S5500 SEM/STEM. Barras de escala são ilustradas no canto inferior direito das imagens.

[0019] Figura 2: Imagens de Microscopia Óptica de pó CSP7 a granel. Amostras de pó foram pulverizadas nas lâminas de vidro e visualizadas em um microscópio óptico Leica (Leica CTR6500). As barras de escala são indicadas no canto esquerdo inferior de cada imagem. As setas apontam para partículas aglomeradas de pó CSP7 puro.

[0020] Figura 3: Difração de pó de raios-X de partículas de pó a granel de CSP7. Partículas de pó CSP7 a granel foram avaliadas usando difração de pó de raios-X para determinar a cristalinidade. O pó é medido de 2 a 40 26 graus usando um tamanho de etapa de 0,025 20 graus e uma velocidade de 2 graus/min.

[0021] Figura 4: Microscopia de Luz Polarizada de pó CSP7 a granel. A cristalinidade foi avaliada por microscopia de luz polarizada. Na foto está uma imagem representativa. Setas brancas apontam para regiões cristalinas.

[0022] Figura 5: Calorimetria de Varredura Diferencial de pó CSP7 a granel. O pó CSP7 a granel foi analisado por calorimetria de varredura diferencial usando Calorimetria de Varredura Diferencial de instrumento TA Q20. Na foto está uma curva de DSC modulado com uma frequência de 1 ºC/60s e uma taxa de 2 ºC/min, com rampa de 25 a 300 ºC.

[0023] Figura 6: Análise termogravimétrica de pó CSP7 a granel. A análise termogravimétrica foi realizada usando um Analisador Termogravimétrico Mettler, Modelo TGA/DSC. Na foto está a curva TGA. A taxa de aquecimento foi ajustada para 10 ºC/min, com rampa de 25 a 500 ºC.

[0024] Figura 7: Sorção dinâmica de vapor de pó CSP7 a granel O pó CSP7 a granel foi executado em um instrumento DVS de Sistemas de Medição de Superfície para um ciclo completo de sorção/dessorção de 0% a 90% de umidade relativa em etapas de 10% a ºC. A dessorção de umidade a 0% de umidade e a mudança de massa a 90% de umidade são indicadas.

[0025] Figura 8: Distribuição de tamanho de partícula de CSP7 seco por pulverização. CSP7 foi misturado com leucina, trealose, citrato de sódio ou leucina e trealose e seco por pulverização. O tamanho de partícula foi avaliado por Malvern Mastersizer 2000 (difração de luz laser, aproximação de Fraunhofer; pressão de ar dispersiva: 3,0 Bar). Na foto estão as curvas de cada mistura seca por pulverização.

[0026] Figura 9: Observação visual da suspensão CSP7 homogeneizada. A. Etanol processado com maior potência do rotor-estator por 1 min; B. Suspensão de CSP7-etanol não processado, a seta vermelha indica partículas/agregados grandes; C. Suspensão de CSP7-etanol processada com a maior potência do rotor-estator por 1 min, a suspensão torna-se cinza escuro; D. CSP7- suspensão de etanol processada com a menor potência do rotor-estator por 1 min, suspensão torna-se cinza claro.

[0027] Figura 10: Microscopia Óptica de pó CSP7 moído a jato de ar. Amostras de pó coletadas nos locais indicados do moinho de jato de ar foram fotografadas por microscopia óptica. Na foto estão imagens representativas.

[0028] Figura 11: Microscopia Eletrônica de Varredura de pó CSP7 moído a jato de ar. O pó CSP7 moído (lote 171027) foi fotografado por Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) sob condições idênticas ao pó CSP7 a granel. Na foto está uma imagem SEM representativa do pó CSP7 moído.

[0029] Figura 12: Microscopia de luz de CSP7 após congelamento de película fina. Amostras de pó foram pulverizadas nas lâminas de vidro e visualizadas em um microscópio óptico Leica (Leica CTR6500). As barras de escala são indicadas no canto esquerdo inferior de cada imagem.

[0030] Figura 13: Microscopia Eletrônica de Varredura de CSP7 Seco por Pulverização. A morfologia das partículas de misturas CSP7 secas por pulverização (A = 100% LTI, B = leucina, C = trealose, d = citrato de sódio, e = leucina e trealose) foi examinada usando SEM. Imagens representativas são retratadas.

[0031] Figura 14: Difração de Pó de raios-X de pó CSP7 moído a jato de ar. Os perfis de difração de pó de raios-X de pó de CSP7 a granel moído (lote 171027) e não processado são mostrados. As curvas de difração indicam uma diminuição na cristalinidade no CSP7 moído.

[0032] Figura 15: Estado físico de secagem por pulverização do CSP7. As misturas de CSP7 secas por pulverização foram examinadas por difração de raios-X. Curvas indicando a cristalinidade ou a falta da mesma de cada mistura de CSP7 seca por pulverização são mostradas.

[0033] Figura 16: Análise de HPLC de CSP7 seco por pulverização. A pureza das misturas de CSP7 secas por pulverização foi examinada através do ensaio de sua potência química usando HPLC.

[0034] Figura 17: Análise de HPLC de estabilidade do CSP7 Moído a Jato de Ar. As estabilidades tanto do pó CSP7 a granel não processado quanto do CSP7 moído a jato de ar (lote 171027) foram examinadas por ensaio de sua potência química usando HPLC. Uma amostra de cada foi armazenada em 3 condições diferentes (4 ºC, 25 ºC/60 UR, 40 ºC/75 UR) com tampa de frasco aberta/fechada antes de testar a potência química em 5, 15 e 32 dias de armazenamento.

[0035] Figura 18: Deposição de partículas de CSP7 em aerossol. Após a aerossolização usando um Impactor de Última Geração (NGl), todas as superfícies de coleta foram enxaguadas com volumes conhecidos de tampão Tris 20 mM (pH 10,3). Pós depositados na garganta, pré-separador e etapas 1-MOC foram extraídos separadamente e medidos. É indicada a porcentagem de pó de CSP7 não processado ou moído a jato de ar (lote 171013) (coletado do recipiente de coleta) depositado em um local específico.

[0036] Figura 19: Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica de CSP7 Moído a Jato de Ar. Após a aerossolização usando um Impactor de Última Geração (NG), todas as superfícies de coleta foram enxaguadas com volumes conhecidos de tampão Tris 20 mM (pH 10,3). Os pós depositados na cápsula, dispositivo, adaptador, garganta, pré-separador e etapas 1-MOC foram extraídos separadamente e medidos. Os locais dentro do moinho onde o pó CSP7 não processado ou moído a jato de ar (lote 171027) (coletado de todas as frações do pó moído) foi determinado. A porcentagem do pó moído presente em cada local é mostrada.

[0037] Figura 20: Desempenho de aerossol de misturas de CSP7 seco por pulverização. Após aerossolização por NGl, todas as superfícies de coleta foram enxaguadas com volumes conhecidos de tampão Tris 20 mM (pH 10,3). Os pós depositados na cápsula, dispositivo, adaptador, garganta, pré-separador e etapas 1-MOC foram extraídos separadamente e medidos. É indicada a porcentagem de pó depositado em um local específico.

[0038] Figura 21: Sorção dinâmica de vapor de pó CSP7 moído por jato de ar. O pó CSP7 moído (lote 171027) foi executado em um instrumento DVS de Sistemas de Medição de Superfície para um ciclo completo de sorção/dessorção de 0% a 90% de umidade relativa em etapas de 10% a 25 ºC. A dessorção de umidade a 0% de umidade e a mudança de massa a 90% de umidade são indicadas.

[0039] Figura 22: Análise térmica do pó CSP7 Moído a Jato de Ar. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foi realizada em CSP7 moído (lote 171027) usando um calorímetro conforme acima. Na foto, uma curva de DSC com frequência de 1ºC/60s e taxa de 2ºC/min, com rampa de a 300ºC.

[0040] Figura 23: Propriedades térmicas da secagem por pulverização de 100% de CSP7. O CSP7 seco por pulverização livre de excipiente foi analisado por calorimetria de varrimento diferencial modulada. Na foto está a curva mDSC.

[0041] Figura 24: Propriedades Térmicas de CSP7 Seco por Pulverização com Leucina. A mistura CSP7 seca por pulverização contendo 25% de leucina foi analisada por calorimetria de varredura diferencial modulada. Na foto está a curva mDSC.

[0042] Figura 25: Propriedades térmicas de CSP7 Seco por Pulverização com Trealose. A mistura CSP7 seca por pulverização contendo 25% de trealose foi analisada por calorimetria de varredura diferencial modulada. Na foto está a curva mDSC.

[0043] Figura 26: Propriedades térmicas de CSP7 Seco por Pulverização com Citrato de Sódio. A mistura CSP7 seca por pulverização contendo 25% de citrato de sódio foi analisada por calorimetria de varredura diferencial modulada. Na foto está a curva mDSC.

[0044] Figura 27: Propriedades térmicas de CSP7 Seco por Pulverização com Leucina e Trealose. A mistura de CSP7 seca por pulverização contendo 15% de leucina e 10% de trealose foi analisada por calorimetria de varredura diferencial modulada. Na foto está a curva mDSC.

[0045] Figura 28: Propriedades térmicas de todas as misturas de CSP7 secas por pulverização. Cada uma das misturas de CSP7 secas por pulverização fabricadas foi analisada por MDSC. Todas as curvas mDSC para esses pós são mostradas.

[0046] Figura 29: Peso úmido de tecidos pulmonares dissecados de camundongos. Camundongos eutanasiados foram dissecados e seus pulmões removidos e pesados. Os camundongos foram tratados com solução salina, bleomicina tratada para induzir fibrose pulmonar ou bleomicina tratada e tratada com o peptídeo CSP7 por 12 ou 60 min.

[0047] Figura 30: Teor de Colágeno do Tecido Pulmonar Murino. Os tecidos pulmonares não tratados, tratados com bleomicina ou tratados com bleomicina e com CSP7 foram homogeneizados e o teor de colágeno foi analisado usando o ensaio de colágeno Quickzyme. O gráfico mostra o teor total de colágeno dos pulmões.

[0048] Figura 31: Ashcroft Score do Tecido Pulmonar Murino. Os tecidos pulmonares não tratados, tratados com bleomicina ou tratados com bleomicina e com CSP7 foram homogeneizados e o teor de colágeno foi analisado usando o ensaio de colágeno Quickzyme. Ashcroft scores foram determinadas conforme descrito por Hubner et al. 2008, incorporado neste documento por referência. O gráfico mostra o teor total de colágeno dos pulmões.

[0049] Figura 32: Teor de Colágeno do Tecido Pulmonar Murino. Os tecidos pulmonares não tratados, tratados com bleomicina ou tratados com bleomicina e com CSP7 foram homogeneizados e o teor de colágeno foi analisado usando o ensaio de colágeno Quickzyme. O gráfico mostra o teor total de colágeno dos pulmões.

[0050] Figura 33: Estabilidade de CSP7 (contra-íon de amônio) após 5 ciclos de congelamento e descongelamento.

[0051] Figura 34: Área de superfície específica do pó de CSP7 (contra-íon de amônio) puro e moído.

[0052] Figura 35: Análise termogravimétrica de pó de CSP7 (contra-íon de amônio) puro e moído.

[0053] Figura 36: Imagens de SEM de pó moído e puro de CSP7 (contra-íon de amônio).

[0054] Figura 37: Aparência do pó de CSP7 (contra-íon de amônio) moído no estudo de estabilidade.

[0055] Figura 38: Cristalinidade de CSP7 moído (contra-íon de amônio) no estudo de estabilidade.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS LL DEFINIÇÕES

[0056] Conforme usado neste documento, "essencialmente livre”, em termos de um componente especificado, é usado neste documento para significar que nenhum dos componentes especificados foi propositalmente formulado em uma composição e/ou está presente somente como contaminante ou em pequenas quantidades. A quantidade total do componente especificado resultante de qualquer contaminação não intencional de uma composição é portanto bem inferior a 0,01%. Mais preferida é uma composição em que nenhuma quantidade do componente especificado pode ser detectada com métodos analíticos padrão.

[0057] Conforme usado neste relatório descritivo, "um" ou "uma" pode significar um ou mais. Conforme usado neste documento na(s) reivindicação(ões), quando usado em conjunto com a palavra "compreendendo", as palavras "um" ou "uma" podem significar um ou mais de um.

[0058] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas somente ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas a alternativas e "e/ou". Conforme usado neste documento, "outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais.

[0059] Por todo este pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor ou a variação que existe entre os pacientes do estudo. “Cerca de” significa +/- 10%, a menos que indicado de outra forma.

[0060] O termo "peptídeo", conforme usado neste documento, se refere tipicamente a uma sequência de aminoácidos constituída por uma única cadeia de aminoácidos unida por ligações peptídicas. Geralmente, os peptídeos contêm pelo menos dois resíduos de aminoácidos e têm menos de cerca de 50 aminoácidos de comprimento, a menos que definido de outra forma. Em alguns aspectos, um peptídeo pode ser fornecido com um contra-íon. Da mesma forma, em alguns casos, um peptídeo pode incluir uma modificação N e/ou C-terminal, tal como modificação de bloqueio que reduz a degradação.

[0061] Um peptídeo de caveolina-1 (Cav-1) "biologicamente ativo" se refere a um peptídeo que aumenta os níveis de proteína p53, reduz o ativador de plasminogênio uroquinase (uPA) e o receptor de uPA (UPAR) e/ou aumenta o inibidor de ativador de plasminogênio-1 (PAlI-1) expressão em células, como fibroblastos pulmonares fibróticos. Em alguns aspectos, o peptídeo biologicamente ativo tem pelo menos 20% da atividade biológica ou bioquímica do polipeptídeo de Cav-1 nativo de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, conforme medido por um ensaio in vitro ou in vivo). Em alguns aspectos, o peptídeo ativo biológico tem a mesma ou um aumento da atividade biológica ou bioquímica em comparação com o polipeptídeo de Cav-1 nativo.

[0062] O termo "identidade" ou "homologia' deve ser interpretado como significando a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos ao resíduo de uma sequência correspondente com a qual é comparado, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas, se necessário para atingir a percentagem máxima de identidade para toda a sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Nem as extensões dos N- ou C-terminal, nem as inserções devem ser interpretadas como redutoras de identidade ou homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. A identidade de sequência pode ser medida usando software de análise de sequência.

[0063] O termo "polipeptídeo" ou "proteína" é usado em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de duas ou mais subunidades —de aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações amida. Em outra modalidade, a subunidade pode ser conectada por outras ligações, por exemplo éster, éter, etc. Conforme utilizado neste documento, o termo "aminoácido" se refere a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D ou L e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos. O termo "peptidomimético" ou "peptídeo mimético" significa que um peptídeo, de acordo com a invenção, é modificado de tal forma que inclui pelo menos uma ligação não peptídica, tal como, por exemplo, ligação de ureia, ligação carbamato, ligação sulfonamida, ligação hidrazina, ou qualquer outra ligação covalente. Um peptídeo de três ou mais aminoácidos é comumente chamado de oligopeptídeo se a cadeia do peptídeo for curta. Se a cadeia do peptídeo for longa (por exemplo, mais de 50 aminoácidos), o peptídeo é comumente chamado de polipeptídeo ou proteína.

[0064] Os termos "sujeito" e "indivíduo" e "paciente" são usados indistintamente neste documento e se referem a um animal, por exemplo, um animal humano ou não humano (por exemplo, um mamífero), a quem o tratamento, incluindo o tratamento profilático, com uma composição farmacêutica, conforme divulgada neste documento, é fornecida. O termo "indivíduo", conforme usado neste documento, se refere a animais humanos e não humanos. O termo "animais não humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos, como primatas não humanos (particularmente — primatas superiores), ovelhas, cães, roedores(por exemplo, camundongo ou rato), porquinhos-da-índia, cabras, porcos, gatos, coelhos, vacas e não mamíferos, como galinhas, anfíbios, répteis, etc. Em uma modalidade, o indivíduo é humano. Em outra modalidade, o indivíduo é um animal experimental ou substituto de animal como modelo de doença. Mamíferos não humanos incluem mamíferos como primatas não humanos (particularmente — primatas superiores), ovelhas, cães, roedores(por exemplo, camundongo ou rato), porquinhos-da-índia, cabras, porcos, gatos, coelhos e vacas. Em alguns aspectos, o animal não humano é um animal de companhia, como um cachorro ou um gato.

[0065] "Tratar" uma doença ou condição em um indivíduo ou "tratar" um paciente com uma doença ou condição se refere a submeter o indivíduo a um tratamento farmacêutico, por exemplo, a administração de um medicamento, de modo que pelo menos um sintoma da doença ou condição é diminuído ou estabilizado. Normalmente, quando o peptídeo é administrado terapeuticamente como um tratamento, é administrado a um indivíduo que apresenta um ou mais sintomas de lesão pulmonar ou fibrose pulmonar.

[0066] Por "isolado" entende-se que o polipeptídeo foi separado de qualquer ambiente natural, como um fluido corporal, por exemplo,

sangue, e separado dos componentes que acompanham naturalmente um polipeptídeo.

[0067] Por isolado e "substancialmente puro" entende-se um polipeptídeo que foi separado e purificado pelo menos em algum grau dos componentes que o acompanham naturalmente. Normalmente, um polipeptídeo é substancialmente puro quando é pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mesmo pelo menos cerca de 99%, em peso, livre de proteínas e moléculas orgânicas de ocorrência natural com as quais está naturalmente associado. Por exemplo, um polipeptídeo substancialmente puro pode ser obtido por extração de uma fonte natural, por expressão de um ácido nucleico recombinante em uma célula que normalmente não expressa essa proteína, ou por síntese química.

[0068] O termo "variante", conforme utilizado neste documento, se refere a um polipeptídeo que difere do polipeptídeo por uma ou mais eliminações de aminoácidos, adições, substituições ou modificações da cadeia lateral, ainda retém uma ou mais funções específicas ou atividades biológicas da molécula de ocorrência natural. As substituições de aminoácidos incluem alterações nas quais um aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido diferente de ocorrência natural ou não convencional. Tais substituições podem ser classificadas como "conservativas", caso em que um resíduo de aminoácido contido em um polipeptídeo é substituído por outro aminoácido de ocorrência natural de caráter semelhante em relação à polaridade, funcionalidade da cadeia lateral ou tamanho. Essas substituições conservativas são bem conhecidas na técnica. As substituições abrangidas pela presente invenção também podem ser "não conservativas", em que um resíduo de aminoácido que está presente em um peptídeo é substituído por um aminoácido com propriedades diferentes, como um aminoácido de ocorrência natural de um grupo diferente (por exemplo, substituindo um aminoácido carregado ou hidrofóbico com alanina), ou alternativamente, em que um aminoácido de ocorrência natural é substituído por um aminoácido não convencional. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são conservativas. Também englobado no termo variante quando usado com referência a um polinucleotídeo ou polipeptídeo, se refere a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que pode variar na estrutura primária, secundária ou terciária, em comparação com um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, respectivamente (por exemplo, em comparação a um polinucleotídeo ou polipeptídeo de tipo selvagem).

[0069] Os termos "inserções" ou "eliminações" estão tipicamente na gama de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada experimentalmente pela produção do peptídeo sinteticamente, enquanto sistematicamente faz inserções, eliminações ou substituições de nucleotídeos na sequência usando técnicas de DNA recombinante.

[0070] O termo "substituição" quando se refere a um peptídeo, se refere a uma mudança em um aminoácido para uma entidade diferente, por exemplo, outro aminoácido ou fração de aminoácido. As substituições podem ser conservativas ou não conservativas.

[0071] Um "análogo" de uma molécula, tal como um peptídeo, se refere a uma molécula semelhante em função à molécula inteira ou a um fragmento da mesma. O termo "análogo" também pretende incluir espécies alélicas e variantes induzidas. Os análogos normalmente diferem dos peptídeos de ocorrência natural em uma ou algumas posições, muitas vezes em virtude de substituições conservativas. Os análogos exibem tipicamente pelo menos 80 ou 90% de identidade de sequência com peptídeos naturais. Alguns análogos também incluem aminoácidos não naturais ou modificações de aminoácidos N- ou C-terminal. Exemplos de aminoácidos não naturais são, por exemplo, mas não estão limitados a; aminoácidos dissubstituídos, N-alguila aminoácidos, ácido láctico, 4-

hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, e-N,N, N-trimetilisina, e-N-acetilisina, O- fosfoserina, — N-acetilserina, — N-formilmetionina, — 3-metil-histidina, — 5- hidroxilisina, o-N-metilarginina. Fragmentos e análogos podem ser analisados quanto à eficácia profilática ou terapêutica em modelos animais transgênicos, conforme descrito abaixo.

[0072] Por "ligado covalentemente" entende-se unido direta ou indiretamente (por exemplo, através de um ligante) por uma ligação química covalente. Em alguns aspectos de todas as modalidades da invenção, os peptídeos de fusão são ligados covalentemente.

[0073] O termo "proteína de fusão", conforme usado neste documento, se refere a uma proteína recombinante de duas ou mais proteínas. As proteínas de fusão podem ser produzidas, por exemplo, por uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é unida ao ácido nucleico que codifica outra proteína de modo que constituam um único quadro de leitura aberta que pode ser traduzido nas células em um único polipeptídeo que abriga todas as proteínas pretendidas. A ordem de arranjo das proteínas pode variar. As proteínas de fusão podem incluir um marcador de epítopo ou um extensor de meia-vida. As etiquetas de epítopo incluem biotina, etiqueta FLAG, c-myc, hemaglutinina, His6, digoxigenina, FITC, Cy3, Cy5, proteína verde fluorescente, etiquetas de epítopo V5, GST, B-galactosidase, AU1I, AUS e avidina. Os extensores de meia-vida incluem domínio Fc e albumina sérica.

[0074] O termo "via aérea" se refere neste documento a qualquer parte do trato respiratório, incluindo o trato respiratório superior, as vias aéreas respiratórias e os pulmões. O trato respiratório superior inclui o nariz e as passagens nasais, boca e garganta. As vias respiratórias incluem a laringe, traqueia, brônquios e bronquíolos. Os pulmões incluem os bronquíolos respiratórios, ductos alveolares, sacos alveolares e alvéolos.

[0075] Os termos "lesão pulmonar aguda induzida por inalação de fumaça" e "ISALI" são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a uma forma de lesão pulmonar aguda (ALI) causada pela inalação de fumaça. A ALI também é conhecida como “síndrome do desconforto respiratório agudo leve; SDRA." SDRA pode ser definida encontrando-se uma ou mais das seguintes condições em um indivíduo: 1) infiltrados pulmonares bilaterais na radiografia de tórax, 2) quando medido por cateterismo cardíaco direito conforme indicado clinicamente, pressão capilar pulmonar em cunha <18 mmHg (2,4 kPa) e 3) PaO2/FiO2 <300 mmHg (40 kPa). Em algumas modalidades, o tratamento de ISALI inclui o tratamento de uma ou mais das seguintes condições: oxigenação reduzida, obstrução das vias aéreas (incluindo uma obstrução grave das vias aéreas), vazamentos ou detritos fibrinosos das vias aéreas e deposição de fibrina alveolar.

[0076] O termo "moinho de jato de ar" se refere a um dispositivo ou método para reduzir o tamanho das partículas usando um jato de gás comprimido para impactar as partículas umas nas outras, pulverizando assim as partículas. Um moinho de jato de ar pode ser usado para reduzir o tamanho das partículas de peptídeo. Outros dispositivos de moagem mecânica que executam a mesma função também podem ser usados alternadamente com o moinho a jato de ar. A moagem a jato de ar pode ocorrer sob vários parâmetros ambientais, como temperatura, pressão, umidade relativa/de absorção, teor de oxigênio, etc.

[0077] O termo "moinho de bolas" se refere a um dispositivo ou método para reduzir o tamanho da partícula adicionando a partícula de interesse e um meio de moagem ao interior de um cilindro e girando o cilindro. As partículas de interesse são quebradas conforme o meio de moagem sobe e desce ao longo do exterior do cilindro enquanto ele gira. Um moinho de bolas pode ser usado para reduzir o tamanho das partículas de peptídeo. Outros dispositivos de moagem mecânica que executam a mesma função também podem ser usados alternadamente com o moinho a jato de ar.

[0078] Os termos "moinho úmido" ou "moinho de meio" se referem a um dispositivo ou método para reduzir o tamanho da partícula adicionando a partícula de interesse ao dispositivo com um agitador, contendo um meio compreendendo um líquido e um meio de moagem. Com a adição da partícula de interesse, conforme o agitador gira, a energia que ele dispersa faz com que o meio de moagem e as partículas de interesse entrem em contato e quebrem as partículas de interesse. Outros dispositivos de moagem mecânica que executam a mesma função também podem ser usados alternadamente com o moinho a jato de ar.

[0079] O termo "homogeneização de alta pressão" se refere a um método de redução do tamanho de partícula pela adição da partícula de interesse a um dispositivo que combina pressão e forças mecânicas para quebrar a partícula de interesse. As forças mecânicas usadas na homogeneização de alta pressão podem incluir impacto, cisalhamento e cavitação, entre outras. Outros dispositivos de moagem mecânica que executam a mesma função também podem ser usados alternadamente com o moinho a jato de ar.

[0080] O termo "moinho criogênico" se refere a um dispositivo ou método para reduzir o tamanho de partícula, primeiro resfriando uma partícula de interesse com gelo seco, nitrogênio líquido ou outro líquido criogênico e, subsequentemente, moendo a partícula de interesse para reduzir o tamanho. Outros dispositivos de moagem mecânica que executam a mesma função também podem ser usados alternadamente com o moinho a jato de ar.

[0081] A frase "quantidade eficaz" ou "terapeuticamente eficaz" significa uma dosagem de um medicamento ou agente suficiente para produzir um resultado terapêutico desejado. O resultado terapêutico desejado pode ser uma melhora subjetiva ou objetiva no receptor da dosagem, redução da infecção, redução da inflamação, aumento do crescimento pulmonar, aumento do reparo pulmonar, redução do edema do tecido, aumento do reparo do DNA, diminuição da apoptose, diminuição do tamanho do tumor, diminuição na taxa de crescimento das células cancerosas, uma diminuição na metástase ou qualquer combinação dos anteriores.

[0082] Conforme utilizado neste documento, "excipiente" se refere a transportadores farmaceuticamente aceitáveis que são substâncias relativamente inertes usadas para facilitar a administração ou entrega de um Ingrediente Farmacêutico Ativo (API) em um indivíduo ou usado para facilitar o processamento de um API em formulações de medicamentos que podem ser usados farmaceuticamente para entrega ao local de ação em um indivíduo. Excipientes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem todos os componentes inativos da forma de dosagem, exceto para o(s) ingrediente(s) ativo(s). Exemplos não limitantes de excipientes incluem agentes transportadores, agentes de volume, agentes estabilizadores, surfactantes, modificadores de superfície, intensificadores de solubilidade, tampões, agentes encapsulantes, antioxidantes, conservantes, agentes umectantes ou clarifictantes não iônicos, agentes de aumento de viscosidade e agentes de aumento de absorção. "Livre de excipiente" se refere à composição farmacêutica de interesse em uma formulação livre de quaisquer excipientes.

[0083] As frases "composição farmacêutica" ou "composição farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal, tal como um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo de Cav-1, tal como CSP7, ou ingredientes ativos adicionais será conhecida pelos técnicos no assunto à luz da presente divulgação. Além disso, para administração em animais (por exemplo, humanos), será entendido que as preparações devem atender aos padrões de biocarga, esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e/ou pureza, conforme exigido pela FDA ou outra autoridade regulatória reconhecida.

[0084] Conforme utilizado neste documento, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer excipiente, auxiliar de processamento, solventes aquosos (por exemplo, água, Soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parenterais, tais como cloreto de sódio, dextrose de Ringer, etc.), solventes não aquosos (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglico|, óleo vegetal e ésteres orgânicos injetáveis, como etiloleato), meios de dispersão, revestimentos, surfactantes, antioxidantes, “conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos ou antifúngicos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes), agentes isotônicos, agentes de retardamento de absorção, sais, medicamentos, estabilizadores de medicamentos, géis, aglutinantes, agentes de desintegração, lubrificantes, modificadores de sabor (por exemplo, agentes adoçantes, agentes aromatizantes), tais como materiais e combinações dos mesmos, como seria do conhecimento de um técnico no assunto. O pH e a concentração exata dos vários componentes em uma composição farmacêutica são ajustados de acordo com parâmetros bem conhecidos. Em alguns aspectos, o transportador pode encapsular um agente terapêutico, mas não pode ser consumido ou administrado a um indivíduo (por exemplo, uma cápsula de carcaça envolvendo uma composição de pó seco, tal como para uso em um inalador de pó seco).

1. — PEPTÍDEOS DE CAVEOLINA-1

[0085] As modalidades da presente divulgação fornecem a formulação de pó seco de peptídeos de caveolina-1 (Cav-1). O domínio ou peptídeo de estrutura caveolina-1 (Cav-1) interfere com a interação de Cav- 1 com quinases Src que imita o efeito combinado de uPA e anticorpo anti- Bi-integrina. O Cav-1 nativo humano tem um comprimento de 178 aminoácidos e um peso molecular de 22 kDa. A sequência de aminoácidos de Cav-1 é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 1).

1 MSGGKYVDSE GHLYTVPIRE QGNIYKPNNK AMADELSEKQ VYDAHTKEID LVYNRDPKHLN 61 DDVVKIDFED VIAEPEGTHS FDGIWKASET TETVTKYWFY RLLSALFGIP MALIWGIYFA 121 ILSFLHIWAV VPCIKSFLIE IQCISRVYSI YVHTVCDPLF EAVGKIFSNV RINLOKEI

[0086] Em alguns aspectos, o peptídeo é um peptídeo de domínio de estrutura que compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 2,rFmFIvr. O peptídeo pode compreender 1, 2, 3, 4 ou mais substituições, eliminações ou inserções de aminoácidos em relação à sequência de SEQ ID NO: 1, de modo a derivar um polipeptídeo de 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 resíduos. Em aspectos particulares, os peptídeos são truncamentos do polipeptídeo de Cav-1 nativo, como os peptídeos exemplares mostrados na Tabela 1. TABELA 1: PEPTÍDEOS DE CAV-1 EXEMPLARES. Sequência ErTEIVT SEQIDNO:? IASFITEEVT O BEQIDNO:3 IKASFEITETVIKGS NÚ SEQIDNO4 IKASsFTTEIVIKGS-NH2 = SEQIDNO:5 aaEGKASFTTFTVTKGSaa SEQ ID NO: 6 aaEGKASFTTFTVTKGSaa-NH2 SEQ ID NO: 7 ASETTETVTKGSaa-NH2 SEQ ID NO: 8 OASFTTFTVTOS SEQ ID NO: 9 OASFTTFTVTOS-NH2 SEQ ID NO: 10 IFTTFIVTANHA O SEQIDNO:11 IFTTFIVIKANHZ UU BEQIDNO:12 KASFTTFTVTK-NH2 SEQ ID NO: 13 |ACKASFTTFIVTK-NHZ O SEQIDNO: 14 OASFTTFTVTK-NH2 SEQ ID NO: 15 Ac-OASFTTFTVTK-NH2 SEQ ID NO: 16 IAC-KASFTTFTVTKGS-NH2 SEQ ID NO: 17 DSGKASFTTFTVTK-NH2 SEQ ID NO: 18 |Ac-DSGKASFTTFIVIKNHZ => [SEQIDNO:19 IAC-DASFTTFTVTOS-NH2 SEQ ID NO: 20 H-DGIWKASF-NH2 SEQ ID NO: 21 IH-VTKYWFYRNH2 UU KSEQIDNO:22 (a=D-Alanina, O=Omitina)

[0087] Os peptídeos fornecidos na presente divulgação são derivados biologicamente ativos que têm a atividade do polipeptídeo de Cav-1 nativo em ensaios in vitro ou in vivo de ligação ou de atividade biológica. Em aspectos particulares, o peptídeo inibe ou previne a apoptose de células epiteliais pulmonares (LECs) induzidas por bleomicina in vitro ou in vivo com atividade de pelo menos cerca de 20% da atividade do polipeptídeo de Cav-1 nativo, ou pelo menos cerca de 30% 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, cerca de 95%, 97%, 99% e qualquer faixa derivável da mesma, tal como, por exemplo, de cerca de 70% a cerca de 80%, e mais preferencialmente de cerca de 81% a cerca de 90%; ou ainda mais preferencialmente, de cerca de 91% a cerca de 99%. O peptídeo pode ter 100% ou mesmo mais atividade do que o polipeptídeo de CAV-1 nativo. Os ensaios para testar a atividade biológica, por exemplo, atividade antifibrótica, a capacidade de afetar a expressão de uPA, uPAR e PAI-1 mRNAs ou inibir a proliferação de fibroblastos pulmonares, são bem conhecidos na técnica.

[0088] Os peptídeos da presente divulgação são peptídeos do polipeptídeo de Cav-1 nativo ou as versões modificadas do mesmo. Os peptídeos podem ser peptídeos sintéticos, recombinantes ou quimicamente modificados, isolados ou gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. As modificações podem ser feitas aos aminoácidos no N-terminal, C-terminal ou internamente. As modificações do N-terminal podem ser, por exemplo, mas não se limitam a, acilação, acetilação ou amidação do C- terminal. Os peptídeos podem incluir alterações conservativas ou não conservativas de aminoácidos, conforme descrito abaixo. As alterações de polinucleotídeos podem resultar em substituições, adições, eliminações, fusões e truncagens de aminoácidos no polipeptídeo codificado pela sequência de referência. Os peptídeos também podem incluir inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos, incluindo inserções e substituições de aminoácidos (e outras moléculas) que normalmente não ocorrem na sequência de aminoácidos que é a base do peptídeo, por exemplo, mas não se limitando à inserção L-aminoácidos, ou aminoácidos não padrão, como ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. O termo substituição conservativa, quando descreve um peptídeo, se refere a uma mudança na composição de aminoácidos do peptídeo que não altera substancialmente a atividade do peptídeo. Por exemplo, uma substituição conservativa se refere à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente que possui propriedades químicas semelhantes. As substituições conservativas de aminoácidos incluem a substituição de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato ou uma treonina por uma serina.

[0089] As substituições conservativas de aminoácidos resultam da substituição de um aminoácido por outro com propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, como a substituição de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato ou uma treonina por uma serina. Assim, uma substituição conservativa de uma sequência de aminoácidos particular se refere à substituição daqueles aminoácidos que não são críticos para a atividade polipeptídica ou substituição de aminoácidos por outros aminoácidos com propriedades semelhantes (por exemplo, ácido, básico, carregado positivamente ou negativamente, polar ou apolar, etc.) de modo que a substituição mesmo de aminoácidos críticos não reduza a atividade do peptídeo. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, cada um dos seis grupos a seguir contém aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (1), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). (Veja também Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984), incorporado por referência na sua totalidade.) Em algumas modalidades, as substituições, eliminações ou adições individuais que alteram, adicionam ou excluem um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos também podem ser consideradas substituições conservativas se a mudança não reduzir a atividade do peptídeo. As inserções ou eliminações estão tipicamente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A escolha de aminoácidos conservativos pode ser selecionada com base na localização do aminoácido a ser substituído no peptídeo, por exemplo, se o aminoácido está no exterior do peptídeo e exposto a solventes, ou no interior e não exposto a solventes.

[0090] Em modalidades alternativas, pode-se selecionar o aminoácido que irá substituir um aminoácido existente com base na localização do aminoácido existente, ou seja, sua exposição a solventes (isto é, se o aminoácido for exposto a solventes ou estiver presente na superfície externa do peptídeo ou polipeptídeo em comparação com aminoácidos localizados internamente não expostos a solventes). A seleção de tais substituições conservativas de aminoácidos é bem conhecida na técnica, por exemplo, conforme divulgado em Dordo et al, J. Mol Biol, 1999, 217, 721-739 e Taylor et al, J. Theor. Biol. 119(1986); 205-218 e S. French e B. Robson, J. Mol. Evol. 19(1983)171. Consequentemente, pode-se selecionar substituições conservativas de aminoácidos adequadas para aminoácidos no exterior de uma proteína ou peptídeo (ou seja, aminoácidos expostos a um solvente), por exemplo, mas não limitado a, as seguintes substituições podem ser usadas: substituição de Y com F, T com S ou K, P com A, E com D ou Q, N com D ou G, R com K, G com N ou A, T com S ou K, D com N ou E, | com L ou V, F com Y, S com T ou A, R com K, G com N ou A, K com R, Acom S, Kou P.

[0091] Em modalidades alternativas, também se pode selecionar substituições conservativas de aminoácidos abrangidas adequadas para aminoácidos no interior de uma proteína ou peptídeo, por exemplo, pode-se usar substituições conservativas de aminoácidos adequadas no interior de uma proteína ou peptídeo (isto é, os aminoácidos não são expostos a um solvente), por exemplo, mas não limitado a, pode- se usar as seguintes substituições conservativas: onde Y é substituído com F, Tcom A ou S, | com L ou V, W com Y, M com L, N com D, G com A, T com A ou S, D com N, | com L ou V, F com Y ou L, S com A ou T e A com S, G, T ou V. Em algumas modalidades, as substituições não conservativas de aminoácidos também estão englobadas no termo de variantes.

[0092] Em alguns aspectos, os polipeptídeos são derivados do polipeptídeo de Cav-1 nativo. O termo "derivado", conforme utilizado neste documento, se refere a peptídeos que foram quimicamente modificados, por exemplo, mas não limitados a técnicas como acetilação, ubiquitinação, marcação, peguilação (derivatização com polietilenoglico!), lipidação, glicosilação, amidação ou adição de outras moléculas. Uma molécula também é um "derivado" de outra molécula quando contém porções químicas adicionais que normalmente não fazem parte da molécula. Essas porções podem alterar o pH ou melhorar a estabilidade, solubilidade, absorção, meia-vida biológica da molécula, etc. As porções podem, alternativamente, diminuir a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito colateral indesejável da molécula, etc. As porções capazes de mediar tais efeitos são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º edição, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (1990), incorporado neste documento, por referência, na sua totalidade.

[0093] O termo "funcional" quando usado em conjunto com "derivado" ou "variante" se refere a um polipeptídeo da invenção que possui uma atividade biológica (funcional ou estrutural) que é substancialmente semelhante a uma atividade biológica da entidade ou molécula que é um derivado funcional ou variante funcional do mesmo. O termo derivado funcional pretende incluir os fragmentos, análogos ou derivados químicos de uma molécula.

[0094] Em alguns aspectos, as substituições de aminoácidos podem ser feitas em um polipeptídeo em uma ou mais posições em que a substituição é por um aminoácido com uma hidrofilicidade semelhante. À importância do índice hidropático de aminoácidos em conferir função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolittle, 1982). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e semelhantes. Assim, essa substituição conservativa pode ser feita em um polipeptídeo e provavelmente terá apenas efeitos menores em sua atividade. Conforme detalhado na Patente dos EUA nº 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos aos resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 + 1); glutamato (+3,0 + 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 + 1); alanina (0,5); histidina -0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Estes valores podem ser usados como um guia e assim a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de +2 são preferidos, aqueles que estão dentro de +1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidos. Assim, qualquer um dos polipeptídeos descritos neste documento pode ser modificado pela substituição de um aminoácido, por um aminoácido diferente, mas homólogo com um valor de hidrofiliidade semelhante. Os aminoácidos com hidrofilicidades dentro de +/- 1,0 ou +/- 0,5 pontos são considerados homólogos.

[0095] Os peptídeos de Cav1 podem compreender modificações co-traducionais e pós-traducionais (clivagem do peptídeo C- terminal), tais como, por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, acetilação, fosforilação, clivagem proteolítica (por exemplo,

clivagem por furinas ou metaloproteases), e semelhantes, na medida em que tais modificações não afetam as propriedades antiinflamatórias dos peptídeos isolados ou sua capacidade de melhorar o controle glicêmico.

[0096] Em alguns aspectos, o peptídeo de Cav-1 compreende aminoácidos de ocorrência não natural. Os peptídeos podem compreender uma combinação de aminoácidos de ocorrência natural e não natural, ou podem compreender apenas aminoácidos de ocorrência não natural. Os aminoácidos de ocorrência não natural podem incluir aminoácidos não nativos sintéticos, aminoácidos substituídos ou um ou mais D-aminoácidos nos peptídeos (ou outros componentes da composição, com exceção de sequências de reconhecimento de protease) é desejável em certas situações. Os peptídeos contendo D-aminoácido exibem estabilidade aumentada in vitro ou in vivo em comparação com as formas contendo L- aminoácido. Assim, a construção de peptídeos incorporando D-aminoácidos pode ser particularmente útil quando maior estabilidade in vivo ou intracelular é desejada ou necessária. Mais especificamente, os D- peptídeos são resistentes a peptidases e proteases endógenas, proporcionando assim uma melhor distribuição oral transepitelial e transdérmica de medicamentos e conjugados ligados, biodisponibilidade melhorada de complexos permanentes de membrana (ver abaixo para discussão posterior) e vidas úteis intravascular e intersticial prolongadas em que tais propriedades são desejáveis. O uso de peptídeos de D-isômero também pode aumentar a distribuição transdermal e oral transepitelial de medicamentos ligados e outras moléculas de carga. Além disso, os D- peptídeos não podem ser processados eficientemente para apresentação restrita de classe Il do complexo principal de histocompatibilidade para células T auxiliares e, portanto, são menos propensos a induzir respostas imunes humorais em todo o organismo. Os conjugados de peptídeos podem, portanto, ser construídos usando, por exemplo, formas de D- isômero de sequências de peptídeos de penetração celular, formas de L-

isômero de locais de clivagem e formas de D-isômero de peptídeos terapêuticos.

[0097] Além dos 20 L-aminoácidos "padrão", D-aminoácidos ou aminoácidos não padrão, modificados ou incomuns que são bem definidos na técnica também são contemplados para uso na presente divulgação. Aminoácidos fosforilados (Ser, Thr, Tyr), aminoácidos glicosilados (Ser, Thr, Asn), B-aminoácidos, GABA, w-aminoácidos são ainda contemplados para uso na presente divulgação. Estes incluem, por exemplo, B-alanina (B-Ala) e outros w-aminoácidos, tais como ácido 3-aminopropiônico, ácido 2,3- diaminopropiônico (Dpr), ácido 4-aminobutírico e assim por diante; ácido a- aminoisobutírico (Aib); ácido e-amino-hexanóico (Aha); ácido aminovalérico (Ava); N-metilglicina ou sarcosina (MeGly); ornitina (Orn); citrulina (Cit); t-butilalanina (t-BuA); t-butilglicina (t-BuG); N-metilisoleucina (Melle); fenilglicina (Phg); norleucina (Nle); 4-clorofenilalanina (Phe(4-C1)); a-fluorofenilalanina — (Phe(2-F)); — 3-fluorofenilalanina — (Phe(3-FP)); 4 fluorofenilalanina (Phe(4-F)); penicilamina (Pen); ácido 1,2,3,4-tetra- hidroisoquinolina-3-carboxílico (Tic); homoarginina (hArg); N-acetil lisina (AcLys); ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu); ácido 2,4-diaminobutírico (Dab); p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); N-metil valina (MeVal); homocisteína (hCys), homofenilalanina (hPhe) e homoserina (hSer); hidroxiprolina (Hyp), homoprolina (hPro), aminoácidos N-metilados e peptóides (glicinas N- substituídas).

[0098] As modificações do terminal carboxi incluem acilação com ácidos carboxílicos: fórmico, acético, propiônico, ácidos graxos (mirístico, palmítico, esteárico), succínico, benzóico, carbobenzoxi (Cbz); acetilação e biotinilação. As modificações do terminal amino incluem: (i) acilação com ácidos carboxílicos: fórmico, acético, propiônico, ácidos graxos (mirístico, palmítico, esteárico, etc) succínico, benzóico, carbobenzóxi (Cbz); (ii) biotinilação; (iii) amidação; (iv) fixação de corantes, como fluoresceína (FITC, FAM, etc.), ácido 7-hidroxi-4- metilcumarin-3-

acético, ácido 7-hidroxicumarin-3-acético, ácido 7-metoxicumarin-3-acético e outros cumarinas; rodaminas (5-carboxi rodamina 110 ou 6G, 5(6)- TAMRA, ROX); ácido N-[4-(4-dimetilamino)fenilazo]bezóico (Dabcil), 2,4- dinitrobenzeno (Dnp), ácido 5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfônico (Dansil) e outros corantes; e (v) polietilenoglicol.

[0099] O polipeptídeo pode ser tampado em seus terminais N e C com um grupo acila (abreviado "Ac") e um grupo amido (abreviado "Am"), respectivamente, por exemplo acetila (CH3CO-) no N-terminal e amido (- NH>2) no C-terminal. Uma ampla faixa de funções de cobertura N-terminal, preferencialmente em uma ligação ao grupo amino terminal, é contemplada, por exemplo: formila; alcanoila, com 1 a 10 átomos de carbono, como acetila, propionila, butirila; alcenoila, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hex-3-enoila; alcinoila, com 1 a 10 átomos de carbono, tal como hex-5-inoila; aroila, tal como benzoila ou 1-naftoila; heteroaroila, tal como 3-pirrroila ou 4-quinoloila; alquilsulfonila, tal como metanossulfonila; arilsulfonila, tal como benzenossulfonila ou sulfanilila; heteroarilsulfonila, tal como piridina-4-sulfonila; alcanoila substituída, com 1 a 10 átomos de carbono, tal como 4- aminobutirila; alcenoila substituída, com 1 a 10 átomos de carbono, tal como 6- hidroxi-hex-3-enoila; alcinoila substituída, com 1 a 10 átomos de carbono, tal como 3- hidroxi-hex-5-inoila; aroila substituída, tal como 4-clorobenzoila ou 8-hidroxi-naft-2-oila; heteroaroila substituída, tal como 2,4-dioxo-1,2,3,4-tetra-hidro-3-metil- quinazolin-6-oila; alquilsulfonila substituída, tal como 2-aminoetanossulfonila;

arilsulfonila substituída, tal como 5-dimetilamino-1-naftalenossulfonila; heteroarilsulfonila substituída, tal como 1-metoxi-6- isoquinolinossulfonila; carbamoila ou tiocarbamoila; carbamoila substituída (R'-NH-CO) ou tiocarbamoila substituída (R'”- NH-CS) em que R' é alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, alquila substituída, alqguenila substituída, alquinila substituída, arila substituída ou heteroarila substituída; carbamoila substituída (R'-NH-CO) e tiocarbamoila substituída (R'"- NH-CS), em que R' é alcanoila, alcenoila, alcinoila, aroila, heteroaroila, alcanoila substituída, alcenoila substituída, alcinoila substituída, aroila substituída ou heteroaroila substituída, tudo conforme definido acima.

[00100] A função de cobertura C-terminal pode estar em uma ligação amida ou éster com o carboxila terminal. As funções de cobertura que proporcionam uma ligação amida são designadas como NR'R? em que R' e R? podem ser extraídos independentemente do seguinte grupo: hidrogênio; alquila, de preferência com 1 a 10 átomos de carbono, tal como metila, etila, isopropila; alcenila, de preferência com 1 a 10 átomos de carbono, tal como prop-2-enila; alcinila, de preferência com 1 a 10 átomos de carbono, tal como prop- 2-inila; alquila substituída com 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialquila, alcoxialquila, mercaptoalquila, alquiltioalquila, halogenoalquila, — cianoalquila, — aminoalquila, — alguilaminoalquila, — di- alquilaminoalquila, alcanoilalquila, carboxialquila, carbamoilalquila; alcenila substituída com 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialcenila, alcoxialcenila, mercaptoalcenila, alquiltioalcenila,

halogenoalcenila, cianoalcenila, aminoalcenila, alquilaminoalcenila, di- alquilaminoalcenila, alcanoilalcenila, carboxialcenila, carbamoilalcenila; alcinila substituída com 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialcinila, alcoxialcinila, mercaptoalcinila, alquiltioalcinila, halogenoalcinila, —cianoalcinila, = aminoalcinila, — alguilaminoalcinila, — di- alquilaminoalcinila, alcanoilalcinila, carboxialcinila, carbamoilalcinila; aroilalquila com até 10 átomos de carbono, como fenacila ou 2- benzoiletila; arila, tal como fenila ou 1-naftila; heteroarila, tal como 4-quinolila; alcanoila com 1 a 10 átomos de carbono, como acetila ou butirila; aroila, como benzoila; heteroaroila, tal como 3-quinoloila; OR' ou NRR" em que R' e R” são independentemente hidrogênio, alquila, arila, heteroarila, acila, aroila, sulfonila, sulfinila ou SO2-R" ou SO- R" em que R"” é alquila substituída ou não substituída, arila, heteroarila, alcenila ou alcinila.

[00101] As funções de cobertura que fornecem uma ligação éster são designadas como OR, em que R pode ser: alcóxi; arilóxi; heteroarilóxi; aralquilóxi; heteroaralquilóxi; alcóxi substituída; arilóxi substituída; heteroarilóxi substituída; aralquilóxi substituída; ou heteroaralquilóxi substituída.

[00102] As funções de cobertura N-terminal ou C-terminal, ou ambas, podem ser de tal estrutura que a molécula coberta funcione como um pró-medicamento (um derivado farmacologicamente inativo da molécula do medicamento original) que sofre transformação espontânea Ou enzimática dentro do corpo a fim de liberar o medicamento ativo e que melhorou as propriedades de entrega sobre a molécula do medicamento original (Bundgaard H, Ed: Design of Prodrugs, Elsevier, Amsterdam, 1985).

[00103] A escolha criteriosa de grupos de cobertura permite a adição de outras atividades no peptídeo. Por exemplo, a presença de um grupo sulfidrila ligado a cobertura do N- ou C-terminal permitirá a conjugação do peptídeo derivatizado a outras moléculas.

[00104] Ainda em um aspecto adicional, os peptídeos ou fragmentos ou derivados dos mesmos podem ser "peptídeos retro- inversos". Um "peptídeo retro-inverso" se refere a um peptídeo com uma reversão da direção da ligação peptídica em pelo menos uma posição, isto é, uma reversão dos terminais amino- e carboxi- em relação à cadeia lateral do aminoácido. Assim, um análogo retro-inverso inverteu os terminais e a direção das ligações peptídicas, mantendo aproximadamente a topologia das cadeias laterais como na sequência do peptídeo nativo. O peptídeo retro-inverso pode conter L-aminoácidos ou D-aminoácidos, ou uma mistura de L-aminoácidos e D-aminoácidos, até que todos os aminoácidos sejam o D-isômero. Análogos de peptídeos retroinversos parciais são polipeptídeos nos quais apenas parte da sequência é revertida e substituída por resíduos de aminoácidos enantioméricos. Uma vez que a porção retro-invertida de tal análogo reverteu os terminais amino e carboxila, os resíduos de aminoácidos que flanqueiam a porção retro-invertida são substituídos por geminal-diaminometanos a-substituídos análogos de cadeia lateral e malonatos, respectivamente. Constatou-se que as formas retro-inversas de peptídeos de penetração celular funcionam tão eficientemente na translocação através de uma membrana quanto as formas naturais. À síntese de análogos de peptídeo retro-inverso é descrita em Bonelli, F. et al., Int J Pept Protein Res. 24(6):553-6 (1984); Verdini, A e Viscomi, G. C, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 697-701 (1985); e Patente dos EUA nº

6.261.569, que são incorporadas neste documento na sua totalidade por referência. Foram descritos processos para a síntese em fase sólida de análogos de peptídeos retro-inversos parciais (EP 97994-B), que também é incorporado neste documento na sua totalidade por referência.

[00105] Um polinucleotídeo ou região polinucleotídica (ou um polipeptídeo ou região polipeptídica) tem uma certa porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de "identidade de sequência" ou "homologia" com outra sequência significa que, quando alinhadas, essa porcentagem de bases (ou aminoácidos) é a mesma na comparação das duas sequências. Este alinhamento e a homologia percentual ou identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos em Current Protocols In Molecular Biology (F.M. Ausubel et a/., Eds., 1987) Suplemento 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrão são usados para alinhamento. Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão. Em particular, os programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrões: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; expectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundante, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+translações CDS do GenBank+SwissProtein+SPupdate+PIR.

B. — POLIPEPTÍDEOS MULTIMÉRICOS

[00106] As modalidades da presente divulgação também incluem polipeptídeos mais longos construídos a partir de unidades de repetição de peptídeos de Cav-1. Um multímero polipeptídico pode compreender diferentes combinações de polipeptídeos. Esses polipeptídeos multiméricos podem ser feitos por síntese química ou por técnicas de DNA recombinante como discutido neste documento. Quando produzidos por síntese química, os oligômeros têm preferencialmente de 2-5 repetições de uma sequência polipeptídica central, e o número total de aminoácidos no multímero não deve exceder cerca de 160 resíduos, de preferência não mais do que 100 resíduos (ou seus equivalentes, quando incluindo ligantes ou espaçadores).

C. —PEPTIDOMIMÉTICOS

[00107] O peptídeo de Cav-1 pode ser um composto peptidomimético que imita os efeitos biológicos do polipeptídeo de Cav-1 nativo. Um agente peptidomimético pode ser um peptídeo não natural ou um agente não peptídico que recria as propriedades estereoespaciais dos elementos de ligação do polipeptídeo de Cav-1 nativo de modo que tenha a atividade de ligação e a atividade biológica do polipeptídeo de Cav-1 nativo. Semelhante a um polipeptídeo de Cav-1 nativo ou multímero de polipeptídeo, um peptidomimético terá uma face de ligação (que interage com qualquer ligante ao qual o Cav-1 nativo se liga) e uma face de não ligação.

[00108] Em alguns aspectos, a presente divulgação também inclui compostos que retêm características parciais do peptídeo. Por exemplo, qualquer ligação proteoliticamente instável dentro de um peptídeo da invenção pode ser seletivamente substituída por um elemento não peptídico, como um isóstero (N-metilação; D-aminoácido) ou uma ligação peptídica reduzida enquanto o resto da molécula retém sua natureza peptídica.

[00109] Os compostos peptidomiméticos, sejam agonistas, substratos ou inibidores, foram descritos para vários peptídeos/polipeptídeos bioativos, tais como peptídeos opióides, VIP, trombina, protease de HIV, etc. Métodos para projetar e preparar compostos peptidomiméticos são conhecidos na técnica (Hruby, VJ, Biopolymers 33:1073-1082 (1993); Wiley, RA et al., Med. Res. Rev. 13:327- 384 (1993); Moore et al., Adv. em Pharmacol 33:91-141 (1995); Giannis et al., Adv. em Drug Res. 29:1-78 (1997). Certos miméticos que imitam a estrutura secundária são descritos em Johnson et al., em: Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al, Chapman e Hall (Eds.), NY, 1993. Estes métodos são usados para fazer peptidomiméticos que possuem pelo menos a capacidade de ligação e especificidade do polipeptídeo de Cav-1 nativo e, de preferência, também possuem a atividade biológica. Os conhecimentos de química de peptídeos e química orgânica geral disponível para os técnicos no assunto são suficientes, em vista da presente divulgação, para projetar e sintetizar tais compostos.

[00110] Por exemplo, tais peptidomiméticos podem ser identificados por inspeção da estrutura tridimensional de um polipeptídeo da invenção, seja livre ou ligado em complexo com um ligante (por exemplo, uPAR solúvel ou um fragmento do mesmo). Alternativamente, a estrutura de um polipeptídeo da invenção ligado ao seu ligante pode ser obtida pelas técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Um maior conhecimento da estereoquímica da interação do peptídeo com o seu ligante ou receptor irá permitir a concepção racional de tais agentes peptidomiméticos. A estrutura de um peptídeo ou polipeptídeo da invenção na ausência de ligante também pode proporcionar uma estrutura para a concepção de moléculas miméticas.

D. —PEGUILAÇÃO

[00111] Os peptídeos de Cav-1 podem ser conjugados com segmentos — polipeptídicos heterólogos ou polímeros, tais como polietilenoglicol. Os polipeptídeos podem ser ligados ao PEG para aumentar o raio hidrodinâmico da enzima e, portanto, aumentar a persistência em soro. Os polipeptídeos podem ser conjugados a qualquer agente de direcionamento, tal como um ligante tendo a capacidade de se ligar de forma específica e estável a um receptor externo (Publicação de Patente dos EUA de nº 2009/0304666).

[00112] Em certos aspectos, métodos e composições das modalidades estão relacionados à PEGuilação dos polipeptídeos divulgados. A PEGuilação é o processo de ligação covalente de cadeias de polímero de poli(etilenoglicol) a outra moléculay normalmente um medicamento ou proteína terapêutica. A PEGuilação é rotineiramente alcançada pela incubação de um derivado reativo de PEG com a macromolécula alvo. A ligação covalente de PEG a um medicamento ou proteína terapêutica pode "mascarar" o agente do sistema imunológico do hospedeiro (imunogenicidade e antigenicidade reduzidas) ou aumentar o tamanho hidrodinâmico (tamanho em solução) do agente, o que prolonga seu tempo circulatório reduzindo liberação. A PEGuilação também pode fornecer solubilidade em água para medicamentos e proteínas hidrofóbicas.

[00113] A primeira etapa da PEGuilação é a funcionalização adequada do polímero de PEG em um ou ambos os terminais. Os PEGs que são ativados em cada terminal com a mesma fração reativa são conhecidos como "homohbifuncionais", enquanto que, se os grupos funcionais presentes forem diferentes, então o derivado de PEG é referido como "heterobifuncional" ou "heterofuncional". Os derivados quimicamente ativos ou ativados do polímero de PEG são preparados para anexar o PEG à molécula desejada.

[00114] A escolha do grupo funcional adequado para o derivado de PEG é baseada no tipo de grupo reativo disponível na molécula que será acoplada ao PEG. Para as proteínas, os aminoácidos reativos típicos incluem lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina e tirosina. O grupo amino N-terminal e o ácido carboxílico C-terminal também podem ser usados.

[00115] As técnicas usadas para formar derivados de PEG de primeira geração geralmente fazem reagir o polímero de PEG com um grupo que é reativo com grupos hidroxila, normalmente anidridos, cloretos de ácido, cloroformatos e carbonatos. Na química de PEGuilação de segunda geração, grupos funcionais mais eficientes, tais como aldeído, ésteres, amidas, etc., são disponibilizados para conjugação.

[00116] À medida que as aplicações de PEGuilação se tornam cada vez mais avançadas e sofisticadas, tem havido um aumento na necessidade de PEGs heterobifuncionais para a conjugação. Esses PEGs heterobifuncionais são muito úteis na ligação de duas entidades, onde um espaçador hidrofílico, flexível e biocompatível é necessário. Os grupos finais preferidos para PEGs heterobifuncionais são maleimida, vinil sulfonas, dissulfeto de piridila, amina, ácidos carboxílicos e ésteres NHS.

[00117] Os agentes de modificação mais comuns, ou ligantes, são baseados em moléculas de metóxi-PEG (mPEG). Sua atividade depende da adição de um grupo modificador de proteína à extremidade de álcool. Em alguns casos, o polietilenoglicol (PEG diol) é usado como a molécula precursora. O diol é subsequentemente modificado em ambas as extremidades para fazer uma molécula ligada a PEG heterodimérica ou homodimérica.

[00118] As proteínas são geralmente PEGuiladas em locais nucleofílicos, tais como tióis não protonados (resíduos de cisteinila) ou grupos amino. Exemplos de reagentes de modificação específicos de cisteinila incluem PEG-maleimida, PEG-iodoacetato, PEG-tióis e PEG- vinilsulfona. Todos os quatro são fortemente específicos para cisteinila sob condições suaves e pH neutro a ligeiramente alcalino, mas cada um tem algumas desvantagens. O tioéter formado com as maleimidas pode ser um tanto instável sob condições alcalinas, portanto, pode haver alguma limitação às opções de formulação com este ligante. A ligação carbamotioato formada com PEGs de iodo é mais estável, mas o iodo livre pode modificar os resíduos de tirosina em algumas condições. Os PEG-tióis formam ligações dissulfeto com tióis de proteína, mas esta ligação também pode ser instável sob condições alcalinas. A reatividade do PEG- vinilsulfona é relativamente lenta em comparação com a maleimida e o iodo de PEG:; no entanto, a ligação tioéter formada é bastante estável. Sua taxa de reação mais lenta também pode tornar a reação PEG-vinilsulfona mais fácil de controlar.

[00119] A PEGuilação específica de local em resíduos de cisteinila nativos raramente é realizada, uma vez que esses resíduos estão geralmente na forma de ligações dissulfeto ou são necessários para a atividade biológica. Por outro lado, a mutagênese direcionada ao local pode ser usada para incorporar locais de PEGuilação de cisteinila para ligantes específicos de tiol. A mutação da cisteína deve ser projetada de tal modo que seja acessível ao reagente de PEGuilação e ainda seja biologicamente ativa após a PEGuilação.

[00120] Os agentes de modificação específicos de amina incluem PEG NHS éster, PEG tresilato, PEG aldeído, PEG isotiocianato e vários outros. Todos reagem sob condições moderadas e são muito específicos para grupos amino. O éster PEG NHS é provavelmente um dos agentes mais reativos; no entanto, sua alta reatividade pode tornar a reação de PEGuilação difícil de controlar em grande escala. O PEG aldeído forma uma imina com o grupo amino, que é então reduzida a uma amina secundária com cianoboro-hidreto de sódio. Ao contrário do boro-hidreto de sódio, o cianoboro-hidreto de sódio não reduz as ligações dissulfeto. No entanto, este produto químico é altamente tóxico e deve ser manuseado com cautela, especialmente em pH mais baixo, onde se torna volátil.

[00121] Devido aos múltiplos resíduos de lisina na maioria das proteínas, a PEGuilação específica de local pode ser um desafio. Felizmente, como esses reagentes reagem com grupos amino não protonados, é possível direcionar a PEGuilação para grupos amino de pK inferior realizando a reação em um pH mais baixo. Geralmente, a pK do grupo alfa-amino é 1-2 unidades de pH inferior ao grupo épsilon- amino dos resíduos de lisina. Ao PEGuilar a molécula em pH 7 ou inferior, alta seletividade para o N-terminal frequentemente pode ser alcançada. No entanto, isso só é viável se a porção N-terminal da proteína não for necessária para a atividade biológica. Ainda assim, os benefícios farmacocinéticos da PEGuilação frequentemente superam uma perda significativa de bioatividade in vitro, resultando em um produto com muito maior bioatividade in vivo, independentemente da química da PEGuilação.

[00122] Existem vários parâmetros a serem considerados ao desenvolver um procedimento de PEGuilação. Felizmente, geralmente não há mais do que quatro ou cinco parâmetros principais. A abordagem de "projeto de experimentos" para a otimização das condições de PEGuilação pode ser muito útil. Para reações de PEGuilação específicas de tiol, os parâmetros a serem considerados incluem: concentração de proteína, proporção de PEG para proteína (em uma base molar), temperatura, pH, tempo de reação e, em alguns casos, a exclusão de oxigênio. (O oxigênio pode contribuir para a formação de dissulfeto intermolecular pela proteína, o que reduzirá o rendimento do produto PEGuilado). Os mesmos fatores devem ser considerados (com exceção do oxigênio) para a modificação específica da amina, exceto que o pH pode ser ainda mais crítico, particularmente quando se direciona o grupo amino N-terminal.

[00123] Para modificações específicas de amina e tiol, as condições de reação podem afetar a estabilidade da proteína. Isso pode limitar a temperatura, a concentração de proteína e o pH. Além disso, a reatividade do ligante de PEG deve ser conhecida antes de iniciar a reação de PEGuilação. Por exemplo, se o agente de PEGuilação é somente 70 por cento ativo, a quantidade de PEG usada deve garantir que somente as moléculas de PEG ativas sejam contadas na estequiometria da reação de proteína para PEG.

E. — PROTEÍNAS DE FUSÃO

[00124] Certas modalidades da presente invenção referem-se a proteínas de fusão dos peptídeos de Cav-1. Estas moléculas podem ter os polipeptídeos das modalidades ligados no N- ou C-terminal a um domínio heterólogo. Por exemplo, as fusões também podem empregar sequências líder de outras espécies para permitir a expressão recombinante de uma proteína em um hospedeiro heterólogo. As proteínas de fusão podem compreender um extensor de meia-vida. Outra fusão útil inclui a adição de uma etiqueta de afinidade de proteína, tal como uma etiqueta de afinidade de albumina sérica ou seis resíduos de histidina, ou um domínio imunologicamente — ativo, tal como um epítopo de anticorpo,

preferencialmente clivável, para facilitar a purificação da proteína de fusão. Os marcadores de afinidade não limitantes incluem poli-histidina, proteína de ligação à quitina (CBP), proteína de ligação à maltose (MBP) e glutationa-S-transferase (GST).

[00125] Em uma modalidade particular, o peptídeo das modalidades pode estar ligado a um peptídeo que aumenta a meia-vida in vivo, tal como um polipeptídeo XTEN (Schellenberger et a/., 2009), domínio Fc de IgG, albumina ou peptídeo de ligação à albumina.

[00126] Os métodos para de gerar proteínas de fusão são bem conhecidos por aqueles técnicos no assunto. Tais proteínas podem ser produzidas, por exemplo, por síntese de novo da proteína de fusão completa, ou por ligação da sequência de DNA que codifica o domínio heterólogo, seguida pela expressão da proteína de fusão intacta.

[00127] A produção de proteínas de fusão que recuperam as atividades funcionais das proteínas parentais pode ser facilitada pela conexão de genes com um segmento de DNA em ponte que codifica um ligante de peptídeo que é dividido entre os polipeptídeos conectados em tandem. O ligante teria comprimento suficiente para permitir o dobramento apropriado da proteína de fusão resultante.

2. —LIGANTES

[00128] Em certas modalidades, o polipeptídeo das modalidades pode ser conjugado quimicamente usando reagentes de reticulação bifuncionais ou fundido no nível da proteína com ligantes peptídicos.

[00129] Os reagentes de reticulação bifuncional têm sido amplamente utilizados para uma variedade de finalidades, incluindo a preparação de matrizes de afinidade, modificação e estabilização de diversas estruturas, identificação de ligantes e locais de ligação do receptor e estudos estruturais. Os ligantes peptídicos adequados também podem ser usados para ligar o polipeptídeo das modalidades, como os ligantes Gly- Ser.

[00130] Reagentes homobifuncionais que carregam dois grupos funcionais idênticos provaram ser altamente eficientes na indução de reticulação entre macromoléculas idênticas e diferentes ou subunidades de uma macromolécula e ligação de ligantes polipeptídicos aos seus locais de ligação específicos. Os reagentes heterobifuncionais contêm dois grupos funcionais diferentes. Ao tirar vantagem das reatividades diferenciais dos dois grupos funcionais diferentes, a reticulação pode ser controlada seletivamente e sequencialmente. Os reagentes de reticulação bifuncionais podem ser divididos de acordo com a especificidade de seus grupos funcionais, por exemplo, grupos específicos de amino-, sulfidril-, guanidina-, indol-, carboxila-. Destes, os reagentes direcionados aos grupos amino livres tornaram-se especialmente populares devido à sua disponibilidade comercial, facilidade de síntese e as condições de reação moderadas sob as quais podem ser aplicadas.

[00131] A maioria dos reagentes de reticulação heterobifuncional contém um grupo reativo com amina primária e um grupo reativo com tiol. Em outro exemplo, reagentes de reticulação heterobifuncional e métodos de uso dos reagentes de reticulação são descritos (Patente dos EUA nº

5.889.155, especificamente incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Os reagentes de reticulação combinam um resíduo de hidrazida nucleofílica com um resíduo de maleimida eletrofílica, permitindo o acoplamento, em um exemplo, de aldeídos a tióis livres. O reagente de reticulação pode ser modificado para reticular vários grupos funcionais.

[00132] Além — disso, quaisquer outros agentes de ligação/acoplamento e/ou mecanismos conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser usados para combinar polipeptídeos das modalidades, tais como, por exemplo, interação anticorpo-antígeno, ligações avidina biotina, ligações amida, ligações éster, ligações tioéster, ligações éter, ligações tioéter, ligações fosfoéster, ligações fosforamida, ligações anidrido,

ligações —dissulfeto, interações iônicas e hidrofóbicas, anticorpos biespecíficos e fragmentos de anticorpos ou combinações dos mesmos.

[00133] É preferido que seja utilizado um reticulador com estabilidade razoável no sangue. Numerosos tipos de ligantes contendo ligações dissulfeto são conhecidos por poderem ser empregados com Sucesso para conjugar o direcionamento e agentes terapêuticos/preventivos. Os ligantes que contêm uma ligação dissulfureto que é dificultada estericamente podem provar que fornecem mais estabilidade in vivo. Esses ligantes são, portanto, um grupo de agentes de ligação.

[00134] Além de reticuladores dificultados, os ligantes não dificultados também podem ser empregados de acordo com o presente documento. Outros reticuladores úteis, não considerados como contendo ou gerando um dissulfeto protegido, incluem SATA, SPDP e 2-iminotiolano (Wawrzynczak e Thorpe, 1987). O uso de tais reticuladores é bem compreendido na técnica. Outra modalidade envolve o uso de ligantes flexíveis.

[00135] Uma vez conjugado quimicamente, o peptídeo geralmente será purificado para separar o conjugado de agentes não conjugados e de outros contaminantes. Um grande número de técnicas de purificação estão disponíveis para uso no fornecimento de conjugados com um grau de pureza suficiente para torná-los clinicamente úteis.

[00136] Métodos de purificação baseados na separação de tamanhos, tais como filtração em gel, permeação em gel ou cromatografia líquida de alta eficiência, geralmente serão mais úteis. Outras técnicas cromatográficas, como separação de Blue-Sepharose, também podem ser usadas. Os métodos convencionais para purificar as proteínas de fusão de corpos de inclusão podem ser úteis, tais como o uso de detergentes fracos, como N-lauroil-sarcosina de sódio (SLS).

3. —“PEPTÍDEOS DE PENETRAÇÃO CELULAR E DE

TRANSLOCAÇÃO DE MEMBRANA

[00137] Além disso, em certos aspectos, os peptídeos de Cav-1 podem compreender ainda um domínio de ligação celular ou peptídeo de penetração celular (CPP). Conforme utilizado neste documento, os termos "peptídeo de penetração celular" e "domínio de translocação de membrana" são usados indistintamente e referem-se a segmentos de sequência polipeptídica que permitem que um polipeptídeo atravesse a membrana celular (por exemplo, a membrana plasmática no caso de uma célula eucariótica). Exemplos de segmentos de CPP incluem, mas não estão limitados a, segmentos derivados de HIV Tat (por exemplo, GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 23)), vírus do herpes VP22, o produto do gene homeobox Drosophila Antennapedia, protegrina |, Penetratina (RQIKIWFONRRMKWKK(SEQ ID NO: 24)) ou melitina (GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKROQ (SEQ ID NO: 25)). Em certos aspectos, o CPP compreende o T1 (TKIESLKEHG (SEQ ID NO: 26)), T2 (TQIENLKEKG (SEQ ID NO: 27)), 26 (AALEALAEALEALAEALEALAEAAAA (SEQ ID NO: 28)) ou INF7 (GLFEAIEGFIENGWEGMIEGWYGCG (SEQ ID NO: 29)) Sequência CPP.

Il. — MÉTODOS DE USO

[00138] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso de peptídeos descritos neste documento e mutantes, variantes, análogos ou derivados dos mesmos. Especificamente, esses métodos se referem à administração de qualquer um dos peptídeos descritos neste documento ou às suas modificações farmaceuticamente aceitáveis como um pó seco a um indivíduo, uma composição para uso no tratamento de tratar ou prevenir uma doença, lesão ou infecção dos pulmões (por exemplo., uma condição fibrótica dos pulmões), a referida composição compreendendo um polipeptídeo das modalidades em um transportador farmaceuticamente aceitável.

A. — COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00139] É contemplado que os peptídeos de Cav-1 fornecidos neste documento podem ser administrados sistemicamente ou localmente para inibir a apoptose celular e para o tratamento e prevenção de danos aos tecidos pulmonares. Eles podem ser administrados por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intratecal e/ou intraperitoneal. Por exemplo, uma formulação de pó seco pode ser administrada por instalação em um indivíduo (por exemplo, instalação subcutânea) ou pode ser reconstituída em um líquido antes da injeção. Em aspectos particulares, os peptídeos são entregues localmente às vias aéreas, como a administração de uma formulação de pó seco usando um inalador de pó seco. Eles podem ser administrados sozinhos ou em combinação com compostos antifibróticos.

[00140] O pó seco do peptídeo de Cav-1 pode ser administrado em combinação, simultaneamente ou sequencialmente com pelo menos um agente terapêutico adicional (por exemplo, um agente terapêutico para o tratamento de fibrose pulmonar). O terapêutico adicional pode ser um AINE, esteróide, DMARD, imunossupressor, moduladores de resposta biológica, broncodilatador ou agente antifibrótico, como pirfenedona, um agente cujo mecanismo de ação antifibrótico não é totalmente compreendido, mas pode envolver o bloqueio de TGF-beta, nintedanibe, um amplo bloqueador de tirosina quinase ou qualquer outro agente antifibrótico. AINEs adequados são selecionados a partir dos inibidores de COX de ácido acetilsalicílico não seletivos, mesalazina, ibuprofeno, naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, indoprofeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno, ácido tiaprofênico, fluprofeno, indometacina, sulindac, tolmetina, zomepirac, nabumetona, diclofenac, fenclofenac, alclofenac, bromfenac, ibufenac, aceclofenac, acemetacina, fentiazac, clidanac, etodolac, oxpinac, ácido mefenâmico, ácido meclofenâmico, ácido flufenâmico, ácido nifluminíico, ácido tolfenâmico, diflunisal, flufenisal, piroxicam, tenoxicam, lornoxicam e nimesulida e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, os inibidores seletivos de COX 2,meloxicam, celecoxib e rofecoxib e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Os esteróides adequados são prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, budenósido, fluocortolona e triancinolona. DMARDs adequados são sulfassalazina, olsalazina, cloroquina, derivados de ouro (Auranofin), D-penicilamina e citostáticos, tais como metotrexato e ciclofosfamida. Os imunsupressores adequados são a ciclospoihna A e derivados dos mesmos, micofenolatemofetila, FK 506, OKT-3, ATG, 15-desoxyspergualina, mizoribina, — misoprostol, — rapamicina, — reflunomida e azatioprina. Modificadores de resposta biológica adequados são interferon B, anti-TNF-a (Etanercept), IL-10, ant-cCD3 ou anti-CD25. Os broncodilatadores adequados são brometo de ipratrópio, brometo de oxitrópio, brometo de tiotrópio, —cloridrdato de epinefrinay salbutamol, terbutalinsulfato, fenoterolhidrobrometo, salmeterol e formoterol. Em tais combinações, cada ingrediente ativo pode ser administrado (por exemplo, oralmente ou por inalação) de acordo com sua faixa de dosagem usual ou uma dose abaixo de sua faixa de dosagem usual. A dosagem para os AINEs combinados, esteróides, DMARDs, imunsupressores e modificadores de resposta biológica é apropriadamente 1/50 da dose mais baixa normalmente recomendada até 1/1 da dosagem normalmente recomendada, de preferência 1/20 a 1/2 e mais preferencialmente 1/10 a 1/5. A dose normalmente recomendada para o medicamento combinado deve ser entendida como sendo a dose divulgada, por exemplo, em Rote ListeG&G 2002, Editio Cantor Verlag Aulendorf, Alemanha, ou em Physician's Desk Reference.

[00141] Quando as aplicações clínicas são contempladas, pode ser necessário preparar composições farmacêuticas compreendendo proteínas, anticorpos e medicamentos em uma forma apropriada para a aplicação pretendida. Geralmente, as composições farmacêuticas podem compreender uma quantidade eficaz de um ou mais dos polipeptídeos das modalidades ou agentes adicionais dissolvidos ou dispersos em um transportador farmaceuticamente aceitável. As frases "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa quando administradas a um animal, tal como, por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contém pelo menos um polipeptídeo das modalidades pelo método divulgado neste documento, ou ingrediente ativo adicional, será conhecida pelos técnicos no assunto à luz da presente divulgação, conforme exemplificado por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed., 1990, incorporado no presente documento por referência. Além disso, para administração em animais (por exemplo, humanos), será entendido que as preparações devem atender aos padrões de biocarga, esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e/ou pureza, conforme exigido pela FDA Office of Biological Standards ou outra autoridade regulatória apropriada.

[00142] Certas modalidades da presente invenção podem compreender diferentes tipos de transportadores, dependendo se é para ser administrado na forma sólida, líquida ou aerossol, e se precisa ser estéril para a via de administração, tal como injeção. As composições podem ser administradas por via intravenosa, intratecal, intradérmica, transdérmica, —intratecal, intra-arterial, —intraperitoneal, — intranasal, intravaginal, intrarretal, intramuscular, subcutânea, mucosa, oral, tópica, local, por inalação (por exemplo, inalação de fórmula de nebulização), por injeção, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada, banhando as células alvo diretamente, por meio de um cateter, por meio de uma lavagem, em composições lipídicas (por exemplo, lipossomas), ou por outros métodos ou qualquer combinação dos anteriores, como seria conhecido por um técnico no assunto (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed., 1990, incorporado neste documento por referência). A escolha do volume de injeção e do tamanho da agulha pode ser escolhida pelo técnico no assunto com base no local da injeção, seringabilidade e injetabilidade, o que inclui considerar a viscosidade da solução ou suspensão a ser injetada e a concentração do medicamento, pH e osmolalidade. Em alguns casos, o tamanho de partícula do agente ativo pode ser escolhido a fim de fornecer uma taxa de dissolução desejada após a administração (por exemplo, por injeção subcutânea).

[00143] Os peptídeos apresentados neste documento podem ser formulados em uma composição em uma base livre, neutra, zwitterion ou em forma de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como o ácido acético, oxálico, tartárico ou mandélico. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico; ou tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Após a formulação, as soluções serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como formuladas para administração parenteral, tais como soluções injetáveis ou aerossóis para distribuição aos pulmões, ou formuladas para administrações alimentares, tais como cápsulas de liberação de medicamentos e similares.

[00144] Além disso, de acordo com certos aspectos da presente invenção, a composição adequada para administração pode ser fornecida em um transportador farmaceuticamente aceitável com ou sem um diluente inerte. O transportador pode compreender, em alguns aspectos, aerossol, gás, líquido, semissólido, isto é, pastas, ou transportadores sólidos. Exceto na medida em que qualquer meio, agente, diluente ou transportador convencional seja prejudicial para o receptor ou para a eficácia terapêutica de uma composição contida no mesmo, seu uso em composição administrável para uso na prática dos métodos é apropriado. Exemplos de transportadores ou diluentes incluem gorduras, óleos, água, soluções salinas, lipídios, lipossomas, resinas, aglutinantes, enchimentos e similares, ou combinações dos mesmos. A composição também pode compreender vários antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Além disso, a prevenção da ação de microrganismos pode ser realizada por conservantes, tais como vários agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, mas não se limitando a, parabenos (por exemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal ou combinações dos mesmos.

[00145] De acordo com certos aspectos da presente invenção, a composição é combinada com o transportador de qualquer maneira conveniente e prática, ou seja, por solução, suspensão, emulsificação, mistura, encapsulação, absorção e similares. Tais procedimentos são de rotina para os técnicos no assunto.

[00146] Em uma modalidade específica da presente invenção, a composição é combinada ou completamente misturada com um transportador semissólido ou sólido. A mistura pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, tal como moagem. Agentes estabilizantes também podem ser adicionados no processo de mistura para proteger a composição da perda de atividade terapêutica, ou seja, desnaturação no estômago. Exemplos de estabilizantes para uso em uma composição incluem tampões, aminoácidos, tais como glicina e lisina, carboidratos ou lioprotetores, tais como dextrose, manose, galactose, frutose, lactose, sacarose, maltose, sorbitol, manitol, etc.

[00147] Em alguns aspectos, uma formulação farmacêutica compreende um ou mais surfactantes. Os surfactantes usados de acordo com os métodos divulgados incluem surfactantes iônicos e não iônicos. Os surfactantes não iônicos representativos incluem polissorbatos como os surfactantes TWEENG-20 e TWEEN-806 (ICI Americas Inc. de Bridgewater, NJ); poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); surfactantes TRITONGO (Sigma de St. Louis, Mo.); dodecilsulfato de sódio (SDS); lauril sulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil- sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil- sarcosina; linoleil, miristilt ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palnidopropil-, ou (por exemplo, lauroamidopropila); miristamidopropil-, palmidopropil- ou isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil- de sódio, ou metil oleil- taurato de sódio; Surfactantes MONAQUAT '“ (Mona Industries Inc. de Paterson, NJ); polietilglicol; polipropilglicol; copolímeros de bloco de etileno e propilenoglicol, tais como surfactantes PLURONICO (BASF de Mt. Olive, NJ); éteres alquílicos de oligo (óxido de etileno); alquil (tio) glucosídeos, alquil maltosidos; e fosfolípidos. Por exemplo, o surfactante pode estar presente em uma formulação em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 5% (peso do surfactante em relação ao peso total de outros componentes sólidos da formulação; "p/p"), de cerca de 0,03% a cerca de 0,5% (p/p), de cerca de 0,05% a cerca de 0,5% (p/p), ou de cerca de 0,1% a cerca de 0,5% (p/p). No entanto, em outros aspectos, uma formulação farmacêutica das modalidades é essencialmente livre de surfactantes não iônicos ou essencialmente livre de todos os surfactantes.

[00148] No que diz respeito aos métodos terapêuticos da invenção, não se pretende que a administração de um ou mais peptídeos divulgados neste documento ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo e seja limitada a um modo particular de administração, dosagem ou frequência de dosagem; a presente invenção contempla todos os modos de administração, incluindo intramuscular, intravenoso, intraperitoneal, intravesicular, intra-articular, intralesional, subcutâneo ou qualquer outra via suficiente para fornecer uma dose adequada para tratar o distúrbio relacionado à inflamação. O agente terapêutico pode ser administrado ao paciente em uma dose única ou em doses múltiplas. Quando doses múltiplas são administradas, as doses podem ser separadas umas das outras por, por exemplo, uma hora, três horas, seis horas, oito horas, um dia, dois dias, uma semana, duas semanas ou um mês. Por exemplo, o agente terapêutico pode ser administrado por, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 10, 15, 20 ou mais semanas. Deve ser entendido que, para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições. Por exemplo, a dosagem do agente terapêutico pode ser aumentada se a dose mais baixa não fornecer atividade terapêutica suficiente.

[00149] Embora o médico assistente, em última análise, decida a quantidade e o regime de dosagem apropriados, as quantidades terapeuticamente eficazes de um ou mais polipeptídeos, conforme divulgado neste documento ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo, podem ser fornecidos em uma dose de 0,0001, 0,01, 0,01 0,1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500 ou 1.000 mg/kg ou g/kg. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de bioensaios ou sistemas de teste de modelo animal ou in vitro.

[00150] As dosagens para um determinado paciente ou indivíduo podem ser determinadas por um técnico no assunto usando considerações convencionais (por exemplo, por meio de um protocolo farmacológico convencional apropriado). Um médico pode, por exemplo, prescrever uma dose relativamente baixa no início, aumentando subsequentemente a dose até que uma resposta apropriada seja obtida. A dose administrada a um paciente é suficiente para afetar uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo, ou, por exemplo, para reduzir os sintomas ou outra atividade apropriada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia da formulação particular e pela atividade, estabilidade ou meia-vida sérica de um ou mais polipeptídeos, conforme divulgado neste documento ou um mutante, variante, análogo ou derivado do mesmo e a condição do paciente, também como o peso corporal ou área de superfície do paciente a ser tratado.

[00151] Em alguns aspectos, um indivíduo recebe uma dose única, dada uma vez por dia para o tratamento de um indivíduo, de preferência um mamífero, mais preferencialmente humano que sofre de ou é suscetível a fibrose pulmonar resultante, que está entre cerca de 0,2 mg/kg e cerca de 250 mg/kg, tal como entre cerca de 10 mg/kg e cerca de 50 mg/kg, por exemplo, por instilação (por inalação). Essa dose pode ser administrada diariamente durante cerca de 3 dias a uma ou mais semanas.

[00152] A administração crônica também é possível, embora a dose possa precisar ser ajustada para baixo, como é bem compreendido na técnica. Os intervalos anteriores são, no entanto, sugestivos, uma vez que o número de variáveis em um regime de tratamento individual é grande e são esperadas excursões consideráveis a partir desses valores preferidos.

[00153] Para administração contínua, por exemplo, por um sistema de bomba, tal como uma bomba osmótica que foi usada em alguns dos experimentos descritos abaixo, uma dosagem total para um curso de tempo de cerca de 1-2 semanas está preferencialmente na faixa de 1 mg/kg a 1 g/Kkg, preferencialmente 20-300 mg/kg, mais preferencialmente 50-200 mg/kg. Após tal regime de dosagem contínua, a concentração total do composto ativo está de preferência na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 50 UM, de preferência cerca de 1 a cerca de 10 uM.

[00154] Uma concentração eficaz do composto ativo para inibir ou prevenir a apoptose in vitro está na faixa de cerca de 0,5 nM a cerca de 100 nM, mais preferencialmente de cerca de 2 nM a cerca de 20 nM. As doses eficazes e os intervalos de dose ideais podem ser determinados in vitro usando os métodos descritos neste documento.

B. “DISPOSITIVOS DE REDUÇÃO DO TAMANHO DE PARTÍCULA DE PÓ SECO E DE INALAÇÃO DE PÓ SECO.

[00155] Os tamanhos de partícula das formulações podem ser reduzidos por qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitando a moagem, preensão, congelamento de película fina, secagem por pulverização ou trituração. A moagem pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, tal como moinho a jato de ar, moinho de bolas, moinho úmido, moinho de meio, homogeneização de alta pressão ou moinho criogênico.

[00156] A estabilidade do peptídeo após a redução do tamanho de partícula pode ser avaliada usando técnicas conhecidas na técnica, incluindo cromatografia de exclusão de tamanho; técnicas eletroforéticas; HPLC; espectrometria de massa; técnicas espectroscópicas, como espectroscopia de UV e espectroscopia de dicroísmo circular, e atividade (medida in vitro ou in vivo). Para realizar ensaios in vitro de estabilidade de proteína, uma composição de aerossol pode ser coletada e, em seguida, destilada ou absorvida em um filtro. Para realizar ensaios in vivo, ou para administração pulmonar de uma composição a um indivíduo, um dispositivo para dispersão de pó seco é adaptado para inalação pelo indivíduo. Por exemplo, a estabilidade da proteína pode ser avaliada determinando o nível de agregação da proteína. De preferência, uma composição de pó seco da invenção é substancialmente livre de agregados de proteína. A presença de agregados solúveis pode ser determinada qualitativamente usando espalhamento dinâmico de luz (DLS) (DynaPro-801TC, Protein Solutions Inc. de Charlottesville, Va.) e/ou por espectrofotometria UV.

[00157] Em algumas modalidades, o tratamento de um paciente com CSP7 moído pode compreender a liberação de medicamento modulado. Em algumas modalidades, o CS7 moído pode ser formulado para liberação lenta ou retardada. Em algumas modalidades, o CSP7 moído pode ser formulado para liberação rápida. Em outras modalidades, o

CSP7 moído pode ser formulado para liberação lenta e rápida (ou seja, perfil de liberação dupla).

[00158] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para a administração da composição CSP7 inalável fornecida neste documento. A administração pode ser, mas não está limitada, à inalação de CSP7 moído usando um inalador. Em algumas modalidades, um inalador é um inalador de pó seco passivo (DPI), como um DPI monodose Plastiape RSOI. Em um inalador de pó seco, o pó seco é armazenado em um reservatório e é entregue aos pulmões por inalação, sem o uso de propelentes.

[00159] Em algumas modalidades, um inalador é um DPI de dose única, como um DoseOne'“, Spinhaler, RotohalerO, Aerolizerê ou Handihaler. Em algumas modalidades, um inalador é um DPI multidose, como Plastiape RS02, TurbuhalerO, Twisthaler"Y, Diskhaler&, Diskus& ou Ellipta'”. Em algumas modalidades, um inalador é um DPI de plurimonodose para a distribuição simultânea de doses únicas de vários medicamentos, como um DPI de plurimonodose Plastiape RS04. Normalmente, os inaladores de pó seco têm a medicação armazenada em um reservatório interno e a medicação é fornecida por inalação com ou sem o uso de propelentes. Outros tipos de inaladores de pó seco têm medicação em doses pré-divididas armazenadas em uma cápsula (por exemplo, celulose ou base de gelatina) ou bolsa de alumínio, cada uma das quais perfurada pelo dispositivo para liberar a dose para o paciente. Os inaladores de pó seco podem exigir uma taxa de fluxo inspiratório superior a 30 L/min para uma distribuição eficaz, como entre cerca de 30-120 L/min. Em algumas modalidades, a aerossolização eficiente de CSP7 moído é independente da força inspiratória. Em algumas modalidades, o inalador de pó seco tem uma resistência de fluxo entre 0,01 kPaºSmin/L e 0,05 kPaº*Smin/L, tal como entre 0,02 kPaºSmin/L e 0,04 kPaºSmin/L. O inalador de pó seco (por exemplo, alta resistência, baixa resistência, passivo, ativo)

é escolhido com base na população de pacientes e em suas capacidades inspiratórias.

[00160] Em algumas modalidades, o inalador pode ser um inalador de dose medida. Os inaladores de dose medida entregam uma quantidade definida de medicamento aos pulmões em um curto jato de medicamento em aerossol auxiliado pelo uso de propelentes. Os inaladores de dose medida compreendem três partes principais: um recipiente, uma válvula de dosagem e um atuador e podem utilizar um dispositivo espaçador para desacelerar as partículas emitidas e facilitar a inalação da nuvem aerossolizada pelo paciente. A formulação do medicamento, incluindo propelentes e quaisquer excipientes necessários, é armazenada no recipiente. A válvula de dosagem permite dispensar uma quantidade definida da formulação do medicamento. O atuador do inalador de dose medida, ou bocal, contém o bocal de descarga correspondente e normalmente inclui uma tampa contra poeira para evitar contaminação. À taxa de fluxo inspiratória necessária para o uso de um inalador de dose medida pode ser inferior a 90 L/min, tal como entre cerca de 15-90 L/min, preferencialmente cerca de 30 L/imin'n Em algumas modalidades, a aerossolização eficiente de CSP7 moído é independente da força inspiratória.

[00161] Em algumas modalidades, um inalador é um nebulizador. Um nebulizador é usado para fornecer medicamentos na forma de uma névoa aerossol inalada para os pulmões. A formulação do medicamento é aerossolizada por gás comprimido ou por ondas ultrassônicas. Um nebulizador a jato é conectado a um compressor. O compressor emite gás comprimido por meio de uma formulação de medicamento líquido em alta velocidade, fazendo com que a formulação de medicamento seja aerossolizada. A medicação em aerossol é então inalada pelo paciente. Um nebulizador de onda ultrassônica gera uma onda ultrassônica de alta frequência, causando a vibração de um elemento interno em contato com um reservatório de líquido da formulação do medicamento, o que causa a aerossolização da formulação do medicamento. A medicação em aerossol é então inalada pelo paciente. Um nebulizador pode utilizar uma taxa de fluxo entre cerca de 3-12 L/min, tal como cerca de 6 L/imin. Em alguns exemplos, o ativo moído (por exemplo, CSP7) pode ser suspenso em um veículo transportador líquido farmaceuticamente aceitável e administrado por nebulização (por exemplo, nebulização por jato de ar). Em outros aspectos, uma composição das modalidades pode ser administrada por um método de vaporização (por exemplo, vaporização rápida), como por um dispositivo de cigarro eletrônico.

[00162] Em algumas modalidades, a composição pode ser administrada em um cronograma de rotina. Conforme usado neste documento, um cronograma de rotina se refere a um período de tempo designado predeterminado. A programação de rotina pode abranger períodos de tempo idênticos ou de duração diferente, desde que a programação seja predeterminada. Por exemplo, o cronograma de rotina pode envolver a administração duas vezes ao dia, todos os dias, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, semanalmente, mensalmente ou em qualquer número de dias ou semanas depois disso. Alternativamente, o programa de rotina predeterminado pode envolver a administração duas vezes ao dia durante a primeira semana, seguida por uma base diária durante vários meses, etc. Em algumas modalidades, um peptídeo (porexemplo, CSP7) é administrado uma vez por dia. Em modalidades preferidas, um peptídeo é administrado menos de uma vez por dia, como em dias alternados, a cada três dias ou uma vez por semana. Em algumas modalidades, uma dose completa de um peptídeo das modalidades (por exemplo, CSP7) está entre 1-100 mg, tal como 20-100, 50-100, 10-20, 20-40, 50-70 ou 80-90 mg.

[00163] Em algumas modalidades, um peptídeo das modalidades (por exemplo, CSP7) pode ser fornecido em uma forma de dosagem unitária (por exemplo, dose pré-dividida), tal como em uma cápsula, blister ou cartucho, em que a dose unitária compreende em pelo menos 1 mg de um peptídeo, como pelo menos 5 mg, 10 mg, 15 mg ou 20 mg de um peptídeo das modalidades (por exemplo, CSP7) por dose. Em alguns aspectos, a dose unitária é de 1-10 mg (por exemplo, cerca de 5 mg) de um peptídeo. Em aspectos particulares, a forma de dosagem unitária não compreende a administração ou adição de qualquer excipiente e é apenas usada para conter o pó para inalação (isto é, a cápsula, blister ou cartucho não é administrada). Em alguns aspectos, mais de uma das formas de dosagem unitária é administrada a um indivíduo. Por exemplo, no caso de um inalador de pó seco, os peptídeos das modalidades podem ser fornecidos em cápsulas de dose unitária e mais de uma cápsula de dose unitária (por exemplo, 3-4) podem ser administradas a um indivíduo por inalação. Em algumas modalidades, os peptídeos como CSP7 podem ser administrados em uma alta dose emitida, como pelo menos 10 mg, preferencialmente pelo menos 15 mg, ainda mais preferencialmente 20 mg. Em algumas modalidades, a administração de um peptídeo moído das modalidades (por exemplo, CSP7) resulta em uma alta dose de partículas finas no pulmão profundo, como superior a 5 mg. De preferência, a dose de partículas finas para o pulmão profundo é de pelo menos 10 mg, ainda mais preferencialmente de pelo menos 15 mg. Em alguns aspectos, a dose de partícula é produzida a partir de 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais cápsulas compreendendo doses de um peptídeo das modalidades (por exemplo, CSP7). Em alguns aspectos, a dose de partícula fina é de pelo menos 50%, tal como pelo menos 60, 65, 70, 75 ou 80% da dose emitida.

[00164] Em algumas modalidades, as mudanças na queda de pressão de inalação resultam em uma mudança na dose emitida. Em algumas modalidades, as mudanças na pressão de inalação de 3 kPa, como de 4 kPa a 1 kPa, resultam em uma redução da dose emitida de menos de 25%, como 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%,

15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% ou menos. Em algumas modalidades, as mudanças na pressão de inalação resultam em uma mudança na dose de partículas finas. Em algumas modalidades, as mudanças na pressão de inalação de 3 kPa, como de 4kPa a 1 kPa, resultam em uma redução da dose de partículas finas de menos de 15%, como 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% ou menos.

IV. — CONDIÇÕES PULMONARES PARA TRATAMENTO

[00165] Os peptídeos da presente invenção podem ser usados para tratar uma variedade de condições pulmonares. As condições pulmonares para tratamento podem ser agudas ou crônicas. As condições pulmonares agudas podem ser lesão pulmonar aguda, infecção ou indução química. Condições pulmonares crônicas podem ser o resultado de lesão, infecção ou doença.

A. “LESÕES PULMONARES

[00166] Em alguns aspectos, o indivíduo tem uma lesão pulmonar aguda (ALI) ou infecção ou uma lesão pulmonar induzida por produtos químicos. Em aspectos específicos, o indivíduo tem bronquite plástica, asma, via aérea/pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), lesão pulmonar aguda induzida por fumaça inalatória (ISALI), bronquiectasia, doença das vias aéreas induzida por toxina inalatória (por exemplo, cloro ou outra doença induzida das vias aéreas), exposição ao gás mostarda, exposição a partículas (por exemplo, pó de sílica), bronquiolite obliterante, bronquiolite obliterante, pneumonia em organização, colágeno vascular pulmonar (por exemplo, lúpus, esclerodermia ou doença mista do tecido conjuntivo), intersticial doença pulmonar (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática ou sarcoidose), doença pulmonar induzida por medicamentos e fibrose pulmonar acelerada (por exemplo, que ocorre após lesão pulmonar aguda, incluindo SDRA). As doenças pulmonares, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, infecções, bem como lesões pulmonares agudas e crônicas que levam à fibrose, constituem a terceira principal causa de morte em todo o mundo (Murray et al., 1997; Rabe et al., 2007; Tsushima et al., 2009). A lesão pulmonar aguda (ALI) é um problema médico sério entre os militares americanos. ALI durante o combate pode ser resultado de etiologias muito amplas.

[00167] A ALI de lesão inalatória tem sido tratada com anticoagulantes inalatórios, esteroides, beta-agonistas, ventilação de alta frequência e oxigenação por membrana extracorpórea, com resultados variáveis e, em geral, subótimos. Nenhuma medida preventiva eficaz está disponível além de barreiras com máscaras respiratórias. O tratamento da SDRA progrediu significativamente, mas permanece amplamente favorável, com uma espera vigilante para que os mecanismos de cura endógena entrem em vigor; e a mortalidade hospitalar permanece acima de 40% (Matthay et al., 2012). Os sobreviventes de ALI frequentemente sofrem de deficiência respiratória crônica com redução da qualidade de vida. Quaisquer modalidades que possam acelerar a recuperação e/ou prevenir complicações posteriores, como insuficiência respiratória crônica e fibrose pulmonar, serão altamente desejáveis. Há uma necessidade urgente de melhorar o diagnóstico precoce e, muito mais importante, a prevenção e a terapia de ALI. A fisiopatologia da ALI por lesão pulmonar inalatória direta ou SDRA consequente da doença sistêmica é extremamente complexa e heterogênea, abrangendo fatores cardiopulmonares sistêmicos e locais, como aumento da permeabilidade da membrana, influxo de citocinas inflamatórias, “dano celular oxidativo, deslocamento de fluido compartimental, íon desorganizado canais e muitos outros (Matthay et al., 2012). Claramente, novos tratamentos são necessários para tratar e prevenir distúrbios pulmonares, como ALI.

[00168] Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de lesão pulmonar aguda, infecção pulmonar ou doença pulmonar em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de FTTFTVT (SEQ ID NO: 2) ou uma variante do mesmo, em que o peptídeo mantém a atividade biológica da caveolina-1 (Cav-1). Em alguns aspectos, um método de administração de uma formulação farmacêutica dos peptídeos compreende a inalação de pó seco. Em aspectos particulares, o indivíduo é um humano.

B. — DOENÇAS PULMONARES

[00169] As doenças pulmonares incluem fibrose pulmonar, inflamação pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), bronquite, bronquiolite, bronquiolite obliterante, asma e infecções pulmonares, bem como lesão pulmonar aguda e crônica que leva à fibrose (Murray et al., 1997; Rabe et al., 2007; Tsushima et al/., 2009). Essas doenças constituem a terceira causa de morte em todo o mundo.

[00170] A fibrose cística é uma doença hereditária das glândulas exócrinas e das glândulas sudoríparas exócrinas que afeta principalmente os sistemas digestivo e respiratório. Esta doença geralmente é caracterizada por infecções respiratórias crônicas, insuficiência pancreática, secreções mucosas anormalmente viscosas e morte prematura. A fibrose cística (CF) é caracterizada por obstrução progressiva ao fluxo de ar. Subconjuntos de indivíduos com CF também desenvolvem hiper- responsividade das vias aéreas a agonistas colinérgicos inalados (Weinberger, 2002 e Mitchell et a/., 1978) e reversibilidade da limitação do fluxo de ar em resposta a broncodilatadores (van Haren et a/., 1991 e van Haren et al, 1992). A presença de hiper-responsividade brônquica e obstrução das vias aéreas sugere uma possível etiologia compartilhada da doença entre a CF e outras doenças de estreitamento das vias aéreas, como asma ou doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), em que se acredita que a disfunção do músculo liso das vias aéreas contribui para os processos de doença.

[00171] Uma infecção pulmonar pode ser uma infecção bacteriana. As bactérias infecciosas podem ser Pseudomonas aeruginosa, Bacillus anthracis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmenellosis, Yersina pestis, Mycobacterium leprae, M. africanum, M. asiaticum, M. aviuin-intracellulaire, M. chelonei abscessus, M. fallax, M. fortuitum, M. kansasii, M. leprae, M. malmoense, M. shimoidei, M. simiae, M. szulgai, M. xenopi, M. tuberculosis, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus, Brucella canis, Legionella pneumonophilia, Francisella tularensis, Pneumocystis carinii, mycoplasma ou Burkholderia cepacia. À infecção bacteriana pode resultar em pneumonia.

[00172] Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é um termo usado para classificar dois distúrbios principais de obstrução ao fluxo de ar: bronquite crônica e enfisema. Aproximadamente 16 milhões de americanos têm DPOC, 80-90% deles foram fumantes durante grande parte de suas vidas. A DPOC é a principal causa de morte nos Estados Unidos, sendo responsável por 122.283 mortes em 2003. O custo da DPOC para os EUA foi de aproximadamente US $ 20,9 bilhões em despesas diretas com saúde em 2003. A bronquite crônica é a inflamação das vias respiratórias brônquicas. As vias aéreas brônquicas conectam a traqueia com os pulmões. Quando inflamados, os brônquios secretam muco, causando tosse crônica.

[00173] No enfisema, os sacos alveolares estão super inflados como resultado de danos ao esqueleto de elastina do pulmão. As células inflamatórias do pulmão enfisematoso liberam enzimas de elastase, que degradam ou danificam as fibras de elastina dentro da matriz pulmonar. O enfisema tem várias causas, incluindo tabagismo, exposição a poluentes ambientais, deficiência de alfa-1 antitripsina e envelhecimento.

[00174] A bronquiolite é mais comumente causada por infecções virais do trato respiratório inferior e caracterizada principalmente por inflamação aguda, edema, necrose das células epiteliais que revestem as pequenas vias aéreas e aumento da produção de muco (Ralston et al, 2014). Os sinais e sintomas geralmente começam com rinite e tosse, que podem progredir para taquipnéia, sibilância, estertores, uso de músculos acessórios e/ou dilatação nasal.

[00175] A bronquiolite obliterante é uma redução progressiva do fluxo de ar como resultado da remodelação anormal das pequenas vias aéreas nos pulmões (Meyer et al., 2014). A síndrome de bronquiolite obliterante é uma das principais complicações dos transplantes de pulmão e é frequentemente usada para descrever uma disfunção do aloenxerto retardado que resulta em declínio persistente no volume expiratório forçado e na força que não é causada por outras causas conhecidas (Meyer et al., 2014).

[00176] O termo "asma" pode se referir a asma aguda, asma crônica, asma intermitente, asma persistente leve, asma persistente moderada, asma persistente grave, asma persistente crônica, asma leve a moderada, asma persistente leve a moderada, asma crônica persistente leve a moderada, asma alérgica (extrínseca), asma não alérgica (intrínseca), asma noturna, asma brônquica, asma induzida por exercício, asma ocupacional, asma sazonal, asma silenciosa, asma gastroesofágica, asma idiopática e asma variante da tosse. Durante a asma, as vias aéreas ficam persistentemente inflamadas e podem ocasionalmente ter espasmos.

[00177] Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de infecção pulmonar ou doença pulmonar em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um peptídeo de pó seco compreendendo a sequência de aminoácidos de rrtrrFTvT (SEQ ID NO: 2; referido neste documento como CSP7), em que o peptídeo de pó seco mantém a atividade biológica da caveolina-1 (Cav-1). Em alguns aspectos, um método de administração de uma formulação farmacêutica das modalidades compreende a inalação de pó seco do peptídeo. Em aspectos particulares, o indivíduo é um humano.

V. "EXEMPLOS

[00178] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles técnicos no assunto que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles técnicos no assunto devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado similar ou semelhante sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLO 1 - MÉTODOS E MATERIAIS

[00179] Preparação de peptídeos de pó seco. Peptídeo CSP7 (SEQ ID NO: 2), lote ft: AHF66//470103 foi sintetizado por Polypeptide Laboratories (San Diego, EUA).

[00180] Fabricação de misturas CSP7 e secagem por pulverização. Formulações de CSP7 contendo CSP7 sozinho (CSP7), ou uma mistura de 75%425% de CSP7/Leucinay CSP7/Trealose ou CSP7/Citrato de Sódio, ou uma mistura de 75%/15%/10% de CSP7/Leucina/Trealose foram preparados em água com pH 10 (ajustado com NH.OH) e secos por pulverização usando um BLD-35 com ciclone de

2.

[00181] Redução do tamanho de partícula CSP7 de pó seco por Thin Film Freezing (TFF). 0,3 mg/ml de pó a granel de CSP7 e 0,9 ma/ml de manitol (proporção de massa 1:3) foram dissolvidos em tampão Tris 10 mM e o pH foi ajustado para 8,05. A solução foi então filtrada com uma membrana de 0,45 um e colocada em uma câmara de rolamento cheia de nitrogênio líquido. A temperatura de congelamento medida estava entre -55 e -65ºC. Os flocos congelados foram então liofiizados num VirTis Advantage Freeze Dryer (VirTis Company Inc., NY, EUA). As condições de liofiização foram as seguintes: equilíbrio: manter a -55 ºC, 100 mTorr durante 30 min; secagem primária: temperatura de rampa até -380 ºC, 100 mTorr em 250 min; manter a -30 ºC, 100 mTorr por 660 min; secagem secundária: rampa para 30 ºC, 100 mTorr ao longo de 720 min; e manter a ºC, 100 mTorr por 240 min. A amostra processada pela TFF é referida como lote 171014.

[00182] Redução do tamanho de partícula de pó seco CSP7 por Moagem Criogênica. Um grama de pó CSP7 a granel é adicionado a um pequeno tubo de moagem criogênica e, em seguida, carregado em 6870 Freeze/Mill (SPEX Certiprep"", NJ, EUA). A moagem foi feita em 5 ciclos, um pré-resfriamento de 10 minutos, e cada ciclo tendo um tempo de execução de 5 minutos a 10 CPS seguido por um resfriamento de 2 minutos. A amostra moída foi recuperada e pesada, e o rendimento foi calculado em 73,5% com base no peso recuperado sobre o peso carregado.

[00183] Reduzir o tamanho das partículas de pó de CSP7 através de moagem de bolas (BM). O pó a granel de CSP7 foi suspenso em seu anti-solvente, etanol (anidro)) a uma concentração de 1 mgao/ml. Aproximadamente metade do volume do solvente das bolas de zircônio (2 mm) foi adicionado à suspensão. A suspensão foi então carregada em um 8000M Mixer/Mill (SPEX SamplePrep, NJ, EUA) para moer. As amostras foram coletadas do processo de moagem para teste aos 5min, 10 min e 30 min, respectivamente.

[00184] Redução do tamanho de partícula do pó CSP7 usando um rotor-estator. O pó a granel de CSP7 foi disperso em etanol até uma concentração de 1 mg/ml. A ponta (5 mm*75 mm de fundo plano) do rotor- estator foi submersa na suspensão e a homogeneização foi realizada para reduzir o tamanho das partículas.

[00185] Análise de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. As amostras foram dissolvidas em tampão Tris 20 mM (pH 10,3) e realizadas em uma coluna de cromatografia líquida Phenomenex Luna º C18(2) com tamanho de partícula de 5 um e tamanho de poro de 100 À. O kit de cartucho Phenomenex Security Guard Guard foi usado como uma coluna de guarda. A fase móvel A foi de H2O + 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA), e a fase móvel B era de 80% de acetonitrila + 20% H2O + 0,09% (v/v) de TFA. A amostra foi injetada em um volume de 20 uL. As amostras foram realizadas por 25 min cada, e a coluna foi mantida a 25 ºC, a uma taxa de fluxo de 1 mlímin. As amostras foram detectadas em um comprimento de onda de 220 nm. O gradiente de buffer foi definido para as condições especificadas na Tabela 2. Tabela 2: Materiais, condições e métodos para HPLC Coluna de Phenomenex Luna€ 5 um C18 (2) 100 À, Coluna Separação LC 150 x 4,6 mm Coluna de Kit de cartucho Phenomenex Security Guard Guarda Guard Fase Móvél A H2O + 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA Fase Móvél B | 80% de acetonitrila + 20% H2O + 0,09% de TFA Volume de e 20 ul injeção execução ao mm onda Po RS Gradiente

[00186] Determinação da distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica do pó a granel de CSP7 moído. Cerca de 3,5 mg de pó de CSP7 moído encheram manualmente em cápsulas de HPMC de tamanho 3 (Capsugel, Peapack, NJ). As cápsulas de CSP7 foram então aerossolizadas usando um inalador de pó seco RS01 Monodose (alta resistência) e a distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica foi medida por um Impactor de Próxima Geração (Next Generation Impactor -

NGlI, MSP Corp., Shoreview, MN). Os aerossóis foram produzidos durante 4s a uma taxa de fluxo de ar de 60 L/min para o inalador atingir um volume de inalação de 4 L e queda de pressão de 4kPa no dispositivo. Antes de cada execução, as superfícies de coleta de NGI foram revestidas com polissorbato 20 a 5% (v/v) em metanol. Uma cápsula foi injetada para cada execução e cada amostra foi executada em repetições triplicadas (três cápsulas). Após a aerossolização, todas as superfícies de coleta foram enxaguadas com volumes específicos de tampão Tris 20 mM (pH 10,3) para coletar o medicamento. Os pós depositados na cápsula, dispositivo, adaptador, garganta, pré-separador e etapas 1-MOC foram extraídos, respectivamente.

[00187] Para cada teste, a dose administrada é definida como a massa de CSP7 que entrou no NGlI. Desvio padrão geométrico (GSD), diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) e fração% de partícula fina (FPF%) são calculados e analisados com o Software de Análise de Dados de Teste de Inalador Copley (CITDAS, Copley Scientific, Nottingham, Reino Unido), com base nas doses depositadas nas etapas 1- MOC de NGlI. O FPF é definido como a fração de massa de partículas menores que 5,0 um com a dose administrada.

[00188] Preparação e lise dos tecidos pulmonares. Camundongos fêmeas, com idades entre 6 e 8 semanas, são encomendados aos Laboratórios Jackson, estoque: 000664 C57BL/6J são cuidados e alojados de acordo com as diretrizes do IACUC. Na semana seguinte, os camundongos são pesados, anestesiados com uma injeção IP de 80mg/kg de cetamina e 6 mg/kg de xilazina (aproximadamente 115ul/camundongo) e submetidos a uma única instalação intratraqueal de bleomicina. Resumidamente, um cateter de plástico 26G é inserido na traqueia e os camundongos recebem, via pipeta, 2x instalações de 20ul (espaçadas 30s para permitir a liberação das vias aéreas) de bleomicina 0,8U/kg (Biotang, Cat! RBOO3S). Os controles recebem apenas o mesmo volume de solução salina.

O peso é monitorado (aproximadamente 10% de perda de peso ocorre em animais feridos) e os animais são submetidos a um protocolo de inalação de pó seco (tecnologias CH) diariamente durante uma semana.

A dosagem de pó seco foi baseada na dose eficaz mínima da formulação de nebulização anterior que foi estimada como uma dose administrada ao pulmão de 0,7mcg/animal (Tepper et a/l., 2016, incorporado neste documento por referência). Em resumo, um tempo de exposição de 12min/dia combinou uma dose '1X' e uma dose '5X' designou um tratamento de 60min/dia equivalente a 3,5mcg/animal.

Os animais foram expostos por sete dias consecutivos (d14-20; durante a fase fibrótica da lesão por bleomicina) e sacrificados 24 horas após a última dose letal de cetamina heparinizada/coquetel de xialisina (25% de heparina). Um subconjunto “de pulmões inteiros foi colhido para histologia.

Resumidamente, uma perfusão transcardíaca com 10mls de solução salina limpa o sangue do pulmão.

Em seguida, os pulmões foram inflados com solução salina por 1 minuto, seguido de 4% de PFA por 1 minuto a partir de 20cm acima da etapa de dissecção.

A traqueia foi amarrada e o pulmão excisado, fixado, embebido e seccionado a 4 mícrons para obter a visualização da área de superfície máxima e corado com hematoxilina e eosina.

As imagens foram capturadas com Aperio AT2 de alto volume, scanner digital de lâmina inteira e os pulmões foram avaliados para lesão fibrótica de acordo com o protocolo de pontuação Ashcroft modificado (Húbner et al., 2008, incorporado neste documento por referência). Para análises moleculares, pulmões inteiros foram homogeneizados em tampão RIPA e inibidores de protease (Santa Cruz), bem como 1% de DTT (para inibir RNAses), homogeneizados em paralelo a 4C (Precellys Evolution, Bertin Instruments) e processados para ensaios posteriores.

O teor de colágeno do homogenato pulmonar foi testado de acordo com o Ensaio de Colágeno Total (Quickzyme) usando o padrão de colágeno fornecido pelo fabricante e de acordo com as instruções do fabricante.

O ensaio colorimétrico foi lido em um leitor de microplaca (FilterMax F5, Molecular Devices, 580nm). Além disso, o RNA foi extraído do homogenato (Zymogen Research) e transcrito reversamente em cDNA (Qiagen, QuantiNova Reverse Transcription 205413). Os resultados destes estudos são mostrados nas Figuras. 29-32.

[00189] O tampão de homogeneização para 28 amostras foi preparado pela adição de 224 ul de inibidor de coquetel, 224 ul de NaOVA4, 224 ul de PMSF e 0,22 g de DTT a 22,4 mL de tampão RIPA. 800 ul de tampão de homogeneização foram adicionados por amostra. As amostras foram homogeneizadas usando o Precellys Evolution com esferas CK28. O protocolo de homogeneização utilizado foi para tecido duro e realizado duas vezes a 4 ºC para cada amostra. As amostras homogeneizadas foram então aliquotadas, com 400 ul armazenados para determinação da concentração de BCA e ensaios de proteína, 200 ul para isolamento de RNA e 200 uL para o ensaio de colágeno.

[00190] Ensaio de colágeno. O padrão de colágeno foi preparado para uso adicionando 125 ul do padrão de colágeno Quickzyme a 125 uL de 12 M HCL e 200 ul de cada amostra a 200 ul de 12 M HCl. As amostras e o padrão foram incubados a 95 ºC durante 20 horas e vortex brevemente após 20 minutos. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 13.000 x g. O padrão foi preparado de acordo com as instruções do fabricante (Quickzyme). 100 ul de cada amostra foram então diluídos em 50 ul de água. 10 ul de cada amostra diluída foram então ainda mais diluídos em 100 ul de HCl 4M. Os duplicados dos padrões e cada uma das amostras foram pipetados em placas. 75 ul de tampão de ensaio foram adicionados a cada poço e a placa foi coberta antes de agitar por 20 minutos. 75 ul de mistura de reagente de detecção foram adicionados por poço, e a placa foi misturada antes de incubar a 60 ºC por uma hora. As placas foram então lidas, como indicado acima.

[00191] Isolamento de RNA. O isolamento do RNA foi realizado com o kit Qiagen RNeasy, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 25 ul de tampão RLT e 75 uL de etanol a 70% foram adicionados a 50 ul de amostra em tampão RIP A, rendendo um total de 150 ul de material de partida. 50 ul do material de partida para cada amostra foram então adicionados a 50 ul de água livre de RNase. Em seguida, 350 ul de tampão RLT foram adicionados e as amostras foram bem misturadas. 250 ul de etanol 95-100% foram então adicionados a cada um, e as amostras foram misturadas novamente. 700 ul de cada amostra foram então adicionados às respectivas colunas vertebrais e centrifugados a 8000 X g, e o fluxo direto foi descartado. 500 ul de RPE foram adicionados a cada coluna e as colunas foram centrifugadas novamente. 500 ul de RPE foram adicionados novamente e, desta vez, as amostras foram centrifugadas por 2 min a 8000 x g. As amostras foram transferidas para um novo tubo de microcentrífuga e o RNA foi eluído com 40 ul de água livre de RNase por centrifugação por 1 min a 8000 x g. As amostras foram quantificadas por nanogota e analisadas conforme descrito acima.

EXEMPLO 2 - CARACTERIZAÇÃO DO PÓ A GRANEL DE CSP7

[00192] Microscopia Eletrônica de Varredura. Amostras de pó a granel de CSP7 foram pulverizadas na bandeja de amostra e espalhadas por sopro de nitrogênio comprimido. As amostras foram fotografadas por microscopia eletrônica de varredura (Figura 1). SEM indica a existência de partículas grandes (>5 um). Além disso, a maioria das partículas parecia ser grande (>5 um) e, portanto, fora da faixa respirável.

[00193] Avaliação do tamanho de partícula CSP7. Os tamanhos das partículas foram examinados usando difração a laser Spray tec e sistema HELOS-R do instrumento de difração a laser Sympatec, equipado com acessório de dispersão sólida ou úmida, para determinar se o pó a granel está dentro da faixa respirável. O tamanho das partículas de pó a granel de CSP7 foi determinado como sendo maior do que o tamanho de partícula respirável usando o método de dispersão a seco. A Tabela 3 mostra os tamanhos de partícula para as partículas avaliadas como estando em Dv 10, Dv 50 (mediana) e Dv 90 dentro da distribuição. Como pode ser visto na Tabela 3, mais de 50% de todas as partículas CSP7 analisadas tinham um tamanho de partícula de 5,3 um ou maior, que é maior do que a faixa respirável. Tabela 3: Tamanho de partícula de pó CSP7 a granel por dispersão seca de difração a laser Sympatec Dv 10 (um Dv 50 (um) | Dv 90 (um 1,4+0,0 5,3+0,0 22,0+1,7

[00194] Os tamanhos de partícula foram determinados em seguida por difração de laser Sympatec por um método de dispersão úmida. CSP7 foi dissolvido em etanol + Tween 80 a 0,05% como meio de dispersão e sonicado 10 min. Os resultados da determinação do tamanho de partículas CSP7 usando dispersão úmida são mostrados na Tabela 4. Conforme mostrado na Tabela 4, o tamanho médio de partícula (Dv 50) das partículas de dispersão úmida foi de 29,0 + 0,8, muito fora da faixa respirável. Tabela 4: Tamanho de partícula de CSP7 em pó a granel por dispersão úmida de difração a laser Sympatec Dv 10 (um Dv 50 (um) | Dv 90 (um 7,2+0,1 29,0+0,8 63,9+3,8

[00195] O tamanho médio das partículas foi avaliado posteriormente usando o instrumento de difração a laser Spraytec, novamente usando um método de dispersão a seco. O pó a granel de CSP7 foi disperso a 40 PSI e, novamente, o tamanho médio de partícula (8,6 + 1,5 um) estava acima da faixa respirável (Tabela 5). Tabela 5: Tamanho de partícula de pó CSP7 a granel por dispersão seca de difração a laser Spraytec o, Dv 10 (um) | Dv 50 (um) | Dv 90 (um) he & pm 1,7+0,2 29,0+0,8 63,9+3,8 34,5+4,1

[00196] A porcentagem de partículas de pó seco menor que 5 um foi de apenas 34,5 + 4,1%. Dado que cada um dos métodos de difração de laser constatou que a maioria do pó a granel tinha um tamanho de partícula fora da faixa respirável, qualquer pó seco usado para o tratamento precisaria ser processado de alguma forma para reduzir o tamanho da partícula.

[00197] Morfologia do pó CSP7 a granel. Amostras de CSP7 em pó a granel foram pulverizadas em lâminas de vidro e visualizadas por microscopia óptica (Figura 2). A microscopia óptica confirmou o SEM, indicando a presença de partículas grandes (> 5 um). A microscopia óptica também mostra a presença de aglomerados de partículas, visíveis na Figura 2 por setas.

[00198] Determinação da cristalinidade de partículas de pó a granel de CSP7. Partículas de pó a granel de CSP7 foram avaliadas usando difração de pó de raios-X (Figura 3). Verificou-se que CSP7 puro exibe alguma cristalinidade por difração de pó de raios-X (Figura 3). Para confirmar os resultados de difração de raios-X, a cristalinidade foi avaliada por microscopia de luz polarizada (Figura 4). Como pode ser visto na Figura 4, há CSP7 cristalino presente no pó de CSP7 a granel e certas formas cristalinas típicas são indicadas por setas brancas na imagem.

[00199] Termoanálise de pó de CSP7 a granel. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foi usada para determinar o ponto de fusão de CSP7 puro (Figura 5). Conforme determinado por DSC, o ponto de fusão de CSP7 foi determinado como sendo 211,03 ºC (Figura 5). A análise continuou usando análise termogravimétrica (TGA) (Figura 6). O TGA indica que o peso de CSP7 puro começa a diminuir dramaticamente acima de 216 ºC (Figura 6).

[00200] Teor de umidade do pó CSP7 a granel. O teor de umidade do pó CSP7 a granel foi avaliado por titulação Karl Fischer- Volumetric (KF-V) usando um Titulador Mettler Toledo Karl Fischer, e realizado em triplicado. A Tabela 6 mostra o teor de umidade de cada teste e o teor médio de umidade dos 3 testes. a granel. Médio DD gg

[00201] Em seguida, a sorção de umidade do pó CSP7 a granel foi analisada usando sorção de vapor dinâmica, DVS (Figura 7). A amostra CSP7 foi executada para um ciclo completo de sorção/dessorção, e a amostra apresentou uma dessorção de umidade de 6,32% em umidade relativa de zero. A mudança de massa foi encontrada em 10,54% quando a umidade relativa é de 90% (Figura 7).

EXEMPLO 3 - CARACTERIZAÇÃO DE PÓS DE CSP7 APÓS

REDUÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULA

[00202] Redução do tamanho de partícula do pó de CSP7. Para efetivamente inalar e depositar um pó nos pulmões, o tamanho da partícula deve geralmente ter um diâmetro aerodinâmico médio de massa inferior a cerca de 5 um. Uma variedade de técnicas foi realizada para reduzir o tamanho de partícula do material puro, incluindo moagem a jato de ar (AJM), moagem de bolas (BM), moagem criogênica (CM), congelamento de película fina (TFF) e secagem por pulverização. Primeiro, o AJM foi realizado para reduzir o tamanho de partícula do pó CSP7 a granel e o CSP7 moído foi coletado de vários locais dentro do moinho. O rendimento e a distribuição do tamanho de partícula de um primeiro lote de pó moído (Lote 171013) coletado nas posições indicadas são mostrados nas Tabelas e 6. A distribuição do tamanho de partícula foi determinada por dispersão seca de difração a laser Sympatec (Tabela 8) ou dispersão úmida de difração a laser Sympatec (Tabela 9), como acima.

[ Tabela 8: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de | pó CSP7 (Lote 171013) usando dispersão seca iã Dv 90 Produção | Posição | MES | ES | Qimy nersem Procteão BCF + Câmara de | 1,2 +0,0 | 2,7+0,1 | 5,1 +0,2 [83,7 +1,38| 18% Moagem 73,6 0,1 Adaptador o, 2,501 82,6 + 1,4 Tabela 9: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó de CSP7 (Lote 171013) usando dispersão úmida "o Dv 90 Produção | Posição | A EA um ersem Pregão BCF + Câmara de | 1,2+0,0 | 3,1+0,0 |64+20,1| 99% | 18% Moagem ' 3,4+0,1 |7,4+0,2 |61,8+1,0)/ 9% | Adaptador de 1,1 0,0 | 3,0 +0,0 | 5,9 +0,1 [75,3 + 0,9 6% recipiente 2,9 0,0 | 5,8 0,0 [78,2 + 0,6

[00203] O segundo lote (Lote 171027) de CSP7 foi moído a partir de 10 gramas de pó a granel puro usando as mesmas condições acima. Mais uma vez, a distribuição de tamanho de pó e o rendimento foram avaliados a partir dos mesmos locais e estão listados na Tabela 10. Tabela 10: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó CSP7 (Lote 171027) usando dispersão seca iã Dv 90 Produção | Posição | TEA | | um Dersem Pogção Bolsa + adaptador de | 0,7+0,0 | 1,4+0,0 | 3,2+0,1 | 68,3+0,6 19,0 bolsa BCF + Câmara de | 1,0+0,0 | 2,6+0,1 | 5,0+0,2 | 81,0+1,3 16,9 Moagem 0,9:+0,0 5,6:+0,1 Adaptador de eee de 0,90,0 | 2,3:0,0 | 4,401 | 82,2+2 rata 768

[00204] Um terceiro lote de pó seco CSP7 foi submetido a congelamento de película fina (TFF) (lote 171014) e analisado como acima, usando tanto a dispersão seca de difração a laser Sympatec (Tabela 11) quanto a dispersão úmida (Tabela 12). Tabela 11: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó CSP7 (Lote 171014) usando dispersão seca Dv 10 (um) |Dv 50 (um)/Dv 90 (um) % 1-5 um 2,1 +0,0 | 5,7 +0,1 | 10,4 + 0,3 [37,0 + 0,6 Tabela 12: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó CSP7 (Lote 171014) usando dispersão úmida |Dv 10 (um) |Dv 50 (um)[Dv 90 (um) [% 1-5 um 3,8 +0,0 | 7,1 +0,0 | 13,3 +0,2 [24,6 + 0,7

[00205] Outro lote de pó seco CSP7 foi submetido a moagem criogênica (CM) para reduzir o tamanho das partículas. O tamanho de partícula de CSP7 de CM foi avaliado por difração de laser usando dispersão seca (Tabela 13) e dispersão úmida (Tabela 14) como acima. Tabela 13: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó de CSP7 de CM (dispersão seca) Dv 10 (um) Dv 50 (um)|Dv 90 (um) | % 1-5 um 0,7 +0,0 | 2,7 +0,2 | 17,4 +0,9 | 42,7 +0,5 Tabela 14: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó de CSP7 de CM (dispersão úmida) Dv 10 (um) |Dv 50 (um) /Dv 90 (um) | % 1-5 um 1,5+0,0 | 10,5+0,1 | 38,5 +0,7 | 28,2 +01

[00206] Outro lote de pó CSP7 a granel foi submetido a moagem de bolas (BM) para reduzir o tamanho das partículas. As distribuições de tamanho de partícula de pó CSP7 de BM retiradas de vários pontos de tempo durante o processo de moagem são apresentadas na Tabela 15. Tabela 15: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó de CSP7 de BM (dispersão úmida) |Duração |[Dv 10 (um)|Dv 50 (um)[Dv 90 (um)]| % 1-5 um 5min | 0,8+0,0 | 3,8+0,2 | 12,5 0,4 | 43,0 +0,7

Tabela 15: Distribuição de tamanho de partícula e rendimento de pó de CSP7 de BM (dispersão úmida) 2,8+0,1 | 9,2+0,2 | 49,0 +0,6 0,6 +0,0 | 1,4+0,0 | 5,38+0,3 | 55,5+0,7

[00207] Lotes adicionais foram produzidos com misturas de CSP7 (também referido pelo acrônimo de desenvolvimento atribuído, CSP7) e leucina, trealose, citrato de sódio ou leucina e trealose e submetidos a secagem por pulverização para reduzir o tamanho das partículas. O tamanho das partículas secas por pulverização foi examinado por difração de laser de dispersão seca (Figura 8, Tabela 16). Novamente, em relação ao CSP7 a granel, a secagem por pulverização reduziu significativamente o tamanho das partículas de CSP7. Tabela 16: Fabricação por secagem por pulverização de misturas CSP7 ID dotote| 1923 | 1823 1929-001D 1925. 00 1E| 1923 -001F 001B 001C o, 75/25 75/25 75/25 75/15/10 Formulag| 10090 csP7/Leu|CSP7/Treal|cSP7/CitratlCSP7/Leuci cina ose o de sódio Ina/Trealose BLD-35 com ciclone 2' | Solvente | pH = - 10 água (ajustado com NH.OH 2-Fluido Tamanho do lote 4 4 4 2 4 (9) Rendime nto de 3,07 2,98 3,12 1,60 3,04 massa (g) Produção oi) 0,81 +0,04/0,91 +0,00| 0,85 +0,04 | 0,84 +0,04 | 0,89 +0,01 De 1,99:0,01 [1,96 +0,00| 1,98 +0,02 | 1,99 +0,01 | 1,97 +0,02 Pets 4,20 +0,12/3,79:+0,01 | 4,01 +0,10 | 4,06 +0,11 [3,88 +0,03

[00208] O tamanho de partícula CSP7 foi drasticamente reduzido seguindo cada um dos métodos para reduzir o tamanho de partícula

(moagem a jato de ar, congelamento de película fina, moagem criogênica, moagem de bolas e secagem por pulverização), ambos quando medidos por dispersão sólida e dispersão úmida (Compare as Tabelas 1 e 2 às Tabelas 5, 6, 10, 13, 14, 16, 17, 18 e 19). Após a moagem a jato de ar, a maioria das partículas CSP7 está dentro da faixa respirável, no entanto, o congelamento de película fina, moagem criogênica e moagem de bolas não foram tão eficazes, com porcentagens menores dos pós moídos caindo dentro da faixa respirável quando medido por laser difração usando dispersão sólida ou dispersão líquida.

[00209] O tamanho de partícula também foi reduzido usando um homogeneizador portátil rotor-estator (Figura 9). CSP7 mudou de cor em etanol após homogeneização para cinza claro ou escuro, dependendo da duração e poder de homogeneização. Figura 9, e é claro que a homogeneização reduziu o tamanho de partícula, embora o método não tenha sido prosseguido devido à mudança de cor observada.

[00210] Morfologia de pós moídos de CSP7. A morfologia de cada uma das amostras moídas foi examinada usando microscopia óptica ou Microscopia Eletrônica de Varredura. As amostras de pó do moinho de jato de ar foram examinadas conforme acima e a microscopia óptica indicou que o tamanho de partícula foi reduzido para um tamanho de 1 um> tamanho de partícula> 5um e homogêneo (Figura 10). Além disso, as partículas de CSP7 moídas estavam livres de aglomerados (Figura 10). SEM indicou que o tamanho de partícula homogeneizado e reduzido das partículas moídas a jato de ar estava entre 1 e 5 um (Figura 11). As amostras de pó obtidas após TFF também foram examinadas e, embora os tamanhos de partícula fossem maiores, a amostra foi considerada livre de aglomerado (Figura 12). Uma análise posterior incluiu a avaliação da morfologia das partículas das formulações secas por pulverização por microscopia eletrônica de varredura. Imagens de SEM representativas das formulações são mostradas na Figura 13.

[00211] Cristalinidade de CSP7 de AJM. O pó CSP7 moído (lote 171027) foi avaliado por difração de raios-X e cristalinidade exibida no difractograma (Figura 14). A cristalinidade de CSP7 seco por pulverização também foi examinada por difração de raios-X e as curvas são representadas na Figura 15. As formulações de CSP7 sozinho, ou CSP7 acoplado com trealose ou citrato de sódio são amorfas, enquanto CSP7 acoplado com leucina ou leucina e trealose parecem conter o caráter cristalino da leucina, como mostrado pelos picos agudos na Figura 15.

[00212] Avaliação por HPLC de pó CSP7 moído ou seco por pulverização. Para determinar se a moagem do pó CSP7 a granel teve qualquer efeito na potência química, as amostras de pó CSP7 moído foram coletadas de várias partes do moinho e foram avaliadas usando HPLC realizado sob as condições listadas na Tabela 2. A potência foi avaliada usando a equação: Potência - Cone de peptídeo de CSP7 livre, a partir do resultado de HPLC X 100% Concentração de peptídeo de CSP7 livre do balanço de massa

[00213] É claro a partir da Tabela 26, que a moagem não teve efeito deletério sobre a potência de qualquer uma das amostras coletadas. Da mesma forma, quando o Lote 171027 foi testado, a potência química foi determinada como sendo 100,14% io laptador

[00214] As misturas de CSP7 secas por pulverização foram examinadas por RP-HPLC para examinar a pureza (Tabela 17, Figura 16). Semelhante ao pó CSP7 moído a jato de ar, o CSP7 seco por pulverização retém aproximadamente 100% de pureza. (Tabela 17: Pureza de formulações secas por pulverização de CSP7º==—= relativa> LOQ H1 2 HS ATIVO it4 HS totais Primár io [Tempo de retenção 7,99 — [862 =“ 1203 493/1830 188 [| | Pee bs es be amb las 1 Relativo 0,54 10,58 0,81 1,00 [1,28 1,26 Padrão API! 0/00] Lsoj268 | hBbaotl- ——fo13 joao É Padrão API /0/00] jo27/,66 14 baotel- —fo16 js | o BREC 001B o BREC 001B 175/25 BREC ICSP7/Leuci 1923- 100,00) ha potC 175/25 BREC ha potC 175/25 BREC bse PO1D 175/25 BREC bse PO1D 175/25 BREC lo de sódio /001E 175/25 BREC lo de sódio /001E 75/15/10 [BBREC na/Trealose 001F 75/15/10 [BBREC ICSP7/Leuci 1923- |E2 199,84 0,16 na/Trealose 001F

[00215] Estabilidade CSP7. As estabilidades tanto do pó CSP7 a granel não processado quanto do CSP7 moído a jato de ar (lote 171027) foram examinadas por ensaio de sua potência química usando HPLC. Uma amostra de cada uma foi armazenada em 3 condições diferentes antes de testar a potência química em 5, 15 e 32 dias de armazenamento (Figura 17). A estabilidade do CSP7 seco por pulverização durante um período de 24 horas também foi examinada por HPLC (método descrito anteriormente no relatório descritivo) para compreender sua estabilidade de curto prazo.

Cada uma das formulações foi considerada estável, sem aumento de impurezas após 2 ou 24 horas (Tabela 31).

EA trealose sódio Usada amônio sódio amônio amônio amônio Pureza Fotos A da 5 at falo ada 0216] Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica de CSP7 moído. Para determinar a distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica de CSP7 moído, a quantidade de pó depositado em vários locais do coletor NGI foi extraída separadamente. A dose administrada foi medida como a massa de CSP7 que entrou no coletor NGI após a aerossolização, e a quantidade de CSP7 que foi depositada em superfícies individuais foi extraída e medida separadamente. A quantidade de CSP7, não processado ou moído a jato de ar (lote 171013) que foi deixada na cápsula, ou depositada dentro do dispositivo, adaptador, garganta, pré- separador e etapas 1-MOC são mostrados na Figura 18 como uma porcentagem do valor total de CSP7 entregue. A porcentagem de fração de partículas finas (FPF%), diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) e desvio padrão geométrico (GSD) de CSP7 moído e não tratado (por exemplo, não moído ou não processado) são apresentados na Tabela 9. AJM (Lote 171013) LL FPF%(<5 um) MMAD (um) [GSD (um)|

[00217] A distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica do segundo lote de CSP7 moído (171027) foi determinada conforme acima,

exceto por usar cerca de 4,25 mg de pó por cápsula de HPMC de tamanho

3. O GSD, FPF% e MMAD são apresentados na Tabela 11 e a porcentagem de CSP7 depositada em cada local é apresentada na Figura 19, novamente como uma porcentagem do valor total de CSP7 entregue. Tabela 11: Propriedades geométricas de pó CSP7 do lote 171027 Lt — FPF%(<5 um) MMAD (um) [6SD (um) | CcSsP7 não) processado 16,4 + 0,9 13,0 + 0,3 12,5 + 0,0 CSP7 Moido aBa5so7 basoo 900 Jato de Ar

[00218] A aerossolizaçção das formulações secas por pulverização também foi examinada (Figura 20). Cada uma das formulações exibiu uma fração de pó fino superior a 60%, com cada formulação tendo um MMAD entre 2,5 um e 3 um (Tabela 25). Um resumo dos resultados das análises das formulações secas por pulverização, incluindo o teor de água, é apresentado na Tabela 25. Tabela 25: Resumo analítico de misturas de CSP7 secas por pulverização ID do lote BREC1923- [BREC1923/BREC192/BREC1923-| BREC192 001B -001C 3-001D 001E 3-001F 100%de | 75/25 | 75/25 | 75/25 ea Formulação CSP7 CSP7/Leuc| CSP7/Tre| CSP7/Citrat cina/Treal ina alose | o de sódio ose Teor de água (% 2,1 +0,1 1,8+0,0 | 2,1+0,0 | 2,5+0,1 | 1,8+01 Ensaio (mg A/g, | 1059 +14 745 +9 (99 % alvo: 106 % 104% 105 % % 101 % Pureza C6PICO | 99g:0,3 | 99,9 +0,2 99,6 :0,1| 99,8 :+0,1 |99,8+0,0 Carcaças Carcaças Carcaças Carcaças |colapsada Morfologia de | colapsadas | Carcaças cola! Seda colapsadas | s com Partículas (SEM) | com alguns |colapsadas: PR com alguns | alguns fragmentos fragmentos | fragmento Ss Amorfo Amorfo primário primário Estado Físico com com (PXRD) Amorio caráter de Amorfo Amorto caráter de leucina leucina cristalina cristalina

Ponto Médio de TgCC)das =) 135 446,3 | 97,4+1,6/77,1 22,2] 80,4 +0,4 |79,6+2,3 Propriedades Térmicas (DSC de | GSD | 18:01 | 1,7%00 | 1,8:0,2 | 17%00 | 1,7%00 | aeross| EF(%) | 93+1 | o3+ | o5+1 | 93x | 91% | ol MMAD - diâmetro aerodinâmico médio de massa GSD - desvio padrão geométrico EF - fração emitida FPF - fração de partícula fina

[00219] Determinação do teor de umidade do CSP7 moído. Sob as mesmas condições usadas para analisar o CSP7 a granel, pó de CSP7 moído a jato de ar (lote 171027) foi analisado usando Sorção de Vapor Dinâmico (Figura 21). Semelhante ao pó puro a granel, o CSP7 moído tinha uma dessorção de umidade de 4,61% em umidade relativa de 0% (Figura 21). A análise KF-V encontrou um teor de umidade de 4,9% (Tabela 7), embora tenha havido um aumento na mudança de massa para 13,59% quando a umidade relativa de 90% (Figura 21).

Tabela 7: KF-C de CSP7 lote 171027 Teor de umidade iMédio[ ———a49%

[00220] Análise termogravimétrica de pós de CSP7 de tamanho de partícula reduzido. A análise termogravimétrica foi realizada em CSP7 moído (lote 171027) de uma maneira idêntica ao CSP7 a granel, e verificou- se que o CSP7 moído tinha propriedades muito semelhantes ao CSP7 não processado (Figura 22). As propriedades térmicas das formulações secas por pulverização também foram avaliadas e são mostradas na Tabela 24 e nas Figuras 23-27 (resumidas na Figura 28). Notavelmente, o ponto médio de Tg das formulações misturadas foi significativamente menor do que o CSP7 seco por pulverização sozinho (compare 001C-F com 001B na Tabela 24).

Tabela 24: Propriedades térmicas de formulações CSP7 secas por pulverização Número do lote | Formulação manto e Outros eventos térmicos BREC- (p/p%) Tg (ºC) registrados 1923- 9 OO01B. | 100% LTI-003 1228 t Exo a 170 ºC 75/25 Exo a 165 ºC seguido por 0018 |) cspz/Leucina 197416 Endo a 180 ºC 75/25 Exo a 130 ºC seguido por | 0016 | CSP7/Trealose [71 +22 Endo a 170 ºC 15/25 Exo a 150 ºC seguido por CSP7/Citrato de 80,4 + 0,4 o e Endo a 170 ºC sódio 75/15/10 : ; Exo a 100 e 150 ºC seguido CSP7/Leucina/T|79,6 + 2,3 o | onte lestricmat ras sas por Endo a 155 e 170 ºC

[00221] Os resultados apresentados neste documento indicam que uma variedade de métodos para reduzir o tamanho de partícula de pó de CSP7 são eficazes e que os pós resultantes exibem características muito semelhantes. EXEMPLO 4 - TRATAMENTO DE FIBROSE PULMONAR INDUZIDA POR BLEOMICINA POR INALAÇÃO DE PÓ SECO DE CSP7

[00222] Indução e tratamento de fibrose com CSP7 em camundongos. A fibrose pulmonar foi induzida em camundongos por tratamento com Bleomicina. Os camundongos receberam doses de 0,8 U/kg de bleomicina por via intranasal e esperaram 14 dias para desenvolver a doença antes do tratamento. Os camundongos foram então deixados sem tratamento, ou tratados por inalação de pó seco de CSP7 por 12 minutos, ou tratados por inalação de pó seco de CSP7 por 60 minutos. Os camundongos foram eutanasiados no último dia do tratamento e os pulmões foram removidos, congelados rapidamente e armazenados a -80 ºC. Os pulmões congelados rapidamente foram pesados antes de uma análise adicional (Figura 29).

[00223] Os tecidos pulmonares foram homogeneizados e o teor de colágeno foi analisado usando o ensaio de colágeno Quickzyme (Figura 30). A indução de fibrose por bleomicina resultou em um aumento significativo no colágeno nos pulmões em comparação com o tratamento com solução salina (P = 0,0062) (Figura 30). A Ashcroft score, uma medida de fibrose pulmonar em camundongos, foi menor em camundongos tratados com CSP7 após a indução de bleomicina de fibrose pulmonar (Figura 31).

[00224] O RNA também foi preparado a partir de tecidos pulmonares homogeneizados e usado conforme descrito acima.

EXEMPLO 5 - FORMULAÇÃO DE SUSPENSÃO PARA INJEÇÃO INTRAMUSCULAR/SUBCUTÂNEA suspensão SP7

E | Aguaestéri [UU *: O CSP7 Moído a Jato de Ar demonstrou que o tamanho geométrico das partículas é Dv(10) = 0,75 um; Dv(50) = 1,93 um; Dv(90) = 4,29 um, medido por difração de laser.

[00225] Para preparação:

1. Preparando tampão Tris 20 mM (deve ser pH - 10,3)

2. Dissolver 1,5% (p/p) de CMC em tampão Tris 20 mM, com adição de 0,2% (p/p) de Poloxâmero 188. Agite durante a noite a - 600 rom

3. Adicionar 0,7% (p/p) de NaCl na solução CMC.

4. — Ajuste o pH da solução para 7 adicionando — 28,5ul/ml de IN

HCI

5. Pesar e adicionar certa quantidade de pó de CSP7 moído (coletado do saco de coleta para obter frações de tamanho de partícula pequeno) em um frasco limpo

6. Use uma haste limpa para moer o pó primeiro, certifique-se de que não haja partículas visivelmente aglomeradas

7. Adicione gradualmente a solução preparada no frasco com moagem/trituração com a haste

8. Quando o pó está completamente úmido e não são encontradas partículas aglomeradas visíveis, q.s. para o volume alvo Resultado: Foot ie mesemenoo CSP7 Dia 1 [15 Elma] 101% | 9% [45] 4%, | mg/ml mOsm/kg : 99,9% |101,7%| 85,5% | EXEMPLO 6 - SOLUÇÃO DE FORMULAÇÃO PARA INJEÇÃO INTRAMUSCULAR/SUBCUTÂNEA

[00226] Para preparação:

1. Preparando tampão Tris 20 mM (deve ser pH - 10,3)

2. Dissolver 1,5% (p/p) de CMC em tampão Tris 20 mM, com adição de 0,2% (p/p) de Poloxâmero 188. Agite durante a noite a - 600 rom

3. Adicionar 0,7% (p/p) de NaCl na solução CMC.

4. Adicionar 1,2-1,4 mg/ml de CSP7 (pó não processado) à solução, agitar no vórtice para dissolver. O pH deve estar em torno de 9, em seguida, ajuste o pH para 8,2-8,5 com a adição de — 50 ul de 1N HCI de CSP7

E | — Águaestéil | - Tris (chamado Trizma) 20 mM

0,7% (p/v — 50 ul para IN HCI pH 8,2-8,5 Resultado: Tabela 28: Caracterização da solução de CSP7 Cone ; | Potência real, de osmalari Química [Potência Química no Dia 7 CcSsP7 no Dia O 1,18 286 o, | -20ºC: | 4ºC: RT: | nã/R, B8.6 mosmkg| 191-5% | 99 6% | 95,6% | 20,8% EXEMPLO 7 - ESTUDOS DE PRE-FORMULAÇÃO PARA

VARIANTES DE POLIPEPTÍDEOS

[00227] O estudo de solubilidade das variantes foi realizado adicionando variantes em pó ao solvente na concentração de 5 mga/ml e depois agitando no vórtex por 3 min. Observe o aparecimento de soluções em 5 min. Adicione mais pó (- 5mg/ml de cada vez) e repita o vórtice e observe até ocorrer precipitação ou gelificação. Resultados: Tabela 29. Solubilidade de pH de variantes pH | SEQID [| SEQID | SEQID | SEQID | SEQID [| SEQID SEQ ID NO.2 NO.4 NO.7 NO.8 | NO.10 NO.21 NO.22 bs oo ossta ass possas 6210 ba e00s parana à Precipitado: centrifugar as soluções, alíquotas do sobrenadante e diluir com tampão. b Solução de alta viscosidade: pegue uma alíquota da solução e dilua com o tampão. Tabela 30: Aparência de soluções em pH 4,5 EE Concentração (mg/ml Bl 5 [10/15/20/25| o 385 —J40/45|50/55|6o

Tabela 30: Aparência de soluções em pH 4,5 SEQ Concentração (mg/ml) no) 5 [io [as 2nfas| ao | as [ao /as|sojssjco) Precipitado translúcido e 4 | Claro (ClaroClaroClaro(Claro| incolor, viscoso Claro, ; viscoso | 8 | Claro (Claroletaro(elaro[ Ger Fpp e io Precipitado Precipitado translúcido | Claro |Claro/Claro/Claro Claro|translúcido e e incolor. incolor H ' viscoso [at biseosa e e viscoso) Tabela 31: Aparência de soluções em pH 5,5 SEQ Concentração (mg/ml) IBN 5 q 1 pp [po 20 | 25 | viscoso ; Turvo, Claro, Claro, Precipitado translúcido e T is o ; urvo, Claro ligeiramente | ligeiramente incolor, ; : : : viscoso viscoso viscoso viscoso Fig | viscoso Bem viscoso ele | | viscoso Tabela 32: Aparência de soluções em pH 7,5 SEQ ID Concentração (mg/ml no |5]10]|15]20| 25 [30] 35 [40]45]50]55]60| 65 | Preci|Preci pitad |pitad o o Itranslitransl!| Clar úcido úcido) 4 o Claro e e - - - - - - - - - incol | incol or, | or, visco|visco so | so

Tabela 32: Aparência de soluções em pH 7,5 SEQ ID Concentração (mg/ml) no |5]10[15]20]| 25 [30/35 [40[45[/50]55/60| 65 | Preci Clar pitad o, Car igeirCiaro, Ta" CS 7 A" [Claro Claro|Claro| Claro Jame|viscos|. 9º o nte| o |Viscjoe vise oso lincol oso or, visco so Preci Claro pitado) , lClaro, Clar transl Clar ligeir | ligeira o úcido ClarolClaro| ame |mente |. e o VISC|. nte |viscos incolo : oso visco| o Nr, so vviscos) o Precipi tado translú Clar cido, o Claro|Claro Claro) incolor viscos o Turv 21 OS Visco)| so Tabela 33: Aparência de soluções em pH 8,5 SEQ, Concentração (mg/ml)

ID o Precipitado | Precipitado translúcido ettranslúcido el Claro jClaro incolor, incolor, viscoso viscoso Claro, | Claro, Precipitado | Precipitado translúcido eftranslúcido el 8 | Claro |Claro Claro Claro incalar, incalar, - - viscoso viscoso

SEA Concentração (mambo [39 0ma fone] amo ms | o Janes turvo

ECICETENTENCNEIE EXEMPLO 8 - ESTUDO DE PRE-FORMULAÇÃO DA FORMA CSP7 (CONTRA-ÍON DE AMÔNIO)

[00228] A solubilidade da forma de contra-íon de amônio CSP7 puro (isto é, não moído) (Tabela 35) foi realizada adicionando quantidade em excesso de pó de peptídeo em 3 mL de diferentes tampões de pH (Tabela 36) e misturando em agitador orbital a 100 rom por 24 horas em temperatura ambiente.

[00229] Para o estudo de estabilidade de congelamento- descongelamento (Figura 33), 0,1 mg/mL de peptídeo de CSP7 (contra-íon de amônio) em sistema de tampão de fosfato (PBS, pH 7,4) foi aliquotado em 15 mL/frasco para congelamento rápido e lento, respectivamente. Para o congelamento rápido e lento, as amostras foram imersas em nitrogênio líquido por pelo menos 5 min ou colocadas em freezer a -20 ºC por pelo menos 1,5 horas para garantir que a alíquota no frasco fosse congelada completamente antes de ser descongelada à temperatura ambiente. Cada amostra foi submetida a 5 ciclos de congelamento e descongelamento. % de recuperação representa a porcentagem de cada concentração de amostra em comparação com a concentração original (não tratada).

[00230] As amostras de solubilidade e congelamento- descongelamento foram filtradas através de uma membrana de 0,45 um antes de serem testadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, Thermo Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Resumidamente, as amostras foram analisadas usando o sistema Dionex 3000 HPLC equipado com uma coluna WatersO de fase reversa C18 de 2,5 um, 150 mm x 4,60 mm. A coluna de HPLC foi aquecida a 60 ºC para teste e o peptídeo foi detectado em um comprimento de onda de 215 nm e uma taxa de fluxo de 1 mL/min. As duas fases móveis foram A (0,1% de ácido acético em água) e B (0,1% de ácido acético em acetonitrila). O volume de injeção foi de 20 vLea curva padrão foi traçada de 0,01 -1 mg/ml. TABELA 34: DETALHES DO MÉTODO HPLC. Separação 2,5Uum

E injeção 120 ul Et Mem execução 48 min Emo o coluna 60 ºC

SEP de onda 215 nm pb ho ho | Gradiente = Bot úúÚúÚúÚJillago Bo | BB ho ko | B1 bo ho | vB bo o | TABELA 35. PERFIL DE SOLUBILIDADE DE PH DE CSP7 (CONTRA-ÍON DE AMÔNIO). rã (mg/mL) 1 6 | oo 1 8 | os | 1 eo | 230 | TABELA 36: SISTEMA TAMPÃO E QUANTIDADE DE PEPTÍDEO DE CSP7 ADICIONADO EM TAMPÕES DE 3 ML EM CADA PH

IAdicione-X mg pH Sistema tampão —ja3ml 8 [100mM de citrato 4 N1OOomM de acetato [100 mM de acetato 6 [20mM de citrato 7? BomM de fosfato B —[100mM de Tris 9 f10O0mMdeTris carbonato 30 mg 25 mM de 11 jcarbonato —40mg EXEMPLO 9: CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DE ESTABILIDADE DO PÓ DE CSP7 (CONTRA-ÍON DE AMÔNIO) MOÍDO COMO LOTE * UTA181028

[00231] Um modelo 00 Jet-O-Mizer "" (também conhecido como Aljet mill, Fluid Energy, Telford, PA) foi usado para moer o peptídeo CSP7. A taxa de alimentação, pressão de impulso e pressão de moagem são 1 g/min, 60 psi e 70 psi, respectivamente (Tabela 37). O tamanho do lote é de g, e o pó moído é coletado de diferentes seções do moinho a jato, incluindo: o tubo após a câmara de moagem (bfC), o ciclone (C), o adaptador do recipiente de coleta (D), o adaptador do saco de coleta (E), a bolsa coletora (H) e o recipiente coletor (G). O pó coletado foi misturado durante 10 min usando um misturador Turbula (Glen Mills Inc., Clifton, NJ, EUA).

TABELA 37: PARÂMETROS PARA MOER PÓ CSP7 (CONTRA- ÍON DE AMÔNIO).

Pressão de impulso ,

[00232] Área de superfície específica do pó puro moído e do contra-íon de amônio CSP7. As áreas de superfície específicas de pó CSP7 moído e não processado são analisadas usando o Analisador de Área de Superfície Rápida Monosorb Modelo MS-21 (Quantachrome

Instruments, Boynton Beach, FL) com o método BET de ponto único (Figura 34). As amostras são liberadas de gás a 25 ºC com gás nitrogênio a 20 psi por 20-24 horas para remover água e outras moléculas de impureza da superfície. Uma mistura de nitrogênio/hélio (50:50 v/v) é usada como adsorvido, e o equipamento é calibrado com nitrogênio antes do teste.

[00233] Análise termogravimétrica do pó puro moído de CSP7 e do contra-íon de amônio. Usando o método descrito no parágrafo

[0021], exceto que a temperatura inicial foi de 35 ºC em vez de 25 ºC. Os resultados são mostrados na figura. 35.

[00234] Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) Imagens de pó de CSP7 (contra-íon de amônio) puro e moído. A morfologia de CSP7 (Figura 36) é analisado com Zeiss Supra 40VP SEM (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha). As amostras são montadas em pontas de SEM de alumínio por uma fita condutora de carbono e revestidas com 12 nm de platina/paládio (Pt/Pd) usando um aplicador de pulverização Cressington 208 HR (Cressington Scientific Instruments Ltd., Watford, Reino Unido). As imagens são tiradas para amostras puras (ou seja, não processadas) e pós-moagem de CSP7.

[00235] Estudo de estabilidade para CSP7 moído (contra-íon de amônio) do Lote t%! UTA181028. A estabilidade do pó de CSP7 moído foi investigada sob diferentes condições de armazenamento por um período de até 6 meses. O peptídeo de CSP7 moído é embalado em duas formas, pó moído a granel e pó moído encapsulado. Para armazenamento como pó moído a granel, 0,21-0,24 g de peptídeo é colocado em frascos de cintilação de 20 mL (KimbleG, DWK Life Sciences, Millville, NJ, EUA) e armazenado em uma bolsa de alumínio selada por calor (Impak Corp, Los Angeles, CA, EUA) contendo dois sacos de 1 g de dessecante de sílica gel (Tyvek6, Sorbco Packaging LLC, Belen, NM, EUA) em cada bolsa. O pó de peptídeo moído também é encapsulado em cápsulas de HPMC de tamanho 3 (Capsugel, Morristown, NJ, EUA) em um peso de cerca de 11 + 5% mg, e

22-26 cápsulas são então embaladas em frascos de HDPE (Drug Plastic, Boyertown, PA, EUA), seguido de selagem do frasco de HDPE dentro de uma bolsa de alumínio (sem dessecante). As embaladas são armazenadas em câmaras de estabilidade nas seguintes condições de armazenamento: - ºC, 25 ºC/60% UR e 40 ºC/75% UR. As amostras são removidas para teste em 1, 3 e 6 meses (Tabela 38). Para os testes, exceto a distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica, o pó encapsulado foi removido da cápsula e misturado em um frasco de vidro, girando o frasco. TABELA 38: CRONOGRAMA DE TESTES PARA ESTUDO DE ESTABILIDADE. escoa 6 ns SS 1-6 1-5 | 1 | Aparência Core aparência (aglomerado)| Visual | | 2 | Ensaão | %debalançodemassa | HPLC | [co RS | nosamenemea eo Lt 4 | GPSD | Dvio,50,90;1-5um% | LD | o e PART a [116 SAP caro es de crsnarizade xe * Siglas: HPLC: Cromatografia líquida de alta eficiência; KF-C: Karl Fischer Coulometric; GPSD: Distribuição geométrica do tamanho das partículas; LD: Difração de laser; APSD: Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica; NGI; Impactor de Próxima Geração; SEM: Microscópio Eletrônico de Varredura; XRPD: Difração de Pó de raios-X

[00236] Aparência do pó moído. A aparência do pó moído foi registrada por fotos tiradas com uma câmera normal (Figura 30).

[00237] Estabilidade química do peptídeo moído. Os pós foram analisados usando o método de HPLC descrito no Exemplo 8. Os resultados são mostrados abaixo na Tabela 39. A porcentagem representa a quantidade do ensaio em comparação com o balanço de massa. O ensaio foi ajustado para o teor de água. TABELA 39: ENSAIO DE CSP7 MOÍDO CONTRA-ÍON DE AMÔNIO POR HPLC EM ESTUDO DE ESTABILIDADE. a 2 | nosn | coesa | de -20 ºC 25 ºC/ 60UR 40 ºC/ 75UR Tempo | | voime SIP votume USD] vorume FUSO Bases EE It MERO + + + + + +

[00238] Teor de umidade do pó CSP. Coulometric Karl Fischer (Mettler Toledo C20 Leicester, OH, EUA) é usado para determinar o teor de umidade nos pós de peptídeo (Tabela 40). A confiabilidade do equipamento é testada com um padrão de teor de água Karl Fischer (padrão de água Hydranal TM, Honeywell, Charlotte, NC, EUA). Uma quantidade conhecida de pó é suspensa em metanol anidrato (Sigma, St. Louis, MO) e a suspensão é injetada na solução de anólito (Hydranal"y -Coulomat AG, H Honeywell, Charlotte, NC, EUA) para acionar a titulação no presença da solução de católito (Hydranal "" -Coulomat CG, H Honeywell, Charlotte, NC, EUA). O resultado é registrado como a diferença do teor de água na amostra subtraindo a solução de metanol anidro em branco. TABELA 40. TEOR DE UMIDADE EM AMOSTRAS DE PÓ DE ESTUDO DE ESTABILIDADE. pena O | neem | aroren de -20 ºC 25 ºC/ 60UR 40 ºC/ 75UR Tempo Volume | Encap. | Volume | Encap. | Volume | Encap.

Ponto de -20 ºC 25 ºC/ 60UR 40 ºC/ 75UR Tempo 4,18 +0.05% | — | Volume | Encap. | Volume | Encap. | Volume | Encap. | acl 4,31 | 4,904+ | 3,66 o

0.29% | 015% | 0.33% | 993% | 903% | 0.08% 3 4,56 + | 5,51 | 4,54+ | 5,86+ meses 0,31% | 0,37% | 0,08% | 0,14% 6 4,68+ | 5,61+ | 4,42+ | 5,/6+ | 4,71+ | 6,20+ meses| 0,08 0,27 0,32 0,06 0,21 0,18

[00239] Distribuição geométrica do tamanho das partículas. O GPSD do pó de CSP7 foi analisado antes e após a moagem usando um instrumento de difração a laser Sympatec HELOS (Sympatec GmbH, Alemanha) equipado com dispersão RODOS. As medições são feitas a cada 10 ms após a dispersão do pó a 3 bar. As medições que estão entre 5 e 25% da densidade óptica foram calculadas para determinar a distribuição do tamanho de partícula. Os tamanhos de partícula por volume são relatados em percentis de 10, 50 e 90 (por exemplo, Dv 10, Dv 50 e Dv 90), respectivamente, bem como as porcentagens de partículas caindo na faixa de tamanho de 1-5 um. Os resultados são mostrados em 41.

TABELA 41. DISTRIBUIÇÃO GEOMÉTRICA DE TAMANHO DE PARTÍCULA DE CSP7 MOÍDO (CONTRA-ÍON DE AMÔNIO) NO ESTUDO

DE ESTABILIDADE Dv 10 Dv 50 Dv 90 % 1-5 L TA18102 vao | EX e 1 mês 40 ºC/ : 74,1 + Encapsulado| -20 ºC 0,8+0 | 21+0 [4,8+0,1 o1

Dv 10 Dv 50 Dv 90 % 1-5 too somente — | MS | MR [NE 25ºC/ 73,6 + 40 ºC/ 72,8 + 25" | 9g40 [21+0,1 | 47+0,1 | SE 60UR 0,3 Volume 40 ºC/ ; Pr rageiaas 60 sá Encapsulado 40 ºC/ 73,9 TF vamo | EF meses 74,401 25ºC/ 40 ºC/

[00240] Distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica: À distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica foi avaliada realizando NGI como descrito no parágrafo [00215], exceto que o peso do pó na cápsula testada foi de 11+5% mg e o pré-separador foi removido na montagem do NGiI no estudo de estabilidade. Os resultados são dados na Tabela 42.

TABELA 42: DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULA AERODINÂMICA DE CSP7 MOÍDO (CONTRA-ÍON DE AMÔNIO) NO ESTUDO DE ESTABILIDADE.

Lote $UTA181028 FPF% A z 4,2 + [484 +|/92,8+| 3,09+ | 4,67 + Iniciar 8,3 + [93,8 +|83,5+| 1,58+ | 1,91 + 0,5 | 3,3 0,1 0,10 0,03

Lote gUTA181028 FPF% A 20º 8,0 + |88,8+| 84 + | 1,86+ | 1,86 + 0,4 | 2,9 1,4 0,16 0,02 25ºC/ 17,7 + | 92,2+/80,7+| 1,69+ | 1,86 + 1 mês 75UR | 03 | O6 1,4 0,08 0,02 ºC 7,3 + |87,8+/83,6+) 1,85+ | 1,91 + 01 0,3 1,8 0,03 0,01 25ºC/ |7,6+ 90,0 +/81,6+| 1,74+ | 1,90+ 40 ºC/ |7,9+ 89,6 +|84,7+| 1,80+ | 1,90+ 75UR | 0,3 1,8 1 0,15 0,02 Volume 60UR | 0,5 | 21 0,3 0,09 0,06 40 ºC/ 17,7 + 90,4 +/82,9+| 1,66+ | 1,91 + 3 75UR | 0,3 1,6 0,8 0,18 0,05 60UR | 0,3 | O8 1,9 0,05 0,01 Encapsulamento 492C/ T7,4+|87,6+|/834+| 1,83% | 1,92% 75UR | 0,3 | O6 2,5 0,06 0,03 20 ºC 7,2+| 87,1 +/79,1 +) 1,7/9+ | 1,900+ 0,1 1,5 1,6 0,10 0,01 Volum 25ºC/ |7,2+ 87,1 +/ 80,4 +| 1,85+ | 1,86 + otume 60UR | 02 | 1,8 | 21 | 008 | o01 40 ºC/ |7,3+ | 86,2+/81,9+| 1,86+ | 1,92+ 6 75UR | 01 0,8 1,2 0,01 0,06 meses 20 ºC 7,3 +/85,38+|80,9+| 1,90+ | 1,95+ 0,1 1,8 1,8 0,13 0,06 25ºC/ |7,4+ 87,9 +/80,0+| 1,77 + | 1,900+ 40 ºC/ |7,4+ | 85,6 +|/80,7 +) 1,81 + | 1,94 + 75UR | 00 | 2,7 11 0,11 0,03 Observação: IP: Porta de indução; FPD: Dose de partículas finas (partículas <5 um); FPF (%): Dose de partículas finas sobre a dose administrada

[00241] Cristalinidade dos pós de CSP7. A cristalinidade dos pós foi avaliada pelo método descrito no parágrafo [0018] e os resultados são mostrados na Figura 38.

[00242] Todos os métodos divulgados e reivindicados neste documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para os técnicos no assunto que variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência das etapas do método descrito neste documento, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste documento, enquanto os mesmos resultados ou resultados semelhantes seriam alcançados. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evidentes para os técnicos no assunto são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações anexas.

REFERÊNCIAS

[00243] As referências a seguir, na medida em que fornecem procedimentos exemplares ou outros detalhes complementares aos neste documento estabelecidos, são especificamente incorporadas neste documento por referência.

Carvalho et al., “Influence of particle size on regional lung deposition - What evidence is there?” Int. J. Pharma. 406:1-10, 2011.

Húbner, R.-H.; Gitter, W.; El Mokhtari, NE; Mathiak, M.; Both, M.; Bolte, EL; Freitag-Wolf, S.; Bewig, B. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques, 44, 507-11, 514- 7, 2008.

Surasarang et al., "Optimization of Formulation for a Novel Inhaled Candidate Therapeutic for Idiopathic Fibrosis", Drug Development and Industrial Pharmacy, 44 (2): 184-198, 2017.

Tepper, J. S.; Kuehl, P. J.; Cracknell, S.; Nikula, K. J.; Pei, L.; Blanchard, J. D. Resumo do Simpósio: “breathe In, Breathe Out, lts Easy:

What You Need to Know about Developing Inhaled Drugs.” Int.

J.

Toxicol. 35, 376-392, 2016.

Claims (80)

1. REIVINDICAÇÕES 1 Composição farmacêutica, caracterizada por compreender um pó seco de um peptídeo, o referido peptídeo compreendendo uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-20.
2. 2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo ter 7-20 aminoácidos de comprimento.
3. 3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
4. 4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo peptídeo compreender pelo menos um aminoácido adicionado ao N-terminal de um peptídeo da SEQ ID NO: 2.
5. 5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo peptídeo compreender pelo menos um aminoácido adicionado ao C-terminal de um peptídeo da SEQ ID NO: 2.
6. 6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo peptídeo compreender pelo menos um aminoácido adicionado ao N-terminal e ao C-terminal de um peptídeo da SEQ ID NO: 2.
7. 7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender L-aminoácidos.
8. 8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender D-aminoácidos.
9. 9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender ambos L- e D-aminoácidos.
10. 10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender pelo menos um resíduo deuterado.
11. 11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender pelo menos um aminoácido não padrão.
12. 12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo peptídeo compreender 2 aminoácidos não padrão.
13. 13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo aminoácido não padrão ser ornitina.
14. 14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender uma modificação N-terminal.
15. 15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender uma modificação C-terminal.
16. 16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender uma modificação N- e C-terminal.
17. 17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela modificação N-terminal ser acilação.
18. 18. “Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela modificação C-terminal ser amidação.
19. 19. . Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
20. 20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.
21. 21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.
22. 22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9.
23. 23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.
24. 24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.
25. 25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.
26. 26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
27. 27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.
28. 28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
29. 29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.
30. 30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
31. 31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.
32. 32. “Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17.
33. 33. “Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
34. 34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.
35. 35. “Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
36. 36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.
37. 37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda um peptídeo de penetração celular (CPP).
38. 38. “Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo CPP compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que compreende: GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 23) ROQOIKWFONRRMKWKK (SEQ |D NO: 2H) e GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQOQ (SEQ ID NO: 25).
39. 39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo peptídeo compreender pelo menos duas repetições de uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2-20.
40. 40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelas pelo menos duas repetições terem sequências de aminoácidos idênticas.
41. 41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelas pelo menos duas repetições terem sequências de aminoácidos diferentes.
42. 42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pó seco ser produzido por um processo de moagem.
43. 43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pó seco ser produzido por um processo de secagem por pulverização.
44. 44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pó seco ser produzido por moagem a jato de ar.
45. 45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pó seco ser produzido por moagem de bolas.
46. 46. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pó seco ser produzido por moagem úmida.
47. 47. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pó seco compreender menos do que 10% (em peso) de água.
48. 48. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pó seco compreender menos do que 1% (em peso) de água.
49. 49. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela composição farmacêutica ser essencialmente livre de excipientes.
50. 50. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pela composição farmacêutica ser livre de excipientes.
51. 51. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela composição farmacêutica ser formulada para liberação aos pulmões.
52. 52. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pela composição farmacêutica ser formulada para inalação de pó seco.
53. 53. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pela composição farmacêutica ser formulada para inalação por inalação de dose medida pressurizada.
54. 54. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela composição farmacêutica ser formulada para administração oral, administração tópica ou injeção.
55. 55. Dispositivo nebulizador, caracterizado por compreender uma composição farmacêutica, conforme definida nas reivindicações 1 a 51.
56. 56. Método para tratar um indivíduo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, conforme definida nas reivindicações 1 a 51.
57. 57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter um distúrbio inflamatório.
58. 58. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter uma condição fibrótica.
59. 59. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda, infecção pulmonar ou pulmão.
60. 60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo indivíduo ter inflamação pulmonar.
61. 61. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC).
62. 62. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter uma lesão pulmonar aguda ou infecção.
63. 63. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter uma infecção pulmonar.
64. 64. “Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter uma lesão pulmonar induzida por produtos químicos.
65. 65. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter bronquite plástica.
66. 66. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter asma.
67. 67. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA).
68. 68. “Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter lesão pulmonar aguda induzida por inalação de fumaça (ISALI).
69. 69. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter bronquiolite.
70. 70. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ter bronquiolite obliterante.
71. 71. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pela doença pulmonar ser uma condição fibrótica dos pulmões.
72. 72. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pela doença pulmonar ser uma doença pulmonar intersticial.
73. 73. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pela doença pulmonar ser Fibrose Pulmonar Idiopática (FPI) ou cicatrização pulmonar.
74. 74. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pela administração compreender a inalação de pó seco.
75. 75. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pela administração compreender nebulizar uma solução compreendendo o polipeptídeo variante.
76. 76. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado por compreender ainda administrar pelo menos um terapêutico antifibrótico adicional.
77. 77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado por o pelo menos um antifibrótico adicional ser AINE, esteróide, DMARD, imunossupressor, moduladores de resposta biológica ou broncodilatador.
78. 78. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo indivíduo ser um ser humano.
79. 79. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender um peptídeo das SEQ ID Nos: 2-20 formulado em um pó seco moído tendo um tamanho de partícula respirável.
80. 80. Método para tratar um indivíduo, caracterizado por compreender administrar uma quantidade eficaz de uma composição, conforme definida na reivindicação 79, ao indivíduo por inalação.