CN112996530A - 小窝蛋白-1肽的干粉制剂及其使用方法 - Google Patents

小窝蛋白-1肽的干粉制剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了包含小窝蛋白‑1(Cav‑1)肽的组合物。还提供了使用Cav‑1肽治疗肺部感染或者急性或慢性肺损伤，特别是肺纤维化的方法。

Description

小窝蛋白-1肽的干粉制剂及其使用方法
本申请要求2018年9月10日提交的美国临时专利申请No.62/729,010的权益，通过援引以其全文并入本文。
本发明是在联合研究协议范围内开展的活动的结果，该协议在制定本发明时已经生效。所述联合研究协议的当事方是德克萨斯大学系统与肺治疗学董事会。
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学、药学和医学领域。更具体地，本发明涉及用于将干粉治疗多肽组合物递送至受试者，诸如通过递送至呼吸系统的组合物和方法。
背景技术
在肺损伤期间，p53表达增加，诱导纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)，同时抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)的表达，导致肺上皮细胞(LEC)凋亡。损伤的机制涉及uPA、uPAR、小窝蛋白-1(“Cav-1”)和β1-整联蛋白之间的细胞表面信号传导相互作用(Shetty等人，2005)。调节这些相互作用的组合物可用于抑制受伤、患病或受损组织凋亡的方法中。例如，用于治疗炎症或纤维化病症，诸如肺纤维化。因此，需要可用于预防或治疗肺损伤和疾病的多肽，尤其是用于治疗递送此类多肽的稳定制剂和简单方法。
发明内容
根据本公开，提供了一种肽的干粉组合物，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在第一个实施例中，提供了一种药物组合物，其包含肽的干粉，所述肽包含如下序列中任一个：SEQ ID NO:2-20。在一些方面，该肽的长度为7-20个氨基酸。在一个特定方面，该肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在其他方面，该肽包含添加至SEQ ID NO:2的肽的N-末端的至少一个氨基酸。在其他方面，该肽包含添加至SEQ ID NO:2的肽的C-末端的至少一个氨基酸。在另一方面，该肽包含添加至SEQ ID NO:2的肽的N-末端和C-末端的至少一个氨基酸。在某些方面，该肽可包含L-氨基酸或D-氨基酸或L-氨基酸和D-氨基酸两者。在其他方面，该肽可包含至少一个非标准氨基酸。在几个方面，该肽包含2个非标准氨基酸。在一个特定方面，该非标准氨基酸为鸟氨酸。
在其他方面，该肽可包含N-末端修饰或C-末端修饰或N-末端修饰和C-末端修饰两者。在一个特定方面，该N-末端修饰为酰化。在另一方面，该C-末端修饰为酰胺化。
在一些方面，该肽可包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在几个方面，该肽包含SEQ ID NO:2-20中的任何一个的序列的至少两个重复。在特定方面，该至少两个重复具有相同的氨基酸序列。在其他方面，该至少两个重复具有不同的氨基酸序列。在其他方面，该药物组合物另外包含细胞穿透肽(CPP)。在某些方面，该CPP包含选自包括以下项的组的氨基酸序列：GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:23)、RQIKIWFONRRMKWKK(SEQ ID NO:24)和GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:25)。
在其他方面，该干粉通过研磨工艺生产。在几个方面，该干粉通过喷雾干燥工艺生产。在替代方面，该干粉通过喷气研磨、球磨或湿磨生产。在一些方面，该干粉包含少于10％(重量计)的水。在另一方面，该干粉包含少于1％(重量计)的水。在某些方面，该药物组合物基本上不含赋形剂。在一个特定方面，该药物组合物不含赋形剂。在特定方面，该药物组合物配制用于肺部递送。在另一方面，该药物组合物配制用于干粉吸入。在其他方面，该药物组合物配制用于吸入加压计量吸入。在一些方面，该药物组合物配制用于口服施用、局部施用或注射。
在某些方面，实施例的干粉制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％或5％的水含量。在其他方面，组合物包含约0.01％至约10％、0.1％至约10％、1.0％至约8％或1％至约5％的水含量。在其他方面，实施例的干粉制剂包含小于10μm的平均粒度。在某些方面，平均粒度为约0.01pm至约10μm；约0.1μm至约8μm；约0.5μm至约7μm或约1μm至约5μm。在一些方面，实施例的干粉组合物的至少约50％、55％、60％、65％或70％包括约1μm至约5μm的粒度。在某些方面，实施例的肽的干粉制剂(例如，CSP7)由具有约1μm至约5μm的粒度的至少70％(例如，70％-80％)的颗粒组成。在优选的方面，干粉制剂中至少约70％、75％、80％或85％(例如，75％-95％)的颗粒粒度小于5μm。
本发明进一步的实施例提供了一种喷雾器装置，其包括上述实施例和方面的药物组合物。
在又一实施例中，提供了一种治疗受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的上述实施例和方面的药物组合物，给予该受试者。在某些方面，该受试者患有炎性疾患。在其他方面，该受试者患有纤维化病症。在几个方面，该受试者患有肺部炎症、急性肺损伤、肺部感染或肺部。在另一方面，该受试者患有肺部炎症。在一个特定方面，该受试者患有慢性阻塞性肺疾患(COPD)。在其他方面，该受试者可患有急性肺损伤或感染、肺部感染、化学诱导的肺损伤、塑型性支气管炎、哮喘、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、吸入烟气诱发的急性肺损伤(ISALI)、细支气管炎或闭塞性细支气管炎。在特定方面，该肺部疾病是肺部的纤维化病症、间质性肺部疾病或特发性肺纤维化(IPF)或肺部瘢痕形成。在其他方面，该施用包括干粉吸入。在其他方面，该施用包括雾化包含变体多肽的溶液。
在其他方面，该方法另外包括施用至少一种附加抗纤维化治疗剂。在某些方面，该至少一种附加抗纤维化治疗剂为NSAID、类固醇、DMARD、免疫抑制剂、生物反应调节剂或支气管扩张剂。在几个方面，该受试者为人。
本发明的又一进一步的实施例提供了一种药物组合物，其包含SEQ ID No:2-20的肽，该肽配制为具有可吸入粒度的研磨的干粉。例如，在某些方面，研磨的干粉包含小于约10微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)。用于确定MMAD的方法例如在Carvalho等人，2011中提供，其通过援引并入本文。
在又一实施例中，提供了一种治疗受试者的方法，该方法包括通过吸入向受试者施用有效量的实施例的组合物。
根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，虽然指示了本发明的优选实施例，但是详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出，因为通过此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成了本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合在此呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1：CSP7散装粉末的扫描电子显微镜图像。将粉末样品溅射在样品盘上，并通过吹入压缩氮气进行散布。使用Hitachi S5500 SEM/STEM扫描电子显微镜观察样品。比例尺显示在图像的右下方。
图2：CSP7散装粉末的光学显微镜图像。将粉末样品溅射在载玻片上，并使用Leica光学显微镜(Leica CTR6500)进行观察。比例尺显示在每个图像的左下角。箭头指向纯CSP7粉末的团聚颗粒。
图3：CSP7散装粉末颗粒的X射线粉末衍射。使用X射线粉末衍射对CSP7散装粉末颗粒进行评估，以确定结晶度。使用0.025 2θ度的步长和2度/min的速度在2至40 2θ度之间测量粉末。
图4：CSP7散装粉末的偏振光显微镜。通过偏振光显微镜评估结晶度。图中是代表性图像。白色箭头指向结晶区域。
图5：CSP7散装粉末的差示扫描量热法。使用TA仪器Q20差示扫描量热法通过差示扫描量热法分析散装CSP7粉末。图中是调制DSC的曲线，其频率为1℃/60s，并且速率为2℃/min，从25℃升至300℃。
图6：CSP7散装粉末的热重分析。热重分析是使用型号为TGA/DSC的Mettler热重分析仪进行的。图中是TGA曲线。加热速率设定为10℃/min，从25℃升至500℃。
图7：CSP7散装粉末的动态蒸气吸附。在表面测量系统DVS仪器上运行散装CSP7粉末，在25℃以10％的步长从0％到90％相对湿度进行完整的吸附/解吸循环。显示了在0％湿度下的水分解吸和在90％湿度下的质量变化。
图8：喷雾干燥的CSP7的粒度分布。将CSP7与亮氨酸、海藻糖、柠檬酸钠或亮氨酸和海藻糖混合，并喷雾干燥。粒度通过Malvern Mastersizer 2000(激光衍射，Fraunhofer近似；分散气压：3.0Bar)来评估。图中是每种喷雾干燥混合物的曲线。
图9：目视观察均质的CSP7悬浮液。A.用最大转子定子功率处理乙醇1分钟；B.未处理的CSP7-乙醇悬浮液，红色箭头表示大颗粒/聚集体；C.以最大转子定子功率处理CSP7-乙醇悬浮液1分钟，悬浮液变为深灰色；D.用最小转子定子功率处理CSP7-乙醇悬浮液1分钟，悬浮液变成浅灰色。
图10：喷气研磨的CSP7粉末的光学显微镜。从喷气研磨机的指定位置收集的粉末样品通过光学显微镜成像。图中是代表性图像。
图11：喷气研磨的CSP7粉末的扫描电子显微镜。在与散装CSP7粉末相同的条件下，通过扫描电子显微镜(SEM)使研磨的CSP7粉末(批号171027)成像。图中是研磨的CSP7粉末的代表性SEM图像。
图12：薄膜冻结后的CSP7光学显微镜。将粉末样品溅射在载玻片上，并使用Leica光学显微镜(Leica CTR6500)进行观察。比例尺显示在每个图像的左下角。
图13：喷雾干燥的CSP7的扫描电子显微镜。使用SEM检查了喷雾干燥的CSP7混合物(A＝100％LTI、B＝亮氨酸、C＝海藻糖、d＝柠檬酸钠、e＝亮氨酸和海藻糖)的颗粒形态。代表性图像如图。
图14：喷气研磨的CSP7粉末的X射线粉末衍射。示出了研磨的(批号171027)和未处理的散装CSP7粉末的X射线粉末衍射图。衍射曲线表明，研磨的CSP7的结晶度降低。
图15：喷雾干燥的CSP7的物理状态。通过X射线衍射检查喷雾干燥的CSP7混合物。示出了指示每种喷雾干燥的CSP7混合物的结晶度或缺乏结晶度的曲线。
图16：喷雾干燥的CSP7的HPLC分析。通过使用HPLC测定其化学效力来检查喷雾干燥的CSP7混合物的纯度。
图17：喷气研磨的CSP7稳定性的HPLC分析。通过使用HPLC测定其化学效力来检查未处理的散装CSP7粉末以及喷气研磨的CSP7(批号171027)的稳定性。将每种的样品在打开/关闭小瓶盖的3种不同条件下(4℃,25℃/60RH,40℃/75RH)进行存储，然后在存储5、15和32天测定化学效力。
图18：气雾化CSP7的颗粒沉积。使用下一代冲击器(NGI)雾化后，所有收集表面均用已知体积的20mM Tris缓冲液(pH 10.3)冲洗。分别提取并测量在喉管、预分离器和1-MOC级中沉积的粉末。指示的是沉积在特定位置的未处理或喷气研磨(从收集容器中收集)(批号171013)的CSP7粉末的百分比。
图19：喷气研磨的CSP7的空气动力学粒度分布。使用下一代冲击器(NGI)雾化后，所有收集表面均用已知体积的20mM Tris缓冲液(pH 10.3)冲洗。分别提取并测量在胶囊、装置、适配器、喉管、预分离器和1-MOC级中沉积的粉末。确定了磨机中未处理或喷气研磨的(批号171027)CSP7粉末(从研磨粉末的所有级分收集)的位置。示出了在每个位置存在的研磨粉末的百分比。
图20：喷雾干燥的CSP7混合物的气雾性能。通过NGI雾化后，所有收集表面均用已知体积的20mM Tris缓冲液(pH 10.3)冲洗。分别提取并测量在胶囊、装置、适配器、喉管、预分离器和1-MOC级中沉积的粉末。指示的是粉末在特定位置沉积的百分比。
图21：喷气研磨的CSP7粉末的动态蒸气吸附。在表面测量系统DVS仪器上运行研磨的CSP7粉末(批号171027)，在25℃以10％的步长从0％到90％相对湿度进行完整的吸附/解吸循环。显示了在0％湿度下的水分解吸和在90％湿度下的质量变化。
图22：喷气研磨的CSP7粉末的热分析。使用如上所述的量热计，在研磨的CSP7(批号171027)上进行差示扫描量热法(DSC)。图中显示的是DSC的曲线，其频率为1℃/60s，速率为2℃/min，从25升至300℃。
图23：喷雾干燥的100％CSP7的热学性质。通过调制差示扫描量热法分析无赋形剂喷雾干燥的CSP7。图中是mDSC曲线。
图24：具有亮氨酸的喷雾干燥的CSP7的热学性质。通过调制差示扫描量热法分析包含25％亮氨酸的喷雾干燥的CSP7混合物。图中是mDSC曲线。
图25：具有海藻糖的喷雾干燥的CSP7的热学性质。通过调制差示扫描量热法分析包含25％海藻糖的喷雾干燥的CSP7混合物。图中是mDSC曲线。
图26：具有柠檬酸钠的喷雾干燥的CSP7的热学性质。通过调制差示扫描量热法分析包含25％柠檬酸钠的喷雾干燥的CSP7混合物。图中是mDSC曲线。
图27：具有亮氨酸和海藻糖的喷雾干燥的CSP7的热学性质。通过调制差示扫描量热法分析包含15％亮氨酸和10％海藻糖的喷雾干燥的CSP7混合物。图中是mDSC曲线。
图28：所有喷雾干燥的CSP7混合物的热学性质。通过mDSC分析每种制造的喷雾干燥的CSP7混合物。图中是这些粉末的所有mDSC曲线。
图29：小鼠解剖肺组织的湿重。解剖安乐死的小鼠，取出其肺并称重。小鼠经盐水处理、博来霉素处理以诱导肺纤维化，或博来霉素处理并用CSP7肽处理12分钟或60分钟。
图30：鼠肺组织的胶原蛋白含量。将未处理的、博来霉素处理的、或博来霉素和CSP7处理的肺组织均质化，并使用Quickzyme胶原蛋白测定法分析胶原蛋白含量。该图描绘了肺的总胶原蛋白含量。
图31：鼠肺组织的Ashcroft评分。将未处理的、博来霉素处理的、或博来霉素和CSP7处理的肺组织均质化，并使用Quickzyme胶原蛋白测定法分析胶原蛋白含量。Ashcroft评分的确定如Hubner等人2008所述，通过援引并入本文。该图描绘了肺的总胶原蛋白含量。
图32：鼠肺组织的胶原蛋白含量。将未处理的、博来霉素处理的、或博来霉素和CSP7处理的肺组织均质化，并使用Quickzyme胶原蛋白测定法分析胶原蛋白含量。该图描绘了肺的总胶原蛋白含量。
图33：在最多5个冻融循环后，CSP7(铵抗衡离子)的稳定性。
图34：研磨的纯CSP7(铵抗衡离子)粉末的比表面积。
图35：研磨的纯CSP7(铵抗衡离子)粉末的热重分析。
图36：研磨的纯CSP7(铵抗衡离子)粉末的SEM图像。
图37：稳定性研究中，研磨的CSP7(铵抗衡离子)粉末的外观。
图38：稳定性研究中，研磨的CSP7(铵抗衡离子)的结晶度。
具体实施方式
Ⅰ.定义
如本文中所使用的，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于指未将特定组分故意配制到组合物中和/或特定组分仅作为污染物或以量痕存在。因此，由组合物的任何意外污染而产生的特定组分的总量远低于0.01％。最优选的是使用标准分析方法无法在其中检测出特定组分的量的组合物。
如本说明书中所使用的，“一”或“一个(种)”可指一个(种)或多个(种)。如本文在权利要求中所使用的，当与字词“包括”结合使用时，字词“一”或“一个(种)”可以表示一个(种)或多于一个(种)。
除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是互斥的，否则权利要求中的术语“或”的使用是指“和/或”，尽管本公开内容支持仅涉及替代方案及“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可以表示至少第二或更多者。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的设备、方法的固有误差变化或研究对象之间存在的变化。除非另有说明，否则“约”是指+/-10％。
如本文所用，术语“肽”通常是指由通过肽键连接的氨基酸的单链组成的氨基酸序列。通常，除非另有定义，否则肽包含至少两个氨基酸残基并且长度小于约50个氨基酸。在一些方面，可以向肽提供抗衡离子。同样，在某些情况下，肽可包括N和/或C-末端修饰，诸如减少降解的封闭修饰。
“生物学活性的”小窝蛋白-1(Cav-1)肽是指这样的肽，其增加p53蛋白水平，降低尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和uPA受体(uPAR)和/或增加纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)在细胞诸如纤维化肺成纤维细胞中表达。在一些方面，生物学活性肽具有如下序列的天然Cav-1多肽的至少20％的生物学或生化活性：SEQ ID NO:1(例如，通过体外或体内测定法测量)。在一些方面，与天然Cav-1多肽相比，生物学活性肽具有相同或增加的生物学或生化活性。
术语“同一性”或“同源性”应解释为意指在比对序列并引入空位(如果必要)以获得整个序列的最大同一性百分比之后，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分，在候选序列中与被比较的相应序列的残基相同的氨基酸残基的百分比。N-或C-末端的延伸或插入均不应解释为减少同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的。序列同一性可以使用序列分析软件来测量。
广义上，术语“多肽”或“蛋白质”是指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。亚基可以通过酰胺键连接。在另一个实施例中，亚基可以通过其他键连接，例如通过酯键、醚键连接。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和D或L旋光异构体两者，以及氨基酸类似物和拟肽。术语“拟肽(peptidomimetic,peptide mimic)”是指根据本发明的肽以这样的方式被修饰，其包括至少一个非肽键，诸如，例如尿素键、氨基甲酸酯键、磺酰胺键、肼键或任何其他共价键。如果肽链短，则三个或三个以上氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链长(例如，长于50个氨基酸)，则该肽通常称为多肽或蛋白质。
术语“受试者”和“个体”和“患者”在本文可互换使用，并且是指对其使用本文公开的药物组合物进行包括预防性治疗在内治疗的动物，例如人类或非人类动物(例如，哺乳动物)。如本文所用，术语“受试者”是指人类和非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，诸如非人类灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛和非哺乳动物，诸如鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个实施例中，受试者是人类。在另一个实施例中，受试者是作为疾病模型的实验动物或动物替代品。非人类哺乳动物包括哺乳动物，诸如非人类灵长类动物(特别是高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔和牛。在一些方面，非人类动物是伴侣动物，诸如狗或猫。
“治疗”受试者的疾病或病症或“治疗”患有疾病或病症的患者是指使个体接受药物治疗，例如施用药物，诸如以使该疾病或病症的至少一种症状减少或稳定。通常，当将该肽作为治疗剂进行治疗性施用时，将其施用于表现出一种或多种肺损伤或肺纤维化症状的受试者。
“分离的”是指多肽已与任何天然环境诸如体液(例如，血液)分离，并与天然伴随多肽的组分分离。
分离的和“基本上纯的”是指已经从天然伴随的组分中分离并纯化了至少一些程度的多肽。通常，当多肽按重量计至少约60％、或至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或甚至至少约99％，不含蛋白质和与之天然结合的天然有机分子，则基本上是纯的。例如，可以通过从天然来源提取、通过在通常不表达该蛋白质的细胞中表达重组核酸或通过化学合成，来获得基本上纯的多肽。
本文所用的术语“变体”是指与所述多肽不同的多肽，其区别在于一个或多个氨基酸的缺失、添加、取代或侧链修饰，但保留了天然分子的一种或多种特定功能或生物学活性。氨基酸取代包括其中氨基酸被不同的天然存在或非常规氨基酸残基取代的改变。这样的取代可以被分类为“保守的”，在这种情况下，多肽中包含的氨基酸残基被在极性、侧链功能或大小方面具有相似特征的另一种天然存在的氨基酸取代。这样的保守取代是本领域众所周知的。本发明涵盖的取代也可以是“非保守的”，其中存在于肽中的氨基酸残基被具有不同特性的氨基酸取代，诸如来自不同基团的天然存在的氨基酸(例如，用丙氨酸取代带电荷的或疏水的氨基酸)；替代性地，其中天然存在的氨基酸被非常规氨基酸取代。在一些实施例中，氨基酸取代是保守的。当涉及多核苷酸或多肽使用时，术语变体中还包涵的是指分别与参考多核苷酸或多肽相比(例如，与野生型多核苷酸或多肽相比)可以改变一级、二级或三级结构的多核苷酸或多肽。
术语“插入”或“缺失”通常在约1个至5个氨基酸的范围内。允许的变体可以通过合成产生肽来实验确定，同时使用重组DNA技术在序列中系统地进行核苷酸的插入、缺失或取代。
当涉及肽时，术语“取代”是指针对不同实体(例如另一种氨基酸或氨基酸部分)的氨基酸的变化。取代可以是保守或非保守取代。
分子诸如肽的“类似物”是指功能与整个分子或其片段相似的分子。术语“类似物”也旨在包括等位基因物种和诱导的变体。类似物通常在一个或几个位置上与天然存在的肽不同，这通常是由于保守取代。类似物通常表现出与天然肽至少80％或90％的序列同一性。一些类似物还包括非天然氨基酸或N或C末端氨基酸的修饰。非天然氨基酸的实例是，例如但不限于：非取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸。可以如下所述在转基因动物模型中筛选片段和类似物的预防或治疗功效。
“共价键合”是指通过共价化学键直接或间接(例如，通过连接基)连接。在本发明所有实施例的一些方面，融合肽是共价键合的。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指两种或更多种蛋白的重组蛋白。融合蛋白可以例如通过将编码一种蛋白的核酸序列与编码另一种蛋白的核酸连接而产生，从而它们构成单个开放阅读框，该阅读框可以在细胞中翻译成具有所有预期蛋白质的单个多肽。蛋白质的排列顺序可以变化。融合蛋白可以包括表位标签或半衰期延长剂。表位标签包括生物素、FLAG标签、c-myc、血凝素、His6、地高辛、FITC、Cy3、Cy5、绿色荧光蛋白、V5表位标签、GST、β-半乳糖苷酶、AU1、AU5和亲和素蛋白。半衰期延长剂包括Fc结构域和血清白蛋白。
术语“气道”在本文中是指呼吸道的任何部分，包括上呼吸道、呼吸道和肺。上呼吸道包括鼻子和鼻腔、嘴巴和喉咙。呼吸气道包括喉、气管、支气管和细支气管。肺部包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡。
术语“吸入烟气引起的急性肺损伤”和“ISALI”在本文中可互换使用，是指由吸入烟气引起的急性肺损伤(ALI)的一种形式。ALI也被称为“轻度急性呼吸窘迫综合征；ARDS。”可以通过在受试者中发现以下一个或多个病症来定义ARDS：1)胸部X光片显示双侧肺部浸润；2)根据临床指示通过右心导管测量时，肺毛细血管楔压<18mmHg(2.4kPa)；和3)PaO2/FiO2<300mmHg(40kPa)。在一些实施例中，ISALI的治疗包括对以下病症中的一种或多种的治疗：氧合减少、气道阻塞(包括严重的气道阻塞)、纤维状气道铸型或碎屑、以及肺泡纤维蛋白沉积。
术语“喷气研磨机”是指一种装置或方法，其通过使用压缩气体的射流使颗粒彼此碰撞从而粉碎颗粒来减小粒度。喷气研磨机可用于减小肽颗粒的尺寸。执行相同功能的其他机械研磨装置也可以与喷气研磨机互换使用。喷气研磨可以在各种环境参数下进行，诸如温度、压力、相对/绝对湿度、氧含量等。
术语“球磨机”是指通过将目标颗粒和研磨介质添加到圆筒的内部并旋转圆筒来减小粒度的装置或方法。随着研磨介质的旋转，当研磨介质沿圆柱体的外部上升和下降时，目标颗粒会分解。球磨机可用于减小肽颗粒的尺寸。执行相同功能的其他机械研磨装置也可以与喷气研磨机互换使用。
术语“湿式研磨机”或“介质研磨机”是指通过将目标颗粒添加到带有搅拌器的装置中以减小粒度的装置或方法，其含有包含液体和研磨介质的介质。随着目标颗粒的添加，随着搅拌器的旋转，其分散的能量导致研磨介质和目标颗粒接触并分解目标颗粒。执行相同功能的其他机械研磨装置也可以与喷气研磨机互换使用。
术语“高压均质化”是指通过将目标颗粒添加到组合了压力和机械力以分解目标颗粒的装置中来减小粒度的方法。高压均质化中使用的机械力可能包括冲击、剪切和空化等。执行相同功能的其他机械研磨装置也可以与喷气研磨机互换使用。
术语“低温研磨机”是指通过首先用干冰、液氮或其他低温液体冷却目标颗粒，然后研磨目标颗粒以减小尺寸来减小粒度的装置或方法。执行相同功能的其他机械研磨装置也可以与喷气研磨机互换使用。
短语“有效量”或“治疗性有效”是指足以产生所需治疗结果的药物或药剂的剂量。期望的治疗结果可以是剂量接受者的主观或客观改善、感染减少、炎症减少、肺生长增加、肺修复增加、组织水肿减少、DNA修复增加、细胞凋亡减少、肿瘤大小减少、癌细胞生长速度减少、转移的减少、或以上各项的任何组合。
如本文所用，“赋形剂”是指药用载体，其是相对惰性的物质，用于促进将活性药物成分(API)施用或递送至受试者中，或用于促进API加工成可药用的药物制剂以递送给受试者的作用部位。赋形剂或药用载体包括剂型中除活性成分外的所有非活性组分。赋形剂的非限制性实例包括载体剂、填充剂、稳定剂、表面活性剂、表面改性剂、溶解度增强剂、缓冲剂、包囊剂、抗氧化剂、防腐剂、非离子润湿或澄清剂、增粘剂和吸收增强剂。“不含赋形剂”是指不含任何赋形剂的制剂形式的目标药物组合物。
术语“药物组合物”或“药用组合物”是指分子实体和组合物在适当地施用于动物(诸如人)时，不产生不利的、过敏的或其他不良反应。根据本公开，包含Cav-1肽诸如CSP7或额外活性成分的药物组合物的制备对于本领域普通技术人员而言是已知的。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制剂应符合FDA或其他认证管理机构要求的生物负载、无菌性、热原性、一般安全性和/或纯度标准。
如本文所用，如本领域普通技术人员已知的，“药用载体”包括任何和所有赋形剂、加工助剂、水溶剂(例如，水、酒精/水溶液、盐水溶液、诸如氯化钠、林格氏葡萄糖等的非肠道载体)、非水溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和诸如油酸乙酯的可注射有机酯)、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、崩解剂、润滑剂、味道调节剂(例如，甜味剂、调味剂)等材料及其组合。根据已知参数调整药物组合物中各成分的pH值和准确浓度。在一些方面，载体可以封装治疗剂，但本身不被消耗或施用给受试者(例如，包裹干粉组合物的壳胶囊，诸如用于干粉吸入器中)。
II.小窝蛋白-1肽
本公开的实施例提供了小窝蛋白-1(Cav-1)肽的干粉制剂。小窝蛋白-1(Cav-1)支架结构域或肽干扰Cav-1与Src激酶的相互作用，模仿uPA和抗β1整联蛋白抗体的组合效应。天然人Cav-1的长度为178个氨基酸，且分子量为22kDa。Cav-1的氨基酸序列如下所示(SEQID NO：1)。
Figure BDA0003052539720000142
在一些方面，该肽是支架结构域肽，其包含与如下序列具有至少约40％、50％、60％、70％、80％、85％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，FTTFTVT。相对于SEQ ID NO：1的序列，诸如得到3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个残基的多肽，该肽可包含1、2、3、4或更多个氨基酸取代、缺失或插入。在特别方面，该肽是截短的天然Cav-1多肽，诸如表1中所示的示例性肽。
表1：示例性的Cav-1肽。
Figure BDA0003052539720000141
Figure BDA0003052539720000151
(a＝D-丙氨酸，O＝鸟氨酸)
本公开中提供的肽是生物学活性衍生物，其在体外或体内结合或生物学活性测定中具有天然Cav-1多肽的活性。在特别方面，该肽在体外或体内抑制或预防由博来霉素诱导的肺上皮细胞(LEC)的凋亡，其活性为天然Cav-1多肽活性的至少约20％、或至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、约95％、97％、99％以及其中可衍生的任何范围，诸如例如从约70％至约80％、且更优选约81％至约90％；或甚至更优选约91％至约99％。该肽可具有100％的天然CAV-1多肽活性或甚至更高的活性。用于测试生物学活性例如抗纤维化活性，影响uPA、uPAR和PAI-1mRNA的表达的能力，或抑制肺成纤维细胞增殖的能力的测定法是本领域众所周知的。
本公开的肽是天然Cav-1多肽或其修饰形式的肽。肽可以是使用本领域众所周知的方法分离或产生的合成、重组或化学修饰的肽。可以对N-末端、C-末端或内部的氨基酸进行修饰。N-末端修饰可以是例如但不限于酰化、乙酰化或C-末端酰胺化。肽可包括保守或非保守氨基酸变化，如下所述。多核苷酸的变化可导致参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。肽还可以包括氨基酸的插入、缺失或取代，其包括在作为肽基础的氨基酸序列中通常不出现的氨基酸(和其他分子)的插入和取代，例如但不限于插入L-氨基酸，或非标准氨基酸(诸如鸟氨酸)，其通常不会在人类蛋白质中出现。当描述肽时，术语保守取代是指肽的氨基酸组成的改变，其基本上不改变肽的活性。例如，保守取代是指用氨基酸残基代替具有相似化学性质的不同氨基酸残基。保守氨基酸取代包括用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸，用谷氨酸替代天冬氨酸，或用丝氨酸替代苏氨酸。
保守氨基酸取代是通过用一种具有相似结构和/或化学性质的氨基酸替换另一种氨基酸而产生的，诸如用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸，用谷氨酸替换天冬氨酸，或用丝氨酸替换苏氨酸。因此，特定氨基酸序列的保守取代是指对多肽活性不是关键的那些氨基酸的取代，或用具有相似特性(例如，酸性、碱性、带正电或带负电、极性或非极性)的其他氨基酸取代氨基酸，这样即使是关键氨基酸的取代也不会降低肽的活性。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。例如，以下六个组各自包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(另请参见Creighton,Proteins,W.H.Freeman andCompany(1984)，通过援引以其全文并入。)在一些实施例中，如果更改不降低肽的活性，则改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加也可以被认为是保守取代。插入或缺失通常在约1个至5个氨基酸的范围内。保守氨基酸的选择可以基于要被取代的氨基酸在肽中的位置进行选择，例如，如果氨基酸在肽的外部并暴露于溶剂，或在内部而不暴露于溶剂。
在替代实施例中，可以基于现有氨基酸的位置，即其暴露于溶剂中(即，如果与未暴露于溶剂的在内部的氨基酸相比，该氨基酸暴露于溶剂中或存在于肽或多肽的外表面上)，选择将替代现有氨基酸的氨基酸。此类保守氨基酸取代的选择是本领域众所周知的，例如Dordo等人，J.MolBiol,1999,217,721-739和Taylor等人，J.Theor.Biol.119(1986)；205-218和S.French与B.Robson,J.Mol.Evol.19(1983)171。因此，可以选择适合于蛋白质或肽外部的氨基酸(即暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸取代，例如但不限于，可以使用以下取代：用F取代Y、用S或K取代T、用A取代P、用D或Q取代E、用D或G取代N、用K取代R、用N或A取代G、用S或K取代T、用N或E取代D、用L或V取代I、用Y取代F、用T或A取代S、用K取代R、用N或A取代G、用R取代K、用S、K或P取代A。
在替代实施例中，还可以选择适用于蛋白质或肽内部的氨基酸的保守氨基酸取代，例如，可以对蛋白质或肽内部的氨基酸(即氨基酸酸不暴露在溶剂中)使用适当的保守取代，例如但不限于，可以使用以下保守取代：其中用F取代Y、用A或S取代T、用L或V取代I、用Y取代W、用L取代M、用D取代N、用A取代G、用A或S取代T、用N取代D、用L或V取代I、用Y或L取代F、用A或T取代S、用S、G、T或V取代A。在一些实施例中，术语“变体”也涵盖非保守氨基酸取代。
在一些方面，多肽是天然Cav-1多肽的衍生物。如本文所用，术语“衍生物”是指已经化学修饰的肽，例如但不限于通过诸如乙酰化、泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)、脂化、糖基化、酰胺化或添加其他分子。当一个分子包含通常不是另一分子一部分的其他化学部分时，它也是另一个分子的“衍生物”。这样的部分可以改变pH或改善分子的稳定性、溶解性、吸收性、生物半衰期等。这些部分可以替代性地降低分子的毒性，消除或减轻分子的任何不良副作用等。介导这种作用的方法在Remington's PharmaceuticalSciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPubl.,Easton,PA(1990)中公开，通过援引以其全文并入本文。
与“衍生物”或“变体”结合使用时，术语“功能性”是指具有与该实体或分子的生物学活性基本相似的生物学活性(功能性或结构性)的本发明的多肽，它是其功能衍生物或其功能变体。术语功能衍生物旨在包括分子的片段、类似物或化学衍生物。
在一些方面，可以在多肽的一个或多个位置上进行氨基酸取代，其中该取代是针对具有相似亲水性的氨基酸。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能中的重要性在本领域中众所周知(Kyte和Doolittle,1982)。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，继而定义了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。因此，可以在多肽中进行这种保守取代，并且可能仅对其活性产生较小影响。如美国专利4,554,101中所详述，以下亲水性值已分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。这些值可以用作指导，因此亲水性值在±2之内的氨基酸的取代是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，并且在±0.5之内的那些甚至是更特别优选的。因此，本文所述的任何多肽可以通过用具有相似的亲水性值的不同但同源的氨基酸取代氨基酸来修饰。亲水性在+/-1.0或+/-0.5分之内的氨基酸被认为是同源的。
Cav-1肽可包含共翻译和翻译后(C-末端肽裂解)修饰，诸如二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解裂解(例如，通过弗林蛋白酶或金属蛋白酶裂解)等，在一定程度上，这样的修饰不会影响分离的肽的抗炎特性或其改善血糖控制的能力。
在一些方面，Cav-1肽包含非天然存在的氨基酸。肽可包含天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸的组合，或可仅包含非天然存在的氨基酸。在肽(或除蛋白酶识别序列外的组合物的其他组分)中的非天然存在氨基酸可包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸，这在某些情况下是需要的。与含L-氨基酸的形式相比，含D-氨基酸的肽在体外或体内表现出增加的稳定性。因此，当期望或需要更大的体内或细胞内稳定性时，掺入D-氨基酸的肽的构建可能特别有用。更具体地，D-肽对内源肽酶和蛋白酶具有抗性，从而提供了更好的口服经上皮和透真皮递送连接的药物和缀合物，提高了膜永久复合物的生物利用度(参见下文进一步讨论)，并延长了血管内和间质(需要此类特性时)的使用寿命。D-异构体肽的使用还可以增强连接的药物和其他货物分子的透真皮和口服经上皮递送。另外，D-肽不能有效地加工被主要组织相容性复合体II类限制性呈递至T辅助细胞，并且因此在整个生物体中诱导体液免疫应答的可能性较小。因此可以使用例如细胞穿透肽序列的D-异构体形式、切割位点的L-异构体形式和治疗肽的D-异构体形式来构建肽缀合物。
除20个“标准”L-氨基酸外，本领域中已明确定义的D-氨基酸或非标准、修饰的或异常氨基酸也可考虑用于本公开。磷酸化的氨基酸(Ser、Thr、Tyr)、糖基化的氨基酸(Ser、Thr、Asn)、β-氨基酸、GABA、ω-氨基酸被进一步考虑用于本公开。这些包括，例如，其包括β-丙氨酸(β-Ala)和其他ω-氨基酸，诸如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(Melle)；苯甘氨酸(Phg)；正亮氨酸(Nle)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-C1))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉素胺(Pen)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰赖氨酸(AcLys)；2,4-二氨基丁酸(Dbu)；2,4-二氨基丁酸(Dab)；对氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高丝氨酸(hSer)；羟脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸和类肽(N-取代的甘氨酸)。
羧基末端修饰包括与羧酸的酰化作用：甲酸、乙酸、丙酸、脂肪酸(肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸)、琥珀酸、苯甲酸、苄氧羰基(Cbz)；乙酰化和生物素化。氨基末端修饰包括：(i)用羧酸酰化：甲酸、乙酸、丙酸、脂肪酸(肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸等)、琥珀酸、苯甲酸、苄氧羰基(Cbz)；(ii)生物素化；(iii)酰胺化；(iv)附着染料，诸如荧光素(FITC、FAM等)、7-羟基-4-甲基香豆素-3-乙酸、7-羟基香豆素-3-乙酸、7-甲氧基香豆素-3-乙酸等香豆素；罗丹明(5-羧基罗丹明110或6G、5(6)-TAMRA、ROX)；N-[4-(4-二甲基氨基)苯基偶氮]苯甲酸(Dabcyl)、2,4-二硝基苯(Dnp)、5-二甲基氨基萘-1-磺酸(Dansyl)等染料；和(v)聚乙二醇。
多肽可以在其N和C末端分别用酰基基团(缩写为“Ac”)和酰胺基基团(缩写为“Am”)封端，例如在N末端的乙酰基(CH3CO-)和在C末端的酰胺基(-NH2)。设想了广泛的N-末端封端功能，优选地在与末端氨基基团的连接中，例如：甲酰基；
具有1个至10个碳原子的烷酰基，诸如乙酰基、丙酰基、丁酰基；
具有1个至10个碳原子的烯酰基，诸如己-3-烯酰基；
具有1个至10个碳原子的炔酰基，诸如己-5-炔酰基；
芳酰基，诸如苯甲酰基或1-萘甲酰基；
杂芳酰基，诸如3-吡咯基或4-喹啉基；
烷基磺酰基，诸如甲磺酰基；
芳基磺酰基，诸如苯磺酰基或磺胺基；
杂芳基磺酰基，诸如吡啶-4-磺酰基；
具有1个至10个碳原子的取代的烷酰基，诸如4-氨基丁酰基；
具有1个至10个碳原子的取代的烯酰基，诸如6-羟基-己-3-烯酰基；
具有1个至10个碳原子的取代的炔酰基，诸如3-羟基-己-5-炔酰基；
取代的芳酰基，诸如4-氯苯甲酰基或8-羟基-萘-2-酰基；
取代的杂芳酰基，诸如2,4-二氧-1,2,3,4-四氢-3-甲基-喹唑啉-6-酰基；
取代的烷基磺酰基，诸如2-氨基乙烷磺酰基；
取代的芳基磺酰基，诸如5-二甲基氨基-1-萘磺酰基；
取代的杂芳基磺酰基，诸如1-甲氧基-6-异喹啉磺酰基；
氨基甲酰基或硫代氨基甲酰基；
取代的氨基甲酰基(R'-NH-CO)或取代的硫代氨基甲酰基(R'-NH-CS)，其中R'为烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的芳基或取代的杂芳基；
取代的氨基甲酰基(R'-NH-CO)和取代的硫代氨基甲酰基(R'-NH-CS)，其中R'为烷酰基、烯酰基、炔酰基、芳酰基、杂芳酰基、取代的烷酰基、取代的烯酰基、取代的炔酰基、取代的芳酰基或取代的杂芳酰基，如上述所有的定义。
C-末端的封端功能可以在与末端羧基键连的酰胺键或酯键中。提供酰胺键的封端官能团称为NR1R2，其中R1和R2可以独立地选自以下基团：氢；
优选具有1个至10个碳原子的烷基，诸如甲基、乙基、异丙基；
优选具有1个至10个碳原子的烯基，诸如丙-2-烯基；
优选具有1个至10个碳原子的炔基，诸如丙-2-炔基；
具有1个至10个碳原子的取代的烷基，诸如羟基烷基、烷氧基烷基、巯基烷基、烷硫基烷基、卤代烷基、氰基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、烷酰基烷基、羧基烷基、氨基甲酰基烷基；
具有1个至10个碳原子的取代的烯基，诸如羟基烯基、烷氧基烯基、巯基烯基、烷硫基烯基、卤代烯基、氰基烯基、氨基烯基、烷基氨基烯基、二烷基氨基烯基、烷酰基烯基、羧基烯基、氨基甲酰基烯基；
具有1个至10个碳原子的取代的炔基，诸如羟基炔基、烷氧基炔基、巯基炔基、烷基硫代炔基、卤代炔基、氰基炔基、氨基炔基、烷基氨基炔基、二烷基氨基炔基、烷酰基炔基、羧基炔基、氨基甲酰基炔基；
具有至多10个碳原子的芳酰基烷基，诸如苯甲酰基或2-苯甲酰基乙基；
芳基，诸如苯基或1-萘基；
杂芳基，诸如4-喹啉基；
具有1个至10个碳原子的烷酰基，诸如乙酰基或丁酰基；
芳酰基，诸如苯甲酰基；
杂芳酰基，诸如3-喹啉基；
OR'或NR'R”，其中R'和R”独立地是氢、烷基、芳基、杂芳基、酰基、芳酰基、磺酰基、亚磺酰基或SO2-R”'或SO-R”'，其中R”'是被取代的或未取代的烷基、芳基、杂芳基、烯基或炔基。
提供酯键的封端官能团称为OR，其中R可以是：烷氧基；芳氧基；杂芳氧基；芳烷氧基；杂芳烷氧基；取代的烷氧基；取代的芳氧基；取代的杂芳氧基；取代的芳烷氧基；或取代的杂芳烷氧基。
N-末端或C-末端的封端官能团或两者都可以具有这样的结构，使得被封端的分子充当前药(母体药物分子的药理活性衍生物)，在体内发生自发或酶促转化，以释放活性药物并具有比母体药物分子更好的递送性质(Bundgaard H,Ed:Design of Prodrugs,Elsevier,Amsterdam,1985)。
封端基团的明智选择允许在肽上添加其他活性。例如，与N-或C-末端封端连接的巯基基团的存在将允许衍生肽与其他分子的缀合。
在另一个方面，肽或其片段或衍生物可以是“逆向-反转肽”。“逆向-反转肽”是指在至少一个位置具有逆转的肽键方向的肽，即，相对于氨基酸的侧链而言，氨基和羧基末端是逆转的。因此，逆向-反转类似物具有逆转的末端和逆转方向的肽键，同时大致保持了天然肽序列中侧链的拓扑。逆向-反转肽可以包含L-氨基酸或D-氨基酸，或L-氨基酸和D-氨基酸的混合物，直至所有氨基酸均为D-异构体。部分逆向-反转肽类似物是其中仅部分序列被逆转并被对映体氨基酸残基取代的多肽。由于此类类似物的逆向-反转部分的氨基和羧基末端已被逆转，因此，逆转部分侧翼的氨基酸残基分别被侧链类似的a-取代的偕-二氨基甲烷和丙二酸酯所取代。已经发现逆向-反转形式的细胞穿透肽与天然形式一样有效地跨膜转运。逆向-反转肽类似物的合成描述于Bonelli,F.等人，Int J Pept Protein Res.24(6):553-6(1984)；Verdini,A和Viscomi,G.C,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1:697-701(1985)和美国专利号6,261,569，通过援引以其全文并入本文。已经描述了部分逆向-反转肽类似物的固相合成方法(EP 97994-B)，其也通过援引以其全文并入本文。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或“同源性”是指当在比对时，所比较的两个序列相同的碱基(或氨基酸)的百分比。可以使用本领域已知的软件程序来确定该比对和同源性或序列同一性百分数，例如在Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987)补编30，第7.7.18节，表7.7.1中所描述的。优选地，默认参数用于比对。优选的比对程序是使用默认参数的BLAST。特别是，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。
B.多聚多肽
本公开的实施例还包括由Cav-1肽的重复单元构建的更长的多肽。多肽多聚体可包含多肽的不同组合。这样的多聚多肽可以通过化学合成或通过本文讨论的重组DNA技术来制备。当通过化学合成产生时，寡聚物优选地具有核心多肽序列的2-5个重复，并且多聚体中氨基酸的总数应不超过约160个残基，优选地不超过100个残基(或其当量，当包括连接基或间隔基)。
C.拟肽
Cav-1肽可以是模拟天然Cav-1多肽的生物学效应的拟肽化合物。拟肽剂可以是非天然肽或非肽剂，其可再现天然Cav-1多肽的结合元件的立体空间特性，从而使其具有天然Cav-1多肽的结合活性和生物学活性。类似于天然Cav-1多肽或多肽多聚体，拟肽将具有结合面(其与天然Cav-1所结合的任何配体相互作用)和非结合面。
在一些方面，本公开还包括保留部分肽特征的化合物。例如，本发明的肽内的任何蛋白水解不稳定键可以被非肽元件诸如等电体(N-甲基化；D-氨基酸)或还原的肽键选择性地取代，而分子的其余部分保留其肽性。
已经针对多种生物活性肽/多肽(诸如阿片肽、VIP、凝血酶、HIV蛋白酶等)描述了拟肽化合物，无论是激动剂、底物或是抑制剂。设计和制备拟肽化合物的方法是本领域已知的(Hruby,VJ,Biopolymers 33:1073-1082(1993)；Wiley,RA等人，Med.Res.Rev.13:327-384(1993)；Moore等人，Adv.in Pharmacol 33:91-141(1995)；Giannis等人，Adv.in DrugRes.29:1-78(1997)。某些模拟二级结构的模拟物描述于Johnson等人，In:Biotechnologyand Pharmacy,Pezzuto等人，Chapman and Hall(Eds.),NY,1993中。这些方法用于制备拟肽，该拟肽至少具有天然Cav-1多肽的结合能力和特异性，并且优选地还具有生物学活性。鉴于本公开，本领域技术人员可获得的肽化学和一般有机化学的知识对于设计和合成这样的化合物是足够的。
例如，可以通过检查与配体(例如，可溶性uPAR或其片段)游离或复合地结合的本发明多肽的三维结构来鉴定此类拟肽。替代性地，可以通过核磁共振波谱技术获得与其配体结合的本发明多肽的结构。对该肽与其配体或受体的相互作用的立体化学的更多知识将允许这种拟肽剂的合理设计。在不存在配体的情况下，本发明的肽或多肽的结构也可以提供用于设计模拟分子的支架。
D.聚乙二醇化
Cav-1肽可以与异源多肽片段或聚合物，诸如聚乙二醇缀合。肽可与PEG连接，增加酶的流体力学半径，从而增加血清持久性。多肽可以缀合任何靶向剂，诸如能够特异性、稳定地结合到外部受体的配体(美国专利公开2009/0304666)。
在某些方面，实施例的方法和组合物与公开的多肽的聚乙二醇化有关。聚乙二醇化是聚(乙二醇)聚合物链与另一分子(通常是药物或治疗蛋白)共价连接的过程。聚乙二醇化通常是通过将PEG的反应性衍生物与目标大分子孵育来实现的。PEG与药物或治疗蛋白的共价连接可以“掩蔽”该药剂以对抗宿主免疫系统(降低的免疫原性和抗原性)、提高药剂的流体力学大小(在溶液中的大小)，这可以通过降低肾清除而延长其循环时间。聚乙二醇化还可以给疏水性药物和蛋白质提供水溶性。
聚乙二醇化的第一步是PEG聚合物在一个或两个末端处的合适官能化。每个末端均用相同反应性部分活化的PEG称为“同源双官能的”，而如果存在的官能团不同，则PEG衍生物称为“异源双官能的”或“异源官能的”。制备PEG聚合物的化学活性或活化衍生物，以将PEG连接至所需分子。
用于PEG衍生物的合适官能团的选择基于将偶联至PEG的分子上的可用反应性基团的类型。对于蛋白质，典型反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。也可以使用N-末端氨基基团和C-末端羧酸。
用于形成第一代PEG衍生物的技术通常使PEG聚合物与可与羟基反应的基团(通常为酸酐、酰氯、氯甲酸酯和碳酸酯)反应。在第二代聚乙二醇化化学中，更有效的官能团(诸如醛、酯、酰胺等)可用于缀合。
由于聚乙二醇化的应用已经变得越来越先进和复杂，对于用于缀合的异源双官能PEG的需求已经增加。这些异源双官能PEG非常适用于连接其中需要亲水性、柔性和生物相容性间隔基的两个实体。用于异源双官能PEG的优选端基团是顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、胺、羧酸和NHS酯。
最常见的修饰剂或连接基基于甲氧基PEG(mPEG)分子。其活性取决于将蛋白质修饰基团添加至醇末端。在一些情况下，聚乙二醇(PEG二醇)用作前体分子。随后在两个末端处修饰二醇，以产生异源二聚或同源二聚PEG连接分子。
蛋白质通常在亲核位点(诸如未质子化的硫醇(半胱氨酰残基)或氨基基团处)聚乙二醇化。半胱氨酰特异性修饰试剂的实例包括PEG顺丁烯二酰亚胺、PEG碘乙酸酯、PEG硫醇和PEG乙烯基砜。所有四者均在温和条件和中性至微碱性pH下具有强半胱氨酰特异性，但各自具有一些缺陷。通过顺丁烯二酰亚胺形成的硫醚可在碱性条件下稍微不稳定，因此使用这种连接基的配制选择可能存在一些限制。通过碘PEG形成的硫代氨基甲酸酯键更稳定，但游离的碘可在一些条件下修饰酪氨酸残基。PEG硫醇与蛋白硫醇形成二硫键，但这种键也可在碱性条件下不稳定。PEG-乙烯基砜反应性与顺丁烯二酰亚胺和碘PEG相比相对缓慢；然而，所形成的硫醚键极稳定。其较慢反应速率也可使PEG-乙烯基砜反应更容易控制。
在天然半胱氨酰残基处的位点特异性聚乙二醇化很少进行，因为这些残基通常为二硫键的形式或为生物学活性所需。在另一个方面，定点诱变可用于掺入用于硫醇特异性连接基的半胱氨酰聚乙二醇化位点。必须设计半胱氨酸突变，以使其可接近聚乙二醇化试剂并且在聚乙二醇化后仍具有生物学活性。
胺特异性修饰剂包括PEG NHS酯、PEG三氟乙基磺酸酯、PEG醛、PEG异硫氰酸酯等。其均在温和条件下反应并且对氨基基团极具特异性。PEG NHS酯可能是一种更具反应性的试剂；然而，其高反应性可使聚乙二醇化反应在大规模下难以控制。PEG醛与氨基基团形成亚胺，随后用氰基硼氢化钠将亚胺还原为仲胺。不同于硼氢化钠，氰基硼氢化钠将不会还原二硫键。然而，这种化学品具有高度毒性并且必须谨慎地处置，特别是在其具有挥发性较低的pH下。
由于大多数蛋白质上存在多个赖氨酸残基，位点特异性聚乙二醇化具有挑战性。幸运的是，因为这些试剂与未质子化的氨基基团发生反应，所以有可能通过在较低pH下进行反应而将聚乙二醇化引向较低pK氨基基团。一般来说，α-氨基基团的pK比赖氨酸残基的ε-氨基基团小1-2个pH单位。通过在pH为7或更低下使分子聚乙二醇化，通常可获得对N-末端的高选择性。然而，这仅在蛋白质的N-末端部分不为生物学活性所需的情况下可行。另外，聚乙二醇化的药代动力学有益效果通常强于体外生物学活性的显著损失，得到具有更大体内生物学活性的产物，而与聚乙二醇化化学无关。
开发聚乙二醇化程序时需要考虑多个参数。幸运的是，关键参数通常不超过四个或五个。优化聚乙二醇化条件的“实验设计”方法非常有用。对于硫醇特异性聚乙二醇化反应，要考虑的参数包括：蛋白质浓度、PEG与蛋白质之比(以摩尔计)、温度、pH、反应时间、以及在一些情况下除氧气外。(氧气可有助于通过蛋白质实现分子间二硫化物形成，这将降低聚乙二醇化产物的产率。)关于胺特异性修饰应考虑相同的因素(除氧气外)，pH甚至可能更关键，特别是当靶向N-末端氨基基团时。
关于胺和硫醇特异性修饰，反应条件可影响蛋白质的稳定性。这可限制温度、蛋白质浓度和pH。另外，在开始聚乙二醇化反应之前应已知PEG连接基的反应性。例如，如果聚乙二醇化试剂仅有70％活性，那么所用的PEG的量应确保仅有活性的PEG分子计算在蛋白质与PEG反应化学计量中。
E.融合蛋白
本发明的某些实施例涉及Cav-1肽的融合蛋白。这些分子可具有在N-或C-末端连接至异源结构域的实施例的多肽。例如，融合还可使用来自其他物种的前导序列，以允许在异源宿主中重组表达蛋白。融合蛋白可包含半衰期延长剂。另一种有用的融合包括蛋白质亲和标签(诸如血清白蛋白亲和标签或六个组氨酸残基)或免疫活性结构域(诸如抗体表位，优选可切割地)的添加，以促进融合蛋白的纯化。非限制性亲和标签包括多组氨酸、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
在特定实施例中，实施例的肽可能与增加体内半衰期的肽(诸如XTEN多肽(Schellenberger等人，2009)、IgG Fc结构域、白蛋白或白蛋白结合肽)连接。
产生融合蛋白的方法是本领域技术人员众所周知的。可以通过如下方式产生这类蛋白，例如，完全融合蛋白的从头合成，或编码异源结构域的DNA序列的连接以及完整融合蛋白的表达。
通过将基因与编码肽连接基(该肽连接基在串联连接的多肽之间剪接)的桥接DNA片段连接起来，可以促进恢复母体蛋白功能活性的融合蛋白的产生。该连接基应该具有足够的长度以允许适当折叠所生成的融合蛋白。
2.连接基
在某些实施例中，实施例的多肽可以用双功能交联试剂进行化学缀合，也可以在蛋白水平上与肽连接基融合。
双功能交联试剂已被广泛用于各种用途，包括亲和基质的制备、各种结构的修饰和稳定、配体和受体结合位点的识别，以及结构研究。合适的肽连接基(诸如Gly-Ser连接基)也可用于连接实施例的多肽。
携带两个相同官能团的同源双官能试剂被证明可高效地引起相同或不同的大分子或大分子亚基之间的交联，并将多肽配体连接到其特定的结合位点。异源双官能试剂包含两个不同的官能团。利用两个不同官能团的不同反应活性，可以选择性地和顺序地控制交联。根据它们官能团的特异性，可将双功能交联试剂分为例如氨基-、巯基-、胍基-、吲哚基-、羧基-特异性基团。其中，以游离氨基基团为导向的试剂因其商业上的可用性、易于合成以及适用的温和反应条件而受到特别欢迎。
大多数异源双官能交联试剂包含初级胺反应性基团和硫醇反应性基团。在另一个实例中，描述了异源双官能交联试剂和使用该交联试剂的方法(美国专利号5,889,155，更确切地说，该美国专利通过援引以其全文并入本文)。该交联试剂将亲核酰肼残基与亲电马来酰亚胺残基结合，允许(比如)醛类与游离的硫醇的偶联。该交联试剂可被修饰成交联各种官能团。
此外,本领域技术人员已知的任何其他连接/偶联剂和/或机制可以用来组合实施例的多肽，诸如，例如，抗体-抗原相互作用、亲和素-生物素键、酰胺键、酯键、硫酯键、醚键、硫醚键、磷酸酯键、磷酰胺键、酸酐键、二硫化物键、离子和疏水性相互作用、双特异性抗体和抗体片段或它们的组合。
优选的使用具有合理血液稳定性的交联剂。已知有许多类型的含有二硫键的连接基可成功地用于缀合靶向和治疗/预防剂。含有空间位阻的二硫键的连接基在体内可更加稳定。因此，这些连接基是一组连接剂。
除了受阻交联剂，也可以按照本文的规定使用非受阻连接基。其他有用的(不被认为包含或产生受保护的二硫键)交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫醚(Wawrzynczak和Thorpe，1987)。这种交联剂的使用是本领域很好理解的。另一个实施例涉及柔性连接基的使用。
一旦被化学缀合，肽通常会被纯化以从非缀合剂和其他污染物中分离缀合物。大量的纯化技术可用于提供足够纯度的缀合物，使其具有临床用途。
基于粒度分离的纯化方法(比如凝胶过滤、凝胶渗透或高效液相色谱)通常是最常用的。其他色谱技术(比如Blue-Sepharose分离)也是可以使用的。传统的从包涵体中纯化融合蛋白的方法可以是有用的，诸如使用弱洗涤剂，诸如十二烷基肌氨酸钠(SLS)。
3.细胞穿透肽和膜转运肽
此外，在某些方面，Cav-1肽可进一步包含细胞结合结构域或细胞穿透肽(CPP)。如本文所用，术语“细胞穿透肽”和“膜转运结构域”可互换使用，并且是指允许多肽穿过细胞膜(例如，在真核细胞的情况下为质膜)的多肽序列的片段。CPP片段的实例包括但不限于源自如下的片段：HIV Tat(例如GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:23))、疱疹病毒VP22、果蝇触角同源盒基因产物、protegrin I、穿透素(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:24))或蜂毒素(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:25))。在某些方面，CPP包括T1(TKIESLKEHG(SEQ ID NO:26))、T2(TQIENLKEKG(SEQ ID NO:27))、26(AALEALAEALEALAEALEALAEAAAA(SEQ ID NO:28))或INF7(GLFEAIEGFINGWEGMIEGWYGCG(SEQ ID NO:29))CPP序列。
Ⅲ.使用方法
本发明的一个方面涉及本文所述的肽及其突变、变体、类似物或衍生物的用途。具体而言，这些方法涉及将本文所述的任何一种肽或其药用修饰(比如干粉)施用于受试者，用于治疗或预防疾病、损伤或肺部感染(例如肺部的纤维化病症)的组合物，所述组合物包含在药用载体中的实施例的多肽。
A.药物组合物
预期本文提供的Cav-1肽可全身或局部施用以抑制细胞凋亡，并用于治疗和预防对肺组织的损伤。它们可以静脉内、皮下、肌内、鞘内和/或腹膜内施用。例如，干粉制剂可以通过滴注到受试者中(例如，皮下滴注)来施用，或者可以在注射之前在液体中重构。在特定方面，将肽局部递送至气道，诸如使用干粉吸入器施用干粉制剂。它们可以单独施用或与抗纤维化化合物组合施用。
Cav-1肽干粉可以与至少一种另外的治疗剂(例如，用于治疗肺纤维化的治疗剂)组合、同时或依次施用。其他治疗剂可以是NSAID、类固醇、DMARD、免疫抑制剂、生物反应调节剂、支气管扩张剂或抗纤维化剂诸如吡非尼酮(其抗纤维化作用机制尚未完全了解，但可能涉及对TGF-β的阻断)、尼达尼布(一种广泛酪氨酸激酶阻滞剂)或任何其他抗纤维化剂。合适的NSAID选自非选择性COX-抑制剂：乙酰水杨酸、美沙拉嗪、布洛芬、萘普生、氟比洛芬、非洛芬(fenoprofen)、芬布芬(fenbufen)、酮洛芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、奥沙普秦(oxaprozin)、普拉洛芬、米洛洛芬(miroprofen)、硫恶洛芬(tioxaprofen)、舒洛芬(suprofen)、阿米洛芬(alminoprofen)、塞洛芬酸、氟洛芬、吲哚美辛、舒林酸、托美汀(tolmetin)、佐美酸(zomepirac)、萘丁美酮(nabumetone)、双氯芬酸、芬氯芬酸、阿氯芬酸、溴芬酸、布洛芬酸、醋氯芬酸、阿西美辛、芬替酸(fentiazac)、环氯茚酸、依托度酸、oxpinac、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟酸、托芬那酸、二氟尼柳、氟苯柳、吡罗昔康、替诺昔康、氯诺昔康和尼美舒利及其药用盐；选择性COX 2-抑制剂：美洛昔康、塞来昔布和罗非考昔及其药用盐。合适的类固醇是泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、布地奈德(budenoside)、氟可龙和曲安西龙(triamcinolone)。合适的DMARD是柳氮磺胺吡啶、奥沙拉嗪、氯喹、金衍生物(金诺芬)、D-青霉胺和细胞抑制剂诸如甲氨蝶呤和环磷酰胺。合适的免疫抑制剂是环孢菌素A及其衍生物、吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil)、FK 506、OKT-3、ATG、15-去氧精胍菌素(15-desoxyspergualin)、咪唑立宾、米索前列醇、雷帕霉素、reflunomide和硫唑嘌呤。合适的生物反应调节剂是干扰素β、抗TNF-α(依那西普)、IL-10、抗-CD3或抗-CD25。合适的支气管扩张剂是异丙托溴铵、溴托氧溴铵、噻托溴铵、盐酸肾上腺素、沙丁胺醇、硫酸特布他林、氢溴酸非诺特罗、沙美特罗和formoterole。在这样的组合中，可以根据其通常的剂量范围或低于其通常的剂量范围的剂量来施用(例如，口服或通过吸入)每种活性成分。组合的NSAID、类固醇、DMARD、免疫抑制剂和生物反应调节剂的剂量适当地为通常推荐的最低剂量的1/50至通常推荐的最高剂量的1/1，优选为1/20至1/2，且更优选为1/10至1/5。对于组合药物，通常建议的剂量应理解为例如在Rote
Figure BDA0003052539720000301
2002,EditioCantor Verlag Aulendorf,Germany或Physician's Desk Reference中公开的剂量。
在考虑临床应用的情况下，可能需要以适用于预期应用的形式制备包含蛋白质、抗体和药物的药物组合物。一般来说，药物组合物可包含有效量的溶解或分散于药用载体中的一种或多种实施例的多肽或附加药剂。术语“药用”是指分子实体和组合物当视情况而定施用于动物(例如，人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有通过本文公开的方法分离的至少一种实施例的多肽、或另外的活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版,1990所示例的，该文献通过援引并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解制剂应符合FDA生物标准办公室或其他适当管理机构要求的生物负载、无菌性、热原性、一般安全性和/或纯度标准。
本发明的某些实施例可包含不同类型的载体，这取决于它是以固体、液体或是气雾形式施用，以及对于诸如注射等施用途径是否需要无菌。组合物可以通过吸入(例如，吸入雾化制剂)、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注沐浴靶细胞、经由导管、经由灌洗、在脂类成分中(例如，脂质体)、或通过其他方法或本领域普通技术人员已知的上述方法的任何组合(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，通过援引并入本文)而在静脉内、鞘内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、粘膜、口服、局部(topically)、局部(locally)施用。注射体积和针头大小的选择可由本领域普通技术人员根据注射部位、可推注性和可注射性来选择，这包括考虑要注射的溶液或悬浮液的粘度以及药物浓度、pH和渗透压浓度。在一些情况下，可以选择活性剂的粒度，以便在施用时(例如，通过皮下注射)提供所需的溶出速率。
本文提供的多肽可以配制成游离碱、中性、两性离子或盐形式的组合物。药用盐包括酸加成盐，例如通过蛋白质组合物的游离氨基基团形成的那些，或通过无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的那些。与游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱(诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)；或有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因)。在配制后，将溶液以与剂型相容的方式和治疗性有效量施用。制剂易于以多种剂型施用，诸如配制用于肠胃外施用，诸如注射溶液，或用于递送至肺的气雾，或配制用于饮食施用，诸如药物释放胶囊等。
进一步根据本发明的某些方面，适合于施用的组合物可以在具有或不具有惰性稀释剂的药用载体中提供。在一些方面，载体可以包括气雾、气体、液体、半固体(即，糊剂)或固体载体。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接受者或对其中所含的组合物的治疗有效性有害，否则其在用于实践方法的可施用组合物中的用途是适当的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填料等，或它们的组合。组合物也可包含各种抗氧化剂，以延迟一种或多种组分的氧化。另外，微生物作用的预防可通过防腐剂，诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它们的组合来实现。
根据本发明的某些方面，组合物与载体以任何便利和实用的方式来组合，即通过溶液、悬浮液、乳化、掺合物、封装、吸收等。对于本领域技术人员而言，这样的程序是常规的。
在本发明的一个具体实施例中，将组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以以任何方便的方式进行，诸如研磨。也可以在混合过程中加入稳定剂，以保护组合物免受治疗活性的损失，即在胃中变性。用于组合物中的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸(诸如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物或冻干保护剂(诸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露醇等)。
在一些方面，药物制剂包含一种或多种表面活性剂。根据本公开方法所使用的表面活性剂包括离子和非离子表面活性剂。代表性的非离子表面活性剂包括聚山梨酯，诸如
Figure BDA0003052539720000321
和
Figure BDA0003052539720000322
表面活性剂(ICI Americas Inc.of Bridgewater,N.J.)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；
Figure BDA0003052539720000323
表面活性剂(Sigma of St.Louis,Mo.)；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油酰基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-、椰油酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、帕尼基丙基-或(例如，月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰丙基-或异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基钠-或甲基油酰二钠-牛磺酸；MONAQUATTM表面活性剂(Mona Industries Inc.of Paterson,N.J.)；聚乙二醇；聚丙二醇；乙烯和丙二醇的嵌段共聚物，诸如
Figure BDA0003052539720000324
表面活性剂(BASF of Mt.Olive,N.J.)；寡聚(环氧乙烷)烷基醚；烷基(硫代)葡萄糖苷、烷基麦芽糖苷；和磷脂。例如，表面活性剂在制剂中的存在量可以为约0.01％至约5％(表面活性剂的重量相对于制剂中其他固体组分的总重量；“w/w”)、为约0.03％至约0.5％(w/w)、约0.05％至约0.5％(w/w)，或约0.1％至约0.5％(w/w)。然而，在其他方面，实施例的药物制剂基本上不含非离子表面活性剂或基本上不含所有表面活性剂。
关于本发明的治疗方法，其不旨在施用本文公开的一种或多种肽或其突变、变体、类似物或衍生物，并且不限于特定的施用方式、剂量或给药频率；本发明涵盖所有施用方式，包括肌内、静脉内、腹膜内、囊内、关节内、病灶内、皮下或足以提供足以治疗炎症相关疾患的剂量的任何其他途径。可以以单剂量或多剂量将治疗剂施用于患者。当施用多个剂量时，剂量可以彼此分开例如一小时、三小时、六小时、八小时、一天、两天、一周、两周或一个月。例如，可以将治疗剂施用例如2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、15周、20周或更多周。应当理解，对于任何特定的受试者，应根据个体需要和施用或监督施用组合物的人的专业判断，随时间调整特定的剂量方案。例如，如果较低剂量不能提供足够的治疗活性，则可以增加治疗剂的剂量。
虽然主治医生最终将决定合适的量和剂量方案，但可以以0.0001、0.01、0.010.1、1、5、10、25、50、100、500或1,000mg/kg或g/kg的剂量提供治疗性有效量的一种或多种本文公开的多肽或其突变、变体、类似物或衍生物。有效剂量可以根据从体外或动物模型测试生物测定或系统导出的剂量应答曲线来外推。
本领域普通技术人员可以使用常规考虑因素(例如，借助于适当的常规药理学方案)来确定针对特定患者或受试者的剂量。医生可以例如首先开出相对低的剂量，随后增加剂量直到获得适当的应答。取决于应用，施用于患者的剂量足以随着时间的推移影响患者的有益治疗应答，或例如减轻症状或其他适当的活性。剂量由特定制剂的功效和本文所公开的一种或多种多肽或其突变、变体、类似物或衍生物的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病症以及待治疗的患者的体重或表面积来确定。
在一些方面，例如经由滴注(通过吸入)给予受试者单次剂量，每天一次以治疗受试者，所述受试者优选地是哺乳动物，更优选地是患有或易感肺纤维化的人，其所得剂量在约0.2mg/kg至约250mg/kg之间，诸如在约10mg/kg至约50mg/kg之间。可以每天施用这种剂量在任何位置，持续约3天至一个或多个星期。
慢性施用也是可能的，尽管如本领域众所周知的那样，剂量可能需要下调。然而，上述范围是暗示性的，因为在个体治疗方案中变量的数目很大，并且预期与这些优选值具有相当大的偏移。
对于连续施用，例如通过泵系统(诸如在下文所述的某些实验中使用的渗透泵)，约1-2周的时间范围内的总剂量优选地在1mg/kg至1g/kg的范围内，优选地在20-300mg/kg的范围内，更优选地在50-200mg/kg的范围内。在这样的连续剂量方案之后，活性化合物的总浓度优选地在约0.5μM至约50μM的范围内，优选地在约1μM至约10μM的范围内。
在体外抑制或预防细胞凋亡的活性化合物的有效浓度为约0.5nM至约100nM的范围内，更优选地约2nM至约20nM的范围内。可以使用本文所述的方法在体外确定有效剂量范围和最佳剂量范围。
B.干粉粒度减小和干粉吸入装置。
制剂的粒度可以通过任何合适的方法来减小，其包括但不限于研磨、碾磨、薄膜冷冻、喷雾干燥或压碎。可以通过本领域已知的任何方法进行研磨，诸如通过喷气研磨机、球磨机、湿式研磨机、介质研磨机、高压均质法或低温研磨机。
粒度减小后的肽稳定性可以使用本领域中已知的技术进行评估，其包括尺寸排阻色谱法；电泳技术；HPLC；质谱；光谱技术(诸如UV光谱和圆二色光谱)以及活性(在体外或体内测量)。为了进行蛋白质稳定性的体外测定，可以收集气雾组合物，并且然后蒸馏或吸收到过滤器上。为了进行体内测定或将组合物通过肺部施用于受试者，用于干粉分散的装置适用于由受试者吸入。例如，可以通过确定蛋白质聚集水平来评估蛋白质稳定性。优选地，本发明的干粉组合物基本上不含蛋白质聚集体。可溶性聚集体的存在可以使用动态光散射(DLS)(DynaPro-801TC,Protein Solutions Inc.of Charlottesville,Va.)和/或通过紫外分光光度法定性确定。
在一些实施例中，用研磨的CSP7治疗患者可以包括调节的药物释放。在一些实施例中，可以将研磨的CS7配制成用于缓慢释放或延迟释放。在一些实施例中，可以将研磨的CSP7配制成用于快速释放。在其他实施例中，可以将研磨的CSP7配制成用于缓慢释放和快速释放两者(即，双重释放曲线)。
在一些实施例中，本公开提供了用于施用本文提供的可吸入CSP7组合物的方法。施用可以是但不限于使用吸入器吸入研磨的CSP7。在一些实施例中，吸入器是被动干粉吸入器(DPI)，诸如Plastiape RSOl单剂量DPI。在干粉吸入器中，干粉被储存在容器中，并通过吸入方式递送到肺部，而无需使用推进剂。
在一些实施例中，吸入器是单剂量DPI，诸如DoseOneTM、Spinhaler、
Figure BDA0003052539720000341
或Handihaler。在一些实施例中，吸入器是多剂量DPI，诸如Plastiape RS02、
Figure BDA0003052539720000342
TwisthalerTM、
Figure BDA0003052539720000351
或ElliptaTM。在一些实施例中，吸入器是用于单剂量的多种药物的同时递送的多单剂量DPI(plurimonodose DPI)，诸如Plastiape RS04多单剂量DPI。通常，干粉吸入器将药物存储在内部储存器中，并且在使用或不使用推进剂的情况下，通过吸入方式递送药物。其他类型的干粉吸入器将预先分配剂量的药物存储在胶囊(例如，纤维素或明胶基质)或铝箔袋中，通过装置将它们各自刺穿以释放剂量给患者。干粉吸入器可能需要大于30L/min的吸气流速才能有效递送，诸如在大约30-120L/min之间。在一些实施例中，研磨的CSP7的有效雾化与吸气力无关。在一些实施例中，干粉吸入器的流动阻力为0.01kPa0.5min/L至0.05kPa0.5min/L之间，诸如0.02kPa0.5min/L至0.04kPa0.5min/L之间。根据患者群体及其吸气能力选择干粉吸入器(例如，高阻、低阻、被动、主动)。
在一些实施例中，吸入器可以是计量的剂量吸入器。计量的剂量吸入器使用推进剂辅助雾化的药物的短脉冲形式，向肺部递送一定量的药物。计量的剂量吸入器包括三个主要部分：罐、计量阀和作动器，并且可以利用隔离装置来使所发射的颗粒减速并促进患者吸入雾化云。包括推进剂和任何所需的赋形剂在内的药物制剂都存储在罐中。计量阀允许分配限定量的药物制剂。计量的剂量吸入器或吹嘴的作动器包含配对的排放喷嘴，并且通常包括防尘盖以防止污染。使用计量的剂量吸入器所需的所需吸气流速可以小于90L/min，诸如在约15-90L/min之间，优选地约30L/min。在一些实施例中，研磨的CSP7的有效雾化与吸气力无关。
在一些实施例中，吸入器是喷雾器。喷雾器用于以吸入肺部的雾化雾剂的形式递送药物。药物制剂被压缩气体或超声波雾化。喷射喷雾器连接到压缩机。压缩机以高速度通过液体药物制剂排放压缩气体，从而使药物制剂雾化。然后患者吸入雾化药物。超声波喷雾器产生高频超声波，引起与药物制剂的储液器接触的内部元件的振动，这导致药物制剂雾化。然后患者吸入雾化药物。喷雾器可利用约3-12L/min之间的流速，诸如约6L/min。在一些实例中，可以将研磨的活性物质(例如，CSP7)悬浮在药用液体载体媒介中，并通过雾化(例如，喷气雾化)来施用。在其他方面，可以通过汽化方法(例如，快速汽化)，诸如通过电子烟装置来施用实施例的组合物。
在一些实施例中，可以按常规时间表施用组合物。如本文所使用的，常规时间表是指预定的指定时间段。只要时间表是预定的，常规时间表可以包涵相同或不同长度的时间段。例如，常规时间表的施用可能涉及每天两次、每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周一次、每月一次或它们之间的任意设定天数或周数。替代性地，预定的常规时间表的施用可以包括在第一周每天两次，然后在几个月中每天等。在一些实施例中，肽(例如，CSP7)每天施用一次。在优选的实施例中，每天少于一次施用肽，诸如每隔一天、每三天或每周施用一次。在一些实施例中，完整剂量的实施例的肽(例如，CSP7)在1-100mg之间，诸如20-100mg、50-100mg、10-20mg、20-40mg、50-70mg或80-90mg。
在一些实施例中，实施例的肽(例如，CSP7)可以以单位剂型(例如，预先划分的剂量)提供，诸如以胶囊、泡罩或药筒的形式提供，其中单位剂量包含至少1mg肽，诸如每剂量至少5mg、10mg、15mg或20mg的实施例的肽(例如，CSP7)。在一些方面，单位剂量是1-10mg(例如，约5mg)的肽。在特定的方面，单位剂型不包括任何赋形剂的施用或添加，而且仅用于容纳用于吸入的粉末(即，不施用胶囊、泡罩或药筒)。在一些方面，向受试者施用一种以上单位剂型。例如，在干粉吸入器的情况下，可以在单位剂量胶囊中提供实施例的肽，并且可以通过吸入向受试者施用多于一个单位剂量胶囊(例如3-4)。在一些实施例中，可以以高发射剂量施用肽(诸如，CSP7)，诸如至少10mg，优选至少15mg，甚至更优选20mg。在一些实施例中，施用研磨的实施例的肽(例如，CSP7)导致进入深肺的高细颗粒剂量，诸如大于5mg。优选地，进入深肺的细颗粒剂量为至少10mg，甚至更优选至少15mg。在一些方面，颗粒剂量是由1个、2个、3个、4个或5个或更多个胶囊产生的，所述胶囊包含剂量的实施例的肽(例如，CSP7)。在一些方面，细颗粒剂量是发射剂量的至少50％，诸如至少60％、65％、70％、75％或80％。
在一些实施例中，吸入压力下降的改变导致发射剂量的改变。在一些实施例中，3kPa的吸入压力的变化，诸如从4kPa至1kPa，导致发射剂量的减少小于25％，诸如24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少。在一些实施例中，吸入压力的改变导致细颗粒剂量的改变。在一些实施例中，3kPa的吸入压力的变化，诸如从4kPa至1kPa，导致细颗粒剂量的减少小于15％，诸如14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少。
Ⅳ.肺部病症治疗
本发明的肽可用于治疗多种肺部病症。治疗的肺部病症可能是急性的或是慢性的。急性肺部病症可能是急性肺损伤、感染或化学诱导的。慢性肺部病症可能是损伤、感染或疾病的结果。
A.肺损伤
在一些方面，受试者患有急性肺损伤(ALI)或感染或化学诱导的肺损伤。在特定方面，受试者患有塑型性支气管炎、哮喘、慢性阻塞性气道/肺(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、吸入烟气引起的急性肺损伤(ISALI)、支气管扩张、吸入毒素引起的气道疾病(例如，氯气或其他诱发气道疾病)、暴露于芥子气、暴露于颗粒物(例如，硅尘)、闭塞性细支气管炎、闭塞性细支气管炎机化性肺炎、胶原血管性肺病(例如，来自狼疮、硬皮病或混合性结缔组织病)、间质性肺部疾病(例如，特发性肺纤维化或结节病)、药物引起的肺部疾病和加速性肺纤维化(例如，在包括ARDS的急性肺损伤后发生)。包括慢性阻塞性肺疾病、哮喘、感染以及导致纤维化的急性和慢性肺损伤在内的肺部疾病构成了全球第三大死亡原因(Murray等人，1997；Rabe等人，2007；Tsushima等人，2009)。在美国军事人员中，急性肺损伤(ALI)是严重的医学问题。战斗中的ALI可能是由多种病因引起的。
用吸入性抗凝剂、类固醇、β激动剂、高频通气和体外膜氧合治疗吸入性损伤引起的ALI，具有变数，结果普遍不尽理想。除了带有呼吸面罩的障碍物以外，没有有效的预防措施。ARDS的管理已取得重大进展，但仍在很大程度上支持观察性等待内源性愈合机制的生效；住院死亡率仍高于40％(Matthay等人，2012)。ALI的幸存者经常患有慢性呼吸障碍，伴有生活质量下降。能够加速恢复和/或预防以后的并发症(诸如慢性呼吸功能不全和肺纤维化)的任何方式将是高度期望的。迫切需要改善ALI的早期诊断，并且更重要的是，要预防和治疗ALI。全身性疾病导致的直接吸入性肺损伤或ARDS引起的ALI的病理生理学极为复杂和异质，包括全身性和局部性心肺因素，诸如膜通透性增加、炎性细胞因子涌入、氧化性细胞损伤、隔室液流、离子渠道排列紊乱和许多其他因素(Matthay等人，2012)。显然，需要新的疗法来治疗和预防肺部疾患，诸如ALI。
在一些实施例中，提供了一种在受试者中治疗或预防急性肺损伤、肺部感染或肺部疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的包含FTTFTVT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的肽或其变体，其中所述肽维持小窝蛋白-1(Cav-1)的生物学活性。在一些方面，施用肽的药物制剂的方法包括干粉吸入。在特定方面，受试者为人。
B.肺部疾病
肺部疾病包括肺纤维化、肺部炎症、特发性肺纤维化、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管炎、细支气管炎、闭塞性细支气管炎、哮喘和肺部感染、以及导致纤维化的急性和慢性肺损伤(Murray等人，1997；Rabe等人，2007；Tsushima等人，2009)。这些疾病构成全世界第三大死亡原因。
囊性纤维化是外分泌腺和外分泌汗腺的遗传性疾病，其主要影响消化系统和呼吸系统。这种疾病通常以慢性呼吸道感染、胰腺功能不全、粘液分泌异常和过早死亡为特征。囊性纤维化(CF)的特征是进行性气流阻塞。患有CF的个体亚群也对吸入的胆碱能激动剂产生气道高应答性(Weinberger,2002和Mitchell等人，1978)，并且产生对支气管扩张剂的应答的气流受限的可逆性(van Haren等人，1991和van Haren等人，1992)。支气管高应答性和气道阻塞的存在提示CF与其他气道狭窄疾病(诸如哮喘或慢性阻塞性肺疾病(COPD))之间可能存在共同的疾病病因，其中气道平滑肌功能障碍被认为导致疾病进程。
肺部感染可能是细菌感染。传染性细菌可以是铜绿假单胞菌、炭疽芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、麻风分枝杆菌、非洲分枝杆菌、M.asiaticum、M.aviuin-intracellulaire、M.chelonei abscessus、M.fallax、法氏假单胞菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分支杆菌、麻风分枝杆菌、M.malmoense、M.shimoidei、M.simiae、M.szulgai、M.xenopi、结核分枝杆菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、嗜肺军团菌、Francisella tularensis、卡氏肺孢子虫、支原体或伯克霍尔德菌。细菌感染可能导致肺炎。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是用于对两种主要的气流阻塞性疾患进行分类的术语：慢性支气管炎和肺气肿。大约有1600万美国人患有COPD，其中80-90％的人一生中都是吸烟者。COPD是美国的主要死亡原因，在2003年造成122,283人死亡。在2003年，美国用于COPD的直接医疗保健费用约为209亿美元。慢性支气管炎是支气管气道的炎症。支气管气道将气管与肺连接。当发炎时，支气管分泌粘液，引起慢性咳嗽。
在肺气肿中，由于肺的弹性蛋白骨架受损，肺泡囊过度膨胀。气肿性肺中的炎性细胞释放弹性蛋白酶，该酶降解或破坏肺基质内的弹性蛋白纤维。肺气肿有多种原因，其包括吸烟、暴露于环境污染物、α-一抗胰蛋白酶缺乏和衰老。
细支气管炎最常见是由病毒性下呼吸道感染引起的，并且其主要特征是急性发炎、水肿、小气道上皮细胞坏死和粘液产生增加(Ralston等人，2014)。体征和症状通常始于鼻炎和咳嗽，其可能会发展为呼吸急促、喘息、罗音、使用辅助肌肉和/或鼻扩张。
由于肺中小气道的异常重塑，闭塞性细支气管炎进行性气流减少(Meyer等人，2014)。闭塞性细支气管炎综合征是肺移植的主要并发症，并且通常用于描述迟发异体移植功能障碍，导致用力呼气容积和力持续下降，这不是由其他已知原因引起的(Meyer等人，2014)。
术语“哮喘”可以指急性哮喘、慢性哮喘、间歇性哮喘、轻度持续性哮喘、中度持续性哮喘、重度持续性哮喘、慢性持续性哮喘、轻度至中度哮喘、轻度至中度持续性哮喘、轻度至中度慢性持续性哮喘、过敏性(外在)哮喘、非过敏性(内在)哮喘、夜间哮喘、支气管哮喘、运动诱发性哮喘、职业性哮喘、季节性哮喘、无症状性哮喘、胃食管哮喘、特发性哮喘和咳嗽变异性哮喘。在哮喘期间，气道持续发炎，并可能偶尔出现痉挛。
在一些实施例中，提供了一种在受试者中治疗或预防肺部感染或肺部疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的包含FTTFTVT(SEQ ID NO:2；本文中称为CSP7)的氨基酸序列的干粉肽，其中该干粉肽维持小窝蛋白-1(Cav-1)的生物学活性。在一些方面，施用实施例的药物制剂的方法包括肽的干粉吸入。在特定方面，该受试者为人。
Ⅴ.实例
包括以下实例以说明本发明的优选实施例。本领域技术人员应该理解，以下实例中所公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选方式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施例进行许多改变并且仍获得相同或相似的结果。
实例1-方法和材料
制备干粉肽。CSP7肽(SEQ ID NO:2)，批号#:AHF66//470103由PolypeptideLaboratories(San Diego,USA)合成。
制造CSP7混合物并喷雾干燥。包含单独的CSP7(CSP7)，或75％/25％混合的CSP7/亮氨酸、CSP7/海藻糖或CSP7/柠檬酸钠，或75％/15％/10％混合的CSP7/亮氨酸/海藻糖的CSP7制剂，制备于pH 10的水中(用NH4OH调节)，并使用带有2英寸旋风分离器的BLD-35进行喷雾干燥。
通过薄膜冷冻(TFF)降低干粉CSP7的粒度。将0.3mg/ml CSP7散装粉末和0.9mg/ml甘露醇(质量比为1:3)溶解在10mM Tris缓冲液中，并将pH值调节至8.05。然后将溶液用0.45μm膜过滤，并滴入装有液氮的滚动室中。计量的冷冻温度在-55℃至-65℃之间。然后将冷冻的薄片在VirTis Advantage冷冻干燥机(VirTis Company Inc.,NY,US)中冻干。冻干条件如下：平衡：在-55℃，100mTorr下保持30分钟；初步干燥：在250分钟内使温度升至-30℃，100mTorr；在-30℃，100mTorr下保持660分钟；二次干燥：在720分钟内使温度升至30℃，100mTorr；并在30℃，100mTorr下保持240分钟。经TFF处理的样品称为批号171014。
通过低温研磨降低干粉CSP7的粒度。将一克CSP7散装粉末添加到小的低温磨管中，并且然后装入6870冷冻/研磨机(SPEX CertiprepTM,NJ,USA)中。在5个循环中进行研磨，预冷却10分钟，并且每个循环在10CPS下运行5分钟，然后冷却2分钟。取回并称重研磨过的样品，基于取回的重量与负载重量的比值计算得出的产率为73.5％。
通过球磨机(BM)降低CSP7粉末的粒度。将CSP7散装粉末悬浮在其抗溶剂乙醇(无水)中，至浓度为1mg/ml。将大约一半的锆球溶剂体积(2mm)添加到悬浮液中。然后将悬浮液装入8000M混合器/研磨机(SPEX SamplePrep,NJ,USA)中进行研磨。从研磨工艺中收集样品，分别在5分钟、10分钟和30分钟进行测试。
使用转子-定子减小CSP7粉末的粒度。将CSP7散装粉末分散到乙醇中，至浓度为1mg/ml。将转子定子的尖端(5mm*75mm平底)浸没在悬浮液中，并进行均质处理以减小粒度。
高效液相色谱分析。将样品溶解在20mM Tris缓冲液(pH 10.3)中，并在Phenomenex
Figure BDA0003052539720000411
C18(2)液相色谱柱上运行，该色谱柱的粒度为5μm并且孔径为
Figure BDA0003052539720000412
Phenomenex Security Guard保护盒套件用作保护柱。流动相A为H2O+0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)，并且流动相B为80％乙腈+20％H2O+0.09％(v/v)TFA。样品的注射量为20μL。每个样品运行25分钟，并将色谱柱保持在25℃，流速为1ml/min。在220nm的波长处检测样品。将缓冲液梯度设置为表2中特定的条件。
Figure BDA0003052539720000413
Figure BDA0003052539720000421
确定研磨的CSP7散装粉末的空气动力学粒度分布。将约3.5mg研磨的CSP7粉末手动填充到尺寸3HPMC胶囊(Capsugel,Peapack,NJ)中。然后使用RS01单剂量干粉吸入器(高阻力)对CSP7胶囊进行雾化，并通过下一代冲击器(NGI,MSP Corp.,Shoreview,MN)测量空气动力学粒度分布。吸入器以60L/min的空气流速在4s内产生了气雾，以实现4L的吸入量和装置上的4kPa压降。在每次运行之前，NGI收集表面均用5％(v/v)聚山梨酯20的甲醇溶液涂覆。每次运行射出一个胶囊，并且每个样品重复运行三次(三个胶囊)。雾化后，用特定体积的20mM Tris缓冲液(pH 10.3)冲洗所有收集表面，以收集药物。分别提取在胶囊、装置、适配器、喉管、预分离器和1-MOC级中沉积的粉末。
对于每个测试，递送的剂量定义为进入NGI的CSP7的质量。基于沉积在NGI的1-MOC级的剂量，使用Copley吸入器测试数据分析软件(CITDAS,Copley Scientific,NottinghamUK)来计算和分析几何标准偏差(GSD)、质量中值空气动力学直径(MMAD)和细颗粒分数％(FPF％)。FPF定义为递送剂量的小于5.0μm的颗粒的质量分数。
制备和裂解肺组织。6-8周龄的雌性小鼠订购自Jackson Laboratories,stock:000664C57BL/6J，根据IACUC准则对其进行看护和收容。接下来的一周，称重小鼠，用80mg/kg的氯胺酮和6mg/kg的赛拉嗪(约115ul/小鼠)在腹膜内(IP)注射麻醉，并在气管内滴注博来霉素。简而言之，将26G塑料导管插入气管，并且小鼠通过移液器接受2x 20ul的0.8U/kg博来霉素(Biotang,Cat#RB003)滴注(间隔30s，以便从气道清除)。对照只接受相同体积的盐水。跟踪体重(在受伤的动物中体重减轻约10％)，并且每天对动物进行干粉吸入方案(CH技术)持续一周。干粉剂量基于先前雾化制剂的最小有效剂量，该最小有效剂量估计为0.7mcg/动物的肺部递送剂量(Tepper等人，2016，通过援引并入本文)。总之，暴露时间12分钟/天对应‘1X’剂量，而‘5X’剂量对应60分钟/天的治疗，相当于3.5mcg/动物。使动物连续暴露七天(第14-20天；在博来霉素损伤的纤维化阶段)，并在最后剂量的致死剂量的肝素化氯胺酮/赛拉嗪混合物(25％肝素)后24小时处死动物。收集全肺的一部分进行组织学检查。简而言之，经心灌注10ml盐水可以清除肺部的血液。然后，在解剖区上方20cm处，用盐水将肺充气1分钟，然后用4％PFA充气1分钟。绑扎气管，并将肺切除、固定、包埋并切片至4微米，以实现最大表面积的可视化，并用苏木精和伊红染色。用Aperio AT2高容量数字化整片扫描仪捕获图像，并根据改良的Ashcroft评分方案对肺进行纤维化损伤评分(Hübner等人，2008，通过援引并入本文)。对于分子分析，将全肺在RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂(SantaCruz)以及1％DTT(以抑制RNAse)中均质化，并在4C(Precellys Evolution,BertinInstruments)中平行均质化并进行下游测定。肺匀浆的胶原蛋白含量是根据总胶原蛋白测定法(Quickzyme)，使用制造商提供的胶原蛋白标准品，并根据制造商的说明进行测定的。在酶标仪(FilterMax F5,Molecular Devices,580nm)上读取比色测定。另外，从匀浆(Zymogen Research)中提取RNA，然后反转录为cDNA(Qiagen,QuantiNova ReverseTranscription 205413)。这些研究的结果示出于图29-32。
通过向22.4mL RIPA缓冲液中添加224μL混合物抑制剂、224μL NaOV4、224μL PMSF和0.22g DTT，制备28个样品的均质缓冲液。每个样品添加800μL均质缓冲液。使用带有CK28珠的Precellys Evolution将样品均质化。均质方案用于硬组织，并且每个样品均在4℃下进行两次。并且然后将均质化的样品等分，其中400μL存储用于BCA浓度确定和蛋白质测定，200μL用于RNA分离，并且200μL用于胶原蛋白测定。
胶原蛋白测定。通过将125μL的Quickzyme胶原蛋白标准液添加到125μL的12M HCL中，并将200μL的每个样品添加到200μL的12M HCl中，来制备使用的胶原蛋白标准液。将样品和标准品在95℃孵育20小时，并在20分钟后短暂涡旋。孵育后，将样品以13,000x g离心10分钟。该标准品是根据制造商的说明(Quickzyme)制备的。然后将100μL的每个样品稀释到50μL的水中。然后将10μL的每个稀释样品进一步稀释到100μL的4M HCl中。将标准品和每个样品的重复吸移到板中。将75μL测定缓冲液添加至每个孔，并在摇动20分钟之前将板覆盖。每孔添加75μL检测试剂混合物，并在60℃孵育一小时之前混合板。然后如上所示读取板。
RNA分离。根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy试剂盒进行RNA分离。简而言之，将25μL的RLT缓冲液和75μL的70％乙醇添加到RIP A缓冲液中的50μL样品，总共产生150μL起始原料。然后将50μL的每个样品的起始原料添加到50μL不含RNase的水中。然后，添加350μL缓冲液RLT，并将样品充分混合。然后向其中各加入250μL的95-100％乙醇，并再次混合样品。然后将700μL的每个样品添加到其各自的核酸纯化柱中，并以8000X g离心，并丢弃流通液。将500μL的RPE添加到每个柱中，并再次离心柱。再次添加500μL的RPE，并且这次将样品以8000x g离心2分钟。将样品转移到新的微量离心管中，并用40μL不含RNase的水通过8000x g离心1分钟洗脱RNA。通过nanodrop对样品进行定量并如上所述进行分析。
实例2-表征CSP7散装粉末
扫描电子显微镜。将CSP7的散装粉末样品溅射在样品盘上，并通过吹入压缩氮气进行散布。样品通过扫描电子显微镜成像(图1)。SEM表明存在大颗粒(>5μm)。此外，大多数颗粒似乎很大(>5μm)，并且因此不在可吸入范围内。
CSP7粒度评估。使用配备有固态或湿式分散附件的Spray tec激光衍射仪和Sympatec激光衍射仪HELOS-R系统检查粒度，以确定散装粉末是否在可吸入范围内。使用干分散法确定CSP7散装粉末粒度大于可吸入粒度。表3示出了分布内评估为Dv 10、Dv 50(中值)和Dv 90的颗粒的粒度。如表3所示，分析的所有CSP7颗粒中，超过50％的粒度为5.3μm或更大，其大于可吸入范围。
Figure BDA0003052539720000441
接下来通过湿分散法通过Sympatec激光衍射仪确定粒度。将CSP7溶解在乙醇+0.05％吐温80中作为分散介质，并超声处理10分钟。使用湿分散法确定CSP7粒度的结果示出于表4。如表4所示，湿分散颗粒的平均粒度(Dv 50)为29.0±0.8，远远超出可吸入范围。
Figure BDA0003052539720000451
再次使用Spraytec激光衍射仪，使用干分散法，进一步评估平均粒度。CSP7散装粉末以40PSI分散，并且平均粒度(8.6±1.5μm)再次高于可吸入范围(表5)。
Figure BDA0003052539720000452
发现小于5μm的干粉颗粒的百分比仅为34.5±4.1％。考虑到激光衍射方法各自均发现大部分散装粉末的粒度超出可吸入范围，因此用于处理的任何干粉都需要以某种方式进行处理以减小粒度。
散装CSP7粉末的形态。将散装粉末CSP7样品溅射到载玻片上，并通过光学显微镜观察(图2)。光学显微镜确认了SEM，表明存在大颗粒(>5μm)。光学显微镜还示出了颗粒团聚物的存在，在图2中可见，由箭头表示。
确定CSP7散装粉末颗粒结晶度。使用X射线粉末衍射对CSP7散装粉末颗粒进行评估(图3)。使用X射线粉末衍射发现纯CSP7表现出一定的结晶度(图3)。为了确认X射线衍射结果，通过偏光显微镜对结晶度进行了评估(图4)。如图4中所示，散装CSP7粉末中存在结晶CSP7，并且图像中的白色箭头指示某些典型的结晶形式。
CSP7散装粉末的热分析。差示扫描量热法用于确定纯CSP7的熔点(图5)。如通过DSC所确定的，CSP7的熔点确定为211.03℃(图5)。使用热重分析(TGA)继续进行分析(图6)。TGA表明，纯CSP7的重量在216℃以上开始显著下降(图6)。
CSP7散装粉末的水分含量。使用Mettler Toledo Karl Fischer滴定仪，通过KarlFischer-体积(KF-V)滴定法评估散装粉末CSP7的水分含量，并重复三次。表6示出了每个测试的水分含量，以及这3个测试的平均水分含量。
Figure BDA0003052539720000461
接下来，使用动态蒸气吸附DVS对CSP7散装粉末的水分吸收进行分析(图7)。运行CSP7样品进行完整的吸附/解吸循环，发现该样品在相对湿度为零的条件下具有6.32％的水分解吸。当相对湿度为90％时，发现质量变化为10.54％(图7)。
实例3-表征减小粒度后的CSP7粉末
CSP7粉末的粒度减小。为了有效地将粉末吸入并将其沉积到肺中，粒度通常应具有小于约5μm的质量中值空气动力学直径。执行了多种技术来减小纯材料的粒度，包括喷气研磨(AJM)、球磨(BM)、低温研磨(CM)、薄膜冷冻(TFF)和喷雾干燥。首先，执行AJM以减小CSP7散装粉末的粒度，并且从研磨机内的多个位置收集研磨的CSP7。表5和表6示出了从所示位置收集的第一批研磨的粉末(批号171013)的产率和粒度分布。如上所述，通过Sympatec激光衍射仪干分散法(表8)或Sympatec激光衍射仪湿分散法(表9)确定粒度分布。
Figure BDA0003052539720000462
Figure BDA0003052539720000471
使用与上述相同的条件，从10克纯散装粉末中研磨出第二批CSP7(批号171027)。同样，从相同的位置评估了粉末的粒度分布和产率，并列于表10中。
Figure BDA0003052539720000472
使用Sympatec激光衍射仪干分散法(表11)和湿分散法(表12)对第三批CSP7干粉末进行薄膜冷冻(TFF)(批号171014)并进行上述分析。
Figure BDA0003052539720000473
Figure BDA0003052539720000474
将另一批CSP7干粉进行低温研磨(CM)以减小粒度。使用如上所述的干分散法(表13)和湿分散法(表14)通过激光衍射评估CM CSP7的粒度。
Figure BDA0003052539720000481
Figure BDA0003052539720000482
将另一批CSP7散装粉末进行球磨(BM)，以减小粒度。表15显示了在研磨工艺中从几个时间点获取的BM CSP7粉末的粒度分布。
Figure BDA0003052539720000483
用CSP7(也指指定的开发缩写，CSP7)和亮氨酸、海藻糖、柠檬酸钠、或亮氨酸和海藻糖的混合物生产进一步的批料，并进行喷雾干燥以减小粒度。通过干分散法激光衍射检查喷雾干燥的粒度(图8，表16)。再次，相对于散装CSP7，喷雾干燥显著减小了CSP7的粒度。
Figure BDA0003052539720000484
Figure BDA0003052539720000491
当通过固体分散法和湿分散法进行测量时，采用每种减小粒度的方法(喷气研磨、薄膜冷冻、低温研磨、球磨和喷雾干燥)，CSP7粒度均显著减小(将表1和表2与表5、表6、表10、表13、表14、表16、表17、表18和表19比较)。通过激光衍射使用固体分散法或液体分散法进行测量，喷气研磨后，大多数CSP7颗粒落在可吸入范围内，但是薄膜冷冻、低温研磨和球磨效果不那么理想，较小百分比的研磨的粉末降低到可吸入范围内。
使用转子-定子手持式均质机还可以减小粒度(图9)。均质化后，根据均质化的持续时间和功效，CSP7在乙醇中的颜色会变为浅灰色或深灰色，图9，并且可以明显看出，尽管由于观察到的颜色变化没有进一步追求该方法，但是均质化减小了粒度。
研磨的CSP7粉末的形态。使用光学显微镜或扫描电子显微镜检查研磨的样品各自的形态。如上检查来自喷气研磨机的粉末样品，并且光学显微镜检查表明粒度减小至1μm＞粒度＞5μm的大小，并且是均质的(图10)。此外，研磨的CSP7颗粒不含团聚物(图10)。SEM表明喷气研磨的颗粒的均质化和降低后的粒度在1μm和5μm之间(图11)。还检查了TFF后获得的粉末样品，并且虽然粒度较大，但样品中没有发现团聚体(图12)。进一步的分析包括通过扫描电子显微镜评估喷雾干燥制剂的颗粒形态。制剂的代表性SEM图像示出于图13。
AJM CSP7的结晶度。通过X射线衍射评估研磨的CSP7粉末(批号171027)，并在衍射图中显示出结晶度(图14)。还通过X射线衍射检查喷雾干燥的CSP7的结晶度，并且曲线示出于图15。单独的CSP7或与海藻糖或柠檬酸钠偶联的CSP7的制剂是无定形的，而与亮氨酸或亮氨酸和海藻糖偶联的CSP7似乎含有结晶的亮氨酸特征，如图15中的尖峰所示。
HPLC评估研磨或喷雾干燥的CSP7粉末。为了确定研磨CSP7散装粉末是否对化学效力有影响，使用表2中所列的条件下进行的HPLC评估了从研磨机各个部位收集的研磨的CSP7粉末样品。使用以下公式评估效力：
Figure BDA0003052539720000501
从表26清楚可见，研磨对所收集的任何样品的效力均无有害影响。同样，当测试批号171027时，化学效力确定为100.14％
Figure BDA0003052539720000502
通过RP-HPLC检查喷雾干燥的CSP7混合物，以检查纯度(表17，图16)。与喷气研磨的CSP7粉末相似，喷雾干燥的CSP7保留大约100％的纯度。
Figure BDA0003052539720000503
Figure BDA0003052539720000511
CSP7稳定性。通过使用HPLC测定其化学效力来检查未处理的散装CSP7粉末以及喷气研磨的CSP7(批号171027)的稳定性。将每种样品保存在3种不同的条件下，然后在5天、15天和32天的存储时间测定化学效力(图17)。还通过HPLC(说明书中较早描述的方法)检查了喷雾干燥的CSP7在24小时内的稳定性，以了解其短期稳定性。发现每种制剂都是稳定的，在2小时或24小时后杂质没有增加(表31)。
Figure BDA0003052539720000521
研磨的CSP7的空气动力学粒度分布。为了确定研磨的CSP7的空气动力学粒度分布，分别提取了沉积在NGI收集器各个位置的粉末量。雾化后作为进入NGI收集器的CSP7的质量来测量所递送的剂量，并分别提取并测量沉积在单独表面上的CSP7的量。留在胶囊中或沉积在装置、适配器、喉管、预分离器和1-MOC级内的未处理的或喷气研磨的(批号171013)CSP7的量示出于图18，作为递送的CSP7总量的百分比。表9中列出了研磨的和未经处理的(例如，未研磨的或未处理的)CSP7的细颗粒分数百分比(FPF％)、质量平均空气动力学直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)。
Figure BDA0003052539720000522
如上确定第二批研磨的CSP7批号(171027)的空气动力学粒度分布，不同的是每个尺寸3的HPMC胶囊使用约4.25mg的粉末。GSD、FPF％和MMAD示出于表11，并且沉积在每个位置中的CSP7的百分比示出于图19，再次作为递送的CSP7总量的百分比。
Figure BDA0003052539720000531
还检查了喷雾干燥制剂的雾化(图20)。制剂各自均显示出大于60％的细粉末分数，每种制剂的MMAD在2.5μm至3μm之间(表25)。表25示出了喷雾干燥制剂的分析结果总结，其包括水含量。
Figure BDA0003052539720000532
Figure BDA0003052539720000541
确定研磨的CSP7水分含量。在用于分析散装CSP7的相同条件下，使用动态蒸汽吸附法对喷气研磨的CSP7粉末(批号171027)进行分析(图21)。类似于散装纯粉末，研磨的CSP7在0％的相对湿度下具有4.61％的水分解吸率(图21)。KF-V分析发现水分含量为4.9％(表7)，尽管当相对湿度为90％时，质量变化增加到13.59％(图21)。
Figure BDA0003052539720000542
热重分析减小的粒度的CSP7粉末。以与散装CSP7相同的方式对研磨的CSP7(批号171027)进行热重分析，发现研磨的CSP7具有与未处理的CSP7非常相似的性质(图22)。还评估了喷雾干燥制剂的热学性质，并示出于表24和图23-27(总结于图28)。值得注意的是，混合制剂的中点Tg明显低于单独的喷雾干燥的CSP7(将表24中的001C-F与001B进行比较)。
Figure BDA0003052539720000543
Figure BDA0003052539720000551
本文给出的结果表明，多种减小CSP7粉末粒度的方法是有效的，并且所得粉末表现出非常相似的特性。
实例4-通过吸入CSP7干粉治疗博来霉素诱导的肺纤维化
诱导和CSP7治疗小鼠纤维化。用博来霉素处理小鼠以诱发肺纤维化。向小鼠鼻内给药0.8U/kg博来霉素，并在治疗前等待14天以发展为疾病。然后使小鼠不治疗，或通过吸入CSP7的干粉治疗12分钟，或通过吸入CSP7的干粉治疗60分钟。在治疗的最后一天对小鼠实施安乐死，并将肺部取出、速冻、并在-80℃保存。在进一步分析之前，称量速冻的肺部的重量(图29)。
均质化肺组织，并使用Quickzyme胶原蛋白测定法分析胶原蛋白含量(图30)。与盐水处理相比，博来霉素诱导的纤维化导致肺中胶原蛋白的显著增加(P＝0.0062)(图30)。博来霉素诱导肺纤维化后，用CSP7治疗的小鼠的Ashcroft评分(小鼠的肺纤维化度量)较低(图31)。
还从均质化的肺组织制备RNA，并如上所述使用。
实例5-用于肌内/皮下注射的制剂悬浮液
Figure BDA0003052539720000552
*：喷气研磨的CSP7显示出的几何粒度为Dv(10)＝0.75μm；Dv(50)＝1.93μm；Dv(90)＝4.29μm，通过激光衍射测量。
对于制备：
1.制备20mM Tris缓冲液(应该为pH～10.3)
2.将1.5％(w/w)CMC溶解在20mM Tris缓冲液中，加入0.2％(w/w)泊洛沙姆188。隔夜以～600rpm的速度搅拌
3.向CMC溶液中添加0.7％(w/w)NaCl
4.通过添加～28.5μl/ml的1N HCl将溶液的pH值调节至7
5.在干净的小瓶中称重并添加一定量的喷气研磨(从收集袋中收集，以得到较小粒度的级分)的CSP7粉末
6.首先使用干净的棒碾磨粉末，确保没有明显的团聚颗粒
7.逐渐将制备好的溶液添加到小瓶中，并用棒进行研磨/碾磨
8.当粉末完全湿润时，并没有发现可见的达到目标体积的团聚颗粒
结果：
Figure BDA0003052539720000561
实例6-用于肌内/皮下注射的制剂溶液
对于制备：
1.制备20mM Tris缓冲液(应该为pH～10.3)
2.将1.5％(w/w)CMC溶解在20mM Tris缓冲液中，加入0.2％(w/w)泊洛沙姆188。隔夜以～600rpm的速度搅拌
3.向CMC溶液中添加0.7％(w/w)NaCl。
4.向溶液中加入1.2-1.4mg/ml CSP7(未处理的粉末)，涡旋溶解。pH值应约为9，然后通过添加～50μl 1N HCl将pH值调节至8.2-8.5
Figure BDA0003052539720000571
结果：
Figure BDA0003052539720000572
实例7-多肽变体的制剂前研究
通过将变体粉末以5mg/ml的浓度添加到溶剂中，然后涡旋3分钟，进行变体的溶解度研究。在5分钟内观察溶液的外观。加入更多的粉末(每次～5mg/ml)并重复涡旋和观察，直到出现沉淀或胶凝。
结果：
Figure BDA0003052539720000573
Figure BDA0003052539720000581
a沉淀：离心溶液，然后等分上清液并用缓冲液稀释。
b高粘度溶液：取等分溶液并用缓冲液稀释。
Figure BDA0003052539720000582
Figure BDA0003052539720000591
Figure BDA0003052539720000592
Figure BDA0003052539720000601
Figure BDA0003052539720000602
实例8-CSP7(铵抗衡离子)形式的制剂前研究
通过将过量的肽粉末添加到3mL不同的pH缓冲液(表36)中，并在定轨摇床上以100rpm的转速在室温混合24小时，来执行纯(即，未研磨)的CSP7铵抗衡离子形式(表35)的溶解度。
对于冻融稳定性研究(图33)，将磷酸盐缓冲液系统(PBS,pH 7.4)中的0.1mg/mLCSP7(铵抗衡离子)肽等分到15mL/小瓶中，分别进行快速冷冻和慢速冷冻。为了快速冷冻和慢速冷冻，将样品浸入液氮中至少5分钟，或放入-20℃冷冻器中至少1.5小时，以确保将小瓶中的等分试样完全冷冻，然后解冻至室温。每个样品经历5次冻融循环。回收率％表示每种样品浓度与原始(未处理)浓度的百分比。
通过执行高效液相色谱法(HPLC,Thermo Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)进行测定之前，通过0.45μm膜过滤溶解度样品和冻融样品。简而言之，使用配备了
Figure BDA0003052539720000611
反相C18色谱柱2.5μm,150mm x 4.60mm的Dionex 3000HPLC系统分析样品。将HPLC柱加热至60℃以进行测试，并以215nm的波长和1mL/min的流速检测肽。两个流动相是A(0.1％乙酸的水溶液)和B(0.1％乙酸的乙腈溶液)。注射量为20μL，并从0.01-1mg/ml绘制标准曲线。
表34.HPLC方法的详细信息。
Figure BDA0003052539720000612
表35：CSP7(铵抗衡离子)的pH溶解度曲线。
pH 浓度(mg/mL)
3 0.17
4 0.07
5 0.05
6 0.07
7 0.10
8 0.38
9 2.30
10 7.87
11 14.43
表36.缓冲液系统和在每个pH值的3mL缓冲液中添加的CSP7肽的量
Figure BDA0003052539720000621
实例9.研磨的CSP7(铵抗衡离子)粉末批号UTA181028的表征和稳定性研究
使用型号00Jet-O-MizerTM(也称为Aljet mill，Fluid Energy，Telford，PA)来研磨CSP7肽。进料速度、推动压力和碾磨压力分别为1g/min、60psi和70psi(表37)。批量为20g，并且从喷射研磨机的不同部分收集研磨的粉末，其包括：碾磨室后的管(bfC)、旋风分离器(C)、收集容器适配器(D)、收集袋适配器(E)、收集袋(H)和收集容器(G)。使用Turbula混合器(Glen Mills Inc.,Clifton,NJ,USA)将收集的粉末混合10分钟。
表37.用于研磨CSP7(铵抗衡离子)粉末的参数。
参数 值
进料速度 1g/min
推动压力 60psi
碾磨压力 70psi
研磨的CSP7铵抗衡离子纯粉末的比表面积。通过单点BET方法，使用MS-21型Monosorb快速表面积分析仪(Quantachrome Instruments,Boynton Beach,FL)分析研磨的和未处理的CSP7粉末的比表面积(图34)。样品在25℃用20psi的氮气脱气20-24小时，以去除表面上的水和其他杂质分子。使用氮气/氦气的混合物(50:50v/v)作为吸附质，并在测试前用氮气校准装置。
热重分析研磨的CSP7铵抗衡离子纯粉末。使用段落[0021]中描述的方法，不同之处在于起始温度是35℃而不是25℃。结果示出于图35。
研磨的且纯的CSP7(铵抗衡离子)粉末的扫描电子显微镜(SEM)图像。CSP7的形态(图36)用Zeiss Supra 40VP SEM(Carl Zeiss Microscopy GmbH,Jena,Germany)分析。通过碳导电带将样品固定在铝SEM样品桩上，并使用Cressington溅射镀膜机208HR(Cressington Scientific Instruments Ltd.,Watford,UK)涂覆12nm的铂/钯(Pt/Pd)。对纯的(即，未处理的)和研磨的CSP7样品拍摄图像。
来自批号UTA181028的研磨的CSP7(铵抗衡离子)的稳定性研究。研究研磨的CSP7粉末在不同储存条件下长达6个月期间的稳定性。研磨的CSP7肽包装为两种形式：散装研磨的粉末和封装的研磨的粉末。为了以散装研磨的粉末形式存储，将0.21-0.24g肽装入20mL闪烁瓶中(
Figure BDA0003052539720000631
DWK Life Sciences,Millville,NJ,Us)，并存储在热封的铝箔囊中(Impak Corp,Los Angeles,CA,Us)，在每个囊中装有两袋1克硅胶干燥剂(
Figure BDA0003052539720000632
Sorbco Packaging LLC,Belen,NM,US)。研磨的肽粉末也封装在尺寸3HPMC胶囊(Capsugel,Morristown,NJ,US)中，重量约为11±5％mg，并且然后将22-26个胶囊包装在HDPE瓶(DrugPlastic,Boyertown,PA,US)中，然后将HDPE瓶密封在铝箔囊中(无干燥剂)。将包装在以下存储条件存储在稳定室中：-20℃、25℃/60％RH和40℃/75％RH。在1个月、3个月和6个月时取出样品进行测试(表38)。对于除空气动力学粒度分布以外的测试，将包封的粉末从胶囊中取出，并通过旋转小瓶将其混入玻璃小瓶中。
表38.稳定性研究的测试时间表。
Figure BDA0003052539720000641
*缩写：HPLC：高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography)；
KF-C：Karl Fischer库仑法(Karl Fischer Coulometric)；GPSD：几何粒度分布(Geometric Particle Size Distribution)；LD：激光衍射(Laser Diffraction)；APSD：空气动力学粒度分布(Aerodynamic Particle Size Distribution)；NGI：下一代冲击器(Next Generation Impactor)；SEM：扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope)；XRPD：X射线粉末衍射(X-ray Powder Diffraction)。
研磨的粉末的外观。通过使用常规相机拍摄照片来记录研磨的粉末的外观(图30)。
研磨的肽的化学稳定性。使用实例8中所述的HPLC方法测定粉末。结果示出于下表39中。百分比表示与质量平衡相比的测定量。针对水分含量调整测定。
表39.HPLC测定研磨的CSP7铵抗衡离子的稳定性研究。
Figure BDA0003052539720000651
CSP粉末的水分含量。使用Karl Fischer库仑法(Mettler Toledo C20Leicester,OH,US)确定肽粉末中的水分含量(表40)。装置的可靠性已通过Karl Fischer水含量标准(Hydranal TM water standard,Honeywell,Charlotte,NC,US)进行了测试。将已知量的粉末悬浮在无水甲醇(Sigma,St.Louis,MO)中，并且将悬浮液注入阳极液(HydranalTM-Coulomat AG,H Honeywell,Charlotte,NC,US)中，在阴极液(HydranalTM-Coulomat CG,HHoneywell,Charlotte,NC,US)的存在下引发滴定。结果记录为样品中水含量减去空白无水甲醇溶液的差。
表40。稳定性研究中粉末样品的水分含量。
Figure BDA0003052539720000652
Figure BDA0003052539720000661
几何粒度分布。使用配备了RODOS分散的Sympatec HELOS激光衍射仪(SympatecGmbH,Germany)在研磨之前和之后分析CSP7粉末的GPSD。粉末在3bar分散后，每10ms进行一次测量。平均化在5％至25％光密度之间的测量值以确定粒度分布。所报告的按体积的粒度分别以10、50和90的百分位数(例如，Dv 10、Dv 50和Dv 90)以及落在1-5μm粒度范围内的颗粒百分比表示。结果示出于表41。
表41.稳定性研究中研磨的CSP7(铵抗衡离子)的几何粒度分布
Figure BDA0003052539720000662
空气动力学粒度分布：在稳定性研究中通过如段落[00215]中所述执行NGI来评估空气动力学粒度分布，除了在稳定性研究中所测试的胶囊中的粉末重量为11±5％mg，并且NGI的组件中去除了预分离器。结果示出于表42。
表42.稳定性研究中研磨的CSP7(铵抗衡离子)的空气动力学粒度分布。
Figure BDA0003052539720000671
Figure BDA0003052539720000681
注意：IP：进气口；FPD：细颗粒剂量(颗粒<5μm)；FPF(％)：递送剂量中的细颗粒剂量
CSP7粉末的结晶度。通过段落[0018]中所述的方法评估粉末的结晶度，并且结果示出于图38。
***
鉴于本公开，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文所公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选的实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法以及方法的步骤或所述步骤的顺序施加变化。更具体地，将显而易见的是，在化学和生理上均相关的某些药剂可以代替本文所述的药剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域的技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献在一定程度上提供了示例性的过程或其他细节，所述示例性的过程或其他细节是对本文所述的那些过程或细节的补充，所述参考文献通过援引明确地并入本文。
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序列表
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肺治疗学股份有限公司(Lung Therapeutics, Inc.)
R·O·威廉姆斯三世 (Williams, Robert O. III)
A·B·瓦茨(Watts, Alan B.)
Y·张(Zhang, Yajie)
S·萨哈吉皮简(Sahakijpijarn, Sawittree)
J·J·克棱(Koleng, John J.)
D·克里斯顿森(Christensen, Dale)
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<210> 1
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 1
Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val
1 5 10 15
Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met
20 25 30
Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu
35 40 45
Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val
50 55 60
Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser
65 70 75 80
Phe Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
85 90 95
Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala
100 105 110
Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp
115 120 125
Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Ile
130 135 140
Ser Arg Val Tyr Ser Ile Tyr Val His Thr Val Cys Asp Pro Leu Phe
145 150 155 160
Glu Ala Val Gly Lys Ile Phe Ser Asn Val Arg Ile Asn Leu Gln Lys
165 170 175
Glu Ile
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 2
Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 3
Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 4
Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Gly Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 5
Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> X = D-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(19)
<223> X = D-丙氨酸
<400> 6
Xaa Xaa Glu Gly Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Gly
1 5 10 15
Ser Xaa Xaa
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> X = D-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(19)
<223> X = D-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 7
Xaa Xaa Glu Gly Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Gly
1 5 10 15
Ser Xaa Xaa
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基团存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> X = D-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(19)
<223> X = D-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 8
Xaa Xaa Glu Gly Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Gly
1 5 10 15
Ser Xaa Xaa
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = 鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X = 鸟氨酸
<400> 9
Xaa Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Xaa Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = 鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X = 鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 10
Xaa Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Xaa Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 11
Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 12
Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 13
Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基团存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 14
Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = 鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 15
Xaa Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基团存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = 鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 16
Xaa Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基团存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 17
Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Gly Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 18
Asp Ser Gly Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基团存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 19
Asp Ser Gly Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰基团存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = 鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X = 鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 20
Xaa Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Xaa Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 21
His Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> NH2 功能基团存在
<400> 22
His Val Thr Lys Tyr Trp Phe Tyr Arg
1 5
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 23
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 24
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 25
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 25
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 26
Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 27
Thr Gln Ile Glu Asn Leu Lys Glu Lys Gly
1 5 10
<210> 28
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 28
Ala Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala
1 5 10 15
Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ala
20 25
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成氨基酸
<400> 29
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1 5 10 15
Met Ile Glu Gly Trp Tyr Gly Cys Gly
20 25

Claims (80)

1.一种药物组合物，其包含肽的干粉，所述肽包含如下序列中的任一个：SEQ ID NO:2-20。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽的长度为7-20个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述肽包含添加至SEQ ID NO:2的肽的N-末端的至少一个氨基酸。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述肽包含添加至SEQ ID NO:2的肽的C-末端的至少一个氨基酸。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述肽包含添加至SEQ ID NO:2的肽的N-末端和C-末端的至少一个氨基酸。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含L-氨基酸。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含D-氨基酸。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含L-氨基酸和D-氨基酸两者。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含至少一个氘代残基。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含至少一个非标准氨基酸。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述肽包含2个非标准氨基酸。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述非标准氨基酸为鸟氨酸。
14.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含N-末端修饰。
15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含C-末端修饰。
16.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含N-末端修饰和C-末端修饰。
17.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述N-末端修饰为酰化。
18.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述C-末端修饰为酰胺化。
19.根据权利要求1所述的药物组合物，所述肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
21.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
22.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
23.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
24.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
25.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
26.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
27.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
28.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
29.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
30.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
31.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
32.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
33.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
34.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
35.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
36.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
37.根据权利要求1所述的药物组合物，其进一步包括细胞穿透肽(CPP)。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述CPP包含选自包括以下项的组的氨基酸序列：GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:23)、RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:24)和GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:25)。
39.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:2-20中的任何一个的序列的至少两个重复。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述至少两个重复具有相同的氨基酸序列。
41.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述至少两个重复具有不同的氨基酸序列。
42.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干粉通过研磨工艺生产。
43.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干粉通过喷雾干燥工艺生产。
44.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干粉通过喷气研磨生产。
45.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干粉通过球磨生产。
46.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干粉通过湿磨生产。
47.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干粉包含少于10％(重量计)的水。
48.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干粉包含少于1％(重量计)的水。
49.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含赋形剂。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述药物组合物不含赋形剂。
51.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于肺部递送。
52.根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于干粉吸入。
53.根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于吸入加压计量吸入。
54.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制用于口服施用、局部施用或注射。
55.一种喷雾器装置，其包含根据权利要求1-51中任一项所述的药物组合物。
56.一种治疗受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-51中任一项所述的药物组合物。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有炎性疾患。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有纤维化病症。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有肺部炎症、急性肺损伤、肺部感染或肺部。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述受试者患有肺部炎症。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有慢性阻塞性肺疾患(COPD)。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有急性肺损伤或感染。
63.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有肺部感染。
64.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有化学诱导的肺损伤。
65.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有塑型性支气管炎。
66.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有哮喘。
67.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
68.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有吸入烟气诱发的急性肺损伤(ISALI)。
69.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有细支气管炎。
70.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者患有闭塞性细支气管炎。
71.根据权利要求56所述的方法，其中所述肺部疾病为肺部的纤维化病症。
72.根据权利要求56所述的方法，其中所述肺部疾病为间质性肺部疾病。
73.根据权利要求56所述的方法，其中所述肺部疾病为特发性肺纤维化(IPF)或肺部瘢痕形成。
74.根据权利要求56所述的方法，其中所述施用包括干粉吸入。
75.根据权利要求56所述的方法，其中所述施用包括雾化包含变体多肽的溶液。
76.根据权利要求56所述的方法，其进一步包括施用至少一种附加抗纤维化治疗剂。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述至少一种附加抗纤维化治疗剂为NSAID、类固醇、DMARD、免疫抑制剂、生物反应调节剂或支气管扩张剂。
78.根据权利要求56所述的方法，其中所述受试者为人。
79.一种药物组合物，其包含SEQ ID NO:2-20的肽，所述肽配制为具有可吸入粒度的研磨的干粉。
80.一种治疗受试者的方法，其包括通过吸入对所述受试者施用有效量的根据权利要求79所述的组合物。
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