CN107405379A - 多肽治疗剂和其用途 - Google Patents

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Abstract

用于将酶输送到受试者的气道的方法和组合物。在一些方面，提供酶的喷雾化组合物，如纤维蛋白溶酶原活化剂。在另外方面，提供包含酶的全氟化碳组合物，如纤维蛋白溶酶原活化剂。在一些方面，组合物可用于治疗肺感染或急性肺损伤，如吸入烟雾引起的急性肺损伤(ISALI)。

Description

多肽治疗剂和其用途
本申请主张2015年2月27日提交的美国临时申请第62/126,039号的优先权权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
并入序列表
在名称为“UTFBP1049WO_ST25.txt”的文件(其为1KB(如Microsoft中所测量)并且创建于2016年2月26日)中所含有的序列表通过电子提交的方式与此一起提交并且以引用的方式并入本文中。
背景技术
1.发明领域
本发明大体上涉及分子生物学、药物输送和医药领域。更具体地说，其涉及用于将治疗多肽组合物输送到受试者(如通过输送到呼吸系统)的组合物和方法。
2.相关技术说明
在肺损伤期间，p53表达增加，其诱导纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂-1(PAI-1)同时抑制尿激酶型纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)和其受体(uPAR)的表达，从而导致肺上皮细胞(LEC)的凋亡。损伤的机理涉及uPA、uPAR、小窝蛋白-1(“Cav-1”)和β1-整合素之间的细胞表面信号传导相互作用(Shetty等人,2005)。调节这些相互作用的组合物可用于抑制损伤或损坏的肺上皮细胞的凋亡和治疗急性肺损伤和随后的肺纤维化的方法。因此，需要可用于预防或治疗肺损伤的多肽，并且具体来说需要用于治疗输送这类多肽的配制物和方法。
发明内容
在第一实施例中，提供药学上可接受的Cav-1支架结构域多肽的配制物。举例来说，在一些方面，Cav-1支架结构域多肽被配制成用于输送到呼吸系统。因此，在一些方面，提供生物活性Cav-1支架结构域多肽的喷雾化溶液。在优选方面，Cav-1支架结构域多肽包含FTTFTVT的氨基酸序列(“CSP-7”；SEQ ID NO:1)，或相对于SEQ ID NO:1具有1、2或3个氨基酸缺失、取代或插入的序列。在又一方面，提供Cav-1支架结构域多肽，所述Cav-1支架结构域多肽包含DGIWKASFTTFTVTKYWFYR的序列(SEQ ID NO:2)，或相对于SEQ ID NO:2具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸缺失、取代或插入的序列。在某些方面，实施例的Cav-1支架结构域多肽的长度不大于50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸。在特定方面，Cav-1支架结构域多肽由或基本上由FTTFTVT的序列(SEQ ID NO:1)组成。
在又一实施例中，提供药学上可接受的配制物多肽，所述配制物多肽包含NYHYLESSMTALYTLGH的序列(SEQ ID NO:3)，或相对于SEQ ID NO:3具有1、2、3、4或5个氨基酸缺失、取代或插入的序列。在一些方面，药学上可接受的配制物被配制成用于输送到呼吸系统。因此，在一些方面，提供生物活性多肽的喷雾化溶液，所述生物活性多肽包含NYHYLESSMTALYTLGH的序列(SEQ ID NO:3)，或相对于SEQ ID NO:3具有1、2、3、4或5个氨基酸缺失、取代或插入的序列。在某些方面，多肽的长度不大于50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸。
实施例的药学上可接受的配制物可包括但不限于盐、缓冲剂、防腐剂、增稠剂、稳定剂和表面活性剂。在某些方面，配制物为水性配制物。在一些情况下，配制物经冻干并且在一些情况下，可在给药之前溶解于溶液中。在某些方面，实施例的医药配制物基本上不含阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂表面活性剂。在优选方面，实施例的医药配制物经过滤和/或灭菌。在特定方面，医药配制物包含无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液。在其它方面，溶液基本上不含pH缓冲剂。在另外方面，医药配制物包含稳定剂。举例来说，稳定剂可包含氨基酸(如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物或冻干保护剂(例如，右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇或甘露醇)。在特定方面，医药配制物基本上由无菌盐水溶液和生物活性多肽如Cav-1支架结构域多肽组成。用于包含在实施例的医药配制物中的另外组分在下文中详述。在一些方面，实施例的喷雾化组合物包含冻干保护剂(例如，右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇或甘露醇)，其相对于Cav-1支架结构域多肽以100:1到5:1；100:1到10:1；60:1到10:1；50:1到20:1；或40:1到20:1重量/重量(w/w)的比率存在。举例来说，组合物可包含相对于Cav-1支架结构域多肽比率为40:1到20:1w/w(例如，约30:1)的甘露醇。
因此，在一些实施例中，提供包含实施例的多肽的喷雾化组合物。在一些方面，使用振动筛喷雾器制造喷雾化溶液。振动筛喷雾器可为有源或无源振动筛喷雾器。在一些方面，振动筛喷雾器可为专业喷雾器系统(Professional Nebulizer System)或EZ呼吸雾化器(EZ Breathe Atomizer)。在另外方面，使用喷射喷雾器或超声喷雾器制造喷雾化溶液。在一些方面，实施例的喷雾化溶液的中值粒径可在约2.5μm与100μm、2.5.μm与50μm、2.5μm与20μm、2.5μm与8μm或3.0μm与6μm之间。
在一些方面，实施例的医药配制物，这类喷雾化溶液进一步包含生物活性酶。酶可为纤维蛋白溶酶原活化酶。在一些另外方面，纤维蛋白溶酶原活化酶为组织纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)或尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)。uPA可为单链uPA(scuPA)。
在又一实施例中，提供用于治疗或预防肺的疾病、损伤或感染(例如，肺的纤维化病症)的治疗的组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体中实施例的多肽。在组合物为喷雾化组合物的某些实施例中，这类组合物被配制成用于输送到气道。
在又另一个实施例中，提供冻干组合物，所述冻干组合物包含生物活性小窝蛋白-1(Cav-1)支架结构域多肽和至少第一冻干保护剂，其中Cav-1支架结构域多肽在暴露于水溶液时保持可溶。在一些方面，实施例的冻干组合物包含冻干保护剂(例如，右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇或甘露醇)，其相对于Cav-1支架结构域多肽以100:1到5:1；100:1到10:1；60:1到10:1；50:1到20:1；或40:1到20:1重量/重量(w/w)的比率存在。举例来说，组合物可包含相对于Cav-1支架结构域多肽比率为40:1到20:1w/w(例如，约30:1)的甘露醇。
在另一实施例中，提供治疗或预防受试者的肺的疾病、损伤或感染(例如，肺的纤维化病症)的方法，所述方法包含对受试者给药药学上可接受的载体中实施例的有效量多肽。举例来说，方法可包含将生物活性Cav-1支架结构域多肽，如以喷雾化溶液形式提供的多肽给药到受试者的气道。在一些方面，受试者患有急性肺损伤或感染或化学引起的肺损伤。在特定方面，受试者患有塑型性支气管炎、哮喘、慢性阻塞性气道/肺(COPD)、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)吸入烟雾引起的急性肺损伤(ISALI)、支气管扩张、吸入毒素引起的气道疾病(例如，氯气引起的气道疾病)、暴露于芥子气、暴露于颗粒物质(例如，二氧化硅灰尘)、闭塞性细支气管炎、闭塞性细支气管炎伴有机化肺炎、胶原血管肺病(例如，来自狼疮、硬皮病或混合的结缔组织疾病)、间质性肺病(例如，特发性肺纤维化或结节病)、药物引起的肺病和加速的肺纤维化(例如，出现在包括ARDS的急性肺损伤之后)。
在一些方面，给药实施例的医药配制物的方法包含将包含多肽(如Cav-1支架结构域多肽)的溶液喷雾化。喷雾化可包含或可不包含使用超声或喷射喷雾器喷雾化包含Cav-1支架结构域多肽的溶液。在其它方面，喷雾化包含使用振动筛喷雾器喷雾化包含Cav-1支架结构域多肽的溶液。振动筛喷雾器可为有源或无源振动筛喷雾器。在一些方面，振动筛喷雾器可为专业喷雾器系统或EZ呼吸雾化器。
在另一方面，喷雾化实施例的医药配制物包含获得冻干多肽组合物(例如，包含Cav-1支架结构域多肽)，在水溶液中重构冻干酶组合物以提供多肽溶液以及喷雾化所述多肽溶液。在一些方面，根据上述实施例和方面给药喷雾化溶液。在另一方面，对受试者另外给药生物活性纤维蛋白溶酶原活化酶。纤维蛋白溶酶原活化酶可以喷雾化溶液形式给药到受试者的气道。纤维蛋白溶酶原活化酶可为tPA或uPA。在特定方面，uPA可为单链uPA(scuPA)。
在又另一个实施例中，提供制备用于给药到受试者的气道的多肽，如生物活性Cav-1支架结构域多肽的方法，所述方法包含喷雾化包含多肽的溶液以提供喷雾化溶液。
如本文所使用，关于指定组分的“基本上不含”在本文中用于意指没有指定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何不期望污染物产生的指定组分的总量远低于0.05％。最优选的是其中利用标准分析方法没有检测到一定量的指定组分的组合物。
术语“给药”是指通过吸入或经由植入式储存器为口腔、体表、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、微动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道的给药。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或注入技术。在一些实施例中，给药为经由吸入喷雾化组合物。
术语“气道”在本文中是指呼吸道的任何部分，包括上呼吸道、呼吸气道和肺。上呼吸道包括鼻子和鼻通道、口以及喉部。呼吸气道包括喉、气管、支气管和细支气管。肺包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡。
术语“吸入烟雾引起的急性肺损伤”和“ISALI”在本文中可互换使用并且是指由烟雾吸入所引起的急性肺损伤(ALI)形式。ALI还称为“轻微ARDS”。ALI可通过发现受试者的以下病征中的一个或多个而定义：1)在胸部x射线的两侧肺浸润，2)如临床上指示，当通过右心导管插入术测量时，肺毛细血管楔压<18mmHg(2.4kPa)，和3)PaO2/FiO2<300mmHg(40kPa)。在一些实施例中，治疗ISALI包括治疗以下病症中的一个或多个：氧合作用降低、气道阻塞(包括严重的气道阻塞)、纤维素性气道脱落物或碎屑以及肺泡纤维蛋白沉积。
术语“喷雾化”、“喷雾化的”以及其它语法变化形式在本文中是指将液体转化成小气溶胶液滴的过程。在一些实施例中，气溶胶液滴的中数直径为约2到10μm。在一些实施例中，气溶胶液滴的中数直径为约2到4μm。
如在说明书中所使用，“一个或一种(a或an)”可意指一个(种)或多个(种)。如本文所使用，在一个或多个权利要求中，当结合词语“包含(comprising)”使用时，词语“一个或一种”可意指一个(种)或多于一个(种)。
尽管本公开支持仅涉及替代方案和“和/或”的定义，但是除非明确指示为是指仅替代方案或所述替代方案相互排斥，否则在权利要求中使用术语“或(or)”用于意指“和/或(and/or)”。如本文所使用，“另一个(another)”可意指至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“约”用于指示一个值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变化，或在研究受试者间存在的变化。
本发明的其它目的、特征及优点将通过以下具体实施方式而变得显而易见。然而，应理解，具体实施方式和特定实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅以说明方式给出，因为通过此具体实施方式，在本发明精神和范围内的各种变化和修改对所属领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且包括在此以进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个以及在本文中呈现的特定实施例的具体实施方式可更好地理解本发明。
图1-CSP分散体喷雾化步骤的示意图。
图2-根据实例1中描述的不同制剂在喷雾化之后测量组合物的CSP-7肽内含物。
图3-在处理和喷雾化之后CPS-7聚体的化学分析数据，以剩余肽的％给出。
具体实施方式
I.本发明
本文提供生物活性多肽，如Cav-1支架结构域多肽的医药配制物。举例来说，在一些方面，Cav-1支架结构域多肽被配制成用于输送到呼吸系统。可通过在水溶液中配制并且使用喷雾器如振动筛喷雾器喷雾化酶溶液来制备用于给药到受试者的气道的多肽。在本文中详述的本研究令人惊讶的发现，多肽如Cav-1支架结构域多肽的喷雾化产生维持显著比例的多肽的喷雾化组合物。本文还提供通过经由气道对受试者给药治疗有效量的喷雾化多肽如Cav-1支架结构域多肽来治疗肺损伤和疾病的方法。
II.生物活性多肽
实施例的某些方面涉及可用于治疗和预防肺的感染、损伤或疾病的生物活性多肽。具体来说，对于根据实施例的用途的多肽可包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3至少约80％、85％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在某些方面，多肽实施例可包含相对于SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的序列的1、2、3或更多个氨基酸取代、缺失或插入。此外，在一些方面，多肽的长度不大于50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8或7个氨基酸。在另一方面，实施例的多肽包含1、2、3或更多个SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的重复。
术语“同一性”或“同源性”应解释为意指在比对序列并且引入缺口(必要时)以实现对于整个序列的最大同一性百分比之后，候选序列中与和其比较的对应序列的残基相同的氨基酸残基的百分比，而不考虑任何保守替代作为序列同一性的部分。N-或C-端延伸或插入均不应解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序在所属领域中是众所周知的。可使用序列分析软件测量序列同一性。
术语“多肽”以其最宽泛意义而言用于指两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另一实施例中，亚单位可通过其它键，例如酯、醚等连接。如本文所使用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸(包括甘氨酸和D或L光学异构体两者)和氨基酸类似物以及肽模拟物。如果肽链短，那么三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链长，那么肽通常称为多肽或蛋白质。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有某一百分比(例如，80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”或“同源性”，意指在比对时，比较两个序列中相同碱基(或氨基酸)的百分比。可使用所属领域中已知的软件程序，例如在《最新分子生物学实验方法汇编(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)》(F.M.Ausubel等人编，1987)增刊30，章节7.7.18，表7.7.1中所述那些测定此比对和同源性或序列同一性百分比。优选地，默认参数用于比对。优选的比对程序为使用默认参数的BLAST。具体来说，优选的程序为BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码(genetic code)＝标准(standard)；过滤器(filter)＝无(none)；链(strand)＝两条(both)；截止值(cutoff)＝60；预期值(expect)＝10；矩阵(Matrix)＝BLOSUM62；描述(Descriptions)＝50个序列；排序(sortby)＝高分数(HIGH SCORE)；数据库(Databases)＝无冗余(non-redundant)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。
在一些方面，可在多肽中在其中取代为具有类似亲水性的氨基酸的一个或多个位置处进行氨基酸取代。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性在所属领域中是众所周知的(Kyte和Doolittle，1982)。公认氨基酸的相对亲水性特征有助于所得蛋白质的二级结构，这又限定蛋白质与其它分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。因此，这类保守取代可在多肽中进行并且对其活性将可能仅具有较小的影响。如在美国专利4,554,101中所述，已经对氨基酸残基赋予以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。这些值可用作导向，并因此亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，亲水性值在±1内的那些氨基酸的取代是特别优选的，并且亲水性值在±0.5内的那些氨基酸的取代甚至更具体地说是优选的。因此，本文所述的多肽中的任一个可通过氨基酸(对于具有类似亲水性值的不同但同源的氨基酸)的取代而修饰。亲水性在+/-1.0或+/-0.5点内的氨基酸被认为是同源的。
缀合物
本发明的组合物和方法涉及生物活性多肽，如Cav-1支架结构域多肽，其可与异源肽片段或聚合物如聚乙二醇缀合。在另外方面，经工程化的多肽可连接到PEG以增加酶的流体动力学半径并因此增加血清持久性。在某些方面，所公开的多肽可缀合到任何靶向剂，如具有特异性且稳定地结合到外部受体或肿瘤细胞上的结合位点能力的配位体(美国专利公开2009/0304666)。
A.融合蛋白质
本发明的某些实施例涉及融合蛋白质。这些分子可具有在N-或C-端连接到异源结构域的实施例的多肽。举例来说，融合体还可采用来自其它物种的前导序列以允许重组表达异源宿主中的蛋白质。另一种有用的融合包括添加蛋白质亲和标签如血清白蛋白亲和标签或六个组氨酸残基，或免疫活性结构域如抗体表位(优选可断裂的)以促进融合蛋白质的纯化。非限制性亲和标签包括聚组氨酸、甲壳质结合蛋白质(CBP)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)以及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
在具体实施例中，实施例的多肽可连接到增加体内半衰期的肽，如XTEN多肽(Schellenberger等人，2009)、IgG Fc结构域、白蛋白或白蛋白结合肽。
产生融合蛋白质的方法对所属领域的技术人员来说是众所周知的。举例来说，可通过从头合成整个融合蛋白质或通过附接编码异源结构域的DNA序列，接着表达完整的融合蛋白质来制造这类蛋白质。
可通过连接基因与桥接DNA片段来促进制造恢复父代蛋白质的功能活性的融合蛋白质，所述桥接DNA片段编码在串列连接的多肽之间剪接的肽连接子。连接子将具有足够的长度以允许适当的折叠所得融合蛋白质。
B.连接子
在某些实施例中，实施例的多肽可使用双官能交联试剂而化学地缀合或在蛋白质水平与肽连接子融合。
双官能交联试剂已经广泛地用于多种目的，包括制备亲和基质、修饰和稳定不同结构、标识配位体和受体结合位点以及结构研究。合适的肽连接子还可用于连接实施例的多肽，如Gly-Ser连接子。
带有两个相同官能团的同型双官能试剂在诱导相同与不同大分子或大分子的亚单位之间的交联和将多肽配位体连接到其特异性结合位点方面被证明是高效的。异型双官能试剂含有两个不同官能团。通过利用两个不同官能团的不同反应性，可选择性并顺序地控制交联。双官能交联试剂可根据其官能团的特异性来划分，例如氨基-、巯基-、胍-、吲哚-、羧基-特异性基团。其中，针对游离氨基的试剂变得尤其受欢迎，因为它们在商业上可以获得、易于合成并且可以在温和反应条件下应用它们。
大多数异型双官能交联试剂含有伯胺-反应性基团和硫醇-反应性基团。在另一实例中，描述了异型双官能交联试剂和使用所述交联试剂的方法(美国专利第5,889,155号，特定地以全文引用的方式并入本文中)。交联试剂将亲核酰肼残基与亲电的马来酰亚胺残基组合，从而在一个实例中使得醛偶联到游离硫醇。交联试剂可经修饰以交联各种官能团。
另外，所属领域的技术人员已知的任何其它连接剂/偶联剂和/或机制可用于组合实施例的多肽，例如抗体-抗原相互作用、抗生物素蛋白-生物素键、酰胺键、酯键、硫酯键、醚键、硫醚键、磷酸酯键、磷酰胺键、酸酐键、二硫化物键、离子和疏水性相互作用、双特异性抗体和抗体片段或其组合。
优选地将采用在血液中具有适当稳定性的交联剂。许多类型的含有二硫键的连接子已知可成功地用于缀合靶向剂和治疗/预防剂。含有具有位阻的双硫键的连接子可证明在体内得到较大稳定性。因此，这些连接子为连接剂的一个基团。
除阻碍的交联剂以外，还可据此采用非阻碍的连接子。不考虑含有或生成受保护的二硫键的其它有用交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫杂环戊烷(Wawrzynczak和Thorpe，1987)。这类交联剂的用途在所属领域中是众所周知的。另一实施例涉及柔性连接子的使用。
在化学缀合后，通常将会化肽以将缀合物与非缀合剂和其它污染物分离。许多纯化技术可用于提供足够纯度的缀合物，从而使得它们临床上有用。
基于大小分离如凝胶过滤、凝胶渗透或高效液相层析的纯化方法通常将最有用。还可使用其它层析技术，如蓝色-琼脂糖凝胶(Blue-Sepharose)分离。从内含体纯化融合蛋白质的常规方法可为有用的，如使用弱清洁剂，如N-月桂酰基-肌氨酸钠(SLS)。
C.PEG化
在某些方面，实施例的方法和组合物与所公开多肽的PEG化相关。PEG化为将聚(乙二醇)聚合物链共价附接到另一个分子，通常是药物或治疗蛋白质的方法。通常通过用目标大分子培养PEG的反应性衍生物来实现PEG化。PEG共价附接到药物或治疗性蛋白质可“掩蔽”来自宿主免疫系统的药剂(降低免疫原性和抗原性)或增加药剂的流体动力学尺寸(在溶液中的尺寸)，这通过降低肾清除率延长其循环时间。PEG化还可提供对疏水性药物和蛋白质的水溶性。
PEG化的第一步为在一个或两个末端处对PEG聚合物进行适当的官能化。在每个末端处用同一反应性部分活化的PEG被称为“同型双官能”，然而如果存在的官能团是不同的，那么PEG衍生物被称作“异型双官能”或“杂官能”。制备化学活性或活化的PEG聚合物衍生物以将PEG附接到期望分子。
对于PEG衍生物选择适当的官能团是基于将偶联到PEG的分子上的可用反应性基团的类型。对于蛋白质，通常是反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸。还可使用N-端氨基和C-端羧酸。
用于形成第一代PEG衍生物的技术通常是使PEG聚合物与和羟基反应的基团，通常是酸酐、酰氯、氯甲酸酯以及碳酸酯反应。在第二代PEG化化学中，更高效官能团如醛、酯、酰胺等可用于进行缀合。
由于PEG化的应用已经变得越来越先进和精密，对用于缀合的异型双官能PEG的需要增加。这些异型双官能PEG非常适用于连接两个实体，在所述两个实体中需要亲水性、柔性以及生物相容性间隔件。对于异型双官能PEG，优选的端基为马来酰亚胺、乙烯基砜、吡啶基二硫键、胺、羧酸以及NHS酯。
最常见的修饰剂或连接子是基于甲氧基PEG(mPEG)分子。其活性取决于将蛋白质-修饰基团加成到醇端。在一些情况下，聚乙二醇(PEG二醇)用作前体分子。随后在两端修饰二醇以便制备异源或同源二聚PEG连接分子。
蛋白质通常在亲核位点，如未质子化硫醇(半胱氨酰残基)或氨基处PEG化。半胱氨酰基-特异性修饰试剂的实例包括PEG马来酰亚胺、PEG碘乙酸酯、PEG硫醇和PEG乙烯基砜。所有四种修饰试剂在温和条件和中性到稍碱性pH下都具有强烈的半胱氨酰基-特异性，但是各自均具有一些缺点。由马来酰亚胺形成的硫醚在碱性条件下可有些不稳定，因此在此连接子情况下对配制物选择可存在一些局限。由碘PEG形成的硫代氨基甲酸酯键更稳定，但是游离碘可在一些条件下修饰酪氨酸残基。PEG硫醇形成具有蛋白质硫醇的二硫键，但是此键在碱性条件下也可不稳定。相比于马来酰亚胺和碘PEG，PEG-乙烯基砜反应性相对缓慢；然而，形成的硫醚键非常稳定。其较慢的反应速率还可使PEG-乙烯基砜反应更易于控制。
很少进行在天然半胱氨酰基残基处的位点-特异性PEG化，因为这些残基通常呈二硫键形式或者生物活性需要这些残基。在另一方面，定点诱变可用以结合用于硫醇-特异性连接子的半胱氨酰基PEG化位点。半胱氨酸突变必须被设计成使得其可到达PEG化试剂并且在PEG化之后仍具有生物活性。
胺-特异性修饰剂包括PEG NHS酯、PEG三氟乙磺酸酯、PEG醛、PEG异硫氰酸酯以及若干其它修饰剂。所有均在温和条件下反应并且对氨基极具特异性。PEG NHS酯可能是一种更具反应性的药剂；然而，其高反应性可使得PEG化反应难以大规模控制。PEG醛与氨基形成亚胺，其然后用氰基硼氢化钠还原成仲胺。不同于硼氢化钠，氰基硼氢化钠将不还原二硫键。然而，此化学物质具有高毒性并且必须小心处理，特别在较低pH下其变得有挥发性。
由于在大部分蛋白质上的多个赖氨酸残基，所以位点-特异性PEG化可成为挑战。幸运地，因为这些试剂与未质子化的氨基反应，所以通过在较低pH下执行所述反应可以对较低pK氨基直接PEG化。通常α-氨基的pK比赖氨酸残基的ε-氨基低1-2个pH单位。通过在pH7或低于7下使分子PEG化，可常常获得针对N-端的高选择性。然而，这仅在对于生物活性不需要蛋白质的N-端部分的情况下可行。另外，药物动力学受益于PEG化常常胜于体外生物活性的显著损失，这导致产物具有大得多的体内生物活性而不管PEG化化学。
当开发PEG化步骤时，需要考虑若干参数。幸运地，通常存在不大于四个或五个关键参数。用以优化PEG化条件的“试验设计”方法可是非常有用的。对于硫醇-特异性PEG化反应，考虑的参数包括：蛋白质浓度、PEG与蛋白质比率(以摩尔为基准)、温度、pH、反应时间以及在一些情况下，氧气的排除。(氧气可促进通过蛋白质的分子间二硫键形成，其将降低PEG化产物的收率)。对于胺-特异性修饰应该考虑(除氧气之外)相同因素，例外为pH甚至可为更重要的，特别当靶向N-端氨基时。
对于胺-特异性修饰和硫醇-特异性修饰两者，反应条件可影响蛋白质的稳定性。这可限制温度、蛋白质浓度和pH。此外，在开始PEG化反应之前应该已知PEG连接子的反应性。举例来说，如果PEG化剂仅为70％活性，那么所用PEG的量应该确保在蛋白质-PEG反应化学计量中仅计数活性PEG分子。
III.医药组合物
预期实施例的多肽，如Cav-1支架结构域多肽，可全身性或局部给药以抑制细胞凋亡并且用于治疗和防止对肺组织的损坏。他们可经静脉内、鞘内和/或腹膜内给药。在优选方面，多肽被局部输送到气道，如给药喷雾化配制物。他们可单独或与抗纤维化化合物组合给药。
并未考虑本发明受治疗制剂的具体性质限制。举例来说，这类组合物可以配制物形式以及生理上可耐受液体、凝胶、或固体载体、稀释剂和赋形剂形式提供。对于兽医用途而言，这些治疗制剂可给药到哺乳动物，如家畜和以类似于其它治疗剂的方式在人类中的临床使用。一般而言，针对疗效所需的剂量将根据使用类型和给药模式以及单独受试者的特殊化要求而变化。
这类组合物通常制备成如可注射的液体溶液或悬浮液。适当的稀释剂和赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。另外，如果需要，组合物可含有少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。
在考虑临床应用的情况下，可需要制备呈适于预期应用形式的包含蛋白质、抗体和药物的医药组合物。一般来说，医药组合物可包含溶解或分散于药学上可接受的载体中的有效量的一种或多种实施例的多肽或额外药剂。短语“医药或药学上可接受”是指当视需要给药到动物例如人类时，并不产生不利、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有通过本文所公开方法隔离的至少一种实施例的多肽或额外活性成分的医药组合物将为所属领域的技术人员已知的，如通过《雷明顿氏医药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》，第18版，1990所举例说明，其以引用的方式并入本文中。此外，对于动物(例如，人类)给药，将理解制剂应满足如FDA生物学标准办公室(the FDAOffice of Biological Standards)所要求的无菌、发热性、一般安全性和纯度标准。
如本文所使用,“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、这类相似的材料及其组合，如将为所属领域的普通技术人员已知的(参见，例如《雷明顿氏医药科学》，第18版，1990，其以引用的方式并入本文中)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于医药组合物中。
根据载体是否以固体、液体或气溶胶形成给药和对于给药路径如注射其是否需要灭菌，本发明的某些实施例可包含不同类型的载体。所述组合物可经静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌内、皮下、经粘膜、经口、体表、局部、通过吸入(例如，吸入喷雾化配制物)、通过注射、通过注入、通过连续注入、通过直接沐浴靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、以脂质组合物(例如，脂质体)或通过其它方法或前述的任何组合，如将为所属领域的普通技术人员已知的(参见，例如《雷明顿氏医药科学》，第18版，1990，其以引用的方式并入本文中)。
经修饰多肽可被配制成以游离碱、中性、或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(例如，由蛋白质组合物的游离氨基形成的那些)，或所述酸加成盐由无机酸(例如盐酸或磷酸)或这类有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成。由游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或这类有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。在配制时，溶液将以与剂量配制物相容的方式并且以如治疗有效的这类量给药。所述配制物易于以多种剂型给药，如配制成用于肠胃外给药如可注射溶液、或用于输送到肺的气溶胶、或配制成用于食物给药如药物释放胶囊等。
另外，根据本发明的某些方面，适合于给药的组合物可在具有或不具有惰性稀释剂情况下提供在药学上可接受的载体中。载体应该是可吸收的并且包括液体、半固体(即，膏体)或固体载体。除非任何常规的介质、药剂、稀释剂或载体对接受体不利或对包含于其中的组合物的治疗效果不利，否则其以用于实践所述方法的可给药组合物形式使用是适当的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填料等或其组合。组合物还可包含延缓一种或多种组分氧化的各种抗氧化剂。另外，防止微生物的作用可通过防腐剂实现，如各种抗菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
根据本发明的某些方面，组合物与载体以任何便利和实用的方式组合，即，通过溶液、悬浮液、乳化、掺合物、封装、吸收等。这类步骤对于所属领域的技术人员来说是常规的。
在本发明的具体实施例中，组合物与半固体或固体载体充分地组合或混合。可以任何便利方式，如研磨进行所述混合。还可在混合方法中添加稳定剂以便保护组合物免于损失治疗活性，即，在胃中变性。用于组合物的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸(如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物或冻干保护剂(如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等)。
在另外的实施例中，本发明可涉及医药脂质媒剂组合物的使用，所述医药脂质媒剂组合物包括实施例的多肽、一种或多种脂质和水性溶剂。如本文所使用，术语“脂质”将被定义成包括在特征上不溶于水并且可用有机溶剂萃取的宽范围物质中的任一种。此宽类别的化合物对于所属领域的技术人员是众所周知的，并且如本文所使用的术语“脂质”，其不限于任何具体结构。实例包括含有长链脂肪族烃和其衍生物的化合物。脂质可为天然存在或合成的(即，经人类设计或制造)。然而，脂质通常为生物物质。生物脂质在所属领域中是众所周知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、溶血脂质、鞘醣脂、糖脂、硫脂、带有醚-和酯-连接的脂肪酸的脂质、可聚合脂质及其组合。当然，除本文所述的那些特异性化合物之外被所属领域的技术人员理解为脂质的化合物还涵盖在组合物和方法中。
所属领域的普通技术人员将熟悉可用于将组合物分散在脂质媒剂中的技术范围。举例来说，实施例的多肽可分散于含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、共价键结到脂质、作为悬浮液包含于脂质中、用胶束或脂质体包含或复合或通过所属领域的普通技术人员已知的任何方法以其它方式与脂质或脂质结构相关联。分散体可引起或可不引起脂质体的形成。
可通过身体和生理因素，如体重、病症的严重程度、被治疗疾病的类型、先前或同时治疗性干预、患者的原发症以及给药路径测定给药到动物患者的组合物的实际剂量。取决于给药的剂量和路径，优选剂量和/或有效量的给药次数可根据受试者的反应而变化。负责给药的从业人员将在任何情况下测定组合物中一种或多种活性成分的浓度和用于个别受试者的一个或多个适当剂量。
在某些实施例中，医药组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其它实施例中，活性化合物可包含约2％到约75％之间重量的单元，或约25％到约60％之间，例如，和可从其中得出的任何范围的单元。天然地，可以将在任何给定单位剂量的化合物中获得适当剂量的方式制备每种治疗上有用组合物中一定量的一种或多种活性化合物。制备这类医药配制物的所属领域的技术人员将考虑因素，如溶解度、生物可用性、生物半衰期、给药路径、产品保存期限以及其它药理学考虑因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可是理想的。
在其它非限制性实例中，剂量还可包含每次给药每公斤体重约1微克、每公斤体重约5微克、每公斤体重约10微克、每公斤体重约50微克、每公斤体重约100微克、每公斤体重约200微克、每公斤体重约350微克、每公斤体重约500微克、每公斤体重约1毫克、每公斤体重约5毫克、每公斤体重约10毫克、每公斤体重约50毫克、每公斤体重约100毫克、每公斤体重约200毫克、每公斤体重约350毫克、每公斤体重约500毫克到每公斤体重约1000毫克或更多以及其中可得出的任何范围。在由本文中所列的数值可得出的范围的非限制性实例中，基于以上描述的数值，给药范围可为每公斤体重约5毫克到每公斤体重约100毫克、每公斤体重约5微克到每公斤体重约500毫克等。
在一些方面，医药配制物包含一种或多种表面活性剂。根据所公开方法使用的表面活性剂包括离子表面活性剂和非离子表面活性剂。代表性非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯如-20和TWEEN-表面活性剂(新泽西州布里奇沃特的ICI美洲有限公司(ICI Americas Inc.of Bridgewater,N.J.))；泊洛沙姆(poloxamer)(例如，泊洛沙姆188)；表面活性剂(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma of St.Louis,Mo.))；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或十八烷基-磺基甜菜碱；十二烷基-、肉豆蔻基-、亚油醇基-或十八烷基-肌氨酸；亚油醇基-、肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂醇酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻油酰胺丙基-、palnidopropyl-、或(例如，月桂醇酰胺丙基)；肉豆蔻油酰胺丙基-、palmidopropyl-、或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油基牛磺酸二钠；MONAQUATTM表面活性剂(新泽西州帕特森的蒙娜工业有限公司(Mona IndustriesInc.of Paterson,N.J.))；聚乙基乙二醇；聚丙基乙二醇；乙烯和丙二醇的嵌段共聚物如表面活性剂(新泽西州蒙特奥利弗的BASF公司(BASF of Mt.Olive,N.J.))；寡聚(环氧乙烷)烷基醚；烷基(硫基)葡糖苷、烷基麦芽糖苷；及磷脂。举例来说，表面活性剂可以约0.01％到约0.5％(表面活性剂的重量相对于配制物的其它固体组分的总重量；“w/w”)，约0.03％到约0.5％(w/w)，约0.05％到约0.5％(w/w)或约0.1％到约0.5％(w/w)的量存在于配制物中。然而，在另外方面，实施例的医药配制物基本上不含非离子表面活性剂或基本上不含所有表面活性剂。
另外，本文提供包含实施例的多肽和全氟化碳(PFC)的组合物。在一些实施例中，组合物中的多肽选自SEQ ID NO:1-3的多肽中的一种。在另外的实施例中，组合物中PFC选自全氟十氢萘、全氟-1,3-二甲基环己烷、FC-75、全氟辛烷和全氟甲基溴辛烷。在一些方面，PFC是或包含具有环烷基，如全氟十氢萘、全氟-1,3-二甲基环己烷或FC-75的PFC。应理解，纤维蛋白溶酶原活化剂和PFC可呈任何比率或浓度。在一些实施例中，组合物包含以约0.005到0.040mg/mL PFC的浓度的纤维蛋白溶酶原活化剂。
另外提供治疗受试者的肺损伤或疾病(例如，吸入烟雾引起的急性肺损伤(ISALI))的方法，所述方法包含对受试者给药治疗有效量的组合物，所述组合物包含实施例的多肽和PFC。因此，在一些实施例中，提供给药多肽和PFC组合物的方法，其中组合物中的PFC选自全氟十氢萘和全氟甲基溴辛烷。
术语“全氟化碳”和“PFC”可互换使用并且在本文中是指主要含有碳和氟的有机氟化合物。应理解，术语“全氟化碳”意指包括含有除碳和氟以外的分子的高度氟化的分子并且通常被称为碳氟化合物。全氟化碳的实例包括但不限于全氟十氢萘、全氟甲基溴辛烷、FC77、PF 5060和Rimar 101。根据本发明使用的多种PFC在气体溶解度、密度和表面张力方面具有类似的物理化学特性，但是在不透射线性和动态粘度方面可不同，这对在清创术过程中气道脱落物的观测和移动性具有影响。每个列出的全氟化碳均包括所有相关的异构体，如立体异构体、对映异构体和非对映异构体。
IV.气溶胶分散体和喷雾化装置
可使用任何适当的装置使配制物气溶胶化，所述装置包括但不限于喷射喷雾器、超声喷雾器、定量吸入剂(MDI)以及通过加压通道穿过喷口或喷嘴使液体气溶胶化的装置(例如，药物输送装置，加利福尼亚州哈沃德的Aradigm公司)。如下文中另外所述，对于将配制物输送到受试者，肺输送装置还可包括呼吸机，其任选地与防护罩、管嘴、湿气吸入装置和/或引导使用者正确且自动地吸气并且在呼吸中在适当时间输送药物的平台组合。可根据本发明方法使用的代表性气溶胶化装置包括但不限于以下所述的那些：美国专利第6,357,671号；第6,354,516号；第6,241,159号；第6,044,841号；第6,041,776号；第6,016,974号；第5,823,179号；第5,797,389号；第5,660,166号；第5,355,872号；第5,284,133号；以及第5,277,175号和美国公开专利申请第20020020412号和第20020020409号。
使用喷射喷雾器，来自压缩机或医院空气管线的压缩气体穿过被称为喷口的狭窄收缩部。这产生低压区域，并且来自贮存器的液体药剂向上抽吸通过进料管并且通过空气流分段成液滴。只有最小的液滴直接离开喷雾器，而大多数液滴冲击挡板和壁并且返回到贮存器。因此，执行喷射喷雾化所需的时间根据待喷雾化组合物的体积而变化，除了其它因素以外，此时间可容易地由所属领域的技术人员调节。
定量吸入器(MDI)可用于以比使用喷雾器通常输送的更加浓缩形式输送本发明的组合物。对于最优效果，MDI输送系统需要适当的给药技术，其包括气溶胶输送与吸入的协同致动、约0.5到0.75公升/秒的缓慢吸入、接近吸气容量吸入的深呼吸以及至少4秒的屏息。当治疗受益于相对较短治疗时间和较低成本时，使用MDI的肺输送是便利且适当的。任选地，在喷雾化期间可将配制物加热到约25℃到约90℃以促进有效的液滴形成和连续的输送。参见例如，美国专利第5,299,566号。
实施例的气溶胶组合物包含具有用于在肺内有效输送的适当尺寸的组合物的液滴。在一些情况下，表面活性剂配制物被输送到肺支气管，更优选地到细支气管，再更优选地到肺泡管以及再更优选地到肺泡。气溶胶液滴通常直径小于约15μm、直径小于约10μm、直径小于约5μm或直径小于约2μm。为了有效输送到人类受试者的肺泡支气管，气溶胶组合物可优选地包含直径为约1μm到约5μm的液滴。
可使用所属领域中已知的技术评估液滴尺寸，所述技术例如级联、冲击、激光衍射以及光学图案。参见McLean等人(2000)《分析化学(Anal Chem)》72:4796-804，Fults等人(1991)《药学和药理学杂志(J Pharm Pharmacol)》43:726-8以及Vecellio None等人(2001)《气溶胶医学杂志(J Aerosol Med)》14:107-14。
可使用所属领域中的已知技术评估气溶胶化之后的蛋白质稳定性，所述已知技术包括尺寸排阻层析；电泳技术；光谱技术如UV光谱分析和圆二色谱光谱分析以及蛋白质活性(体外或体内测量)。为了体外执行蛋白质稳定性的分析，可收集气溶胶组合物并然后将其蒸馏或吸收到过滤器上。为了执行体内分析，或用于将组合物肺给药到受试者，用于气溶胶化的装置被调适成由受试者吸入。举例来说，可通过测定蛋白质聚集的水平来评估蛋白质稳定性。优选地，本发明的气溶胶组合物基本上不含蛋白质聚集体。可使用DLS(DynaPro-801TC，弗吉尼亚州夏洛茨维尔的ProteinSolutions有限公司(DynaPro-801TC,ProteinSolutions Inc.of Charlottesville,Va.))和/或通过UV分光光度法定性测定可溶性聚集体的存在。
术语“振动筛喷雾器”在本文中是指基于使用具有多个孔的振动筛或板(孔板)以产生精细-颗粒、低速气溶胶的普遍原理操作的任何喷雾器。一些喷雾器可含有具有1000与7000个孔洞之间的筛/隔膜，筛/隔膜在液体贮存器的顶部振动(参见，例如美国专利公开第20090134235号和Waldrep与Dhand 2008，每个专利均以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，振动筛喷雾器为专业喷雾器、OmronPari或EZ呼吸雾化器。在一些方面，振动筛喷雾器的振动频率在约50到250kHz、75到200kHz、100到150kHz或约120kHz之间。这些装置具有高的输送气溶胶到肺的效率并且这些装置中剩余液体的体积为最小，这对于昂贵且强效化合物如纤维蛋白溶酶原活化剂而言是优点。
在某些方面，使用振动筛喷雾器制造实施例的喷雾化组合物。举例来说，可利用活性振动筛喷雾器(例如，专业喷雾器系统)制造所述组合物。对这类系统和其操作的描述可发现于例如美国专利第6,921,020号；第6,926,208号；第6,968,840号；第6,978,941号；第7,040,549号；第7,083,112号；第7,104,463号；以及第7,360,536号，每个专利均以其全文引用的方式并入本文中。在又一方面，可利用无源振动筛喷雾器，如Omron或EZ呼吸雾化器制造实施例的组合物。
V.实例
包括以下实例以展示本发明的优选实施例。所属领域的技术人员应理解，以下实例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中操作良好的技术，并且因此可视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，所属领域的技术人员应了解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可对所公开的特定实施例作出许多改变并且仍获得相同或类似结果。
实例1-肽喷雾化
材料-肽由德克萨斯大学泰勒健康科学中心(The University of Texas HealthScience Center at Tyler)获得并且存储在-80℃下。肽为CSP、CSP-7或乱序的。使用两种类型的液体介质，两者都存储在室温下。由吉毕科公司(Gibco)制造的批号14190-144的Dulbecco磷酸盐缓冲溶液(DPBS)购自犹他州奥斯汀市(UT-Austin)的Biostore公司。DPBS的组分示出在以下表1中。由应用制药有限责任公司(APP Pharmaceuticals,LLC.)制造，NDC 63323-186-10，批号6008039的无菌标准盐水(NS)(封装在10mL小瓶中并且含有0.9％w/v氯化钠)购自Forty Acres Pharmacy。
表1.DPBS调配物
利用两种类型的喷雾器。专业喷雾器系统(活性振动筛，戈尔韦(Galway)的Aerogen公司)为用于多个患者使用的便携式医疗装置，其旨在使经批准与通用喷雾器一起使用的用于吸入的医生规定药剂气溶胶化。EZ呼吸雾化器(无源振动筛，美国内弗伦制药公司(Nephron Pharmaceuticals Corporation,USA))为这样的装置，其旨在将呈气溶胶形式的液体药剂喷洒到人将呼吸的空气中。这些装置在有和没有机械通风或其它正压呼吸辅助情况下供患者使用。
CSP分散体制备-根据不同制剂制得测试闪烁小瓶。在第一制剂中，称量4mg的乱序或CSP肽并且将其置于小瓶中，然后添加8mL的PBS或NS。在第二制剂中，称量3mg的乱序或CSP-7肽并且将其置于小瓶中，然后添加6mL的PBS或NS。将小瓶置于磁性搅拌上并且搅拌30分钟。然后将分散体置于Aeroneb Pro或EZ呼吸雾化器中。通过冷凝将样品收集在冷冻的小瓶中。每次收集0.5mL样品并且立即存储在-80℃下(参见图1)。
分析收集样品的肽内含物(参见图2)。在CSP7肽分散于磷酸盐缓冲盐水或标准盐水中后并且通过两个振动筛喷雾器喷雾化之后，发现保留有大量的CSP7肽。因此，这些研究展示CSP7可被配制成用于吸入。
实例2-肽冻干和喷雾化
配制物制备-使用冻干制备CSP 7聚体的冻干饼。500μg/mL的CSP 7聚体溶液制备如下：用最小体积的氢氧化铵(pH 7-8)将肽粉末溶解于DPBS中并且将1.5％w/v的甘露醇添加到溶液中。使用0.2μm SFCA无菌针筒过滤器(纽约科宁的康宁有限公司(Corning Inc.,Corning,NY))无菌过滤所述溶液。还测试了过滤效果。将1毫升的滤液填充到硼硅酸盐玻璃小瓶中并且使用VirTis优势冻干器(纽约加德纳的VirTis有限公司(VirTis CompanyInc.,Gardiner,NY))冻干。如表2中概述设置冻干循环参数。初次干燥时间根据样品数目变化。
表2.冻干循环参数
CSP 7聚体肽的喷雾化研究-利用用于注射的无菌水(500μg/mL)重构冻干肽。使用两种可商购品牌的振动筛喷雾器展示喷雾化以研究喷雾器效率的变化。使用Pro(加利福尼亚州山景城的Aerogen公司(Aerogen,Mountain View,CA))或EZ呼吸雾化器(型号EZ-100，佛罗里达州奥兰多的内弗伦制药公司(Model EZ-100,NephronPharmaceuticals Corporation,Orlando,FL))雾化溶液。在观察不到气溶胶云状物之后停止喷雾化。将每个样品的冷凝物收集在聚丙烯管中并且在分析之前一直保持在5℃下。使用高效液相层析(HPLC)分析每个样品中肽的量并且使用液相色谱质谱(LC/MS)检测降解产物。
层析条件-使用波长为220nm的Dionex 3000高效液相层析(HPLC)系统(新泽西州费尔劳恩的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ))分析样品。通过Luna 5μC18(2)150mm×4.6mm(加利福尼亚州托伦斯市(Torrance,CA))柱以1.0mL/min的流动速率洗脱7聚体肽。两种流动相为相A(0.1％三氟乙酸于水中)和流动相B(0.09％三氟乙酸于20:80的水和乙腈的混合物中)。由25％到35％流动相B组成的HPLC梯度在环境温度下运行20min。将20μL的每种样品注入到柱上并且在220nm的检测波长下获取色谱图。对于样品中的每种进行两次测定。还在LC/MS上测试同一样品以测定降解产物。
配制物、无菌过滤、冻干和喷雾化对uPA活性的影响-冻干肽易于溶解于水中。图3示出对肽的化学分析。配制物组成、无菌过滤或喷雾化对肽的回收百分比没有影响。两种喷雾器得到类似的结果。
***
根据本公开，在没有不当实验情况下都可进行并且执行本文中公开和主张的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已就优选实施例描述过了，但是对所属领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下方法和本文所述方法的步骤或步骤的顺序可改变。更具体来说，将显而易见的是，在化学上和生理上相关的某些药剂可以取代本文所述的药剂，同时实现相同或类似结果。对所属领域的技术人员显而易见的是所有这类类似取代和修改均视为在由所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。
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序列表
<110> 得克萨斯州大学系统董事会(BOARD OF REGENTS, UNIVERSITY OF TEXASSYSTEM)
<120> 多肽治疗剂和其用途
<130> UTFB.P1049WO
<140> 未知
<141> 2016-02-26
<150> US 62/126,039
<151> 2015-02-27
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Tyr
1 5 10 15
Trp Phe Tyr Arg
20
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Asn Tyr His Tyr Leu Glu Ser Ser Met Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Gly
1 5 10 15
His

Claims (65)

1.一种组合物，包含生物活性小窝蛋白-1(Cav-1)支架结构域多肽的喷雾化溶液。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Cav-1支架结构域多肽包含FTTFTVT(SEQ IDNO:1)；DGIWKASFTTFTVTKYWFYR(SEQ ID NO:2)；或NYHYLESSMTALYTLGH(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述Cav-1支架结构域多肽的长度不大于20个氨基酸并且包含FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的序列。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述Cav-1支架结构域多肽的长度不大于10个氨基酸并且包含FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的序列。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述Cav-1支架结构域多肽由或基本上由FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的序列组成。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中使用振动筛喷雾器制造所述喷雾化溶液。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述振动筛喷雾器为有源振动筛喷雾器。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述振动筛喷雾器为无源振动筛喷雾器。
9.根据权利要求6所述的组合物，其中所述振动筛喷雾器为专业喷雾器系统(Professional Nebulizer System)或EZ Breathe Atomizer。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中使用喷射喷雾器或超声喷雾器制造所述喷雾化溶液。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述溶液为水溶液。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述溶液包含生理学上可接受的盐。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述溶液包含pH缓冲剂。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中所述溶液基本上不含pH缓冲剂。
16.根据权利要求11所述的组合物，其中所述溶液为无菌盐水溶液。
17.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物基本上由无菌盐水溶液和所述生物活性Cav-1支架结构域多肽组成。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述喷雾化溶液进一步包含生物活性酶。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述酶为纤维蛋白溶酶原活化酶。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述纤维蛋白溶酶原活化酶为组织纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)或尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述uPA为单链uPA(scuPA)。
22.根据权利要求1所述的组合物，其中所述喷雾化溶液的中值粒径在约2.5μm与20μm之间。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述喷雾化溶液的中值粒径在约2.5μm与8μm之间。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述喷雾化溶液的中值粒径在约3.0μm与6μm之间。
25.一种用于治疗或预防肺的纤维化病症的治疗的组合物，所述组合物包含根据权利要求1到24中任一项所述的组合物。
26.一种治疗或预防受试者的急性肺损伤、肺感染或肺病的方法，包含对所述受试者给药有效量的生物活性Cav-1支架结构域多肽，所述多肽以喷雾化溶液形式给药到所述受试者的气道。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有急性肺损伤或感染。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有化学物质引起的肺损伤。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有塑型性支气管炎、哮喘、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)或吸入烟雾引起的急性肺损伤(ISALI)。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述肺病为肺的纤维化病症。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述肺病为间质性肺病。
32.根据权利要求26所述的方法，其中所述肺病为特发性肺纤维化(IPF)或肺疤痕。
33.根据权利要求26所述的方法，其中所述给药包含使包含所述Cav-1支架结构域多肽的溶液喷雾化。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述喷雾化包含使用超声或喷射喷雾器将包含所述Cav-1支架结构域多肽的所述溶液喷雾化。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述喷雾化并不包含使用超声或喷射喷雾器将包含所述Cav-1支架结构域多肽的所述溶液喷雾化。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述喷雾化包含使用振动筛喷雾器将包含所述Cav-1支架结构域多肽的所述溶液喷雾化。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述振动筛喷雾器为有源振动筛喷雾器。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述振动筛喷雾器为无源振动筛喷雾器。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述振动筛喷雾器为专业喷雾器系统或EZ Breathe Atomizer。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述喷雾化包含：
(i)获得包含Cav-1支架结构域多肽的冻干多肽组合物；
(ii)在水溶液中重构所述冻干酶组合物以提供多肽溶液；以及
(iii)使所述多肽溶液喷雾化。
41.根据权利要求26所述的方法，包含给药根据权利要求1到25中任一项所述的喷雾化溶液。
42.根据权利要求26所述的方法，进一步包含对所述受试者给药生物活性纤维蛋白溶酶原活化酶。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述纤维蛋白溶酶原活化酶以喷雾化溶液形式给药到所述受试者的所述气道。
44.根据权利要求2所述的方法，其中所述纤维蛋白溶酶原活化酶为tPA或uPA。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述纤维蛋白溶酶原活化剂为scuPA。
46.一种制备用于给药到受试者气道的生物活性Cav-1支架结构域多肽的方法，包含使包含所述Cav-1支架结构域多肽的溶液喷雾化以提供喷雾化溶液。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述Cav-1支架结构域多肽包含FTTFTVT(SEQ IDNO:1)；DGIWKASFTTFTVTKYWFYR(SEQ ID NO:2)；或NYHYLESSMTALYTLGH(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述Cav-1支架结构域多肽的长度不大于20个氨基酸并且包含FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的序列。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述Cav-1支架结构域多肽的长度不大于10个氨基酸并且包含FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的序列。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述Cav-1支架结构域多肽由或基本上由FTTFTVT(SEQ ID NO:1)的序列组成。
51.根据权利要求46所述的方法，其中使所述溶液喷雾化是通过使用振动筛喷雾器。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述振动筛喷雾器为有源振动筛喷雾器。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述振动筛喷雾器为无源振动筛喷雾器。
54.根据权利要求51所述的方法，其中所述振动筛喷雾器为专业喷雾器系统或EZ Breathe Atomizer。
55.根据权利要求46所述的方法，其中使所述溶液喷雾化包含使用超声或喷射喷雾器。
56.根据权利要求46所述的方法，其中使所述溶液喷雾化并不包含使用超声或喷射喷雾器。
57.根据权利要求46所述的方法，其中所述溶液为水溶液。
58.根据权利要求46所述的方法，进一步定义为一种制造根据权利要求1到25中任一项所述的组合物的方法。
59.根据权利要求46所述的方法，其中喷雾化包含：
(i)获得包含Cav-1支架结构域多肽的冻干多肽组合物；
(ii)在水溶液中重构所述冻干酶组合物以提供多肽溶液；以及
(iii)使所述多肽溶液喷雾化。
60.一种喷雾化多肽溶液，通过根据权利要求46到59中任一项所述的方法制造。
61.根据权利要求46到59中任一项所述的方法，进一步包含将所述喷雾化溶液给药到有需要的受试者的气道。
62.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含冻干保护剂。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述冻干保护剂为甘露醇。
64.根据权利要求62所述的组合物，其中所述甘露醇以相对于所述Cav-1支架结构域多肽100:1到5:1的比率存在。
65.一种冻干组合物，包含生物活性小窝蛋白-1(Cav-1)支架结构域多肽和至少第一冻干保护剂，其中所述Cav-1支架结构域多肽在暴露于水溶液中时保持可溶。
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