KR20180058843A - 짧은 합성 펩티드 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

X1ITYX2RLKX3으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 합성 펩티드를 제공한다. 또한, 합성 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물이 제공된다. 또한 치료적 유효량의 합성 펩티드를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 대상에 투여함으로써 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 또는 증상을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

짧은 합성 펩티드 및 그의 용도
본 발명은 짧은 합성 펩티드, 및 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 그의 용도의 발견에 관한 것이다.
통상 "건성안"으로 지칭되는 안구건조증은 눈물 생산 감소, 과도한 눈물 증발 또는 정상 안구 표면을 덮고 있는 눈물막의 점액 또는 지질 성분의 이상과 같이, 일반적으로 눈물 생산 과정에서 어떤 이상으로 인하여 발생하는 만연한 눈 상태이다. 전형적인 안구건조증 증상으로는 건조감, 이물감, 자극감, 장시간 독서 장애, 쑤심 및 심지어는 과도한 찢어지는 듯한 현상 또는 눈물 흐름의 명백한 상반된 현상을 포함한다. 극단적인 경우, 환자는 빛에 비정상적으로 민감해지고 눈에 심한 통증을 느끼며 시력이 약화되는 것을 알아차리기 시작할 수 있다. 건성안에 대한 통상적인 치료는 원인보다는 증상 치료를 포함한다. 예를 들어, 인공 눈물과 안구 윤활제가 일반적인 치료법이다. 인공 눈물은 일시적인 경감을 제공할 수 있지만 단지 증상만을 완화시킬 뿐이다. 또한, 인공 눈물에 사용된 방부제는 실제로 상태를 악화시킬 수 있고 심지어 각막 세포를 죽일 수도 있다. 지금까지 안구건조증에 관한 모든 문제를 해결하는데 효과적인 건성안 장애의 치료법에 대한 접근은 거의 없었다.
건선은 은색 비늘로 덮인 분홍색 또는 적색 병변으로 특징지어진다. 이러한 병변은 종종 팔꿈치와 무릎, 두피 및 생식기 부위의 접힌 부분에서 발견된다. 증상은 피부의 표피층 및 결과적으로 표피 두께의 교체 가속화로 나타난다. 정상적인 표피 교체는 25-30일마다 발생하지만, 건선 피부에서는 대략 3-4일마다 발생한다. 이러한 속도에서는 피부색이 보통 영향을 받아 색소침착이 너무 많거나 적게 된다. 심상성 건선의 기간은 다양하다. 건선성 병변은 평생 지속될 수 있거나, 또는 짧은 기간 내에 사라질 수도 있다. 심상성 건선을 치료하기 위한 많은 시도가 과거에 있었다. 이러한 증상을 치료하고자 했던 첫 번째 시도는 살리실산을 활성 성분으로 함유한 국소제를 통해 이루어졌다. 그러나, 살리실산은 자극성이 있기 때문에 때로는 상태를 악화시키는 결과를 낳았다. 국소제의 또 다른 대중적인 활성 성분은 하이드로코르티손과 같은 코르티코스테로이드이다. 코르티코스테로이드는 건선을 상당히 억제할 수 있다. 그러나, 이들 또한 국소 위축 및 전신 흡수와 같은 많은 부작용을 유발한다. 또한 사용을 중단하면 재발의 위험이 있다. 다른 접근법에서는, 자외선 노출이 시도되었지만 성공이 제한적이었다. 자외선 및 콜타르 제제의 병용 요법은 자외선 단독보다 효과적인 것으로 나타났다. 하지만, 일부 환자는 콜타르를 감염 부위에 적용하였을 때 상태가 악화되기에 이르렀다. 시도된 다른 전신 치료로는 세포 분열 요법 및 비타민 A 및 C 치료가 포함된다; 그러나 이러한 치료의 효과에 대해서는 의문의 여지가 남아있다. 지금까지 건선 치료법 중 어떤 것도 성공하지 못했으며, 효과가 없거나 바람직하지 않은 부작용을 동반하였다.
다발성 골수종은 단클론으로부터 유래된 형질 세포의 악성 증식을 나타낸다. 다발성 골수종의 치료를 위한 새로운 부류의 항암제 개발에 최근 진전이 있었음에도 불구하고, 서양에서 2번째로 흔한 것으로 진단된 혈액학적 악성 종양인 이 질환에 대한 치유 요법은 현재 존재하지 않는다. 따라서, 항-다발성 골수종 활성을 갖는 새로운 치료제를 찾아내는 것이 시급한 과제로 남아 있다.
따라서, 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 개선된 약제 및/또는 방법이 관련 분야에서 요구된다.
일반적으로, 본 발명은 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 치료하기 위한 신규 화합물 및/또는 방법의 개발에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 치료할 수 있는 짧은 합성 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 짧은 합성 펩티드는 X1ITYX2RLKX3 (서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이되, X3은 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이며; 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된다.
바람직한 일 실시양태에 따라, 합성 펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열 (이하 9-mer)을 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에 따라, 합성 펩티드는 서열 번호 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 일례로, 합성 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열 (이하 9-mer Da)을 갖는다. 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 (이하 9-mer Va)을 갖는다. 또 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 11의 아미노산 서열 (이하 9-mer Fa)을 갖는다.
또 다른 예에서, 9-mer 합성 펩티드는 그의 N-말단의 상류에 추가의 3개의 아미노산 잔기를 더 포함하고, 서열 번호 6의 인접 펩티드 (이하 "12-mer")를 생성한다.
추가의 예에서, 서열 번호 1의 아르기닌 (R) 및 X3은 독립적으로 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이다. 일 예에서, 9-mer의 아르기닌은 D-형태 (이하 9-mer DR)이다. 다른 예에서, 9-mer의 페닐알라닌 (D)은 D-형태 (이하 9-mer DF)이다.
본 발명의 제2 양태는 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 치료하기에 적합한 약제 및/또는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 약제 또는 조성물은 유효량의 상술된 합성 펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에 따라, 합성 펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열 (9-mer)을 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에 따라, 합성 펩티드는 서열 번호 3, 7, 11 또는 12 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 일례로, 합성 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열 (이하 9-mer Da)을 갖는다. 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 (이하 9-mer Va)을 갖는다. 또 다른 예에서, 합성 펩티드는 서열 번호 11의 아미노산 서열 (이하 9-mer Fa)을 갖는다.
또 다른 예에서, 9-mer 합성 펩티드는 그의 N-말단의 상류에 추가의 3개의 아미노산 잔기를 더 포함하고, 서열 번호 12의 인접 펩티드 (이하 "12-mer")를 생성한다.
본 발명의 약제 또는 조성물에 의해 치료가능한 혈관신생과 관련된 질환 및/또는 증상은 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종이다.
일부 실시양태에 따라, 본 발명의 약제 또는 조성물은 안구건조증과 같은 안 질환을 치료하기에 적합하다.
일부 실시양태에 따라, 본 발명의 약제 또는 조성물은 피부 염증, 특히 심상성 건선을 치료하기에 적합하다.
일부 실시양태에 따라, 본 발명의 약제 또는 조성물은 종양, 특히 다발성 골수종을 치료하기에 적합하다.
본 발명의 약제 또는 조성물은 혈관 내 전달 (예를 들어, 주사 또는 주입), 경구, 장 내, 직장, 폐 (예를 들어, 흡입), 비강, 국소 (경피, 협측 및 설하 포함) 방광 내, 유리체 내, 복강 내, 질 내, 뇌 전달 (예를 들어, 뇌실 내 및 뇌 내), CNS 전달 (예를 들어, 척추강 내, 척수 주변 및 척수 내) 또는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육 내, 정맥 내 및 피 내), 경점막 투여 또는 임플란트를 통한 투여, 또는 당업계에 공지된 다른 전달 경로를 통해 대상에 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제3 양태는 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상과 관련된 증세를 완화시키거나 경감시키기 위해 상술된 본 발명의 약제 또는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
모든 실시양태에서, 대상은 인간이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 합성 펩티드는 0.01 내지 100 mg/Kg의 양으로 대상에게 투여된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 수반되는 이하의 설명에서 기술된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면이 포함된다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청시 필요한 수수료를 지불하면 청에서 제공할 것이다. 본 설명은 첨부 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시양태에 따른, RPMI8226 세포의 생존력에 대한 9-mer 펩티드 및 그의 알라닌 치환된 유사체의 효과를 도시한다.
도 2는 본 발명의 또 다른 실시양태에 따른, RPMI8226 세포의 생존력에 대한 9-mer 펩티드 및 그의 D-형태 아미노산 치환된 유사체의 효과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시양태에 따른, 플루오레세인 염색에 의해 결정된 건조 유도된 각막 표면 손상에 대한 9-mer 펩티드의 효과를 나타낸다; A. 각막 손상을 평가하기 위한 각막의 플루오레세인 염색 이미지; B. 각막 손상을 나타내기 위한 평균 각막 플루오레세인 염색 점수 (여기서, *P < 0.0002 versus 0일).
도 4는 본 발명의 일 실시양태에 따른, 페놀 레드 실 시험에 의해 결정된 눈물 생산에 대한 9-mer 펩티드의 효과를 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 실시양태에 따른, 인간 다발성 골수종 세포에 대한 9-mer 펩티드의 효과를 도시한다; A. 트립판 블루로 염색된 RPMI8226 및 U266 세포의 위상차 사진; B. 패널 A의 정량화 결과를 나타내는 막대 그래프. 데이터는 세 독립 실험의 평균±S.D로 나타냈다. *P < 0.005 versus 용매 처리 세포.
도 6은 본 발명의 일 실시양태에 따른, RPMI8226 세포에서 9-mer 펩티드로 유도된 세포자멸사를 나타낸다. A. 3가지 독립적인 분석으로부터의 대표적인 아넥신 V 대 요오드화프로피듐 등고선 플롯; B. 패널 A의 정량화 결과를 나타내는 막대 그래프로서, 제시된 데이터는 사멸 세포의 백분율에 대한 평균값±S.D.이다. *P < 0.002 versus 용매 처리 세포.
도 7은 본 발명의 일 실시양태에 따른, IMQ로 유발된 심상성 건선-유사 피부 염증 및 박리 형성에 대한 9-mer 펩티드의 효과를 나타내는 마우스 사진이다; A. 처리 6일 후 마우스 등 피부의 표현형 제시, 삽입부: 등 피부는 고배율 명시야 카메라로 보았다. B. 6일째, 우측 귀의 귀 두께를 마이크로미터로 중복 측정하였다. 평균 귀 두께 (mm)가 IMQ로 유발된 피부 염증을 나타내기 위해 사용되었다. #P < 0.0001 versus 치료되지 않은 정상 마우스. *P < 0.0001 versus IMQ/비히클 처리 마우스.
도 8은 본 발명의 일 실시양태에 따른, IMO로 유발된 케라틴 생성 세포 증식에 대한 9-mer 펩티드의 효과를 도시한다. A. 9-mer 펩티드의 존재 또는 부재하에 IMQ-처리 마우스의 등 피부 절편에 대한 H&E 염색 사진. B. IMQ-처리 마우스로부터 수득한 피부 절편의 정량화된 표피 두께 (μm)에 대한 9-mer 펩티드 또는 그의 유사체의 효과를 나타내는 막대 그래프; 여기서, *P < 0.00059 versus IMQ 대조군.
도 9는 본 발명의 일 실시양태에 따른, 표피 내 BrdU-양성 세포의 수에 의해 결정된 IMO로 유발된 케라틴 생성 세포 증식에 대한 9-mer 펩티드 및 그의 유사체의 효과를 도시한다. A. IMQ 처리 후 6일째 세포 복제의 조직학적 분석. B. 표피 내 BrdU 양성 세포의 정량화 결과. 표지율 (%)은 HPF (200x 고배율 시야) 당 표지된 세포의 수로서 계산되었다. 데이터는 각 그룹에서 10-16 HPF를 나타내며, 여기서 *P < 0.0001 versus IMQ 대조군이다.
첨부된 도면과 관련하여 이하에 제공되는 상세한 설명은 본 실시예의 설명으로서 의도되며 본 실시예가 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내고자 하지 않는다. 설명은 실시예의 기능과, 실시예를 구성하고 조작하기 위한 일련의 단계를 설명한다. 그러나, 동일 또는 동등한 기능 및 순서가 상이한 실시예로 달성될 수도 있다.
1. 정의
편의상, 본 개시의 문맥에 사용된 특정 용어들을 여기에 모아놨다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "합성 펩티드"는 자연 발생 단백질 분자 전체를 포함하지 않는 펩티드를 의미한다. 펩티드는 화학적 합성, 재조합 유전자 기술 또는 전 항원의 단편화 등과 같은 기술을 사용하여 인간이 개입하여 생산할 수 있다는 점에서 "합성"이다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 펩티드 내 임의의 특정 아미노산 잔기의 위치는 펩티드의 N 말단으로부터 시작하여 번호가 매겨진다. 아미노산이 D- 또는 L-아미노산으로 지정되지 않은 경우, 아미노산은 L-아미노산이거나, 특정 이성질체를 필요로 하지 않는 한, D- 또는 L-아미노산일 수 있다. 또한, 폴리펩티드 아미노산 잔기에 대해 본원에서 사용된 표기법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 약어들이다.
본원에서 기술된 바와 같이, 아미노산 서열에서의 변화가 적어도 90%, 예컨대 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 75%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%를 유지한다면, 단백질/펩티드의 아미노산 서열에 약간의 변화는 본 발명으로 개시되고 청구된 발명 개념(들)에 포함되는 것으로 고려된다. 본 발명의 합성 펩티드는 그의 생리학적 활성과 무관한 펩티드의 특징을 변경하도록 특이적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 본 연구에서 펩티드의 생리학적 활성 (즉, 혈관신생 관련 질환 및/또는 증상을 치료하는 그의 능력)에 영향을 미치지 않고 변경 및/또는 결실될 수 있다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보전적 대체는 아미노산 부류 내에서 그의 측쇄에 대해 일어나는 것이다. 유전적으로 인코딩된 아미노산은 일반적으로 다음 부류로 분류된다: (1) 산성 = 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 보다 바람직한 부류는 다음과 같다: 세린 및 트레오닌은 지방족-하이드록시 부류이고; 아스파라긴 및 글루타민은 아미드-함유 부류이며; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 부류이고; 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 방향족 부류이다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린으로의 류신, 글루타메이트로의 아스파테이트, 세린으로의 트레오닌의 분리 대체, 또는 구조적으로 관련이 있는 아미노산으로의 임의의 아미노산의 유사한 대체는, 특히 이러한 대체가 골격 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는 경우, 생성된 분자의 결합 또는 성질에 주요한 영향을 미치지 않는 것으로 예상하는 것이 마땅하다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드로 이어지는지의 여부는 펩티드 유도체의 특이적 활성을 분석함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 단백질/펩티드의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카복시-말단은 기능성 도메인의 경계 부근에서 발생한다. 일례에서, 본 발명의 합성 펩티드의 하나의 아미노산 잔기 (예를 들어, 아스파테이트, 발린 또는 페닐알라닌)는 비극성 아미노산 잔기에 의해 (예를 들어, 알라닌에 의해) 보존적으로 대체된다. 다른 예에서, 본 발명의 합성 펩티드의 하나의 아미노산 잔기는 그의 D-형태 아미노산 잔기로 보존적으로 대체되고, 예를 들어 L-형태 아르기닌 및 L-형태 페닐알라닌은 각각 상응하는 D-형태 잔기로 대체된다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 소정의 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것, 예를 들어, 암 증식을 지연 또는 억제하거나, 또는 각막 표면 손상 (예를 들어, 안구건조증) 또는 피부 손상 (예를 들어, 심상성 건선)을 개선하는 것을 의미하도록 의도된다. 그 효과는 질환 또는 그의 증세를 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적 및/또는 질환 또는 그 질환에 기인하는 부작용을 부분적 또는 완전히 치유한다는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 예방 (예: 예방적), 치유 또는 완화 치료를 포함하며, 다음을 예로 들 수 있다: (1) 질환의 성향을 가지나 아직 이로 진단되지 않은 개체에서 질환 또는 증상 (예: 암 또는 심부전)의 발생 예방 (예: 예방적), 치유 또는 완화 치료; (2) 질환의 억제 (예를 들어, 그의 발생을 저지시킴으로써); 또는 (3) 질환 경감 (예: 질환과 관련된 증세 감소).
용어 "투여된", "투여하는 것" 또는 "투여"는 제한없이 본 발명의 약제 (예를 들어, 화합물 또는 조성물)의 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 동맥 내, 두개 내 또는 피하 투여를 포함하는 전달 방식을 지칭하도록 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 합성 펩티드 및/또는 그의 유사체는 각막 표면에 직접 적용을 위해 점안액으로서 제형화된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 합성 펩티드 및/또는 그의 유사체는 피부에 직접 도포를 위해 피부 연고 또는 로션으로서 제형화된다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 합성 펩티드 및/또는 그의 유사체는 정맥 내 주사와 같이, 사용 전에 적절한 담체 (예를 들어, 완충액)와 혼합하기 위한 분말로 제형화된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 질환의 치료에 대해 바람직한 결과를 얻기 위해 필요한 용량 및 기간에서 유효한 양을 의미한다. 예를 들어, 건성안 질환의 치료에서, 건성안 질환의 임의의 증세를 감소, 예방, 지연 또는 억제 또는 저지하는 약제 (즉, 화합물, 합성 펩티드, 또는 치료용 펩티드를 코딩하는 핵산)가 효과적일 것이다. 유사하게, 심상성 건선의 치료에서, 건선 피부의 임의의 증세를 감소, 예방, 지연 또는 억제 또는 저지하는 약제 (즉, 화합물, 합성 펩티드, 또는 치료용 펩티드를 코딩하는 핵산)가 효과적일 것이다. 유효량의 약제는 질환 또는 증상을 치유할 필요가 없지만 질환 또는 증상의 발병을 지연, 장애 또는 예방하거나, 질환 또는 증상의 증세를 완화시키도록 질환 또는 증상에 대한 치료를 제공할 것이다. 유효량은 지정된 기간에 걸쳐 1회, 2회 또는 그 이상으로 투여될 수 있는 적합한 형태로 1, 2 또는 그 이상의 용량으로 나누어질 수 있다.
용어 "대상" 또는 "환자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 본 발명의 합성 펩티드 및/또는 방법에 의해 치료가능한, 인간 종을 포함한 포유동물을 의미하는 것으로 의도된다. "포유동물"이란 용어는 인간, 영장류, 가축 및 농장 동물, 예컨대 토끼, 돼지, 양 및 소; 뿐만 아니라 동물원, 스포츠 또는 애완 동물; 및 마우스 및 래트와 같은 설치류를 포함한 포유류의 모든 구성원을 의미한다. 또한 "대상" 또는 "환자"라는 용어는 특정 성별이 명시되지 않는 한 수컷 및 암컷 성별을 모두 의미한다. 따라서, "대상" 또는 "환자"라는 용어는 본 개시의 치료 방법으로부터 혜택을 받을 수 있는 임의의 포유동물을 포함한다. "대상" 또는 "환자"의 예로는 인간, 래트, 마우스, 기니 피그, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 새 및 가금류가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 환자는 인간이다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사값이긴 해도, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고되었다. 그러나 모든 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오차를 포함한다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용가능한 표준 오차 이내를 의미한다. 작동/작업 실시예의 경우를 제외하고, 또는 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 제시된 재료의 양, 시간의 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등과 같은 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율은 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수식된 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 필요에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
단수 형태, "및", 그리고 "상기"는 본원에서 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하도록 본원에서 사용된다.
2. 바람직한 실시양태의 상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로, 대상에서 혈관신생과 관련된 질환 또는 증상의 발생을 치료 및/또는 예방할 수 있는 짧은 합성 펩티드의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 혈관신생과 관련된 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한, 새로이 확인된 합성 펩티드를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다.
2.1 본 발명의 합성 펩티드
본 발명의 짧은 합성 펩티드는 X1ITYX2RLKX3 (서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이되, R 및 X3은 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이며; 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된다.
바람직한 일 실시양태에 따라, 본 발명의 합성 펩티드는 DITYVRLKF의 아미노산 서열 (서열 번호 2, 9-mer)을 갖는다.
다른 실시양태에 따라, 9-mer 합성 펩티드는 그 안에 보존적 치환을 가질 수 있고, 이에 의해 서열 번호 3, 7 또는 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 유사체를 생성할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에 따라, 9-mer 합성 펩티드는 그의 N-말단의 상류에 3개의 추가 아미노산 잔기를 더 포함하고, 이에 의해 KAFDITYVRLKF의 인접 펩티드 (서열 번호 12, 이하 "12-mer")를 생성할 수 있다.
또 다른 예에서, 9-mer 합성 펩티드는 그 안에 적어도 하나의 D-형태 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 그에 의해 D-형태 유사체를 생성할 수 있다.
본 발명의 합성 펩티드는 하기 표 1에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명의 합성 펩티드
펩티드 명 아미노산 서열 서열 번호
9-mer NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH
DITYVRLKF 		2
9-mer Da NH2-Ala-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH
AITYVRLKF		 3
9-mer Ia NH2-Asp-Ala-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH
DATYVRLKF		 4
9-mer Ta NH2-Asp-Ile-Ala-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH
DIAYVRLKF		 5
9-mer Ya NH2-Asp-Ile-Thr-Ala-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH
DITAVRLKF		 6
9-mer Va NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Ala-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH
DITYARLKF		 7
9-mer Ra NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Phe-COOH
DITYVALKF 		8
9-mer La NH2- Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Ala-Lys-Phe-COOH
DITYVRAKF		 9
9-mer Ka NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Ala-Phe-COOH
DITYVRLAF 		10
9-mer Fa NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Ala-COOH
DITYVRLKA 		11
12-mer NH2-Lys-Ala-Phe-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH KAFDITYVRLKF 12
8-mer NH2-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Ala-COOH
ITYVRLKA		 13
9-mer DD NH2-(D-Asp)-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DI NH2-Asp-(D-Ile)-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DT NH2-Asp-Ile-(D-Thr)-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DY NH2-Asp-Ile-Thr-(D-Tyr)-Val-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DV NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-(D-Val)-Arg-Leu-Lys-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DR NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-(D-Arg)-Leu-Lys-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DL NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-(D-Leu)-Lys-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DK NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-(D-Lys)-Phe-COOH DITYVRLKF 2
9-mer DF NH2-Asp-Ile-Thr-Tyr-Val-Arg-Leu-Lys-(D-Phe)-COOH DITYVRLKF 2
임의 서열에서 굵은 글씨체는 특정 아미노산이 D-형태임을 나타낸다.
바람직한 실시양태에 따라, 서열 번호 1의 이소류신 (I), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), 아르기닌 (R), 류신 (L) 및 리신 (K) 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체되어서는 안되고, 그렇지 않으면 합성 펩티드는 안구건조증, 심상성 건선 및/또는 다발성 골수종에 대한 그의 생체 활성을 잃을 것이다. 따라서, 서열 번호 1의 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 일 실시양태에서, X1은 알라닌 (A)이고, X2는 발린 (V)이며, X3는 페닐알라닌이고, 합성 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열 (이하 "9-mer Da")을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, X1은 아스파테이트이고, X2는 알라닌 (A)이며, 합성 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열 (이하 "9-mer Va")을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, X1은 아스파테이트이고, X2는 발린 (V)이며, X3은 알라닌 (A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 11의 아미노산 서열 (이하 "9-mer Fa")을 갖는다.
또 다른 실시양태에 따라, 적어도 하나의 D-형태 아미노산 잔기가 9-mer 합성 펩티드에, 특히 9번 위치의 아미노산 잔기에 포함되어 상기 표 1에 설명되어 있는 바와 같이 9-mer의 D-형태 유사체가 발생한다. 특정 일례에서, 9-mer 합성 펩티드의 페닐알라닌 (F)은 D-형태이고, 나머지 아미노산 잔기는 L-형태이다.
본 발명의 합성 펩티드는 당업계의 임의의 표준 펩티드 합성 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 합성 펩티드는 제조사의 프로토콜에 따라 고상 펩티드 합성기 (ABI433A 펩티드 합성기, Applied Biosystems Inc., Life Technologies Corp., Foster City, CA, USA)를 사용하여 합성하였다.
대안적으로, 본 발명의 합성 펩티드는 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터에서 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산을 클로닝할 수 있으며, 여기에서 핵산은 숙주 세포에서 본 펩티드를 발현하기에 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 이어, 적합한 숙주 세포에 벡터를 도입하여 펩티드를 발현시킬 수 있다. 발현된 재조합 폴리펩티드는 황산암모늄 침전 및 분별 컬럼 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 숙주 세포로부터 정제할 수 있다. 이와 같이 제조된 펩티드는 하기 실시예에 기재된 방법에 따라 그의 활성이 시험될 수 있다.
상기 언급된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 중합, 생분해성 마이크로입자 또는 마이크로캡슐 전달 장치를 사용함으로써 전달할 수 있다. 숙주에서 핵산의 흡수를 달성하기 위한 다른 방법은 표준 방법으로 제조된 리포좀을 사용하는 것이다. 폴리뉴클레오티드는 단독으로 이들 전달 비히클에 도입되거나 조직 특이적 항체와 함께 도입될 수 있다. 대안으로, 정전기적 또는 공유 결합력에 의해 폴리-L-리신에 부착된 플라스미드 또는 다른 벡터로 구성된 분자 접합체를 제조할 수 있다. 대안적으로, 당업계에 공지된 조직 특이적 전사 조절 요소의 사용에 의해서 조직 특이적 표적화를 달성할 수 있다. 근육 내, 피 내 또는 피하 부위로의 "네이키드 (naked) DNA" (즉, 전달 비히클 없이)의 전달이 생체 내 발현을 달성하기 위한 또 다른 수단이다.
본 발명의 합성 펩티드는 그의 N-말단 또는 C-말단에서 변형될 수 있다. N-말단 변형의 예는 N-당화, N-알킬화 및 N-아세틸화 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 말단 변형은 페길화를 포함할 수 있다. C-말단 변형의 일례는 C-말단 아미드화 아미노산이다. 대안적으로, 하나 이상의 펩티드 결합이 비-펩티딜 연결로 대체될 수 있고, 개별 아미노산 잔기는 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 제제로 처리되어 변형될 수 있다.
다양한 작용기가 또한 화학적 변형이 일어나기 쉬운 합성 펩티드의 다양한 지점에서 첨가될 수 있다. 작용기는 펩티드의 말단에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용기는 합성 펩티드의 안정성, 효능 또는 선택성 개선; 세포막 및/또는 조직 배리어를 통한 합성 펩티드의 침투 개선; 조직 국재화 개선; 독성 또는 제거율 감소; 및 세포 펌프에 의한 추출 저항성 향상 등과 같이, 하나 이상의 특성에 대한 펩티드의 활성을 개선시킨다. 적합한 작용기의 비제한적인 예로는, 예를 들어 펩티드의 친수성을 감소시키고 친유성을 증가시킴으로써 그에 부착된 펩티드가 세포로 운반되는 것을 촉진시키는 것이 있으며, 이들 작용기는 임의로 및 바람직하게는 세포 내부에서 가수 분해에 의해 또는 효소적으로 생체 내에서 절단될 수 있다. 하이드록시 보호기는 에스테르, 카보네이트 및 카바메이트 보호기를 포함한다. 아민 보호기는 알콕시 및 아릴옥시 카보닐기를 포함한다. 카복실산 보호기는 지방족, 벤질 및 아릴 에스테르를 포함한다. 일부 임의적인 실시양태에서, 본 발명의 합성 펩티드의 아스파르트산 (D) 측쇄 내 카복실산 산기는 바람직하게는 메틸, 에틸, 벤질 또는 치환된 벤질 에스테르에 의해 보호된다.
펩티드 모방 (peptidomimetic) 유기 부위"가 임의로 보존 및 비보존적 치환 모두로서 본 발명의 합성 펩티드의 아미노산 잔기를 치환할 수 있다. 펩티드 모방 유기 부위는 임의로 및 바람직하게는 대체된 아미노산과 유사한 입체, 전자 또는 배열 특성을 갖고, 이러한 펩티드 모방체는 필수 위치에서 아미노산을 대체하는데 사용되며 보존적 치환으로 간주된다. 펩티드 모방체는 임의로 효소 또는 다른 분해 과정에 의한 펩티드의 분해를 억제하는데 사용될 수 있다. 펩티드 모방체는 임의로 및 바람직하게는 유기 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 적합한 펩티드 모방체의 비제한적 예로서는 아미드 결합, 3-아미노-2-프로페니돈-6-카복실산, 하이드록실-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카복실레이트, 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카복실레이트, 및 히스티딘 이소퀴놀론 카복실산을 들 수 있다.
합성 펩티드의 임의의 부분은 선택적으로 작용기 첨가에 의한 것과 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 변형은 임의로 본 발명의 펩티드의 합성 중에 수행될 수 있다. 변형의 비제한적인 예시적 유형은 카복시메틸화, 아실화, 인산화, 글리코실화 또는 지방 아실화를 포함한다. 에테르 결합이 세린 또는 트레오닌 하이드록실을 당의 히드록실에 결합시키기 위해 임의로 사용될 수 있다. 아미드 결합이 글루타메이트 또는 아스파테이트 카복시기를 당의 아미노기에 결합시키기 위해 임의로 사용될 수 있다. 아세탈 및 케탈 결합이 또한 아미노산과 탄수화물 사이에 형성될 수 있다.
2.2 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물
본 발명의 합성 펩티드는 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 앓고 있는 대상을 치료하거나; 또는 대상에게서 안구건조증, 심상성 건선증 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상이 발생하는 것을 예방하는데 적합하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 치료하기 위한 본 발명의 합성 펩티드를 포함하는 약제를 제공하는 것이다.
일 실시양태에서, 약제는 종양, 특히 다발성 골수종을 치료하기 위한 것으로서, 치료 후, 종양의 부피, 증식률 및/또는 전이가 감소되거나 저하된다.
또 다른 실시양태에서, 약제는 안 질환, 특히 안구건조증의 치료를 위한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 약제는 피부 질환, 특히 심상성 건선의 치료를 위한 것이다.
약제는 적당량의 본 발명의 합성 펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 조성물에 혼합하여 제조된다. 특정 실시양태에서, 합성 펩티드는 9-mer, 9-mer Da, 9-mer Va, 9-mer Fa, 9-mer DF, 12-mer 및 이들의 조합을 포함하나 이들에 제한되지 않는 상술된 바와 같은 펩티드 군으로부터 선택된다.
약제 또는 조성물에 존재하는 펩티드의 양은 사용된 펩티드에 좌우될 것이다. 펩티드는 전형적으로 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%, 예컨대 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2., 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.9, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0 중량%의 양; 특히 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 예컨대 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2., 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.9, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 및 5.0 중량%의 양으로 조성물 중에 존재할 것이다.
합성 펩티드와 함께 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 관련 분야에 잘 알려져 있으며, 비독성 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화제 또는 제형 보조제를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 전형적인 약학적으로 허용가능한 담체는 물 또는 생리 식염수이다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당류; 옥수수 전분과 같은 전분류; 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 그 유도체; 분말화 트래거칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올레 에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 및 비독성 윤활유 (예컨대, 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트), 착색제, 방출제, 향미제, 방부제 및 항산화제와 같은 다른 제제를 들 수 있지만 이들로만 제한되는 것은 아니다. 조성물은 그 안에 항생제 또는 항진균제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제 또는 조성물의 적합한 투여 경로는 혈관 내 전달 (예를 들어, 주사 또는 주입), 경구, 장 내, 직장, 폐 (예를 들어, 흡입), 비강, 국소 (경피, 협측 및 설하 포함) 방광 내, 유리체 내, 복강 내, 질 내, 뇌 전달 (예를 들어, 뇌실 내 및 뇌 내), CNS 전달 (예를 들어, 척추강 내, 척수 주변 및 척수 내) 또는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육 내, 정맥 내 및 피 내), 경점막 투여 또는 임플란트를 통한 투여, 또는 당업계에 공지된 다른 전달 경로를 통한 것이다.
경구 투여에 적합한 약학 조성물은 환제, 정제, 로젠지 또는 경질 또는 연질 캡슐과 같은 개별 투여 단위로서, 또는 분산성 분말 또는 과립으로, 또는 용액 또는 현탁액, 예를 들어 수성 또는 유성 현탁액, 유제, 시럽, 엘릭서 또는 장용 제형으로서 제형화될 수 있다. 바람직한 일례에서, 약학 조성물은 점안액이다. 조성물은 밀봉 바이알 또는 앰풀과 같은 단일 용량 또는 다중 용량 용기에 제공될 수 있으며, 사용 전에 무균 액체 담체 (예: 물 또는 염분)의 첨가를 필요로 하는 동결 건조된 상태로 저장될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 본 발명의 합성 펩티드를 물, 링거액, 염수, 1,3-부탄디올, 알콜 등과 같은 무균 용매와 혼합 또는 분산시킴으로써 수성 또는 비수성 멸균 주사제로 제형화될 수 있다. 대안적으로, 고정유, 지방산 또는 합성 모노- 또는 디글리세리드가 용매로서 사용될 수 있다. 조성물은 필터를 통해 여과함으로써 멸균될 수 있다.
국소 또는 경피 적용을 위해, 약학 조성물은 일반적으로 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 패치 또는 스프레이로 제형화된다. 안과 제형, 점이제 및 점안제가 또한 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 일부 실시양태에 따라, 본 발명의 조성물은 눈에 국소 투여된다. 다른 실시양태에 따라, 약학 조성물은 피부 사용을 위한 연고이다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 본 발명의 합성 펩티드 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 50 mg/kg), 예컨대 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 또는 1,000 μg/kg; 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 mg/kg이 대상에 투여된다. 전형적인 일일 또는 주간 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 또는 그 이상, 예컨대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 mg/kg의 범위일 수 있다. 상기 임의의 국소 투여 목적을 위해 이용되는 용량은 일반적으로 하루에 1 내지 수 회, 예를 들어 4회, 6회, 8회 또는 그 이상의 횟수로 투여될 것이다.
폐 투여에 적합한 약학 조성물은 계량 용량의 가압 에어로졸, 네뷸라이저 또는 흡입기에 의해 생성될 수 있는 미세 더스트 또는 미스트로서 제형화된다.
본 발명에 의해 제공되는 약학 조성물은 바람직하게는 키트의 형태로 제공된다. 본 발명에서, "키트"는 운반, 저장 및 그의 동시 또는 연속 투여를 허용하도록 본 발명에 의해 제공되는 합성 펩티드(들) 및/또는 포장된 조성물을 형성하는 추가적인 치료 화합물을 함유하는 제품으로서 이해된다. 따라서, 본 발명의 키트는 각각 본 발명의 합성 펩티드를 함유하고 단일 용량 또는 다중 용량으로 제조될 수 있는 하나 이상의 밀봉 앰풀을 함유할 수 있다. 키트는 추가로 식염수, 링거액, 덱스트로스 및 염화나트륨과 같은 수성 매질; 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필에틸렌 글리콜과 같은 수용성 매질; 및 필요에 따라 수불용성 비히클과 같이 합성 펩티드를 용해시키기에 적합한 비히클을 함유할 수 있다. 키트에 존재할 수 있는 다른 성분은 본 발명의 조성물을 결정된 한계 내에서 유지시키는 것을 허용하는 패키지이다. 이러한 패키지를 제조하는데 적합한 재료는 유리, 플라스틱 (폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등), 병, 바이알, 종이, 샤세 등을 포함한다.
본 발명의 키트는 키트에 존재하는 상이한 제형을 동시에, 연속적으로 또는 별도로 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트는 상이한 성분의 동시, 연속 또는 개별 투여를 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 상기 설명서는 인쇄물의 형태 또는 전자 저장 매체 (자기 디스크, 테이프 등), 광학 매체 (CD-ROM, DVD) 등과 같이 대상이 읽을 수 있도록 설명서를 저장할 수 있는 전자적 지원 형태일 수 있다. 매체는 추가적으로 또는 대안적으로 상기 설명서를 제공하는 인터넷 웹페이지를 포함할 수 있다.
2.3 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방 방법
상기한 바와 같이, 본 발명에 기재된 발견은 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명은 X1ITYX2RLKX3 (서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열 (여기서 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이되, X3은 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이다)로 이루어진 합성 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상술된 약제 또는 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
대상에게 투여되는 경우 약제 및/또는 조성물은 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상과 관련된 증세를 개선시키거나 경감시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 합성 펩티드는 9-mer, 9-mer Da, 9-mer Va, 9-mer Fa, 9-mer DF, 12-mer 및 이들의 조합을 포함하나 이들에 제한되지 않는 상술된 펩티드 군으로부터 선택된다.
일 실시양태에 따라, 본 발명은 본 발명의 약제 또는 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 종양, 특히 다발성 골수종을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 발명은 본 발명의 약제 또는 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 안 질환, 특히 안구건조증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에 따라, 본 발명은 본 발명의 약제 또는 조성물을 치료가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 심상성 건선을 치료하는 방법에 관한 것이다.
방법은 본 발명의 약제 또는 조성물을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
임의로, 본 발명의 방법은 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 및/또는 증상을 치료하기 위해 항염증제, 항암제 및 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된 약제의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 항염증제는 사이클로스포린일 수 있다. 항암제는 알킬화제, 항 -미소관제, 토포이소머라제 억제제 또는 세포독성제일 수 있다. 항생제는 아미카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 테이코플라닌, 반코마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 트롤레아노도마이신, 아목시실린, 암피실린, 아즐코실린, 카베니실린, 클로자실린, 디클록사실린, 플루코자실린, 메지오실린, 나프실린, 페니실린, 피페라실린, 티카실린, 바시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 B, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플라자신, 트로바플록사신, 마페니드, 설파세타미드, 설파메티졸, 설파살라진, 설피속사졸, 트리메토프림, 코트리목사졸, 데메클로사이클린, 속시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린 및 테트라사이클린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
모든 실시양태에서, 치료에 적합한 대상은 인간이다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 이는 한정이 아니라 설명을 목적으로 제공된다.
실시예
재료 및 방법
재료
RPMI1640 배지, 트립신-EDTA, 소태아 혈청 (FBS), 항생제-항진균제 용액 및 트립신은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구매하였다. 카복시메틸셀룰로스 나트륨 (CMC), 디메틸 설폭시드 (DMSO) 및 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU)은 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 제품이다. 3-(4,5-시메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT)는 Merck (카탈로그 번호 1.11714.0001) 제품이다. 항-BrdU 항체는 GeneTex (San Antonio, Tex, USA)로부터 구매하였다. GenScript (Piscataway, NJ)에 의뢰해 12-mer (KAFDITYVRLKF), 9-mer (DITYVRLKF), 8-mer (ITYVRLFK), 알라닌-치환된 펩티드 및 D-펩티드를 비롯한 짧은 합성 펩티드를 합성하고, 안정성을 위해 NH2 말단에서의 아세틸화 및 COOH 말단에서의 아미드화에 의해 변형시킨 후, 질량 분석법에 의해 특성화하였다 (>90% 순도). 모든 펩티드는 GenScript (Piscataway, NJ, USA)에 의해 합성되었으며, 이때 각 펩티드는 안정성을 향상시키기 위해 NH2 말단에서 아세틸화 및 COOH 말단에서 아미드화에 의해 변형되었으며, 이후 질량 분석법을 사용하여 특성화되었다 (>95% 순도).
세포 배양
다발성 골수종 주 RPMI8226 또는 래트 Raw264.7 대식세포를 10% (부피/부피) 열-불활성화된 송아지 태아 혈청 (Invitrogen), 50 ㎍/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 보충된 복합 배지 (RPMI 1640)에서 37 ℃, 5% CO2 분위기에서 배양하였다.
MTT 분석
RPMI8226 세포 또는 U266 세포를 무혈청 RPMI1640 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 48-웰 배양 플레이트에 세포를 시딩하고 (3×105 세포/웰), 20 μM의 펩티드를 함유한 신선한 0.5 ml 무혈청 RPMI1640 배지에서 24시간 동안 더 배양하였다. 세포 생존력을 MTT 분석에 의해 결정하였다.
50 μL의 MTT 스톡 용액 (멸균 PBS 1 ml에 용해된 MTT 5 ㎎)을 각 웰에 첨가하였고, 50 μL의 MTT 스톡 용액을 500 μL의 배지 단독에 첨가하여 음성 대조군으로서 사용하였다. 각 샘플을 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 각 샘플에서 분취액 (450 μl)을 48-웰 배양 플레이트의 새로운 웰에 취해 100 μL의 DMSO를 첨가하고 피펫을 사용하여 완전히 혼합한 다음, 37 ℃에서 20분 동안 반응시키고, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
트립판 블루 배제
0.1 mL의 트립판 블루 스톡 용액 (등장성 염 완충 용액 중 트립판 블루 0.4% 용액, pH 7.2)을 1 mL 세포 현탁액에 첨가하여 로딩시킨 혈구계를 사용하여 현미경하에 세포를 조사하였다. 청색 염색 세포의 수 (비생존성으로 간주됨) 및 총 세포 수를 각각 세었다. 세포 생존력은 건강한 로그기 (log-phase) 배양에 대해 적어도 95%이어야 한다.
세포자멸사 평가
제조사의 지침 (아넥신 V-FITC 세포자멸사 검출 키트; Roche)에 따라 유세포 계수법을 사용하여 아넥신 V/프로피듐 아이오다이드 (PI) 염색을 수행하였다. 요약하면, 0.5×106 세포를 Ca2 + 또는 Mg2 + 부재하의 빙냉 PBS (Life Technologies)에서 세척하였다. 그 다음, 세포를 100 μl의 결합 완충액에 재현탁하고 5.0 μl의 PI 및 2.0 μl의 아넥신 V-플루오레세인 이소티오시아네이트와 함께 암실에서 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 즉시 FACScalibur 장비 (Becton Dickinson)를 사용하여 유세포 계수 분석을 수행하였다.
건성안 동물 모델
동물
C57BL/6 마우스 (7-8 주령, 각각 체중 약 18 내지 25 g)가 본 모델 시스템에 사용되었다. 모든 마우스는 Mackay Memorial Hospital Review Board (대만)에 의해 승인된 절차에 따라 동물 시설에서 유지되었다. 모든 동물 실험 절차는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 선언문에 따라 수행되었다.
건성안 유도
Barabino 등 (IVOS (2005) 46(8), 2766-2771)에 의해 이전에 기재된 절차에 따라 14일 동안 제어된 환경 챔버 (CEC)에 마우스를 두어 건성안을 유도하였다. CEC에 배치된 마우스를 상대 습도 (RH) 25% 미만, 온도 20-22 ℃, 기류 약 15 L/분으로 유지시킨 조건에 하루 12시간씩 노출시켰다. 대조군 마우스는 정상 환경 (RH > 50%, 기류 없음, 온도 20-22 ℃)에서 동일한 기간 동안 유지시켰다.
처리
일반적인 인공 눈물 제형인 균형 염 용액 (BSS)에 용해된 1% 카복시메틸셀룰로스 (CMC)를 펩티드 비히클로서 사용하였다. 펩티드 (50 μM) 또는 1% CMC 비히클을 하루에 세 번씩 4일간 국소적으로 투여하였다.
각막 손상을 검출하기 위한 플루오레세인 눈 염색 시험
국소용 플루오레세인 (100 mg/ml 또는 10%; FLUORESCITE™, Alcon Laboratories)으로 염색하여 각막 상피 손상을 결정하였다. 투약을 위해, 국소용 플루오레세인 (눈 당 4.4 μL BSS에 용해된 0.5% 나트륨 플루오레세인 0.6 μL)을 마이크로-피펫을 통해 외안각에 15초간 적용하였다. 각막 플루오레세인 염색을 코발트블루 광 하에 슬릿-램프 생체현미경을 사용하여 조사하고 디지털 카메라로 촬영하였다. 데이터는 평균±S.D.로 나타내었다. 각막의 염료 염색을 다음과 같이 맹검 방식으로 기록하였다: 점선 염색이 없는 경우 0 점; 각막이 1/3 미만으로 염색된 경우 1 점, 2/3 이하가 염색된 경우 2 점; 2/3를 초과하여 염색된 경우 3 점이 배정되었다.
눈물 생산량 측정
페놀 레드-함침 면사 (Zone-Quick; Oasis, Glendora, CA)로 눈물 생산을 측정하였다. 마우스에서 이 시험의 타당성은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다 (Dursun et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002; 43:632-8). 실을 보석 겸자로 잡고 외안각에 60초 동안 놓아 두었다. 눈물 생산량은 눈물에 젖어 빨갛게 변한 실의 밀리미터로 표시되었다.
실험적 심상성 건선 유사 피부 염증 모델
이 모델 시스템에는 BALB/c 마우스 (8 주령 암컷, n=42)가 사용되었다. 이미퀴모드 (IMQ)로 마우스 피부를 처리하면 심상성 건선 유사 피부 염증을 유발한다는 것이 입증되었다 (van der Fits et al., J Immunol., 2009; 182:5836-45). 이에 따라, 본 모델에는 각 BALB/c 마우스에게 시판중인 IMQ 크림 (이미퀴모드 크림 5% w/w, Aldara™)을 면도한 등과 우측 귀에 매일 6일 연속 (n=6) 국소 투여 (62.5 mg)하였고; 대조 마우스 (정상군)는 대조 크림 (n=6)으로 처리하였다. 치료를 위해, 각 시험 펩티드를 IMQ 크림과 혼합하여 25 μM 농도로 만들었다 (군 당 n=6). 케라틴 생성 세포 증식을 BrdU 도입으로 결정하였다. BrdU (Sigma-Aldrich)를 80 mM의 원액으로서 DMSO에서 재구성하였다. 안락사시키기 전 24시간 동안 각 마우스에 PBS 90 μl와 혼합시킨 BrdU 10 μl를 복강 내 주사하였다.
조직학 및 면역조직화학 및 정량화
마우스의 등 피부를 4% 파라포름알데히드에서 하룻밤 고정시키고, 등급화된 에탄올 시리즈로 탈수시킨 뒤, 파라핀화하였다. 고정된 샘플을 크실렌에서 탈파라핀화시키고 등급화된 에탄올 시리즈에서 재수화시켰다. 조직을 5-μm 섹션으로 슬라이스하였다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) (Merck, Rayway, NJ, USA)을 사용하여 일반 조직학을 수행하였다.
슬라이드를 10% 염소 혈청으로 60분간 블록킹한 후, BrdU에 대한 일차 항체 (1:50 희석; GTX42641)와 함께 RT에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 슬라이드를 퍼옥시다아제로 표지된 당나귀 면역글로불린과 함께 30분 동안 인큐베이션하고, 헤마톡실린으로 대조 염색하기 전에 크로모겐 기질 (3,3'-디아미노벤지딘)과 2분간 인큐베이션하였다. Nikon Eclipse 80i 광학 현미경을 사용하여 포착한 고품질 이미지 (1208×960 픽셀 버퍼)를 기준으로 정량 평가하였다.
통계
결과는 평균±평균의 표준 오차 (SEM)로 표현되었다. 일원 (1-way) ANOVA를 통계적 비교에 사용하였다. P < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1: 세포 생존력에 대한 9-mer 및 그의 유사체의 효과
본 실시예에서는, 골수종 RPMI 8226 세포 생존력에 미치는 본 발명의 9-mer (DITYVRLKF, 서열 번호 2) 펩티드 및 그 유사체의 효능을 조사하였다. 네 가지 유형의 9-mer 유사체가 제조되었다. 9-mer의 특정 아미노산을 알라닌으로 각각 대체하여 9-mer Da, 9-mer Ia, 9-mer Ta, 9-mer Ya, 9-mer Va, 9-mer Ra, 9-mer La, 9-mer Ka, 및 9-mer Fa 펩티드 (서열 번호 3 내지 11)를 포함하는 제1 유형의 유사체를 제조하였다. 예를 들어, 9-mer Da는 아스파테이트 (D) 잔기가 알라닌 (A)으로 대체된 9-mer 유사체를 나타낸다. 유사하게, 9-mer Ia, 9-mer Ta, 9-mer Ya, 9-mer Va, 9-mer Ra, 9-mer La, 9-mer Ka, 및 9-mer Fa 펩티드는 9-mer의 이소류신 (I), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), 발린 (V), 아르기닌 (R), 류신 (L), 리신 (K) 및 페닐알라닌 잔기가 각각 알라닌으로 대체된 9-mer 유사체를 나타낸다. 9-mer DD, 9-mer DI, 9-mer DT, 9-mer DY, 9-mer DV, 9-mer DR, 9-mer DL, 9-mer DK 및 9-mer DK를 포함하는 제2 유형의 유사체는 9-mer의 특정 아미노산을 각각 상응하는 D-형태 아미노산으로 대체하여 제조하였다. 예를 들어, DD는 아스파테이트 (D) 잔기가 D-형태 아스파테이트로 대체된 9-mer 유사체를 나타낸다. 유사하게, 9-mer DI, 9-mer DT, 9-mer DY, 9-mer DV, 9-mer DR, 9-mer DL, 9-mer DK 및 9-mer DF는 9-mer의 이소류신 (I), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), 발린 (V), 아르기닌 (R), 류신 (L), 리신 (K) 및 페닐알라닌 잔기가 각각 상응하는 D-형태 아미노산 잔기로 대체된 9-mer 유사체를 나타낸다. 제3 유형의 9-mer 유사체는 12-mer 펩티드로서, 추가적인 3개의 아미노산 잔기가 9-mer의 N-말단에 첨가되어 12-mer 펩티드 (KAFDITYVRLKF, 서열 번호 12)를 생성시키는 것이다. 제4 유형의 9-mer 유사체는 9-mer의 아스파테이트 (D) 잔기 결실로 8-mer 펩티드 (ITYVRLKF, 서열 번호 13)를 생성시키는 8-mer 펩티드이다.
MTT 분석에 의해 결정된 세포 생존력에 대한 9-mer 및 그의 유사체의 효과를 도 1 내지 2에 나타내었다.
도 1에 도시된 데이터로부터 입증된 바와 같이, 12-mer 및 9-mer는 모두 골수종 RPMI 8226 세포 생존력을 성공적으로 억제하였다; 그러나, 2, 3, 4, 6, 7 및 8번 위치에서 9-mer 잔기에 대한 알라닌 치환 (즉, 9-mer Ia, 9-mer Ta, 9-mer Ya, 9-mer Ra, 9-mer La, 및 9-mer Ka 펩티드)으로 9-mer의 저해 활성이 상실되었으며, 이는 이들 모든 위치에 있는 아미노산 잔기가 9-mer의 생체활성에 필수적임을 제시한다. 특히, 1, 5 및 9번 위치에서 9-mer 잔기에 대한 알라닌 치환 (즉, 9-mer Da, 9-mer Va 및 9-mer Fa 펩티드)은 9-mer의 저해 활성의 일부를 유지할 수 있으며, 이는 이들 세 위치에 있는 아미노산 잔기가 9-mer의 저해 기능에 필수적이지 않음을 제시한다.
한편, D-형태 아미노산 치환이 이루어진 9-mer 유사체는 예기치 않게 1-8번 위치에 있는 9-mer 잔기가 9-mer의 생체 활성 상실로 이어지는 것으로 관찰되었다. 특히, 9-mer DF 펩티드 (즉, 9번 위치에서 9-mer 잔기에 대한 D-아미노산 치환)는 9-mer의 것과 유사한 활성을 나타내는데, 이는 D-형태 치환이 펩티드 활성을 유지할 수 있음을 나타낸다 (도 2).
종합하면, 상기 결과는 9-mer 및 12-mer가 둘 다 골수종 생존력을 억제하는데 효과적이며, 12-mer가 저용량에서 보다 강력함을 나타낸다. 또한, 9-mer 펩티드의 1, 5 및 9번 위치에 있는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며; 9-mer의 9번 위치에 있는 아미노산 잔기는 L-형태 또는 D-형태일 수 있는데 반해, 나머지 아미노산 잔기는 9-mer의 생체활성을 유지하기 위해 L-형태로 남아 있어야 한다.
실시예 2: 건조로 유도된 안구건조증에 대한 9-mer의 치료 효과
"재료 및 방법" 섹션에 기재된 절차에 따라 확립된 뮤린 건성안 모델을 본 실시예에 사용하여 9-mer 및 그의 유사체의 치료 효능을 평가하였다.
요약하면, 건성안의 전형적인 징후인 플루오레세인 염색을 가진 각막 궤양으로 입증되는 안구건조증을 유발하기 위해 마우스를 건조 조건에서 14일 동안 유지시키고, 제시된 시간 및 투여량으로 처리를 실시하였다. 결과는 도 3에 도시되어 있다.
대조 점안액 또는 9-mer 펩티드를 함유하는 점안액으로 처리된 안구 사진을도 3의 패널 A에 나타내었다. 각막의 플루오레세인 염색은 4일 동안 9-mer 처리를 받은 마우스에서 유의하게 감소하였으며, 이는 9-mer가 건성안에 치료 기능을 가지고 있다는 표시이다. 유사하게, 12-mer, 9-mer, 9-mer DF 또는 9-mer 알라닌 유사체 (9-mer Da, 9-mer Va 또는 9-mer Fa)로 4일 동안 처리한 건성안은 모두 비히클 처리 대조군 마우스의 것과 비교하여 평균 각막 플루오레세인 염색 점수에서 약 3배의 감소를 보였다 (도 3, 패널 B). 한편, 대조 8-mer 펩티드는 그러한 효과가 없었다. 또한, 눈물 부피는 12-mer, 9-mer, 9-mer DF 및 9-mer 알라닌 유사체 (9-mer Da, 9-mer Va 및 9-mer Fa)로 4일 동안 처리한 눈에서 유의적으로 증가하였다 (P < 0.01 versus 비히클 처리) (도 4).
실시예 3: 인간 다발성 골수종 세포에 대한 9-mer의 치료 효과
본 실시예에서는, RPMI8226 세포 및 U266 세포를 포함하는 인간 골수종 세포의 증식에 대한 9-mer의 세포독성 효과를 조사하였다. 결과는 도 5 및 도 6에 도시되어 있다.
인간 다발성 골수종 세포의 증식에 대한 9-mer의 세포독성 효과를 트립판 블루 분석법으로 결정한 결과, 9-mer 용매 (DMSO) 처리와 비교하여 9-mer는 RPMI8226 세포 (7.5±1.3 대 59.7±4.5) 및 U266 세포 (8.7±1.1 대 47.0±4.6)의 생존력을 각각 유의적으로 감소시켰다 (도 5). 9-mer의 저해 효과는 아넥신-V 염색에 의해 결정된 바와 같이, 이들 암세포에서 세포자멸사 유도에 의해 달성되었다. 대조군의 비처리 세포에서는 세포의 15% 미만이 세포자멸사인 것으로 나타난 것에 비해 24시간 동안 9-mer로 처리시에, 골수종 세포의 약 54%는 세포자멸 포스파티딜세린 노출을 보였다 (도 6).
실시예 4: IMQ로 유발된 심상성 건선 -유사 피부 염증에 대한 9-mer의 치료 효과
"재료 및 방법" 섹션에 기재된 절차에 따라 확립된 뮤린 심상성 건선-유사 피부 염증 모델을 본 실시예에 사용하여 9-mer 및 그의 유사체의 치료 효능을 평가하였다.
요약하면, BALB/c 마우스에게 9-mer 및/또는 그의 유사체 (예를 들어, 12-mer, 9-mer DF, 9-mer Da, 9-mer Va, 또는 9-mer Fa)의 존재하 또는 부재하에 IMQ를 면도한 등과 우측 귀에 매일 6일 연속 국소적으로 처리하였다. 이 기간 동안 IMQ 단독으로 처리된 마우스에서는 심상성 건선 유사 피부 염증 및 박리 형성이 발생하였으며; 반면에 IMQ와 9-mer (25 μM)가 국소 적용된 마우스는 등의 피부 염증 및 박리 수준이 감소된 것으로 나타났다 (도 7).
IMQ로 처리된 마우스의 피부 절편을 현미경 검사하였더니 표피종 (표피 비대), 박리 및 진피 침윤 (H&E 염색; 도 8, 패널 A)과 같은 심상성 건선 병변의 특징적인 변화를 나타내었다. 대조적으로, 9-mer 처리된 피부 절편은 IMQ로 처리된 피부 절편과 비교하여 표피종 감소 및 박리 감소를 나타내었다. 유사하게, 12-mer, 9-mer, 9-mer DF 펩티드로 처리된 심상성 건선 유사 피부 염증을 가진 마우스는 IMQ 대조군의 것에 비해 표피종의 현저한 감소를 보였다 (35.3±4.1, 39.2±2.7 및 35.7±4.2 대 122±10.5; 도 8, 패널 B).
이들 모든 피부 절편에 대한 케라틴 생성 세포의 과다증식을 또한 BrdU 도입으로 모니터링하였다. 도 9의 패널 A에 도시된 바와 같이, IMQ로 처리된 마우스에서는 BrdU가 표피의 여러 층에 걸쳐 위치한 케라틴 생성 세포 (갈색의 색깔) 내 DNA로 도입되었으며, 이는 증식 무조절을 반영한다. 대조적으로, 양성 BrdU 세포는 IMQ + 9-mer 처리 마우스에서 표피의 기저층으로 제한된 것으로 밝혀졌다. 유사하게, IMQ/9-mer DD의 것에 비해 12-mer, 9-mer 또는 9-mer DF로 처리된 마우스에서는 케라틴 생성 세포의 과다증식이 유의하게 감소하였다 (8.5±1.4, 8.3±1.4 및 6.3±1.2 대 24.5±2.0 및 23.3±2.5; 도 9, 패널 B).
종합하면, 상기 언급된 실시예에 제시된 결과는 본 발명의 짧은 합성 펩티드가 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종과 관련된 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있음을 확인해 준다.
상기 구체예들의 설명은 단지 예시로서 주어진 것이며, 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 구체예들의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 구체예가 특정 정도로, 또는 하나 이상의 개별 구체예를 참조하여 상술되었지만, 당업자는 본 발명의 정신 또는 범위로부터 벗어남이 없이 개시된 구체예에 많은 변경을 가할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> TSAO Yeou-Ping HO Tsung-Chuan <120> SHORT SYNTHETIC PEPTIDE AND USES THEREOF <130> P2902-PCT <150> US62/267,269 <151> 2015-12-14 <160> 13 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa is any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa is any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa is any amino acid residue <400> 1 Xaa Ile Thr Tyr Xaa Arg Leu Lys Xaa 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer <400> 2 Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Da <400> 3 Ala Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Ia <400> 4 Asp Ala Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Ta <400> 5 Asp Ile Ala Tyr Val Arg Leu Lys Phe 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Ya <400> 6 Asp Ile Thr Ala Val Arg Leu Lys Phe 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Va <400> 7 Asp Ile Thr Tyr Ala Arg Leu Lys Phe 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Ra <400> 8 Asp Ile Thr Tyr Val Ala Leu Lys Phe 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer La <400> 9 Asp Ile Thr Tyr Val Arg Ala Lys Phe 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Ka <400> 10 Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Ala Phe 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 9-mer Fa <400> 11 Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Ala 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 12-mer <400> 12 Lys Ala Phe Asp Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic; 8-mer <400> 13 Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Ala 1 5

Claims (30)

  1. X1ITYX2RLKX3 (서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드로서,
    여기서 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이되, R 및 X3은 독립적으로 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이며; 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된 것인 합성 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 그의 N-말단에 3개의 추가 아미노산 잔기를 더 포함함으로써 서열 번호 12의 인접 펩티드를 생성하는 합성 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, X1이 알라닌 (A)이고, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  5. 제1항에 있어서, X2가 알라닌 (A)이고, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  6. 제1항에 있어서, X3이 알라닌 (A)이고, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  7. 유효량의 제1항의 합성 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 합성 펩티드가 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 7, 서열 번호 11 및 서열 번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체는 액체, 겔, 크림, 및 연고로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  10. X1ITYX2RLKX3 (서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 유효량의 합성 펩티드를 대상자에게 투여하는 것을 포함하는, 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로,
    여기서 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이되, R 및 X3은 독립적으로 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이며; 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 합성 펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 합성 펩티드는 그의 N-말단의 상류에 3개의 추가 아미노산 잔기를 더 포함함으로써 서열 번호 2의 인접 펩티드를 생성하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, X1이 알라닌 (A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 방법.
  14. 제10항에 있어서, X2가 알라닌 (A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 방법.
  15. 제10항에 있어서, X3이 알라닌 (A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 합성 펩티드는 0.01 내지 100 mg/Kg의 양으로 투여되는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 대상은 인간인 방법.
  18. 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종 치료용 약제를 제조하기 위한 합성 펩티드의 용도로, 합성 펩티드는 X1ITYX2RLKX3 (서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지고,
    여기서 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이되, R 및 X3은 독립적으로 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이며; 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된 것인 용도.
  19. 제18항에 있어서, 합성 펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 용도.
  20. 제19항에 있어서, 합성 펩티드는 그의 N-말단의 상류에 3개의 추가 아미노산 잔기를 더 포함함으로써 서열 번호 3의 인접 펩티드를 생성하는 용도.
  21. 제18항에 있어서, X1이 알라닌 (A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 용도.
  22. 제18항에 있어서, X2가 알라닌 (A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 용도.
  23. 제18항에 있어서, X3이 알라닌 (A)이고, 합성 펩티드는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 용도.
  24. 안구건조증, 심상성 건선 또는 다발성 골수종 치료용 약제로 사용하기 위한 합성 펩티드로, 합성 펩티드는 X1ITYX2RLKX3 (서열 번호 1)으로 기재된 아미노산 서열로 이루어지고,
    여기서 X1, X2 및 X3은 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이되, R 및 X3은 독립적으로 L- 또는 D-형태이고 나머지 아미노산 잔기는 모두 L-형태이며; 아미노산 서열의 N-말단은 아세틸화되고 아미노산 서열의 C-말단은 아미드화된 것인 합성 펩티드.
  25. 제24항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 그의 N-말단의 상류에 3개의 추가 아미노산 잔기를 더 포함함으로써 서열 번호 3의 인접 펩티드를 생성하는 합성 펩티드.
  27. 제24항에 있어서, X1이 알라닌 (A)이고, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  28. 제24항에 있어서, X2가 알라닌 (A)이고, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  29. 제24항에 있어서, X3이 알라닌 (A)이고, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드.
  30. 제24항에 있어서, 0.01 내지 100 mg/Kg의 양으로 투여되는 합성 펩티드.
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