RU2816868C2

RU2816868C2 - Фармацевтические композиции для ингибирования воспалительных цитокинов

Info

Publication number: RU2816868C2
Application number: RU2020134114A
Authority: RU
Inventors: Нафтали ПРИМОР
Original assignee: С.И.С Шулов Инновейтив Сайенс Лтд.
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2024-04-08

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента пептид, выбранный из группы, состоящей из pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH (SEQ ID NO: 1), pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (SEQ ID NO:2) и их фармацевтически приемлемых солей, для лечения воспалительного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания или нарушения глаз, воспалительного заболевания или нарушения уха, воспалительного заболевания или нарушения легких, воспалительного заболевания или нарушения кишечника, или воспалительного аутоиммунного заболевания или нарушения. Изобретение обеспечивает ослабление экспрессии воспалительных и провоспалительных медиаторов пептидами, обозначенными ZEP3 и ZEP4. 15 з.п. ф-лы, 17 ил., 9 табл., 15 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям и способам облегчения симптомов, связанных с высвобождением воспалительных цитокинов при воспалительных состояниях, включая, без ограничения, воспалительные заболевания глаз.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Воспаление является частью сложной биологической реакции тканей организма на вредные стимулы, такие как патогены, поврежденные клетки или раздражители, и представляет собой защитную реакцию с участием иммунных клеток, кровеносных сосудов и молекулярных медиаторов. Функция воспаления состоит в том, чтобы устранить первоначальную причину повреждения клеток, очистить некротические клетки и ткани, поврежденные в результате первоначального повреждения и воспалительного процесса, и инициировать восстановление тканей.

Классическими признаками воспаления являются жар, боль, покраснение, отек и потеря функции. Воспаление - это общий ответ, поэтому его считают механизмом врожденного иммунитета.

Воспалительные заболевания включают широкий спектр нарушений и состояний, которые характеризуются воспалением. Примеры включают аллергию, астму, отторжение трансплантата, аутоиммунные заболевания и воспаление глаз, и это лишь некоторые из них.

Воспалительные заболевания глаз

Увеит - это общий термин, описывающий группу воспалительных заболеваний глаз, которые могут незначительно ухудшить зрение или привести к серьезной потере зрения. Заболевания часто поражают часть глаза, называемую сосудистой оболочкой глаза, но не ограничиваются этой частью глаза. Эти заболевания также влияют на хрусталик, сетчатку, зрительный нерв и стекловидное тело, вызывая ухудшение зрения или слепоту. Увеит может быть вызван проблемами или заболеваниями, возникающими в глазах, или может быть частью воспалительного заболевания, поражающего другие части тела. Увеит может быть острым или хроническим и обычно подразделяется на инфекционный или неинфекционный.

Сухой кератоконъюнктивит, также известный как болезнь сухого глаза (БСГ) или синдром сухого глаза (ССГ), является распространенным заболеванием глаз, побуждающим миллионы людей обращаться за офтальмологической помощью. Независимо от лежащей в основе этиологии было показано, что сухой глаз связан с аномалиями в предкорнеальной слезной пленке и последующими воспалительными изменениями на всей поверхности глаза, включая придатки, конъюнктиву и роговицу. Активация воспалительных цитокинов, например, ИЛ-6, играет решающую роль в патофизиологии БСГ.

С момента признания роли воспаления в развитии синдрома сухого глаза был исследован ряд средств лечения, предназначенных для подавления различных воспалительных путей, например, циклоспорин А, кортикостероиды, такролимус, производные тетрациклина и аутологичная сыворотка (Michelle Hessen M. и Karamursel Akpek EJ). Ophthalmic Vis Res. 2014, 9 (2), 240-250).

Патент США № 4619916 описывает 13 трипептидов формулы pGlu-X-Trp, где pGlu представляет собой циклизованную глутаминовую кислоту (пироглутаминовую кислоту), а X может представлять собой Gly, Val, Glu, Asp, Ser, Ala, Asn, Gln, Ile, Leu, Pro, Lys и Arg. В ссылке не описывается и не предлагается применение пептидов для лечения воспаления.

Патент США № 7220725 и международная патентная публикация WO200212269 раскрывают новые пептиды, включая pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH (ZEP3) и pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (ZEP4), и их применение для лечения боли. В этом документе не описывается и не предлагается применение пептидов для лечения воспаления.

В патенте США № 9012397 и WO2012/131676 описаны фармацевтические композиции для местного применения, включающие пептиды ZEP3 или ZEP4, и их применение для облегчения симптомов кожных заболеваний. В ссылке не описывается и не предлагается применение пептидов для лечения воспаления.

Gaynes et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, E-Abstract 5416, 2013) описывают обезболивающее действие пептида ZEP4 в отношении уменьшения боли в глазах и модификации путей ноцицепции в модели на крысах экспериментально индуцированного химического повреждения роговицы. В ссылке не описывают и не предполагают противовоспалительной активности пептида.

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение постоянной потребности в улучшении и разработке новых безопасных и эффективных методов лечения, которые улучшают воспалительные состояния путем вмешательства в воспалительный каскад.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы облегчения симптомов, связанных с высвобождением воспалительных цитокинов. Эти цитокины, как известно, являются частью этиологии и патологии многих воспалительных заболеваний. Заболевания и нарушения, поддающиеся лечению композициями согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, воспалительные заболевания глаза, уха, легких и кишечника. Заболевания и нарушения, поддающиеся лечению, также включают аутоиммунные заболевания, при которых введение лекарственных средств может быть хроническим введением для предотвращения обострений.

Настоящее изобретение частично основано на обнаружении на моделях in vitro и in vivo того факта, что пептиды, обозначенные ZEP3 и ZEP4, проявляют неожиданно сильную активность в ослаблении экспрессии и/или высвобождения воспалительных и провоспалительных медиаторов, включая конкретные цитокины интерферон гамма (ИФН-гамма, ИФНγ), интерлейкин 1 бета (ИЛ-1 бета, ИЛ-1β), интерлейкин 10 (ИЛ-10), фактор некроза опухоли альфа (ФНО альфа, ФНОα) и интерлейкин 6 (ИЛ-6), и медиаторы активных форм кислорода (АФК) и RANTES (экспрессируемого и предположительно секретируемого нормальными T-клетками при активации).

Неожиданно было обнаружено, что активность пептидов в ингибировании воспалительных каскадов проявляется даже в том случае, когда пептиды вводят до начала воспалительной реакции. Таким образом, пептиды могут облегчать или подавлять симптомы, вызванные различными воспалительными заболеваниями и нарушениями, и могут быть полезны для полного устранения воспалительной реакции. Предполагается, что композиции согласно настоящему изобретению могут быть полезны для предотвращения обострений хронических воспалительных заболеваний.

Следует четко понимать, что применение композиций согласно настоящему изобретению для лечения воспалительных заболеваний не включает лечение кожных заболеваний или боли как таковой.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента пептид формулы I: pGlu-X₁-X₂-X₃-OH, где X₁ представляет собой полярный аминокислотный остаток; X₂ представляет собой остаток ароматической или гидрофобной аминокислоты; и X₃ выбран из положительно заряженного аминокислотного остатка и полярного аминокислотного остатка, или его фармацевтически приемлемую соль или производное; и фармацевтически приемлемый носитель, для применения для уменьшения высвобождения или ингибирования активности воспалительного цитокина.

Согласно некоторым вариантам реализации X₁ выбран из группы, состоящей из: Asn, Gln, His, Ser, Thr, Tyr и Cys, X₂ выбран из Trp, Phe, Tyr, Ala, Ile, Leu, Met, Val. и Gly, и X₃ выбран из Lys, производного Lys, Arg, His, Asn, Gln, His, Ser, Thr и Tyr.

Согласно другим вариантам реализации X₁ выбран из Asn и Thr; X₂ выбран из Trp, Phe и Tyr; и X₃ выбран из Lys, производного Lys и Thr.

Согласно некоторым вариантам реализации пептидное производное содержит алкильную группу, присоединенную к свободной функциональной группе пептидной последовательности.

Согласно другим вариантам реализации алкильная группа присоединена амидной связью или соединением к свободной аминогруппе боковой цепи или N-конца пептида.

Согласно некоторым вариантам реализации, алкил представляет собой C4-C30 алкил.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации C8-алкильная группа (здесь октаноил) присоединена амидной связью к боковой цепи остатка Lys пептидной последовательности или концевой аминогруппы пептида. Согласно некоторым вариантам реализации карбокси-конец пептида модифицирован с образованием, например, амидного, спиртового или сложноэфирного конца.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации пептид выбран из группы, состоящей из: pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH (SEQ ID NO: 1), pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (SEQ ID NO: 2) и их фармацевтически приемлемых производных и солей.

Согласно некоторым вариантам реализации воспалительный цитокин выбран из группы, состоящей из: ФНО альфа, ИЛ-1 бета, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИФН гамма.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента пептид формулы I: pGlu-X₁-X₂-X₃-OH, где X₁ представляет собой полярный аминокислотный остаток; X₂ представляет собой остаток ароматической или гидрофобной аминокислоты; и X₃ выбран из положительно заряженного аминокислотного остатка и полярного аминокислотного остатка, или его фармацевтически приемлемую соль или производное; и фармацевтически приемлемый носитель, для применения для уменьшения высвобождения медиатора воспаления или хемокина, при этом медиатор или хемокин.

Согласно некоторым вариантам реализации медиатор воспаления или цитокин выбран из группы, состоящей из активных форм кислорода (АФК) и RANTES (экспрессируемого и предположительно секретируемого нормальными T-клетками при активации).

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ уменьшения высвобождения или ингибирования активности по меньшей мере одного воспалительного или провоспалительного цитокина, причем способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пептида формулы I: pGlu-X₁-X₂-X₃-OH, где X₁ представляет собой полярный аминокислотный остаток; X₂ представляет собой остаток ароматической или гидрофобной аминокислоты; и X₃ выбран из положительно заряженного аминокислотного остатка и полярного аминокислотного остатка, или его фармацевтически приемлемой соли или производного.

Согласно другому аспекту предложен способ уменьшения высвобождения медиатора воспаления или хемокина, причем способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пептида формулы I: pGlu-X₁-X₂-X₃-OH, где X₁ представляет собой полярный аминокислотный остаток; X₂ представляет собой ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток, и X₃ выбран из положительно заряженного аминокислотного остатка и полярного аминокислотного остатка, или его фармацевтически приемлемой соли или производного.

Согласно некоторым вариантам реализации медиатор воспаления или хемокин выбран из группы, состоящей из АФК и RANTES.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения воспалительного заболевания или нарушения. Согласно конкретным вариантам реализации воспалительное заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из: воспалительного заболевания или нарушения глаз, воспалительного заболевания или нарушения уха, воспалительного заболевания или нарушения легких, воспалительного заболевания или нарушения кишечника или воспалительного аутоиммунного заболевания или нарушения, и способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пептида согласно формуле I: pGlu-X₁-X₂-X₃-OH, или его фармацевтически приемлемой соли или производного, где X₁ представляет собой полярный аминокислотный остаток; X₂ выбран из остатка ароматической аминокислоты и остатка гидрофобной аминокислоты; и X₃ выбран из положительно заряженного аминокислотного остатка и полярного аминокислотного остатка.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы лечения хронических воспалительных заболеваний. Согласно конкретным вариантам реализации стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пептида формулы I осуществляют еще до появления или развития симптомов. Указанные способы лечения хронических воспалительных заболеваний эффективны для предотвращения обострений.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения воспалительного заболевания или нарушения глаз, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пептида формулы I: pGlu-X₁-X₂-X₃-OH, или его фармацевтически приемлемой соли или производного, где X₁ представляет собой полярный аминокислотный остаток; X₂ представляет собой ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток, и X₃ выбран из положительно заряженного аминокислотного остатка и полярного аминокислотного остатка.

Согласно некоторым вариантам реализации X₁ выбран из группы, состоящей из: Asn, Gln, His, Ser, Thr, Tyr и Cys; X₂ выбран из Trp, Phe, Tyr, Ala, Ile, Leu, Met, Val и Gly; и X₃ выбран из Lys, производного Lys, Arg, His, Asn, Gln, His, Ser, Thr и Tyr.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации производное Lys представляет собой Lys(октаноил).

Согласно некоторым вариантам реализации пептидное производное содержит алкильную группу, присоединенную к функциональной группе пептидной последовательности.

Согласно другим вариантам реализации алкильная группа присоединена амидной связью к аминогруппе боковой цепи или к концу пептида.

Согласно некоторым вариантам реализации алкил представляет собой C4 - C30 алкил.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации C8-алкильная группа (здесь октаноил) присоединена амидной связью к боковой цепи остатка Lys или концевой аминогруппе пептидной последовательности.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации пептид выбран из группы, состоящей из: pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH (SEQ ID NO: 1), pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (SEQ ID NO: 2) и их фармацевтически приемлемых солей или производных.

Согласно некоторым вариантам реализации пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция содержит производное или соль пептида, имеющего аминокислотную последовательность, установленную в последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Согласно некоторым вариантам реализации способ включает введение производного или соли пептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция содержит натриевую соль пептида, указанного в любой из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция составлена для (выполнена с возможностью) введения путем, выбранным из группы, состоящей из местного применения, офтальмологического введения, перорального введения, назального введения и парентерального введения.

Согласно различным вариантам реализации составы для местного применения могут быть выбраны из крема, мази, пасты, лосьона, геля или глазных капель.

В соответствии с некоторыми конкретными вариантами реализации предложен состав крема, содержащий пептид, выбранный из SEQ ID NO: 1 и 2, или его фармацевтически приемлемую соль, для местного применения.

Согласно некоторым вариантам реализации композиция крема содержит 0,1-5 % масс./масс. пептида. Согласно другим вариантам реализации композиция содержит 0,5-2 % пептида. Согласно другим вариантам реализации композиция содержит примерно 1 % пептида.

Согласно некоторым вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению имеет pH от примерно 4 до примерно 8. Согласно некоторым вариантам реализации композиция имеет pH от примерно 4,5 до примерно 6,5. Согласно другим вариантам реализации композиция имеет pH от примерно 7 до примерно 9.

Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один наполнитель, выбранный из группы, состоящей из: полисорбата 80, динатрия эдетата (ЭДТА), диоксида кремния, метилпарабена, белого вазелина, изопропилмиристата, цетилового спирта и моностеарата глицерина.

Согласно другим вариантам реализации композицию для введения субъекту с заболеванием или повреждением глаз, составляют в форме, выбранной из группы, состоящей из жидкого раствора или суспензии для применения в форме глазных капель, эмульсии, крема, мази, спрея и геля.

Согласно некоторым вариантам реализации заболевание или повреждение глаза представляет собой воспалительное заболевание или нарушение, выбранное из группы, состоящей из: увеита, синдрома сухого глаза, воспалительных симптомов, связанных с инфекционным заболеванием глаз, аллергического заболевания глаз, кератита, конъюнктивита, дисфункции мейбомиевых желез и синдрома Шегрена.

Согласно другим вариантам реализации фармацевтическая композиция составлена в виде глазных капель, глазной мази, спрея для глаз, офтальмологической суспензии, офтальмологической эмульсии, офтальмологического раствора, офтальмологического геля или интравитреальной инъекции.

Согласно другим вариантам реализации воспалительное заболевание или нарушение представляет собой аутоиммунное заболевание или нарушение.

Согласно другим вариантам реализации аутоиммунное заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, остеоартрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идиопатического артрита, волчанки и синдрома Шегрена.

Согласно другим вариантам реализации воспалительное заболевание или нарушение представляет собой воспалительное заболевание кишечника.

Согласно другим вариантам реализации воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из болезни Крона, язвенного колита и целиакии.

Согласно другим вариантам реализации воспалительное заболевание или нарушение представляет собой воспалительное заболевание или нарушение легких.

Согласно другим вариантам реализации воспалительное заболевание или нарушение легких выбрано из группы, состоящей из астмы, бронхита, плеврита, альвеолита, васкулита, пневмонии, хронического бронхита, бронхоэктазии, диффузного панбронхиолита, пневмонита гиперчувствительности, идиопатического легочного фиброза и муковисцидоза.

Согласно другим вариантам реализации воспалительное заболевание или расстройство представляет собой воспалительное заболевание или нарушение уха.

Согласно другим вариантам осуществления воспалительное заболевание или нарушение уха выбрано из группы, состоящей из воспалительных симптомов, связанных с инфекцией уха, среднего отита, наружного отита, мастоидита и отомастоидита.

Согласно другим вариантам реализациивведение представляет собой офтальмологическое введение.

Согласно другим вариантам реализации введение представляет собой пероральное введение.

Согласно другим вариантам реализации введение представляет собой назальное введение.

Согласно другим вариантам реализациивведение представляет собой парентеральное введение.

Настоящее изобретение успешно устраняет недостатки известных в настоящее время конфигураций, благодаря обеспечению фармацевтических композиций для использования для снижения высвобождения или ингибирования активности воспалительных цитокинов и медиаторов и для лечения заболеваний или нарушений, связанных с воспалительными цитокинами и медиаторами.

Если не указано иное, все технические и/или научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в той области техники, к которой относится изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, могут использоваться при практической реализации или при тестировании вариантов реализации настоящего изобретения, ниже описаны примерные способы и/или материалы. В случае конфликта описание патента, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Некоторые варианты реализации изобретения описаны здесь только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи. Обращаясь теперь к конкретным подробным чертежам, следует подчеркнуть, что детали показаны в качестве примера и в целях иллюстративного обсуждения вариантов реализации изобретения. В этом отношении описание чертежей делает очевидным для специалистов в данной области техники, как варианты реализации изобретения могут быть реализованы на практике.

На чертежах:

Фиг. 1 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую действие ZEP4 (Z), диапазон концентраций: 3,125 - 100 мкг/мл, на количество ФНОα, продуцируемого индуцированными воспалением клетками макрофагов. Линии, отмеченные знаком ****, представляют статистически значимую разницу при p <0,0001.

Фиг. 2 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую влияние ZEP4 (Z) (50 мкг/мл) на количество ФНОα, продуцируемого индуцированными воспалением клетками макрофагов, обработанными липополисахаридом (ЛПС, 100 нг/мл) и пальмитиновой кислотой (ПК, 100, 200 или 400 мкМ). Линии, отмеченные знаком ****, представляют статистически значимую разницу при p <0,0001.

Фиг. 3 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую действие ZEP3 (Z) (диапазон концентраций: 3,125 - 100 мкг/мл) на количество ФНОα, продуцируемого индуцированными воспалением клетками макрофагов. Линии, отмеченные знаком ****, ***, **, * и н.з., представляют статистически значимую разницу при p <0,0001, p <0,001, p <0,01, P <0,1 и не значимую, соответственно.

Фиг. 4 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую влияние ZEP4 (Z) (50 мкг/мл) на количество ИЛ-1бета, продуцируемого воспаленными клетками макрофагов, индуцированными нигерицином. Линия, отмеченная знаком ****, представляет статистически значимую разницу при p <0,0001.

Фиг. 5 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую влияние ZEP3 на жизнеспособность индуцированных воспалением клеток макрофагов.

Фиг. 6 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую защитное действие ZEP3 при различных концентрациях на жизнеспособность индуцированных воспалением эпителиальных клеток роговицы, подвергнутых воздействию 70 мМ NaCl (черные столбцы) или NHE20 (серые столбцы), определенное с помощью анализа с ЛДГ. Линии, отмеченные знаком **** и *, представляют статистически значимую разницу при p <0,0001 и p <0,05 соответственно.

Фиг. 7 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую влияние ZEP3 в различных концентрациях на количество ИЛ-6, продуцируемого вызванными воспалением эпителиальными клетками роговицы, подвергнутыми воздействию 4-гидроксиноненаля (4-HNE) в течение 24 часов. Линия, отмеченная *, представляет статистически значимую разницу при p <0,05.

Фиг. 8 представляет собой гистограмму, иллюстрирующую защитный эффект ZEP3 при различных концентрациях на количество активных форм кислорода (АФК, измеренных с помощью набора DCFDA), продуцируемых индуцированными воспалением эпителиальными клетками роговицы, подвергнутыми воздействию 4-HNE в течение 24 часов. Линии, отмеченные ****, *** и **, представляют статистически значимую разницу при p <0,0001, p <0,001 и p <0,01 соответственно.

Фиг. 9 описывает продуцирование ИФН-γ нормальными МКПК от 4 доноров-людей в ответ на стимуляцию ZEP3 в различных концентрациях и средах, стимуляцию и контроль по дексаметазону. Статистически значимые различия представлены как: * p <0,05, ** p <0,01, по сравнению с контролем стимуляции, с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Дюнетт.

На Фиг. 10 показана продукция ИЛ-10 в нормальных МКПК от четырех доноров-людей в ответ на стимуляцию ZEP3 в различных концентрациях и средах, стимуляцию и контроль по дексаметазону. Статистически значимые различия представлены как: * p <0,05, ** p <0,01, по сравнению с контролем стимуляции, с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Дюнетт.

На Фиг. 11 изображена продукция ИЛ-1B в нормальных МКПК от 4 доноров-людей в ответ на стимуляцию ZEP3 в различных концентрациях и средах, стимуляцию и контроль по дексаметазону. Статистически значимые различия представлены как: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001 по сравнению с контролем стимуляции с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Дюнетт.

На Фиг. 12 представлена продукция RANTES в нормальных МКПК от 4 доноров-людей в ответ на стимуляцию ZEP3 в различных концентрациях и средах, стимуляцию и контроль по дексаметазону. Статистически значимые различия представлены как: * p <0,05, по сравнению с контролем стимуляции с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Дюнетт.

Фигуры 13A и 13B представляют собой графики, показывающие изменение толщины кожи спины с течением времени у мышей, получавших местно ZEP3, ZEP3Na (фиг. 13A) или ZEP4 (фиг. 13B), по сравнению с контролем по наполнителю и бетаметазоном в модели атопического дерматита, индуцированного оксазолоном. Статистически значимые различия представлены как: * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,001, по сравнению с контролем стимуляции с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Дюнетт.

На фигурах 14A и 14B показано изменение толщины правого уха с поправкой на исходный уровень с течением времени у мышей, получавших местно ZEP3, ZEP3Na (фиг. 14A) или ZEP4 (фиг. 14B), по сравнению с контролем по наполнителю и бетаметазоном в модели атопического дерматита, индуцированного оксазолоном у мышей.

Фигуры 15A и 15B представляют собой графики, отображающие эволюцию показателя эритемы с течением времени у мышей, получавших местно ZEP3, ZEP3Na (фиг. 15A) или ZEP4 (фиг. 15B), по сравнению с контролем по наполнителю и бетаметазоном в модели атопического дерматита, индуцированного оксазолоном, у мышей. Статистически значимые различия представлены как: * p <0,05, ** p <0,001, **** p <0,0001, по сравнению с контролем стимуляции с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Дюнетт.

Фигуры 16A и 16B представляют эволюцию шкалы оценки во времени у мышей, получавших местно ZEP3, ZEP3Na (фиг. 16A) или ZEP4 (фиг. 16B), по сравнению с контролем по наполнителям и бетаметазоном в модели атопического дерматита, индуцированного оксазолоном. Статистически значимые различия представлены как: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001, по сравнению с контролем стимуляции с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями Дюнетт.

Фигуры 17A и 17B иллюстрируют относительное изменение массы тела животных с 8 по 28 день у мышей, получавших местно ZEP3, ZEP3Na (фиг. 17A) или ZEP4 (фиг. 17B), по сравнению с контролем по наполнителю и бетаметазоном в модели индуцированного оксазолоном атопического дерматита у мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим определенные пептиды, их соли и производные, для применения в ингибировании воспалительных каскадов. Ингибирование медиаторов воспаления полезно для профилактики и лечения некоторых воспалительных заболеваний и нарушений, например, воспалительных заболеваний и нарушений глаз.

Как проиллюстрировано в настоящем документе, ингибирующее действие на высвобождение воспалительных цитокинов было продемонстрировано in vitro на нескольких моделях, включая клеточную линию макрофагов мыши, клеточную линию моноцитов человека, клеточную линию кератиноцитов человека, моноциты периферической крови человека (МКПК человека) и эпителиальные клетки роговицы человека (ЭКРЧ) и in vivo на мышиной модели воспалительного атопического дерматита (АД).

Благоприятное действие пептидов на экспериментальное воспаление роговицы был продемонстрирован на модели культуры эпителиальных клеток роговицы человека.

Идеи и принцип действия настоящего изобретения можно лучше понять со ссылкой на чертежи и сопроводительные описания.

Прежде чем подробно объяснять по меньшей мере один вариант реализации изобретения, следует понимать, что изобретение не обязательно ограничено в своем применении деталями, изложенными в нижеследующем описании или проиллюстрированными примерами. Изобретение может быть реализовано в других вариантах реализации или реализовано на практике различными способами. Также следует понимать, что фразеология и терминология, используемые в данном документе, предназначены для целей описания и не должны рассматриваться как ограничивающие.

Применяя настоящее изобретение на практике, авторы неожиданно обнаружили, что пептиды ZEP3 и ZEP4 и их формы натриевой соли снижают экспрессию воспалительных цитокинов ФНО-альфа, ИЛ-1-бета и ИЛ-6 макрофагами и эпителиальными клетками роговицы, которые были индуцированы для воспаления (примеры 1-7 ниже), и снижают экспрессию ИФН гамма, ИЛ-10, ИЛ-1 бета и RANTES в стимулированных воспалением МКПК человека (пример 12 ниже). Кроме того, в воспалительной модели атопического дерматита у мышей ZEP4, ZEP3 и форма его натриевой соли ZEP3Na значительно уменьшали клинические поражения in-vivo (Пример 13 ниже). Результаты показывают, что пептиды согласно настоящему изобретению обладают уникальной способностью подавлять или предотвращать воспаление.

Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения, предложена фармацевтическая композиция для уменьшения высвобождения или ингибирования активности по меньшей мере одного цитокина или медиатора, вовлеченного в этиологию или патологию воспалительного заболевания или нарушения. Фармацевтическая композиция включает пептид в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель. Пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 1 и 2, или его фармацевтически приемлемую соль.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения и лечения воспалительных патологий, связанных с избыточным высвобождением или активностью определенных цитокинов и медиаторов.

Согласно некоторым вариантам реализации воспалительная патология представляет собой заболевание или нарушение, связанное с избыточным высвобождением или активностью по меньшей мере одного цитокина или медиатора, при этом по меньшей мере один цитокин или медиатор выбран из группы, состоящей из:ИФН-гамма, ИЛ-1 бета, ИЛ-10, ФНО альфа, ИЛ-6, АФК и RANTES.

Используемая здесь фраза «воспалительное заболевание или нарушение» относится к заболеванию, состоянию или нарушению, связанным с воспалением. Используемый здесь термин «воспаление» относится к процессу, с помощью которого иммунная система субъекта координирует ответ на повреждение ткани, инфекцию, антигенную нагрузку и т.д. Воспаление может быть связано с повышенным кровоснабжением ткани, повышенной проницаемостью капилляров в ткани и/или повышенной миграцией лейкоцитов в ткань.

Провоспалительные цитокины вырабатываются преимущественно активированными макрофагами и участвуют в регуляции воспалительных реакций.

Воспаление можно диагностировать по повышенным уровням воспалительных цитокинов, таких как, помимо прочего, ФНОα, ИЛ-1-альфа, ИЛ-1-бета, ИФН-гамма и ИЛ-6, в биологическом образце, полученном от субъекта. Биологический образец может представлять собой, например, слезы, кровь, сыворотку, плазму, мочу, мокроту, слюну, фекалии, сперму, спинномозговую жидкость,костный мозг, лимфатическую жидкость или цереброспинальную жидкость, внешние выделения кожи, дыхательных, кишечных и мочеполовых путей, молоко, любой орган или ткань человека, любой образец, полученный с помощью лаважа, множественный выпот, образец культуры клеток in vitro или ex vivo и составляющие клеточной культуры.

Активные формы кислорода (АФК) являются ключевыми сигнальными молекулами, которые играют важную роль в прогрессировании воспалительных заболеваний. Повышенная генерация АФК полиморфноядерными нейтрофилами (ПМН) в месте воспаления вызывает эндотелиальную дисфункцию и повреждение тканей. В условиях воспаления окислительный стресс, вызываемый ПМН, приводит к открытию межэндотелиальных контактов и способствует миграции воспалительных клеток через эндотелиальный барьер.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения воспалительное заболевание или нарушение представляет собой воспалительное заболевание или нарушение глаз. Воспалительное заболевание или нарушение глаз может представлять собой, помимо прочего, увеит, синдром сухого глаза, воспалительные симптомы, связанные с вирусной, бактериальной или грибковой инфекцией глаз, аллергическое заболевание глаз, кератит, конъюнктивит, дисфункцию мейбомиевых желез и синдром Шегрена.

В одном из вариантов реализации воспалительное заболевание или нарушение глаз представляет собой увеит. Используемый здесь термин «увеит» относится к воспалению сосудистой оболочки глаза, которая представляет собой слой между склерой и сетчаткой, который включает радужную оболочку, цилиарное тело и сосудистую оболочку. Увеит также часто называют иритом, парспланитом, хороидитом, хориоретинитом, передним увеитом и задним увеитом. Наиболее распространенной формой увеита является передний увеит, который включает воспаление в передней части глаза, которое обычно ограничивается радужной оболочкой. Это состояние часто называют иритом.

В одном варианте реализации воспалительное заболевание или состояние глаза представляет собой синдром сухого глаза. Выражение «синдром сухого глаза (ССГ)», используемое в данном документе, относится к состоянию измененного состава слезы, которое является результатом заболевания или дисфункции функциональной единицы слезной железы. Данные свидетельствуют о том, что воспаление вызывает структурные изменения слезных желез. Изменения в составе слезы в результате дисфункции слезной железы, повышенного испарения и/или плохого клиренса оказывают провоспалительное действие на поверхность глаза. Это воспаление частично отвечает за симптомы раздражения, заболевание поверхностного эпителия глаза и изменение барьерной функции эпителия роговицы при сухом глазе. Противовоспалительная терапия для ССГ нацелена на один или несколько медиаторов/путей воспаления, которые были идентифицированы при синдроме сухого глаза. ССГ также известен специалистам как болезнь сухого глаза (БСГ), сухой кератоконъюнктивит и сухой кератит.

В одном варианте реализации воспалительное заболевание или состояние глаза связано с синдромом Шегрена. Выражение «синдром Шегрена» в контексте настоящего описания относится к системному аутоиммунному воспалительному заболеванию, характеризующемуся уменьшением слезотечения, сухостью во рту и другими сухими слизистыми оболочками, и часто ассоциируется с аутоиммунными ревматическими расстройствами, такими как ревматоидный артрит. Сухость глаз и рта - самые частые симптомы этого синдрома. Симптомы могут возникать сами по себе или вместе с симптомами, связанными с ревматоидным артритом или другими заболеваниями соединительной ткани. Возможно сопутствующее увеличение слюнных желез. Могут быть затронуты другие органы. Синдром может быть связан с ревматоидным артритом, системной красной волчанкой (СКВ), склеродермией, полимиозитом и другими заболеваниями.

В некоторых вариантах реализации воспалительное заболевание или состояние глаза возникает в результате процедуры, вовлекающей глаз, например, трансплантации/кератопластики роговицы, операции кератопротезирования, ламеллярной трансплантации или селективной трансплантации эндотелия.

В некоторых вариантах реализации воспалительное заболевание или состояние глаза влияет на поверхность глаза, например, но не ограничиваясь ими, воспалительные состояния роговицы и глазной поверхности, неоваскуляризация роговицы, кератит, включая периферический язвенный кератит и микробный кератит, конъюнктивит или пемфигоидный синдром.

В некоторых вариантах реализации воспалительное заболевание или состояние глаза представляет собой аутоиммунное заболевание, поражающее глаз, такое как, помимо прочего, симпатическая офтальмия, синдром Фогта-Коянаги Харада (VKH), дробевидная ретинохориодопатия, глазной рубцовый пемфигоид (ГРП), синдром Шегрена. или гетерохронный иридоциклит Фукса.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения воспалительное заболевание или нарушение представляет собой аутоиммунное заболевание или нарушение. Аутоиммунное заболевание или нарушение может представлять собой, без ограничения, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориатический артрит, вульгарную пузырчатку, анкилозирующий спондилит, ювенильный идиопатический артрит, волчанку и синдром Шегрена.

В одном варианте реализации аутоиммунное заболевание или нарушение представляет собой ревматоидный артрит. Выражение «ревматоидный артрит» в контексте настоящего описания относится к хроническому аутоиммунному заболеванию, при котором воспалены несколько суставов. Воспаление слизистой оболочки синовиального сустава сопровождается болью в суставах и их скованностью и обычно приводит к разрушению костей и суставов, деформации, инвалидности и даже смерти.

В одном варианте реализации аутоиммунное заболевание или нарушение представляет собой волчанку. Используемый здесь термин «волчанка» относится к хроническому воспалительному аутоиммунному заболеванию, называемому красной волчанкой, которое может поражать многие системы органов, включая кожу, суставы и внутренние органы. Волчанка - это общий термин, который включает ряд конкретных типов волчанки, включая системную волчанку, волчаночный нефрит и волчаночный церебрит. При системной волчанке (СКВ) естественная защита организма направлена против него самого, и иммунные клетки атакуют собственные ткани. Могут вырабатываться антитела, которые могут реагировать против клеток крови, органов и тканей организма. Эта реакция приводит к тому, что иммунные клетки атакуют пораженные системы, вызывая хроническое заболевание. Волчаночный нефрит, также называемый гломерулярной волчанкой, представляет собой заболевание почек, которое обычно является осложнением СКВ и характеризуется повреждением клубочков и прогрессирующей потерей функции почек. Волчаночный церебрит относится к еще одному осложнению СКВ, которое представляет собой воспаление головного мозга и/или центральной нервной системы.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения воспалительное заболевание или нарушение представляет собой остеоартрит (ОА). ОА также называют гипертрофическим остеоартрозом, остеоартрозом и дегенеративным заболеванием суставов. ОА - это хроническое дегенеративное заболевание скелетных суставов, которое поражает определенные суставы, обычно колени, бедра, суставы рук и позвоночник, у взрослых всех возрастов. ОА характеризуется рядом следующих проявлений, включая дегенерацию и истончение суставного хряща с сопутствующим развитием «язв» или кратеров, образование остеофитов, гипертрофию костей по краям, а также изменения синовиальной оболочки и увеличение пораженных суставов. Кроме того, остеоартрит сопровождается болью и скованностью, особенно после продолжительной активности. Пептиды, их соли и производные, а также содержащие их фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно использовать для лечения остеоартрита. Характерные рентгенологические признаки остеоартрита включают сужение суставной щели, субхондральный склероз, остеофитоз, образование субхондральных кист, рыхлое костное тело (или «суставную мышь»).

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения воспалительное заболевание или нарушение представляет собой воспалительное заболевание кишечника. Воспалительное заболевание кишечника может представлять собой, помимо прочего, болезнь Крона, язвенный колит и целиакию.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения воспалительное заболевание или нарушение представляет собой воспалительное заболевание или нарушение легких. Воспалительное заболевание или нарушение легких может представлять собой, помимо прочего, астму, бронхит, плеврит, альвеолит, васкулит, пневмонию, хронический бронхит, бронхоэктазию, диффузный панбронхиолит, гиперчувствительный пневмонит, идиопатический легочный фиброз и муковисцидоз.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения воспалительное заболевание или нарушение представляет собой воспалительное заболевание или нарушение уха. Воспалительное заболевание или нарушение уха может представлять собой, без ограничения, воспалительные симптомы, связанные с инфекцией уха, средний отит, наружный отит, мастоидит и отомастоидит.

Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция для применения при лечении заболевания или расстройства, связанного с избыточным высвобождением медиаторов воспаления и хемокинов, включая, но не ограничиваясь ими, АФК, RANTES и хемотаксический белок-1 моноцитов (ХБМ-1). Воспалительные заболевания, связанные с высвобождением АФК, которые поддаются лечению с помощью композиций согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, заболевания легких, сердечно-сосудистые заболевания, кальцификацию сосудов, связанную с заболеванием почек, и воспалительные метаболические заболевания.

Хемокины RANTES и ХБМ-1 участвуют в аллергическом воспалении легких, инфильтрации лейкоцитов в легких, гиперреактивности бронхов и вовлечении эозинофилов в патогенез астмы.

Термины «лечение» или «лечить» могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к ингибированию, предотвращению или остановке развития заболевания или нарушения и/или к уменьшению, ремиссии или регрессу заболевания или нарушения.

Пептиды, производные и соли, применяемые в композициях и способах согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы с использованием любого способа, известного в данной области техники, включая, помимо прочего, твердофазный и жидкофазный пептидный синтез. Некоторые из пептидов, используемых в композициях согласно настоящему изобретению, могут быть получены с использованием рекомбинантных методов или комбинации рекомбинантных и синтетических методов.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептид представляет собой pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH (SEQ ID NO: 1; далее обозначается как «ZEP3»), где pGlu представляет собой пироглутаминовую кислоту. Пептид ZEP3 может быть получен, например, согласно методике, описанной в патенте США № 7220725.

В одном варианте реализации настоящего изобретения пептид представляет собой pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (SEQ ID NO: 2; далее упоминается как «ZEP4»). Пептид ZEP4 можно получить, например, с помощью следующей процедуры:

Синтез пептида ZEP4 осуществляют последовательным синтезом 9-фторметоксикарбонил (Fmoc) аминокислот на твердом носителе из хлортритилхлоридной смолы (ХТХ). В смолу ХТХ (125 г) загружают Fmoc-треонин (трет-бутил; 79 г) и диизопропиламин (DIPEA; 160 г), служащий связующим агентом аминокислоты с твердым носителем. Защитную группу Fmoc удаляют смесью 25 % пиперидина, и смолу-пептид фильтруют и промывают диметилформамидом (ДМФ). Вторую аминокислоту, Fmoc-Trp (85 г), активируют смесью гексафторфосфата 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HBTU) / гидроксибензотиазола (OHBT) и присоединяют к первой аминокислоте добавлением DIPEA. Группу Fmoc удаляют, как описано выше, и смолу-пептид фильтруют и промывают диметилформамидом (ДМФ). Третью аминокислоту, Fmoc-Asn (трифенилметил) (119 г), активируют HBTU/HOBT и связывают путем добавления DIPEA. Группу Fmoc удаляют, как описано выше, и смолу-пептид фильтруют и промывают диметилформамидом (ДМФ). Четвертую аминокислоту pGlu (26 г) активируют HBTU/HOBT и связывают с помощью DIPEA.

Пептид-смолу тщательно промывают ДМФ, затем ИПС, и сушат при пониженном давлении. Пептид отщепляют от смолы и защитных групп Thr и Asn, под действием ТФУК (95 %) и триизопропилсилана (ТИС) (5 %) при комнатной температуре в течение 2 часов. Пептид осаждают добавлением метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ), фильтруют и сушат (выход 46 г).

Неочищенный продукт (46 г) растворяют в смеси ацетонитрил (ACN) / вода, загружают в систему препаративной ВЭЖХ (4 дюйма, RP C-18, размер пор 100-120 A) и очищают с использованием градиентной системы, состоящей из: фазы A - 0,1 % ТФУК в воде и фазы B - ACN. Элюирование осуществляют путем постепенного увеличения фазы B (от 3 % до 33 %) в течение 45 минут. Собирают фракции, имеющие чистоту более 97 %. Объединенные фракции элюируют в той же системе ВЭЖХ, используя градиент, состоящий из: фазы A: 0,2 % уксусной кислоты; и фазы B: ACN. Элюирование осуществляют путем постепенного увеличения фазы B (от 10 % до 40 %) в течение 30 минут. Фракции, имеющие чистоту более 97%, собирают, объединяют и лиофилизируют (выход 29 г). Конечный продукт имеет молекулярную массу (МС) 530,5; и чистоту 97,3 % (ВЭЖХ).

В объем изобретения также входят соли и производные пептидов, используемых в композициях и способах согласно настоящему изобретению.

Используемый здесь термин «соли» относится как к солям карбоксильных групп, так и к образованным присоединением кислоты солям амино- или гуанидиногрупп молекулы пептида. Соли карбоксильных групп могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., и соли с органическими основаниями, такие как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, пиперидин, новокаин и тому подобное. Образованные присоединением кислоты соли включают, например, соли с минеральными кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Соли описывают также ионные компоненты, добавленные к раствору пептида для усиления образования гидрогеля и/или минерализации минералов кальция.

Используемый здесь термин «производные» пептидов согласно настоящему изобретению охватывает производные, которые могут быть получены из функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на остатках или N- или C-концевых группах, способами, известными в данной области техники, и которые включены в изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. не нарушают активность пептида, не придают токсических свойств композициям, содержащим его, и не оказывают отрицательного воздействия на его иммуногенные свойства.

Эти производные могут включать, например, алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные реакцией с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованных реакцией с ацильными фрагментами (например, алканоильные или ароильные группы) или O-ацильные производные свободной гидроксильной группы (например, серильных или треонильных остатков), образованные реакцией с ацильными фрагментами.

В одном варианте реализации настоящего изобретения пептид представляет собой натриевую сольпептида, представленного в SEQ ID NO: 1 (pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH^.nNa, где n равно 1 или 2; далее именуемую «натриевая соль ZEP3» или ZEP3Na).

Натриевая соль ZEP3 может быть получена, например, с помощью следующей процедуры:

ZEP3 (3,1 г) солюбилизируют в растворе NaHCO₃ (100 мМ) в воде (50 г/л). Раствор вводят в ионообменную колонку для ВЭЖХ (2,5 x 22 см Luna C18, 100A, 15 микрон) и элюируют градиентом, состоящим из: подвижной фазы A: 2 мМ NaHCO₃ в H₂O; подвижной фазы B: 2 мМ NaHCO₃ в CH₃CN/H₂O (8/2); и подвижной фазы C: NaHCO₃ 100 мМ в воде. Загрузка за цикл: максимум 5 % (масс./масс. % ПЕПТИД/ НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА). Расход: 4,8 см/мин (24 мл/мин). Процедура градиента следующая: 20 мин фаза C; 5 мин фаза А; 18 мин. фаза B; и 7 мин. фаза С. Фракцию, содержащую продукт, собирают и концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетонитрила (110 г/л), затем сушат вымораживанием [выход 2,2 г (71 %)]. Конечный продукт имеет чистоту 99,7 % (ВЭЖХ), содержание натрия 3,1 % и растворимость 50 мг/мл воды.

В одном варианте реализации настоящего изобретения пептид представляет собой натриевую соль пептида, указанного в SEQ ID NO: 2 (pGlu-Asn-Trp-Thr-OH.nNa, где n равно 1 или 2; в дальнейшем именуемую «натриевая соль ZEP4» или ZEP4Na). Натриевая соль ZEP4 может быть получена, например, с помощью следующей процедуры:

ZEP4 (5 г) солюбилизируют в NaHCO₃ (100 мМ) в воде (50 г/л). Раствор вводят в ионообменную колонку для ВЭЖХ (2,5 x 22 см Luna C18, 100A, 15 микрон) и элюируют градиентом, состоящим из: подвижной фазы A: 2 мМ NaHCO₃ в H2O; подвижной фазы B: 2 мМ NaHCO₃ в CH₃CN/H₂O (8/2); и подвижной фазы C: NaHCO₃ 100 мМ в воде. Загрузка за цикл: максимум 5 % (масс./масс. % ПЕПТИД/ НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА). Расход: 4,8 см/мин (24 мл/мин). Процедура градиента следующая: 20-минут фаза C, затем 5-минут фаза A, затем 20-минут фаза B и 10-минут фаза C. Фракцию, содержащую продукт, собирают и концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетонитрила (110 г/л), затем сушат вымораживанием [выход 4 г (80 %)]. Конечный продукт имеет чистоту 97,5 % (ВЭЖХ), содержание натрия 2,5 % и растворимость 50 мг/мл воды.

Пептиды согласно настоящему изобретению могут использоваться в терапии сами по себе или как часть (активный ингредиент) фармацевтической композиции.

Используемый здесь термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату одного или нескольких активных ингредиентов, описанных в настоящем документе, с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и наполнители. Назначение фармацевтической композиции - облегчить введение соединения в организм.

Здесь и далее фразы «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые могут использоваться взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения организма и не отменяет биологическую активность и свойства вводимого соединения. Указанные выражения включают адъювант.

Здесь термин «наполнитель» относится к инертному веществу, добавляемому в фармацевтическую композицию для дальнейшего облегчения введения активного ингредиента. Примеры наполнителей, без ограничения, включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, полисахариды, циклодекстрины, суспендирующие агенты, такие как поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, ионные или неионные поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, эмульгаторы, такие как лецитин, усилители проникновения, поликарбоновые кислоты, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, воски, минеральные масла, пропиленгликоль и полиэтиленгликоли.

Методы составления и введения лекарственных средств можно найти в последнем издании «Remington's Pharmaceutical Sciences», Mack Publishing Co., Easton, PA, включенном в настоящее описание посредством ссылки.

Подходящие пути введения могут, например, включать: офтальмологические, местные, пероральные, ректальные, чрескожные, трансназальные, кишечные или парентеральные пути доставки, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутриперитонеальные, интраназальные или внутриглазные инъекции.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники, например, посредством традиционных способов смешивания, растворения, суспендирования, солюбилизации, гранулирования, изготовления драже, отмучивания, эмульгирования, инкапсулирования, улавливания, распылительной сушки или лиофилизации.

Таким образом, фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных ингредиентов в препараты, которые можно использовать в фармацевтике. Правильный состав зависит от выбранного пути введения.

Описанная здесь фармацевтическая композиция может быть приготовлена для офтальмологического введения. Используемая здесь фраза «офтальмологическое введение» относится к введению пептида или фармацевтической композиции согласно изобретению в наружный глаз (например, конъюнктивальный мешок) или интравитреально. Лекарственные формы, подходящие для офтальмологического введения, могут представлять собой, помимо прочего, глазные капли, глазную мазь, спрей для глаз, глазную суспензию, глазную эмульсию, глазной раствор, глазной гель или интравитреальную инъекцию.

Описанная здесь фармацевтическая композиция может быть приготовлена для местного применения. Лекарственные формы, подходящие для местного применения, могут представлять собой, без ограничения, жидкие капли, жидкую промывку, гель, мазь, эмульсию, суспензию, лосьон, спрей, распыляемую жидкость, суппозиторий, крем, порошок, пену, кристаллы и липосомы.

Для инъекции активные ингредиенты фармацевтической композиции могут быть приготовлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Одним из путей введения, который подходит для фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, является субпериостальная инъекция, как описано в патенте США № 6525030 на имя Erikkson. Для чрескожного введения в композиции используют пенетранты, подходящие для проницаемого барьера. Такие пенетранты обычно известны в данной области техники.

Для перорального введения фармацевтическая композиция может быть легко приготовлена путем объединения активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области техники. Такие носители позволяют составлять фармацевтическую композицию в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий, эмульсий и т.п. для перорального приема пациентом. Фармакологические препараты для перорального применения могут быть приготовлены с использованием твердого наполнителя, необязательно, с измельчением полученной смеси и обработкой смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных средств, если желательно, для получения таблеток или ядер драже. Подходящими наполнителями являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбометилцеллюлоза натрия; и/или физиологически приемлемые полимеры, такие как поливинилпирролидон (ПВП). Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Используемый здесь термин «пероральное введение» включает введение фармацевтического соединения на любую поверхность полости рта, включая язык, десны, нёбо, подъязычную или другую щечную поверхность.

Ядра драже имеют подходящие покрытия. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахаров, которые могут, необязательно, содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль, диоксид титана, растворы лаков и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К покрытиям таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или для характеристики различных комбинаций доз активного соединения.

Фармацевтические композиции, которые можно применять перорально, включают в себя твердые капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметичные капсулы из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные ингредиенты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все составы для перорального введения должны быть в дозах, подходящих для выбранного пути введения.

Для буккального введения композиции могут иметь форму таблеток или леденцов, приготовленных обычным способом.

Для введения путем назальной ингаляции активные ингредиенты для использования в соответствии с настоящим изобретением удобно доставлять в форме аэрозольного спрея из герметичной упаковки или небулайзера с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлорфторметана, тетрафторэтана или диоксида углерода. В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определить путем обеспечения клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в дозаторе, могут быть составлены с содержанием смеси порошка соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Описанная здесь фармацевтическая композиция может быть составлена для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекций могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы, например, в ампулах или в контейнерах для нескольких доз с необязательно добавленным консервантом. Композиции могут представлять собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и могут содержать агенты для составления рецептур, такие как солюбилизирующие, суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активного препарата в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных ингредиентов могут быть приготовлены в виде соответствующих суспензий для инъекций на масляной или водной основе. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или сложные эфиры синтетических жирных кислот, такие как этилолеат, эмульсии триглицеридов или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость активных ингредиентов, что позволяет приготовить высококонцентрированные растворы.

Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для смешивания с подходящим носителем, например, со стерильным апирогенным раствором на водной основе, перед применением.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению также может быть приготовлена в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживаемые клизмы, с использованием, например, обычных основ для суппозиториев, таких как масло какао или другие глицериды.

Фармацевтические композиции, подходящие для использования в контексте настоящего изобретения, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов, эффективное для предотвращения, облегчения или ослабления симптомов заболевания или расстройства у субъекта, которого лечат.

Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалистов в данной области техники, особенно в свете подробного описания, представленного в данном документе.

Для любого препарата, используемого в способах согласно настоящему изобретению, терапевтически эффективное количество или доза может быть первоначально оценена с помощью анализов in vitro и клеточных культур. Например, доза может быть сформулирована в модели на животных для достижения желаемой концентрации или титра. Такую информацию можно использовать для более точного определения полезных доз для человека.

Токсичность и терапевтическую эффективность активных ингредиентов, описанных в данном документе, можно определить стандартными фармацевтическими процедурами in vitro, на культурах клеток или экспериментальных животных. Данные, полученные в результате этих анализов in vitro и клеточных культурах, а также исследований на животных, можно использовать для определения диапазона доз для применения на людях. Дозировка может варьироваться в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны индивидуальным врачом с учетом состояния пациента. (См., например, Fingl, et al., 1975, в «The Pharmacological Basis of Therapeutics» (Фармакологические основы терапии), Ch. 1 p.1).

Количество и интервал дозирования можно индивидуально отрегулировать до уровней активного ингредиента, которые достаточны для достижения минимальной эффективной концентрации (МЭК). МЭК будет различаться для каждого препарата, но его можно оценить на основе данных in vitro. Дозировки, необходимые для достижения МЭК, будут зависеть от индивидуальных характеристик и пути введения. Анализы обнаружения можно использовать для определения концентраций в плазме или ткани.

В зависимости от тяжести и восприимчивости состояния, которое необходимо лечить, дозирование может быть однократным или множественным, с курсом лечения, продолжающимся от нескольких дней до нескольких недель, или до достижения уменьшения болезненного состояния.

Количество вводимой композиции, конечно же, будет зависеть от субъекта, которого лечат, тяжести заболевания, способа введения, заключения лечащего врача и т.д.

Таким образом, композиции и/или изделия согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения могут, при желании, быть представлены в упаковке или дозирующем устройстве, таком как одобренный FDA набор, который может содержать одну или несколько стандартных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. К упаковке или дозирующему устройству могут прилагаться инструкции по применению. На упаковке или дозаторе также может быть размещено уведомление, связанное с контейнером, в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов, причем это уведомление отражает одобрение агентством формы композиций или для введения человеку или животному. Такое уведомление, например, может относиться к маркировке, одобренной Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для рецептурных лекарств, или к утвержденному вкладышу продукта. Композиции, содержащие препарат согласно настоящему изобретению, составленный в совместимом фармацевтическом носителе, также могут быть приготовлены, помещены в соответствующий контейнер (например, лиофилизированный флакон) и помечены для лечения указанного состояния, как дополнительно подробно описано выше.

Пептид или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно использовать для ингибирования высвобождения или активности воспалительных цитокинов и медиаторов и для лечения воспалительного заболевания или нарушения путем обеспечения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пептида или фармацевтической композиции.

Используемая здесь фраза «субъект, нуждающийся в этом» относится к млекопитающему мужского или женского пола (например, человеку), у которого диагностировано воспалительное заболевание или нарушение. В конкретном варианте реализации этот термин охватывает людей, которые подвержены риску развития воспалительного заболевания или нарушения. Субъект может быть любого пола или любого возраста, включая новорожденных, младенцев, подростков, подростков, взрослых и пожилых людей.

Используемый здесь термин «примерно» относится к ± 10 %.

Термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий», «имеющий» и их конъюгаты означают «включая, но не ограничиваясь указанным».

Термин «состоящий из» означает «включая и ограничиваясь указанным».

Термин «состоящий по существу из» означает, что композиция, способ или структура могут включать дополнительные ингредиенты, этапы и/или части, но только если дополнительные ингредиенты, этапы и/или части не изменяют существенно основные и новые характеристики заявленного состава, способа или структуры.

Используемые здесь формы единственного числа включают указания на множественное число, если контекст явно не диктует иное. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере одно соединение» может включать множество соединений, включая их смеси.

В данной заявке различные варианты реализации настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона приведено просто для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.

Всякий раз, когда здесь указан числовой диапазон, подразумевается, что он включает любое указанное число (дробное или целое) в пределах указанного диапазона. Фразы «диапазон/диапазоны между» первым указанным числом и вторым указанным числом и «диапазон/диапазоны от» первого указанного числа «до» второго указанного числа используются здесь взаимозаменяемо и предназначены для включения первого и второго указанных чисел и всех дробных и целых чисел между ними.

Используемый здесь термин «способ» относится к способам, средствам, методикам и процедурам для выполнения данной задачи, включая, но не ограничиваясь ими, те способы, средства, методики и процедуры, которые либо известны, либо легко могут быть разработаны исходя из известных способов, средств, методик и процедур практикующими химиками, фармакологами, биологическими, биохимическими и медицинскими специалистами.

Понятно, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов реализации, также могут быть предоставлены в комбинации в одном варианте реализации. И наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта реализации, также могут быть предоставлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации или как подходящие в любом другом описанном варианте реализации настоящего изобретения. Определенные признаки, описанные в контексте различных вариантов реализации, не следует рассматривать как существенные особенности этих вариантов реализации, если только вариант реализации не работает без этих элементов.

Различные варианты реализации и аспекты настоящего изобретения, описанные выше и заявленные в приведенном ниже разделе формулы изобретения, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

Ниже приведены ссылки на следующие примеры, которые вместе с приведенными выше описаниями иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.

ПРИМЕР 1 - Влияние ZEP4 на экспрессию ФНО-альфа индуцированными воспалением клетками макрофагов

Материалы и методы

Пептид pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (далее именуемый «ZEP4», SEQ ID NO: 2) синтезировали, как описано выше.

Экспрессия ФНО альфа клетками макрофагов B6

Макрофаги, происходящие от мышей C57BL/6, культивировали при плотности 200000 клеток/мл в 24-луночном планшете (лунки 500 мкл) и инкубировали при 37°C и 5 % CO₂ в течение ночи. После инкубации культуральные среды в некоторых экспериментальных группах заменяли свежими средами, содержащими 100 нг/мл ЛПС, с последующей трехчасовой инкубацией. Затем среды (содержащие ЛПС или не содержащие ЛПС) в определенных экспериментальных группах заменяли свежими средами, содержащими ZEP4 в концентрациях от 3,125 до 100 мкг/мл, с последующей часовой инкубацией. Затем в соответствующие лунки добавляли пальмитиновую кислоту (ПК, 200 мкМ) и планшеты инкубировали в течение дополнительных 24 часов, затем измеряли количество ФНО альфа в каждой лунке. В таблице 1 перечислены различные группы воздействия и контрольные группы. Снижение продукции ФНО-альфа в группах воздействия рассчитывали относительно клеток, обработанных ЛПС и ПК (CLP200).

Результаты

Рисунок 1 и таблица 1 ниже показывают, что ZEP4 существенно снижает количество ФНО-альфа, продуцируемого индуцированными воспалением макрофагальными клетками,обработанными ЛПС и пальмитиновой кислотой в течение 24 часов. Концентрация ZEP4 3,125 мкг/мл вызвала снижение экспрессии ФНО-альфа на 70,6 %. Наиболее эффективная концентрация ZEP4 составляла 50 мкг/мл, что вызывало снижение экспрессии ФНО-альфа на 77,0 % (p <0,0001).

Таблица 1

Влияние концентрации ZEP4 на экспрессию ФНО-альфа макрофагами, обработанными ЛПС и пальмитиновой кислотой

Воздействие	Маркировка	ZEP4 (мкг/мл)	ЛПС (нг/мл)	пальмитиновая кислота (мкМ)	ФНО альфа (пг/мл)	% снижения ФНО альфа
Отрицательный контроль (клетки)	Контроль	-	-	-	0	-
Контроль ЛПС и пальмитиновая кислота	CLP200	-	100	200	332,39	-
Контроль ЛПС	CL	-	100	-	613,81	-
Контроль пальмитиновая кислота	CP200	-	-	200	0	-
ZEP4-100	CLPZ100	100	100	200	211,68	36,3
ZEP4-50	CLPZ50	50	100	200	76,23	77,0
ZEP4-25	CLPZ25	25	100	200	115,58	65,2
ZEP4-12,5	CLPZ12,5	12,5	100	200	93,12	72,0
ZEP4-6,25	CLPZ6,25	6,25	100	200	89,83	73,0
ZEP4-3,125	CLPZ3,125	3,125	100	200	97,79	70,6
Контроль ZEP4	CZ100	100	-	-	0	-
Контроль по среде изопропанол	Ciso	-	-	-	0	-

ПРИМЕР 2 - Влияние ZEP4 на экспрессию ФНО-альфа индуцированными воспалением клетками макрофагов

Материалы и методы

Пептид ZEP4 (SEQ ID NO: 2) был синтезирован, как описано выше.

Экспрессия ФНО альфа клетками макрофагов B6

Макрофаги, происходящие от мышей C57BL/6, культивировали при плотности 200000 клеток/мл в 24-луночном планшете (лунки 500 мкл) и инкубировали при 37°C и 5 % CO₂ в течение ночи. После инкубации среду заменяли свежей средой, содержащей 100 нг/мл ЛПС, с последующей трехчасовой инкубацией. Затем среду, содержащую ЛПС, в группах воздействия заменяли свежей средой, содержащей ZEP4 в концентрации 50 мкг/мл, с последующей часовой инкубацией. Затем аликвоты пальмитиновой кислоты (100, 200 или 400 мкМ) добавляли в соответствующие лунки. Планшеты инкубировали в течение дополнительных 24 часов и измеряли количество ФНО-альфа в каждой лунке. В таблице 2 перечислены различные группы воздействия и контрольные группы. Снижение продукции ФНО-альфа в группах лечения рассчитывали относительно клеток, обработанных ЛПС и ПК, в соответствии с концентрацией ПК.

Результаты

На рисунке 2 и в таблице 2 ниже показано, что концентрации пальмитиновой кислоты 100, 200 и 400 мкМ индуцировали экспрессию ФНО-альфа макрофагами на уровне 416, 462 и 593 пг/мл соответственно. ZEP4 в концентрации 50 мкг/мл существенно снижал экспрессию ФНО-альфа макрофагами при всех концентрациях пальмитиновой кислоты (**** p <0/0001).

Таблица 2

Влияние ZEP4 (50 мкг/мл) на экспрессию ФНО альфа макрофагами, обработанными ЛПС (100 нг/мл) и пальмитиновой кислотой (100, 200 и 400 мкМ).

Воздействие	ZEP4 (мкг/мл)	ЛПС (нг/мл)	пальмитиновая кислота (мкМ)	ФНО альфа (пг/мл)	% снижения ФНО альфа
Контроль	Отрицательный контроль	-	-	0	-
CL	-	100	-	423,67	-
CLP400	-	100	400	592,82	-
CLP400Z	50	100	400	252,177	57,5 ****
CLP200	-	100	200	462,06	-
CLP200Z	50	100	200	167,52	63,7 ****
CLP100	-	100	100	416,48	-
CLP100Z	50	100	100	133,93	67,8 ****

ПРИМЕР 3 - Влияние ZEP3 на экспрессию ФНО-альфа индуцированными воспалением клетками макрофагов

Материалы и методы

Пептид pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH (в дальнейшем именуемый «ZEP3», SEQ ID NO: 1) синтезировали, как описано в патенте США № 7220725.

Экспрессия ФНО альфа клетками макрофагов B6

Клетки макрофагов, происходящие от мышей C57BL/6, культивировали при плотности 200000 клеток/мл в 24-луночном планшете (лунки 500 мкл) и инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение ночи. После инкубации среды в некоторых экспериментальных группах заменяли свежими средами, содержащими 100 нг/мл ЛПС, с последующей трехчасовой инкубацией. Затем среды (содержащие или не содержащие ЛПС) в определенных экспериментальных группах заменяли свежими средами, содержащими ZEP3 в концентрации от 3,125 до 100 мкг/мл, с последующей инкубацией в течение одного часа. Затем аликвоты пальмитиновой кислоты (200 мкМ) добавляли в соответствующие лунки и планшеты инкубировали в течение дополнительных 24 часов, затем измеряли количество ФНО-альфа в каждой лунке. В таблице 3 перечислены различные группы воздействия и контрольные группы. Снижение продукции ФНО-альфа в группах воздействия рассчитывали относительно клеток, обработанных ЛПС и ПК.

Результаты

Фигура 3 и таблица 3 ниже показывают, что ZEP3 существенно снижает экспрессию ФНО-альфа клетками макрофагов, обработанными ЛПС и пальмитиновой кислотой. Наиболее эффективная концентрация ZEP3 в экспериментальных условиях составляла 3,125 мкг/мл (82,9 % снижение экспрессии ФНО-альфа; p <0,0001). ZEP3 ED₅₀ составляет 51,94 мкг/мл.

Таблица 3

Влияние концентраций ZEP3 на экспрессию ФНО-альфа макрофагами, обработанными ЛПС и пальмитиновой кислотой

Воздействие	Маркировка	ZEP3 (мкг/мл)	ЛПС (нг/мл)	пальмитиновая кислота (мкМ)	ФНО альфа (пг/мл)	% снижения ФНО альфа
Контроль клеток	Контроль	-	-	-	11,022	-
Контроль ЛПС и пальмитиновая кислота	Контроль + ЛПС + ПК	-	100	200	245,11	-
Контроль ЛПС	Контроль + ЛПС	-	100	-	592,80	-
Контроль пальмитиновая кислота	Контроль + ПК	-	-	200	11,21	-
ZEP3-100	CLPZ100	100	100	200	176,22	28,1
ZEP3-50	CLPZ50	50	100	200	106,75	56,4
ZEP3-25	CLPZ25	25	100	200	61,57	74,9
ZEP3-12,5	CLPZ12,5	12,5	100	200	74,83	69,5
ZEP3-6,25	CLPZ6,25	6,25	100	200	75,52	69,2
ZEP3-3,125	CLPZ3,125	3,125	100	200	41,98	82,9
ZEP3 контроль	C + Z100	100	-	-	10,44
Контроль по среде (изопропанол)	C + Iso	-	-	-	10,46

ПРИМЕР 4 - Влияние ZEP4 на экспрессию ИЛ-1бета клетками макрофагов, активированных нигерицином

Материалы и методы

Экспрессия ИЛ-1бета макрофагами, активированными нигерицином.

Клетки макрофагов, происходящие от мышей C57BL/6, культивировали при плотности 200000 клеток/мл в 24-луночном планшете (лунки 500 мкл) и инкубировали при 37°C и 5% CO₂ в течение ночи. После инкубации в течение ночи среду заменяли свежей средой, содержащей 100 нг/мл ЛПС. Три часа спустя среду, содержащую ЛПС, заменяли в лунках для воздействия свежей средой, содержащей 50 мкг/мл ZEP4. После 1-часовой инкубации аликвоты нигерицина (20 мМ) добавляли в лунки, обработанные ZEP4, и контрольные лунки ЛПС. Планшеты инкубировали в течение дополнительных 24 часов и измеряли количество ИЛ-1бета в каждой лунке. В таблице 4 перечислены различные контрольные группы и группы воздействия. Снижение продукции ФНО-альфа в группе воздействия рассчитывали относительно клеток, обработанных ЛПС и нигерицином (ЛПС + Н).

Результаты

На рисунке 4 и в таблице 4 ниже показано, что ZEP4 в концентрации 50 мкг/мл снижает высвобождение ИЛ-1бета макрофагами, активированными нигерицином, на 53,8 % (**** p <0,0001).

Таблица 4

Влияние ZEP4 на высвобождение ИЛ-1бета макрофагами, активированными нигерицином

Воздействие	Маркировка	ZEP4 (мкг/мл)	ЛПС (нг/мл)	Нигерицин (мМ)	ИЛ-1бета (мкг/мл)	% снижения ИЛ-1бета
Контроль	Контроль	-	-	-	-	-
Контроль ЛПС и нигерицин	LPS + N	-	100	20	340,2	-
ZEP4	LPS + N + Z	50	100	20	157,1	53,8 ****

ПРИМЕР 5 -Влияние ZEP3 на жизнеспособность клеток макрофагов, индуцированных воспалением

Материалы и методы

Пептид ZEP3 (SEQ ID NO: 1) был синтезирован, как описано в патенте США № 7220725.

Влияние ZEP3 на жизнеспособность макрофагов, активированных ЛПС и пальмитиновой кислотой

Макрофаги, происходящие от мышей C57BL/6, культивировали при плотности 200000 клеток/мл в 24-луночном планшете (лунка 500 мкл) и инкубировали при 37°C и 5 % CO₂ в течение ночи. После инкубации в течение ночи среду заменяли свежей средой, содержащей 100 нг/мл ЛПС, с последующей трехчасовой инкубацией. Затем среду, содержащую ЛПС, в группах воздействия заменяли свежей средой, содержащей ZEP3 в концентрации 50 мкг/мл, с последующей часовой инкубацией. Затем в соответствующие лунки добавляли пальмитиновую кислоту (100, 200 или 400 мкМ). Планшеты инкубировали в течение дополнительных 24 часов, и жизнеспособность клеток оценивали с использованием набора для анализа цитотоксичности с ЛДГ. В таблице 5 перечислены различные группы воздействия и контрольные группы.

Результаты

Рисунок 5 и таблица 5 ниже показывают, что ZEP3 не оказывал значительного влияния на жизнеспособность индуцированных воспалением клеток макрофагов в экспериментальных условиях.

Таблица 5

Влияние ZEP3 на жизнеспособность клеток макрофагов B6, активированных ЛПС и пальмитиновой кислотой

Воздействие	ZEP3 (мкг/мл)	ЛПС (нг/мл)	пальмитиновая кислота (мкМ)	ОП	Статистическая значимость
CLP400	-	100	400	1,661	-
CZ400	50	100	400	1,6095	н.з.
CLP200	-	100	200	1,601	-
CZ200	50	100	200	1,496	н.з.
CLP100	-	100	100	1,3895	-
CZ100	50	100	100	1,437	н.з.

ПРИМЕР 6 - Влияние предварительной обработки ZEP3 на экспрессию ФНО-альфа индуцированными воспалением клетками макрофагов

Материалы и методы

Экспрессия ФНО альфа клетками макрофагов B6

Макрофаги, происходящие от мышей C57BL/6, культивировали при плотности 200000 клеток/мл в 24-луночном планшете (лунки 500 мкл) и помещали при 37°C, 5 % CO₂ в инкубатор на ночь. После инкубации в течение ночи среду заменяли свежей средой, содержащей 50 мкг/мл ZEP3. После 1-часовой инкубации в соответствующие лунки добавляли 100 нг/мл ЛПС, планшеты инкубировали в течение дополнительных 24 часов, затем измеряли количество ФНО-альфа в каждой лунке.

Результаты

В таблице 6 ниже показано, что предварительная обработка клеток макрофагов ZEP3 перед индукцией ЛПС приводила к 46,7 % снижению ФНО-альфа, продуцируемого клетками (** p <0,05).

Таблица 6

Влияние предварительной обработки ZEP3 на экспрессию ФНО-альфа макрофагами, обработанными ЛПС

Воздействие	ZEP3 (мкг/мл)	ЛПС (нг/мл)	ФНО альфа (пг/мл)	% снижения ФНО альфа
Контроль	-	-	0
Контроль ЛПС	-	100	189,884
ZEP3	50	100	101,15088	46,7 **

ПРИМЕР 7 - Противовоспалительное действие ZEP3 на модели болезни сухого глаза на культуре клеток эпителия роговицы

Противовоспалительный эффект пептидов при экспериментальном воспалении роговицы был протестирован на модели клеточной культуры с использованием различных индукторов инфламмасом, таких как ЛПС, 4-HNE, нигерицин и другие, для моделирования болезни сухого глаза (БСГ). Используя модель «доза-отклик», первичные эпителиальные клетки роговицы человека предварительно обрабатывали пептидами с последующим воздействием индукторов ССГ. Измеряли экспрессию ИЛ-6, а также жизнеспособность клеток и продукцию АФК.

Материалы и методы

Первичные эпителиальные клетки роговицы человека (PCS-700-010; ЭКРЧ) обрабатывали ZEP3 в концентрациях от 3 до 12 мкг/мл в течение 2 часов, затем подвергали воздействию ЛПС, 4-HNE или нигерицина в течение 24 часов. После инкубации измеряли уровни провоспалительного цитокина ИЛ-6, жизнеспособность клеток и продукцию активных форм кислорода (АФК) в культурах клеток.

Результаты

Как показано на Рисунке 7, уровень ИЛ-6 в клеточной культуре снизился с 52,45 ± 0,9121 пг/мл в необработанной культуре клеток до 38,08 ± 1,368 пг/мл в клетках, обработанных ZEP3 (снижение на 27,4 %; P <0,05).

Как показано на фиг. 8, уровень АФК в культуре клеток (выраженный в относительных единицах флуоресценции; ОЕФ) снизился с 27043 ± 952 ОЕФ в необработанной культуре клеток до 13000 ± 800 ОЕФ в культуре клеток, обработанных ZEP3 (снижение на 51,9 %; P <0,0001).

Как показано на Фигуре 6, плотность гибели клеток снизилась с 21,125 ± 0,942 % в необработанной культуре клеток до 3,625 ± 1,092 % в культуре, обработанной ZEP3 (снижение 82,8 %; P <0,0001).

Сделан вывод о том, что пептид ZEP3 эффективен в уменьшении воспаления роговицы, восстановлении жизнеспособности ЭКРЧ и снижении продукции АФК, факторов, которые имеют значение для тяжести БСГ. Результаты обеспечивают основу для использования этого и подобных пептидов для профилактики и лечения БСГ, вызванной различными патологиями.

Примеры 1-7, приведенные выше, показывают, что пептиды ZEP3 (SEQ ID NO: 1) и ZEP4 (SEQ ID NO: 2) снижают экспрессию воспалительных цитокинов ФНО-альфа, ИЛ-1-бета и ИЛ-6 в макрофагах, индуцированных воспалением, и эпителиальных клетках роговицы. Кроме того, пептиды были способны восстанавливать жизнеспособность клеток, подвергшихся воспалительному стрессу. Результаты показывают, что пептиды согласно настоящему изобретению способны эффективно ингибировать или предотвращать воспаление в макрофагах и эпителиальных клетках роговицы.

ПРИМЕР 8 - Эффект ZEP3, натриевой соли ZEP3 и ZEP4 на индуцированный эндотоксином увеит (ИЭУ) у крыс

Модель выполнена в соответствии с De Vos et al., Exp Eye Res 61: 667-675, 1995. ИЭУ индуцировали у самцов крыс Lewis массой от 180 до 200 г путем инъекции в подушечки лап 200 μг ЛПС, разведенного в 0,1 мл стерильной воды. Затем животных случайным образом распределяли в (4 пептида) x (три концентрации) = двенадцать групп. Необработанную индуцированную группу использовали в качестве контроля индукции.

Через 24 часа, что соответствует пику тяжести ИЭУ, животных исследовали с помощью биомикроскопа с щелевой лампой. Клиническое воспаление глаза оценивали в каждом глазу по шкале от 0 до 7 следующим образом: гиперемия радужки и клетки в передней камере 0-2, (0 = нет признаков; 1 = легкие; 2 = тяжелые) и воспаление, миоз и гипопион получали 0 баллов за отсутствие признака или 1 за присутствие. Максимально возможный балл - 7 (сумма баллов по 5 параметрам).

ПРИМЕР 9 - Влияние ZEP3, натриевой соли ZEP3 и ZEP4 в модели на мышах сухого глаза в камере с контролируемой средой (ККС)

Модельная процедура описана в Barabino et al. (IOVS 46: 2766 - 2771, 2005). Вкратце, мышей BALB/c в возрасте 8-12 недель использовали вкамере с контролируемой средой (ККС), в которой регулировали и контролировали относительную влажность (RH), температуру (T) и воздушный поток (AF). Мышей случайным образом распределяли на группы и воздействовали ZEP3, натриевой солью ZEP и ZEP4 (тестируемые пептиды). Необработанную индуцированную группу использовали в качестве контроля. Затем мышей помещали в ККС и подвергали воздействию определенных контролируемых условий окружающей среды (RH = 18,5 % ± 5,1 %, AF = 15 л/мин, T = 21-23°C) в течение 3, 7, 14 и 28 дней. Контрольных мышей содержали в нормальных условиях (относительная влажность = 50-80 %, без AF, T = 21-23°C) в течение того же времени. Наблюдатель в маске измерял образование водянистой слезы с помощью теста хлопковой нити, окрашивания роговицы флуоресцеином (оценка от 0 до 15), и плотность бокаловидных клеток в верхней и нижней конъюнктиве.

ПРИМЕР 10 - Влияние ZEP3, натриевой соли ZEP3 и ZEP4 в индуцированной скополамином модели сухого глаза у крыс

Использовали самцов крыс Sprague-Dawley массой от 300 г до 350 г. Сухость глаз индуцировали с помощью скополамина (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), который непрерывно и системно вводили животным с помощью осмотического насоса (2ML4 Alzet ^®; CedarLane, Берлингтон, Онтарио), заполненного скополамином и имплантированного подкожно в среднюю дорсальную область между лопатками. Рану закрывали 2-3 зажимами. После операции и снова на следующий день животным подкожно вводили карпрофен (0,5 мг/100 г), нестероидное противовоспалительное средство и сильнодействующий анальгетик длительного действия для грызунов. Животных анестезировали перед имплантацией хирургического насоса и перед всеми конечными испытаниями в камере с изофлураном 99,9 % USP (Abraxis Bioscience, Ричмонд-Хилл, Онтарио). Скополамин вводили в дозе 12,5 мг/день, и данные оценивали на 14-й день.

Стерильный раствор 0,175 г/мл гидробромида скополамина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) готовили в физиологическом растворе (0,9 %) и фильтровали через фильтр на конце шприца 0,22 мкм (Millex-GC, Millipore Corp., Bedford, Масс.). Насосы 2ML4 Alzet.RTM. заполняли 2 мл раствора скополамина 0,175 г/мл в соответствии с инструкциями производителя.

Испытывали следующие группы глаз крыс: Группа 1: контрольные крысы (n = 12 глаз от 6 крыс). Группа 2: у крыс (n = 12 глаз от 6 крыс) индуцировали синдром сухого глаза постоянным системным введением скополамина, и измерение окрашивания флуоресцеином проводили на четырнадцатый день. Группа 3: у крыс (n = 14 глаз от 7 крыс) индуцировали синдром сухого глаза постоянным системным введением скополамина и воздействовали один раз местно на восьмой день физиологическим раствором. Группа 4: у крыс (n = 14 глаз от 7 крыс) индуцировали синдром сухого глаза постоянным системным введением скополамина и воздействовали один раз местно на восьмой день тестируемым пептидом.

Результатами являются: (i) снижение окрашивания роговицы флуоресцеином, измеренное на тринадцатый день, по сравнению с контролем, обработанным физиологическим раствором; (ii) образование водянистой слезы и оборот водянистой слезы, измеренные на тринадцатый день по сравнению с необработанными или обработанными скополамином контролями.

ПРИМЕР 11 - Эффект ZEP3, натриевой соли ZEP3 и ZEP4 на модели сухого кератоконъюнктивита на кроликах

Сухой кератоконъюнктивит (СКК) индуцировали в правых глазах 8 новозеландских белых кроликов путем хирургического закрытия выводного протока слезной железы и удаления мигательной перепонки, никтитальной железы и железы Хардера. Всех кроликов оставляли без лечения в течение 8 недель, и СКК подтверждали путем измерения повышенной осмолярности слезной пленки путем взятия 0,1-0,4 мкл образцов слезы, как описано J. Gilbard, et al. (Ophthalmol. 96: 677, 1978). 3,0 ммоль раствор UTP или аналога готовили в консервированном изотоническом буферном растворе. Кроликов случайным образом распределяли по группам и обрабатывали ZEP3, натриевой солью ZEP и ZEP4 (тестируемые пептиды). Необработанную группу использовали в качестве контроля. После начала лечения у всех кроликов брали образцы слезы 0,1-0,4 мкл для измерения осмолярности перед первой дозой. Через 20 недель животных умерщвляли и измеряли плотность бокаловидных клеток путем окрашивания альциановым синим и реагентом Шиффа-периодной кислотой (D. Dartt, et al., Exp. Eye Res. 67: 27, 1996).

ПРИМЕР 12 - Влияние ZEP3 и его натриевой соли (ZEP3Na) на продукцию цитокинов в модели воспаления in vitro в человеческих МКПК

Эффект пептида ZEP3 (SEQ ID NO: 1) на продукцию цитокинов оценивали на модели воспаления человека in vitro. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) стимулировали с использованием липополисахарида (ЛПС) для продуцирования цитокинов.

Метод: Вкратце, криоконсервированные МКПК человека от четырех здоровых некурящих, не принимавших какие-либо кортикостероиды или другие противовоспалительные препараты доноров, выращивали в RPMI 1640 с 10 % инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (ФБС), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед./мл.μг/мл стрептомицина (полная питательная среда, CGM).

Человеческие МКПК размораживали и высевали на чашки для всех групп (1-6, таблица 7) и оставляли в покое в течение 1 часа перед обработкой. Группы клеток обрабатывали исследуемым пептидом, ZEP3 (SEQ ID NO: 1).в концентрации40, 100 и 150 мкг/мл,или дексаметазоном в течение 1 часа, с последующей стимуляцией ЛПС в течение 24 часов. За четыре часа до сбора супернатанта добавляли Almar Blue. Через 24 часа после добавления ЛПС измеряли флуоресценцию Almar Blue при 585 нм (коррелирующую с жизнеспособностью клеток),и собирали супернатант для определения цитокинов. Каждую группу тестировали в трех повторениях.

Таблица 7

Экспериментальные группы, использованные в исследовании

Группа	Стимуляция (100 пг/мл)	Воздействие	Время воздействия
1	Нет	Нет (контроль по среде)	Нет
2	ЛПС	Нет (контроль стимуляции)	Нет
3	ЛПС	1 мкмДексаметазон	1 час предварительной обработки
4	ЛПС	ZEP3 (40 мкг/мл)	1 час предварительной обработки
5	ЛПС	ZEP3 (100 мкг/мл)	1 час предварительной обработки
6	ЛПС	ZEP3 (150 мкг/мл)	1 час предварительной обработки

Подробный метод: клетки размораживали в соответствии с инструкциями производителя, промывали в CGM и оценивали на жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим. Маточный раствор 2×10^6 клеток/мл готовили в CGM. 100μмкл исходного раствора добавляли в соответствующие лунки 96-луночного планшета с черными стенками (один планшет на донора), высев 2×105 клеток на лунку. Клетки инкубировали при 37°C с 5 % CO₂ в течение одного часа. В соответствующие лунки добавляли 100μмкл 2Х исследуемого образца, дексаметазона или 1X CGM в соответствующие ячейки до конечного объема 200μл/ ячейку. Планшеты инкубировали еще 1 час при 37°C с 5 % CO₂. Через 1 час 20μл ЛПС добавляли в группы 2-9 до конечного объема 220μл. 20μл среды добавляли в группу 1. Клетки инкубировали при 37°C с 5 % CO₂ в течение 20 часов. На 20-часовой отметке во все ячейки добавляли 20μл Alamar Blue . Планшеты инкубировали при 37°C с 5 % CO₂ еще 4 часа. Через 24 часа после стимуляции ЛПС планшеты считывали для оценки жизнеспособности клеток, собирали супернатанты клеточных культур и хранили при -80° C для анализа цитокинов. Оставшиеся клетки промывали 1 раз стерильным ФБР. Клетки инкубировали в растворе трипсина для отделения от планшета, центрифугировали, получая осадок, и раствор трипсина удаляли. Затем клетки хранили при -80° C для необязательного дальнейшего анализа. Анализ Luminex использовали для определения концентраций GM-CSF, ИФН-g, ИЛ-10, ИЛ-12p40, ИЛ-17a, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, RANTES и ФНО-альфа, присутствующих в образцах супернатанта, собранных после анализа Alamar Blue. При проведении анализа цитокинов соблюдали протоколы производителя. Рассчитывали продукцию цитокинов и процент стимуляции образца по сравнению со средним значением контроля стимуляции.

Результаты: Как показано на рисунках 9-12, ZEP3, как было показано, вызывает значительное снижение основных медиаторов воспаления, включая интерферон гамма (ИФНγ, Фигура 9), ИЛ-10 (Фигура 10), ИЛ-1β (Фиг. 11) и RANTES (Фиг. 12), что подтверждает его противовоспалительное действие. В отношении некоторых измеренных цитокинов наблюдали дозозависимый отклик. Никаких значительных изменений в жизнеспособности клеток или каких-либо тенденций у каких-либо доноров не наблюдалось после обработки пептидами во всех испытанных концентрациях, что указывает на то, что пептиды не цитотоксичны для МКПК. Уровни ИЛ-4 и ИЛ-17a были ниже предела обнаружения во всех тестируемых группах.

Снижение выработки цитокинов было напрямую связано с ZEP3, подтверждая противовоспалительный эффект ZEP3 в клетках крови человека.

ПРИМЕР 13 - Модель атопического дерматита in vivo

Эффект местного применения ZEP3 (SEQ ID NO: 1) и его натриевой соли (ZEP3Na) и ZEP4 (SEQ ID NO: 2) оценивали на мышах с индуцированных оксазолоном атопическим дерматитом (АД). Эта модель широко используется и хорошо описана в литературе (Avci et al., 2013 Expert Opin Drug Discov. 8, 331-355; Petersen T. K. 2006, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 99, 104-115) в качестве принятой модели на животных для оценки лекарств для терапии АД у людей.

Метод. Сенсибилизацию животных проводили путем местного нанесения 2 % оксазолона в этаноле на спину в день 0 после бритья и депиляции животных (фаза сенсибилизации). Затем через неделю выполняли контрольную пробу путем местного нанесения 1 % оксазолона в этаноле на спину и правое ухо каждые 2 дня в 10 приемов, а именно в течение всего 3 недель. Тестируемые соединения применяли во время фазы контрольного воздействия каждые 2 дня местным путем как готовые к использованию составы кремов. Поверхность нанесения такая же, как и для контрольного воздействия (спина + ухо). На спину наносили 100 мкл и осторожно массировали спину. Затем оставшийся состав на перчатке для пальца наносили на внутреннюю поверхность уха. Через день измеряли толщину кожи спины и ушей штангенциркулем; и регистрировали для кожи спины следующие клинические оценки: эритема и шелушение. Животных также взвешивали через день (примерный вес мыши в начале испытания составляет около 20 г). Калиброванные цифровые снимки кожных зон спины были сделаны на 8, 18 и 28 дни. На 28 день эксперимент был прекращен, у животных брали пробы крови и отделяли образцы плазмы. У умерщвленных животных образцы кожи правого уха и спины собирали и замораживали при -80° C (образцы кожи спины и плазмы) или хранили в формалине (образцы кожи спины и правого уха) для дальнейшего анализа. В таблице 8 описаны группы воздействия.

Таблица 8

Экспериментальные группы, протестированные в модели АД

Группа	Кол-во животных	Соединение	Конц. (мг/г) *	Доза (мг/кг)
1/Контрольная группа	8	Наполнитель	0	0
2/Референтная группа	8	Бетаметазон (Дипрозон® 0,05 %)	0,5	2,5
3/Тестовая группа 1	8	ZEP3 1 %	10	50
4/Тестовая группа 2	8	ZEP3Na 1 %	10	50
5/Тестовая группа 3	8	ZEP4 1 %	10	50

* В объеме 100μл на каждое животное.

Составы, используемые для местного приенения тестируемого соединения, представляли собой:

ZEP3 1 % крем, имеющий рН 7,1 и включающий: пропиленгликоль, полисорбат 80, динатрия эдетат, диоксид кремния (Syloid), метилпарабен, белый вазелин, изопропилмиристат, цетиловый спирт и моностеарат глицерина.

ZEP3Na 1 % крем, имеющий pH 8,0 и содержащий: пропиленгликоль, полисорбат 80, динатрия эдетат, диоксид кремния (Syloid), метилпарабен, белый вазелин, изопропилмиристат, цетиловый спирт и моностеарат глицерина.

ZEP4 1 % крем, имеющий pH 4,5 и содержащий: пропиленгликоль, глицерин, полисорбат 80, динатрия ЭДТА, ксантановую камедь, диоксид кремния (Syloid), метилпарабен, белый вазелин, изопропилмиристат, цетиловый спирт, стеариловый спирт и глицерилмоностеарат (kolliwax).

Результаты. Тестируемые соединения ZEP3, ZEP3Na и ZEP4, вводимые в дозе 50 мг/кг мышам с индуцированным атопическим дерматитом, хорошо переносились. Все пептиды значительно уменьшали клинические поражения атопического дерматита, толщину кожи спины (Фигуры 13A и 13B), толщину ушей (Фигуры 14A и 14B) и эритему (Фигуры 15A и 15B). Оценки уменьшились с 18 до 24 дней у мышей, получавших ZEP3 (фигура 16A), и с 14 до 24 дней у мышей, получавших ZEP3Na (фигура 16A) или ZEP4 (фигура 16B), что указывает на отсроченный эффект. Масса тела мышей, получавших ZEP3, ZEP3Na или ZEP4, была нормальной по сравнению с наполнителем (Фигуры 17A и 17B).

Подробнее, масса тела для ZEP3, ZEP3Na и ZEP4 была достаточно стабильной в течение первых дней исследования и показала увеличение примерно на 3-4 % на 28 день (рисунки 17A и 17B). В группе, получавшей бетаметазон, наблюдалась потеря веса примерно на 8-10 %, как и предполагалось.

Толщина кожи спины увеличивалась в течение первых дней исследования, за исключением мышей, получавших бетаметазон, а затем оставалась довольно стабильной до конца исследования (Фигуры 13A и 13B). На 28 день было отмечено увеличение примерно на 110 % для группы отрицательного контроля, получавшей наполнитель, 90 % для группы 3, получавшей 1 % ZEP3, 105 % для группы 4, получавшей 1 % ZEP3Na и около 90 % для группы 5, получавшей ZEP4 1 %, тогда как снижение на 40 % было отмечено для группы 2 положительного контроля, которым вводили бетаметазон. Все обработанные группы (группы 3, 4 и 5) графически показали тенденцию к тому, что толщина кожи спины ниже, чем у группы 1 отрицательного контроля. Значительная разница в толщине спины по сравнению с контрольной группой 1 была отмечена для ZEP3 на 20-й (-25,5 %) и 24-й дни (-16,6 %). Для ZEP4 значительная разница в толщине спины по сравнению с контрольной группой 1 была отмечена на 14 день (-13,5 %).

Толщина правого уха: как обычно наблюдается с этой моделью, все группы показали значительное утолщение с первых дней до конца исследования, за исключением группы положительного контроля 2, которая показала лишь небольшое увеличение примерно на 15-20 % в течение всего курса исследования (Фигуры 14A и 14B). Значительная разница была отмечена на 20, 22 и 28 дни для ZEP3 (от -10,1 до -18,0 % по сравнению с контролем), на 18, 20 и 22 дни для ZEP3Na (от -18,4 до -22,7 % по сравнению с контролем) и на 20, 22, 28 дни для ZEP4 (от -12,3 до -16,0 % по сравнению с контролем).

Оценка эритемы была максимальной на 16 день для группы отрицательного контроля (группа 1), а затем немного снизилась до 0 на 26-28 дни. Показатели эритемы, записанные для опытных групп 3, 4 и 5, были аналогичны группе отрицательного контроля 1 (Фигуры 15A и 15B). Значительная разница была показана на 22 и 24 дни для ZEP3, на 24 день для ZEP3Na и на 12, 16, 22 и 24 дни для ZEP4.

Оценка по шкале прогрессивно увеличивалась в течение первых дней, затем немного снижалась и оставалась довольно стабильной во второй части исследования (Рисунки 16A и 16B). Все обработанные группы 3, 4 и 5 показали более низкий балл по шкале, чем группа отрицательного контроля 1, с 14 по 28 день.

Общий балл (сумма баллов эритемы и шкалы) также был ниже для обработанных групп 3, 4 и 5, чем у группы отрицательного контроля 1 с 14 по 28 день. Значительная разница в общем количестве баллов была показана на 20, 24 и 28 дни для ZEP3, на 14, 18, 20 и 22 дни для ZEP3Na и на 12-20, 24 и 28 дни для ZEP4.

Заключение: Соединения ZEP3 и ZEP4 и их натриевые соли, вводимые мышам с индуцированным атопическим дерматитом, в дозе 50 мг/кг, хорошо переносились и значительно уменьшали клинические поражения при атопическом дерматите, о чем свидетельствует уменьшение толщины кожи спины, толщины ушей, эритемы и шелушения.

ПРИМЕР 14. Лечение запястно-пястного остеоартрита (артрита CMC) с помощью ZEP3

Пациенту-мужчине в возрасте 75 лет хирург-ортопед диагностировал артрит большого пальца стопы типа CMC. Палец на ноге был опухшим, красным и настолько болезненным, что пациент не мог ходить.

Натриевую соль ZEP3 в виде крема 0,5 % наносили на опухшие участки 5 раз в день. Субъект сообщил об облегчении в течение одного дня после лечения и исчезновении состояния в течение 3-4 дней.

ПРИМЕР 15. Влияние пептидов ZEP3 и ZEP3Na на секрецию ФНО-альфа в кератиноцитах человека

ФНО-альфа является основным провоспалительным медиатором в кератиноцитах. Соединения были протестированы на противовоспалительное действие путем измерения их влияния на уровни ФНО-альфа.

Методы: клетки SCCE020 (Эпидермальные кератиноциты человека EpiGRO™) выращивали в полной ростовой среде (полная среда для кератиноцитов человека EpiGRO™; Millipore Cat. # SCMK001) в течение 4 пересевов. При 5 пересеве клетки высевали (3 × 10⁵ клеток/лунку) в трех повторениях в объеме 1 мл полной ростовой среды на лунку. Дополнительные 3 контрольные лунки содержали только среду без клеток. После прикрепления клеточную среду заменяли базовой средой, содержащей L-глутамин без добавок (среда голодания), и клетки голодали в течение ночи. На следующий день, через 24 часа после посева, клетки обрабатывали ZEP3 или ZEP3Na или подходящим разбавителем (ФБР или ДМСО). После 4 часов инкубации добавляли в лунки ЛПС (из E. Coli 055: B5; Sigma Cat. # L6529-1MG) в конечной концентрации 20 или 30 мкг/мл. Экспериментальные группы (по три лунки для каждого воздействия) приведены в таблице 9.

Клетки инкубировали в течение 24 часов в инкубаторе для тканевых культур. После сбора супернатантов из всех лунок, клетки из групп воздействия: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 13, 14 (без ДМСО групп), осаждали и хранили при -80°С для дальнейших анализов. Клетки собирали следующим образом: после сбора супернатантов лунки промывали трипсином, затем инкубировали с трипсином до тех пор, пока они не отделялись от поверхности планшета, центрифугировали, промывали ФБР и хранили в виде осадка клеток. Концентрацию ФНО-α в супернатантах измеряли с помощью ELISA (Quantikine HS ELISA; R&D Systems Cat. # HSTA00D) в 5-ти повторениях.

Результаты: ZEP3 и ZEP4 эффективно снижали уровни ФНО альфа в культуре клеток кератиноцитов человека. Концентрацию ФНО-альфа в образцах рассчитывали в соответствии с уравнением линии тренда стандартной кривой: OD = 0,063x + 0,1718. Процент ингибирования продукции ФНО-альфа рассчитывали в каждой экспериментальной группе по сравнению с соответствующей контрольной группой (те же условия, без пептида). Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9

Условия эксперимента, результаты и анализ.

#	ДМСО	Пептид (мг/мл)	ЛПС (мкг/мл)	ФНОα (пг/мл)	Станд. откл.	Кратность Изменение*	% Ингибирования	t-критерий**	группа t-критерия 2
1^&	-	-	-	0	0		-
2	-	-	-	2,8	0,3	1,0	-		1
3	-	-	20	12,4	0,6	4,4	-	7,4х10^-8	2
4	0,10 %	-	20	8,8	0,7	3,1	-	1,7х10^-5	3
5	0,10 %	ZEP3 0,4	20	4,6	0,5	1,6	48	5,1х10^-6	4
6	0,05 %	ZEP3 0,2	20	6,0	0,4	2,1	32	7,1х10^-4	4
7	0,025 %	ZEP3 0,02	20	9,6	0,5	3,4	-	-	-
8	-	ZEP3Na 0,4	20	5,9	0,5	2,1	52	8,6х10^-8	3
9	-	ZEP3Na 0,2	20	6,7	1,0	2,4	46	1,5х10^-5	3
10	-	ZEP3Na 0,02	20	9,2	0,7	3,3	26	7,8х10^-5	3
11	0,10 %	-	30	21,5	2,2	7,6	-	0,75	13
12	0,10 %	ZEP3 0,2	30	17,3	1,2	6,1	20	0,009	11
13	-	-	30	21,0	1,8	7,5	-	1,4х10^-5	2
14	-	ZEP3Na 0,2	30	13,1	0,8	4,7	38	1,5х10^-4	13

^& Нет клеток;

* Кратное изменение каждого образца относится к концентрации ФНО-α в образце №2;

* * t-критерий рассчитывали с использованием функции Microsoft EXCEL для каждого образца (группа 1) по сравнению с контролем этого образца (группа 2). Параметры, используемые для t-критерия: двустороннее распределение, непарный t-критерий, неравномерная дисперсия. Тот же контрольный эталонный образец использовали для расчета процента ингибирования секреции ФНО-α.

Выводы: Количественный тест с помощью ELISA продемонстрировал дозозависимое ингибирование продуцирования ФНО-α в кератиноцитах человека, обработанных ЛПС, под действием ZEP3 или ZEP3Na, по сравнению с количеством, секретируемым клетками, стимулированными только с помощью ЛПС.

Хотя изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами реализации, очевидно, что многие альтернативы, модификации и вариации будут очевидны для специалистов в данной области техники. Соответственно, предполагается, что изобретение охватывает все такие альтернативы, модификации и вариации, которые находятся в пределах сущности и широкого объема прилагаемой формулы изобретения.

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в данном описании, полностью включены в данное описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были специально и индивидуально указаны для включения в данное описание посредством ссылки. Кроме того, цитирование или идентификация любой ссылки в этой заявке не должно толковаться как признание того, что такая ссылка доступна в качестве известного уровня техники для настоящего изобретения. В той степени, в которой используются заголовки разделов, их не следует рассматривать как обязательные ограничения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> S.I.S Shulov Innovative Science Ltd.

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ

<130> SIS001PCT

<150> US 62649940

<151> 2018-03-29

<160> 2

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> пироглутаминовая кислота(pGlu)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> C8 алкил, присоединенный к эпсилон-амину боковой цепи лизина

с образованием Lys(октаноила)

<400> 1

Glu Asn Trp Lys

1

<210> 2

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический пептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> пироглутаминовая кислота(pGlu)

<400> 2

Glu Asn Trp Thr

1

<---

Claims

1. Применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента пептид, выбранный из группы, состоящей из pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноил)-OH (SEQ ID NO: 1), pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (SEQ ID NO: 2) и их фармацевтически приемлемых солей, для лечения воспалительного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания или нарушения глаз, воспалительного заболевания или нарушения уха, воспалительного заболевания или нарушения легких, воспалительного заболевания или нарушения кишечника, или воспалительного аутоиммунного заболевания или нарушения.

2. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.

3. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что пептид представляет собой натриевую соль пептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.

4. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что пептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

5. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что пептид представляет собой натриевую соль пептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.

6. Применение по любому из пп. 1-5, характеризующееся тем, что фармацевтическая композиция имеет pH в диапазоне от 4 до 8.

7. Применение по любому из пп. 1-5, характеризующееся тем, что фармацевтическая композиция выполнена с возможностью введения путем, выбранным из группы, состоящей из местного применения, офтальмологического введения, перорального введения, назального введения и парентерального введения.

8. Применение по любому из пп. 1-5, характеризующееся тем, что фармацевтическая композиция выполнена с возможностью местного введения в форме крема, мази, пасты, лосьона, геля или в форме глазных капель.

9. Применение по любому из пп. 1-5, характеризующееся тем, что фармацевтическая композиция выполнена с возможностью введения субъекту с заболеванием или повреждением глаза, в форме жидкого раствора или суспензии для использования в форме глазных капель, эмульсии, крема, мази, спрея, геля или интравитреальной инъекции.

10. Применение по п. 9, характеризующееся тем, что фармацевтическая композиция выполнена в форме крема, содержащего 0,1-5% масс./масс. пептида или его фармацевтически приемлемой соли.

11. Применение по любому из пп. 1-5 для использования у субъекта с воспалительным заболеванием или нарушением легких, где указанное заболевание или нарушение легких выбрано из группы, состоящей из астмы, бронхита, плеврита, альвеолита, васкулита, пневмонии, хронического бронхита, бронхоэктазии, диффузного панбронхиолита, пневмонита гиперчувствительности, идиопатического легочного фиброза и муковисцидоза.

12. Применение по любому из пп. 1-5 для использования у субъекта с заболеванием или повреждением глаз, где указанное заболевание или повреждение глаз представляет собой воспалительное заболевание или повреждение глаз, выбранное из группы, состоящей из увеита, синдрома сухого глаза, воспалительных симптомов, связанных с инфекционным заболеванием глаз, аллергического заболевания глаз, кератита, конъюнктивита, дисфункции мейбомиевых желез и глазных симптомов, связанных с синдромом Шегрена.

13. Применение по любому из пп. 1-5 для использования у субъекта с аутоиммунным заболеванием или нарушением, где указанное аутоиммунное заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, остеоартрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, ювенильного идиопатического артрита и волчанки.

14. Применение по любому из пп. 1-5 для использования у субъекта с воспалительным заболеванием кишечника, где указанное воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из болезни Крона и язвенного колита.

15. Применение по любому из пп. 1-5 для использования у субъекта с воспалительным заболеванием или нарушением уха, где указанное воспалительное заболевание или нарушение уха выбрано из группы, состоящей из воспалительных симптомов, связанных с инфекцией уха, средним отитом, наружным отитом, мастоидитом и отомастоидитом.

16. Применение по любому из предыдущих пунктов, характеризующееся тем, что лечение воспалительного заболевания или нарушения включает снижение высвобождения или подавление активности по меньшей мере одного воспалительного цитокина, выбранного из группы, состоящей из: ФНО-альфа, ИЛ-1-бета и ИЛ-6.