CN114539356B - 一种脂肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脂肽,包含Pam2C和多肽序列,其具有式Ⅰ所示结构式,其中,R为多肽序列,所述多肽序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中的任一种。本发明还提供了该脂肽的制备方法,以及作为黏膜佐剂活性成分的应用。本发明提供的新型脂肽相对于Pam2CSK4更显著的提高了粘膜部位OVA特异性sIgA和IgG的水平。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种脂肽及其制备方法,以及其在制备疫苗中的应用。
背景技术
疫苗接种是预防传染病最经济和最有效的手段,能够有效降低多种传染病的死亡率,提高生活质量。本质上,疫苗接种是模拟自然感染的过程,通过激活免疫系统产生有效的保护性免疫反应。随着生物技术的发展,多种新型技术路线的疫苗获得授权,例如重组亚单位蛋白疫苗、多糖结合疫苗和肽疫苗。然而,这些类型的疫苗由于免疫原性不理想而在应用上受到一定的限制。因此,需要添加可以佐剂等提高疫苗免疫原性且不影响疫苗成分抗原性的物质。
佐剂是添加到疫苗中以增强免疫反应的物质,其可以减少加强免疫的次数,重塑适应性免疫反应,减少抗原剂量并提高保护效果。Toll样受体(TLR)在针对微生物病原体的先天免疫反应以及随后诱导适应性免疫反应中发挥重要作用。基于TLRs在免疫反应中的重要作用,TLRs激动剂已被报道为疫苗中很有前景的佐剂,例如TLR4激动剂MPL[Wang YQ,Bazin-Lee H,Evans JT,Casella CR,Mitchell TC.MPL adjuvant contains competitiveantagonists of human TLR4.Front Immunol.2020;11:577823.]和TLR9激动剂CpG ODN[Gursel M,Gursel I.Development of CpG ODN based vaccine adjuvantformulations.Methods Mol Biol.2016;1404:289-298],已被纳入许可的疫苗。TLR2与TLR1或TLR6形成异二聚体,相应的配体可以通过与该异二聚体结合诱导炎性细胞因子释放[Reuven EM,Fink A,Shai Y.Regulation of innate immune responses bytransmembrane interactions:lessons from the TLR family.Biochim BiophysActa.2014;1838(6):1586-93]。含有Pam2Cys和Pam3Cys的脂肽可以激活TLR2信号传导[LuBL,Williams GM,Brimble MA.TLR2 agonists and their structure-activityrelationships.Org Biomol Chem.2020;18(27):5073-509],因此在佐剂研究中也引起研究者们的广泛关注。Pam2CSK4是已经发现的最有效的TLR2激动剂之一,是小鼠模型中的Th2极化佐剂[Halliday A,Turner JD,A,Bates PA,Taylor MJ.The TLR2/6ligand PAM2CSK4 is a Th2 polarizing adjuvant in Leishmania major and Brugiamalayi murine vaccine models.Parasit Vectors.2016;9:96]。
近年来,研究者设计并合成了多种脂肽,均通过激活TLR2发挥佐剂作用[HeitmannJS,Bilich T,Tandler C,Nelde A,Maringer Y,Marconato M,et al.A COVID-19peptidevaccine for the induction of SARS-CoV-2T cell immunity.Nature.2021]。现有的研究成果中,发现含有细菌脂蛋白N末端序列的脂肽可以促进抗原特异性免疫反应[Xue RY,Guo MF,Guo L,Liu C,Li S,Luo J,et al.Synthetic lipopeptide enhances protectiveimmunity against helicobacter pylori infection.Front Immunol.2019.10:1372]。虽然这些脂肽具有相同的脂质部分,例如FSL-1和FSL-2在肽部分的C端仅一个氨基酸不同,但是,却导致FSL-2的TLR2激动活性仅为FSL-1的80%。FSL-1的TLR2活性可以达到MALP-2的4倍,但Pam2CSK4却是四种脂肽中最有效的TLR2激动剂[Buwitt-Beckmann U,Heine H,Wiesmuller KH,Jung G,Brock R,Akira S,et al.Toll-like receptor 6-independentsignaling by diacylated lipopeptides.European journal of immunology.2005;35:282-9]。虽然,当前研究已经显示脂肽中的肽序列能够显著影响其TLR2活性,但是,肽序列影响脂肽活性的具体原因和方式却尚不清楚。
疫苗介导的黏膜反应在预防病原体感染方面起着至关重要的作用。作为TLR2激动剂,一些脂肽已被证明是有效的粘膜佐剂,使用脂肽作为佐剂的鼻内疫苗接种能够诱导血清中IgG和支气管肺泡灌洗液(BALF)中sIgA升高[Rharbaoui F,Drabner B,Borsutzky S,Winckler U,Morr M,Ensoli B,et al.The mycoplasma-derived lipopeptide MALP-2isa potent mucosal adjuvant.Eur J Immunol.2002;32(10):2857-65]。然而,现有技术中尚没有关于将脂肽用于增强新冠病毒疫苗的功效的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种相比Pam2CSK4更能有效激活TLR2信号的新型脂肽,且该脂肽能够作为佐剂,通过黏膜反应增强新冠病毒疫苗的免疫功效。
本发明首先提供了一种脂肽,其包含Pam2C和多肽序列,其具有式Ⅰ所示结构式,
其中,R为多肽序列,所述多肽序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中的任一种。经验证含有上述16条多肽序列中的任一个的脂肽均具有相当或显著高于Pam2C SK4的效果,能够有效激活TLR2信号。
在根据本发明的一个实施方案中,所述多肽序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16中的任一种。经实验验证含有上述5条多肽序列中的任一个的脂肽均具有显著高于Pam2CSK4的效果,能够更加有效地激活TLR2信号。
在根据本发明的一个实施方案中,所述多肽序列的N端与Pam2C连接。
本发明还提供了上述的脂肽的制备方法,包括:
1)利用Fmoc固相合成法合成多肽;所述多肽选自氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中的任一个;
2)获得Fmoc-Pam2Cys;
3)利用固相合成法,将Fmoc-Pam2Cys引入步骤1)合成得到的多肽的N端,随后脱去所有保护基,即得脂肽。
本发明还提供了上述的脂肽在制备疫苗中的应用。
在根据本发明的一个实施方案中,所述疫苗含有佐剂,所述佐剂含有所述脂肽。
在根据本发明的一个实施方案中,所述疫苗为用于预防或治疗呼吸道感染的疫苗。
在根据本发明的一个实施方案中,所述疫苗为新型冠状病毒感染的疫苗。
本发明的再一方面提供了一种佐剂,其含有上述的脂肽。
在根据本发明的一个实施方案中,所述佐剂为鼻粘膜佐剂。
本发明的上述技术方案的有益效果如下:
本发明提供的新型脂肽具有激活先天免疫反应和T细胞应答介导的反应的潜力,相对于Pam2CSK4更显著的提高了粘膜部位OVA特异性sIgA和IgG的水平,同时本发明提供的新型脂肽增强了重组抗原RBD介导的新冠病毒预防的潜力,显著提升了血清中新冠病毒假病毒的中和抗体滴度,可以作为预防或治疗新型冠状病毒感染疫苗的的黏膜佐剂。
附图说明
图1为23种新型合成脂肽的化学结构示意图;
图2A为Fmoc-Pam2Cys的核磁共振氢谱;
图2B为LP1-1(Pam2Cys-SREPKALIA)的质谱图谱;
图2C为LP1-2(Pam2Cys-SSKGFDQPG)的质谱图谱;
图2D为LP1-4(Pam2Cys-SADAQHFAK)的质谱图谱;
图2E为LP1-14(Pam2Cys-SKHANNTHA)的质谱图谱;
图2F为LP1-19(Pam2Cys-STIPSAIRH)的质谱图谱;
图2G为LP1-20(Pam2Cys-SIVHEGSKY)的质谱图谱;
图2H为LP1-23(Pam2Cys-SIRFVKDRT)的质谱图谱;
图2I为LP1-24(Pam2Cys-SFHRAVHAY)的质谱图谱;
图2J为LP1-30(Pam2Cys-SLARRNDTN)的质谱图谱;
图2K为LP1-34(Pam2Cys-SHYAPLPDS)的质谱图谱;
图2L为LP1-37(Pam2Cys-SRVVSKLYL)的质谱图谱;
图2M为LP1-38(Pam2Cys-SLLKETAAG)的质谱图谱;
图2N为LP1-40(Pam2Cys-SKVLRKHYG)的质谱图谱;
图2O为LP2-1(Pam2Cys-SPALVSAER)的质谱图谱;
图2P为LP2-2(Pam2Cys-SEFAHPRHG)的质谱图谱;
图2Q为LP2-3(Pam2Cys-SEFQATYAP)的质谱图谱;
图2R为LP2-5(Pam2Cys-SHKLGLRHS)的质谱图谱;
图2S为LP2-6:(Pam2Cys-SAPNPSTNQ)的质谱图谱;
图2T为LP2-7(Pam2Cys-SKALWANKG)的质谱图谱;
图2U为LP2-10(Pam2Cys-SAVMLEQRM)的质谱图谱;
图2V为LP2-12(Pam2Cys-SGGQRSPGP)的质谱图谱;
图2W为LP2-17(Pam2Cys-SIKNKQSVG)的质谱图谱;
图2X为LP2-20(Pam2Cys-SPNSAQFSS)的质谱图谱;
图3为合成脂肽的TLR2激动活性筛选结果图谱;
图4为合成脂肽的细胞毒性和溶血毒性测定结果图谱;
图5为新型脂肽刺激BMDCs表面成熟标志以及上清液中细胞因子的表达情况图谱;
图6为小鼠血清中OVA特异性IgG和IgA的水平图谱;
图7为小鼠粘膜中OVA特异性sIgA和IgG的表达水平图谱;
图8为OVA特异性T细胞应答水平图谱;
图9为粘膜部位的RBD特异性sIgA和IgG反应图谱;
图10为用小鼠血清中RBD特异性IgG、IgG亚类和IgA的水平图谱;
图11为血清、BALF和鼻腔灌洗液中的新冠病毒中和抗体水平图谱。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
试剂
DMEM(C11995500BT)、澳洲合格胎牛血清(10099141C)和Trypsin-EDTA(0.25%)、酚红(25200072)购自Gibco;CD11c-FITC(117306)、CD86-PerCP(105026)、CD80-APC(104714)和CD40-PE(124610)购自Biolegend;山羊抗小鼠IgG抗体(HRP)(ab98762)、山羊抗小鼠IgAα链(HRP)(ab97235)、山羊抗小鼠IgG1重链(HRP)(ab97240)、山羊抗小鼠IgG2a重链(HRP)(ab97245)、TMB ELISA Substrate(ab171523)和TMB底物的450nm终止溶液(ab171529)购自Abcam;青霉素-链霉素溶液100X(C0222)和BSA、FranctionV(ST023)购自Beyotime;小鼠IFN-γELISpot PLUS试剂盒(HRP)(3321-4HPW-2)、小鼠TNFa ELISA试剂盒(1217202)、小鼠IL-1βELISA试剂盒(1210122)和小鼠IL-12p70 ELISA试剂盒(1211202)购自Dakewe;GM-CSF(315-02-10ug)和IL-4(214-14-20ug)购自PEPROTECH;Quant-iTTMPicoGreendsDNA试剂(P7581)购自Thermo Scientific;2019-nCoV蛋白RBD(DRA36)购自novoprotein;来自鸡蛋清的白蛋白(A5503)购自sigma。
小鼠和细胞系
6-8周龄无特异性病原体雌性BALB/c小鼠购自陆军医科大学实验动物中心。
HEK-BlueTM mTLR2细胞购自InvivoGen(San Diego,USA),在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺(2mM)、Normocin(100μg/mL)、青霉素(50U/mL)和链霉素(50g/mL)在37℃的5%CO2中。
实施例1脂肽的合成
利用在线序列操作套件(http://bioinformatics.org/sms2/sample_protein.html),根据UniProtKB/Swiss-Prot数据库中氨基酸组成(%)随机生成100个肽序列,然后尝试合成包含上述生成序列的100条脂肽,并成功合成获得其中的23条脂肽(如图1所示),且产物纯度超过95%。
1、Fmoc-Pam2Cys与脂肽的合成方法如下:
1)化合物2的合成
L-胱氨酸(1,20.8mL,5g)溶解在70%HClO4(8.4mL)中,然后在冰浴冷却下滴加乙酸叔丁酯(50mL,374.4mmol),所得溶液在室温搅拌2天。将反应混合物用冰冷却,并使用4NNaOH水溶液(32g NaOH在200mL H2O中)将pH调节至11。将反应温度恢复至室温,用乙酸乙酯萃取6次并将所得有机相合并在一起,经Na2SO4干燥并真空浓缩,得到呈黄色油状物,即化合物2(4.5g,产率62%)。
2)化合物3的合成
向化合物2(1.6g,4.54mmol)的THF溶液中加入Fmoc-OSu(1.53g×2,4.54mmol×2)。将混合物冰冷却。滴加N-甲基吗啉(NMM)(1mL,9.08mmol)并继续搅拌过夜。向该反应混合物中加入乙酸乙酯(60mL)和10%柠檬酸溶液(25mL)。将得到的有机相进一步用10%柠檬酸溶液(25mL)、盐水洗涤两次,然后浓缩得到浆状残余物,通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体,即化合物3(2.9g,收率80%)。
3)化合物5的合成
将(R)-3-氯-1,2-丙二醇(化合物4,2g,18.2mmol)溶解于25mL二氯甲烷中,加入K2CO3(6.3g,45.45mmol),室温搅拌2小时。将所得混合物通过硅藻土真空过滤,减压浓缩得到无色油状物,即粗品5(1.13g,产率84%),未经纯化进行下一步反应。
4)化合物6的合成
冰浴冷却下,向化合物3(500mg,0.63mmol)的二氯甲烷溶液中加入锌粉(153mg,2.35mmol)与甲醇、浓盐酸和浓硫酸的混合溶液(100:7:1,18mL)。在0℃搅拌30分钟后,将化合物5(466mg,6.3mmol)加入到反应混合物中并在40℃搅拌3小时。将混合物浓缩到一半体积后,过滤除去沉淀物。向滤液中加入饱和NaCl,并用DCM萃取两次。合并的有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩。通过柱层析纯化,得到油状6(1.01g,产率59%)。
5)化合物7的合成
在冰浴冷却下,向棕榈酸(108mg,0.42mmol)的DMF(1mL)溶液中加入化合物6(100mg,0.21mmol)和DMAP(5mg,0.042mmol),EDCI(8mg,0.042加入mmol),搅拌6h,同时逐渐升温至室温。向反应混合物中加入水,用DCM萃取,并通过柱层析纯化,得到化合物7(35mg,产率17.6%)。
6)Fmoc-Pam2Cys的合成
向化合物7(700mg,0.737mmol)的二氯甲烷溶液中加入2mL三氟乙酸,并将混合物在室温搅拌2h。利用石油醚/乙酸乙酯重结晶纯化得到白色固体,即Fmoc-Pam2Cys(183.7mg,产率27.9%),其核磁共振氢谱如图2A所示。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J=4.0Hz,2H),7.62(d,J=4.0Hz,2H),7.41(t,J=8.0Hz,2H),7.35(t,J=8.0Hz,2H),5.81(d,J=4.0Hz,1H),5.20(s,1H),4.69(d,J=4.0Hz,1H),4.44–4.40(m,3H),4.37(t,J=4.0Hz,1H),4.28-4.26(m,1H),3.20–3.08(m,2H),2.80–2.79(m,2H),2.36–2.30(m,4H),1.63–1.62(m,4H),1.28–1.26(m,48H),0.92–0.89(m,6H).LC-MS(ESI+):m/z 893.2(M-H)+;[α]23 D=6.57°(C=1,CHCl3).
2、多肽的合成
根据上述生成的多肽序列利用固相合成法分别合成并获得对应的多肽。
脂肽LP1-1中的多肽序列为SEQ ID NO:1SREPKALIA;
脂肽LP1-2中的多肽序列为SEQ ID NO:2SSKGFDQPG;
脂肽LP1-4中的多肽序列为SEQ ID NO:3SADAQHFAK;
脂肽LP1-14中的多肽序列为SEQ ID NO:4SKHANNTHA;
脂肽LP1-19中的多肽序列为SEQ ID NO:5STIPSAIRH;
脂肽LP1-20中的多肽序列为SEQ ID NO:6SIVHEGSKY;
脂肽LP1-23中的多肽序列为SEQ ID NO:7SIRFVKDRT;
脂肽LP1-24中的多肽序列为SEQ ID NO:8SFHRAVHAY;
脂肽LP1-30中的多肽序列为SEQ ID NO:9SLARRNDTN;
脂肽LP1-34中的多肽序列为SEQ ID NO:10SHYAPLPDS;
脂肽LP1-37中的多肽序列为SEQ ID NO:11SRVVSKLYL;
脂肽LP1-38中的多肽序列为SEQ ID NO:12SLLKETAAG;
脂肽LP1-40中的多肽序列为SEQ ID NO:13SKVLRKHYG;
脂肽LP2-1中的多肽序列为SEQ ID NO:14SPALVSAER;
脂肽LP2-2中的多肽序列为SEQ ID NO:15SPALVSAER;
脂肽LP2-3中的多肽序列为SEQ ID NO:16SEFAHPRHG;
脂肽LP2-5中的多肽序列为SEQ ID NO:17SEFQATYAP;
脂肽LP2-6中的多肽序列为SEQ ID NO:18SHKLGLRHS;
脂肽LP2-7中的多肽序列为SEQ ID NO:19SAPNPSTNQ;
脂肽LP2-10中的多肽序列为SEQ ID NO:20SAVMLEQRM;
脂肽LP2-12中的多肽序列为SEQ ID NO:21SGGQRSPGP;
脂肽LP2-17中的多肽序列为SEQ ID NO:22SIKNKQSVG;
脂肽LP2-20中的多肽序列为SEQ ID NO:23SPNSAQFSS。
3、脂肽的合成
通过固相合成法,将Fmoc-Pam2Cys连接到多肽的N端,然后脱去所有保护基即获得脂肽。合成得到的23条脂肽的质谱图谱如图2B-图2X所示。
实施例2脂肽对TLR2信号的影响
1、TLR2信号测定
HEK-BlueTM检测是根据制造商的说明进行。以无内毒素水作为阴性对照,将脂肽加入平底96孔板(每孔20μL)中,然后将HEK-BlueTM mTLR2细胞悬浮在HEK-BlueTM检测液中并加入板中(每孔180μL,5×104个细胞)。在37℃孵育14小时后,通过分光光度计在620nm处测量SEAP活性。
2、RNA提取和实时RT-PCR
根据制造商的说明,利用RNAiso Plus(TakaRa,9108)提取总RNA。根据制造商的说明,使用PrimeScript RT试剂盒(TakaRa,RR037A)进行逆转录(RT)-PCR。然后通过基于SYBRgreen的实时PCR(TOYOBO,QPK-201)对cDNA进行定量。使用了以下引物:
TLR1正向引物(SEQ ID NO:24):5'-ACGGGTAAGGTTGTCTTGACG-3',
反向引物(SEQ ID NO:25):5'-CTTCCGCTCTCTTCATGCCT-3';
TLR2正向引物(SEQ ID NO:26):5'-AAGGAGGTGCGGACTGTTTC-3',
反向引物(SEQ ID NO:27):5'-CCGGTGATGCAATTCGGATG-3;
TLR3正向引物(SEQ ID NO:28):5'-GCGCATATCACAGGCTGAA-3',
反向引物(SEQ ID NO:29):5'-ATCTTCTTTTGGTGCGCGAT-3;
TLR4正向引物(SEQ ID NO:30):5'-AGATCTGAGCTTCAACCCCTT-3',
反向引物(SEQ ID NO:31):5'-GTCTCCACAGCCACCAGATT-3;
TLR5正向引物(SEQ ID NO:32):5'-GTATGCACTGTCACTCTGACTCTGT-3',
反向引物(SEQ ID NO:33):5'-AGCCCCGGAACTTTGTGACT-3';
TLR6正向引物(SEQ ID NO:34):5'-TCGGAGAAGGAAGTCTTGAGC-3',
反向引物(SEQ ID NO:35):5'-TATTAAGGCCAGGGCGCAAA-3';
TLR7正向引物(SEQ ID NO:36):5'-TGGCTCCCTTCTCAGGATGA-3',
反向引物(SEQ ID NO:37):5'-ATGTCTCTTGCTGCCCCAAA-3';
TLR8正向引物(SEQ ID NO:38):5'-TGTGAGCTGAAGCTCATGG-3',
反向引物(SEQ ID NO:39):5'-GGACAGGTGGACGAAGTCAG-3';
TLR9正向引物(SEQ ID NO:40):5'-TCTGCTCTCTGCACAGCTAC-3',
反向引物(SEQ ID NO:41):5'-CATGACTGAGGGGGCATGTT-3';
β-actin正向引物(SEQ ID NO:42):5'-TGGCTCCTAGCACCATGAAG-3',
反向引物(SEQ ID NO:43):5'-AACGCAGCTCAGTAACAGTC-3'。
以β-actin为内参,采用比较阈值循环(Ct)法计算基因表达量。
3、实验结果
为了筛选到比Pam2CSK4更能够有效地激活TLR2信号的脂肽,在用每种新型脂肽刺激HEK-BlueTM mTLR2细胞后测量SEAP活性。如图3中A所示,LP1-14、LP1-30、LP1-34、LP2-2和LP2-3处理显示出比Pam2CSK4更强的SEAP活性,表明它们可能诱导更强大的TLR2信号。在上述5种新型脂肽的存在下,TLR2的基因表达也显著增加。此外,测量了这些脂肽对其他TLR信号传导的影响,如图3中B所示,它们还能够显著触发TLR1、TLR6和TLR8信号。
实施例3细胞毒性实验
1、溶血试验
进行溶血测定,具体步骤包括:将不同浓度的每种脂肽与2%红细胞混合,将所得悬浮液加入平底96孔板(每孔200μL),以PBS为阴性对照,无菌水为阳性对照。在37℃孵育3h后,通过测量上清液在570nm处的吸光度来确定溶血活性。溶血百分比计算为:H(%)=(OD570nm样品-OD570nm PBS)/(OD570nm水-OD570nm PBS)*100。
2、细胞活力测定
通过MTT法分析细胞活力。BMDCs与梯度稀释的每种脂肽共培养48小时。之后,每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml),37℃孵育4h。然后,从孔中取出混合物并加入100μL DMSO。在570nm波长处检测吸光度。存活细胞百分比=暴露于脂肽的细胞的平均光吸收/对照细胞的平均光吸收×100。
通过MTT比色法对5种新型合成脂肽对BMDCs的细胞毒性进行了评估。结果显示,除了LP1-14对BMDCs有轻微的细胞毒性,其它脂肽在测试浓度(10-200μg/mL)下没有检测到显著毒性(图4中A)。
此外,与Pam2CSK4相比,5种合成脂肽在暴露于小鼠红细胞后诱导较少的溶血(图4中B)。上述结果表明,除LP1-14外,其它新型合成脂肽在体外是安全的。
实施例4脂肽对BMDCs的作用
1、BMDCs生成
分离骨髓衍生的树突状细胞(BMDCs)。冲洗雌性BALB/c小鼠的股骨获得细胞,在含有IL-4(10ng/mL)、GM-CSF(10ng/mL)和10%FBS的RPMI 1640培养基中诱导分化7天获得BMDCs。
2、FCM(流式细胞术)
BMDCs经每种脂肽处理后48小时后收集细胞。细胞在4℃下用CD11c-FITC(Biolegend,117306)、CD86-PerCP(Biolegend,105026)、CD80-APC(Biolegend,104714)和CD40-PE(Biolegend,124610)染色30分钟。PBS洗涤后,流式细胞仪检测共刺激分子的表达。
3、细胞因子测定
用合成脂肽(1μg/mL)或PBS刺激BMDCs(4mL RMPI-1640培养基中的4×106个细胞/孔)48小时。ELISA检测上清中IL-1β、TNF-α和IL-12的表达。
4、实验结果
以PBS、LP1-30、LP1-34、LP2-2和LP2-3刺激BMDCs 2天,并通过FACS评估共刺激分子(CD40和CD80)的表达水平。如图5中A-D所示,这些新型脂肽诱导BMDCs上CD80/CD86表达显著增加,并且与Pam2CSK4相比,LP1-30显示出更有效的刺激作用,表明新型脂肽能够显著诱导BMDCs的成熟。
此外,通过ELISA对BMDCs分泌的细胞因子水平进行测定。四种脂肽增加了促炎细胞因子TNF-α的产生,但不增加IL-1β(图5中E和F)。与Pam2CSK4相比,LP1-30和LP1-34处理诱导更高水平的IL-12(图4中G),表明新型脂肽具有激活先天免疫反应和T细胞介导的反应的潜力。
实施例5体液免疫应答检测
1、动物免疫
对于OVA免疫,将小鼠随机分成7组。小鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉小鼠,然后用PBS、OVA(10μg)、OVA(10μg)加以下脂肽之一在第0、14、28天进行鼻内免疫:LP1-30、LP1-34、LP2-2和LP2-3或OVA加Pam2CSK4。OVA加Pam2CSK4组作为阳性对照。对于新冠病毒重组抗原rRBD免疫,小鼠每隔两周用PBS、rRBD、rRBD+LP1-34、rRBD+LP2-2或rRBD+Pam2CSK4进行鼻内免疫。最后一次免疫后两周,处死小鼠并收集血清、唾液、胃匀浆、肠灌洗液和阴道洗液用于进一步分析。
2、酶联免疫吸附试验(ELISA)
通过标准间接ELISA确定特异性IgG和sIgA水平。用OVA或rRBD包被96孔平底板并在4℃下孵育过夜。用PBST中的5%BSA封闭后,将稀释的样品加入板中,并在37℃下孵育1小时。HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a或IgA用作二抗。每孔加入TMB底物溶液并孵育约5-10分钟。然后,通过添加终止溶液来结束反应。最后,在酶标仪(Thermo Scientific)中在450nm处检测光密度。
3、新型脂肽增强血清OVA特异性IgG和IgA反应
为了评估新型脂肽的黏膜佐剂作用,分别用OVA加LP1-30、LP1-34、LP2-2或LP2-3对小鼠进行鼻内免疫(图6中A)。每种新型脂肽和Pam2CSK4为佐剂的组之间的体重变化没有显著差异(图6中B)。ELISA数据显示,OVA加LP1-30、LP1-34、LP2-2或LP2-3免疫显著增加了血清特异性IgG和IgA的水平(图6中C-F)。此外,与Pam2CSK4相比,LP2-2和LP2-3引发了更强大的特异性IgG反应。此外,通过ELISA测量血清中脂肽特异性抗体的水平,虽然在OVA+LP1-30组中检测到低水平的LP1-30特异性IgG抗体,但这种趋势没有达到统计学意义。其他脂肽未能引发特异性IgG或IgA抗体,这表明它们几乎没有反应原性或免疫原性。IgG2a和IgG1可以分别作为Th1和Th2细胞应答的标志物,还测定了OVA特异性IgG1和IgG2a水平。如图6中G和H所示,所有合成脂肽都显著增强了特异性IgG1反应,LP2-2、LP2-3、Pam2CSK4也提高了特异性IgG2a的水平。当脂肽用作黏膜佐剂时,观察到较低的IgG2a/IgG1比率,表明这些新型脂肽更有效地驱动Th2偏向免疫反应(图6中I)。
4、新型脂肽提高粘膜部位OVA特异性sIgA和IgG的水平
还测定了不同粘膜部位的特异性sIgA和IgG水平。与OVA单独组相比,OVA加合成脂肽诱导显著更高水平的阴道特异性sIgA和IgG(图7中A)。与Pam2CSK4相比,LP1-30、LP1-34和LP2-2增加了更高水平的阴道IgG,但只有辅以LP2-2才达到显著性(图7中B)。此外,新型脂肽提高了肠道灌洗液、胃匀浆和唾液中OVA特异性sIgA和IgG的水平(图7中C-G)。重要的是,用OVA和新型脂肽免疫增强了鼻粘膜中的特异性sIgA和IgG反应(图7中H和I)。此外,与Pam2CSK4相比,LP1-34和LP2-2辅助OVA在BALF中诱导更高水平的sIgA(图7中J和K)
5、新型脂肽辅助rRBD提高了粘膜部位特异性sIgA和IgG的水平
由于新冠病毒最初感染呼吸道,疫苗介导的呼吸道黏膜抗体和全身IgG对于抵御病原体至关重要。通过研究了新型合成脂肽作为新冠病毒rRBD粘膜佐剂的可能性,在rRBD鼻内免疫的小鼠中,未观察到BALF和鼻洗液中的RBD特异性IgG或sIgA。然而,与LP1-34或LP2-2联用,rRBD在呼吸道中引起显著的粘膜sIgA和IgG反应(图8中A-D)。此外,合成脂肽显著提高了唾液和阴道特异性sIgA和IgG水平(图8中E-H)。一般而言,LP1-34对黏膜sIgA和IgG水平的增强能力强于Pam2CSK4。
6、新型脂肽辅助rRBD提升了血清特异性IgG和IgA的水平
与粘膜抗体的结果相似,单独使用rRBD进行鼻内免疫未能诱导显著的特异性血清IgG和IgA反应,可能是由于其低免疫原性(图9中A-B)。然而,使用LP1-34、LP2-2或Pam2CSK4作为佐剂显著提高了RBD特异性血清IgG和IgA的水平。此外,与单独的rRBD组相比,LP1-34、LP2-2或Pam2CSK4均提高了特异性IgG2a和IgG1水平,并且LP1-34诱导了最高的特异性IgG2a反应(图9中C-D)。IgG2a/IgG1比率显示rRBD加脂肽诱导Th2偏向反应(图9中E)。
实施例6细胞免疫应答检测
为了进一步研究新型脂肽是否增强特异性细胞免疫应答,收集免疫后小鼠的脾淋巴细胞,使用ELISPOTPLUS试剂盒(Mabtech)通过ELISPOT评价评估T细胞反应。在不存在或存在10μg/mL OVA257-264肽或OVA323-339肽的情况下,将免疫小鼠的脾细胞在ELISpot板中孵育48小时。通过肽处理后的斑点形成细胞的数量减去没有肽处理的斑点形成细胞的数量用来计算特定的形成IFN-γ的细胞的数量。
如图10中A-D所示,通过检测形成OVA257-264特异性CD8+T细胞和OVA323-339特异性CD4+T细胞应答水平,发现以新型合成脂肽作为佐剂未能引发实质性的特异性T细胞反应,而Pam2CSK4略微提高了CD4+和CD8+T细胞反应。
实施例7新冠病毒中和抗体检测
1、ELISA法
根据制造商的说明(zybio)进行新冠病毒中和抗体检测。将稀释的血清、BALF或鼻腔洗液与HRP-RBD混合加入到hACE2包被的板中,然后将板在37℃下孵育1小时。洗板后,加入TMB底物,37℃孵育10min。最后,通过加入终止溶液来结束反应,并用微板读数器(ThermoScientific)在450nm处测量吸光度。
2.假病毒中和试验
实验前一天,将HEK293T-hACE2细胞以2×104个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中过夜。接种疫苗的小鼠血清从1:50稀释度开始连续稀释两倍用于测定。将血清样品与2μL假病毒(Longzoe)混合30分钟,然后添加到HEK293T-hACE2细胞中。48小时后,根据制造商的说明使用荧光素酶测定(Promega)裂解细胞,并通过Thermo Fisher读板仪测量相对发光单位(RLU)。SARS-CoV-2假病毒中和滴度定义为相对于病毒对照孔的平均值,观察到RLU降低50%的样品稀释度。然后使用GraphPad Prism(8.4版)计算SARS-Cov-2假病毒中和IC50。
3.实验结果
由于新冠病毒感染是通过将RBD与人类hACE2结合来引发的,因此疫苗的诱导抗体阻断RBD-ACE2相互作用被认为在防止SARS-CoV-2感染方面起重要作用。本发明确定了阻断RBD-ACE2相互作用的中和抗体的水平。LP1-34、LP2-2和Pam2CSK4显著提高血清中rRBD诱导的SARS-CoV-2中和抗体水平(图11中A-B)。此外,新型脂肽,尤其是LP1-34,提高了BALF和鼻腔灌洗液抑制RBD与ACE2相互作用的能力(图11中C-D),表明新型脂肽具有增强抗原介导的病毒预防的潜力进入呼吸道黏膜部位。更重要的是,LP1-34、LP2-2和Pam2CSK4可以显著增强rRBD免疫原对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体滴度(图11中E)。
实施例8支持向量机(SVM)
支持向量机用于在给定约束下在k维空间中找到一个分离超平面,并将样本分成两类。最优分离超平面的SVM解可以表示为:
s.t.yi(wTΦ(xi)+b)-(1-ξi)≥0,i=1,…,n.
k:特征的数目 n:训练向量的个数 w:法向量
b:截距项 xi:第i个训练向量 yi:第i个训练向量的分类标签
C:惩罚参数 ξi:第i个训练向量的预测误差 Φ(x):核函数
求解超平面wTx+b=0后,wi越大,第i个特征对超平面的贡献越大,说明序列的第i个特征对脂肽的影响更显著。在本研究中,所有9个特征都是从Expasy上的ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)中检索到的,如表1所示。对于向量y=(y1;…;yn),如果脂肽xi具有激动活性,定义yi=1,如果没有,则定义yi=-1(与Pam2CSK4的激动活性相比)。所有SVM计算均在libsvm 3.18中执行,这是一个用于支持向量分类和回归的通用库。在计算之前,通过libsvm中的svm-scale工具将9个特征的所有值统一为[-1,1]。exp(-γ||xi-xj||2给出的径向基函数被用作所有计算的核函数Φ(x)。惩罚参数C和内核参数γ由libsvm中的网格搜索工具确定。
表1 wi对应的肽链特征参数
SVM用于研究脂肽中的肽序列与其TLR2活性之间的关系。如表1和表2所示,具有强正贡献的三个特征是w3(Arg+Lys的数量)、w4(Asp+Glu的数量)和w5(理论等电点),这表明带电残基可能是有利于TLR2激动活性。脂肪族指数和GRAVY显示负贡献。肽的GRAVY值计算为所有氨基酸的亲水性值之和除以序列中的残基数。肽的脂肪族指数定义为脂肪族侧链(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)占据的相对体积。亲水性在两个特征中都表示为负值。因此,这两个特征显示出相似的结果,即亲脂性残基可能对TLR2活性产生不利影响。此外,训练样本的预测准确率为93.10%。
表2肽段特征对TLR2激动作用的贡献
+:正贡献;-:负贡献;0:无贡献。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种脂肽及其制备方法和应用
<141> 2022-02-21
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (8)
2.如权利要求1所述的脂肽,其特征在于,所述R选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:15或SEQ ID NO:16中的任一种。
3.如权利要求1或2所述的脂肽,其特征在于,所述多肽序列的N端与Pam2C连接。
4.如权利要求1-3中任一项所述的脂肽的制备方法,其特征在于,包括:
1)利用Fmoc固相合成法合成多肽;所述多肽选自氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中的任一个;
2)获得Fmoc-Pam2Cys;
3)利用固相合成法,将Fmoc-Pam2Cys引入步骤1)合成得到的多肽的N端,随后脱去所有保护基,即得脂肽。
5.如权利要求1-3中任一项所述的脂肽在制备疫苗中的应用,所述疫苗为新型冠状病毒感染的疫苗。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述疫苗含有佐剂。
7.一种佐剂,其特征在于,含有如权利要求1-3中任一项所述的脂肽。
8.如权利要求7所述的佐剂,其特征在于,为鼻粘膜佐剂。
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