CN112851755A - 一种线性脂肽化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种线性脂肽化合物及其制备方法与应用，其结构为亲脂性结构片段(QZ)与多肽链(TL‑OH)通过酰胺键(CONH)连接形成，其结构式如式Ⅰ所示，QZ‑CONH‑TL‑OH式Ⅰ；本发明提供了一类N‑端具有亲脂性结构的线性脂肽化合物，具有较小的毒性，且具有一定的抗辐射损伤活性，作为药物具有良好的开发前景。

Description

一种线性脂肽化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种线性脂肽化合物及其制备方法与应用。
背景技术
辐射无需通过介质便可传递能量，从而诱发各种放射病和/或辐射损伤。根据损伤的作用方式不同，辐射损伤可分为急性辐射损伤和慢性辐射损伤，急性辐射损伤是因一次或短时间内接受大剂量辐照所致，主要发生于事故照射，慢性辐射损伤是指经历持续较长一段时间的辐照后发生的的损伤。随着核能愈加广泛的应用，对核辐射损伤机制和抗辐射药物的研究越来越迫切。
虽然，几十年来已经研发出多种抗辐射药物，如WR2721(氨磷汀)，WR2721只能以注射剂方式给药，存在副作用较大(包括低血压、恶心、呕吐、嗜睡、过敏性皮疹、发热或休克)、给药方式受限等缺点。因此，临床治疗上仍然缺乏理想的抗辐射药物，开发有效的且具有毒性小的抗辐射药物是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的，第一方面，提供一种具有抗辐射损伤功能的线性脂肽化合物，其结构为亲脂性结构片段(QZ)与多肽链(TL-OH)通过酰胺键(CONH)连接形成，其结构式如式Ⅰ所示，
QZ-CONH-TL-OH
式Ⅰ；
QZ代表亲脂性结构片段，结构式如式Ⅱ所示，
Figure BDA0002896070380000011
R1选自棕榈酰，11-氨基十一酰，12-氨基酸十二酰或硫辛酰；
R表示H、棕榈酰、硫辛酰或含有5-20个碳的烷酰基(即CmH2m+1CO，m＝5-20)或烷基末端有氨基取代的含5-20个碳的烷酰基(即NH2CmH2m+1CO，m＝5-20)；
TL代表含有n个氨基酸残基的线性多肽链，n＝4-30，氨基酸残基可以是天然或非天然的氨基酸。
亲脂性结构片段QZ中
R＝H，R1分别选自棕榈酰，11-氨基十一酰，12-氨基酸十二酰或硫辛酰，此时，式Ⅱ化合物(即亲脂性结构片段QZ)可分别表示为Dhc(Pam)2-OH，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH或Dhc(PamALA)-OH；
亲脂性结构片段QZ更优选Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH或Dhc(PamALA)-OH。
Dhc(Pam)2-OH、Dhc(Pam11NC)-OH、Dhc(Pam12NC)-OH、Dhc(PamALA)-OH的logP值分别为12.9322、8.4022、8.9292、8.1062。
TL的氨基酸排列选自以下氨基酸序列中的一种或几种：YPPAK、LDGDVW、FGLGRLCG、PQGEESNDK、LQGEESNDK、VQGEESNDY、V(ψ)QGEESNDK、VQGEESNDK、SNDKK、GETDK、VQGEESND、VQGEENDK、VQGSNDK、GEESNDK、QGEESNDK、S(ψ)NDKK、S(ψ)KKKK、GEESND、SETDK、GETDS、GETD、VQGEESND-Orn、GETD-Orn、SKKKK、TNDK、LVQGEESNDK、(D)VQGEESNDK、(D)LQGEESNDK、(D)SKKKK、SNDK；其中：ψ是伪肽键CH2NH2，D是d构型的氨基酸；
TL的氨基酸排列优选以下氨基酸序列中的一种或几种：YPPAK、SNDKK、VQGEESNDK、GETDK、LQGEESNDK、QGEESNDK、PQGEESNDK、GETDK、VQGSNDK。
包括以下结构式的化合物(R＝H)：
Dhc(Pam)2-YPPAK-OH(代号：QZ-1)、Dhc(Pam)2-LDGDVW-OH(代号：QZ-2)、Dhc(Pam)2-FGLGRLCG-OH(代号：QZ-3)、Dhc(Pam)2-PQGEESNDK-OH(代号：QZ-4)、Dhc(Pam)2-LQGEESNDK-OH(代号：QZ-5)、Dhc(Pam)2-VQGEESNDY-OH(代号：QZ-6)、Dhc(Pam)2-V(ψ)QGEESNDK-OH(QZ-7)、Dhc(Pam11NC)-VQGEESNDK-OH(QZ-8)、Dhc(Pam12NC)-VQGEESNDK-OH(代号：QZ-9)、Dhc(Pam)2-SNDKK-OH(代号：QZ-10)、Dhc(Pam11NC)-GETDK-OH(代号：QZ-11)、Dhc(Pam11NC)-SNDKK-OH(代号：QZ-12)、Dhc(Pam)2-VQGEESND-OH(代号：QZ-13)、Dhc(Pam)2-VQGEENDK-OH(代号：QZ-14)、Dhc(Pam)2-VQGSNDK-OH(代号：QZ-15)、Dhc(Pam)2-GEESNDK-OH(代号：QZ-16)、Dhc(Pam11NC)-QGEESNDK-OH(QZ-17)、Dhc(PamALA)-VQGEESNDK-OH(QZ-18)、Dhc(PamALA)-GETDK-OH(代号：QZ-19)、Dhc(Pam)2-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-20)、Dhc(Pam11NC)-S(ψ)NDKK-OH(QZ-21)、Dhc(PamALA)-V(ψ)QGEESNDK-OH(QZ-22)、Dhc(Pam)2-S(ψ)KKKK-OH(代号：QZ-23)、Dhc(Pam)2-GEESND-OH(代号：QZ-24)、Dhc(Pam)2-SETDK-OH(代号：QZ-25)、Dhc(Pam)2-GETDS-OH(代号：QZ-26)、Dhc(Pam)2-GETD-OH(代号：QZ-27)、Dhc(Pam)2-VQGEESND-Orn-OH(代号：QZ-28)、Dhc(Pam)2-GETD-Orn-OH(代号：QZ-29)、Dhc(Pam12NC)-GETDK-OH(代号：QZ-30)、Dhc(Pam12NC)-SNDKK-OH(QZ-31)、Dhc(Pam12NC)-QGEESNDK-OH(代号：QZ-32)、Dhc(Pam12NC)-S(ψ)KKKK-OH(QZ-33)、Dhc(Pam12NC)-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-34)、Dhc(PamALA)-SNDKK-OH(代号：QZ-35)、Dhc(PamALA)-SKKKK-OH(代号：QZ-36)、Dhc(PamALA)-S(ψ)NDKK-OH(QZ-37)、Dhc(PamALA)-S(ψ)KKKK-OH(代号：QZ-38)、Dhc(Pam)2-TNDK-OH(代号：QZ-39)、Dhc(Pam)2-LVQGEESNDK-OH(代号：QZ-40)、Dhc(Pam)2-(D)VQGEESNDK-OH(QZ-41)、Dhc(Pam)2-(D)LQGEESNDK-OH(QZ-42)、Dhc(Pam)2-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-43)、Dhc(PamALA)-SNDK-OH(代号：QZ-44)、Dhc(Pam12NC)-YPPAK-OH(代号：QZ-45)、Dhc(PamALA)-YPPAK-OH(代号：QZ-46)、Dhc(Pam11NC)-SNDK-OH(代号：QZ-47)、Dhc(Pam11NC)-YPPAK-OH(代号：QZ-48)、Dhc(Pam)2-SNDK-OH(代号：QZ-49)、Dhc(Pam)2-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-50)、Dhc(Pam11NC)-(D)SKKKK-OH(QZ-51)、Dhc(Pam12NC)-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-52)、Dhc(PamALA)-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-53)。
所述氨基(酸)酰基是指天然或非天然的氨基(酸)酰基，例如丙氨(酸)酰基、天冬氨(酸)酰基、谷氨(酸)酰基、赖氨(酸)酰基、缬氨(酸)酰基、丝氨(酸)酰基、苏氨(酸)酰基等。
第二方面，本发明提供一种药物组合物，其含有上述线性脂肽化合物，以及药学上可接受的盐、载体或赋形剂。
所述药学上可接受的盐可为酸加成盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、对苯甲磺酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、马来酸盐；也可为与碱类形成的盐，如：钠盐、钾盐、镁盐和钙盐等，优选乙酸盐。
第三方面，本发明提供制备上述线性脂肽化合物的方法，将亲脂性结构片段(QZ)的羧基端与多肽链(TL)的氨基端反应，形成酰胺键，得到亲脂性结构片段(QZ)位于N-末端的线性脂肽。
当亲脂性结构片段QZ为Dhc(Pam)2-OH，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH或Dhc(PamALA)-OH时，结构如式Ⅲ-式Ⅵ所示，其合成路线如式1，式1中式Ⅲ化合物为化合物6，式Ⅳ-式Ⅵ化合物分别为化合物9a-化合物9c，
第四方面，本发明提供上述线性脂肽化合物在制备预防和/或治疗辐射引起的损伤的药物中的应用；优选的，所述辐射引起的损伤包括急性辐射损伤和慢性辐射损伤(包括恶性肿瘤患者因放疗所致辐射损伤)；更优选的，所述慢性辐射损伤的症状包括辐射可能导致的慢性皮肤损伤、造血障碍、白内障，白细胞、淋巴细胞降低(造血综合征)，恶心、呕吐、腹泻(胃肠综合征)，失眠、嗜睡、多梦、记忆力衰退、食欲不振(神经综合征)等。
所述药物的给药途径可以是腹腔注射、静脉注射、肌肉注射或肺局部给药。依据给药方式的不同，所述药物中可以含有合适重量比的本发明药物组合物(作为活性组分)和药学上可接受的载体或赋形剂。
Figure BDA0002896070380000041
本发明提供了一类氨基端具有亲脂性结构的线性脂肽化合物，该线性脂肽化合物具有较强的水溶性，有利于制成含水剂型，如口服液，水针剂等，给药途径灵活，不受限制，且具有一定的抗辐射损伤活性，毒性小，作为药物具有良好的开发前景。
附图说明
图1-图21所示为本发明线性脂肽化合物QZ-1、QZ-4～QZ-5、QZ-8～QZ-12、QZ-14～QZ-15、QZ-17～QZ-19、QZ-25、QZ-30、QZ-32、QZ-35、QZ-39～QZ-42的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种线性脂肽化合物通过激活TLR2/6发挥抗辐射效果，该线性脂肽化合物毒性小、亲脂性降低，亲水性增强，以便于制成含水剂型，如口服液，水针剂等。
本发明提供的线性脂肽化合物，其结构为亲脂性结构片段(QZ)与多肽链(TL-OH)通过酰胺键(CONH)连接形成，即：亲脂性结构片段QZ端部的羧基与多肽链TL端部的氨基形成肽键(CONH)，其结构如式Ⅰ所示，多肽链TL另一端以羧酸形式(-COOH)暴露，因此可以形成药学上可接受的盐；
QZ-CONH-TL-OH
式Ⅰ
其中，QZ代表亲脂性结构片段，选自式Ⅱ，
Figure BDA0002896070380000051
R1选自棕榈酰(C15H31CO，代号为Pam，式Ⅱ中两个手性碳的构型组合为R，R)，11-氨基十一酰(C11H22NO，代号为11NC，式Ⅱ中两个手性碳的构型组合为R，R)，12-氨基酸十二酰(C12H24NO，代号为12NC，式Ⅱ中两个手性碳的构型组合为R，R)或硫辛酰(C8H14OS2，代号为ALA，式Ⅱ中两个手性碳的构型组合为R，R)；
R表示H、棕榈酰、硫辛酰或含有5-20个碳的烷酰基(即CmH2m+1CO，m＝5-20)或末端有氨基取代的含5-20个碳的直链烷酰基(即NH2CmH2m+1CO，m＝5-20)；
当R＝H，R1分别选自棕榈酰，11-氨基十一酰，12-氨基酸十二酰或硫辛酰时，式Ⅱ化合物(即亲脂性结构片段QZ)可分别表示为Dhc(Pam)2-OH，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH，Dhc(PamALA)-OH。
Dhc(Pam)2-OH，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH，Dhc(PamALA)-OH的结构式分别如式Ⅲ-式Ⅵ所示：
Figure BDA0002896070380000052
Figure BDA0002896070380000061
式Ⅲ-式Ⅵ化合物的合成路线如式1，式1中化合物6(R1＝COC15H31，R＝H)为式Ⅲ化合物，化合物9a-化合物9c分别为式Ⅳ-式Ⅵ化合物：
Figure BDA0002896070380000062
TL代表多肽链，为含有n个氨基酸残基的线性多肽，n＝4-30，氨基酸残基可以是天然或非天然的氨基酸。TL的氨基酸排列选自以下氨基酸序列中的一种或几种：YPPAK、LDGDVW、FGLGRLCG、PQGEESNDK、LQGEESNDK、VQGEESNDY、V(ψ)QGEESNDK、VQGEESNDK、SNDKK、GETDK、VQGEESND、VQGEENDK、VQGSNDK、GEESNDK、QGEESNDK、S(ψ)NDKK、S(ψ)KKKK、GEESND、SETDK、GETDS、GETD、VQGEESND-Orn、GETD-Orn、SKKKK、TNDK、LVQGEESNDK、(D)VQGEESNDK、(D)LQGEESNDK、(D)SKKKK、SNDK；其中：ψ是伪肽键CH2NH2，D是d构型的氨基酸，Orn为鸟氨酸。
本发明提供的线性脂肽化合物包括以下结构式(以下化合物中R均为H)
Dhc(Pam)2-YPPAK-OH(代号：QZ-1)、Dhc(Pam)2-LDGDVW-OH(代号：QZ-2)、Dhc(Pam)2-FGLGRLCG-OH(代号：QZ-3)、Dhc(Pam)2-PQGEESNDK-OH(代号：QZ-4)、Dhc(Pam)2-LQGEESNDK-OH(代号：QZ-5)、Dhc(Pam)2-VQGEESNDY-OH(代号：QZ-6)、Dhc(Pam)2-V(ψ)QGEESNDK-OH(代号：QZ-7)(ψ表示VQ间的肽键CONH替换为伪肽键-CH2NH-)、
Dhc(Pam11NC)-VQGEESNDK-OH(QZ-8)、Dhc(Pam12NC)-VQGEESNDK-OH(QZ-9)、Dhc(Pam)2-SNDKK-OH(代号：QZ-10)、Dhc(Pam11NC)-GETDK-OH(代号：QZ-11)、Dhc(Pam11NC)-SNDKK-OH(代号：QZ-12)、Dhc(Pam)2-VQGEESND-OH(代号：QZ-13)、Dhc(Pam)2-VQGEENDK-OH(代号：QZ-14)、Dhc(Pam)2-VQGSNDK-OH(代号：QZ-15)、Dhc(Pam)2-GEESNDK-OH(代号：QZ-16)、Dhc(Pam11NC)-QGEESNDK-OH(QZ-17)、Dhc(PamALA)-VQGEESNDK-OH(代号：QZ-18)、Dhc(PamALA)-GETDK-OH(QZ-19)、Dhc(Pam)2-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-20)、Dhc(Pam11NC)-S(ψ)NDKK-OH(QZ-21)、Dhc(PamALA)-V(ψ)QGEESNDK-OH(代号：QZ-22)、Dhc(Pam)2-S(ψ)KKKK-OH(QZ-23)、Dhc(Pam)2-GEESND-OH(代号：QZ-24)、Dhc(Pam)2-SETDK-OH(代号：QZ-25)、Dhc(Pam)2-GETDS-OH(代号：QZ-26)、Dhc(Pam)2-GETD-OH(代号：QZ-27)、Dhc(Pam)2-VQGEESND-Orn-OH(代号：QZ-28)(Orn为鸟氨酸)、Dhc(Pam)2-GETD-Orn-OH(代号：QZ-29)、Dhc(Pam12NC)-GETDK-OH(代号：QZ-30)、Dhc(Pam12NC)-SNDKK-OH(代号：QZ-31)、Dhc(Pam12NC)-QGEESNDK-OH(QZ-32)、Dhc(Pam12NC)-S(ψ)KKKK-OH(代号：QZ-33)、Dhc(Pam12NC)-S(ψ)NDKK-OH(QZ-34)、Dhc(PamALA)-SNDKK-OH(代号：QZ-35)、Dhc(PamALA)-SKKKK-OH(代号：QZ-36)、Dhc(PamALA)-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-37)、Dhc(PamALA)-S(ψ)KKKK-OH(QZ-38)、Dhc(Pam)2-TNDK-OH(代号：QZ-39)、Dhc(Pam)2-LVQGEESNDK-OH(代号：QZ-40)、Dhc(Pam)2-(D)VQGEESNDK-OH(QZ-41)、Dhc(Pam)2-(D)LQGEESNDK-OH(QZ-42)、Dhc(Pam)2-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-43)、Dhc(PamALA)-SNDK-OH(代号：QZ-44)、Dhc(Pam12NC)-YPPAK-OH(代号：QZ-45)、Dhc(PamALA)-YPPAK-OH(代号：QZ-46)、Dhc(Pam11NC)-SNDK-OH(代号：QZ-47)、Dhc(Pam11NC)-YPPAK-OH(代号：QZ-48)、Dhc(Pam)2-SNDK-OH(代号：QZ-49)、Dhc(Pam)2-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-50)、Dhc(Pam11NC)-(D)SKKKK-OH(QZ-51)、Dhc(Pam12NC)-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-52)、Dhc(PamALA)-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-53)。
本发明线性脂肽化合物的合成采用标准的Fmoc固相肽合成方法：WANG树脂作为固相载体，Fmoc保护的氨基酸为原料，HOBt、DMAP和DIC混合后为负载试剂，HOBt、TBTU和NMM混合后为缩合试剂，25％哌啶/DMF(即体积百分含量25％的哌啶和75％的DMF的混合液，下同)为Fmoc脱保护试剂；先将所要合成的肽链C端的氨基酸偶联到固相载体上，然后依次以序列对应的氨基酸作为氨基组份脱去氨基Fmoc保护基后，再同过量的N-Fmoc保护的氨基酸耦合来延长肽链。重复(缩合-洗涤-脱保护-洗涤-下一轮缩合)操作直至得到目标多肽链。
将亲脂性结构片段(QZ)的羧基端与多肽链(TL)的氨基端反应，形成酰胺键，得到亲脂性结构片段(QZ)位于N-末端的线性脂肽，QZ可事先合成好作为最后一个氨基酸接到TL的末端，形成脂肽链。最后用三氟乙酸将脂肽链从WANG树脂上切割下来，粗品脂肽链经制备型反相HPLC纯化得目标线性脂肽化合物。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例。
以下结合实施例对本发明的实施方案进行更具体更详细的描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，绝非对本发明进行限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器为市购常规产品。
用于实施例中的氨基酸及其衍生物购自市售产品或根据文献方法制得。
本发明中使用的缩写词具有如下含义：
DCC：二环己基碳二酰亚胺；DCM：二氯甲烷；DIC：二异丙基碳二酰亚胺；DMAP：N,N-二甲基-4-氨基吡啶；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；HOBt：1-羟基苯并三氮唑；HPLC：高效液相色谱仪；IL：白介素；NF-κB(Nuclear factor-κB)：核转录因子-κB；NMM：N-甲基吗啉；NMR：核磁共振；TFA：三氟乙酸；TLC：薄层层析；TLR：Toll样受体；TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸；1H NMR由JNM-ECA-400型超导核磁共振仪(日本电子株式会社)测定；MS由G6230A质谱仪测定。以下内容中，如无特殊说明的地方，百分含量均是指体积百分含量。
实施例1、N-芴甲氧羰基-R-(2,3-双棕榈酰氧基丙基)-R-半胱氨酸(Fmoc-Dhc(Pam)2-OH)的合成(即QZ片段，结构如式Ⅲ所示，对应式1中的化合物6)
1.Fmoc-Cystine-OH(对应式1中的化合物2)
4.80g(20mmol)L-Cystine与9.20g(100mmol)Na2CO3溶于200mL H2O中，加入80mL二氧六环，冰盐浴下搅拌，分批加入11.64g(45mmol)Fmoc-Cl，30min后撤去冰盐浴。反应液逐渐变为难以搅拌的白色固体，补加30mL H2O和20mL二氧六环。搅拌过夜后得白色流混悬液，加入2M稀盐酸调pH＝2-3，抽滤得白色滤饼，水与冷甲基叔丁基醚各洗涤滤饼两次，干燥得白色粉末Fmoc-Cystine-OH(以下相同)13.70g，收率100.0％。
2.Fmoc-Cystine-OtBu(对应式1中的化合物3)
13.70g(20mmol)Fmoc-Cystine-OH溶于叔丁醇(80mL)，吡啶(35mL)，二氯甲烷(80mL)的混合溶液中，室温搅拌下滴加POCl3(10mL)，反应液温度上升并回流，维持微沸，继续滴加剩余的POCl3，溶液变为浅黄色。室温反应过夜，反应液倒入100mL冰水中，沉淀溶解，蒸去一些反应液，剩余物以乙酸乙酯萃取3次，合并有机相以饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂得粗品。粗品经柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)得到无色透明泡状产物(即Fmoc-Cystine-OtBu)13.62g(理论值15.31g)，收率88.9％，Rf值＝0.47(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)。
1H-NMR(400Hz,DMSO-d6)δ(ppm):1.42(s,18H),2.91(m,2H),3.18(m,2H),4.22(m,8H),7.18(t,4H),7.26(t,4H),7.59(d,4H),7.82(d,2H),7.88(d,4H).
3.Fmoc-Dhc-OtBu(对应式1中的化合物4)
13.62g(16mmol)Fmoc-Cystine-OtBu溶于60mL二氯甲烷中，冰浴搅拌下加入4.18g(64mmol)Zn粉以及新鲜配置的43.62mL混合溶液(甲醇：浓HCl：浓H2SO4＝100：7：1)，冰浴下反应30min，然后加入8.29g(112mmol)R-缩水甘油改为室温搅拌，TLC监测反应过程，Rf值＝0.33(石油醚:乙酸乙酯＝1:2)，，待反应不再进行后滤除沉淀，旋干溶剂并加入适量水，乙酸乙酯萃取3次并合并有机相，有机相经饱和食盐水洗涤一次并用无水硫酸镁干燥。柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:2)得无色透明胶状固体(即Fmoc-Dhc-OtBu)11.87g(理论值15.84g)，收率74.9％。
1H-NMR(400Hz,CDCl3)δ:1.47(s,9H),3.21(m,6H),3.54-3.66(m,3H),4.20-4.49(m,4H),5.96(d,1H),7.30(t,2H),7.32(t,2H),7.59(d,2H),7.76(d,2H).
4.Fmoc-Dhc(Pam)2-OtBu(对应式1中的化合物5)
1.28g(2.70mmol)Fmoc-Dhc-OtBu溶于30mL DCM中，冰浴下依次加入1.34g(7mmol)EDC·HCl、1.79g(7mmol)棕榈酸以及0.73g(0.22mmol)DMAP，30min后撤去冰浴，室温搅拌。TLC监测反应过程，Rf值＝0.82(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，待反应完全后，旋干溶剂并加入适量水，乙酸乙酯萃取3次并合并有机相，有机相经饱和食盐水洗涤一次并用无水硫酸镁干燥。柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)得白色蜡状固体(即Fmoc-Dhc(Pam)2-OtBu)1.67g(理论值2.57g)，收率65.0％。
5.Fmoc-Dhc(Pam)2-OH(对应式1中的化合物6)
2.23g(2.34mmol)Fmoc-Dhc(Pam)2-OtBu溶于10mL TFA中，室温搅拌1.5h后减压旋蒸除去TFA。剩余物以乙酸乙酯重结晶，少量冷甲基叔丁基醚洗涤产物两次，得白色固体(即Fmoc-Dhc(Pam)2-OH)2.10g，产率80.1％。
1H-NMR(400Hz,CDCl3)δ:0.87(t,J＝1.6Hz,6H),1.27(s,48H),1.75(m,J＝2.2Hz,4H),2.20(m,4H),2.67(m,2H),2.92(m,2H),4.05(dd,1H),4.45(m,2H),4.52(m,1H),5.17(t,1H),5.69(m,1H),7.30(t,2H),7.36(t,2H),7.59(d,2H),7.76(d,2H).
实施例2、N-芴甲氧羰基-R-[2-(11’-芴甲氧羰基氨基十一酰氧基)-3-棕榈酰氧基丙基]-R-半胱氨酸(Fmoc-Dhc(Pam11NC)-OH)的合成(即QZ片段，结构如式Ⅳ所示，对应式1中的化合物9a)
1.Fmoc-Dhc(Pam)-OtBu(对应式1中的化合物7)
2.56g(10mmol)棕榈酸溶于15mL氯化亚砜中，50℃加热搅拌2h，通风橱内蒸去氯化亚砜，加入20mL DCM溶解得棕榈酰氯溶液备用。将4.97g(10mmol)Fmoc-Dhc-OtBu溶于50mLDCM，加入1.01g(10mmol)三乙胺，冰浴搅拌下缓慢滴入上述棕榈酰氯的DCM溶液，室温搅拌5h。旋蒸除去溶剂后加入适量水，以乙酸乙酯萃取3次，合并有机相以饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得粗品。粗品经柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得3.25g(理论值7.35g)浅黄色胶状产物(Fmoc-Dhc(Pam)-OtBu)，收率44.3％，Rf＝0.52(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)。直接用于下一步反应。
2.Fmoc-Dhc(Pam11NC)-OtBu(对应式1中的化合物8a)
2g(10mmol)11-氨基十一酸与4.23g(40mmol)Na2CO3溶于100mL H2O中，加入40mL1,4-二氧六环，冰盐浴中搅拌，分批加入5.17g(20mmol)Fmoc-Cl(耗时10min)，30min后撤去冰盐浴，最大搅拌速度搅拌过夜。2M HCl调节反应液pH＝2～3，乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂得粗品。粗品经柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得白色粉末Fmoc-11-氨基十一酸1.52g(理论值4.22g)，收率36.0％。
2.51g(3.41mmol)Fmoc-Dhc(Pam)-OtBu溶于40mL DCM中，冰浴搅拌下依次加入2.06g EDC·HCl、1.10g Fmoc-11-氨基十一酸以及0.12g DMAP，30min后撤去冰浴，室温搅拌10h。旋蒸除去DCM，加入适量水后以乙酸乙酯萃取三次，有机相以饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸干得粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，得2.97g透明胶状产物(Fmoc-Dhc(Pam11NC)-OtBu)(理论值3.85g)，收率77.1％，Rf值＝0.64(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)。
3.Fmoc-Dhc(Pam11NC)-OH(对应式1中的化合物9a)
2.97g(2.63mmol)Fmoc-Dhc(Pam11NC)-OtBu溶于15mL TFA中，室温搅拌1.5h，在通风橱内旋蒸除去三氟乙酸。硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得黄色油状产物(Fmoc-Dhc(Pam11NC)-OH)2.07g(理论值2.79g)，收率74.2％。
1H-NMR(400Hz,DMSO-d6)δ(ppm):0.88(t,3H),1.17(m,36H),1.60(m,2H)，1.66(m,4H),2.28(m,4H),2.67(m,3H),2.92(m,2H),4.05(dd,1H),4.15(m,9H),5.17(t,1H),7.30(t,4H),7.36(t,4H),7.52(d,1H),7.59(d,4H),7.76(d,4H),12.91(s,1H).
实施例3、N-芴甲氧羰基-R-[2-(12’-芴甲氧羰基氨基十二酰氧基)-3-棕榈酰氧基丙基]-R-半胱氨酸(Fmoc-Dhc(Pam12NC)-OH)的合成(即QZ片段，结构如式Ⅴ所示，对应式1中的化合物9b)
1.Fmoc-Dhc(Pam12NC)-OtBu(对应式1中的化合物8b)
2.69g(3.78mmol)Fmoc-Dhc(Pam)-OtBu溶于50mL DCM中，冰浴搅拌下依次加入1.08g(5.67mmol)EDC·HCl，2.39g(5.67mmol)Fmoc-12-氨基十二酸，0.07g(0.60mmol)DMAP，30min后撤去冰浴，室温搅拌10h。旋蒸除去DCM，加入适量水后以乙酸乙酯萃取三次，有机相以饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸干得粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝6:1)得浅黄色胶状产物(Fmoc-Dhc(Pam12NC)-OtBu)3.75g(理论值4.27g)，收率87.8％。Rf值＝0.64(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)。
2.Fmoc-Dhc(Pam12NC)-OH(对应式1中的化合物9b)
1.02g(0.50mmol)Fmoc-Dhc(Pam12NC)-OtBu溶于25mL TFA中，室温搅拌1.5h，在通风橱内旋蒸除去三氟乙酸。硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得0.66g黄色胶状产物(Fmoc-Dhc(Pam12NC)-OH)(理论值0.96g)，收率68.8％。
1H-NMR(400Hz,DMSO-d6)δ(ppm):0.88(t,3H),1.22(m,38H),1.47(m，2H),1.66(m,4H),2.25(m,4H),2.51(m,3H),2.92(m,2H),4.05(dd,1H),4.24(m,9H),5.11(t,1H),7.30(t,4H),7.31(t,4H),7.42(d,1H),7.87(d,4H),7.89(d,4H),13.01(s,1H).
实施例4、N-芴甲氧羰基-R-(2-硫辛酰氧基-3-棕榈酰氧基丙基)-R-半胱氨酸(Fmoc-Dhc(PamALA)-OH)的合成(即QZ片段，结构如式Ⅵ所示，对应式1中的化合物9c)
1.Fmoc-Dhc(PamALA)-OtBu(对应式1中的化合物8c)
1.74g(2.43mmol)Fmoc-Dhc(Pam)OtBu溶于40mL DCM中，冰浴搅拌下依次加入0.479g(3.6mmol)EDC·HCl、0.52g(3.6mmol)硫辛酸以及0.07g(0.72mmol)DMAP，30min后撤去冰浴，室温搅拌6h。旋蒸除去DCM，加入适量水后以乙酸乙酯萃取三次，有机相以饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥后蒸干得粗品。粗品经硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)得浅黄色油状产物(Fmoc-Dhc(PamALA)-OtBu)1.87g(理论值2.18g)，收率85.8％。Rf值＝0.67(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)。
2.Fmoc-Dhc(PamALA)-OH(对应式1中的化合物9c)
1.18g(1.27mmol)Fmoc-Dhc(PamALA)-OtBu溶于10mL TFA中，室温搅拌1h，终止反应，在通风橱内旋蒸除去三氟乙酸。硅胶柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)得0.65g油状产物(Fmoc-Dhc(PamALA)-OH)(理论值1.07g)，收率56.2％。
1H-NMR(400Hz,DMSO-d6)δ(ppm):0.88(t，3H),1.21(m,26H),1.47(m,2H),1.66(m,4H),2.25(m,4H),2.49(m,2H),2.59(m,2H),2.62(m,3H),2.92(m,2H),4.05(dd,1H),4.24(m,9H),5.11(t,1H),7.30(t,4H),7.31(t,4H),7.42(d,1H),7.87(d,4H),7.89(d,4H).
实施例5、Dhc(Pam)2-YPPAK-OH(QZ-1)的合成
1.肽树脂的合成
线性多肽的合成采用的是Fmoc保护固相多肽合成法，合成载体树脂选自负载量为0.56mmol/g的Wang树脂，负载试剂为HOBt+DMAP+DIC的混合物，负载溶剂为80％DCM+20％DMF(体积百分含量)的混合液，氨基酸的缩合试剂为HOBt+TBTU+NMM的混合物，缩合溶剂为DMF。具体地，由C端向N端延长的线性多肽固相合成操作步骤如下：
(1)第一个氨基酸的接入
称取0.1587g(0.1mmol)Wang树脂(SD值＝0.56g/mmol)置于多肽合成管中，DMF溶胀20min，去除溶剂。称取0.23g(0.5mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，0.0675g(0.5mmol)HOBt和催化量的DMAP，置于由5mL DCM和1mL DMF混合后的混合液中，一次性加入到多肽合成管中，加入催化量的DMAP，随后滴加0.063g(0.5mmol)DIC，室温振摇12h。去除溶剂并以DMF和DCM分别洗涤树脂3次，重复上述反应投料再室温反应12h，去除反应液并用DMF和DCM分别洗涤树脂。配置封闭试剂(由0.4mL乙酸酐、0.4mL吡啶和1.2mLDMF组成)，加入到多肽合成管，室温振摇1h，DMF润洗3次，以实现对树脂上未反应羟基的乙酰化封闭。加入4mL 25％哌啶-DMF溶液震摇20min，脱去Fmoc保护基，DMF润洗3次，除去哌啶。用茚三酮检测树脂，如为阴性则反应结束，洗涤树脂；如为阳性再重复脱除Fmoc保护操作。
(2)肽链的延伸
称取0.093g(0.3mmol)Fmoc-Ala-OH，0.045g(0.3mmol)HOBt溶解于5mL DCM+1mLDMF的混合液中，溶解完成后滴加0.15g(0.3mmol)NMM，一次性加入到多肽合成管中，与树脂混合震荡4h。取少量树脂置于1.5ml EP管中，甲醇润洗3次，加入7滴茚三酮和1滴醋酸，95℃加热5min，若树脂变为蓝色，则重复Fmoc-Ala-OH的缩合步骤。若树脂未变色，说明反应完全，除去反应液，DMF润洗三次。以4mL 25％哌啶-DMF溶液处理20min脱除Fmoc保护，DMF润洗三次，除去哌啶。
然后重复耦联(按顺序依次缩合剩下的氨基酸，投料物料比为保护的氨基酸：HOBt：NMM：树脂载量＝3:3:3:1)、脱除Fmoc保护基操作，接入第三个氨基酸Fmoc-L-Pro-OH，以此循环，再依次接入Fmoc-L-Pro-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Dhc(Pam)2-OH(即QZ片段)，并脱除QZ片段上的胺基的Fmoc保护基，DMF和甲醇分别润洗树脂3次，干燥树脂，并称重。
(3)肽树脂的裂解
甲醇润洗肽树脂三次，以除去DMF，真空泵抽干溶剂，真空干燥箱50℃干燥6h，称重树脂，估算多肽重量。配置裂解液(由3.6mL TFA、100μL水、100μL间甲苯酚(即间甲基苯酚)、100μL二甲硫醇和100μL三异丙基硅烷组成)，竖直震荡1h，收集裂解液，并用DCM润洗树脂一次，合并润洗液并于40℃下浓缩。加8ml乙醚于浓缩液中，有凝胶状的固体析出，7000r/min离心3min，弃去上清液，再次加入8ml乙醚经震摇和离心，弃去上清液，氩气吹干底部固体，得QZ-1粗产品。
(4)粗肽的纯化
由于脂肽化合物的N端存在一个亲脂性的特殊氨基酸(即该氨基酸胺基上的一个氢被QZ片段取代)，其在Agela Venusil ASB C18(5μm,4.6mm×250mm)色谱柱上的保留效果远好于一般的天然氨基酸多肽。为了能更好地在Agela Venusil ASB C18色谱柱上分离脂肽化合物，选择的流动相为洗脱能力较强的水(含0.1％TFA)-33％异丙醇+67％乙腈体系。采用Agilent 1100型高效液相色谱仪，兼具分析与制备两种功能，通用的检测条件为柱温30℃，检测波长220nm，流动相A：H2O(0.1％TFA)，流动相B：33％异丙醇+67％CH3CN，溶剂均为色谱纯。
粗肽的分析、纯化以及纯化后肽的纯度分析操作过程如下：
1.粗肽的分析：取步骤(3)得到的QZ-1粗产品2mg，溶于0.5mL含20％乙腈+80％H2O的混合溶剂中，经0.45μm微孔滤膜过滤得到样品溶液。通过色谱柱Agela Venusil ASB C18(5μm，4.6mm×250mm)进行分析，流速1mL/min，保留时间27.201min，流动相梯度为：30min，60％-100％(B相浓度)。
2.粗肽的纯化：取QZ-1粗肽30mg，溶于1mL 20％乙腈/H2O的混合溶剂中，经0.45μm微孔滤膜过滤得到样品溶液。采用色谱柱Agela Venusil ASB C18(5μm，21.2mm×250mm)进行纯化，流速16mL/min，线性洗脱，制备流动相浓度为84％(B相浓度)，保留时间23.606min。收集所含目标化合物纯度大于95％的洗脱液，旋转蒸发除去有机溶剂，低压冷冻冻干机冻干，得到白色絮状固体，m/z[M+H+]:1228.8231，理论分子值1227.989，确定得到的是线性脂肽化合物QZ-1。
实施例6、其他脂肽化合物的合成
Dhc(Pam)2-PQGEESNDK-OH(QZ-2)至Dhc(PamALA)-(D)SKKKK-OH(QZ-53)的合成、裂解同实施例5，粗肽的纯化及产品纯度分析条件如下：
流动相梯度为：
N端氨基酸为Dhc(Pam)2-OH的脂肽化合物(即QZ为Dhc(Pam)2-OH)：30min，60％-100％(B相浓度)；
N端氨基酸为Dhc(Pam11NC)-OH和Dhc(Pam12NC)-OH的脂肽化合物(即QZ为Dhc(Pam11NC)-OH和Dhc(Pam12NC)-OH)：20min，50％-80％(B相浓度)；
N端氨基酸为Dhc(PamALA)-OH的脂肽化合物(即QZ为Dhc(PamALA)-OH)：20min，60％-90％(B相浓度)。
最终通过MS验证分子量，确定目标化合物的结构。
以下列脂肽化合物为例：
Dhc(Pam)2-PQGEESNDK-OH(QZ-2)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间26.253min；制备流动相浓度为87％(B相浓度)，保留时间14.281min。m/z[M+H+]:1656.936，理论分子值1656.29。
Dhc(Pam)2-LQGEESNDK-OH(QZ-5)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间26.444min；制备流动相浓度为87％(B相浓度)，保留时间14.709min。m/z[M+H+]:1672.9703，理论分子值1672.34。
Dhc(Pam11NC)-VQGEESNDK-OH(QZ-8)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为50％-80％(B相浓度)，保留时间14.946min；制备流动相浓度为60％(B相浓度)，保留时间12.561min。m/z[(M+2H+)/2]:802.4494，理论分子值1603.27。
Dhc(Pam12NC)-VQGEESNDK-OH(QZ-9)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为50％-80％(B相浓度)，保留时间17.144min；制备流动相浓度为64％(B相浓度)，保留时间14.752min。m/z[(M+2H+)/2]:809.4570，理论分子值1617.27。
Dhc(Pam)2-SNDKK-OH(QZ-10)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间20.778min；制备流动相浓度为64％(B相浓度)，保留时间21.122min。m/z[M+H+]:1244.8144，理论分子值1243.94。
Dhc(Pam11NC)-GETDK-OH(QZ-11)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为50％-80％(B相浓度)，保留时间23.656min；制备流动相浓度为60％(B相浓度)，保留时间16.696min。m/z[M+H+]:1147.6923，理论分子值1146.81。
Dhc(Pam11NC)-SNDKK-OH(QZ-12)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为50％-80％(B相浓度)，保留时间12.943min；制备流动相浓度为64％(B相浓度)，保留时间9.319min。m/z[M+H+]:1189.7490，理论分子值1188.98。
Dhc(Pam)2-VQGEENDK-OH(QZ-14)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间22.439min；制备流动相浓度为84％(B相浓度)，保留时间14.213min。m/z[M+H+]:1571.9217，理论分子值1571.25。
Dhc(Pam)2-VQGSNDK-OH(QZ-15)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间26.361min；制备流动相浓度为87％(B相浓度)，保留时间14.746min。m/z[M+H+]:1400.8708，理论分子值1400.1。
Dhc(Pam11NC)-QGEESNDK-OH(QZ-17)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为50％-80％(B相浓度)，保留时间15.011min；制备流动相浓度为87％(B相浓度)，保留时间12.633min。m/z[(M+H2+)/2]:752.9132，理论分子值1589.27。
Dhc(PamALA)-VQGEESNDK-OH(QZ-18)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-90％(B相浓度)，保留时间15.863min；制备流动相浓度为70％(B相浓度)，保留时间19.136min。m/z[(M+2H+)/2]:804.8808，理论分子值1608.13。
Dhc(PamALA)-GETDK-OH(QZ-19)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-90％(B相浓度)，保留时间17.319min；制备流动相浓度为70％(B相浓度)，保留时间19.923min。m/z[M+H+]:1152.5600，理论分子值1151.67。
Dhc(Pam)2-SETDK-OH(QZ-25)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间27.826min；制备流动相浓度为75％(B相浓度)，保留时间16.796min。m/z[(M+2H+)/2]:616.8866，理论分子值1231.89。
Dhc(Pam12NC)-GETDK-OH(QZ-30)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为50％-80％(B相浓度)，保留时间17.168min；制备流动相浓度为60％(B相浓度)，保留时间19.607min。m/z[M+H+]:1161.7060，理论分子值1160.81。
Dhc(Pam12NC)-QGEESNDK-OH(QZ-32)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为50％-80％(B相浓度)，保留时间30.623min；制备流动相浓度为64％(B相浓度)，保留时间18.970min。m/z[M+H+]:759.9201，理论分子值1603.27。
Dhc(PamALA)-SNDKK-OH(QZ-35)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-90％(B相浓度)，保留时间17.479min；制备流动相浓度为84％(B相浓度)，保留时间18.479min。m/z[M+H+]:1194.0183，理论分子值1193.74。
Dhc(Pam)2-TNDK-OH(QZ-39)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间25.898min；制备流动相浓度为84％(B相浓度)，保留时间18.795min。m/z[M+H+]:1129.7856，理论分子值1129.8。
Dhc(Pam)2-LVQGEESNDK-OH(QZ-40)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间28.812min；制备流动相浓度为90％(B相浓度)，保留时间14.727min。m/z[(M+2H+)/2]:887.0223，理论分子值1771.47。
Dhc(Pam)2-(D)VQGEESNDK-OH(QZ-41)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间32.742min；制备流动相浓度为90％(B相浓度)，保留时间15.120min。m/z[M+2H+]:1658.9522，理论分子值1658.41。
Dhc(Pam)2-(D)LQGEESNDK-OH(QZ-42)的合成
肽树脂的合成、裂解、粗肽的纯化及产品纯度分析条件同实施例5，不同之处：分析流动相梯度为60％-100％(B相浓度)，保留时间34.239min；制备流动相浓度为87％(B相浓度)，保留时间13.208min。m/z[M+H+]:1672.9652，理论分子值1672.34。
比较例1、
CBLB612是美国Cleveland公司在研的一种辐射损伤保护剂，结构上属于典型的脂肽化合物，结构式如式A所示，
Figure BDA0002896070380000161
该化合物的水溶性较差，给药方式受限，用作以下实验中的阳性对照。
实验一、水溶性模拟
用ChemDraw软件计算亲脂性结构片段QZ片段的理论logP值(logP值(物质在正辛醇和水中的分配系数比值的对数值，可用来在理论层面上评价水溶性)越大，水溶性越差，logP值越小，水溶性越好)。计算结果如下：Dhc(Pam)2-OH的logP值为12.9322，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH，Dhc(PamALA)-OH的logP值分别为8.4022，8.9292，8.1062。可见，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH，Dhc(PamALA)-OH的logP均小于Dhc(Pam)2-OH，理论上可表明这三个亲脂性结构片段QZ的水溶性强于亲脂性结构片段Dhc(Pam)2-OH。
由于阳性对照化合物CBLB612中含有的QZ片段为Dhc(Pam)2-OH，说明本发明亲脂性结构片段QZ为Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH或Dhc(PamALA)-OH的脂肽化合物的水溶性要优于化合物CBLB612。
实验二、本发明线性脂肽化合物的抗辐射活性评价
1.取状态良好的人脐静脉内皮(HUVECs)细胞，用胰酶将细胞消化下来，计数，用RPMI-1640完全培养基将细胞密度调整为4×103/mL。
2.将HUVEC细胞分种到96孔细胞培养板中，每孔加入100μL，含400个细胞，96孔细胞培养板最外圈空白孔用200μl纯净水填充以减少边缘效应的影响，放置于CO2培养箱中。实验分为空白组、阴性不照射组、阴性照射组、阳性对照组和待测脂肽组，每组设置3个复孔。空白组不含细胞，其它操作均与待测脂肽组相同。
3.细胞培养24小时后，空白组、阴性不照射组和阴性照射组分别加入100μL完全培养基。阳性对照组和待测脂肽组分别加入100μL用RPMI-1640完全培养基稀释的化合物CBLB612溶液和脂肽化合物溶液，使整个实验体系中化合物CBLB612和待测脂肽化合物的终浓度为10μM(初筛浓度)。
4.将空白组、阴性不照射组、阴性照射组、阳性对照组和待测脂肽组均放置于CO2培养箱中培养5小时，然后将空白组、阴性照射组、阳性对照组和待测脂肽组置于60Coγ射线下用剂量率为63.88cGy/min(1Gy＝100cGy)60Coγ辐照(阴性不照射组不辐照)，辐照剂量为8Gy，辐照结束后放回CO2培养箱中继续培养。
5.辐照后96小时内，每48小时更换一次新鲜的RPMI-1640完全培养基；96h后弃去96孔板中原有的培养基，每孔加入100μL新鲜的RPMI-1640完全培养基；再加入10μL CellTiter
Figure BDA0002896070380000171
Aqueous(Promega公司的单溶液细胞增殖检测试剂盒)，继续于CO2培养箱中培养3小时；然后以酶标仪读取490nm的吸光度值，并记录数据。
6.根据公式1计算出细胞辐照后的存活率。
Figure BDA0002896070380000172
对QZ-1～QZ-53的线性脂肽化合物进行该活性评价，以QZ-1、QZ-4、QZ-5、QZ-8、QZ-10、QZ-11、QZ-12、QZ-15、QZ-18、QZ-25、QZ-30、QZ-32、QZ-40、QZ-41和QZ-42的数据为例，实验结果如表1所示。
表1抗辐射实验的细胞存活率(10μM,
Figure BDA0002896070380000181
n＝3)
Figure BDA0002896070380000182
由表1结果可知，QZ-1、QZ-4、QZ-5、QZ-8、QZ-9、QZ-10、QZ-11、QZ-12、QZ-15、QZ-18、QZ-25、QZ-30、QZ-32、QZ-40、QZ-41和QZ-42在给药浓度为10μM时的抗辐射活性显著强于阴性对照组(P<0.05)，说明这些化合物对HUVEC细胞具有抗辐射作用。这些化合物中，与CBLB612相比，QZ-1、QZ-4、QZ-5、QZ-8、QZ-10、QZ-11、QZ-12、QZ-15、QZ-30、QZ-32和QZ-41在给药浓度为10μM时的抗辐射活性显著强于阳性对照CBLB612(P<0.05)，说明这些化合物对HUVEC细胞具有比CBLB612更好的抗辐射作用；这些化合物中QZ-9、QZ-18、QZ-25、QZ-40和QZ-42在给药浓度为10μM时的抗辐射活性与CBLB612相比相当，但水溶性显著优于CBLB612。
实验三、细胞毒性实验
按实验二同样步骤，仅是步骤3中阳性对照组和待测脂肽组分别加入100μL用RPMI-1640完全培养基稀释的化合物CBLB612和脂肽化合物，使化合物CBLB612和待测脂肽化合物在实验系统中的终浓度分别为10μM，20μM和40μM；且不进行辐照。计算得出细胞存活率，结果见表2。
表2细胞毒性实验的细胞存活率(
Figure BDA0002896070380000183
n＝3)
Figure BDA0002896070380000184
Figure BDA0002896070380000191
表2结果表明，表中线性脂肽化合物在10μM、20μM和40μM的浓度下的细胞存活率与阴性对照组的100％相比，没有显著性差异(P>0.05)，与阳性对照CBLB612相比，也没有显著性差异(P>0.05)，说明表中的线性脂肽化合物与CBLB612一样均没有细胞毒性。
实验四、本发明线性脂肽化合物对内皮细胞IL-6表达的影响
Toll样受体(Toll-like Receptors,TLRs)是存在于脊椎动物和无脊椎动物中高度保守的蛋白。在脊椎动物中，它由6个亚家族组成：TLR1亚家族(包括TLR1、TLR2、TLR6、TLR10、TLR14和TLR15)、TLR3亚家族、TLR4亚家族、TLR5亚家族、TLR7亚家族(包括TLR7、TLR8和TLR9)和TLR11亚家族(包括TLR11和TLR13，均在小鼠体内)。
TLR 2/6信号通路被脂肽化合物激活后，可进一步激活下游信号转导分子，包括MyD88和NF-κB，从而促进下游的多种细胞因子分泌，如TNF-α、G-CSF、IL-6。
其中IL-6主要由淋巴细胞、成纤维细胞(主要是内皮细胞)和单核巨噬细胞产生，属于白细胞介素的一种，并在机体中发挥着多种生物学功能。IL-6可促进激活G0期造血干细胞进入G1期，升高血液中的血小板数量，促进机体的造血功能；同时IL-6可促进T细胞增殖活化，并诱导成熟B细胞成为抗体产生细胞，提高机体的免疫能力。IL-6可以对抗辐射后的机体感染和造血功能损伤，是在辐射防护和治疗中起着重要作用的细胞因子。
通过检测IL-6的水平来反映TLR2的表达量，再通过TLR2的表达量推知TLR 2/6信号通路是否被激活。正常情况下，HUVEC细胞的TLR2表达量低，说明TLR 2/6信号通路未被激活。
实验中：RPMI-1640培养基：gibco公司；四季青胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；0.25％Trypsin-EDTA(1X)：gibco公司；PBS(1×)：gibco公司；注射用硫酸链霉素：山东鲁杭医药股份有限公司；注射用青霉素钠：华北制药股份有限公司；DMSO：北京伊诺凯科技有限公司；Human IL-6elisa kit试剂盒：康朗生物；受试脂肽化合物：QZ-1，QZ-11；阳性对照药：化合物CBLB612；评价指标：HUVEC细胞中IL-6的表达水平。
实验前准备工作：
10％胎牛血清RPMI-1640细胞培养基的配置：向RPMI-1640培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，使其终浓度为10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
1％RPMI-1640完全培养基的配置：向RPMI-1640培养基中加入胎牛血清，使其终浓度为1％。
细胞在37℃，含5％CO2的细胞培养箱中培养。
将受试脂肽化合物和化合物CBLB612分别用DMSO配置为20mM的母液，给药时用RPMI-1640完全培养基稀释为所需的浓度。
实验步骤：
将HUVEC细胞以每孔8×104接种于24孔板，每孔500μl，培养于RPMI-1640的完全培养基(RPMI-1640的完全培养基为含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素培养基的RPMI-1640培养基)培养基中，12h后细胞贴壁后换成1％胎牛血清的RPMI-1640培养基(1％胎牛血清的RPMI-1640培养基为含1％胎牛血清的RPMI-1640培养基)培养基继续培养24小时后换液分别按以下说明干预：
(1)阴性对照组：加入细胞和1％BSA培养基；
(2)待测脂肽化合物组：加入细胞和一种待测脂肽化合物(试验体系中脂肽化合物的终浓度分别为5μM和10μM)；
(3)阳性对照组：加入细胞和化合物CBLB612(试验体系中化合物CBLB612的终浓度分别为5μM和10μM)；
每组设3个平行孔，12和24h后收集上清液50μl，作为样品用于检测。
检测时按照试剂盒的说明书进行操作。
1)标准品的稀释：按倍比稀释标准液，浓度依次为：40ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L，1.25ng/L。
2)配制洗涤液：将10mL洗涤液进行30倍稀释。
3)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加试剂盒中提供的样品稀释液(Human IL-6elisa kit试剂盒中提供的)40μL，然后再加待测样品10μL(即样品被稀释了5倍)。加样时将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
4)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6)加酶：每孔加入酵标试剂50μL，空白孔除外。
7)温育：操作同4。
8)洗涤：操作同5。
9)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
10)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)(测定应在加终止液后15分钟以内进行)。
12)计算：采用EXCEL软件计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。所有标准品和样本的OD值应减去空白孔的OD值，结果如表3所示。
表3两种浓度的脂肽化合物对HUVEC细胞IL-6表达的影响(
Figure BDA0002896070380000211
n＝3)
Figure BDA0002896070380000212
表3可以看出，以内皮细胞的IL-6表达量为指标，在给药剂量为5μM时，QZ-1组(p<0.01)、QZ-11组(p<0.1)与阴性对照组间存在统计学差异，与阳性对照组也存在统计学差异。在给药剂量为10μM时，QZ-1组(p<0.05)、QZ-11组(p<0.1)与阴性对照组间存在统计学差异，QZ-11组与阳性对照组也存在统计学差异。
由于IL-6由内皮细胞产生，是一种在辐射防护和治疗中起着重要作用的细胞因子。本发明脂肽化合物组中的IL-6表达量的表达量升高，说明TLR 2/6信号通路被脂肽化合物激活，进一步激活下游信号转导分子，包括MyD88和NF-κB，从而促进下游的细胞因子IL-6的分泌；即：本发明的线性脂肽化合物可提高内皮细胞的TLR2表达量，进而激活TLR 2/6信号通路，从而促进IL-6的分泌，达到辐射防护和治疗的目的。与阳性对照药相比，QZ-1与阳性对照药效果相当，QZ-11的效果显著优于阳性对照药。
实验五、本发明线性脂肽化合物对辐照后小鼠30天存活率的影响
实验动物：SPF级雄性C57BL/6J小鼠(北京斯贝福生物技术公司)，体重18-22g，动物许可证号SCXK(京)2019-0010，饲养于军事医学科学院实验动物中心，每笼5只，每日饲以鼠料，饮用水置饲养盒上供小鼠自由饮用。
实验试剂：
PBS(1X)：Gibco公司、
生理盐水：石家庄四环有限公司、
其余试剂均为市售分析纯；
待测化合物：本发明脂肽化合物QZ-1，QZ-15；阳性对照药：化合物CBLB612。
将0.2mg的待测化合物(CBLB612、QZ-1和QZ-15)分别溶于100μL丙二醇中，再用PBS稀释到15.0mL，得到阳性对照药溶液和待测化合物溶液，备用；
实验过程：
实验设为4组，每组10只老鼠，分别为辐射对照组(丙二醇与PBS按体积比1：150混合得到的混合溶剂)，阳性对照组(0.25mg/kg)，待测化合物QZ-1组(0.25mg/kg)，待测化合物QZ-15组(0.25mg/kg)。
每组辐照前2h给药一次，均腹腔注射给药，注射量为0.2mL/只。将各组小鼠置于60Coγ射线下用剂量率为54.07cGy/min的60Coγ辐照，辐照剂量为9Gy，使得各组的每只小鼠均接受一次全身照射。
以辐照当天为第0天，观察辐照后第1天至第30天小鼠的存活情况，并于辐照前、辐照射后第1，4，7，10，14，18，22，30天记录小鼠的体重变化情况，结果见表4和表5。
表4小鼠辐照30天后存活数
Figure BDA0002896070380000221
表4可以看出，小鼠在辐照后第11天开始死亡，第17天后不再死亡。辐照对照组小鼠辐照30天后存活0％，脂肽化合物QZ-1组小鼠辐照30天后存活50％，脂肽化合物QZ-15组小鼠辐照30天后存活30％，与辐照对照组相比，均显著优于辐照对照组，具有显著的抗辐射活性。本发明脂肽化合物组与阳性对照组相比，结果相当，说明本发明的脂肽化合物能够延长辐照后小鼠的生存率，具有较好的抗辐射活性。
表5给药小鼠30天体重变化表
Figure BDA0002896070380000231
表5可以看出，各组在辐照后第7天到第14天，体重持续减轻，辐照后18天恢复。其中QZ-1组和QZ-15组的小鼠体重从辐照后第14天至第30天，均显著高于辐射对照组(P<0.05)；QZ-1组小鼠体重从辐照后第14天也显著高于阳性对照组的小鼠，QZ-15组的小鼠体重从辐照后第18天也显著高于阳性对照组的小鼠，说明本发明的脂肽化合物能够逐渐恢复辐照后小鼠的体重，具有显著的抗辐射活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (10)

1.一种线性脂肽化合物，其特征在于，其结构为亲脂性结构片段(QZ)与多肽链(TL-OH)通过酰胺键(CONH)连接形成，其结构式如式Ⅰ所示，
QZ-CONH-TL-OH
式Ⅰ；
QZ代表亲脂性结构片段，结构式如式Ⅱ所示，
Figure FDA0002896070370000011
R1选自棕榈酰，11-氨基十一酰，12-氨基酸十二酰或硫辛酰；
R表示H、棕榈酰、硫辛酰或含有5-20个碳的烷酰基(即CmH2m+1CO，m＝5-20)或烷基末端有氨基取代的含5-20个碳的烷酰基(即NH2CmH2m+1CO，m＝5-20)；
TL代表含有n个氨基酸残基的线性多肽链，n＝4-30，氨基酸残基可以是天然或非天然的氨基酸。
2.根据权利要求1所述线性脂肽化合物，其特征在于，亲脂性结构片段QZ中
R＝H，R1分别选自棕榈酰，11-氨基十一酰，12-氨基酸十二酰或硫辛酰，此时，式Ⅱ化合物(即亲脂性结构片段QZ)可分别表示为Dhc(Pam)2-OH，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH或Dhc(PamALA)-OH。
3.根据权利要求2所述线性脂肽化合物，其特征在于，亲脂性结构片段QZ更优选Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH或Dhc(PamALA)-OH。
4.根据权利要求2所述线性脂肽化合物，其特征在于，Dhc(Pam)2-OH、Dhc(Pam11NC)-OH、Dhc(Pam12NC)-OH、Dhc(PamALA)-OH的logP值分别为12.9322、8.4022、8.9292、8.1062。
5.根据权利要求1-4任一所述线性脂肽化合物，其特征在于，TL的氨基酸排列选自以下氨基酸序列中的一种或几种：YPPAK、LDGDVW、FGLGRLCG、PQGEESNDK、LQGEESNDK、VQGEESNDY、V(ψ)QGEESNDK、VQGEESNDK、SNDKK、GETDK、VQGEESND、VQGEENDK、VQGSNDK、GEESNDK、QGEESNDK、S(ψ)NDKK、S(ψ)KKKK、GEESND、SETDK、GETDS、GETD、VQGEESND-Orn、GETD-Orn、SKKKK、TNDK、LVQGEESNDK、(D)VQGEESNDK、(D)LQGEESNDK、(D)SKKKK、SNDK；其中：ψ是伪肽键CH2NH2，D是d构型的氨基酸；
TL的氨基酸排列优选以下氨基酸序列中的一种或几种：YPPAK、SNDKK、VQGEESNDK、GETDK、LQGEESNDK、QGEESNDK、PQGEESNDK、GETDK、VQGSNDK。
6.根据权利要求2所述线性脂肽化合物，其特征在于，包括以下结构式的化合物(R＝H)：
Dhc(Pam)2-YPPAK-OH(代号：QZ-1)、
Dhc(Pam)2-LDGDVW-OH(代号：QZ-2)、
Dhc(Pam)2-FGLGRLCG-OH(代号：QZ-3)、
Dhc(Pam)2-PQGEESNDK-OH(代号：QZ-4)、
Dhc(Pam)2-LQGEESNDK-OH(代号：QZ-5)、
Dhc(Pam)2-VQGEESNDY-OH(代号：QZ-6)、
Dhc(Pam)2-V(ψ)QGEESNDK-OH(代号：QZ-7)、
Dhc(Pam11NC)-VQGEESNDK-OH(代号：QZ-8)、
Dhc(Pam12NC)-VQGEESNDK-OH(代号：QZ-9)、
Dhc(Pam)2-SNDKK-OH(代号：QZ-10)、
Dhc(Pam11NC)-GETDK-OH(代号：QZ-11)、
Dhc(Pam11NC)-SNDKK-OH(代号：QZ-12)、
Dhc(Pam)2-VQGEESND-OH(代号：QZ-13)、
Dhc(Pam)2-VQGEENDK-OH(代号：QZ-14)、
Dhc(Pam)2-VQGSNDK-OH(代号：QZ-15)、
Dhc(Pam)2-GEESNDK-OH(代号：QZ-16)、
Dhc(Pam11NC)-QGEESNDK-OH(代号：QZ-17)、
Dhc(PamALA)-VQGEESNDK-OH(代号：QZ-18)、
Dhc(PamALA)-GETDK-OH(代号：QZ-19)、
Dhc(Pam)2-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-20)、
Dhc(Pam11NC)-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-21)、
Dhc(PamALA)-V(ψ)QGEESNDK-OH(代号：QZ-22)、
Dhc(Pam)2-S(ψ)KKKK-OH(代号：QZ-23)、
Dhc(Pam)2-GEESND-OH(代号：QZ-24)、
Dhc(Pam)2-SETDK-OH(代号：QZ-25)、
Dhc(Pam)2-GETDS-OH(代号：QZ-26)、
Dhc(Pam)2-GETD-OH(代号：QZ-27)、
Dhc(Pam)2-VQGEESND-Orn-OH(代号：QZ-28)、
Dhc(Pam)2-GETD-Orn-OH(代号：QZ-29)、
Dhc(Pam12NC)-GETDK-OH(代号：QZ-30)、
Dhc(Pam12NC)-SNDKK-OH(代号：QZ-31)、
Dhc(Pam12NC)-QGEESNDK-OH(代号：QZ-32)、
Dhc(Pam12NC)-S(ψ)KKKK-OH(代号：QZ-33)、
Dhc(Pam12NC)-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-34)、
Dhc(PamALA)-SNDKK-OH(代号：QZ-35)、
Dhc(PamALA)-SKKKK-OH(代号：QZ-36)、
Dhc(PamALA)-S(ψ)NDKK-OH(代号：QZ-37)、
Dhc(PamALA)-S(ψ)KKKK-OH(代号：QZ-38)、
Dhc(Pam)2-TNDK-OH(代号：QZ-39)、
Dhc(Pam)2-LVQGEESNDK-OH(代号：QZ-40)、
Dhc(Pam)2-(D)VQGEESNDK-OH(代号：QZ-41)、
Dhc(Pam)2-(D)LQGEESNDK-OH(代号：QZ-42)、
Dhc(Pam)2-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-43)、
Dhc(PamALA)-SNDK-OH(代号：QZ-44)、
Dhc(Pam12NC)-YPPAK-OH(代号：QZ-45)、
Dhc(PamALA)-YPPAK-OH(代号：QZ-46)、
Dhc(Pam11NC)-SNDK-OH(代号：QZ-47)、
Dhc(Pam11NC)-YPPAK-OH(代号：QZ-48)、
Dhc(Pam)2-SNDK-OH(代号：QZ-49)、
Dhc(Pam)2-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-50)、
Dhc(Pam11NC)-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-51)、
Dhc(Pam12NC)-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-52)、
Dhc(PamALA)-(D)SKKKK-OH(代号：QZ-53)。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-6任一所述线性脂肽化合物，以及药学上可接受的盐、载体或赋形剂。
所述药学上可接受的盐可为酸加成盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、对苯甲磺酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、马来酸盐；也可为与碱类形成的盐，如：钠盐、钾盐、镁盐和钙盐等，优选乙酸盐。
8.制备权利要求1-6任一所述线性脂肽化合物的方法，其特征在于，将亲脂性结构片段(QZ)的羧基端与多肽链(TL)的氨基端反应，形成酰胺键，得到亲脂性结构片段(QZ)位于N-末端的线性脂肽。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，当亲脂性结构片段QZ为Dhc(Pam)2-OH，Dhc(Pam11NC)-OH，Dhc(Pam12NC)-OH或Dhc(PamALA)-OH时，结构如式Ⅲ-式Ⅵ所示，其合成路线如式1，式1中式Ⅲ化合物为化合物6，式Ⅳ-式Ⅵ化合物分别为化合物9a-化合物9c，
Figure FDA0002896070370000041
10.权利要求1-6任一所述线性脂肽化合物或权利要求7所述药物组合物在制备预防和/或治疗辐射引起的损伤的药物中的应用；优选的，所述辐射引起的损伤包括急性辐射损伤和慢性辐射损伤(包括恶性肿瘤患者因放疗所致辐射损伤)；更优选的，所述慢性辐射损伤的症状包括辐射可能导致的慢性皮肤损伤、造血障碍、白内障，白细胞、淋巴细胞降低(造血综合征)，恶心、呕吐、腹泻(胃肠综合征)，失眠、嗜睡、多梦、记忆力衰退、食欲不振(神经综合征)等。
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