CN101242852A - 利用脂肽抵抗细胞凋亡的保护方法 - Google Patents

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Abstract

描述了脂肽作为NF－κB诱导物在保护哺乳动物免受细胞凋亡影响中的用途。

Description

利用脂肽抵抗细胞凋亡的保护方法
发明领域
[0001]本发明涉及NF-κB诱导物在保护哺乳动物免受细胞凋亡影响中的用途。更具体地讲，本发明涉及NF-κB诱导物在保护哺乳动物免受应激暴露(例如放疗和癌症治疗)中的用途。
发明背景
[0002]从正常细胞发展成为肿瘤细胞的过程包括生长控制负机制的缺失，包括对生长抑制刺激的抗性和缺乏对生长因子和激素的依赖性。基于辐射或细胞毒药物的传统癌症治疗依赖于正常细胞与恶性细胞生长控制的差异。传统的癌症治疗使细胞遭受严重的基因毒性应激。在这些条件下，大部分正常细胞被阻滞而得以挽救，而肿瘤细胞则持续分裂乃至死亡。
[0003]然而，常规癌症治疗策略的特性使得正常的快速分裂组织或易于凋亡的组织处于危险之中。这些正常的快速分裂细胞的损伤，导致了众所周知的癌症治疗副作用(敏感组织：造血系统、小肠、毛囊)。这类组织的天然敏感性因以下事实而更复杂化：癌细胞在自杀(凋亡)机和治疗过程中频繁获得缺陷，这可引起正常敏感组织死亡，但对癌细胞却无效。减少癌症治疗副作用的常规方法基于(a)使肿瘤细胞对治疗更敏感，(b)使癌症疗法对肿瘤细胞更具特异性，或(c)在治疗后促进正常组织再生(例如红细胞生成素、GM-CSF和KGF)。然而，这些方法都具有有限的有效性。因此，在癌症治疗中，一直都需要减轻化疗和放疗相关副作用的治疗药。本发明正好满足这些需求并提供了其它相关优势。
发明概述
[0004]本文提供保护哺乳动物使其免受一种或多种触发细胞凋亡的条件或治疗(conditions or treatments)的方法。可以给予哺乳动物包含药学上可接受的量的下式化合物的组合物：
Figure A20068002933600051
其中，
R1代表H或-CO-R4，
R2、R3和R4独立地为H或任选取代的C8-C16脂族基；
X为肽；和
Z为S或CH2。
[0005]该肽可包括SEQ ID NO：1-52所示序列。肽的前5个氨基酸可选自表2中所示位置上的氨基酸。该化合物可以是RR立体异构体或RS立体异构体或其混合物。该化合物也可具有下式结构：
Figure A20068002933600052
[0006]触发细胞凋亡的条件可以是辐射、创伤、中毒、感染或温度休克(temperature shock)。触发细胞凋亡的治疗可以是癌症治疗。癌症治疗可以是化疗或放疗。触发细胞凋亡的组织可以是脾、胸腺、胃肠道、肺、肾、肝、心血管系统、血管内皮、神经系统(中枢或周围)、造血祖细胞(骨髓)、免疫系统、毛囊或生殖系统。
[0007]化合物可与辐射防护剂联合给药。辐射防护剂可以是抗氧化剂，例如氨磷汀或维生素E。辐射防护剂也可以是细胞因子，例如干细胞因子。辐射防护剂也可以是鞭毛蛋白、潜在TGFβ(latentTGFβ)或TLR活化剂。
附图简述
[0008]图1表明在小鼠中，p53缺陷加速辐射诱导的胃肠道综合征的发展。图A表示在用p53抑制剂、p53抑制素(pifithrin-alpha，PFT)或DMSO(对照)预治疗之后，暴露给9、12.5、25或5×2.5Gy总体γ辐射量的小鼠存活百分率图。p53失效型小鼠(p53-null mice)也暴露给分次累积辐射剂量12.5Gy(5×2.5Gy)。图B表示暴露给低(10Gy)或高(15Gy)剂量的总体γ辐射量之后，野生型和p53失效型小鼠的存活百分率图。图C表示在用来自野生型或p53失效型小鼠的骨髓(BM)重建之后，暴露给15Gy总体γ辐射量的小鼠的存活百分率图。图D表示在15Gy γ辐射之后指定时间点的苏木精-伊红染色的野生型和p53失效型小鼠肠石蜡切片。24小时的插图表明隐窝区的TUNEL染色。
[0009]图2表示野生型和p53失效型小鼠小肠内细胞增殖和存活动力学。图A(左)表示注射14C-胸苷并用15Gy γ辐射治疗或未治疗的野生型和p53失效型小鼠总体切片的放射自显影图。箭头指向肠。图A(右)显示在15Gy γ辐射后的不同时间点，野生型和p53失效型小鼠小肠的BrdU掺入的显微照片。96小时图像区高倍放大。图B表示在15Gy γ辐射之后不同时间点，野生型和p53失效型小鼠小肠内BrdU阳性细胞/隐窝数量的图。图C表示在15Gy γ辐射之后不同时间点，野生型和p53失效型小鼠小肠内BrdU标记细胞的显微照片。辐射前30分钟注射BrdU，在指定时间点处死小鼠。
[0010]图3表示化合物CBLB601的辐射防护效果。显示在用CBLB601或PBS预治疗之后，暴露给9、12.5、25或5×2.5Gy总体γ辐射量的小鼠存活百分率图。
[0011]图4表示在用CBLB601或PBS预治疗后，暴露给13Gy总体γ辐射量之后的脾脏大小变化。左图是用PBS和CBLB601治疗的小鼠的脾脏重量图，右图是对照或治疗小鼠的脾脏照片。
[0012]图5表示对腹膜内注射CBLB601的最佳时间的判定。图A表示辐射前24、6、1或0.5小时经腹膜内给予PBS或CBLB601之后，暴露给10Gy总体辐射量(TBI)的小鼠存活百分率图。图B表示辐射前96、72、48、24或1小时经腹膜内给予PBS或CBLB601之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。
[0013]图6表示对CBLB601最佳剂量的判定。图A表示辐射前24小时经腹膜内给予PBS或1、3、10、20、30μg CBLB601/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。图B表示辐射前24小时经腹膜内给予PBS或0.1、0.3、1、3、10或15μg CBLB601/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。
[0014]图7表示对CBLB601所保护的辐射剂量的判定。图A表示辐射前24小时经腹膜内给予PBS之后，暴露给10、11、12、13、14或15Gy TBI的小鼠存活百分率图。图B表示辐射前24小时经腹膜内给予3μgCBLB601/小鼠之后，暴露给10、11、12、13、14或15Gy TBI的小鼠存活百分率图。
[0015]图8表示肌内给予CBLB601的辐射防护效果。显示辐射前24小时经腹膜内给予PBS或肌内给予1、3或10μg CBLB601/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。
[0016]图9表示不同剂量辐射和不同剂量CBLB601之后的存活率。显示辐射前24小时经肌内给予PBS或0.3、1、3、10或30μgCBLB601/小鼠之后，暴露给10、11或12Gy TBI的小鼠存活百分率图。
[0017]图10比较通过不同途径给予不同剂量CBLB601之后的存活率。显示辐射前24小时经腹膜内或肌内给予不同剂量CBLB601之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率柱状图。
[0018]图11比较通过不同途径给予不同剂量CBLB601(以μg/kg计)之后的存活率。显示辐射前24小时经腹膜内或肌内给予不同剂量CBLB601之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。
[0019]图12表示对肌内注射CBLB601的最佳时间的判定。图A表示辐射前24、6、3或1小时或者辐射后1或3小时，经肌内给予PBS或3μgCBLB601/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。图B表示辐射前48、36、24、12或6小时，经肌内给予PBS或3μgCBLB601/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。图C表示辐射后1小时，经肌内给予PBS或1、3、10或30μg CBLB601/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活百分率图。
[0020]图13比较了CBLB601的给药时间和给药途径与存活率的关系。表明在辐射前不同时间，经腹膜内或肌内给予3μg CBLB601/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活率柱状图。
[0021]图14表示在最佳辐射防护条件下，在30天对CBLB601的剂量修饰因子(Dose Modification Factor at day30，DMF30)的判定。表明在辐射前24小时，经肌内给予PBS或3μg CBLB601/小鼠之后，暴露给不同辐射剂量的小鼠存活百分率图。
[0022]图15表示来自辐射对照和CBLB601治疗小鼠的脾脏平均重量的图。描绘了在辐射前24小时，经肌内给予PBS或3μg CBLB601/小鼠之后，暴露给0、6或10Gy TBI的小鼠脾脏重量/体重的比率图。
[0023]图16表示在辐射后8、18或20周用鞭毛蛋白免疫的CNLB601治疗小鼠的免疫应答。图A显示初次免疫后1个月各组的免疫应答。图B显示初次放血后1个月各组的免疫应答。图C显示第3次免疫后10天针对不同组鞭毛蛋白的第二次免疫应答。
[0024]图17是在表达TLR2/TLR6异型二聚体的293细胞中，不同剂量CBLB613和CBLB601对NF-κB报道分子的活化图。
[0025]图18表示在表达TLR2/TLR6异型二聚体的293细胞中，不同CBLB化合物对NF-κB报道分子的活化图。图A表示不同剂量的CBLB601、CBLB612、CBLB614或CBLB615对NF-κB的活化作用。图B表示不同剂量的CBLB601、CBLB612、CBLB614或CBLB615对NF-κB的活化作用，以及相应游离肽的无活化作用。
[0026]图19是在表达TLR2/TLR6异型二聚体的293细胞中，不同剂量的CBLB617和CBLB601对NF-κB报道分子的活化图。
[0027]图20表示CBLB613的辐射防护活性。显示辐射前24小时，经肌内给予PBS或0.3、1、3、10、30或82.5μg CBLB613/小鼠之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活率图。
[0028]图21表示CBLB612、CBLB614和CBLB615的辐射防护活性。显示辐射前24小时，经肌内给予PBS或不同剂量CBLB612、CBLB614或CBLB615之后，暴露给10Gy TBI的小鼠存活率图。
[0029]图22表示CBLB612的缓和活性。显示暴露给8.5、9或10Gy TBI 1小时后，用50μg CBLB612/小鼠或PBS治疗的小鼠存活百分率图。
发明详述
[0030]本文提供保护正常细胞和组织以免因各种应激而引起的细胞凋亡的方法。细胞凋亡的正常功能是“清除”组织中的创伤或遗传损伤细胞，而细胞因子则动员机体的防御系统对抗应激。然而，在严重损伤条件下，这两种应激反应机制本身也会引起死亡。例如，在造血系统、免疫系统和消化系统中发生的大量细胞凋亡可导致辐射致死。
[0031]细胞内有两种主要机制控制细胞凋亡：p53(促凋亡)途径和NF-κB途径(抗凋亡)。这两种途径在肿瘤中都经常被解除管制：p53可以失去，而NF-κB可成为组成型活性。因此，在正常细胞中p53的抑制和/或NF-κB的活化可保护它们以免因应激而死亡。在癌症治疗中这样的方法将不会使肿瘤细胞对治疗更具抗性，因为它们的控制机制已经被解除管制。这与p53和NF-κB的常规观点是相矛盾的，认为它们分别是活化和阻遏的靶标。
[0032]如本文所述，可以诱导NF-κB活性以保护正常细胞免于细胞凋亡。在哺乳动物正常细胞中诱导NF-κB活性可保护细胞以免因细胞应激而导致的细胞凋亡。一旦正常细胞从应激中恢复，NF-κB活性就可恢复到正常水平。对于瞬时诱导的NF-κB活性而言，可以保护细胞免于各种应激。这可提供对炎症反应及受损组织和器官的细胞生命死亡决定的控制。
[0033] NF-κB的保护作用可由编码以下蛋白质的多基因转录活化而介导：a)阻断这两种主要凋亡途径的抗凋亡蛋白，b)诱导造血干细胞和其它干细胞增殖和存活的细胞因子和生长因子，和c)强效ROS清除抗氧化蛋白，例如MnSOD(SOD-2)。因此，例如通过NF-κB的瞬时活化用于辐射防护，不仅在癌症患者中可以达到对细胞凋亡的抑制，而且能够降低继发性癌症发病率，因为如果NF-κB的活化由Toll样受体介导，可达到它的同时免疫刺激作用。
[0034]将NF-κB途径作为靶标的另一个吸引人的特性就是它通过众多天然因子而活化。这其中有多种病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)。PAMP仅在微生物中存在，而在宿主生物中不存在，这对于大量病原体而言是特征性的，而且不容易发生突变。它们由Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)识别，该受体是先天免疫的关键性传感组件。TLR起到免疫系统的最早警告机制的作用，即通过诱导免疫细胞直接或通过细胞因子释放而迁移和活化。TLR是I型膜蛋白，已知以同型二聚体和异型二聚体起作用。一旦结合配体，TLR募集MyD88蛋白(一种对大多数TLR而言的必不可少的信号转导连接物)。随之而来的信号转导级联导致包括以下活化在内的作用：(i)NF-κB途径的活化，和(ii)MAPK的活化，包括Jun N端激酶(JNK)的活化。与细胞因子不同，许多PAMP除了活化TLR之外几乎没有其它作用，因此不太可能产生副作用。此外，在人体内存在大量的TLT(TLR1-TLR10)。与它们的免疫细胞活化功能一致，所有TLR都可在脾脏和外周血白细胞中表达，在其它淋巴样器官和白细胞亚类中具有更高TLR特异性表达模式。所有TLR也在皮肤和呼吸道、肠道和泌尿生殖道的内皮和粘膜上皮细胞中表达。
1.定义
[0035]应当知道，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，不得视为限制性的。必须注意的是，本说明书和所附权利要求书所用的术语前未加数词修饰时包括复数形式，除非另有明确说明。
[0036]术语“给药”当用于描述NF-κB活性的诱导物剂量时，是指诱导物的单剂量或多剂量。
[0037]本文所用的术语“脂族基”是指非支链、支链或环状烃基，可以是取代或未取代的，也可以是饱和或不饱和的，但是不为芳族基。术语脂族基还包括烃主链中含有一个或多个碳原子被氧、氮、硫或磷原子置换的脂族基。
[0038]本文中单用或联用的术语“烷基”是指支链或非支链、饱和脂族基。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。
[0039]本文中单用或联用的术语“烯基”是指支链或非支链、不饱和脂族基，可在链上任何稳定位点含有至少一个碳-碳双键。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、E-戊烯基、Z-戊烯基、癸烯基等。
[0040]本文中单用或联用的术语“炔基”是指支链或非支链、不饱和脂族基，可在链上任何稳定位点含有至少一个碳-碳三键。炔基的代表性实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、炔丙基、丁炔基、己炔基、癸炔基等。
[0041]术语“类似物”当用于肽或多肽的情况下，是指包含一个或多个非标准氨基酸或来自常规氨基酸组的其它结构变异体的肽或多肽。
[0042]本文所用的术语“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类抗体或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab′)2、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能性抗体及其衍生物。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，并对所需表位或其来源序列表现出足够的结合特异性。抗体也可以是嵌合抗体。可通过连接一种或多种化学物质、肽或本领域已知的多肽部分而衍生抗体。抗体可以与化学部分缀合。
[0043]本文所用的术语“细胞凋亡”是指细胞死亡形式，包括细胞体积逐渐收缩并保持细胞器的完整性；通过光学显微镜或电子显微镜可观察到的染色质凝聚(即核凝聚)；和/或通过离心沉降法测定的DNA断裂成核小体大小的片段。当细胞的膜完整性丧失(例如膜起泡(membrane blebbing))时，发生细胞死亡，同时完整细胞片段(“凋亡体(apoptotic body)”)被吞噬细胞吞入。
[0044]本文所用的术语“癌症”是指特征为对凋亡刺激具有抗性的任何疾病。
[0045]本文所用的术语“癌症治疗”是指本领域已知的任何用于癌症的治疗，包括但不限于化疗和放疗。
[0046]术语“联用”当用于描述给予NF-κB活性的诱导物和额外治疗时，是指可在给予额外治疗之前、同时或之后给予诱导物，或其组合。
[0047]术语“衍生物”当用于肽或多肽的情况下，是指不同于一级结构(氨基酸和氨基酸类似物)的肽或多肽。为了说明，衍生物可因糖基化的不同而不同，这样的糖基化是一种翻译后修饰形式。例如，肽或多肽可因在异源系统中表达而表现出糖基化模式。如果这些肽或多肽保留了至少一种生物活性，那么它们就是本发明的衍生物。其它衍生物包括但不限于具有共价修饰N-端或C-端的融合肽或融合多肽，PEG化肽或多肽，与脂质部分缔合的肽或多肽，烷基化肽或多肽，通过氨基酸侧链官能团与其它肽、多肽或化学物质连接的肽或多肽，以及本领域可以理解的额外修饰。
[0048]术语“片段”当用于肽或多肽的情况下，可指长度约6个至约10个氨基酸的肽。片段长度可以是6、7、8、9或10个氨基酸。
[0049]术语“同源物”当用于肽或多肽的情况下，是指共享共同进化祖先的肽或多肽。
[0050]本文所用的术语“饱和”是指主链原子上所有可用价键都与其它原子连接的基团。
[0051]本文所用的术语“取代”是指从碳上去掉一个或多个氢或其它原子并被额外基团取代的基团。本文的取代基可以被1-5个或1-3个取代基取代。这类取代基的代表性实例包括但不限于脂族基、芳族基、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、卤素、芳氧基、羰基、丙烯基、氰基、氨基、硝基、含磷基团、含硫基团、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、酰基氨基、脒基、亚氨基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、烷基亚磺酰基、三氟甲基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、杂芳基、脲氨基、硫代脲氨基、马来酰亚胺基、肟基、亚胺酸酯基(imidate)、环烷基、环烷基羰基、二烷基氨基、芳基环烷基、芳基羰基、芳基烷基羰基、芳基环烷基羰基、芳基次膦酰基、芳基烷基次膦酰基、芳基环烷基次膦酰基、芳基膦酰基、芳基烷基膦酰基、芳基环烷基膦酰基、芳基磺酰基、芳基烷基磺酰基、芳基环烷基磺酰基、其组合及其取代基团。
[0052]术语“治疗”当用于保护哺乳动物免于疾病时，是指预防、抑制、阻遏或消除疾病。预防疾病是指在疾病发作之前将本发明组合物给予哺乳动物。抑制疾病是指在疾病诱发之后、但在临床表现之前将本发明组合物给予哺乳动物。阻遏疾病是指在疾病临床表现之后将本发明组合物给予哺乳动物，使疾病得以减轻或维持。消除疾病是指在疾病临床表现之后将本发明组合物给予哺乳动物，使哺乳动物不再患有该病。
[0053]本文所用的术语“肿瘤细胞”是指特征为对凋亡刺激具有抗性的任何细胞。
[0054]本文所用的术语“不饱和”是指两个相邻主链原子上至少一个可用价键未与其它原子连接的基团。
[0055]本文所用的术语“未取代”是指没有任何额外基团与之连接或取代它的基团。
[0056]术语“变异体”当用于肽或多肽的情况下，是指因氨基酸插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。为了本发明的目的，“生物活性”包括但不限于与特异性抗体结合的能力。本领域认为氨基酸保守取代(即一种氨基酸被另一种具有相似性质(例如亲水性、电荷区的程度和分布)的不同氨基酸取代)通常涉及到少量变化。这些少量变化部分可通过参考氨基酸亲水指数(hydropathic index)而判定，这是本领域已知的(Kyte等，J.Mol.Biol.157：105-132，1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷方面的考虑。本领域已知类似亲水指数的氨基酸可以被取代，但仍保留蛋白质功能。一方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示可导致蛋白质保留生物功能的取代。在肽的情况下，对氨基酸亲水性的考虑允许计算肽的最大局部平均亲水性，这是已报道的与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。美国专利号4,554,101通过引用结合到本文中。具有类似亲水性数值的氨基酸取代可导致肽保留生物活性，例如免疫原性，正如本领域所理解的那样。一方面，用彼此的亲水值在±2之内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水指数和亲水性数值都受到具体氨基酸侧链的影响。与这一观察结果一致的是，认为与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对相似性、特别是这些氨基酸的侧链，正如疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性所揭示的那样。
2.脂肽
[0057]脂肽可用作NF-κB活性的诱导物。脂肽是革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和支原体外膜的组成部分。细菌脂肽没有共享的序列同源性，但其特征都是不常见的N-端氨基酸S-(2，3-二羟基丙基)-L-半胱氨酸，其中2个或3个脂肪酸被酰化。细菌脂肽是强免疫调节剂，在感染后能通过TLR2-TLR1或TLR2-TLR6异源二聚体的信号转导而活化早期宿主反应，导致NF-κB的活化和细胞因子的产生。天然脂肽的N-端脂肽合成类似物是TLR和NF-κB的强效活化剂，以及在体内和体外作为免疫佐剂。
[0058]脂肽可以是下式化合物：
Figure A20068002933600151
其中，
R1代表H或-CO-R4，
R2、R3和R4独立地为H或任选取代的脂族基；
X为H或肽；和
Z为S或CH2。
[0059]脂肽可包含2或3个脂肪酸。R2、R3和R4的脂族取代基可包含6-20个碳原子。R2、R3和R4可以是C6-C20烷基、C6-C20烯基或C6-C20炔基。R2、R3和R4的烷基取代基的代表性实例包括C6、C8、C9、C10、C12、C14和C16。R2、R3和R4的烯基取代基的代表性实例包括C10:1 D1反式、C18:1 D9和C18:2 D9，12。
[0060]肽可包含介于至少4或5个氨基酸且不多于20、30或40个氨基酸。肽部分可能是活性所必需的，脂肽活性可受到氨基酸序列的调节，但是生物活性对大多数肽序列是不敏感的(Spohn等，Vaccine，22(19)：2494-9，2004)。肽可以包含表1所示序列，与其至少具有80％、85％、90％或95％同一性的任何序列，或其任何类似物、衍生物、片段、同源物、变异体或取代物。肽可以携带净负电荷。
表1
 序列   长度   SEQ ID NO
 SNNA     4     1
 GSSHH     5     2
 KQNVS     5     3
 NNSGK     5     4
 QPDRY     5     5
 RPDRY     5     6
 SEEEE     5     7
 SKKKK     5     8
 SNNNA     5     9
 SPPPP     5     10
 GQHHM     5     11
 GQHHH     5     12
 SSHHM     5     13
 GSHHM     5     14
 SQMHH     5     15
 GETDK     5     16
 GEESN     5     17
 GEEDD     5     18
 TENVKE     6     19
 QGEESNDK     8     20
 VQGEESNDK     9     21
 FEPPPATTT     9     22
 GDKYFKETE     9     23
 GDPKHPKSF     9     24
 GGQEKSAAG     9     25
 GPCPGCPPC     9     26
 PPCPGCPPC     9     27
 DNEEKPTPEQD     11     28
 GNGGAPAQPKG     11     29
 FEPPPATTTKSK     12     30
 GNNDESNISFKEK     13     31
 GDPKHPKSFTGWVA     14     32
 AQNPNKTNSNLDSSK     15     33
 NKDNEAEPVTEGNAT     15     34
 SKEGNGPDPDNAAKS     15     35
 GDKTPSTKSAGKVENK     16     36
 GETDKEGKIIRIFDNSF     17     37
 SSTSENNGNGNGNGGTD     17     38
 GNNDESNISFKEKSEEEE     18     39
 GNNDESNISFKEKSKKKK     18     40
 GNNDESNISFKEKSPPPP     18     41
 SSNKSTTGSGETTTAAGT     18     42
 CGNNDESNISFKEKSKKKK     19     43
 GSPLSFESSVQLIVSDNSS     19     44
 SNYAKKVVKQKNHVYTPVY     19     45
 ADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK     21     46
 GAASSLTYESSVQLVVSDNSS     21     47
 GGEPAAQAPAETPAAAAEAAS     21     48
 GQTDNNSSQSQQPGSGTTNT     21     49
 SGALAATSDDDVKKAATVAIVA     22     50
 SIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKK     22     51
 SSGGGGVAADIGAGLADALTAP     22     52
[0061]脂肽的肽部分前4-5个氨基酸的每个位置可选自表2中所示位置上的氨基酸。该表基于Spohn等，Vaccine，22(19)：2494-9，2004；和Reutter等，J.Peptide Res.，65，375-383，2005。
表2
    1     2     3     4     5
    D     D     A     D     D
    E     E     D     E     E
    F     G     E     H     H
    G     K     G     N     K
    K     P     H     R     M
    Q     Q     M     S     N
    R     R     R     T     R
    S     S     S     S
    T     T
[0062]对于N-端脂氨基酸的立体化学结构而言，脂肽可以是RR立体异构体或RS立体异构体或其混合物。脂肽可以是水溶性的。
3.应激的治疗
[0063]NF-κB活性的诱导物可用于保护正常细胞免受引起细胞应激而触发细胞凋亡的条件或治疗。条件或治疗的代表性实例包括癌症治疗，例如放疗或化疗；温度休克；暴露给有害剂量的辐射，例如核电厂、国防工业或放射性药物生产的工人或士兵；细胞衰老；创伤；中毒；和感染。
[0064]所述诱导物可与其它治疗同时或按节奏(metronomically)给予。本文所用的术语“同时”是指所述诱导物和其它治疗可在48小时内给予，优选24小时、更优选12小时、还更优选6小时，最优选3小时或更短时间内给予。本文所用的术语“按节奏”是指所述给药在与其它治疗不同时间中给予诱导物并且以某种频率重复。
[0065]所述诱导物可在暴露给应激之前的任何时间点给予，包括但不限于暴露之前约48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时或1小时。所述诱导物可以在暴露给应激后的任何时间点给予，包括但不限于暴露之后约1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时或48小时。
a.组成型活性的NF-κB癌
[0066]条件可以是组成型活性的NF-κB癌症。NF-κB活性的诱导物可以与癌症治疗(例如化疗或放疗)联合给予。
[0067]癌症治疗可包括给予细胞毒剂或细胞生长抑制药或其组合。细胞毒剂通过以下方法阻止癌细胞繁殖：(1)干扰细胞复制DNA的能力和(2)在癌细胞中诱导细胞死亡和/或细胞凋亡。细胞生长抑制药通过调节、干扰或抑制可调节细胞增殖的细胞信号转导过程而起作用。
[0068]可用作细胞毒剂的化合物类包括以下药物：烷化剂(包括但不限于氮芥(nitrogen mustard)、氮杂环丙烷衍生物、磺酸烷基酯、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀、氮芥(chlormethine)、环磷酰胺(环磷酰胺制剂
Figure A20068002933600191
)、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、曲他胺、塞替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、达卡巴嗪和替莫唑胺；抗代谢药(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁和吉西他滨；天然产物及其衍生物(例如长春花属生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)：长春碱、长春新碱、长春地辛、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、ara-c、紫杉醇(紫杉醇是市售的，称为泰素(Taxol)
Figure A20068002933600192
)、光辉霉素、脱氧考福霉素、丝裂霉素-c、l-天冬酰胺酶、干扰素(优选IFN-α)、依托泊苷和替尼泊苷。
[0069]其它增殖性细胞毒剂是诺维本(navelbene)、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬(droloxafine)。
[0070]影响微管的药物能干扰细胞的有丝分裂，其细胞毒活性是本发明众所周知的。可以使用的影响微管的药物包括但不限于别秋水仙素(NSC 406042)、软海绵素(halichondrin)B(NSC 609395)、秋水仙素(NSC 757)、秋水仙素衍生物(例如NSC 33410)、多拉司他汀10(NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根霉素(NSC 332598)、紫杉醇(泰素
Figure A20068002933600201
，NSC 125973)、泰素
Figure A20068002933600202
衍生物(例如衍生物(例如NSC608832)、硫秋水仙素NSC 361792)、三苯甲基半胱氨酸(NSC83265)、硫酸长春碱(NSC 49842)、硫酸长春新碱(NSC 67574)、天然和合成埃博霉素(包括但不限于埃博霉素A、埃博霉素B)和盘皮海绵内酯(参见Service，(1996)Science，274：2009)雌莫司汀、诺考达唑、MAP4等。这类药物的实例也可参见Bulinski(1997)J.Cell Sci.110：3055 3064；Panda(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：10560-10564；Muhlradt(1997)Cancer Res.57：3344-3346；Nicolaou(1997)Nature 387：268-272；Vasquez(1997)Mol.Biol.Cell.8：973-985；和Panda(1996)J.Biol.Chem 271：29807-29812。
[0071]合适的细胞毒剂还有例如表鬼臼毒素(epidophyllotoxin)；抗肿瘤酶；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；铂配位络合物，例如顺铂和卡铂；生物反应调节剂；生长抑制剂；抗激素治疗药；亚叶酸；替加氟；和造血生长因子。
[0072]可使用的细胞生长抑制药包括但不限于激素和甾体(包括合成类似物)：17α-炔雌醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲泼尼龙、甲睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、hlorotrianisene、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙立德、氟他胺、托瑞米芬和诺雷德。
[0073]其它细胞生长抑制药是抗血管生成药(例如基质金属蛋白酶抑制剂)，而其它VEGF抑制剂(例如抗VEGF抗体)和小分子(例如ZD6474和SU6668)也包括在内。也可使用Genentech公司的抗Her2抗体。合适的EGFR抑制剂是EKB-569(一种不可逆的抑制剂)。也包括对EGFR具有免疫特异性的Imclone抗体C225，以及src抑制剂。
[0074]适宜用作细胞生长抑制药还有康士德
Figure A20068002933600211
(比卡鲁胺，AstraZeneca)，其赋予雄激素依赖性癌非增殖性。细胞生长抑制药的再一个实例是抗雌激素他莫昔芬，其抑制雌激素依赖性乳癌的增殖或生长。细胞增殖信号转导的抑制剂是细胞生长抑制药。代表性实例包括表皮生长因子抑制剂、Her-2抑制剂、MEK-1激酶抑制剂、MAPK激酶抑制剂、PI3抑制剂、Src激酶抑制剂和PDGF抑制剂。
[0075]癌症治疗可包括放疗。放疗可以是体外射线辐射、体内放射治疗或适形放射治疗(conformal radiation therapy)，其中使用计算机以便使辐射波束的形状与肿瘤形状相匹配。放疗所用的辐射可来自各种来源，包括X射线、电子束或γ射线。放疗期间辐射剂量和给予时间可因癌症的部位和程度的不同而异。如上所述，NF-κB活性的诱导物可以与辐射保护剂(参见第3d部分)联合用于放疗。
[0076]可治疗的癌症包括但不限于以下癌症：膀胱癌(包括加速和转移性膀胱癌)、乳癌、结肠癌(包括结肠直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、口腔癌、咽喉癌、食管癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、胆囊癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkinslymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤(Burketts lymphoma)；髓系造血系统肿瘤，包括急慢性骨髓性白血病、骨髓异常增生综合征、骨髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤(schwannomas)；间充质细胞起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenoderma pigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。
b.对癌症治疗副作用的治疗
[0077]条件也可以是对促进组成型活性NF-κB癌治疗的正常组织的破坏。NF-κB活性的诱导物可与如上所述的癌症治疗联用。
c.细胞衰老的调节
[0078]条件也可以是细胞衰老。
d.辐射
[0079]条件也可以是暴露给辐射。暴露给电离辐射(IR)可以是短期或长期，可用单剂量或多剂量，用于全身或局部。因此，核事故或军事进攻可包括单次高剂量的全身辐射(有时随之而来的是放射性同位素的长期中毒)。同样，当需要通过将供体骨髓从宿主血祖细胞中清除掉而准备将宿主造血器官用于供体骨髓时，通常将单剂量辐射用于骨髓移植患者的预治疗。
[0080]在分子和细胞水平上，辐射粒子可导致DNA断裂以及DNA、蛋白质、细胞膜和其它大分子结构之间的交联。电离辐射也可通过产生自由基和活性氧中间体(ROS)而导致对细胞组分的再次破坏。多种修复系统抵抗这类破坏，例如可恢复DNA的完整性和保真性的若干DNA修复途径，以及清除自由基和ROS并使氧化蛋白质和脂质还原的抗氧化化学物质和酶。存在细胞关卡系统，以检查DNA缺陷并延迟细胞周期进程，直到修复破坏或达到让细胞生长停滞或程序性细胞死亡(细胞凋亡)的决定。
[0081]在生物体水平上，中低水平辐射的速效大部分是由细胞死亡引起的，导致辐射引起的炎症。在较高辐射水平上，所谓造血综合征和胃肠综合征导致短期辐射引起的死亡。造血综合征的特点是造血细胞及其祖细胞的损失，因而使其不能更新血液和淋巴系统。死亡通常是感染(因为免疫抑制)、出血和/或贫血的结果。胃肠综合征的特点是肠上皮大量细胞死亡，尤其是在小肠，继而肠壁破裂并因菌血症和脓毒病而死亡。造血综合征在低辐射剂量时就可表现出来，导致比胃肠综合征更迟发的死亡。极高剂量的辐射可通过诱发神经变性而导致几乎立即死亡。
[0082]在辐射的急性毒性期存活的生物体会经历长期后果，包括辐射引起的致癌作用以及在辐射后数月、甚至数年内在暴露器官(例如肾、肝或肺)中发展的纤维化。
[0083]在细胞水平上，NF-κB诱导物具有强烈促生存活性，可用于治疗天然辐射事件、低剂量辐射暴露、作为癌症治疗组成部分的辐射给予或核事故所带来的效应。此外，因为NF-κB诱导物是通过与所有现在已知辐射防护剂都不同的机制起作用，所以它们可用于与其它辐射防护剂联用，因而极大提高了对机体免遭电离辐射的保护程度。
[0084]从历史上看，辐射防护剂一直是抗氧化剂和自由基清除剂，无论是合成的还是天然的。最近，已将细胞因子和生长因子添加到辐射防护剂的列表中；认为其辐射防护机制是因为它们对敏感组织再生的促进作用。两组辐射防护剂之间并无明确的功能上的区别，然而，因为某些细胞因子诱导细胞抗氧化蛋白(例如锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和金属硫蛋白)的表达，所以它们的使用是有利的。
[0085]辐射防护剂可以是治疗辐射暴露效应的任何药物，包括但不限于抗氧化剂、自由基清除剂、细胞因子、鞭毛蛋白和潜在TGFβ。可以使用的抗氧化剂和自由基清除剂包括但不限于硫醇类，例如半胱氨酸、半胱胺、谷胱甘肽和胆红素；氨磷汀(WR-2721)；维生素A；维生素C；维生素E；和黄酮类，例如印度圣罗勒(Ocimum sanctum)、荭草素和葫芦巴苷(vicenin)。细胞因子和生长因子通过补充和/或保护辐射敏感干细胞群体而赋予辐射防护作用。可使用的细胞因子包括干细胞因子(SCF，c-kit配体)、Flt-3配体、白介素-1片段IL-lb-rd和角质形成细胞生长因子(KGF)。一些其它因子(而不是天然细胞因子)可刺激免疫细胞增殖，因此也可以使用。这些因子包括5-AED(5-雄烯二醇)和合成化合物，前者是刺激细胞因子表达的甾体，后者例如三氯(二氧代亚乙基-O，O′-)碲酸铵(AS-101)。潜在TGFβ、鞭毛蛋白和鞭毛蛋白衍生物是NF-κB活性的强诱导物，参见国际专利申请号PCT/US2004/040656和PCT/US2004/040753，以及美国专利申请号60/693,826，所述文献的内容都通过引用结合到本文中。
4.组合物
[0086]本文提供包含治疗有效量的NF-κB诱导物的组合物。组合物可以是用本领域众所周知的方法制备的药物组合物。如上所述，可将包含NF-κB诱导物的组合物给予哺乳动物，用于治疗细胞凋亡相关疾病，包括但不限于辐射暴露、癌症治疗的副作用、应激和细胞衰老。组合物也可包含额外药物，包括但不限于放射保护剂或化疗药。
a.给药
[0087]可按照任何方式给予本文所提供的组合物，包括但不限于口服、胃肠外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过含服给药或它们的组合。胃肠外给药包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内和关节内。对于兽用而言，可以按照常规兽医实践，以适当的可接受制剂形式给予组合物。兽医可以容易地确定特定动物的最适合给药方案和给药途径。
b.配制
[0088]本文所提供的组合物可以呈常规片剂或锭剂形式。例如，口服给药用片剂和胶囊剂可含有常规赋形剂，包括但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和润湿剂。粘合剂包括但不限于糖浆、阿拉伯胶(acacia)、明胶、山梨醇、西黄蓍胶、淀粉和聚乙烯吡咯烷酮胶浆剂。填充剂包括但不限于乳糖、糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和山梨醇。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇和二氧化硅。崩解剂包括但不限于马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠。润湿剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。片剂还可按照本领域众所周知的方法进行包衣。
[0089]本文所提供的组合物可以是液体制剂，包括但不限于水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。组合物也可以配制成干产品，在临用前用水或其它合适溶媒进行配制。这类液体制剂可含有添加剂，包括但不限于悬浮剂、乳化剂、非水溶媒和防腐剂。悬浮剂包括但不限于山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂。乳化剂包括但不限于卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯和阿拉伯胶。非水溶媒包括但不限于食用油、杏仁油、分馏椰子油、油脂、丙二醇和乙醇。防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和山梨酸。
[0090]本文所提供的组合物也可配制成栓剂，其可含有包括但不限于可可脂或甘油酯的栓剂基质。本文所提供的组合物也可配制成以下形式，供吸入给药：包括但不限于溶液剂、混悬剂或乳剂，其可使用抛射剂(例如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷)，以干粉或气溶胶形式给药。本文所提供的组合物也可配制成包含水性或非水溶媒的经皮制剂，包括但不限于乳膏剂、软膏剂、洗剂、糊剂、药用硬膏剂、贴剂或膜剂。
[0091]本文所提供的组合物也可配制成供胃肠外给药用，包括但不限于经注射或连续输注给药。注射用制剂可以呈含油或水性溶媒的混悬剂、溶液剂或乳剂，而且可含有包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂的配方剂(formulation agent)。也可提供粉末状形式的组合物，其可用包括但不限于无菌、无热源水等合适溶媒进行重配。
[0092]本文所提供的组合物也可配制成缓释型制剂，其可经植入或肌内注射给药。组合物可与合适聚合物或疏水材料(例如在可接受的油中的乳剂)、离子交换树脂或微溶的可溶性衍生物(例如微溶的可溶性盐)配制在一起。
c.剂量
[0093]治疗用所需药物的治疗有效量因所治疗疾病的特性、诱导NF-κB活性的所需时间长短、患者年龄和疾病的不同而异，最终由主治医师来判定。然而，一般而言，用于成人治疗的通常剂量范围为0.001mg/kg/天至约200mg/kg/天。剂量可以为约1μg/kg/天至约100μg/kg/天。所需剂量可以按单剂量方便地给予，或者按多剂量以合适时间间隔给予，例如每天2、3、4或更多次分次剂量。通常需要多剂量，因为一旦不再给药，正常细胞内NF-κB活性会下降。
[0094]NF-κB诱导物的剂量可包括但不限于以下任何剂量：约1μg/kg、25μg/kg、50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg、125μg/kg、150μg/kg、175μg/kg、200μg/kg、225μg/kg、250μg/kg、275μg/kg、300μg/kg、325μg/kg、350μg/kg、375μg/kg、400μg/kg、425μg/kg、450μg/kg、475μg/kg、500μg/kg、525μg/kg、550μg/kg、575μg/kg、600μg/kg、625μg/kg、650μg/kg、675μg/kg、700μg/kg、725μg/kg、750μg/kg、775μg/kg、800μg/kg、825μg/kg、850μg/kg、875μg/kg、900μg/kg、925μg/kg、950μg/kg、975μg/kg或1mg/kg。
5.筛选方法
[0095]本文所提供的方法也涉及NF-κB活性的诱导物的鉴定方法。可通过以下方法鉴定NF-κB活性的诱导物：所示方法包括将NF-κB活性的疑似诱导物添加到NF-κB活化表达系统中，将NF-κB活化表达水平与对照进行比较，从而根据增加NF-κB活化表达系统水平的能力而鉴定NF-κB活性的诱导物。
[0096]候选诱导物存在于文库(即一组化合物)中。这样的诱导物可以是例如由表达文库中的DNA分子编码。候选诱导物可存在于条件培养基或细胞提取物中。其它的这类诱导物包括本领域已知称为“小分子”的化合物，其分子量小于105道尔顿，优选小于104道尔顿，还更优选小于103道尔顿。可以以组合文库成员的形式来提供这类候选诱导物，其包括按照多种预定化学反应而制备的合成诱导物(例如肽)。本领域普通技术人员将会知道，可以按照现有方法制备各种这类文库，而且如本文所述，可以同时或序贯筛选候选诱导物文库的成员。
[0097]可按照体外、基于细胞和体内测定等不同方式来进行筛选方法。任何细胞都可用于基于细胞的测定。优选可用的细胞包括哺乳动物细胞，更优选人体细胞和非人灵长类细胞。用遗传修饰的肿瘤细胞表达替代标记，用于活化NF-κB，可进行基于细胞的筛选。这类标记包括但不限于细菌β-半乳糖苷酶、萤光素酶和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。使用包括但不限于比色测定、发光测定和荧光测定等本领域标准技术，可测定替代标记的表达量。
[0098]将疑似调节剂通过例如混合加入到细胞中的条件是这样的条件：其中细胞可经历细胞凋亡或信号转导，如果基本上不存在干扰细胞凋亡或信号转导的其它调节化合物时。有效条件包括但不限于允许细胞生长的合适培养基、温度、pH和氧条件。合适培养基通常为固体或液体培养基，其中含有生长因子和可同化碳源、氮源和磷源，以及合适盐、矿物质、金属和其它营养物，例如维生素，并且包括可培养细胞并使其表现出细胞凋亡或信号转导的有效培养基。例如，对于哺乳动物细胞，培养基可包括含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基。
[0099]细胞可在各种不同容器中培养，包括但不限于组织培养瓶、试管、微量滴定板和培养皿。培养在适于细胞的温度、pH和二氧化碳含量下进行。这样的培养条件也落入本领域技术范围之内。
[0100]将疑似调节物加入到细胞中的方法包括电穿孔、显微注射、细胞表达(即利用表达系统，包括裸核酸分子、重组病毒、逆转录病毒表达载体和腺病毒表达)，使用离子对制剂并且使用去垢剂使细胞透化。
[0101]本发明具有多个方面，由以下非限制性实例予以说明。
实施例1
P53缺陷加速小鼠GI综合征的发展
[0102]哺乳动物电离辐射(IR)的主要死亡原因取决于辐射剂量。在高达9-10 Gy的剂量时，小鼠在12-20天后死亡，主要是因为致死性骨髓耗竭，即造血(HP)综合征。在该剂量时，经辐射的小鼠可以因骨髓移植而得以拯救。接受＞13-15Gy的动物在治疗后7-12天(在造血综合征杀死它们之前)死于小肠损伤并发症，即胃肠(GI)综合征。众所周知，小肠上皮细胞的细胞增殖限制在隐窝，干细胞和早期增殖祖细胞正是位于此处。当一对细胞分裂之后，隐窝干细胞的已分化后代移向绒毛，在绒毛顶端脱落。在小鼠小肠内，细胞的完整“旅程”(即从增殖区室到绒毛顶端)通常需要3-5天。尽管在病理形态学水平上已经充分检查了小肠对γ辐射的反应，但是GI致死性的准确原因，包括初级事件，都尚未搞清楚。死亡是上皮隐窝细胞损伤的直接结果，接着是绒毛剥离，导致流体和电解质失衡、菌血症和内毒素血症。除了炎症和基质反应之外，内皮功能异常看来也是致死的重要因素。
[0103]在HP综合征和GI综合征中，致死组织损伤是由大量p53依赖性细胞凋亡而引起的。此外，已经知道p53依赖性毛发损失(脱发)是实验性化疗或辐射的结果。因此，看来p53在敏化细胞针对基因毒性应激中起作用。
[0104]为了检查p53在辐射诱导死亡中的作用，小鼠用p53小分子抑制剂即p53抑制素(PFTα)治疗(Komarov等，Science 285：1733-7，1999)，然后立即进行γ辐射。C57B1/6J小鼠(6-8周龄的雄性用于此处及以下实验，如果没有另外说明的话)经腹膜内注射10mg/kg PFTα，然后用Shepherd 4000Ci 137铯源，以4Gy/分钟的剂量率进行辐射。PFTα在单次9Gy剂量γ辐射或分次累积辐射剂量12.5Gy(5×2.5Gy)时对小鼠有保护作用。相比之下，PFTα对用单次高剂量IR(即12.5或25Gy)治疗的小鼠的存活率无影响(图1a)。
[0105]为了进一步检查p53在GI综合征中的作用，将野生型和p53缺陷型小鼠暴露给低(10Gy)和高(15Gy)剂量的γ辐射。如图1b所示，p53缺陷型小鼠对能因HP综合征杀死的低剂量辐射具有抗性，但是对能因GI综合征杀死的较高剂量辐射却敏感得多。在15Gy剂量的γ辐射之后0、24、48、72和96小时，用苏木精-伊红染色的野生型和p53失效型小鼠小肠石蜡切片示于图1d。p53缺陷型小鼠表现出加速上皮细胞损伤。24小时的隐窝TUNEL染色表明细胞凋亡在野生型中是明显的，但在p53缺陷型上皮却不明显。为了进一步检查，使野生型小鼠暴露给11Gy总体辐射量，然后在12小时后注射1.5×107来自同基因型C57B1/6J的野生型或p53失效型小鼠的骨髓细胞。(该辐射剂量在非再生对照小鼠中引起100％致死率)。两个月后，当造血系统完全恢复，这两组动物用15Gy总体γ辐射量进行治疗。如图1c所示，这两组骨髓p53状态不同的小鼠之间的死亡率没有差异(两者都具有野生型肠细胞)。
[0106]进一步检查了野生型和p53失效型小鼠的小肠的细胞增殖和细胞存活动力学。4周龄野生型和p53失效型小鼠经腹膜内注射14C-胸苷(10μCi/动物)，然后将每组中的半数动物暴露给15Gy γ辐射。总体切片的放射自显影表明，24小时后p53缺陷型小鼠中肠隐窝细胞继续增殖，而野生型小鼠中肠隐窝细胞却是静息的(图2a，左)。4周龄野生型和p53失效型小鼠用15Gy γ辐射治疗，并在处死前2小时给其注射BrdU(50mg/kg)，对肠进行免疫染色。辐射后24小时，p53失效型小鼠中有许多增殖细胞，但是在野生型小鼠中却几乎没有。相比之下，在96小时，在p53失效型小鼠中几乎没有增殖细胞，而野生型小鼠则表现出更多标记细胞。
[0107]为了进一步表征，在15Gy γ辐射后不同时间点，统计野生型和p53失效型小鼠的小肠内BrdU阳性细胞的数量。每一时间点分析3只动物，每只动物都制备5个髂骨横截面切片并进行显微镜检，以估算隐窝和绒毛数量。在200x放大倍数下，在5个随机视野下统计隐窝中BrdU阳性细胞数量(100-300个隐窝)并绘制BrdU阳性细胞的平均数量(图2b)。p53失效型小鼠中BrdU阳性细胞的数量在10小时达到峰值，随后下降，而野生性小鼠中BrdU阳性细胞的数量在最初20小时下降，然后上升。在15Gy γ辐射后不同时间点，检测野生型和p53失效型小鼠小肠内BrdU标记细胞的位置。辐射前30分钟注射BrdU，在0、48、72和96小时处死小鼠。在p53失效型小鼠中，BrdU标记细胞从隐窝向绒毛加速迁移(在48小时比较野生型和p53失效型小鼠)，接着p53失效型小鼠中的标记细胞快速消除(图2c)。
[0108]因此，已辐射的p53缺陷型上皮隐窝的持续细胞增殖，与隐窝损伤细胞的加速死亡和绒毛的快速破坏有关。然而，在野生型小鼠中，p53通过诱导小肠隐窝的生长停滞而延长存活，因此保持肠的完整性。因此，p53的促凋亡功能促进造血综合征，而其生长停滞功能则延迟胃肠综合征的发展。因此，p53的药理学抑制对GI综合征而言将是无用的(如果无害的话)。因此，需要开发对小肠上皮进行辐射防护的替代方法，所述方法依赖于另一种机制，例如NF-κB的活化和随后对细胞死亡的抑制。
实施例2
脂肽延迟因总体γ辐射引起的小鼠死亡
[0109]脂肽是NF-κB的强效活化剂，本身还可作为例如凋亡性死亡的抑制剂。为了确定脂肽功能是否是作为辐射防护剂，先试验了各种脂肽，以测定最大耐受剂量(MTD)。然后在NIH Swiss小鼠中，在分别暴露给10Gy或13-15Gy总体γ辐射量之后，测定各种脂肽，以测定它们针对致死性造血综合症或nd胃肠综合征的保护作用。辐射前30分钟经皮下给予脂肽(0.3-10μg/小鼠)。提供辐射防护作用的所测脂肽列于表3。
表3
肽序列 SEQ ID NO     肽长度     N-酰化
SKKKK     8     5     R-Pam2
SKKKK     8     5     R-Pam3
FEPPPATTT     22     9     Pam2
GNNDESNISFKEK     31     13     Pam2
GDPKHPKSF     24     9     Pam2
GETDKEGKIIRIFDNSF     37     17     Pam2
[0110]使用＜0.1 MTD的R-PAM2C-SKKKK(SEQ ID NO：8)(在下文中，该化合物称为CBLB601)的代表性实验结果见图3。不出所料，用10Gy辐射的对照小鼠在治疗后11-15天之间死亡，而接受CBLB601的所有小鼠在治疗后存活都超过35天。同样，用13Gy辐射的对照小鼠在治疗后6-10天之间死亡，而接受CBLB601的所有动物(除1只动物之外)在治疗后存活都超过35天。通过测定辐射对脾脏大小的影响，进一步分析CBLB601的辐射防护能力。如图4所示，经CBLB601治疗小鼠的脾脏大小明显表现出较少的缩小。CBLB601对胸腺也有辐射防护作用(数据未显示)。CBLB601有效保护脾细胞、支持胸腺快速恢复并保护GI道免遭辐射损伤的能力都表明，脂肽可用作辐射防护剂。
实施例3
单剂量CBLB601针对总体γ辐射的辐射防护功效
[0111]根据CBLB601活化NF-κB的能力和在NIH-SWISS小鼠体内辐射防护的初步数据，选择CBLB601(一种R-Pam2-脂肽，其肽部分由C-SKKKK(SEQ ID NO：8)组成)作为辐射防护剂用于详细表征(参见实施例2)。该项研究的目的是确定CBLB601作为防护剂的最佳剂量、给药途径和给药时间。使用10-15周龄ICR雌性小鼠，每组或每种条件用10-15只动物。
[0112]通过给ICR小鼠腹膜内(i.p)注射递增剂量的CBLB601(0.3、1、3、10、30、60、100μg/小鼠)，测定NOAEL(无明显副作用水平(No Obvious Adverse Effects Level))的剂量。给对照小鼠注射PBS。观察小鼠两周。在第一周每天给它们称重。CBLB601治疗小鼠与对照小鼠间的体重无差异。治疗后1-2天，在100μg CBLB601/小鼠可见死亡，而更低剂量则没有死亡。然而，在60μg剂量时，在治疗后约3-4天可见小鼠有死亡征兆，例如活动缓慢和毛皮肮脏。在30μg剂量时，治疗小鼠与对照小鼠间没有明显差异。因此，对于CBLB601，确定NOAEL为30μg/小鼠。
[0113]通过在辐射前不同时间注射CBLB601，确定腹膜内给予该化合物的最佳计划。先前，发现CBLB601对10Gy有保护作用，但对更高辐射剂量则没有保护作用(参见实施例2)。因此，所有优化实验都在10Gy总体辐射量(TBI)时进行。选择3μg剂量的BCLB601/小鼠(1/10 NOAEL)作为起始剂量。因此，在10Gy TBI之前0.5小时、1小时、6小时和24小时或1小时、24小时、48小时、72小时、96小时，将3μg CBLB601经i.p注射给ICR小鼠(如实施例1所述)。辐射后，观察小鼠30天并记录其存活情况。将这些实验结果汇总于图5。辐射前24小时注射CBLB601，明显能得到最佳辐射防护作用(90-100％30天存活)。当辐射前48小时给予化合物时，辐射防护作用约为30％。在辐射前1小时给予CBLB601产生不一致的结果，其范围从一个实验的80％防护作用(图5B)，到另一个实验的几乎无保护作用(20％)(图5A)。当TBI之前0.5小时(10％)、6小时(20％)、72小时和96小时给予药物时，没有观察到辐射防护作用。
[0114]为了确定CBLB601的最佳辐射防护剂量，将注射时间和辐射水平保持恒定，而改变CBLB601剂量。在辐射前(10Gy TBI)24小时，ICR小鼠经i.p.注射1、3、10、20或30μg CBLB601/小鼠或0.1、0.3、1、3、10或15μgCBLB601/小鼠，监测其存活情况达30天。最佳防护剂量为3μg/小鼠，保证其存活率为100％(图6A和B)。用1μg和10μg/小鼠的剂量可达到几乎类似的功效，而拯救90％的小鼠(在一个实验)。相比之下，当与辐射联用时，与注射PBS的对照相比，更高剂量的CBLB601(20μg和30μg/小鼠)导致加速死亡。在10μg/小鼠的剂量时，某些联合毒性的征兆是可检测的。因此，确定CBLB601的最佳防护剂量为3μg/小鼠。因此，尽管看来CBLB601在比NOAEL低1 0-30倍剂量时赋予辐射防护作用，但是当CBLB601与辐射联用时，CBLB601的安全界限明显降低。
[0115]为了确定CBLB601所保护的辐射水平，将用辐射防护剂治疗的小鼠和对照小鼠暴露给递增水平的TBI。给ICR小鼠组经i.p.注射3μg CBLB601/小鼠或PBS，然后在24小时后让它们接受10、11、12、13、14和15Gy剂量的TBI。记录30天存活情况。图7A显示注射PBS的小鼠的辐射剂量依赖性死亡率。经10-11Gy TBI辐射的所有小鼠都在辐射后12-14天死亡，这通常是因造血系统衰竭所致的死亡。接受14-15Gy TBI的所有小鼠在辐射后7-9天死亡，这通常是因辐射引起的肠损伤所致的死亡。经12-13Gy TBI辐射的小鼠在中间时间(intermediate time)死亡，这通常是因辐射引起死亡的混合病因所致。图7B显示用CBLB601预治疗的小鼠的辐射剂量依赖性死亡率。不出所料，辐射前24小时注射3μg CBLB601的小鼠针对10Gy TBI具有完全的防护作用。尽管对照小鼠与治疗小鼠间存活率有明显差异，但是CBLB601的防护效果在这种情况下却没有达到统计学上的显著性。为了达到对照小鼠与CBLB601治疗小鼠间有10％的统计显著性差异，必须使用至少50只小鼠的实验组。尽管CBLB601拯救100％经10Gy TBI治疗的小鼠，但是在11Gy TBI时其防护作用仅为20％。高于11Gy的辐射水平则没有防护作用，这表明CBLB601不能从胃肠的辐射毒性成分中拯救动物。此外，与注射PBS的对照小鼠相比，在辐射剂量为11、12和13Gy时，经CBLB601治疗小鼠以加速动力学死亡，即类似于接受14-15Gy剂量的小鼠。这表明药物和辐射的联合毒性。因此，看来在更高辐射水平时，CBLB601不能赋予保护作用，而且它的毒性也更高。
[0116]经肌内给予CBLB601，以确定该化合物的最佳给药途径(尤其是因为这是人用的优选给药途径)。图8显示辐射前24小时经肌内(i.m.)注射1、3或10μg CBLB601/小鼠的小鼠存活率。所有3个剂量的CBLB601都有辐射防护作用；在10μg/小鼠i.m.剂量时没有联合毒性，而10μg/小鼠i.p.剂量时则有联合毒性(图6)。在另一个实验中，针对10、11和12Gy剂量的HBI，测定经i.m.给予的递增剂量的CBLB601(图9)。对于在暴露给10Gy TBI之前，注射更高剂量(10、30μg)CBLB601的小鼠的死亡率增加而言，没有统计学显著性变化。在10Gy TBI之前24小时，经i.p.或i.m.给予CBLB610的辐射防护的剂量依赖性的概述见图10。根据这些数据，得出的结论是i.m.的给药途径与i.p.途径一样有效，对于这两个途径而言最佳剂量(3μg/小鼠)是一样的。此外，得出的结论是经i.m.给药更安全，因为具有更高治疗指数(毒性剂量/有效剂量)：对于i.m.给药为10-30(图8和图9：30μg/小鼠/1-2μg/小鼠)，而对于i.p.给药为3-10(图6：10μg/小鼠/1-3μg/小鼠)。另外，重新计算有效量/体重，表明与肌内给药相比，腹膜内给药具有更小的窗口；即对于i.p.给药为90-110μg/kg，而对于i.m.给药为60-115μg/kg(图11)。
[0117]通过改变给药和辐射间的时间，确定肌内给予CBLB601的最佳计划。在TBI之前24小时、6小时、3小时和1小时以及在TBI之后+1小时、+3小时、以及在TBI之前48小时、36小时、24小时、12小时和6小时，ICR小鼠经i.m.注射3μg CBLB601/小鼠(图12A)(图12B)。这些实验表明，类似于腹膜内给药途径，肌内给予CBLB601的最佳时间为10Gy TBI之前24小时。在10Gy TBI之后(1h和3h)经肌内给予3μg CBLB610/小鼠没有保护效果(图12A)。此外，在10Gy TBI之后1小时，经i.m.注射更高剂量的CBLB601(10和30μg/小鼠)导致联合毒性水平增加(图13C)。这些数据概述于图13。
[0118]为了确定DMF(剂量修正系数(dose modification factor))，在辐射之前24小时经i.m.注射3μg CBLB601/小鼠，而对照小鼠注射PBS。注射药物组和对照组都接受单剂量TBI，剂量范围包括在所选时间间隔内(对于胃肠综合征死亡为7天，而对于造血综合症死亡为30天)引起10-90％死亡率的剂量。绘制死亡率-辐射剂量图，用概率单位(probit)或对数单位(logit)统计学分析求出LD50/7和LD50/30(分别为7天和30天的LD50)。计算DMF(也称为剂量换算系数(dose reductionfactor)，DRF)，为所选存活时间点(7天或30天)的辐射CBLB601治疗组小鼠的辐射LD50和溶媒治疗组小鼠的辐射LD50的比率。为了求出DMF30(辐射后30天的DMF)，测定用PBS治疗小鼠或用3μg CBLB601治疗小鼠的辐射LD50/30值。为此，注射PBS组接受6、6.5、7和7.7Gy剂量的TBI辐射，而注射CBLB601组接受10、10.5、11、11.5和12Gy剂量的TBI。用ProBit分析求出CBLB601的LD50/30，估计范围在11.07-11.61Gy，平均为约11.32Gy(参见图14)。然而，在对照小鼠中与对某些辐射剂量反应有矛盾(在30天7Gy看来无毒，而6.5Gy却引起60％死亡率)，无法准确计算CBLB601的DMF30。然而，预期ICR小鼠的LD50/30约为7 Gy[大多数小鼠品系的平均值；Monobe等，Radiother Oncology 73增刊2：S12709，2004)]。因此，对CBLB601而言的DMF30值粗略估计为约1.6。
实施例4
CBLB601从致死剂量TBI中拯救出来的小鼠的免疫状态
[0119]给予CBLB601而从10Gy TBI中拯救出来的小鼠可具有受损的免疫系统，因此不能“正常”生活。为了检查它们的免疫系统状态，给ICR小鼠注射(i.m.)3μgCBLB601/小鼠或PBS之后24小时，使其暴露给致死(10Gy)或非致死(6Gy)剂量的TBI。正好在第3天处死每种条件的一组5只小鼠，取出它们的脾脏和胸腺并称重。脾脏重量按相应动物的体重标准化，结果见图15。暴露给6Gy辐射并经PBS治疗的小鼠需要约13-14天才能使其脾脏恢复到正常重量，而暴露给6Gy辐射并经CBLB601治疗小鼠到第8天就具有正常脾脏重量。暴露给10Gy TBI的注射PBS的动物不能存活，而注射CBLB601的小鼠不仅在暴露给致死辐射后可以存活，而且在辐射后13-14天还可以完全恢复脾脏重量。需要更长时间(约30天)使其胸腺恢复到正常重量(未显示)。
[0120]在辐射后3、10和30天，经显微镜检查对照和CBLB601注射小鼠脾脏和胸腺的形态变化。辐射之后3天，10Gy总体辐射量的对照和CBLB601治疗小鼠的脾脏和胸腺显示辐射引起的损害，包括脾脏和胸腺的中重度或重度淋巴耗竭，以及脾脏的重度红髓萎缩。在辐射后10天，与对照动物相比，CBLB601治疗动物在脾脏红髓萎缩方面表现出改善；所有CBLB601治疗动物都表现出轻中度多灶性骨髓外造血(EMH)，而对照则都没有表现出EMH。在第10天，这两组都未表现出明显的脾脏白髓耗竭恢复。在第10天，这两组的胸腺再生淋巴增生都很明显，CBLB601治疗小鼠中的再生比对照稍快一些。在辐射后30天，所有动物都有正常脾脏红髓，大多数动物的淋巴元件都完全或几乎完全恢复，所有动物都有基本正常的胸腺。
[0121]为了检测由CBLB601从致死剂量γ辐射(10Gy TBI)中拯救的小鼠的免疫应答，几组这样的小鼠接受强抗原(即沙门氏菌鞭毛蛋白)的免疫。辐射后8、18或20周，小鼠接受初次免疫，在此时它们分别为18、25和33周龄。29周龄的未经辐射的首次用于实验的小鼠用作免疫应答的阳性对照。小鼠在初次免疫后1周接受鞭毛蛋白加强免疫，而且小鼠在第2次加强免疫后3周接受再次加强免疫；测定小鼠血清中的抗鞭毛蛋白抗体效价。为了检测第二次免疫应答，在1月后再次给小鼠放血，以确保抗体效价下降。接着再进行第3次抗原加强注射，并在10天后测定抗鞭毛蛋白抗体效价。在第3次加强免疫时，辐射小鼠为38、30和23周龄，而对照小鼠为34周龄。
[0122]初次免疫后1个月(初次加强免疫后3周)的免疫应答见图16A。CBLN601治疗的辐射小鼠建立了针对鞭毛蛋白的强化体液免疫应答，但无法与首次用于实验的对照小鼠的免疫应答区分开。看来免疫应答水平也不依赖于辐射后的时间，因为所有组都表现出良好应答。尽管在辐射后20周组中有某些个别变异，但是众所周知，在年龄较大的动物中免疫应答可能受损。在第一次放血后1个月再次检查抗体效价，它们在免疫后7周仍然升高(图16B)。第二次免疫应答(图16C)比第一次应答更强烈(图16A)。这些数据充分表明，CBLB601不仅从致死TBI中拯救了小鼠，而且还让功能性免疫系统完全恢复。
实施例5
其它脂肽对NF-KB的活化和辐射防护作用
[0123]合成额外脂肽并检测对NF-κB的活化作用以及对接受致死剂量辐射的小鼠的保护能力。化合物的名称及其关键性成分见表4。对于某些化合物而言，也合成相应的游离肽并对其进行了测试。
表4
化合物名称  N-酰化 肽序列 SEQ ID NO
 CBLB602  Pam2  GQHHH     12
 CBLB603  Pam2  GQHHM     11
 CBLB604  Pam2  GSHHM     14
 CBLB605  Pam2  SQMHH     15
 CBLB606  R-Pam2  GDPKHPKSF     24
 CBLB607  Pam2  GDPKHPKSFTGWVA     32
 CBLB608  Pam2  FEPPPATTTKSK     30
 CBLB611  Pam2  GETDKEGKIIRIFDNSF     37
 CBLB612  R-Pam2  VQGEESNDK     21
 CBLB613  R-Pam2  GETDK     16
 CBLB614  R-Pam2  QGEESNDK     20
 CBLB615  R-Pam2  GEESN     17
 CBLB616  R-Pam2  TENVKE     19
 CBLB617  R-Pam2  GEEDD     18
[0124]在表达TLR2/YLR6异型二聚体的293细胞中测定了NF-κB依赖性报道分子的活性。比较了CBLB613与CBLN601对NF-κB的体外活化作用(图17)。化合物CBLB614和CBLB615都具有CBLB612肽的连续短衍生物(参见表4)。所有3种化合物都活化NF-κB报道分子，而且所有3种都是比CBLB601更好的活化剂(图18A，B)。非棕榈酰化相应肽都不能活化NF-κB报道分子(图18B)。CBLB617的肽组分具有(-4)电荷，可阻止其与带负电荷的细胞表面标记相互作用。比较了CBLB617与CBLB601对NF-κB的活化作用(图19)。表5概述了所有化合物的体外活性和溶解度。
表5
    化合物     溶解度   NF-κB活化
    CBLB601     易溶     100
    CBLB602     难溶     0
    CBLB603     难溶     0
    CBLB604     难溶     0
    CBLB605     难溶     2
    CBLB606     难溶     100
    CBLB607     难溶     2
    CBLB608     易溶     2
    CBLB611     不溶     0
    CBLB612     易溶     200
    CBLB613     溶解     200
    CBLB614     溶解     200
    CBLB615     溶解     200
    CBLB616     未测定     未测定
    CBLB617     溶解     100
[0125]也测定了某些化合物的体内辐射防护活性。ICR小鼠经肌内给予不同剂量的试验化合物，然后在24小时后，使小鼠暴露给10GyTBI。监测存活率达30天。图20显示CBLB613的保护活性。10、30和82.5μg剂量的CBLB613/小鼠与辐射联用时提供100％的保护性，而且无毒(与CBLB601相比)。也测定了相关化合物CBLB612、CBLB614和CBLB615针对10Gy TBI的辐射防护活性。辐射前24小时，将1、3、10和30μg剂量/小鼠(也测定了60μg CBLB612/小鼠)经i.m.注射ICR小鼠。如图21所示，所有3种化合物当给予最高剂量时都提供90-100％辐射防护作用。辐射防护作用明显是剂量依赖性的，与辐射联用无毒。化合物的效力为CBLB612＞CBLB614＞CBLB615。目前使用标准方法评价CBLB617的辐射防护活性。13天后，在最高剂量没有可见毒性(87.5μg/小鼠)，而在10-87.5μg/小鼠剂量时存活率分别为7-90％。总之，与CBLB601相比，CBLB612和CBLB613明显是更好的辐射防护剂，它们的治疗指数更高(对于CBLB612和CBLB613为约20，而对于CBLB601为3)。
[0126]也检查了CBLB612作为低剂量辐射损伤缓和剂的能力。为此，在暴露给8.5、9或10Gy TBI之后1小时经肌内注射50μgCBLB612/小鼠。用CBLB612治疗，能提高各剂量辐射的存活率(图22)。例如，在8.5Gy时，90％CBLB612治疗小鼠和50％PBS治疗小鼠存活27天(p＝0.03)，并且，在9Gy时，70％CBLB612治疗小鼠和50％PBS治疗小鼠存活27天(p＝0.0006)。CBLB612治疗组与对照组之间在更低辐射剂量时没有差异，因为对照小鼠存活率低(未显示)。这些数据表明，CBLB612可用作辐射缓和剂以及辐射防护剂。
序列表
<110>克里夫兰生物实验室公司(Cleveland Biolabs，Inc.)
     Shakhov，Alexander N.
     Gudkov，Andrei
<120>利用脂肽抵抗细胞凋亡的保护方法
<130>050991.0401.01PC00
<150>PCT/US06/022865
<151>2006-06-13
<150>US 60/689,810
<151>2005-06-13
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>1
Ser Asn Asn Ala
1
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>2
Gly Ser Ser His His
1               5
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>3
Lys Gln Asn Val Ser
1               5
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>4
Asn Asn Ser Gly Lys
1               5
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>5
Gln Pro Asp Arg Tyr
1               5
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>6
Arg Pro Asp Arg Tyr
1               5
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>7
Ser Glu Glu Glu Glu
1               5
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>8
Ser Lys Lys Lys Lys
1               5
<210>9
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>9
Ser Asn Asn Asn Ala
1               5
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>10
Ser Pro Pro Pro Pro
1               5
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>11
Gly Gln His His Met
1               5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>12
Gly Gln His His His
1               5
<210>13
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>13
Ser Ser His His Met
1               5
<210>14
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>14
Gly Ser His His Met
1               5
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>15
Ser Gln Met His His
1               5
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>16
Gly Glu Thr Asp Lys
1               5
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>17
Gly Glu Glu Ser Asn
1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>18
Gly Glu Glu Asp Asp
1               5
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>19
Thr Glu Asn Val Lys Glu
1               5
<210>20
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>20
Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys
1               5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>21
Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys
1               5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>22
Phe Glu Pro Pro Pro Ala Thr Thr Thr
1            5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>23
Gly Asp Lys Tyr Phe Lys Glu Thr Glu
1               5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>24
Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe
1               5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>25
Gly Gly Gln Glu Lys Ser Ala Ala Gly
1               5
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>26
Gly Pro Cys Pro Gly Cys Pro Pro Cys
1               5
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>27
Pro Pro Cys Pro Gly Cys Pro Pro Cys
1               5
<210>28
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>28
Asp Asn Glu Glu Lys Pro Thr Pro Glu Gln Asp
1               5                   10
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>29
Gly Asn Gly Gly Ala Pro Ala Gln Pro Lys Gly
1               5                   10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>30
Phe Glu Pro Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Ser Lys
1               5                   10
<210>31
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>31
Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys
1               5                   10
<210>32
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>32
Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe Thr Gly Trp Val Ala
1               5                   10
<210>33
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>33
Ala Gln Asn Pro Asn Lys Thr Asn Ser Asn Leu Asp Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
<210>34
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>34
Asn Lys Asp Asn Glu Ala Glu Pro Val Thr Glu Gly Asn Ala Thr
1               5                   10                  15
<210>35
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>35
Ser Lys Glu Gly Asn Gly Pro Asp Pro Asp Asn Ala Ala Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>36
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>36
Gly Asp Lys Thr Pro Ser Thr Lys Ser Ala Gly Lys Val Glu Asn Lys
1               5                   10                  15
<210>37
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>37
Gly Glu Thr Asp Lys Glu Gly Lys Ile Ile Arg Ile Phe Asp Asn Ser
1               5                   10                  15
Phe
<210>38
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>38
Ser Ser Thr Ser Glu Asn Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Asp
<210>39
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>39
Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys Ser Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Glu
<210>40
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>40
Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys Ser Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys
<210>41
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>41
Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys Ser Pro Pro
1               5                   10                  15
Pro Pro
<210>42
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>42
Ser Ser Asn Lys Ser Thr Thr Gly Ser Gly Glu Thr Thr Thr Ala Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr
<210>43
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>43
Cys Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys Ser Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys
<210>44
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>44
Gly Ser Pro Leu Ser Phe Glu Ser Ser Val Gln Leu Ile Val Ser Asp
1               5                   10                  15
Asn Ser Ser
<210>45
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>45
Ser Asn Tyr Ala Lys Lys Val Val Lys Gln Lys Asn His Val Tyr Thr
1               5                   10                  15
Pro Val Tyr
<210>46
<211>21
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>46
Ala Asp Val Ile Ala Lys Ile Val Glu Ile Val Lys Gly Leu Ile Asp
1               5                   10                  15
Gln Phe Thr Gln Lys
            20
<210>47
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>47
Gly Ala Ala Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Ser Ser Val Gln Leu Val Val
1               5                   10                  15
Ser Asp Asn Ser Ser
            20
<210>48
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>48
Gly Gly Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Ala Glu Thr Pro Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Glu Ala Ala Ser
            20
<210>49
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>49
Gly Gln Thr Asp Asn Asn Ser Ser Gln Ser Gln Gln Pro Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Thr Asn Thr
            20
<210>50
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>  50
Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ser Asp Asp Asp Val Lys Lys Ala Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Ala Ile Val Ala
            20
<210>51
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>51
Ser Ile Val Ser Thr Ile Ile Glu Val Val Lys Thr Ile Val Asp Ile
1               5                   10                  15
Val Lys Lys Phe Lys Lys
            20
<210>52
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>52
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Ala Leu Thr Ala Pro
            20

Claims (21)

1. 一种保护哺乳动物免受一种或多种触发细胞凋亡的治疗或条件影响的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物包含药用有效量的下式化合物的组合物：
Figure A2006800293360002C1
其中，
R1代表H或-CO-R4，
R2、R3和R4独立地为H或任选取代的C8-C16脂族基；
X为肽；和
Z为S或CH2。
2. 权利要求1的方法，其中所述条件选自辐射、创伤、中毒、感染和温度休克。
3. 权利要求2的方法，其中所述条件是辐射。
4. 权利要求1的方法，其中所述治疗是癌症治疗。
5. 权利要求4的方法，其中所述治疗是化疗或放疗。
6. 权利要求1的方法，其中所述肽是SEQ ID NO：21。
7. 权利要求1的方法，其中所述肽包括SEQ ID NO：1-52中的任一序列。
8. 权利要求1的方法，其中所述肽的前5个氨基酸选自表2中所示位置上的氨基酸。
9. 权利要求1的方法，其中所述肽包括选自SEQ ID NO：8、16、17、18、20和21的序列及其取代序列。
10. 权利要求9的方法，其中R1为H，R2和R3为C16脂族基或其取代基团。
11. 权利要求1的方法，其中所述化合物为RR立体异构体或RS立体异构体或其混合物。
12. 权利要求1的方法，其中所述化合物具有下式结构：
Figure A2006800293360003C1
13. 权利要求3的方法，其中所述组合物与辐射防护剂联合给药。
14. 权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是抗氧化剂。
15. 权利要求14的方法，其中所述抗氧化剂选自氨磷汀和维生素E。
16. 权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是细胞因子。
17. 权利要求16的方法，其中所述细胞因子是干细胞因子。
18. 权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是鞭毛蛋白。
19. 权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是潜在TGFβ。
20. 权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是TLR活化剂。
21. 权利要求1的方法，其中在选自以下的组织中触发细胞凋亡：脾、胸腺、胃肠道、肺、肾、肝、心血管系统、血管内皮、中枢神经系统、周围神经系统、造血祖细胞(骨髓)、免疫系统、毛囊和生殖系统。
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