ES2539490T3 - Métodos para proteger frente a apoptosis usando lipopéptidos - Google Patents

Métodos para proteger frente a apoptosis usando lipopéptidos Download PDF

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ES2539490T3 ES12190223.3T ES12190223T ES2539490T3 ES 2539490 T3 ES2539490 T3 ES 2539490T3 ES 12190223 T ES12190223 T ES 12190223T ES 2539490 T3 ES2539490 T3 ES 2539490T3
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Abstract

Un compuesto para uso en un método para proteger a un mamífero de los efectos de uno o más tratamientos o afecciones que desencadenan la apoptosis, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto, en donde dicho compuesto es de la fórmula:**Fórmula** en la que, R1 representa H o -CO-R4, R2, R3 y R4 son independientemente H o alifático C6-C20 sustituido opcionalmente; X es un péptido; y Z es S o CH2, y el péptido consiste en no más de 40 aminoácidos y comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID Nos: 8, 16, 17, 18, 20, 21 y 24.

Description

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fragmento, homólogo, variante o sustitución de la misma. El péptido puede llevar una carga neta negativa. Tabla 1
Secuencia
Longitud SEQ ID NO
SNNA
4 1
GSSHH
5 2
KQNVS
5 3
NNSGK
5 4
QPDRY
5 5
RPDRY
5 6
SEEEE
5 7
SKKKK
5 8
SNNNA
5 9
SPPPP
5 10
GQHHM
5 11
GQHHH
5 12
SSHHM
5 13
GSHHM
5 14
SQMHH
5 15
GETDK
5 16
GEESN
5 17
GEEDD
5 18
TENVKE
6 19
QGEESNDK
8 20
VQGEESNDK
9 21
FEPPPATTT
9 22
Secuencia
Longitud SEQ ID NO
GDKYFKETE
9 23
GDPKHPKSF
9 24
GGQEKSAAG
9 25
GPCPGCPPC
9 26
PPCPGCPPC
9 27
DNEEKPTPEQD
11 28
GNGGAPAQPKG
11 29
FEPPPATTTKSK
12 30
GNNDESNISFKEK
13 31
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GDPKHPKSFTGWVA
14 32
AQNPNKTNSNLDSSK
15 33
NKDNEAEPVTEGNAT
15 34
SKEGNGPDPDNAAKS
15 35
GDKTPSTKSAGKVENK
16 36
GETDKEGKIIRIFDNSF
17 37
SSTSENNGNGNGNGGTD
17 38
GNNDESNISFKEKSEEEE
18 39
GNNDESNISFKEKSKKKK
18 40
GNNDESNISFKEKSPPPP
18 41
SSNKSTTGSGETTTAAGT
18 42
CGNNDESNISFKEKSKKKK
19 43
GSPLSFESSVQLIVSDNSS
19 44
SNYAKKVVKQKNHVYTPVY
19 45
ADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK
21 46
GAASSLTYESSVQLVVSDNSS
21 47
GGEPAAQAPAETPAAAAEAAS
21 48
GQTDNNSSQSQQPGSGTTNT
21 49
SGALAATSDDDVKKAATVAIVA
22 50
SIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKK
22 51
SSGGGGVAADIGAGLADALTAP
22 52
Los primeros cuatro a cinco aminoácidos del resto peptídico de un lipopéptido se pueden seleccionar de aquellos listados para cada posición en la Tabla 2. Esta tabla está basada en Spohn et al., Vaccine, 22(19):2494-9, 2004; y Reutter et al., J. Peptide Res., 65, 375-383, 2005.
Tabla 2
1
2 3 4 5
D
D
A
D
D
E
E
D
E
E
F
G E H H
G
K G N K
K
P H R M
Q
Q
M S N
R
R
R
T
R
S
S
S
S
T
T
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carboplatino; modificadores de la respuesta biológica; inhibidores del crecimiento; agentes terapéuticos antihormonales; leucovorina; tegafur; y factores de crecimiento hematopoyéticos.
Los agentes citostáticos que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a, hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos): 17 -etinilestradiol, dietilestilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, acetato de megestrol, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolido, flutamida, toremifeno y zoladex.
Otros agentes citostáticos son antiangiogénicos, tales como inhibidores de metaloproteinasas de la matriz, y también están incluidos otros inhibidores de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF y moléculas pequeñas tales como ZD6474 y SU6668. También pueden utilizarse los anticuerpos anti-Her2 de Genentech. Un inhibidor de EGFR adecuado es EKB-569 (un inhibidor irreversible). También están incluidos el anticuerpo C225 Imclone inmunoespecífico para el EGFR y los inhibidores de src.
También es adecuado para usarse como un agente citostático Casodex (bicalutamida, Astra Zeneca) que hace que los carcinomas dependientes de andrógenos se vuelvan no proliferativos. Otro ejemplo más de un agentes citostático es el antiestrógeno Tamoxifen que inhibe la proliferación o crecimiento del cáncer de mama dependiente de estrógenos. Los inhibidores de la transducción de señales celulares proliferativas son agentes citostáticos. Los ejemplos representativos incluyen inhibidores del factor de crecimiento epidérmico, inhibidores de Her-2, inhibidores de la MEK-1 quinasa, inhibidores de la MAPK quinasa, inhibidores de PI3, inhibidores de la Src quinasa e inhibidores de PDGF.
El tratamiento del cáncer puede comprender terapia con radiación. La terapia con radiación puede ser radiación con rayo externo, terapia con radiación interna o terapia con radiación conformada, en la que se usa un ordenador para dar forma al rayo de la radiación para que coincida con la forma del tumor. La radiación usada en la terapia con radiación puede proceder de una variedad de fuentes, incluyendo un rayo x, rayo de electrones o rayos gamma. Las dosis y momento de la administración de la radiación durante la terapia con radiación pueden variar y variarán dependiendo de la localización y magnitud del cáncer. El agente que induce actividad la de NF-B puede administrarse con un agente radioprotector (véase la sección 3d) en combinación con la terapia con radiación, como se ha descrito anteriormente.
Los cánceres que pueden tratarse incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: carcinoma incluyendo el de vejiga (incluyendo cáncer de vejiga acelerado y metastásico), mama, colon (incluyendo cáncer colorrectal), riñón, hígado, pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas y adenocarcinoma de pulmón), ovario, próstata, testículos, tracto genitourinario, sistema linfático, laringe, páncreas (incluyendo carcinoma pancreático exocrino), boca, faringe, esófago, estómago, intestino delgado, colon, recto, vesícula biliar, cuello del útero, tiroides y piel (incluyendo carcinoma de células escamosas); tumores hematopoyéticos del linaje linfoide incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de células pilosas, linfoma histiocítico y linfoma de Burkett; tumores hematopoyéticos del linaje mieloide incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide y leucemia promielocítica; tumores del sistema nervioso central y periférico incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimático incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer de tiroides folicular y teratocarcinoma.
b. Tratamiento de los efectos secundarios del tratamiento del cáncer
La afección también puede ser daño al tejido normal atribuible al tratamiento de un cáncer con NF-B constitutivamente activo. El agente que induce la actividad de NF-B puede administrarse en combinación con un tratamiento del cáncer como se ha descrito anteriormente.
c. Modulación del envejecimiento celular
La afección también puede ser el envejecimiento celular.
d. Radiación
La afección también puede ser exposición a radiación. La exposición a radiación ionizante (IR) puede ser a corto o largo plazo, puede aplicarse como una única dosis o múltiples dosis, en el cuerpo completo o localmente. Así, los accidentes nucleares o ataques militares pueden implicar la exposición a una única dosis alta de irradiación del cuerpo completo (algunas veces seguida de un envenenamiento a largo plazo con isótopos radiactivos). Asimismo, una única dosis de radiación se usa generalmente para el pretratamiento de pacientes con trasplante de médula ósea cuando es necesario preparar los órganos hematopoyéticos del huésped para la médula ósea del donante "limpiándolos" de los precursores sanguíneos del huésped.
A nivel molecular y celular, las partículas de radiación pueden dar lugar a rotura en el ADN y al entrecruzamiento entre ADN, proteínas, membranas celulares y otras estructuras macromoleculares. La radiación ionizante también
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puede inducir un daño secundario en los componentes celulares elevando los radicales libres y las especies de oxígeno reactivas (ROS). Múltiples sistemas de reparación contrarrestan este daño, tales como varias rutas de reparación del ADN que restauran la integridad y fidelidad del ADN, y compuestos químicos y enzimas antioxidantes que secuestran los radicales libres y ROS y reducen las proteínas y lípidos oxidados. Los sistemas de regulación del ciclo celular están presentes para detectar los defectos del ADN y retrasar la progresión del ciclo celular hasta que el daño se repara o se toma una decisión para destinar a la célula a parada del crecimiento o muerte celular programada (apoptosis).
A nivel de organismo, los efectos inmediatos de niveles bajos y moderados de radiación están causados en gran medida por la muerte celular, que da lugar a inflamación inducida por radiación. A niveles mayores de radiación, los denominados síndromes hematopoyéticos y gastrointestinales dan lugar a la muerte inducida por radiación a corto plazo. El síndrome hematopoyético se caracteriza por la pérdida de células hematopoyéticas y sus progenitores, haciendo de esta manera imposible regenerar la sangre y el sistema linfoide. La muerte ocurre habitualmente como una consecuencia de infección (debida a inmunosupresión), hemorragia y/o anemia. El síndrome gastrointestinal se caracteriza por muerte celular masiva en el epitelio intestinal, predominantemente en el intestino delgado, seguido de la desintegración de la pared intestinal y muerte por bacteriemia y sepsis. El síndrome hematopoyético se manifiesta en sí mismo a dosis menores de radiación y da lugar a una muerte más retrasada que el síndrome gastrointestinal. Unas dosis muy altas de radiación pueden causar una muerte casi instantánea por incitación de la degeneración neuronal.
Los organismos que sobreviven un periodo de toxicidad aguda de radiación pueden padecer consecuencias a largo plazo que incluyen carcinogénesis y fibrosis inducidas por radiación que se desarrollan en los órganos expuestos (por ejemplo, riñón, hígado o pulmones) meses e incluso años después de la irradiación.
Los inductores de NF-B poseen una fuerte actividad pro-supervivencia al nivel celular y pueden usarse para tratar los efectos de los eventos de la radiación natural, exposición a dosis bajas de radiación, radiación administrada como parte de terapia del cáncer o accidentes nucleares. Además, como los inductores de NF-B actúan a través de mecanismos diferentes de todos los radioprotectores conocidos actualmente, pueden usarse en combinación con otros radioprotectores, incrementando de esta manera dramáticamente la escala de protección frente a la radiación ionizante.
Históricamente, los radioprotectores han sido generalmente antioxidantes y secuestradores de radicales libres -tanto sintéticos como naturales. Más recientemente, las citoquinas y los factores de crecimiento se han añadido a la lista de radioprotectores; se considera que el mecanismo de su radioprotección se debe a su efecto facilitador de la regeneración de los tejidos sensibles. No existe una distinción funcional clara entre los dos grupos de radioprotectores, sin embargo, como algunas citoquinas inducen la expresión de las proteínas celulares antioxidantes, tales como manganeso superóxido dismutasa (MnSOD) y metalotioneína, su uso puede ser ventajoso.
Los radioprotectores pueden ser cualquier agente que trata los efectos de la exposición a la radiación incluyendo, pero no limitado a, antioxidantes, secuestradores de radicales libres, citoquinas, flagelina y TGF latente. Los antioxidantes y los secuestradores de radicales libres que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a, tioles, tales como cisteína, cisteamina, glutatión y bilirrubina; amifostina (WR-2721); vitamina A; vitamina C; vitamina E; y flavonoides tales como albahaca sagrada de la India (Ocimum sanctum), orientina y vicenina. Las citoquinas y factores de crecimiento confieren radioprotección reponiendo y/o protegiendo las poblaciones de células madre radiosensibles. Las citoquinas que pueden usarse incluyen factor de células madre (SCF, ligando c-kit), ligando Fit-3, interleuquina-1 fragmento IL-1b-rd y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF). Varios otros factores, aunque no de naturaleza citoquina, estimulan la proliferación de los inmunocitos, y así, pueden usarse. Éstos incluyen, 5-AED (5-androstenediol), que es un esteroide que estimula la expresión de citoquinas, y compuestos sintéticos, tales como tricloro(dioxoetilen-O,O') telurato de amonio (AS-101). El TGF latente, flagelina y derivados de flagelina son inductores fuertes de la actividad de NF-B como se muestra en las Solicitudes de Patente Internacional Nos. PCT/US2004/040656 y PCT/US2004/040753 y en la Solicitud de Patente U.S. No. 60/693.826.
4. Composición
En la presente memoria también se proporcionan composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un inductor de NF-B. La composición puede ser una composición farmacéutica, que puede producirse usando métodos muy conocidos en la técnica. Como se ha descrito anteriormente, la composición que comprende un inductor de NF-B puede administrarse a un mamífero para el tratamiento de afecciones asociadas con la apoptosis incluyendo, pero no limitado a, exposición a radiación, efecto secundario de los tratamientos del cáncer, estrés y envejecimiento celular. La composición también puede comprender agentes adicionales incluyendo, pero no limitado a, un radioprotector o un fármaco quimioterapéutico.
a. Administración
Las composiciones proporcionadas en la presente memoria pueden administrarse de cualquier manera incluyendo, pero no limitado a, oralmente, parenteralmente, sublingualmente, transdérmicamente, rectalmente,
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tipo salvaje, sin embargo, p53 prolonga la supervivencia induciendo la parada del crecimiento en las criptas del intestino delgado, preservando de esta manera la integridad del intestino. Así, la función proapoptótica de p53 promueve el síndrome hematopoyético, mientras que su función de parada del crecimiento retrasa el desarrollo del síndrome gastrointestinal. Así, la supresión farmacológica de p53 sería inútil (si no perjudicial) frente al síndrome GI. Por lo tanto, es necesario desarrollar estrategias alternativas para la radioprotección del epitelio del intestino delgado que se basarán en otro mecanismo, tal como, por ejemplo, la activación de NF-B e inhibición posterior de la muerte celular.
Ejemplo 2
Lipopéptidos retrasan la muerte de ratones causada por irradiación gamma de cuerpo entero
Los lipopéptidos son activadores potentes de NF-B y, como tales, pueden actuar como inhibidores de la muerte apoptótica. Para determinar si los lipopéptidos funcionan como radioprotectores, varios lipopéptidos se ensayaron inicialmente para determinar la dosis máxima tolerable (MTD). Varios lipopéptidos se ensayaron entonces para medir su efecto protector en ratones NIH Swiss frente a síndromes letales hematopoyéticos y/o gastrointestinales después de exposición a 10 Gy ó 13-15 Gy de radiación gamma de cuerpo entero, respectivamente. Los lipopéptidos (0,3-10 g/ratón) se administraron subcutáneamente 30 minutos antes de la irradiación. Los lipopéptidos ensayados que proporcionaron radioprotección se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Secuencia del Péptido
SEQ ID NO Longitud del Péptido N-acilación
SKKKK
8 5 R-Pam2
SKKKK
8 5 R-Pam3
FEPPPATTT
22 9 Pam2
GNNDESNISFKEK
31 13 Pam2
GDPKHPKSF
24 9 Pam2
GETDKEGKIIRIFDNSF
37 17 Pam2
Los resultados de un experimento representativo usando R-PAM2C-SKKKK (SEQ ID NO: 8) (de aquí en adelante, este compuesto se denomina, CBLB601) a <0,1 MTD se muestran en la Fig. 3. Como se esperaba, los ratones control irradiados con 10 Gy murieron entre 11 y 15 días después del tratamiento, mientras que todos los animales que recibieron CBLB601 vivieron más allá de 35 días después del tratamiento. De manera similar, los ratones control irradiados con 13 Gy murieron entre 6 y 10 días después del tratamiento, mientras que todos menos un animal que recibieron CBLB601 vivió más allá de 35 días después del tratamiento. La capacidad radioprotectora de CBLB601 se analizó adicionalmente midiendo el efecto de la radiación en el tamaño del bazo. Como se muestra en la Fig. 4, los ratones tratados con CBLB601 mostraron una reducción significativamente menor en el tamaño del bazo. CBLB601 también protegió el timo de la radiación (datos no mostrados). La capacidad de CBLB601 de proteger eficazmente los esplenocitos, apoyar la recuperación rápida del timo y proteger el tracto GI del daño por radiación indica que los lipopéptidos pueden usarse como radioprotectores.
Ejemplo 3
Eficacia radioprotectora de una única dosis de CBLB601 frente a irradiación gamma de cuerpo entero
CBLB601, un lipopéptido R-Pam2 con el resto peptídico que consiste en C-SKKKK (SEQ ID NO: 8), se seleccionó para una caracterización más detallada como un radioprotector tomando como base su capacidad de activar NF-B y los datos preliminares in vivo sobre radioprotección en ratones NIH-SWISS (véase el Ejemplo 2). Los objetivos de este estudio fueron determinar la dosis, ruta de administración y tiempo de administración óptimos de CBLB601 para funcionar como un protector. Se usaron ratones hembra ICR de 10-15 semanas de edad, con 10-15 animales por grupo o afección.
La dosis de NOAEL (nivel sin efectos adversos obvios) se determinó inyectando intraperitonealmente (i.p) a ratones ICR dosis crecientes de CBLB601 (0,3, 1, 3, 10, 30, 60, 100 g/ratón). A los ratones control se les inyectó PBS. Los ratones se observaron durante dos semanas. Durante la primera semana se pesaron diariamente. No hubo diferencias en el peso entre los ratones tratados con CBLB601 y control. Se observó mortalidad 1-2 días después del tratamiento a 100 g de CBLB601/ratón, pero no a ninguna de las dosis menores. Sin embargo, a la dosis 60 g, los ratones mostraron signos de morbilidad, tales como movimiento lento y pelo desaliñado, alrededor de 3-4 días después del tratamiento. A la dosis 30 g, no hubo diferencias notorias entre los ratones tratados y control. Así, se
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refuerzo de flagelina una semana después de la primera inmunización y otro refuerzo tres semanas después del 2º refuerzo; se midieron las titulaciones del anticuerpo anti-flagelina en el suero de los ratones. Para ensayar la respuesta inmune secundaria, los ratones se sangraron de nuevo un mes después para asegurar la reducción de las titulaciones de anticuerpo. Esto se siguió por un 3er refuerzo de la inyección de antígeno y la medida de las titulaciones de anticuerpos anti-flagelina 10 días después. En el momento del 3er refuerzo, los ratones irradiados tenían 38, 30 y 23 semanas de edad y los ratones control tenían 34 semanas de edad.
La respuesta inmune un mes después de la primera inmunización (tres semanas después del primer refuerzo) se muestra en la Fig. 16A. Los ratones irradiados tratados con CBLB601 generaron una respuesta inmune humoral robusta frente a la flagelina que fue indistinguible de la de los ratones control sin estimular. También resultó que el nivel de respuesta inmune no era dependiente del tiempo que había pasado después de la irradiación, ya que todos los grupos presentaron una buena respuesta. Aunque había alguna variación individual en el grupo de 20 semanas después de la irradiación, se sabe bien que la respuesta inmune puede estar alterada en los animales más viejos. Se comprobaron de nuevo las titulaciones de anticuerpo un mes después del primer sangrado, y todavía estaban elevadas siete semanas después de la inmunización (Fig. 16B). La respuesta inmune secundaria (Fig. 16C) fue más fuerte que la primera respuesta (Fig. 16A). Estos datos indican encarecidamente que CBLB601 no sólo rescató a los ratones de TBI letal, sino que también permitió una restauración completa de un sistema inmune funcional.
Ejemplo 5
Activación de NF-B y radioprotección proporcionada por otros lipopéptidos
Se sintetizaron lipopéptidos adicionales y se ensayaron para activación de NF-B y su capacidad de proteger a ratones de dosis letales de radiación. Los nombres de los compuestos y sus constituyentes clave se muestran en la Tabla 4. Para algunos de los compuestos, también se sintetizaron y ensayaron los péptidos libres correspondientes.
Tabla 4
Nombre del compuesto
N-acilación Secuencia del péptido SEQ ID NO
CBLB602
Pam2 GQHHH 12
CBLB603
Pam2 GQHHM 11
CBLB604
Pam2 GSHHM 14
CBLB605
Pam2 SQMHH 15
CBLB606
R-Pam2 GDPKHPKSF 24
CBLB607
Pam2 GDPKHPKSFTGWVA 32
CBLB608
Pam2 FEPPPATTTKSK 30
CBLB611
Pam2 GETDKEGKIIRIFDNSF 37
CBLB612
R-Pam2 VQGEESNDK 21
CBLB613
R-Pam2 GETDK 16
CBLB614
R-Pam2 QGEESNDK 20
CBLB615
R-Pam2 GEESN 17
CBLB616
R-Pam2 TENVKE 19
CBLB617
R-Pam2 GEEDD 18
La actividad informadora dependiente de NF-B se midió en células 293 que expresaban el heterodímero TLR2/TLR6. La activación in vitro de NF-B por CBLB613 fue comparable a la de CBLB601 (Fig. 17). Los compuestos CBLB614 y CBLB615 tienen derivados sucesivamente más cortos del péptido de CBLB612 (véase la Tabla 4). Los tres compuestos activaron el informador NF-B y todos fueron mejores activadores que CBLB601 (Fig. 18A, B). Ninguno de los péptidos no palmitoilados correspondientes activó el informador NF-B (Fig. 18B). El componente peptídico de CBLB617 tiene una carga (-4), que debería evitar que interaccionara con marcadores de la superficie celular cargados negativamente. La activación de NF-B de CBLB617 fue comparable a la de CBLB601 (Fig. 19). La Tabla 5 resume la actividad in vitro y la solubilidad de todos los compuestos.
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