PT1904084E - Métodos de proteção contra apoptose mediante uso de lipopéptidos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS DE PROTECÇÃO CONTRA APOPTOSE MEDIANTE USO DE

LIPOPÉPTIDOS

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao uso de indutores de NF-κΒ para proteger mamíferos dos efeitos de apoptose. Mais especificamente, esta invenção refere-se ao uso de indutores de NF-κΒ para proteger mamíferos de exposição a tensão (stress), tais como tratamentos com radiação e tratamentos de cancro.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A progressão de células normais para células tumorais envolve uma perda de mecanismos negativos de regulação de crescimento que incluem resistência a estímulos inibidores de crescimento e uma falta de dependência a factores de crescimento e hormonas. Tratamentos tradicionais de cancro que se baseiam em radiação ou fármacos citotóxicos dependem das diferenças no controlo de crescimento de células normais e malignas. Tratamentos tradicionais de cancro submetem as células a severa tensão genotóxica. Sob essas condições, a maioria das células normais fica detida e, portanto, preservada, enquanto as células tumorais continuam a dividir-se e morrem.

Entretanto, a natureza de estratégias de tratamentos convencionais de cancro é tal que tecidos normais que se dividem rapidamente ou que são propensos a apoptose ficam em risco. Dano a essas células normais que se dividem rapidamente causa os efeitos colaterais bem conhecidos de 1 tratamento de cancro (tecidos sensíveis: hematopoese, intestino delgado, folículos pilosos). A sensibilidade natural de tais tecidos é complicada pelo fato de que células cancerosas frequentemente adquirem defeitos na maquinaria suicida (apoptótica) e procedimentos terapêuticos que causam morte em tecidos normais sensíveis poderão não ser eficazes sobre células cancerosas. Tentativas convencionais para minimizar os efeitos colaterais de terapias de cancro baseiam-se em (a) tornar células tumorais mais susceptíveis a tratamento, (b) tornar terapias de cancro mais específicas a células tumorais ou (c) promover regeneração de tecido normal após tratamento (por exemplo, eritropoietina, GM-CSF e KGF). Cada um desses procedimentos, no entanto, tem eficácia limitada. Como resultado, continua a haver uma necessidade de agentes terapêuticos para mitigar os efeitos colaterais associados à quimioterapia e terapia com radiação no tratamento de cancro. Esta invenção preenche essa necessidade e proporciona outras vantagens afins.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Proporciona-se aqui uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula: 2 *3 em que Ο Λ

R

o-ch9I 2 O-CH

Ο

Rx representa H ou -CO-R4, R2, R3 e R4 independentemente são H ou Cs-Ci6 alifático opcionalmente substituído;

X é um péptido compreendendo SEQ ID NO: 21 e Z é S ou CH2. 0 composto poderá ser um estereoisómero RR ou RS ou mistura destes. 0 composto poderá também ser de fórmula:

C16 ο η δΑ fcl M

A composição da presente invenção pode ser usada num método para a produção de um mamífero relativamente aos efeitos de um ou mais tratamentos ou de uma condição que desencadeie a apoptose. A condição que desencadeie a apoptose poderá ser radiação, 3 ferimento, envenenamento, infecção ou choque de temperatura. 0 tratamento que dispara apoptose poderá ser um tratamento de cancro. 0 tratamento de cancro poderá ser quimioterapia ou terapia com radiação. 0 tecido em que apoptose é disparada poderá ser o baço, timo, trato GI, pulmões, rins, fígado, sistema cardiovascular, endotélio dos vasos sanguíneos, sistema nervoso (central ou periférico), células hematopoiéticas progenitoras (medula óssea), sistema imune, folículos pilosos ou o sistema reprodutor. 0 composto poderá ser administrado em combinação com um radioprotector. 0 radioprotector poderá ser um antioxidante, tal como amifostina ou vitamina E. 0 radioprotector poderá também ser uma citocina, tal como factor de células-tronco. 0 radioproctetor poderá também ser flagelina, TGFP latente ou um activador de um TLR.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra que deficiência de p53 acelera o desenvolvimento de síndrome gastrointestinal induzido por radiação em camundongos. 0 painel A apresenta gráficos da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 9; 12,5; 25 ou 5 x 2,5 Gy de radiação-gama de corpo inteiro após pré-tratamento com um inibidor de p53, pifitrina-alfa (PFT) ou DMSO (controlo). Camundongos p53 nulo foram também expostos à dose de radiação cumulativa fraccionada de 12,5 Gy (5 x 2,5 Gy). 0 painel B apresenta gráficos da sobrevivência percentual de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo após exposição a doses baixas (10 Gy) ou altas (15 Gy) de radiação-gama de corpo inteiro. O painel C apresenta um gráfico que ilustra a sobrevivência percentual de 4 camundongos expostos a 15 Gy de radiação-gama de corpo inteiro após reconstituição com medula óssea (BM) do tipo selvagem ou camundongos p53 nulo. 0 painel D apresenta secções intestinais parafinadas coradas com hematoxilina-eosina de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo nos pontos de tempo indicados após 15 Gy de radiação-gama. Insectos em 24 h mostram coração TUNEL de regiões crípticas. A Figura 2 ilustra a dinâmica de proliferação e sobrevivência celulares no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo. 0 painel A (esquerda) mostra auto-radiografias de secções de corpo inteiro de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo injectado com l^C-timidina que foram tratados com 15 Gy de radiação-gama ou não tratados. Setas apontam para os intestinos. 0 painel A (direita) mostra fotomicrografias de incorporação de BrdU no intestino delgado camundongos do tipo selvagem e p53 nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy de radiação-gama. Regiões das imagens de 96 h são mostradas sob ampliação maior. 0 painel B apresenta um gráfico do número de células positivas a BrdU/criptas no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy de radiação-gama. 0 painel C apresenta fotomicrografias de células marcadas com BrdU no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy de radiação-gama. BrdU foi injectado 30 min antes de irradiação e os camundongos foram sacrificados nos momentos de tempo indicados. A Figura 3 ilustra o efeito radioprotector do composto, CBLB601. São mostrados gráficos da percentagem de 5 sobrevivência de camundongos expostos a 9; 12,5; 25 ou 5 x 2,5 Gy de radiação-gama de corpo inteiro após pré-tratamento com CBLB601 ou PBS. A Figura 4 ilustra alterações no tamanho do baço após exposição a 13 Gy de radiação-gama de corpo inteiro após pré-tratamento com CBLB601 ou PBS. À esquerda está um gráfico de pesos de baços de camundongos tratados com PBS e CBLB601 e à direita estão imagens de baços dos camundongos de controlo ou tratados. A Figura 5 ilustra a determinação do tempo óptimo para injecção intraperitoneal de CBLB601. 0 painel A mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de irradiação de corpo inteiro (TBI) após administração intraperitoneal de PBS ou CBLB601 24, 6, 1 ou 0,5 h antes de irradiação. O painel B mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal de PBS ou CBLB601 96, 72, 48, 24 ou 1 h antes de irradiação. A Figura 6 ilustra a determinação da dose óptima de CBLB601. O painel A mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal de PBS ou 1, 3, 10, 20, 30 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. O painel B mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal de PBS ou 0,1; 0,3; 1; 3; 10 ou 15 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. A Figura 7 ilustra a determinação da dose de radiação protegida por CBLB601. O painel A mostra um gráfico da 6 sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 Gy de TBI após administração intraperitoneal de PBS 24 h antes de irradiação. O painel B mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 Gy de TBI após administração intraperitoneal de 3 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. A Figura 8 ilustra o efeito radioprotector de administração intramuscular de CBLB601. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal de PBS ou administração intramuscular de 1, 3 ou 10 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. A Figura 9 representa a sobrevivência após diferentes doses de radiação e diferentes doses de CBLB601. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10, 11 ou 12 Gy de TBI após administração intramuscular de PBS ou 0,3; 1; 3; 10 ou 30 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. A Figura 10 compara sobrevivência após diferentes doses de CBLB601 serem administradas via diferentes rotas. É mostrado um gráfico de barras da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal ou intramuscular de diferentes doses de CBLB601 24 h antes de irradiação. A Figura 11 compara sobrevivência após diferentes doses de CBLB601, expressas como pg/kg, serem administradas via diferentes rotas. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após 7 administração intraperitoneal ou intramuscular de diferentes doses de CBLB601 24 h antes de irradiação. A Figura 12 ilustra a determinação do tempo óptimo para injecção intramuscular de CBLB601. 0 painel A mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intramuscular de PBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 24, 6, 3 ou 1 h antes de irradiação ou 1 ou 3 h após irradiação. O painel B mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intramuscular de PBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 48, 36, 24, 12 ou 6 h antes de irradiação. O painel C mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intramuscular de PBS ou 1, 3, 10 ou 30 pg de CBLB601/camundongo 1 h após irradiação. A Figura 13 compara sobrevivência como função do tempo de administração e via de administração de CBLB601. É mostrado um gráfico de barras da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal ou intramuscular de 3 pg de CBLB601/camundongo em vários tempos antes de irradiação. A Figura 14 ilustra a determinação do Fator de Modificação de Doses no 30° dia (DMF30) para CBLB601 sob as condições radioprotectoras óptimas. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a várias doses de radiação após administração intramuscular de PBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. A Figura 15 apresenta um gráfico dos pesos médios de baços de camundongos de controlo irradiados e camundongos tratados com CBLB601. É traçada a razão de peso do baço por peso corporal de camundongos expostos a 0, 6 ou 10 Gy de TBI após administração intramuscular de PBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. A Figura 16 representa as respostas imunes de camundongos tratados com CNLB601 que foram imunizados com flagelina 8, 18 ou 20 semanas após irradiação. O painel A mostra a resposta imune dos diferentes grupos um mês após a primeira imunização. O painel B mostra a resposta imune dos diferentes grupos um mês após a primeira sangria. O painel C mostra a resposta imune secundária a flagelina dos diferentes grupos 10 dias após a terceira imunização. A Figura 17 é um gráfico da activação de um repórter NF-kB por várias doses de CBLB613 e CBLB601 em 293 células que expressam o heterodimero TLR2/TLR6. A Figura 18 apresenta a activação de um repórter NF-κΒ por vários compostos de CBLB em 293 células que expressam o heterodimero TLR2/TLR6. O painel A apresenta activação de NF-κΒ por várias doses de CBLB601, CBLB612, CBLB614 ou CBLB615. O painel B apresenta activação de NF-κΒ por várias doses de CBLB601, CBLB612, CBLB614 ou CBLB615 e nenhuma activação pelos péptidos livres correspondentes. A Figura 19 é um gráfico da activação de um repórter NF-kB por várias doses de CBLB617 e CBLB601 em 293 células que expressam o heterodimero TLR2/TLR6. A Figura 20 ilustra a actividade radioprotectora de CBLB613. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração 9 intramuscular de PBS ou 0,3; 1; 3; 10; 30 ou 82,5 μg de CBLB613/camundongo 24 h antes de irradiação. A Figura 21 ilustra a actividade radioprotectora de CBLB612, CBLB614 e CBLB615. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intramuscular de PBS ou várias doses de CBLB612, CBLB614 ou CBLB615 24 h antes de irradiação.

A Figura 22 ilustra a actividade mitigadora de CBLB612. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos tratados com 50 pg de CBLB612/camundongo ou PBS 1 h após exposição a 8,5; 9 ou 10 Gy de TBI.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Proporciona-se aqui o uso de uma composição de acordo com a invenção num método de protecção de células e tecidos normais de apoptose causada por uma variedade de tipos de tensões. A apoptose normalmente funciona de modo a "limpar" tecidos de células feridas ou geneticamente danificadas, enquanto citocinas mobilizam o sistema de defesa do organismo contra a tensão. Entretanto, sob condições de dano grave, ambos os mecanismos de resposta a tensão podem eles mesmos actuar como causa de morte. Por exemplo, letalidade em consequência de radiação poderá resultar de apoptose maciça que ocorre em sistemas hematopoéticos, imunes e digestivos. Há dois importantes mecanismos de controlo de apoptose na célula: o caminho p53 (pró-apoptótico) e o caminho NF-kB (anti-apoptotico). Ambos os caminhos são frequentemente desregulados em tumores: p53 poderá perder-se, enquanto 10 NF-κΒ poderá tornar-se constitutivamente activo. Portanto, inibição de p53 e/ou activação de NF-κΒ em células normais poderão protegê-las de morte causada por tensões. Tal abordagem no tratamento de cancro não tornaria as células tumorais mais resistentes a tratamento porque elas poderão já apresentar esses mecanismos de controlo desregulados. Isso contradiz a visão convencional sobre p53 e NF-κΒ, que são considerados como alvos para activação e repressão, respectivamente.

Como descrito neste relatório, actividade de NF-κΒ poderá ser induzida para proteger células normais de apoptose. Mediante indução de actividade de NF-κΒ em um mamífero, células normais poderão ser protegidas de apoptose atribuível a tensão celular. Uma vez que as células normais se tenham recuperado da tensão, actividade de NF-κΒ poderá ser restaurada a níveis normais. Induzindo temporariamente actividade de NF-κΒ, as células poderão ser protegidas de vários tipos de tensões. Isso poderá proporcionar controlo tanto de respostas inflamatórias quanto das decisões vida-morte de células de tecidos e órgãos danificados. 0 papel protector de NF-κΒ poderá ser mediado por activação transcricional de genes múltiplos que codificam: a) proteínas anti-apoptóticas que bloqueiam ambos os importantes caminhos apoptóticos, b) citocinas e factores de crescimento que induzem proliferação e sobrevivência de células hematopoiéticas e outras células-tronco, e c) potentes proteínas antioxidantes que sequestram ROS, tal como MnSOD (SOD-2). Assim, por exemplo, por meio de activação transiente de NF-κΒ para radioprotecção, poderá ser possível obter não só supressão de apoptose em pacientes de cancro, como também a capacidade de reduzir a 11 taxa de incidência secundária de cancro devido a seus efeitos imunoestimuladores simultâneos, o que poderá ser obtido se a activação de NF-κΒ é mediada por receptores semelhantes a Toll.

Uma outra propriedade atraente do caminho NF-κΒ como alvo é sua activação por numerosos factores naturais. Entre estes estão múltiplos padrões moleculares associados a patogéneos (PAMPs). PAMPs estão presentes somente em microorganismos e não são encontrados no organismo hospedeiro, são caracteristicos de grandes grupos de patogéneos e não podem ser facilmente submetidos a mutação. Eles são reconhecidos por receptores semelhantes a Toll (TLRs), os elementos-chave sensores de imunidade inata. TLRs actuam como um primeiro mecanismo de advertência do sistema imune mediante indução de migração e activação de células imunes directamente ou através de liberação de citocina. TLRs são proteínas de membranas tipo I, como 0 funcionamento conhecido como homo e heterodímeros. Após ligação com ligante, TLRs recrutam proteína MyD8 8, um indispensável adaptador de sinalização para a maioria dos TLRs. A cascata de sinalização que se segue conduz a efeitos que incluem (i) activação de caminho NF-κΒ e (ii) activação de MAPKs, incluindo Jun quinase com término N (JNK). Diferentemente de citocinas, muitos PAMPs apresentam pequeno efeito além de activação de TLRs e, assim, improvavelmente produzem efeitos colaterais. Além disso, numerosos TLTs (TLR1-TLR10) estão presentes em seres humanos. Consistentes com sua função de activação de imunócitos, todos os TLRs são expressos no baço e leucócitos de sangue periférico, com padrões de expressão mais específicos a TLR em outros órgãos linfóides e subconjuntos de leucócitos. Todos os TLRs são também expressos nas células endoteliais e 12 epiteliais mucosas da pele e dos tratos respiratórios, intestinais e genitourinários. 1. Definições

Deve-se entender que a terminologia usada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não pretende ser limitativa. Deve-se observar que, como usadas no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o (a)" incluem referentes plurais, a não ser que o contexto dite claramente o contrário. 0 termo "administrar", quando usado para descrever a dosagem de um agente que induz actividade de NF-kB, significa uma única dose ou doses múltiplas do agente. 0 termo "alifático", como usado neste relatório, refere-se a um grupo hidrocarboneto não-ramifiçado, ramificado ou ciclico, que poderá ser substituído ou não-substituído e que poderá ser saturado ou insaturado, mas que não é aromático. 0 termo alifático adicionalmente inclui grupos alifáticos, que compreendem átomos de oxigénio, nitrogénio, enxofre ou fósforo que substituem um ou mais carbonos da cadeia principal do hidrocarboneto. 0 termo "alquila", como usado neste relatório, isoladamente ou em combinação refere-se a um grupo alifático ramificado ou não-ramifiçado saturado. Exemplos representativos de grupos alquila incluem, mas sem se limitar aos mesmos, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, octila, decila, tetradecila, hexadecila, eicosila, tetracosila e similares. 13 0 termo "alquenila", como usado neste relatório, isoladamente ou em combinação refere-se a um grupo alifático ramificado ou não-ramifiçado insaturado que contém pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono que poderá ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia. Exemplos representativos de grupos alquenila incluem, mas sem se limitar aos mesmos, etenila, E- e Z-pentenila, decenila e similares. 0 termo "alquinila", como usado neste relatório, isoladamente ou em combinação refere-se a um grupo alifático ramificado ou não-ramifiçado insaturado que contém pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono que poderá ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia. Exemplos representativos de grupos alquinila incluem, mas sem se limitar aos mesmos, etinila, propinila, propargila, butinila, hexinila, decinila e similares. 0 termo "análogo", quando usado no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido que compreende um ou mais aminoácidos não-padrão ou outras variações estruturais do conjunto convencional de aminoácidos. 0 termo "anticorpo", como usado neste relatório, significa um anticorpo de classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmentos ou derivados destas, incluindo Fab, F(ab')2, Fd e anticorpos, diacorpos, anticorpos biespecificos, anticorpos bifuncionais e derivados destes de cadeia única. 0 anticorpo poderá ser um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpo purificado por afinidade ou misturas dos mesmos que exibem suficiente especificidade de ligação com um epitopo desejado ou uma sequência derivada deste. 0 14 anticorpo poderá também ser um anticorpo quimera. 0 anticorpo poderá ser derivatizado pela ligação de uma ou mais porções químicas, peptídicas ou polipeptídicas conhecidas no estado da técnica. 0 anticorpo poderá ser conjugado com uma porção química. 0 termo "apoptose", como usado neste relatório, refere-se a uma forma de morte celular que inclui contracção progressiva de volume celular com a preservação da integridade de organelas citoplasmáticas; condensação de cromatina (isto é, condensação nuclear), como observado por meio de microscópio óptico ou electrónico; e/ou clivagem de DNA em fragmentos dimensionados como nucleossomos, conforme determinado por ensaios de sedimentação centrifugada. Morte celular ocorre quando a integridade da membrana da célula é perdida (por exemplo, formação de vesículas na membrana) com engolfamento de fragmentos celulares intactos ("corpos apoptóticos") por células fagocíticas. 0 termo "cancro", como usado neste relatório, significa qualquer condição caracterizada por resistência a estímulos apoptóticos. 0 termo "tratamento de cancro", como usado neste relatório, significa qualquer tratamento para cancro conhecido no estado da técnica, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, quimioterapia e terapia com radiação. 0 termo "combinação com", quando usado para descrever administração de um agente que induz actividade de NF-κΒ e um tratamento adicional, significa que o agente poderá ser administrado antes de, juntamente com ou após o tratamento adicional, ou uma combinação destes. 15 0 termo "derivado", quando usado no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido diferente de outro na estrutura primária (aminoácidos e análogos de aminoácidos). À guisa de ilustração, derivados poderão diferir ao serem glicosilados, uma forma de modificação pós-tradução. Por exemplo, péptidos ou polipéptidos poderão exibir padrões de glicosilação devido a expressão em sistemas heterólogos. Se pelo menos uma actividade biológica é retida, por conseguinte esses péptidos ou polipéptidos são derivados de acordo com a invenção. Outros derivados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, péptidos de fusão ou polipéptidos de fusão que apresentam um término N ou C covalentemente modificado, péptidos ou polipéptidos PEGilados, péptidos ou polipéptidos associados a porções lipidicas, péptidos ou polipéptidos alquilados, péptidos ou polipéptidos ligados via um grupo funcional com cadeia lateral aminoácido a outros péptidos, polipéptidos ou compostos químicos, e modificações adicionais como seria entendido no estado da técnica. 0 termo "fragmento", quando usado no contexto de um péptido ou polipéptido, poderá significar um péptido de cerca de 6 a cerca de 10 aminoácidos de comprimento. O fragmento poderá ser de 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. O termo "homólogo", quando usado no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido que compartilha um ancestral evolucionário comum. O termo "saturado", como usado neste relatório, refere-se a um grupo em que todas as ligações com valências disponíveis dos átomos da cadeia principal ligam-se a outros átomos. 16 0 termo "substituído", como usado neste relatório, refere-se a um grupo que apresenta um ou mais hidrogénios ou outros átomos removidos de um carbono e substituídos por um grupo adicional. Grupos substituídos neste relatório poderão ser substituídos por um a cinco, ou um a três substituintes. Exemplos representativos de tais substituintes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, grupos alifáticos, grupos aromáticos, alquila, alquenila, alquinila, arila, alcóxi, halo, arilóxi, carbonila, acrila, ciano, amino, nitro, grupos que contêm fosfato, grupos que contêm enxofre, hidroxila, alquilcarbonilóxi, arilcarbonilóxi, alcoxicarbonilóxi, ariloxicarbonilóxi, alquilcarbonila, arilcarbonila, alcoxicarbonila, aminocarbonila, alquilaminocarbonila, dialquilaminocarbonila, alquiltiocarbonila, acilamino, amidino, imino, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, alquilsulfinila, trifluormetila, azido, heterociclila, alquilarila, heteroarila, semicarbazido, tio-semicarbazido, maleimido, oximino, imidato, cicloalquila, cicloalquilcarbonila, dialquilamino, arilcicloalquila, arilcarbonila, arilalquilcarbonila, arilcicloalquilcarbonila, arilfosfinila, arilalquilfosfinila, arilcicloalquilfosfinila, arilfosfonila, arilalquilfosfonila, arilcicloalquilfosfonila, arilsulfonila, arilalquilsulfonila, arilcicloalquilsulfonila, combinações destes e substituições nos mesmos. 0 termo "tratar" ou "tratamento", quando se referindo a protecção de um mamífero de uma condição, significa prevenção, supressão, repressão ou eliminação da condição. Prevenção da condição envolve administrar uma composição desta invenção a um mamífero antes de início da condição. 17

Supressão da condição envolve administrar uma composição desta invenção a um mamífero após indução da condição, mas antes de seu aparecimento clínico. Repressão da condição envolve administrar uma composição desta invenção a um mamífero após aparecimento clínico da condição tal que a condição seja reduzida ou mantida. Eliminação da condição envolve administrar uma composição desta invenção a um mamífero após aparecimento clínico da condição tal que o mamífero não mais sofra da condição. 0 termo "célula tumoral", como usado neste relatório, significa qualquer célula caracterizada por resistência a estímulos apoptóticos. 0 termo "insaturado", como usado neste relatório, refere-se a um grupo em que pelo menos uma ligação de dois átomos adjacentes com valência disponível da cadeia principal não se ligue a outros átomos. 0 termo "não-substituído", como usado neste relatório, refere-se a um grupo que não apresenta quaisquer grupos adicionais ligados a ele ou substituídos nele. 0 termo "variante", quando usado no contexto de um péptido ou polipéptido, significa um péptido ou polipéptido que difere em sequência de aminoácidos pela inserção, supressão ou substituição conservativa de aminoácidos, mas retém pelo menos uma actividade biológica. Para fins desta invenção, "actividade biológica" inclui, mas sem se limitar a mesma, à capacidade de ser ligado por um anticorpo específico. Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades similares (por exemplo, hidrofilicidade, 18 grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecida no estado da técnica como tipicamente envolvendo alterações em quantidade menor. Essas alterações em quantidade menor podem ser identificadas, em parte, considerando o indice hidropático de aminoácidos, como entendido no estado da técnica (Kyte e outros, J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982). O indice hidropático de um aminoácido baseia-se em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga. Sabe-se no estado da técnica que aminoácidos de índices hidropáticos similares podem ser substituídos e todavia reter função proteica. Em um aspecto, aminoácidos que apresentam índices hidropáticos de ±2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos pode também ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas que retêm função biológica. Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um péptido permite cálculo da maior hidrofilicidade média local desse péptido, uma medida útil que é relatada correlacionar-se bem com antigenicidade e imunogenicidade. Patente Estados Unidos No. 4.554.101. Substituição de aminoácidos que apresentam valores de hidrofilicidade similares pode resultar em péptidos que retêm actividade biológica, por exemplo imunogenicidade, como é entendido no estado da técnica. Em um aspecto, substituições são realizadas com aminoácidos que apresentam valores de hidrofilicidade de ±2 entre si. Tanto o índice de hidrofobicidade quanto o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido. Consistente com essa observação, substituições de aminoácidos que são compatíveis com função biológica são entendidas depender da similaridade relativa dos aminoácidos e particularmente das cadeias laterais desses aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras 19 propriedades . 2. Lipopéptidos

Um lipopéptido poderá ser usado como agente para induzir actividade de NF-κΒ. Lipopéptidos são parte das membranas externas de bactérias gram-negativas, bactérias gram-positivas e micoplasma. Lipopéptidos bacterianos não apresentam homologia de sequências compartilhadas, mas se caracterizam pelo aminoácido incomum com término N S-(2,3-diidroxipropil)-L-cisteína que é acilado por dois ou três ácidos graxos. Lipopéptidos bacterianos são fortes imunomoduladores que activam respostas precoces do hospedeiro após infecção mediante sinalização por meio de heterodimeros TLR2-TLR1 ou TLR2-TLR6, levando à activação de NF-κΒ e produção de citocina. Análogos sintéticos dos lipopéptidos com término N de lipopéptidos naturais são potentes ativadores de TLRs e NF-κΒ, bem como são imunoadjuvantes in vivo e in vitro. 0 lipopéptido é um composto de fórmula:

O

X

Rf^O-CH, 3 I 2 R2\^°-ÇH íl ch9 O I 2 z

I ch2 o em que

Ri representa H ou -CO-R4, R2, R3 e R4 independentemente são H ou alifático 20 opcionalmente substituído; X é um péptido; eZ é S ou CH2. 0 lipopéptido poderá compreender dois ou três ácidos graxos. Os substituintes alifáticos de R2, R3 e R4 compreendem de 6 a 20 átomos de carbono. R2, R3 e R4 poderão ser C6~C2o alquila, C6~C2o alquenila ou C6-C2o alquinila. Exemplos representativos de substituintes alquila em R2, R3 e R4 incluem Ce, C8, Cg, Ci0, Ci2, C14 e Ci6. Exemplos representativos de substituintes alquenila em R2, R3 e R4 incluem Cio:i r Ci8:i e Cis:2 O péptido poderá transportar uma carga líquida negativa.

Tabela 1

Sequência Comprimento SEQ ID NO SNNA 4 1 GSSHH 5 2 KQNVS 5 3 NNSGK 5 4 QPDRY 5 5 RPDRY 5 6 SEEEE 5 7 SKKKK 5 8 SNNNA 5 9 SPPPP 5 10 GQHHM 5 11 GQHHH 5 12 SSHHM 5 13 GSHHM 5 14 SQMHH 5 15 GE TDK 5 16 GEESN 5 17 GEEDD 5 18 TENVKE 6 19 QGEESNDIC 8 20 21

Sequência Comprimento SEQ ID NO VQGEESNDK 9 21 FEPPPATTT 9 22 GDKYFKETE 9 23 GDPKHPKSF 9 24 GGQEKSAAG 9 25 GPCPGCPPC 9 26 PPCPGCPPC 9 27 DNEEKPTPEQD 11 28 GNGGAPAQPKG 11 29 FEPPPATTTKSK 12 30 GNNDESNISFKEK 13 31 GDPKHPKSFTGWVA 14 32 AQNPNKTNSNLDSSK 15 33 NKDNEAEPVTEGNAT 15 34 SKEGNGPDPDNAAKS 15 35 GDKTPSTKSAGKVENK 16 36 GETDKEGKIIRIFDNSF 17 37 SSTSENNGNGNGNGGTD 17 38 GNNDESNISFKEKSEEEE 18 39 GNNDESNISFKEKSKKKK 18 40 GNNDESNISFKEKSPPPP 18 41 SSNKSTTGSGETTTAAGT 18 42 CGNNDESNISFKEKSKKKK 19 43 GSPLSFESSVQLIVSDNSS 19 44 SNYAKKVVKQKNHVYTPVY 19 45 ADVIAKIVEIVKGLIDQFTQK 21 46 GAASSLTYESSVQLVVSDNSS 21 47 GGEPAAQAPAE T PAAAAEAAS 21 48 GQTDNNSSQSQQPGSGTTNT 21 49 S GALAAT S D D DVKKAATVAIVA 22 50 SIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKK 22 51 SSGGGGVAADIGAGLADALTAP 22 52 0 lipopéptido poderá ser um estereoisómero RR ou RS, ou mistura destes, com relação à estereoquímica do 22 lipoaminoácido com término N. 0 lipopéptido poderá ser solúvel em água. 3. Tratamento de Tensão

Um agente que induz actividade de NF-κΒ poderá ser usado para proteger células normais de condições ou tratamentos que causam tensão celular, disparando desse modo apoptose. Exemplos representativos de condições ou tratamentos incluem tratamentos de cancro, por exemplo terapia com radiação ou quimioterapia; choque de temperatura; exposição a doses nocivas de radiação, por exemplo operários em usinas de energia nuclear, a indústria de defesa ou produção radiofarmacêutica, ou soldados; envelhecimento celular; ferimento; envenenamento; e infecção. 0 agente poderá ser administrado simultânea ou metronomicamente com outros tratamentos. 0 termo "simultâneo" ou "simultaneamente", como usado neste relatório, significa que o agente e outro tratamento sejam administrados dentro de 48 horas, preferencialmente 24 horas, mais preferencialmente 12 horas, ainda mais preferencialmente 6 horas, e bem mais preferencialmente 3 horas ou menos, um do outro. 0 termo "metronomicamente", como usado neste relatório, significa a administração do agente em tempos diferentes do outro tratamento e sob uma certa frequência relativa para repetir a administração. 0 agente poderá ser administrado em qualquer ponto antes de exposição à tensão, incluindo, mas sem se limitar às mesmas f cerca de 4 8 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h ou 1 h antes de 23 exposição. 0 agente poderá ser administrado em qualquer ponto após exposição à tensão, incluindo, mas sem se limitar às mesmas, cerca de 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h ou 48 h após exposição. a. Cancro de NF-κΒ Constitutivamente Activo A condição poderá ser um cancro de NF-κΒ constitutivamente activo. O agente que induz actividade de NF-κΒ poderá ser administrado em combinação com um tratamento de cancro, tal como quimioterapia ou terapia com radiação. 0 tratamento de cancro poderá compreender administração de um agente citotóxico ou agente citostático, ou combinação destes. Agentes citotóxicos impedem que células cancerosas se multipliquem mediante: (1) interferência na capacidade da célula em replicar DNA e (2) indução de morte celular e/ou apoptose nas células cancerosas. Agentes citostáticos actuam via modulação, interferência ou inibição dos processos de transdução de sinais celulares que regulam proliferação celular.

Classes de compostos que poderão ser usados como agentes citotóxicos incluem o seguinte: agentes de alquilação (incluindo, sem limitação, nitrogénio mostardas, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosouréias e triazenos): uracil mostarda, clormetina, ciclofosfamida (Cytoxan®), ifosfamida, melfalano, clorambucil, pipobromano, trietileno-melamina, trietilenotiofosforamina, bussulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina e temozolomida; antimetabólitos (incluindo, sem 24 limitação, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosino desaminase): metotrexato, 5-fluoruracil, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina e gemcitabina; produtos naturais e seus derivados (por exemplo, vinca alcaloides, antibióticos antitumor, enzimas, linfocinas e epipodofilotoxinas): vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, ara-c, paclitaxel (paclitaxel é comercialmente disponível como Taxol®), mitamicina, desoxico-formicina, mitomicina-c, 1-asparaginase, interferons (preferencialmente IFN-α), etoposida e teniposida.

Outros agentes citotóxicos proliferativos são navelbene, CPT-11, anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida e droloxafina.

Agentes que afectam microtúbulos interferem em mitose celular e são bem conhecidos no estado da técnica por sua actividade citotóxica. Agentes que afetam microtúbulos que poderão ser usados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, alocolchicina (NSC 406042), halicondrina B (NSC 609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por exemplo, NSC 33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina (NSC 332598), paclitaxel (Taxol®, NSC 125973), derivados de Taxol® (por exemplo, derivados (por exemplo, NSC 608832), tiocolchicina NSC 361792), tritil cisteina (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato de vincristina (NSC 67574), epotilonas naturais e sintéticas, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, epotilona A, epotilona B e discodermolida (ver Service, 25 (1996) Science, 274:2009) estramustina, nocodazol, MAP4 e similares. Exemplos de tais agentes são também descritos in Bulinski (1997) J. Cell Sei. 110:3055 3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Câncer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell. 8:973-985; e Panda (1996) J. Biol. Chem 271:29807-29812.

Também adequados são os agentes citotóxicos tal como epidofilotoxina; uma enzima antineoplástica; um inibidor de topoisomerase; procarbazina; mitoxantrona; complexos de coordenação de platina tais como cis-platina e carboplatina; modificadores de resposta biológica; inibidores de crescimento; agentes terapêuticos anti-hormonais; leucovorina; tegafur; e factores de crescimento hematopoético.

Agentes citostáticos que poderão ser usados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, hormonas e esteróides (incluindo análogos sintéticos): 17 a-etinilestradiol, dietilstilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, megestrolacetato, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, hlorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, medroxiprogesteronacetato, leuprolida, flutamida, toremifeno e zoladex.

Outros agentes citostáticos são antiangiogénicos, tais como inibidores de metaloproteinase matricial, e outros inibidores de VEGF, tais como anticorpos anti-VEGF, e pequenas moléculas tais como ZD6474 e SU6668 são também inclusos. Anticorpos anti-Her2 de Genentech poderão também 26 ser utilizados. Um inibidor adequado de EGFR é EKB-569 (um inibidor irreversível). Também são inclusos anticorpo C225 imunoespecífico Imclone para EGFR e inibidores de src.

Também adequado para uso como agente citostático Casodex® (bicalutamida, Astra Zeneca) que torna não-proliferativos carcinomas dependentes de androgénio. Ainda outro exemplo de um agente citostático é o antiestrogénio Tamoxifen® que inibe a proliferação ou crescimento de cancro de mama dependente de estrogénio. Inibidores da transdução de sinais proliferativos celulares são agentes citostáticos. Exemplos representativos incluem inibidores de fator de crescimento epidérmico, inibidores de Her-2, inibidores de MEK-1 quinase, inibidores de MAPK quinase, inibidores de PI3, inibidores de Src quinase e inibidores de PDGF. 0 tratamento de cancro poderá compreender terapia com radiação. A terapia com radiação poderá ser radiação com feixe externa, terapia com radiação interna ou terapia com radiação conformai, em que um computador é utilizado para perfilar o feixe de radiação para combinar com perfil do tumor. A radiação usada em terapia com radiação poderá vir de várias fontes que incluem raios X, feixe de elétrons ou raios-gama. As doses e tempos de administração da radiação durante terapia com radiação podem variar e variarão dependendo do local e grau do cancro. 0 agente que induz actividade de NF-κΒ poderá ser administrado com um agente radioprotetor (ver seção 3d) em combinação com a terapia com radiação, conforme descrito acima.

Cancros que podem ser tratados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, o seguinte: carcinoma, incluindo aquele da bexiga (incluindo cancro de bexiga acelerado e 27 metastático), mama, cólon (incluindo cancro colorrectal), rins, figado, pulmão (incluindo cancro de pulmão de pequenas e não-pequenas células e adenocarcinoma de pulmão), ovário, próstata, testículos, trato genitourinário, sistema linfático, laringe, pâncreas (incluindo carcinoma pancreático exócrino), boca, faringe, esófago, estômago, intestino delgado, cólon, reto, vesicula biliar, cerviz, tireoide e pele (incluindo carcinoma de células escamosas); tumores hematopoéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkins, linfoma não-Hodgkins, linfoma de célula pilosas, linfoma histiocitico e linfoma de Burketts; tumores hematopoéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crónicas, sindrome mielodisplástica, leucemia mielóide e leucemia pró-mielocítica; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cancro folicular de tireoide e teratocarcinoma. b. Tratamento de Efeitos Colaterais de Tratamento de Cancro A condição poderá também ser dano em tecido normal atribuível ao tratamento de um cancro de NF-kB constitutivamente ativo. 0 agente que induz actividade de NF-κΒ poderá ser administrado em combinação com um tratamento de cancro conforme descrito acima. c. Modulação de Envelhecimento Celular 28 A condição poderá também ser envelhecimento celular. d. Radiação A condição poderá também ser exposição a radiação. Exposição a radiação ionizante (IR) pode ser de curto ou longo prazo; ela poderá ser aplicada como dose única ou doses múltiplas, no corpo inteiro ou localmente. Assim, acidentes nucleares ou ataques militares poderão envolver exposição a uma única alta dose de irradiação de corpo inteiro (às vezes seguida de um envenenamento de longo prazo com isótopos radioactivos). Igualmente, uma única dose de radiação é geralmente usada para o pré-tratamento de pacientes de transplante de medula óssea quando é necessário preparar os órgãos hematopoéticos do hospedeiro para a medula óssea do doador mediante "limpeza" desses órgãos dos precursores sanguíneos do hospedeiro. A nível molecular e celular, partículas de radiação poderão levar a bloqueio no DNA e reticulação entre DNA, proteínas, membranas celulares e outras estruturas macromoleculares. Radiação ionizante poderá também induzir dano secundário aos componentes celulares dando origem a radicais livres e espécies de oxigénio reactivas (ROS). Sistemas de reparo múltiplos neutralizam esse dano, tais como diversos caminhos de reparo de DNA que restauram a integridade e fidelidade do DNA, e produtos químicos antioxidantes e enzimas que sequestram os radicais livres e ROS e reduzem as proteínas e os lípidos oxidados. Sistemas de observação celular estão presentes para detectar os defeitos de DNA e retardar progressão do ciclo celular até o dano ser reparado ou uma decisão submeter a célula a parada de crescimento ou morte celular programada (apoptose) ser 29 atingida.

Em nivel do organismo, os efeitos imediatos de niveis baixos e moderados de radiação são grandemente causados por morte celular, o que leva a inflamação induzida por radiação. Em niveis de radiação maiores, as chamadas sindromes hematopoiéticas e gastrointestinais conduzem morte induzida por radiação a longo prazo. A sindrome hematopoiética caracteriza-se pela perda de células hematopoiéticas e seus progenitores, tornando desse modo impossível regenerar sangue e o sistema linfóide. Morte usualmente ocorre como consequência de infecção (devido a imunossupressão), hemorragia e/ou anemia. A sindrome gastrointestinal caracteriza-se por morte celular maciça no epitélio intestinal, predominantemente no intestino delgado, seguida da desintegração da parede intestinal e morte em consequência de bacteremia e septicemia. A sindrome hematopoiética manifesta-se sob doses menores de radiação e leva a uma morte mais retardada do que a sindrome gastrointestinal. Doses muito altas de radiação podem causar morte quase instantânea por surgimento de degeneração neuronal.

Organismos que sobrevivem um período de toxicidade aguda de radiação poderão sofrer consequências a longo prazo que incluem carcinogénese e fibrose induzidas por radiação que se desenvolvem em órgãos expostos (por exemplo, rins, fígado ou pulmões) meses e mesmo anos após irradiação.

Indutores de NF-κΒ possuem forte actividade pró-sobrevivência em nível celular e poderão ser usados para tratar os efeitos de eventos de radiação natural, exposição a baixas doses de radiação, radiação administrada como 30 parte de terapia de cancro ou acidentes nucleares. Adicionalmente, uma vez que indutores de NF-κΒ actuam por meio de mecanismos diferentes de todos os radioprotectores presentemente conhecidos, eles poderão ser usados em combinação com outros radioprotectores, aumentando, desse modo, dramaticamente a escala de protecção de radiação ionizante.

Historicamente, radioprotectores têm geralmente sido antioxidantes e sequestrantes de radicais livres - tanto sintéticos e naturais. Mais recentemente, citocinas e fatores de crescimento têm sido adicionados à lista de radioprotectores; o mecanismo de sua radioprotecção é considerado ser devido a seu efeito facilitador da regeneração de tecidos sensíveis. Não há distinção funcional clara entre os dois grupos de radioprotectores, contudo, uma vez que algumas citocinas induzem a expressão das proteínas antioxidantes celulares, tais como superóxido de manganésio dismutase (MnSOD) e metalotioneína, seu uso poderá ser vantajoso.

Os radioprotectores poderão ser qualquer agente que trata os efeitos de exposição a radiação, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, antioxidantes, sequestrantes de radicais livres, citocinas, flagelina e TGFp latente. Antioxidantes e sequestrantes de radicais livres que poderão ser usados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, tios, tais como cisterna, cisteamina, glutationa e bilirrubina; amifostina (WR-2721); vitamina A; vitamina C; vitamina E; e flavonóides tais como manjericão sagrado dos índios (Ocimum sanctum), orientina e vicenina. Citocinas e fatores de crescimento conferem radioprotecção mediante restauração e/ou protecção das populações de células-tronco 31 radiossensíveis. Citocinas que poderão ser usadas incluem fator de células-tronco (SCF, ligante de kit c), ligante de Flt-3, fragmento IL-lb-rd de interleucina-1 e fator de crescimento de queratinócitos (KGF). Diversos outros factores, embora não citocinas por natureza, estimulam a proliferação dos imunócitos e, assim, poderão ser usados. Estes incluem, 5-AED (5-androstenodiol), que é um esteróide que estimula a expressão de citocinas, e compostos sintéticos, tal como tri-cloro(dioxoetileno-O,0'-)telurato de amónio (AS-101). TGFP latente, flagelina e derivados de flagelina são fortes indutores de actividade de NF-κΒ como mostrado nos Pedidos Internacionais de Patente Nos. PCT/US2004/040656 e PCT/US2004/040753, e Pedido de Patente Estados Unidos No. 60/693.826. 4. Composição

Também são aqui proporcionadas composições que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um indutor de NF-kB . A composição poderá ser uma composição farmacêutica, que poderá ser produzida utilizando métodos bem-conhecidos no estado da técnica. Como descrito acima, a composição que compreende um indutor de NF-κΒ poderá ser administrada a um mamifero para o tratamento de condições associadas a apoptose que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, exposição a radiação, efeito colateral de tratamentos de cancro, tensão e envelhecimento celular. A composição poderá também compreender agentes adicionais que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, um radioprotector ou um fármaco quimioterapêutico. a. Administração 32

Composições proporcionadas por esta invenção poderão ser administradas sob qualquer maneira, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, oralmente, parenteralmente, sublinqualmente, transdermicamente, retalmente, transmucosamente, topicamente, via inalação, via administração bucal ou combinações dessas vias de administração. Administração parenteral inclui, mas sem se limitar aos mesmos, administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intrapial e intra-articular. Para uso veterinário, a composição poderá ser administrada como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com prática veterinária normal. 0 veterinário pode imediatamente determinar o regime de dosagem e via de administração que seja a mais apropriada para um animal particular. b. Formulação

Composições proporcionadas aqui poderão ser na forma de comprimidos ou losangos formulados de maneira convencional. Por exemplo, comprimidos e cápsulas para administração oral poderão conter excipientes convencionais que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, agentes de ligação, cargas, lubrificantes, agentes de desintegração e agentes de humectação. Agentes de ligação incluem, mas sem se limitar aos mesmos, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucilagem de amido e polivinilpirrolidona. Cargas incluem, mas sem se limitar aos mesmos, lactose, açúcar, celulose microcristalina, amido de milho, fosfato de cálcio e sorbitol. Lubrificantes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, polietilenoglicol e silica. Agentes de desintegração incluem, mas sem se limitar aos mesmos, amido de batata e 33 amido glicolato de sódio. Agentes de umectação incluem, mas sem se limitar aos mesmos, lauril sulfato de sódio. Comprimidos poderão ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos no estado da técnica.

Composições proporcionadas nesta invenção poderão também ser formulações liquidas que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes e elixires. As composições poderão também ser formuladas como um produto seco para constituição com água ou outro veiculo adequado antes de uso. Tais preparações liquidas poderão conter aditivos que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, agentes de suspensão, agentes de emulsificação, veiculos não-aquosos e conservantes. Agentes de suspensão incluem, mas sem se limitar aos mesmos, xarope de sorbitol, metilcelulose, xarope de glicose/açúcar, gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, gel de estearato de alumínio e gorduras hidrogenadas comestíveis. Agentes de emulsificação incluem, mas sem se limitar aos mesmos, lecitina, monooleato de sorbitano e acácia. Veículos não-aquosos incluem, mas sem se limitar aos mesmos, óleos comestíveis, óleo de amêndoa, óleo de coco fraccionado, ésteres oleosos, propilenoglicol e álcool etílico. Conservantes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, p-hidroxibenzoato de metila ou de propila e ácido sórbico.

Composições proporcionadas aqui poderão também ser formuladas como supositórios, que poderão conter bases para supositórios que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, manteiga de cacau ou glicerídeos. Composições proporcionadas nesta invenção poderão também ser formuladas para inalação, as quais poderão ser em uma forma que 34 inclui, mas sem se limitar aos mesmos, uma solução, suspensão ou emulsão que poderão ser administradas como um pó seco ou na forma de um aerossol usando um propelente, tal como diclorodifluormetano ou triclorofluormetano. Composições proporcionadas aqui poderão também ser formuladas como formulações transdérmicas que compreendem veiculos aquosos ou não-aquosos que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, cremes, pomadas, loções, pastas, emplastro medicado, adesivo ou membrana.

Composições proporcionadas aqui poderão também ser formuladas para administração parenteral, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, injecção ou infusão continua. Formulações para injecção poderão ser na forma de suspensões, soluções ou emulsões em veiculos oleosos ou aquosos, e poderão conter agentes de formulação que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, agentes de suspensão, de estabilização e dispersão. A composição poderá também ser proporcionada em forma de pó para reconstituição com um veiculo adequado, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, água estéril sem pirogénio.

Composições proporcionadas aqui poderão também ser formuladas como uma preparação de depósito que poderá ser administrada mediante implantação ou injecção intramuscular. As composições poderão ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (como uma emulsão em um óleo aceitável, por exemplo), resinas de troca iónica ou como derivados moderadamente solúvel (como um sal moderadamente solúvel, por exemplo). c. Dosagem 35

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente exigido para uso em terapia varia com a natureza da condição que é tratada, a extensão de tempo em que indução de actividade NF-κΒ é desejada e a idade e a condição do paciente, e é por fim determinada pelo médico assistente. Em geral, entretanto, doses empregadas para tratamento de um ser humano adulto tipicamente situam-se na faixa de 0,001 mg/kg a cerca de 200 mg/kg por dia. A dose poderá ser de cerca de 1 μρ/kg a cerca de 100 μρ/kg por dia. A dose desejada poderá ser convenientemente administrada em uma única dose, ou como doses múltiplas administradas em intervalos apropriados, por exemplo como duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. Doses múltiplas frequentemente desejadas ou exigidas, porque actividade de NF-κΒ em células normais poderá ser diminuída uma vez que o agente não seja mais administrado. A dosagem de um indutor de NF-κΒ poderá ser qualquer dosagem, incluindo, mas sem se limitar as mesmas, cerca de 1 μg/kg, 25 μg/kg, 50 μg/kg, 75 μq/kqr 100 μυ/kg, 125 μg/kg, 150 μg/kg, 175 μg/kg, 200 μρ/kg, 225 μυ/kg, 250 μυ/kg, 275 μq/kqr 300 μς/ΐζς, 325 μρ/kg, 350 375 μg/kg, 400 μg/kg, 425 μg/kg, 450 μg/kg, 475 μq/kq, 500 μg/kg, 525 μg/kg, 550 μg/kg, 575 μg/kg, 600 μq/kq, 625 μg/kg, 650 μg/kg, 675 μg/kg, 700 μg/kg, 725 μq/kq, 750 775 μg/kg, 800 μg/kg, 825 μg/kg, 850 μq/kqr 875 μg/kg, 900 μg/kg, 925 μg/kg, 950 μg/kg, 975 μg/kg ou 1 μg/kg. 5. Selecção de Métodos O método proporcionado aqui também se refere a métodos de identificação de agentes que induzem actividade de NF-kB. 36

Um agente que induz actividade de NF-κΒ poderá ser identificado por um método que compreende adicionar um indutor suspeito de actividade de NF-κΒ em um sistema de expressão activado por NF-κΒ, comparando o nivel de expressão activada por NF-κΒ com um controlo, por meio do que um indutor de actividade de NF-κΒ é identificado pela capacidade de aumentar o nível de sistema de expressão activado por NF-kB.

Agentes candidatos poderão estar presentes em uma biblioteca (isto é, uma colecção de compostos). Tais agentes poderão, por exemplo, ser codificados por moléculas de DNA em uma biblioteca de expressão. Agentes candidatos poderão estar presentes em meios condicionados ou em extractos celulares. Outros desses agentes incluem compostos conhecidos no estado da técnica como "moléculas pequenas", que apresentam pesos moleculares menores que 105 dáltons, preferencialmente menores que 104 dáltons, e ainda o mais preferencialmente menores que 10 dáltons. Tais agentes candidatos poderão ser proporcionados como membros de uma biblioteca combinatória, que inclui agentes sintéticos (por exemplo, péptidos) preparados de acordo com reacções químicas múltiplas predeterminadas. Aqueles versados no estado da técnica entenderão que diversos agrupamentos dessas bibliotecas poderão ser preparados de acordo com procedimentos estabelecidos, e membros de uma biblioteca de agentes candidatos podem ser simultânea ou sequencialmente seleccionados como descrito neste relatório. A selecção de métodos poderá ser realizada em vários formatos, incluindo ensaios in vitro, baseado em células e in vivo. Quaisquer células poderão ser usadas em ensaios 37 baseados em células. Preferencialmente, células que poderão ser usadas incluem células de mamíferos, mais preferencialmente células de primatas humanos e não-humanos. Selecção à base de células poderá ser realizada usando células tumorais geneticamente modificadas que expressam marcadores substitutos para activação de NF-kB. Tais marcadores incluem, mas sem se limitar aos mesmos, β-galactosidase bacteriana, luciferase e proteína fluorescente com alto grau de verde (EGFP). A quantidade de expressão do marcador substituto poderá ser medida utilizando técnicas padrões no estado da técnica, incluindo, mas sem se limitar às mesmas, colorimetria, luminometria e fluorimetria.

As condições sob as quais um modulador suspeito é adicionado a uma célula, tal como mistura, são condições em que a célula pode sofrer apoptose ou sinalização se essencialmente nenhum outro composto regulador está presente que pudesse interferir em apoptose ou sinalização. Condições eficazes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, meio apropriado, temperatura, pH e condições de oxigénio que permitam crescimento celular. Um meio apropriado é tipicamente um meio sólido ou líquido que compreende factores de crescimento e fontes assimiláveis de carbono, nitrogénio e fosfato, bem como sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, tais como vitaminas, e inclui um meio eficaz em que a célula pode ser cultivada tal que essa célula possa exibir apoptose ou sinalização. Por exemplo, para uma célula de mamífero, o meio poderá compreender meio de Eagle modificado da Dulbecco contendo soro fetal de bezerro a 10%. Células poderão ser cultivadas numa variedade de 38 recipientes, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, frascos de cultura de tecidos, tubos de ensaio, placas de micro-titulo e placas de Petri. Cultura é realizada a uma temperatura, pH e teor de dióxido de carbono apropriados para a célula. Tais condições de cultura estão também dentro da capacidade do estado da técnica. Métodos para adicionar um modulador suspeito à célula incluem eletroporação, microinjecção, expressão celular (isto é, usando um sistema de expressão que inclui moléculas de ácidos nucléicos desprotegidas, virus recombinantes, vectores de expressão de retrovirus e expressão de adenovirus) , uso de agentes de emparelhamento de iões e uso de detergentes para permeabilização celular.

Esta invenção possui múltiplos aspectos, ilustrados pelos exemplos seguintes não-limitativos.

Exemplo 1

Deficiência de p53 Acelera Desenvolvimento da Sindrome GI em Camundongos A causa primária de morte em consequência de radiação ionizante (IR) de mamíferos depende da dose de radiação. Sob doses de até 9-10 Gy, camundongos morrem de 12-20 dias depois, principalmente de depleção letal da medula óssea, isto é, a sindrome hematopoiética (HP) . Sob essa dose, camundongos irradiados podem ser resgatados de letalidade por transplante de medula óssea. Animais que receberam >13-15 Gy morrem entre 7-12 dias após tratamento (antes que sindrome hematopoiética pudesse matá-los) de complicações de dano ao intestino delgado, isto é, a sindrome 39 gastrointestinal (GI) . Sabe-se bem que a proliferação celular das células epiteliais do intestino delgado limita-se às criptas em que células-tronco e progenitores de proliferação precoces localizam-se. Após um par de divisões celulares, descendentes já diferenciados de células-tronco crípticas deslocam-se para as vilosidades a serem irradiadas na extremidade vilosa. No intestino delgado do camundongo, a "viagem" inteira da célula (isto é, do compartimento proliferativo à extremidade da vilosidade) normalmente leva entre 3 e 5 dias. Embora a reacção do intestino delgado a radiação-gama tenha sido bem examinada em um nível patomorfológico, a causa exacta de letalidade GI, incluindo o evento primário, ainda permanece obscura. Morte poderá ocorrer como consequência directa do dano às células epiteliais crípticas, seguido de desnudação das vilosidades que levam a desequilíbrio de fluido e electrólito, bacteremia e endotoxemia. Além de inflamação e respostas estromático, disfunções endoteliais parecem ser importantes factores que contribuem para letalidade.

Em ambas as síndromes HP e GI, dano letal a tecido resulta de apoptose maciça dependente de p53. Adicionalmente, tem sido mostrado que perda de cabelo dependente de p53 (alopécia) ocorre como resultado de quimioterapia experimental ou radiação. Assim, parece que p53 poderia desempenhar um papel na sensibilização de células a tensão genotóxica.

Para examinar o papel de p53 em morte induzida por radiação, camundongos foram tratados com o inibidor de p53 de pequenas moléculas, pifitrina-alfa (PFTa) (Komarov e outros, Science 285:1733-7, 1999) imediatamente antes de irradiação-gama. Camundongos C57B1/6J (machos de 6-8 40 semanas foram usados aqui e abaixo, se não indicado de outra maneira) foram injectados intraperitonealmente com 10 mg/kg de PFTa e em seguida irradiados usando uma fonte de 137Césio Shepherd 4000 Ci sob uma taxa de doses de 4 Gy por minuto. Camundongos protegidos com PFTa de uma única dose de 9 Gy de radiação-gama ou uma dose radiação cumulativa fraccionada de 12,5 Gy (5 x 2,5 Gy) . Em contraste, PFTa não teve efeito na sobrevivência de camundongos tratados com altas doses únicas, isto é, 12,5 ou 25 Gy, de IR (Figura la).

Para examinar adicionalmente o papel de p53 na sindrome GI, camundongos do tipo selvagem e deficientes de p53 foram expostos a baixas (10 Gy) e altas (15 Gy) doses de radiação-gama. Como mostrado na Figura lb, camundongos deficientes de p53 foram resistentes a baixas doses de radiação que mataram pela sindrome HP, mas muito mais sensíveis a doses mais altas de radiação que mataram pela sindrome GI. Secções parafinadas coradas com hematoxilino-eosina do intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo em 0, 24, 48, 72 e 96 h após uma dose de 15 Gy dose de radiação-gama são mostradas na Figura ld. Os camundongos deficientes de p53 exibiram dano acelerado em células epiteliais. Coração TUNEL nas criptas (em 24 h) revelaram que apoptose foi evidente em tipo selvagem, mas não em epitélio deficiente de p53. Para examinar isso adicionalmente, camundongos do tipo selvagem foram expostos a 11 Gy de irradiação de corpo inteiro e, em seguida, 12 h depois, injectados com 1,5 x 10^ células de medula óssea de camundongos C57B1/6J isogenéticos do tipo selvagem ou p53 nulo. (Essa dose de radiação causou 100% de letalidade em camundongos de controlo não-reconstituídos). Dois meses depois, após recuperação completa de hematopoese, os dois 41 grupos de animais foram tratados com 15 Gy de radiação-gama em todo o corpo. Como mostrado na Figura lc, não houve diferença nas taxas de morte entre os camundongos dos dois grupos que diferiram no status de p53 de sua medula óssea (ambos tinham células intestinais do tipo selvagem). A dinâmica de proliferação celular e sobrevivência celular foi adicionalmente examinada no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo. Camundongos do tipo selvagem e p53 nulo de quatro semanas foram injectados intraperitonealmente com 14C-timidina (10 pCi por animal) e em seguida metade de cada grupo foi exposto a 15 Gy de radiação-gama. Auto-radiografia de secções de corpo inteiro revelaram que após 24 h, as células nas criptas intestinais de camundongos deficientes de p53 continuaram a proliferar, considerando que aquelas nos camundongos do tipo selvagem mostraram-se inactivas (Figura 2a, esquerda). Camundongos do tipo selvagem e p53 nulo de quatro semanas foram tratados com 15 Gy de radiação-gama, e 2 h antes de serem sacrificados foram injectados com BrdU (50 mg/kg) e os intestinos imunocorados. Em 24 h após irradiação, houve muitas células proliferativas nos camundongos p53 nulo, mas poucas nos camundongos do tipo selvagem. Em contraste, em 96 h, houve poucas células proliferativas nos camundongos p53 nulo, considerando que os camundongos do tipo selvagem apresentaram mais células marcadas.

Para caracterizar isso adicionalmente, o número de células positivas a BrdU foram contadas no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy de radiação-gama. Três animais foram analisados em relação a cada ponto de tempo, cinco secções transversais ilíacas foram preparadas a partir de 42 cada animal e analisadas microscopicamente para estimar o número de criptas e vilosidades. Números de células positivas a BrdU nas criptas foram contados em cinco campos aleatórios sob ampliação de 200x (100-300 criptas) e o número médio de células positivas a BrdU foi traçado (Figura 2b). O número de células positivas a BrdUno camundongos p53 nulo atingiu pico em 10 h e em seguida declinou, considerando que o número de células positivas a BrdU em camundongos do tipo selvagem declinou durante as primeiras 20 h e em seguida aumentou. A localização de células marcadas com BrdU foi traçada no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy de radiação-gama. BrdU foi injectado 30 min antes de irradiação e camundongos foram sacrificados em 0, 48, 72 e 96 h. Em camundongos p53 nulo, não houve migração acelerada de células marcadas com BrdU das criptas às vilosidades (compare tipo selvagem e p53 nulo em 48 h) , seguido de rápida eliminação das células marcadas em camundongos p53 nulo (Figura 2c).

Assim, a proliferação celular continua nas criptas de epitélio irradiado deficiente de p53 correlaciona-se com a morte acelerada de células danificadas da cripta e rápida destruição das vilosidades. Em camundongos do tipo selvagem, contudo, p53 prolonga sobrevivência mediante indução de parada de crescimento nas criptas do intestino delgado, preservando desse modo integridade do intestino. Assim, a função pró-apoptótica de p53 promove a sindrome hematopoiética, enquanto sua função de parada de crescimento retarda desenvolvimento da sindrome gastrointestinal. Desse modo, supressão farmacológica de p53 será inútil (se não prejudicial) contra sindrome GI. Portanto, é necessário desenvolver abordagens alternativas 43 a radioprotecção de epitélio de intestino delgado que dependerão de um outro mecanismo, tais como, por exemplo, activação de NF-κΒ e subsequente inibição de morte celular.

Exemplo 2

Lipopéptidos Retardam Morte de Camundongos Causada por Irradiação-gama de Corpo Inteiro

Lipopéptidos são potentes activadores de NF-κΒ e, como tal, poderão actuar como inibidores de morte apoptótica. Para determinar se lipopéptidos funcionam como radioprotectores, vários lipopéptidos foram inicialmente testados para determinar a dose máxima tolerável (MTD). Vários lipopéptidos foram então testados para medir seu efeito protector em camundongos suiços NIH em sindromes hematopoiéticas letais ou gastrointestinal nd após exposição a 10 Gy ou 13-15 Gy de radiação-gama de corpo inteiro, respectivamente. Lipopéptidos (0,3-10 μρ/camundongo) foram administrados subcutaneamente 30 minutos antes de irradiação. Lipopéptidos testados que proporcionaram radioprotecção são mostrados na Tabela 3. 44

Tabela 3

Sequência de Péptido SEQ ID NO Comprimento do Péptido N-acilação SKKKK 8 5 R-Pam2 SKKKK 8 5 R-Pam3 FEPPPATTT 22 9 Pam2 GNNDESNISFKEK 31 13 Pam2 GDPKHPKSF 24 9 Pam2 GETDKEGKIIRIFDNSF 37 17 Pam2

Os resultados de uma experiência representativa usando R-PAM2C-SKKKK (SEQ ID NO: 8) (daqui por diante, esse composto é chamado CBLB601) a <0,1 MTD são mostrados na Figura 3. Como esperado, camundongos de controlo irradiados com 10 Gy morreram entre 11 e 15 dias pós-tratamento, enquanto todos os animais que receberam CBLB601 viveram além de 35 dias pós-tratamento. Similarmente, camundongos de controlo irradiados com 13 Gy morreram entre 6 e 10 dias pós-tratamento, enquanto todos os animais, excepto um, que receberam CBLB601 viveram além de 35 dias pós-tratamento. A capacidade radioprotectora de CBLB601 foi adicionalmente analisada medindo o efeito de radiação sobre as dimensões do baço. Como mostrado na Figura 4, camundongos tratados com CBLB601 mostraram redução significativamente menor no tamanho do baço. CBLB601 também protegeu o timo de radiação (dados não mostrados). A capacidade de CBLB601 em proteger eficazmente esplenócitos, sustentar recuperação rápida do timo e proteger o trato GI de dano por radiação indica que lipopéptidos poderão ser usados como radioprotectores.

Exemplo 3

Eficácia Radioprotectora de Uma Única Dose de CBLB601 Contra Irradiação-gama de Corpo Inteiro 45 CBLB601, um R-Pam2-lipopéptido com a porção péptido consistindo de C-SKKKK (SEQ ID NO: 8), foi seleccionado para caracterização mais detalhada como radioprotector baseado em sua capacidade de activar NF-κΒ e dados preliminares in vivo sobre radioprotecção em camundongos suíços NIH (ver Exemple 2) . Os objectivos desse estudo foram determinar a dose óptima, via de administração e tempo de administração de CBLB601 para servir como protector. Camundongos ICR de 10-15 semanas de idade foram usadas, com 10-15 animais por grupo ou condição. A dose NOAEL (Nível de Efeitos Adversos Não Óbvios) foi determinada injectando intraperitonealmente (i.p.) camundongos ICR com doses crescentes de CBLB601 (0,3; 1; 3; 10; 30; 60; 100 pg/camundongo). Camundongos de controlo foram injectados com PBS. Os camundongos foram observados por duas semanas. Durante a primeira semana eles foram pesados diariamente. Não houve diferenças no peso entre os camundongos tratados com CBLB601 e de controlo. Mortalidade foi observada 1-2 dias pós-tratamento sob 100 pg de CBLB601/camundongo, mas não sob qualquer das doses menores. Entretanto, sob dose de 60 pg, os camundongos mostraram sinais de morbidez, tais como movimento lento e pele escamosa, em torno de 3-4 dias após tratamento. Sob dose de 30 pg, não houve diferenças notáveis entre os camundongos tratados e de controlo. Desse modo, NOAEL para CBLB601 foi determinado como sendo 30 pg/camundongo. O programa óptimo de administração intraperitoneal de CBLB601 foi determinado injectando o composto em diferentes tempos antes de irradiação. Previamente, verificou-se que CBLB601 foi protector contra 10 Gy, mas não contra doses de irradiação superiores (ver Exemplo 2) . Portanto, todos os 46 experimentos de optimização foram realizados 10 Gy de irradiação de corpo inteiro (TBI) . Uma dose de 3 pg de BCLB601/camundongo (1/10 NOAEL) foi escolhida como dose de partida. Desse modo, 3 pg de CBLB601 foram injectados i.p. em camundongos ICR 0,5 h, 1 h, 6 h e 24 h ou 1 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h antes de 10 Gy de TBI (como descrito no

Exemplo 1) . Após irradiação, os camundongos foram observados por 30 dias e sua sobrevivência registada. Os resultados desses experimentos são resumidos na Figura 5. Injecção de CBLB601 24 h antes de irradiação produziu claramente a melhor radioprotecção (90-100% de sobrevivência em 30 dias). Quando o composto foi administrado 48 h antes de irradiação, a radioprotecção foi de ~30%. Administração de CBLB601 lh antes de irradiação produziu resultados inconsistentes variando de 80% de protecção em um experimento (Figura 5B) a guase nenhuma protecção (20%) em um outro experimento (Figura 5A). Nenhuma radioprotecção foi observada quando o fármaco foi administrado 0,5 h (10%), 6 h (20%), 72 h e 96 h antes de TBI.

Para determinar a dose óptima radioprotectora de CBLB601, o tempo de injecção e nivel de irradiação foram mantidos constantes, enquanto a dose de CBLB601 foi variada. Camundongos ICR foram injectados i.p. com 1, 3, 10, 20 ou 30 pg de CBLB601/camundongo ou 0,1; 0,3; 1; 3; 10 ou 15 de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação (10 Gy de TBI), e sua sobrevivência foi monitorada por 30 dias. A melhor dose protectora foi 3 pg/camundongo, que sustentou uma sobrevivência de 100% (Figura 6 A e B) . Eficácia quase similar foi obtida com as doses de 1 e 10 pg/camundongo, que resgataram 90% dos camundongos (em um experimento). Em contraste, doses superiores a CBLB601 (20 e 30 47 μg/camundongo) levaram a mortalidade acelerada quando administradas em combinação com irradiação, em comparação com camundongos de controlo injectados com PBS. Alguns sinais dessa toxicidade combinada foram detectáveis já sob a dose de 10 pg/camundongo. Assim, a dose protectora óptima de CBLB601 foi determinada como sendo de 3 pg/camundongo. Desse modo, embora pareça que CBLB601 conferiu radioprotecção sob doses 10-30 vezes menores que NOAEL, as margens de segurança de CBLB601 foram significativamente reduzidas quando CBLB601 foi administrado em combinação com irradiação.

Para determinar o nivel de radiação que foi protegido por CBLB601, camundongos tratados com radioprotector e de controlo foram expostos a niveis crescentes de TBI. Grupos de camundongos ICR foram injectados i.p. com 3 pg de CBLB601/camundongo ou PBS, e em seguida 24 h depois receberam doses de 10, 11, 12, 13, 14 e 15 Gy de TBI. Sobrevivência foi registada por 30 dias. A Figura 7A mostra a mortalidade dependente de doses de radiação de camundongos injectados com PBS. Todos os camundongos irradiados com 10-11 Gy de TBI morreram entre 12-14 dias pós-irradiação, o que foi típico para morte devido a falha hematopoiética. Todos os camundongos que receberam 14-15 Gy de TBI morreram entre 7-9 dias pós-irradiação, o que foi típico de mortalidade devido a dano intestinal induzido por radiação. Camundongos que foram irradiados com 12-13 Gy de TBI morreram em tempos intermediários, o que foi típico de uma etiologia mista de mortalidade induzida por radiação. A Figura 7B mostra a mortalidade dependente de doses de radiação de camundongos pré-tratados com CBLB601. Camundongos injectados com 3 pg de CBLB601 24 h antes de irradiação foram, como esperado, totalmente protegidos de 48 10 Gy de TBI. Apesar das diferenças óbvias na sobrevivência entre camundongos de controlo e camundongos tratados, os efeitos protectores de CBLB601 não atingiram significância estatística sob essa condição. Para atingir uma diferença estatisticamente significativa de 10% entre camundongos de controlo e camundongos tratados com CBLB601, grupos experimentais de pelo menos 50 camundongos têm de ser usados. Embora CBLB601 tenha resgatado 100% de camundongos de 10 Gy de TBI, sua protecção sob 11 Gy de TBI foi somente de 20%. Não houve protecção de irradiação em níveis maiores que 11 Gy, indicando que CBLB601 foi incapaz de resgatar animais do componente gastrointestinal de radiotoxicidade. Além disso, sob doses de irradiação de 11, 12 e 13 Gy, os camundongos tratados com CBLB601 morreram com uma cinética acelerada, isto é, similar àqueles que receberam doses de 14-15 Gy, em comparação com camundongos de controlo injectados com PBS. Isso poderá ser indicativo de uma toxicidade combinada do fármaco e da irradiação. Desse modo, parece que sob niveis de irradiação maiores, CBLB601 não conferiu protecção e foi também mais tóxico. CBLB601 foi administrado intramuscularmente para determinar a via óptima de administração desse composto (especialmente uma vez que esta seria a via preferida de administração para humanos). A Figura 8 mostra as taxas de sobrevivência de camundongos injectados intramuscularmente (i.m.) com 1, 3 ou 10 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. Todas as três doses de CBLB601 conferiram radioprotecção; e não houve sinal de toxicidade combinada sob a dose i.m. de 10 pg/camundongo, como houve para a dose i.p. de 10 pg/camundongo (Figura 6) . Em um outro experimento, doses crescentes de CBLB601 administradas i.m. foram testadas contra doses de 10, 11 e 12 Gy de HBI (Figura 9) . Houve um 49 deslocamento não-estatisticamente significativo para aumento de mortalidade de camundongos injectados com as doses mais altas (10, 30 pg) de CBLB601 antes de exposição a 10 Gy de TBI. Um resumo da dependência de doses da radioprotecção de CBLB610 administrado i.p. ou i.m. 24 h antes de 10 Gy de TBI é mostrado na Figura 10. A partir desses dados, concluiu-se que a via i.m. de administração foi tão eficaz quanto a via i.p., e a dose ótima (3 pg/camundongo) foi a mesma para ambas as vias de administração. Além disso, concluiu-se que transferência i.m. poderá ser mais segura porque ela apresentou um indice terapêutico maior (dose tóxico/dose eficaz): 10-30 para administração i.m. (Figura 8 e 9: 30 pg/camundongo/1-2 pg/camundongo) vs 3-10 para administração i.p. (Figura 6: 10 pg/camundongo/1-3 pg/camundongo) . Adicionalmente, recálculo da dose eficaz por peso corporal revelou uma janela menor para transferência intraperitoneal em comparação com transferência intramuscular; isto é, 90-110 pg/kg para transferência i.p. e 60-115 pg/kg para transferência i.m. (Figura 11). O programa óptimo de administração intramuscular de CBLB601 foi determinado variando o tempo entre transferência de fármaco e irradiação. Camundongos ICR foram injectados i.m. com 3 pg de CBLB601/camundongo 24 h, 6 h, 3 h e 1 h antes de TBI e +1 h, +3 h após TBI (Figura 12A) , bem como 48 h, 36 h, 24 h, 12 h e 6 h antes de TBI (Figura 12B) . Essas experiências revelaram que, similarmente à via de transferência intraperitoneal, o tempo óptimo para transferência intramuscular de CBLB601 foi de 24 h antes de 10 Gy de TBI. Administração intramuscular de 3 pg de CBLB610/camundongo após (1 h e 3 h) 10 Gy de TBI não teve efeito protector (Figura 12A). Além disso, doses de CBLB601 50 mais altas (10 e 30 μg/camundongo) injetadas i.m. 1 h após 10 Gy de TBI levaram a níveis elevados de toxicidade combinada (Figura 13C). Esses dados são resumidos na Figura 13.

Para determinar DMF (fator de modificação de doses), 3 pg de CBLBôOl/camundongo foram injectados i.m. 24 h antes de irradiação e camundongos de controlo foram injectados com PBS. Tanto grupos injectados com fármaco quanto grupos de controlo receberam uma única dose de TBI cobrindo a faixa de doses que leva a 10-90% de mortalidade dentro dos intervalos de tempo escolhidos (7 dias para a mortalidade por síndrome gastrointestinal e 30 dias para a mortalidade por síndrome hematopoiética). Os gráficos de mortalidade percentual-doses de radiação foram construídos e LD50/7 e LD50/30 (LD50 em 7 dias e 30 dias, respectivamente) foram calculados usando análise estatística probit ou logit. DMF (também conhecido como factor de redução de doses, DRF) foi calculado como razão de LD50 de radiação para grupos de camundongos tratados com CBLB601 e LD50 de radiação para grupos de camundongos tratados com veículo para o ponto de tempo de sobrevivência escolhido, 7 ou 30 dias. Para calcular DMF30, que é o DMF no 30° dia pós-irradiação, foram determinados os valores de LD50/30 de radiação para camundongos tratados com PBS ou 3 pg de CBLB601. Para isso, grupos injectados com PBS foram irradiados com doses de 6; 6,5; 7 e 7,7 Gy de TBI, e grupos injectados com CBLB601 foram irradiados com doses de 10; 10,5; 11; 11,5 e 12 Gy de TBI. O LD50/30 para CBLB601 foi calculado usando análise ProBit e foi estimado situar-se na faixa de 11,07-11,61 Gy, com a média de -11,32 Gy (ver Figura 14). Contudo, inconsistência na resposta a algumas doses de radiação (7 Gy pareceram não-tóxicos, considerando que 6,5 Gy causaram 51 60% de letalidade em 30 dias) nos camundongos de controlo impediu um cálculo preciso do DMF30 para CBLB601. Todavia, esperava-se que o LD50/30 para camundongos ICR fosse em torno de 7 Gy [uma média da maioria de cepas de camundongos; Monobe e outros, Radiother Oncology 73 Supl. 2: S12709, 2004)]. Assim, o valor de DMF30 para CBLB601 foi estimado aproximadamente como ~1,6.

Exemplo 4

Status Imune de Camundongos Resgatados de Doses Letais de TBI por CBLB601

Camundongos que foram resgatados de 10 Gy de TBI por administração de CBLB601 poderão ter sistemas imunes comprometidos e, portanto, poderão não ter vida "normal". Para verificar o status de seus sistemas imunes, camundongos ICR foram expostos a doses letais (10 Gy) ou não-letais (6 Gy) de TBI 24 h após terem sido injectados (i.m.) com 3 pg de CBLB601/camundongo ou PBS. Grupos de cinco camundongos de cada condição foram sacrificados exactamente três dias e seus baços e timos foram removidos e pesados. Os pesos dos baços foram normalizados com os pesos corporais dos animais correspondentes e os resultados são apresentados na Figura 15. Camundongos tratados com PBS que foram expostos a 6 Gy de radiação levaram cerca de 13-14 dias para restaurar seus baços a pesos normais, considerando que camundongos tratados com CBLB601 expostos a 6 Gy de radiação apresentaram pesos normais dos baços em torno do 8o dia. Animais injectados com PBS não sobreviveram a 10 Gy de TBI, considerando que camundongos injectados com CBLB601 não só sobreviveram à dose letal dose de radiação, como também restauraram completamente 52 seus pesos dos baços em torno dos 13-14 dias pós-irradiação. Levaram um período mais longo de tempo (—30 dias) para restaurar os timos a pesos normais (não mostrados).

Os baços e os timos de camundongos de controlo e de camundongos injectados com CBLB601 foram examinados microscopicamente em relação a alterações morfológicas 3, 10 e 30 dias após irradiação. Três dias pós-irradiação, o baço e o timo de camundongos de controlo irradiados em corpo inteiro com 10 Gy e camundongos tratados com CBLB601 revelaram lesões induzidas por irradiação, incluindo depleção linfóide moderadamente grave e grave do baço e do timo, e atrofia grave da polpa vermelha do baço. Dez dias pós-irradiação, animais tratados com CBLB601 mostraram uma melhoria em relação aos animais de controlo na recuperação da atrofia esplénica da polpa vermelha; todos os animais tratados com CBLB601 mostraram hematopoese extramedular multifocal suave a moderada (EMH), considerando que nenhum dos controles apresentaram EMH. Não houve evidência de recuperação da depleção esplénica da polpa branca em qualquer dos grupos em 10 dias. Hiperplasia linfóide regenerativa no timo foi evidente em ambos os grupos no 10° dia, com a regeneração ligeiramente mais avançada nos camundongos de controlo que nos camundongos tratados como CBLB601. Em torno do 30° dia pós-irradiação, todos os animais apresentavam polpa vermelha esplénica normal, a maioria dos animais mostrava recuperação total ou aproximadamente total de elementos linfóides e todos tinham timos essencialmente normais.

Para testar a resposta imune de camundongos resgatados de uma dose letal de irradiação-gama (10 Gy de TBI) por 53 CBLB601, diversos grupos desses camundongos foram submetidos a imunização com um antigénio forte, Salmonella flagellin. Os camundongos foram primeiro imunizados 8, 18 ou 20 semanas após irradiação, em cujo tempo eles tinham 18, 25 e 33 semanas de idade, respectivamente. Camundongos virgens não-irradiados com 29 semanas de idade foram usados como controlo positivo para a resposta imune. Os camundongos receberam um reforço de flagelina uma semana após a primeira imunização, e um outro reforço três semanas após o segundo reforço; títulos de anticorpos antiflagelina foram medidos no soro dos camundongos. Para testar a resposta imune secundária, os camundongos foram submetidos a sangria novamente um mês depois de assegurar redução dos títulos de anticorpos. Isso foi seguido de um terceiro reforço da injecção de antigénios e de medição de títulos de anticorpos antiflagelina 10 dias depois. Quando do terceiro reforço, os camundongos sob irradiação tinham 38, 30 e 23 semanas de idade e os camundongos de controlo, 34 semanas de idade. A resposta imune um mês após a primeira imunização (três semanas após o primeiro reforço) é mostrada na Figura 16A. Os camundongos irradiados tratados com CBLN601 montaram uma resposta humoral imune robusta contra flagelina que foi indistinguível daquela dos camundongos virgens de controlo. Também parece que o nível de resposta imune não foi dependente do tempo que se passou após irradiação, uma vez que todos os grupos apresentaram uma boa resposta. Embora houvesse alguma variação individual no grupo pós-irradiação de 20 semanas, sabe-se bem que resposta imune pode ser prejudicada em animais mais velhos. Títulos de anticorpos foram verificados novamente um mês após a primeira sangria, e eles estavam ainda assim elevados sete semanas após 54 imunização (Figura 16B). A resposta imune secundária (Figura 16C) foi mais intensa do que a primeira resposta (Figura 16A) . Esses dados indicam fortemente que CBLB601 não só resgataram camundongos de TBI letal, mas também permitiram total restauração de um sistema imune funcional.

Exemplo 5

Activação de NF-κΒ e Radioproteção Proporcionada por Outros Lipopéptidos

Lipopéptidos adicionais foram sintetizados e testados em relação a activação de NF-κΒ e sua capacidade de proteger camundongos de doses letais de radiação. Os nomes dos compostos e seus constituintes-chave são mostrados na Tabela 4. Para alguns dos compostos, os péptidos livres correspondentes foram também sintetizados e testados.

Tabela 4

Nome do Composto N-acilação Sequência de Péptido SEQ ID NO CBLB602 Pam2 GQHHH 12 CBLB603 Pam2 GQHHM 11 CBLB604 Pam2 GSHHM 14 CBLB605 Pam2 SQMHH 15 CBLB606 R-Pam2 GDPKHPKSF 24 CBLB607 Pam2 GDPKHPKSFTGWVA 32 CBLB608 Pam2 FEPPPATTTKSK 30 CBLB611 Pam2 GETDKEGKIIRIFDNSF 37 CBLB612 R-Pam2 VQGEESNDK 21 CBLB613 R-Pam2 GE TDK 16 CBLB614 R-Pam2 QGEESNDK 20 CBLB615 R-Pam2 GEESN 17 55 CBLB616 R-Pam2 TENVKE 19 CBLB617 R-Pam2 GEEDD 18

Actividade repórter dependente de NF-κΒ foi medida em 293 células que expressaram o heterodimero TLR2/YLR6. A activação in vitro de NF-κΒ por CBLB613 foi comparável àquela de CBLN601 (Figura 17) . Os compostos CBLB614 e CBLB615 apresentam derivados do péptido de CBLB612 (ver

Tabela 4) sucessivamente mais curtos. Todos os três compostos activaram o NF-κΒ repórter e todos foram activadores melhores do que do que CBLB601 (Figura 18A, B). Nenhum dos péptidos não-palmitoilados correspondentes activaram o NF-κΒ repórter (Figura 18B). 0 componente péptido de CBLB617 apresenta uma carga (-4), que deve impedi-lo de interagir com marcadores de superficie celular negativamente carregados. A activação de NF-κΒ por CBLB617 foi comparável àquela de CBLB601 (Figura 19) . A Tabela 5 resume a actividade e solubilidade in vitro de todos os compostos.

Tabela 5

Composto Solubilidade Activação de NF-kB CBLB601 Excelente 100 CBLB602 Pobre 0 CBLB603 Pobre 0 CBLB604 Pobre 0 CBLB605 Pobre 2 CBLB606 Pobre 100 CBLB607 Pobre 2 CBLB608 Excelente 2 CBLB611 Insolúvel 0 CBLB612 Excelente 200 56 CBLB613 Solúvel 200 CBLB614 Solúvel 200 CBLB615 Solúvel 200 CBLB616 Não testada Não testada CBLB617 Solúvel 100 A actividade radioprotectora in vivo de alguns dos compostos foi também testada. Camundongos ICR foram injectados intramuscularmente com várias doses dos compostos de teste e em seguida 24 horas depois que os camundongos foram expostos a 10 Gy de TBI. Sobrevivência foi monitorada por 30 dias. A Figura 20 mostra a actividade protectora de CBLB613. Doses de 10, 30 e 82,5 pg de CBLB613/camundongo proporcionaram 100% de protecção e revelaram-se não-tóxicas em combinação com a radiação (em contraste com CBLB601). Os compostos relacionados CBLB612, CBLB614 e CBLB615 foram testados em relação a actividade radioprotectora contra 10 Gy de TBI. Doses de 1, 3, 10 e 30 pg/camundongo (CBLB612 foi também testado sob 60 pg/camundongo) foram injectadas i.m. em camundongos ICR 24 h antes de irradiação. Como mostrado na Figura 21, todos os três compostos proporcionaram 90-100% de radioprotecção quando administrados nas doses mais altas. A radioprotecção foi claramente dependente de doses, sem nenhuma toxicidade em combinação com radiação. A potência dos compostos são CBLB612>CBLB614>CBLB615. A actividade radioprotectora de CBLB617 está presentemente sob avaliação usando o procedimento padrão. Após 13 dias, não houve toxicidade visível à dose mais alta (87,5 pg/camundongo), embora houvesse 7-90% de sobrevivência sob doses de 10-87,5 pg/camundongo, respectivamente. Em resumo, CBLB612 e CBLB613 são significativamente radioprotectores melhores do que CBLB601 e apresentam índices terapêuticos maiores (~20 57 para CBLB612 e CBLB613 vs 3 para CBLB601). A capacidade de CBLB612 em funcionar como um mitigador de dano por radiação sob dose mais baixa foi também examinada. Para isso, 50 pg de CBLB612/camundongo foram injectados intramuscularmente 1 h após exposição a 8,5; 9 ou 10 Gy de TBI. Tratamento com CBLB612 elevou a taxa de sobrevivência sob cada dose de radiação (Figura 22). Por exemplo, sob 8,5 Gy, 90% dos camundongos tratados com CBLB612 e 50% dos camundongos tratados com PBS sobreviveram 27 dias (p=0,03), e sob 9 Gy 7 0% dos camundongos tratados com CBLB612 e 50% dos camundongos tratados com PBS sobreviveram 27 dias (p=0,0006). Nenhuma diferença foi observada entre grupos tratados com CBLB612 e grupos de controlo sob doses de radiação menores devido à baixa sobrevivência de camundongos de controlo (não mostrada). Esses dados indicam que CBLB612 poderá funcionar como um mitigador de radiação, bem como radioprotector. 58

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Clevel and Biolabs, xnc. Shakhov, Alexander N. Gudkov, Andrei <12 0> MÉTODOS DE PROTEÇÃO CONTRA APOPTOSE MEDIANTE USO DE LIPOPEPTÍDEOS <1B0> 050991-110422 <150> <151> 60/689,810 2005-06-13 <160> 52 <170> Patentln versão 3.3 <210> <211> <212> <213> 1 4 PRT Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 1

Ser Asn Asn Ala 1 <210> <211> <212> <213> 2 5 PRT Arti fi ci al <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 2

Gly ser Ser His His 1 5 <210> <211> <212> <213> 3 5 PRT Arti fiei al <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 3

Lys Gin Asn Vai ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 4 5 PRT Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 4 59 asn Asn ser Gly Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> . <223> PEPTIDO SINTÉTICO <400> 5

Gin Pro Asp Arg Tyr 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 6

Arg Pro Asp Arg Tyr <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 7

Ser Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PEPTIDO SINTÉTICO <400> 8 ser Lys Lys Lys Lys <Z10> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> PÉPTIDO SINTÉTICO 6 0 <4O0> 9

Ser Asn Asn Asn Ala 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PEPTIDO SINTÉTICO <40Q> 10

Ser Pro Pro Pro Pro 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 11

Glv Gin His His Met 1 5 <210> 12 <211> S <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 12

Glv Gin His His His 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 13

Ser ser His His Met 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial 61 <220> <223> PEPTIDO SINTÉTICO <400> 14

Gly Ser His His Met 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Arti f'i ci al <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 15

Ser Gin Met His His 1 5 <210> 16 <2U> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> . <223> PEPTIDO SINTÉTICO <400> 16

Gly Glu Thr Asp Lys 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO c400> 17

Gly Glu Glu Ser Asn 1 5 <210^ 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 18

Gly Glu Glu Asp Asp

<210> 19 <211> 6 <212> PRT 62 <213> Artificial <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 19

Thr Glu Asn Vai Lys Glu 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <40Q> 20

Gin Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 21

Vai Gin Gly Glu Glu ser Asn Asp Lys 1 5 <21G> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 22

Phe Glu pro pro Pro Ala Thr Thr Thr 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 23

Gly Asp Lys Tyr Phe Lys Glu Thr Glu 1 5 <210> 24 63 <211> 9

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 24

Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 25

Gly Gly Gin Glu Lys Ser Ala Ala Gly <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 26

Gly Pro cys Pro Gly cys Pro Pro Cys 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 27

Pro pro cys Pro Gly Cys Pro Pro Cys 1 5 <210> 28 <213> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 28

Asp Asn Glu Glu Lys Pro Thr Pro Glu Gin Asp 15 10 64 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 29

Gly Asn Gly Gly Ala pro Ala Gin Pro Lys Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 30

Phe Glu Pro Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Ser Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <22Q> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 31

Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn lie Ser Phe Lys Glu Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 32

Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe Thr Gly Trp Vai Ala 1 S 10 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 33

Ala Gin Asn Pro Asn Lys Thr Asn ser Asn Leu Asp Ser Ser Lys 65 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 34

Asn Lys Asp Asn Glu Ala Glu Pro vai Thr Glu Gly Asn Ala Thr 15 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 35

Ser Lys Glu Gly Asn Gly Pro Asp Pro Asp Asn Ala Ala Lys ser 15 10 15 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 36

Gly Asp Lys Thr Pro Ser Thr Lys Ser Ala Gly Lys Vai Glu Asn Lys 15 10 15 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 37 1 5 Phe

Gly Glu Thr Asp Lys Glu Gly Lys Ile Ile Arg Ile Phe Asp Asn Ser <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial 6 6 <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 38

Ser Ser Thr Ser Glu Asn Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Gly Thr 15 10 15

Asp <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Arti fi ci al <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 39

Gly Asn Asn Asp Glu ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys ser Glu Glu 15 10 15

Glu Glu <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Arti fici al <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 40

Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys ser Lys Lys 15 10 15

Lys Lys <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 41

Gly Asn Asn Asp Glu ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys ser Pro Pro 15 10 15

Pro Pro <210> 42 67 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 42

Ser ser Asn Lys ser Thr Thr Gly Ser Gly Glu Thr Thr Thr Ala Ala 15 10 15

Gly Thr <210> 43 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 43

Cys Gly Asn Asn Asp Glu ser Asn ile Ser Phe Lys Glu Lys Ser Lys 1 5 10 15

Lys Lys Lys <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 44

Gly Ser Pro Leu Ser Phe Glu Ser ser vai Gin Leu Ile Vai Ser Asp 1 5 10 15

Asn ser ser <210> 45 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 45 ser Asn Tyr Ala Lys Lys vai vai Lys Gin Lys Asn His Vai Tyr Thr 15 10 15

Pro vai Tyr 68 <210> 46 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> . <223> PEPTIDO SINTÉTICO <400> 46

Ala Asp vai ile Ala Lys ile vai Glu lie Vai Lys Gly Leu ile Asp 1 5 10 15

Gin Phe Thr Gin Lys 20 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Arti fici al <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 47

Gly Ala Ala ser Ser Leu Thr ryr Glu Ser Ser Vai Gin Leu Vai Vai 15 10 15 ser Asp Asn ser ser 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 48

Gly Gly Glu Pro Ala Ala Gin Ala Pro Ala Glu Thr Pro Ala Ala Ala 15 10 15

Ala Glu Ala Ala ser 20 <210> 49 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 49

Gly Gin Thr Asp Asn Asn ser Ser Gin Ser Gin Gin Pro Gly ser Gly 6 9 1 5 10 15

Thr Thr Asn Thr 20 <210> 50 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PEPTIDO SINTÉTICO <400> 50

Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ser ASp Asp Asp Vai Lys Lys Ala Ala 15 10 15

Thr Val Ala Ile vai Ala 20 <210> 51 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 51 ser Ile val Ser Thr ile lie Glu val val Lys Thr ile Val Asp Ile 15 10 15 val Lys Lys Phe Lys Lys 20 <210> 52 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PÉPTIDO SINTÉTICO <400> 52

Ser ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala 15 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala pro 20 70

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição terapeuticamente eficaz que compreende de um composto de uma fórmula: quantidade V Ri\, çh2 O-CH I CH, I 2 z IÇH2 H^Y X em que Ri representa H ou -CO-R4, R2, R3 e R4 independentemente são H ou C6-C20 alifático opcionalmente substituído; X é um péptido compreendendo a SEQ ID NO:21; e Z é S ou CH2.
2. 2. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização num método para proteger um mamífero contra os efeitos de um ou mais tratamentos ou condições que desencadeiam a apoptose.
3. 3. A composição de acordo com a reivindicação 1 ou a utilização da reivindicação 2, em que a condição é seleccionada de entre o grupo consistindo de radiação, ferimentos, envenenamento, infecção e choque térmico.
4. 4. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 3, em que a condição é a radiação. 1
5. 5. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 2, em que o tratamento é um tratamento do cancro.
6. 6. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 5, em que o referido tratamento é a quimioterapia ou a radioterapia.
7. 7. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 2, em que Ri é H e R2 e R3 ou Ci6 são alifáticos ou seus substitutos.
8. 8. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 2, em que o composto é um estereoisómero RR ou RS, ou mistura dos mesmos.
9. 9. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 4, em que a composição é para administração em combinação com um radioprotector.
10. 10. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 9, em que o radioprotector é um antioxidante.
11. 11. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 10, em que o antioxidante é seleccionado de entre o grupo consistindo de amifostina e vitamina E.
12. 12. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 9, em que o radioprotector é uma citocina. 2
13. 13. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 12, em que a citocina é o factor das células estaminais.
14. 14. A composição ou a utilização da reivindicação 9, em que o radioprotector é flagelina.
15. 15. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 9, em que o radioprotector é TGF βρ latente.
16. 16. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 9, em que o radioprotector é um activador de um TLR.
17. 17. A composição de acordo com a reivindicação 1 para utilização da reivindicação 2, em que a apoptose é desencadeada num tecido seleccionado de entre o grupo que consiste no baço, timo, do tracto GI, pulmões, rins, figado, sistema cardiovascular, do endotélio dos vasos sanguíneos, sistema neural central e periférico, as células progenitoras hematopoiéticas (medula óssea), sistema imunológico, folículos cabelo, e sistema reprodutivo. 3