ES2350485T3 - Método para mejorar la estabilidad y la duración de conservación de complejos de liposomas. - Google Patents

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Abstract

Un método de preparación de un complejo estable de selección como objetivo de células que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico, gen indicador o agente diagnóstico que comprende: proporcionar un complejo que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente diagnóstico, gen indicador o agente terapéutico; combinar dicho complejo liposómico con una disolución acuosa que consiste esencialmente en una cantidad estabilizante de sacarosa en agua o en un tampón hasta una concentración final de alrededor de un 1% a alrededor de un 80% de sacarosa; liofilizar dicha disolución de complejo liposómico y sacarosa para obtener una preparación liofilizada; en el que, tras la reconstitución, dicha preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización.

Description

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. número 60/475.500, presentada el 4 de junio de 2003, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad.
Campo de la Invención
Esta invención se refiere a un método de preparación de un complejo estable que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico o diagnóstico.
Antecedentes de la Invención
Los liposomas catiónicos están compuestos de bicapas lipídicas cargadas positivamente, y se pueden complejar con ADN desnudo cargado negativamente mediante la mezcla simple de los lípidos y el ADN, de forma que el complejo resultante tiene una carga neta positiva. El complejo se puede unir a células, y puede ser absorbido por las células en cultivo con una eficacia de transfección moderadamente buena. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos son seguros y eficaces para la administración de genes in vivo.
Se pueden usar liposomas para seleccionar como objetivo células tumorales modificando los liposomas de forma que administren selectivamente su carga a las células tumorales. Se pueden usar moléculas superficiales para dirigir los liposomas a las células tumorales debido a que el tipo y/o el número de moléculas que revisten el exterior de las células tumorales difieren de los de las células normales. Por ejemplo, si un liposoma tiene una molécula de folato o transferrina (Tf) en su superficie, se dirigirá a las células cancerosas que tengan niveles del receptor de folato o de transferrina que sean superiores a los de las células normales.
Además del uso de ligandos que son reconocidos por los receptores de las células tumorales, también se pueden unir anticuerpos específicos a la superficie de los liposomas, lo que les permite dirigirse hacia antígenos superficiales tumorales específicos (que incluyen, pero sin limitación, los receptores). Estos "inmunoliposomas" pueden administrar fármacos terapéuticos a una población celular específica. Se ha descubierto, por ejemplo, que los fragmentos Fab del anticuerpo monoclonal (Mab) anti-HER-2 conjugados a liposomas se podrían unir de forma específica a una línea de células de cáncer de mama, S-BR-3, que sobreexpresa HER-2 (Park, J.W., et al. PNAS 92:1327-1331 (1995)). Se descubrió que los inmunoliposomas se interiorizaban de forma eficaz, y el anclaje de los fragmentos Fab anti-HER-2 aumentó sus efectos inhibitorios. La combinación de liposomas catiónicos-transferencia génica y las técnicas con inmunoliposomas parece ser un sistema prometedor para la terapia génica dirigida.
Se ha descrito en la técnica un sistema de administración liposomal dirigida por ligandos para la terapia génica con ADN que posee una selección como objetivo de tumores y una eficacia de transfección elevada. Xu, L., et al. Human Gene Therapy 8:467-475 (1997); Xu, L., et al., Human Gene Therapy 10:2941-2952 (1999); y Xu, L., et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999). Este sistema se ha mejorado por medio del uso de un fragmento de anticuerpo de cadena simple anti-receptor de transferrina (TfRscFv) como ligando de selección del objetivo en el complejo (Xu, L., et al. Molecule Medicine 7:723-734 (2001); Xu, L., et al. Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)). El TfRscFv se forma conectando los dominios variables VH y VL componentes de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente, con un péptido ligador diseñado de forma apropiada. El ligador enlaza el extremo C-terminal de la primera región variable y el extremo N-terminal de la segunda, ordenadas como VH-ligador-VL
o VL-ligador-VH. El sitio de unión de un scFv puede reproducir tanto la afinidad como la especificidad del sitio de unión de su anticuerpo original.
Los tratamientos convencionales del cáncer implican los tratamientos con quimioterapia y/o con radiación. La incorporación de estas terapias convencionales del cáncer en un componente nuevo que da como resultado la sensibilización de los tumores a la quimioterapia o a la radioterapia tendría una gran importancia clínica, disminuyendo las dosis eficaces de ambos tipos de modalidades anti-cancerosas y reduciendo de forma correspondiente los efectos secundarios graves asociados a menudo a estos tratamientos.
Los estudios iniciales con complejos liposómicos, tal como se describió anteriormente, han demostrado que los complejos son eficaces en la administración de agentes diagnósticos o terapéuticos a las células seleccionadas como objetivo. Es poco factible administrar los complejos a un paciente inmediatamente tras su preparación. Sería deseable proporcionar complejos liposómicos con selección del objetivo que tras la liofilización y el almacenamiento a 2-8 °C, -20 °C o -80 °C sigan siendo estables durante al menos seis meses, y que se puedan reconstituir sin una pérdida significativa de actividad.
Los informes previos han indicado que se podría liofilizar un complejo de dos componentes (lípido y ADN pero sin ligando o proteínas de selección del objetivo) en presencia de mono-o di-sacáridos, y todavía mantendría su actividad biológica y un tamaño de partícula apropiado para la terapia génica (Li, B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89:355-364 (2000) y Molina, M.D.C. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1445-1455 (2001); Allison, S.D., et al. Biochemical et Biophysical Acta 1468:127-138 (2000)). Además, la Tf unida por medio de PEG a un poliplex PEI-ADN mantuvo cierta actividad biológica después de la congelación y la descongelación (Kursa, M. et al., Bioconjugate Chemistry 14:222-231 (2003)). Es importante indicar que este complejo no se liofilizó, no se proporcionó ninguna indicación de la duración o de las condiciones de almacenamiento, y se añadió un carbohidrato (glucosa), si se incluyó, tras la descongelación. Este complejo polimérico requiere que la Tf esté unida al polímero por medio de una molécula de PEG. La patente de EE.UU. nº 5.811.406 describe complejos polinucleotídicos estabilizados añadiendo un compuesto crioprotector y liofilizando la formulación resultante. Esta referencia no describe un liposoma con un ligando de selección del objetivo, ni un complejo de selección como objetivo de células liofilizado tal como se describe en la presente memoria.
Sumario de la Invención
Un método para preparar un complejo estable que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico o diagnóstico o gen indicador comprende:
combinar un complejo que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente diagnóstico o terapéutico o un gen indicador con una disolución que comprende una cantidad estabilizante de sacarosa tal como se describe en la reivindicación 1; y
liofilizar la disolución resultante de complejo y de sacarosa para obtener una preparación liofilizada;
en el que, tras la reconstitución, la preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización.
En una realización preferida, la preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización, y más preferiblemente, al menos alrededor de un 90% de su actividad pre-liofilización.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 muestra el tamaño (nm) de complejos recién preparados y liofilizados (Tf-LipA-Luc y TfRscFv-LipA-Luc) que contienen un 5% de dextrosa o un 5% de sacarosa.
Las Figuras 2A y 2B muestran la eficacia de transfección in vitro, proporcionada como unidades relativas de luz (URL) por �g de proteína, de complejos recién preparados y liofilizados (Tf-LipA-Luc y TfRscFv-LipA-Luc) que contienen un 5% de dextrosa
o un 5% de sacarosa en células de próstata DU145 humanas.
La Figura 3 muestra la comparación de la eficacia de transfección in vitro de complejo TfRscFv-LipA-Luc recién preparado y liofilizado (URL/�g de proteína) que contiene un 5% o un 10% de sacarosa en células de cáncer de próstata DU145 humanas.
Las Figuras 4A y 4B, respectivamente, muestran la selección como objetivo de tumores por xenoinjerto de DU145 de próstata y de PANCI de páncreas mediante complejos ligando-liposoma-ADN plasmídico liofilizados.
La Figura 5 demuestra en un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de próstata humano (DU145) que la capacidad de selección como objetivo de tumores de un complejo TfRscFv-LipA-p53 preparado en el laboratorio con un 10% de sacarosa se mantiene tras la liofilización y el almacenamiento a 2-8 °C durante hasta seis meses.
La Figura 6 muestra la consistencia de la selección como objetivo de tumores y de la eficacia de transfección entre lotes de complejos TfRscFv-LipA-p53 liofilizados con un 10% de sacarosa en un modelo de ratón con xenoinjerto de DU145.
La Figura 7 muestra la selección como objetivo de tumores y la eficacia de transfección de cinco lotes diferentes preparados y liofilizados comercialmente de TfRscFv-LipA-p53 con un 10% de sacarosa en un modelo de ratón con xenoinjerto de DU145.
La Figura 8 muestra el porcentaje estimado de TfRscFv sin complejar en diversos complejos TfRscFv-LipA-p53 recientes y liofilizados mediante electroforesis en gel no desnaturalizante.
La Figura 9 muestra la comparación in vitro de la inhibición del crecimiento celular entre complejos TfRscFv-LipA-AS-HER-2 liofilizados y recién preparados en células de cáncer de mama MDA-MB-435.
La Figura 10 muestra la comparación in vitro de la quimiosensibilización de PANC-1 mediante complejos TfRscFv-LipA-AS HER-2 recién preparados o liofilizados.
La Figura 11 muestra la inhibición in vitro de la expresión de HER-2 en células de cáncer de mama humanas MDA-MB-435 mediante TfRscFv-LipA-AS HER-2 con un 10% de sacarosa tras la liofilización y el almacenamiento a 2-8 °C durante hasta seis meses.
Descripción Detallada de la Invención
De acuerdo con la presente invención, la estabilidad de los complejos liofilizados de un ligando y de un liposoma que encapsula un agente diagnóstico o terapéutico se puede incrementar combinando los complejos antes de la liofilización con una disolución acuosa de una cantidad estabilizante de sacarosa. La disolución de sacarosa puede ser simplemente sacarosa en agua, o se puede incluir un tampón, tal como PBS, HEPES, TRIS o TRIS/EDTA. En general, la disolución de sacarosa se combina con el complejo hasta una concentración final de alrededor del 1% a alrededor del 80% de sacarosa, el general del 1% a alrededor del 50% de sacarosa, tal como del 1% a alrededor del 10%, 20%, 30% o 40% de sacarosa, preferiblemente de alrededor del 5% al 10% de sacarosa, y lo más preferiblemente alrededor del 10% de sacarosa. La preparación liofilizada es estable en un intervalo de alrededor de 2-8 °C a alrededor de -80 °C durante un periodo de al menos 6 meses sin perder una actividad significativa. Preferiblemente, la preparación es estable durante un período de al menos alrededor de 6-12 meses. Tras la reconstitución, los complejos mantienen al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización, preferiblemente al menos alrededor de un 85% de su actividad pre-liofilización, y lo más preferiblemente al menos alrededor de un 90 -95% de su actividad pre-liofilización.
Los informes previos han indicado que se podría liofilizar una mezcla de lípido y ADN en presencia de mono-o di-sacáridos, y mantener la actividad biológica (Li, B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89:355-364 (2000) y Molina, M.D.C. et al. Journal of Pharmaceutical Sciences 90:1445-1455 (2001); Allison, S.D., et al. Biochemical et Biophysical Acta 1468:127-138 (2000)). Es inesperado, sin embargo, que un complejo de tres componentes que consiste en 1) una proteína (p.ej. transferrina), que incluye incluso una proteína que es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (p.ej., un fragmento de anticuerpo de cadena simple anti-receptor de transferrina, TfRscFv); 2) un liposoma y 3) una molécula terapéutica de ácido nucleico (p.ej. un ADN plasmídico, una molécula de oligonucleótido complementario o incluso una molécula de siARN) se pueda liofilizar y mantenga tanto su tamaño como su actividad biológica tras la reconstitución.
Los complejos liposómicos se administran en general de forma intravenosa. Para la inyección intravenosa, se ha añadido de forma convencional una disolución de un 50% de dextrosa a los complejos ligando-liposoma hasta una concentración final del 5%. Ahora se ha descubierto de forma sorprendente que combinando los complejos ligando-liposoma recién preparados (es decir, un complejo que no tiene más de alrededor de 1 a alrededor de 24 horas) con una disolución de sacarosa, en vez de dextrosa, se puede incrementar de forma significativa la actividad y la duración de almacenamiento de los complejos de tres componentes (que incluyen los que tienen una entidad de selección como objetivo de antígenos) tras la liofilización y la reconstitución.
Los complejos de tres componentes se pueden mezclar simplemente con una disolución de sacarosa antes de la liofilización. El general, la disolución comprende de alrededor del 50% a alrededor del 100% en peso de sacarosa, preferiblemente alrededor del 50% en peso de sacarosa. La liofilización se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento convencional que reduzca el contenido de humedad del complejo hasta menos de alrededor del 1,3%. Un procedimiento preferido comprende liofilizar la disolución que contiene el complejo a una temperatura de -50 °C a -60 °C, 20-50 militorr, preferiblemente 25 militorr, durante 12 a 60 horas, preferiblemente 2048 horas, y después almacenar la preparación liofilizada a una temperatura entre alrededor de 2-8 °C y alrededor de -80 °C. En otro procedimiento preferido, los viales que contienen la disolución de complejo se cargan en un liofilizador de tipo comercial a temperatura ambiente, después la temperatura se modifica linealmente hasta -45 °C ± 3 °C durante 1 hora y se mantiene a esa temperatura durante tres horas. El condensador se enfría después a -80 °C o menos, y el vacío se ajusta a 50 �m de Hg. La temperatura de la bandeja se modifica linealmente después hasta -35 °C ± 3 °C durante 1 hora y entonces se mantiene a esta temperatura durante alrededor de 36-72 horas, preferiblemente alrededor de 48 horas. La temperatura de la bandeja se modifica linealmente después hasta 20 °C ± 3 °C durante 4 horas y se mantiene a esta temperatura durante alrededor de 6 a alrededor de 48 horas, preferiblemente alrededor de 12 horas. Al final de este proceso se restaura la presión de la cámara hasta la presión atmosférica con nitrógeno (pasado a través de un filtro de retención microbiana esterilizante apropiado) y se tapan los viales.
Los complejos liofilizados se pueden reconstituir mediante la adición de agua estéril exenta de endotoxinas igual al volumen de disolución antes de la liofilización. Los complejos secados se disuelven rápidamente con un balanceo suave. No se dan cambios apreciables de tamaño del complejo o del potencial zeta debido a la liofilización o al almacenamiento.
Los complejos adecuados que se pueden mezclar con una disolución de sacarosa, liofilizar y reconstituir son complejos de ligando de selección como objetivo de células/liposoma/molécula terapéutica, indicadora o diagnóstica que posibilitan la administración sistémica dirigida a células de una diversidad de tipos de moléculas terapéuticas o diagnósticas para el uso en el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades. La célula seleccionada como objetivo es preferiblemente una célula cancerosa, pero también puede ser una célula que no es cancerosa. Las células seleccionadas como objetivo cancerosas preferidas incluyen el cáncer de próstata, páncreas, mama, cabeza y cuello, ovario, hígado y cerebro, y el melanoma. Un experto en la técnica sabe bien que la mayoría de los tipos de células cancerosas, que incluyen, pero sin limitación, las enumeradas anteriormente, sobreexpresan del receptor de transferrina y de folato, y que estos receptores también se reciclan rápidamente en las células cancerosas (Li, H., y Qian, Z.M., Medicinal research Reviews 2(3):225-250 (2000); Qian, Z.M., et al., Pharmacological Reviews 54(4):561-587 (2002); Gosselin, M.A., y Lee, P.J., Biotechnology annual Reviews 8:103-131 (2002)).
De forma deseable, la molécula terapéutica es un gen, polinucleótido, tal como ADN plasmídico, fragmento de ADN, oligonucleótido, oligodesoxinucleótido, oligonucleótido complementario, oligonucleótido de ARN/ADN quimérico, ARN, siARN, ribozima, partícula viral, factor de crecimiento, citocina, agente inmunomodulador, u otra proteína, lo que incluye las proteínas que cuando se expresan presentan un antígeno que estimula o inhibe el sistema inmunitario. Los agentes terapéuticos preferidos son las moléculas de ácido nucleico, preferiblemente las moléculas de ADN o siARN. Una molécula de ADN preferida es una que codifica un gen tal como una molécula de p53 de tipo natural, una molécula de Rb94, una molécula de Apoptina, una molécula de EGFG o una molécula complementaria. Un oligonucleótido complementario de HER-2 preferido es contra el gen HER-2, y tiene la secuencia 5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3'. Una molécula de siARN preferida es una que actúa contra el mARN de HER-2. Un experto en la técnica puede determinar otras moléculas terapéuticas preferidas sin experimentación excesiva.
Tal como se indicó anteriormente, la célula seleccionada como objetivo puede ser alternativamente una célula que no es cancerosa. Las células seleccionadas como objetivo preferidas que no son cancerosas incluyen las células dendríticas, las células endoteliales de los vasos sanguíneos, las células pulmonares, las células mamarias, las células de la médula ósea y las células hepáticas. Se puede seleccionar como objetivo células indeseables, pero benignas, tales como las células de la hiperplasia prostática benigna, las células tiroideas hiperactivas, las células de lipomas, y las células relacionadas con las enfermedades autoinmunitarias, tales como las células B que producen anticuerpos implicados en la artritis, lupus, miastenia gravis, metaplasia escamosa, displasia y similares.
De forma alternativa, el agente puede ser un agente diagnóstico que posibilite la detección in vivo tras la administración. Los agentes diagnósticos ejemplares incluyen los materiales densos en electrones, los agentes de formación de imágenes mediante resonancia magnética y los compuestos radiofarmacéuticos. Los radionúclidos útiles para la formación de imágenes incluyen los radioisótopos de cobre, galio, indio, renio, y tecnecio, que incluyen los isótopos 64Cu, 67Cu, 111In, 99mTc, 67Ga o 68Ga. Los agentes de formación de imágenes descritos por Low et al. en la patente de EE.UU.
5.688.488 son útiles en los complejos liposómicos descritos en la presente memoria.
El ligando puede ser cualquier ligando para el receptor que se expresa de forma diferencial en la célula seleccionada como objetivo. Los ejemplos incluyen transferrina, folato, otras vitaminas, EGF, insulina, Heregulina, péptidos RGD u otros polipéptidos reactivos para los receptores de integrina, anticuerpos o sus fragmentos. Un fragmento de anticuerpo preferido es un fragmento Fv de cadena simple de un anticuerpo.
El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo es uno que se unirá a un receptor de la superficie de la célula seleccionada como objetivo, y preferiblemente a un receptor que se expresa de forma diferencial en la célula seleccionada como objetivo. Un anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal anti-TfR, y un fragmento de anticuerpo preferido es un scFv basado en un anticuerpo monoclonal anti-TfR. Otro anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal anti-HER-2, y otro fragmento de anticuerpo preferido es un scFv basado en un anticuerpo monoclonal anti-HER-2.
El ligando se mezcla con el liposoma a temperatura ambiente y a una proporción ligando:liposoma en el intervalo de alrededor de 1:0,001 a 1:500 (µg:nmol), preferiblemente alrededor de 1:10 a alrededor de 1:50 (µg:nmol). El agente terapéutico se mezcla con el liposoma catiónico a temperatura ambiente y a una proporción agente:lípido en el intervalo de alrededor de 1:0,1 a alrededor de 1:50 (µg:nmol), preferiblemente alrededor de 1:10 a alrededor de 1:24 (µg:nmol). En los complejos, por ejemplo, en los que el ligando es transferrina y el agente terapéutico es ADN plasmídico, las proporciones útiles del agente terapéutico respecto del liposoma respecto del ligando están en general dentro del intervalo de alrededor de 1 µg: 0,1-50 nmoles: 0,1100 µg, preferiblemente 1 µg: 5-24 nmoles: 6-36 µg, lo más preferiblemente alrededor de 1 µg: 10 nmoles: 12,5 µg. Si el ligando es TfRscFv, las proporciones útiles del ligando respecto del liposoma están en general dentro del intervalo de alrededor de 1:5 a 1:40 (µg:µg), preferiblemente 1:30 (µg:µg), y la proporción de ADN plasmídico respecto del liposoma en general está dentro del intervalo de alrededor de 1:6 a 1:20 (µg:µg), preferiblemente 1:14 (µg:µg). Si el agente terapéutico es un oligonucleótido (ODN) en vez de ADN plasmídico, las proporciones típicas de ligando, liposoma y el ODN son 0,1 nmoles a 36 nmoles (ODN:liposoma) y 0,1 µg a 100 µg (ligando:liposoma), preferiblemente 0,5 nmoles a 20 nmoles (ODN:liposoma) y 0,5 µg a 50 µg (ligando:liposoma), lo más preferiblemente 1 nmol a 15 nmoles (ODN:liposoma) y 1 µg a 30 µg (ligando:liposoma). Si el agente terapéutico es un siARN, las proporciones útiles de los componentes pueden ser 0,1 µg a 30 nmoles (siARN:liposoma) y 0,1 µg a 100 µg (TfRscFv:liposoma), preferiblemente 1 µg a 7 nmoles (siARN:lipsosoma) y 1 µg a 30 µg (TfRscFv:liposoma).
Es útil una amplia diversidad de liposomas catiónicos en la preparación de los complejos. La solicitud PCT publicada WO99/25320, incorporada en la presente memoria como referencia, describe la preparación de varios liposomas catiónicos. Los ejemplos de liposomas deseables incluyen los que comprenden una mezcla de fosfato de dioleoiltrimetilamonio (DOTAP) y dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y/o colesterol (col), o una mezcla de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y DOPE y/o colesterol. La proporción de los lípidos se puede variar para optimizar la eficacia de la absorción de la molécula terapéutica para el tipo celular seleccionado como objetivo específico. El liposoma puede comprender una mezcla de uno o más lípidos catiónicos y uno o más lípidos neutros o auxiliares. Una proporción deseable de lípido(s) catiónico(s) respecto de el/los lípido(s) neutro(s) o auxiliar(es) es de alrededor de 1:(0,5-3), preferiblemente 1:(1-2) (proporción molar).
En una realización, el liposoma usado para formar el complejo es un liposoma estabilizado estéricamente. Los liposomas estabilizados estéricamente son liposomas en los que se ha integrado un polímero hidrófilo, tal como PEG, poli(ácido 2-etilacrílico)
o poli(n-isopropilacrilamida) (PNIPAM). Tales liposomas modificados pueden ser útiles en particular cuando se complejan con agentes terapéuticos o diagnósticos, ya que no son eliminados de la circulación sanguínea por el sistema reticuloendotelial tan rápidamente como lo son los liposomas comparables que no se han modificado de esta forma. En una segunda realización, el liposoma usado para formar el complejo está unido también a un péptido compuesto de histidina y lisina (ramificado o lineal) cuando el péptido tiene una longitud de al menos alrededor de 10 aminoácidos, el general entre alrededor de 10 y 1000 aminoácidos, y está compuesto de un 5-100% de histidina y un 0-95% de aminoácidos que no son histidina; preferiblemente al menos un 10% de los aminoácidos que no son histidina son lisina. Lo más preferiblemente, el péptido tiene una longitud de alrededor de 31 aminoácidos, aproximadamente un 20% de los cuales son histidina y aproximadamente un 80% de los cuales no son histidina. De éstos, al menos un 75% son lisina y al menos uno es una cisteína terminal. Un péptido preferido tiene la estructura 5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3', y se puede conjugar de manera covalente al liposoma por medio de la cisteína terminal y un grupo maleimida del liposoma. En tales complejos, las proporciones de los componentes pueden ser en general las siguientes: ligando respecto de HK-liposoma (µg: µg) de 1:5 a 1:40, preferiblemente, 1:30, y ADN respecto de HK-liposoma (µg:nmol) de 1:1 a 1:20, preferiblemente 1:14.
Los complejos se pueden preparar mezclando el ligando-liposoma y el agente terapéutico o diagnóstico, invirtiendo lentamente la disolución resultante varias veces o agitando la disolución a una velocidad a la que justamente se forma un vórtice en la disolución durante un periodo que oscila de alrededor de 10 segundos a alrededor de 10 minutos, preferiblemente 15 segundos a alrededor de 2 minutos.
Los complejos se pueden administrar en combinación con otro agente terapéutico, tal como un agente radioterápico o quimioterápico. El agente terapéutico, o una combinación de agentes terapéuticos, se puede administrar antes o después de la administración del complejo, por ejemplo dentro de alrededor de 12 horas a alrededor de 7 días. Los agentes quimioterápicos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5FU), cisplatino (CDDP), docetaxel, gemcitabina, paclitaxel, vinblastina, etopósido (VP-16), camptotecina, actinomicina-D, mitoxantrona y mitomicina C. Las radioterapias incluyen la radiación �, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de Complejos Recientes y Liofilizados con Carbohidrato y Determinación In Vitro de la Actividad y el Tamaño
Se llevaron a cabo experimentos iniciales para ensayar tanto el tamaño como la eficacia de transfección in vitro de los complejos ligando-liposoma-ácido nucleico producidos con carbohidrato antes y después de la liofilización. Se ensayaron dos ligandos distintos, Tf y TfRscFv. Los complejos se produjeron mediante el uso de la metodología descrita en la solicitud de patente de EE.UU. 09/601.444 y las solicitudes de patentes De EE.UU. publicadas 09/914.046 y 10/113.927 [véase también, Xu, L., et al. Human Gene Therapy 10:2941-2952 (1999); Xu, L., et al., Human Gene Therapy 13:469-481 (2002); y Xu, L., et al., Molecular Cancer Therapeutics 1:337-346 (2002)]. En cada complejo, el liposoma estuvo a una proporción 1:1 de DOTAP:DOPE, identificado en la presente memoria como Liposoma A (LipA). El ADN usado fue un plásmido que portaba un gen que codificaba el gen de luciferasa de luciérnaga. En todos los casos, la disolución de carbohidrato se añadió en la última etapa de la preparación del complejo.
Se hizo una serie de 8 complejos. Cuatro contuvieron Tf como ligando (a una proporción de ADN:LipA:Tf de 1 µg:10 nmoles:12,5 µg); cuatro contuvieron TfRscFv como ligando (a una proporción de ADN:LipA:TfrscFv de 1 µg:14 nmoles:0,34 µg). Las disoluciones que contenían el ligando-liposoma y el ADN se mezclaron entre sí, se invirtieron lentamente 10 veces, y la disolución resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la adición de una disolución acuosa de dextrosa
o de sacarosa en agua hasta una concentración final del 5%. Cada mezcla resultante se invirtió 10 veces y después se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la liofilización o la transfección.
Las disoluciones a liofilizar se liofilizaron mediante el uso de un liofilizador Virtis Benchtop 3L a 25 militorr durante 24 horas, a -55°C, y después se almacenaron durante la noche a -80 °C antes de la reconstitución. Después de la reconstitución con un volumen de agua igual al volumen de disolución antes de la liofilización, el recipiente que contenía cada disolución se invirtió lentamente 10 veces y se mantuvo a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de este tiempo, el complejo reconstituido se pudo mantener a 2-8 °C durante hasta 24 horas. Se midió el tamaño de los complejos antes y después de la liofilización mediante dispersión de luz láser dinámica con el uso de un Zetasizer 3000H de Malvern.
Los resultados de la determinación del tamaño (promedio en número) se muestran en la Figura 1. Cuando Tf fue el ligando, hubo un incremento aproximado de 10 veces en el tamaño tras la liofilización en presencia de un 5% de dextrosa. Mientras el tamaño del complejo recién preparado con un 5% de sacarosa fue ligeramente mayor que el que tenía un 5% de dextrosa, no hubo esencialmente ningún cambio pre/postliofilización en presencia de sacarosa. Se observó un patrón similar cuando se usó TfRscFv como ligando. Aquí también el uso de un 5% de sacarosa proporcionó resultados post-liofilización mucho mejores.
Se ensayó también la eficacia de transfección en una línea de células tumorales de próstata DU145 humana de los complejos recientes y liofilizados. Se compararon las eficacias de transfección de los complejos liofilizados (con Tf y TfRscFv) tras la reconstitución, y de la disolución recién hecha correspondiente del mismo complejo. Los resultados de la eficacia de transfección pre-y post-liofilización se muestran en las Figuras 2A y 2B. Cuando el ligando fue Tf, la eficacia cayó tras la liofilización hasta alrededor de un 60% de la del complejo recién preparado para la preparación que contenía un 5% de dextrosa, mientras la preparación liofilizada que contenía un 5% de sacarosa mantuvo alrededor de un 80% de su actividad inicial. El patrón fue similar con el ligando TfRscFv. El complejo liofilizado que contenía un 5% de dextrosa cayó hasta alrededor de un 50% de la actividad del reciente, mientras se mantuvo alrededor de un 90% de la actividad cuando se usó un 5% de sacarosa (Fig. 2B). Así, la sacarosa es un estabilizante más eficaz que la dextrosa.
La proporción carbohidrato/complejo se optimizó adicionalmente para mejorar la estabilidad y mantener el tamaño de las partículas. Se compararon los complejos con un 5% y 10% de sacarosa. La cantidad de ADN plasmídico también se incrementó hasta 20 �g, la cantidad usada normalmente para una inyección simple en los estudios in vivo discutidos más adelante. Tras la liofilización como se describió anteriormente, la eficacia de transfección del complejo que contenía un 10% de sacarosa fue un ~95% de la observada con el complejo recién preparado de forma convencional con una disolución de un 5% de dextrosa. La Figura 3 muestra una comparación de la eficacia de transfección entre los complejos preparados con un 5% y 10% de sacarosa. La eficacia de transfección in vitro con el complejo liofilizado que contenía un 10% de sacarosa fue la mejor. Se descubrió que esto era cierto independientemente de si se usaba la proteína o el fragmento de anticuerpo como ligando de selección del objetivo. También se determinó el tamaño de los complejos que contenían un 10% de sacarosa antes y después de la liofilización mediante el uso de las condiciones proporcionadas anteriormente. No hubo una diferencia significativa entre los tamaños de los complejos producidos con un 10% de sacarosa, antes y después de la liofilización, en comparación con el complejo recién preparado convencional hecho con un 5% de dextrosa. Se descubrió que éste también era el caso independientemente del ligando de selección del objetivo.
Así, la presencia de un 10% de sacarosa en una preparación reconstituida de complejos liposómicos dio como resultado un mantenimiento superior de la actividad biológica y del tamaño que el obtenido con preparaciones reconstituidas comparables que contenían un 5% de dextrosa o un 5% de sacarosa.
Ejemplo 2 Selección como Objetivo de Tumor de Próstata Humano In Vivo Mediante un Complejo Liofilizado tras Almacenamiento a 2-8 °C Durante una Semana
La selección como objetivo de un tumor in vivo con un complejo liposómico con un 10% de sacarosa (recién hecho o liofilizado y almacenado durante 1 semana a 2-8 °C) se ensayó mediante el uso de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) como gen indicador en el complejo. El complejo fue TfRscFv-Liposoma A-pEGFP, en el que el liposoma A es DOTAP:DOPE (1:1). La proporción de los tres componentes fue 0,3 µg:14 nmoles:1 µg (TfRscFv:Liposoma:ADN). El complejo se preparó y se liofilizó como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Tras la liofilización, el complejo se almacenó refrigerado a 2-8 °C durante una semana. Las muestras se reconstituyeron mediante la adición de agua exenta de endotoxinas hasta un volumen igual al anterior a la liofilización, como se describió en el Ejemplo 1.
Se inyectaron i.v. 3 veces durante 24 horas diversos complejos (preparación recién hecha con un 5% de dextrosa; preparación recién hecha con un 10% de sacarosa y una preparación liofilizada y reconstituida con un 10% de sacarosa que antes de la reconstitución se había mantenido refrigerada durante 1 semana a 2-8 °C con TfRscFv como ligando de selección del objetivo) a ratones que albergaban tumores por xenoinjertos DU145 de al menos 50 mm3. Después de 48 horas, los animales se sacrificaron, se extirpó el tumor y el hígado, se aislaron las proteínas y se llevaron a cabo análisis de Western mediante el uso de Ab anti-EGFP (COVANCE). Tal como se muestra en la Figura 4A, el complejo liofilizado y reconstituido con un 10% de sacarosa tuvo un nivel comparable de expresión génica en comparación con cualquiera de los complejos recién preparados. De forma más significativa, mientras fue evidente un nivel elevado de expresión génica exógena en los tumores, casi no se expresó EGFP en los hígados de los ratones, lo que demostró la naturaleza específica hacia el tumor del complejo, y que esta especificidad dirigida hacia el tumor se mantuvo después de la liofilización, el almacenamiento a 2-8 °C durante al menos una semana y la reconstitución.
Ejemplo 3 Selección como Objetivo de Tumor Pancreático Humano In Vivo Mediante un Complejo Liofilizado tras Almacenamiento a -80 °C durante un Mes
También se ensayó la estabilidad del complejo liofilizado después de un mes de almacenamiento a -80 °C seleccionando como objetivo tumores por xenoinjerto de cáncer pancreático. El complejo (el mismo complejo y proporción que se describieron anteriormente en el Ejemplo 2) se preparó con un 10% de sacarosa y se liofilizó como se describió en el Ejemplo 1. Tras la liofilización, las muestras se almacenaron a -80 °C durante un mes, después se reconstituyeron con agua exenta de endotoxinas como se describió en el Ejemplo 1.
Tal como se muestra en la Figura 4B, los tumores de los ratones a los que se inyectó i.v. 3 veces durante un periodo de 24 horas (como en el Ejemplo 2 anterior) mostraron un nivel aún más elevado de expresión génica de EGFP que el hallado tras la inyección del complejo recién preparado. De nuevo, se observó muy poca o ninguna expresión en el hígado.
Ejemplo 4 Estabilidad a Largo Plazo del Complejo Liofilizado Almacenado a 2-8 °C Determinada Mediante el Tamaño y la Eficacia de Transfección In Vitro
Para incrementar el potencial del complejo TfRscFv-liposoma-ADN como compuesto terapéutico clínico viable, se desarrolló un medio para incrementar su estabilidad, manteniendo así su capacidad para ser dirigido hacia tumores, y la duración de almacenamiento. Algunos de los estudios han indicado que el complejo liofilizado con un 10% de sacarosa como excipiente se podría almacenar de forma eficaz a -20 °C, 80 °C o 2-8 °C. Por comodidad para el uso en la clínica, el método preferido de almacenamiento es a 2-8 °C. Para determinar el período de tiempo que el complejo liofilizado se puede almacenar a 2-8 °C sin pérdida de actividad biológica, se estudió la eficacia de transfección in vitro del complejo liofilizado y almacenado a 2-8 °C durante 1, 4 y 6 meses. El complejo fue TfRscFv-Liposoma A-p53, en el que el liposoma A es DOTAP:DOPE (1:1). La proporción de los tres componentes fue 0,3 µg: 14 nmoles: 1 µg (TfRscFv: Liposoma A: ADN), que es equivalente a 0,34 µg:10 µg:1 µg. Se usó un 10% de sacarosa como excipiente. El ADN del complejo fue un vector plasmídico que contenía una secuencia de cADN de ~1,7 Kb que codifica p53 humano de tipo natural.
El complejo se preparó, se liofilizó y se reconstituyó en el momento apropiado tras el almacenamiento a 2-8 °C como se describió en el Ejemplo 1. Se determinó el tamaño (parámetro en número) y el potencial zeta mediante el uso de un 3000H Zetasizer de Malvern. La actividad funcional se determinó mediante el uso de un ensayo de co5 transfección de luciferasa. Las células DU145 de cáncer de próstata humano se cotransfectaron con ADN plasmídico BP100 y con los complejos. El plásmido BP100 porta el gen de luciferasa bajo el control de un promotor inducible de wtp53. Así, el nivel de la actividad de luciferasa refleja el nivel de p53 funcional en las células transfectadas. 24 horas tras la transfección, las células se lisaron y se ensayó la actividad
10 de luciferasa, mediante el uso del Reactivo de Luciferasa de Promega según el protocolo del fabricante. Tal como se muestra en la Tabla 1, la actividad de luciferasa, el tamaño y el potencial zeta de los complejos son consistentes entre el complejo recién preparado y los complejos liofilizados y almacenados a 2-8 °C durante hasta seis meses.
15 Tabla 1 Comparación del Complejo Liofilizado con el Complejo Recién Preparado
Actividad de luciferasa (URL/�g)
Tamaño (nm) Potencial zeta
UT
- - -
BP100
- - -
Reciente-1
19,550 - 25,3
Reciente-2
19,825 453,7 (100%) 8,0
Lio. 1mes-1
15,420 450,8 (99,3%) 28,9
Lio. 1mes-2
13,879 463,3 (99,8%) 33,2
Lio. 4mes-1
20,055 462,5 (99,4%) 29,1
Lio. 4mes-2
18,413 554,2 (99,4%) 27,5
Lio. 4mes-3
22,058 548,5 (100%) 29,4
Lio. 6mes-1
14,507 550 (99,7%) 23
Lio. 6mes-2
13,301 414,5 (99,4%) 28
Lio. 6mes-3
15,028 386,4 (99,4%) 25,6
Ejemplo 5 Selección del Objetivo Específica de Tumores In Vivo del Complejo Liofilizado Administrado de Forma Sistémica tras Almacenamiento a 2-8 °C
Los complejos recientes y liofilizados, preparados, almacenados a 2-8 °C durante 1, 4, o 6 meses, y después reconstituidos para los estudios descritos en el Ejemplo 4 se ensayaron también in vivo en función de su capacidad de alcanzar y transfectar tumores de próstata humanos por xenoinjerto tras la administración sistémica (i.v.). Se inyectó i.v. tres veces durante 24 horas el complejo (reciente o liofilizado y reconstituido) en una cantidad equivalente a 40 µg de ADN por inyección en un volumen final de 0,8 mL a ratones atímicos que albergaban tumores por xenoinjertos subcutáneos de la línea celular tumoral humana DU145 de próstata de al menos 100 mm3. A las 48 horas tras la última inyección, los animales se sacrificaron humanamente, se extrajeron los órganos, se aislaron las proteínas y se determinó la expresión mediante análisis de Western tal como describió Xu, L. et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999). Se podrían haber usado de forma alternativa otros métodos conocidos generalmente en la técnica. Se cargaron 80 µg de lisado de proteínas totales por carril en un gel de un 12% de SDS-poliacrilamida. Después de realizar la electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se analizó con una sonda de anticuerpo monoclonal anti-p53 de ratón (Oncogene Research Products).
Los resultados de la selección como objetivo de tumores in vivo en ratones se muestran en la Fig. 5. Los niveles de expresión de p53 fueron similares entre los del tumor de los animales que recibieron el complejo recién preparado y los de los animales que recibieron cada uno de los complejos liofilizados, incluso seis meses después de la liofilización. Los niveles de expresión de p53 en todos los tumores fueron significativamente mayores que los del hígado, lo que demuestra que la especificidad hacia el tumor tras la administración i.v. se mantiene incluso después de 6 meses de almacenamiento a 2-8 °C.
Ejemplo 6 Consistencia entre Lotes y Estabilidad tras la Liofilización
Es importante establecer que los múltiples lotes de complejo, preparados y liofilizados en diferentes momentos en el mismo día, y preparados y liofilizados en diferentes días, tienen tamaños similares y niveles similares de eficacia de transfección.
Se preparó el complejo TfRscFv-Liposoma A-p53, en el que el liposoma A es DOTAP:DOPE (1:1), se liofilizó, se almacenó y se reconstituyó como se describió en el Ejemplo 1. La proporción de los componentes y el ADN de p53 fueron como se describieron en el Ejemplo 4.
5 Se estudió la expresión funcional de múltiples complejos TfRscFv-LipA-p53 recién preparados o liofilizados en células DU145 de cáncer de próstata. Se determinó la actividad in vitro mediante el uso del plásmido BP100 y el ensayo de luciferasa tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 4. En 5 días diferentes, se prepararon al menos dos muestras independientes y se liofilizaron. Después de almacenarlas a 2
10 8 °C durante 2 semanas, las muestras se reconstituyeron como en el Ejemplo 1 y se analizaron in vitro e in vivo. In vitro, se ensayó la actividad de luciferasa (URL/µg: unidades relativas de luz por µg de proteína en la célula) mediante el uso del Reactivo de Luciferasa de Promega tal como se describe en el protocolo del fabricante, y también se midió el potencial zeta y el tamaño de partícula (parámetro en número) de cada lote
15 en un 3000H Zetasizer de Malvern. Tal como se muestra en la Tabla 2, mediante el parámetro en número, el tamaño de la mayoría de las preparaciones se halla dentro del intervalo de 400-700 nm, y los potenciales zeta están todos en un intervalo positivo. Así, los diferentes complejos producidos en diferentes días tienen un comportamiento consistente.
20 Tabla 2
Tamaño
Muestra nº
Actividad de Luciferasa (URL/�g de Proteína) En número (nm) Potencial Zeta
1/2/03 1
17284 ± 1175 100% 466 16
1/2/03 2
21703 ± 2422 99% 509 32
1/3/03 1
16246 ± 1121 100% 575 38
1/3/03 2
19225 ± 1118 100% 477 32
1/7/03 1
17921 ± 1564 100% 537 39
1/7/03 2
17519 ± 3029 95% 444 31
1/8/03 1
21534 ± 3028 100% 668 29
1/8/03 2
21528 ± 3922 100% 750 32
1/9/03 1
18146 ± 1612 100% 478 60
1/9/03 2
12521 ± 172 91% 645 38
Reciente
12806 66% 147 38
Reciente
13173 100% 258 40
BP 100
131 NA NA
UT
103 NA NA
También se han estudiado las muestras in vivo en ratones atímicos que albergan xenoinjertos de DU145 como se describió en el Ejemplo 5. Para demostrar que el complejo ligando-liposoma-ADN que emplea TfRscFv como entidad de selección del
5 objetivo mantiene la especificidad hacia el tumor, se empleó un análisis de Western (Figura 6). Estos lotes independientes de complejo TfRscFv-LipA-p53 se ensayaron en el modelo de ratón con xenoinjerto subcutáneo de DU145 de próstata humana. Se inyectaron de forma intravenosa los complejos (40 µg de ADN/inyección) tres veces durante un periodo de 24 horas a los ratones atímicos que portaban los tumores
10 DU145 de ~50-100 mm3. Veinticuatro horas después de la última inyección, los animales se sacrificaron y se extirpó el tumor y el hígado. Se aislaron las proteínas. Se cargaron 80 µg de lisado de proteínas totales por carril de un gel de un 12% de SDSpoliacrilamida. Después de realizar la electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se analizó con una sonda de anticuerpo monoclonal anti
15 p53 de ratón (Oncogene Research Products). Posteriormente se analizaron los niveles de GAPDH en la membrana con una sonda para demostrar que la carga había sido uniforme. Son evidentes unos niveles elevados de expresión de p53 en el tumor de los ratones que recibieron los complejos que contenían cada uno de los diversos lotes (Fig. 6). Se observó un nivel similar de expresión de p53 en los tumores con el com
20 plejo TfRscFv recién preparado o liofilizado. En contraste, se observó una expresión muy baja de p53 en los ratones que no se trataron con el complejo. La especificidad hacia el tumor se demuestra por los niveles muy bajos de expresión en el hígado. En todos los casos, existe una diferencia de 5-10 veces en la expresión entre el tumor y el hígado. Comparado con el nivel de p53 en el tumor sin tratar, todas las preparaciones
25 proporcionaron una señal intensa de p53 en los tumores de los ratones tratados, pero no en los hígados correspondientes en los mismos ratones. Por lo tanto, estos estudios indican que la liofilización del complejo completo es viable, y que puede ser capaz de superar los problemas de estabilidad y de duración del almacenamiento.
30
Ejemplo 7 Liofilización por un Fabricante Comercial: Ensayos In Vitro e In Vivo
Para que un complejo liofilizado sea útil en el tratamiento de pacientes humanos, es necesario demostrar que el procedimiento de la preparación del complejo en presencia de un 10% de sacarosa podría ser transferido y realizado con éxito a gran escala por una entidad de fabricación comercial. Los complejos fueron preparados mediante agitación, bajo contrato y con un acuerdo de confidencialidad, por Cardinal Health, Albuquerque, NM. La disolución de ADN se añadió a la disolución de TfRscFv:liposoma mientras se agitaba a una velocidad a la que justamente se formaba un vórtice en la disolución durante 30 segundos a 1 minuto. Esta disolución se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 -20 minutos, tras lo cual se añadió una disolución acuosa de un 50% de sacarosa con agitación como anteriormente durante 30 segundos a 1 minuto hasta una concentración final del 10%, y se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 -20 minutos. Los lotes preparados comercialmente tuvieron un tamaño en el intervalo de 50-1000 ml. El protocolo de liofilización mediante el uso de un liofilizador Hull en esta instalación comercial fue el siguiente:
•
Se cargaron viales de 10 ml, cada uno con un contenido de 5 mL de complejo con un 10% de sacarosa, a temperatura ambiente.
•
La temperatura de la bandeja se modificó linealmente hasta -45 °C durante 1 hora. Una vez que la temperatura de la bandeja alcanzó -45 ± 3 °C, el producto se mantuvo durante 3 horas.
•
En este punto, el condensador se enfrió hasta -55 °C o menos, y el vacío se ajustó a 50 �m de Hg.
•
La temperatura de la bandeja se modificó linealmente después hasta -35 °C durante 1 hora.
•
Una vez que la temperatura de la bandeja alcanzó -35 °C, el producto se mantuvo durante 48 horas.
•
La temperatura de la bandeja se modificó linealmente hasta 20 °C durante 4 horas y el producto se mantuvo durante 12 horas.
•
Al final del ciclo, la presión de la cámara se restauró hasta la presión atmosférica con nitrógeno, y se filtró NF a través de un filtro de retención microbiana esterilizante apropiado.
•
El producto se tapó, se etiquetó y se almacenó a 2-8 °C.
La entidad comercial preparó cinco lotes diferentes del complejo TfRscFv-LipAp53. Se muestra un ejemplo de la actividad de luciferasa in vitro, el tamaño y el potencial zeta de los lotes representativos preparados comercialmente en la Tabla 3. El ta
5 maño, el potencial zeta y el nivel de actividad de luciferasa de los complejos preparados comercialmente y liofilizados fueron comparables a los de los complejos recién preparados en el laboratorio.
Tabla 3 10
Muestra
Actividad de Luciferasa (URL/µg de proteína) Tamaño en Número (nm) Potencial Zeta
Reciente
16,7 x 104 413 35
Comercial
12,4 x 104 16,4 x 104 416 412 29,8 30,9
Para comparar los cinco lotes, se trataron ratones que albergaban xenoinjertos de DU145 como se describió en el Ejemplo 5 (a 40 µg de ADN/inyección en 0,8 mL). Cada ratón recibió tres inyecciones i.v. durante 24 horas. Cuarenta y ocho horas des
15 pués de la última inyección, los animales se sacrificaron y se recogieron los órganos. Los cinco lotes mostraron niveles elevados de expresión de p53 mediante análisis de Western que fueron comparables a los del complejo recién preparado, y significativa-mente mayores que los observados en el tumor sin tratar o el hígado (Fig. 7). Por lo tanto, esta técnica se puede transferir con éxito a los fabricantes comerciales.
20 Ejemplo 8 Consistencia del Porcentaje de Niveles de TfRscFv sin Complejar en el Complejo Liofilizado
25 Para estudiar adicionalmente la estabilidad del complejo liofilizado, se determinó la cantidad de ligando sin complejar tras el almacenamiento a 2-8 °C durante hasta seis meses. Para determinar la cantidad de TfRscFv sin complejar presente en el complejo TfRscFv-LipA-p53, se empleó una electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante y no reductora con un gradiente del 4%-20% seguida por un análisis de Western mediante el uso de métodos conocidos en general para un experto en la técnica (Fig. 8). Se usó un anticuerpo policlonal de conejo hacia la proteína TfRscFv como primer anticuerpo (producido por Animal Pharm, Healdsburg, CA) y un anticuerpo monoclonal anti-conejo de ratón marcado con HRP (Sigma) como anticuerpo secundario. Se prepararon complejos recién hechos o liofilizados que contenían 134 ng de TfRscFv en cada uno y se liofilizaron como se describió en el Ejemplo 1. Las muestras liofilizadas se almacenaron a 2-8 °C durante 1, 4, o 6 meses, tras lo cual se reconstituyeron como en el Ejemplo 1. Una vez complejada a los liposomas, la proteína TfRscFv no será capaz de entrar en el gel de PAGE. Por lo tanto, solamente se detectará la TfRscFv libre sin complejar. Es difícil, en condiciones no desnaturalizantes y no reductoras, determinar con precisión la cantidad del monómero de TfRscFv libre. Así, las muestras sin complejar que contenían 13,4 ng (el 10% de éstos en cada uno de los complejos), 26,8 ng (20%) o 40,2 ng (30%) del agente simple TfRscFv se sometieron también a electroforesis en el mismo gel como patrones de concentración para proporcionar una estimación aproximada de la cantidad de TfRscFv sin complejar en cada uno de los complejos de ensayo.
Los resultados indicaron que aproximadamente un 10% o menos del TfRscFv colocado inicialmente en el complejo está presente en forma de TfRscFv libre en las diversas preparaciones recientes o liofilizadas de complejo TfRscFv-LipA-p53, incluso después del almacenamiento a 2-8 °C durante seis meses. Estos datos indican que la cantidad de TfRscFv libre, sin complejar, es bastante consistente en todas las preparaciones, y que este nivel no cambia tras la liofilización y el almacenamiento a 2-8 °C durante al menos seis meses.
Ejemplo 9 Liofilización de un Complejo Ligando-Liposoma-Ácido Nucleico que Contiene un Oligonucleótido complementario de HER-2
Los estudios anteriores usaron ADN plasmídico en el complejo. Debido a que el ADN plasmídico y los oligonucleótidos no son siempre intercambiables, y pueden tener químicas diferentes, también se llevaron a cabo experimentos para demostrar que el procedimiento de liofilización se podría aplicar a un complejo ligando-liposoma que contuviera un oligonucleótido (ODN). El ODN usado fue una secuencia complementaria 15-mérica fosforotioada de ODN de HER-2 específica complementaria a la región del codón de iniciación del gen HER-2 (AS HER-2) con la secuencia 5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3'. Mediante el uso de la línea de células de cáncer de mama humana MDAMB-453 como sistema de ensayo, se estudió la destrucción celular mediante el complejo TfRscFv-lipA-AS HER-2 tras la liofilización con diferentes carbohidratos a concentraciones crecientes de ODN. Los complejos se prepararon como se describió en el Ejemplo 1 y estuvieron compuestos de TfRscFv, Liposoma A (DOTAP:DOPE a 1:1) y el ODN a una proporción de 1 nmol a 15 nmoles (ODN:liposoma) y 1 µg a 30 µg (TfRscFv:liposoma).
Los complejos a liofilizar se prepararon para que contuvieran un 5% de dextrosa o un 10% de sacarosa, y se compararon con preparaciones de complejos comparables recién preparadas que comprendían un 10% de sacarosa. Los complejos se liofilizaron como se describió en el Ejemplo 1, se almacenaron durante la noche a 2-8 °C y se reconstituyeron en agua exenta de endotoxinas como se describió en el Ejemplo 1. Se sembraron 5 x 103 células MDA-MB-453 por pocillo de una placa de 96 pocillos. 24 horas más tarde, las células se transfectaron con los complejos recién preparados o liofilizados y reconstituidos. El ensayo de citotoxicidad basado en la viabilidad celular con XTT (XTT=3'-[1-fenil-Amino-Carbonil)-3,4-[tetrazolio]-bis(4-metoxi-6-nitro)benceno sulfonato) se llevó a cabo por triplicado 48 horas post-transfección. Tal como se muestra en la Figura 9, a concentraciones de ODN de AS-HER-2 por encima de 0,25 µM, el complejo liofilizado y reconstituido que contenía un 10% de sacarosa tuvo el mayor efecto en la destrucción celular. A las concentraciones más altas de ODN, los complejos que contenían un 10% de sacarosa tanto recientes como reconstituidos fueron muy superiores a los que tenían un 5% de dextrosa, y la liofilización no tuvo un efecto adverso sobre la capacidad de destrucción celular del ODN complementario de HER-2 contenido en el complejo.
Para confirmar que la liofilización y la reconstitución en presencia de un 10% de sacarosa no fue perjudicial para la eficacia del complejo, se realizó un ensayo con XTT que determinaba el nivel de quimiosensibilización a Gemzar en células de cáncer pancreático humano 1 (PANC), comparando los complejos recién preparados con complejos comparables que se habían liofilizado y reconstituido como se describió en el Ejemplo 1. Las proporciones de los componentes en el complejo fueron 1 nmol : 15 nmoles (ODN:liposoma) y 1 µg : 30 µg (TfRscFv:liposoma). Se sembraron 4 x 103 células PANC-1 por pocillo en una placa de 96 pocillos, y se transfectaron 24 horas más tarde con complejo TfRscFv-LipA-AS HER-2 (0,25 µM de ODN) que se había preparado recientemente o que se había mezclado con sacarosa para proporcionar un 10% de sacarosa y se había liofilizado, almacenado con refrigeración durante la noche a 28 °C y reconstituido. El fármaco quimioterápico Gemzar se añadió 24 horas después. El ensayo basado en la viabilidad celular con XTT se llevó a cabo por triplicado 72 horas tras la adición del fármaco. Los resultados se ilustran en la Figura 10. Tal como se muestra, las curvas de supervivencia de las muestras fueron prácticamente idénticas. Además, los valores de CI50 (la concentración de fármaco que destruye un 50% de las células) de los complejos son los mismos, si no menores, que los que se determinaron previamente mediante el uso de un complejo recién preparado con un 5% de dextrosa. El método de preparación y de almacenamiento de esta invención es así adecuado también para el uso con cualquier oligonucleótido complementario, ya que el gen seleccionado como objetivo es irrelevante para el procedimiento.
Estos estudios indican que la liofilización del complejo completo es factible, y que se pueden superar las dificultades previas con la estabilidad y la duración de almacenamiento cuando se usa ODN como molécula terapéutica.
Ejemplo 10 Mantenimiento del Tamaño, Potencial Zeta y Eficacia tras la Liofilización de un Complejo que Porta ODN AS y el Almacenamiento durante Seis Meses
Se examinó el tamaño, el potencial zeta y la actividad de transfección de los complejos ligando-liposoma-ácido nucleico que contenían ODN de AS HER-2 y preparados con un 10% de sacarosa antes y después de la liofilización. Se descubrió que el tamaño del complejo era básicamente el mismo antes y después de la liofilización y el almacenamiento a -20 °C durante hasta seis meses. Por ejemplo: Pre-liofilización, los valores de tamaño (nm) en intensidad, volumen y promedio en número para los complejos recientes y liofilizados durante seis meses preparados como se describió en el Ejemplo 9 fueron 410 (I), 454 (V) y 368 (N) frente a 339 (I), 427 (V) y 397 (N), respectivamente. Además, también se complejó otro oligonucleótido que no afecta a los niveles de HER-2 (SC-ODN_ (5'-CTA GCC ATG CTT GTC-3') en la misma proporción, se liofilizó, se almacenó durante hasta seis meses a -20 °C y se reconstituyó como en el Ejemplo 9. Aquí, la liofilización y el almacenamiento tampoco tuvieron un efecto significativo sobre el tamaño o el potencial zeta del complejo. Así, cualquier ODN se puede complejar y liofilizar.
Los potenciales zeta fueron -43,8 (reciente) y -47,7 (liofilizado) después de un almacenamiento de seis meses. La eficacia de transfección del complejo liofilizado con un 10% de sacarosa se midió determinando la capacidad del TfRscFv-lip A-AS HER-2
de inhibir la expresión de HER-2 in vitro. Tras la preparación, la liofilización (como en el Ejemplo 4), y el almacenamiento a -20 °C durante hasta seis meses, se usó el complejo de ODN AS HER-2 a dos concentraciones diferentes (0,3 ó 0,6 µM) o SC-ODN a 0,6 µM, para transfectar células de la línea celular de cáncer de mama humano MDA5 MS-435. Se usaron complejos recién preparados que portaban AS HER-2 o SC-ODN como controles. El SC-ODN no tuvo ningún efecto antes o después de la liofilización. Sin embargo, hubo una inhibición dependiente de la dosis de ODN AS HER-2 de la expresión de HER-2 con los complejos tanto recién preparados como liofilizados (Figura 11) incluso después de seis meses de almacenamiento a -20 °C. Debido a que el
10 SC-ODN no tuvo ningún efecto, la inhibición observada no fue el resultado de ninguna citotoxicidad general debida a la liofilización del complejo.
Ejemplo 11 Mantenimiento del Tamaño y del Potencial Zeta de un Complejo 15 que Porta siARN tras la Liofilización
Se determinó la estabilidad de un complejo de TfRscFv, Liposoma A y siARN con un 10% de sacarosa tras la liofilización midiendo el tamaño del complejo y el potencial zeta antes y después de la liofilización. El complejo estaba compuesto de
20 TfRscFv, Liposoma A (DOTAP:DOPE a una proporción molar 1:1) y siARN a 33,3 µg. El volumen total del complejo fue 500 µL. La proporción de los componentes fue 1 µg a 7 nmoles (siARN:liposoma) y 1 µg a 30 µg (TfRscFv:liposoma). Se añadió sacarosa al complejo hasta una concentración final del 10%. El complejo se preparó y se liofilizó como se describió en el Ejemplo 1. Tras la liofilización, el complejo se reconstituyó
25 como se describió en el Ejemplo 1, y se midió el tamaño y el potencial zeta mediante el uso de un Zetasizer 3000H de Malvern. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
Muestra
Intensidad Volumen Tamaño en Número (nm) Potencial Zeta
Reciente
416 437 31,9 (99%) 363 (1%) 5,0
Liofilizada
261 373 115 (94%) 392 (6%) 5,4
Por lo tanto, tras la liofilización no hubo ningún cambio significativo de tamaño
o de potencial zeta. En todo caso, el tamaño en intensidad y el volumen son incluso menores después de la liofilización, lo que hace que el complejo sea más eficaz para el uso in vivo.
Ejemplo 12 Mantenimiento del Tamaño del Complejo Producido con Péptido-Liposoma tras la Liofilización
Para demostrar adicionalmente la naturaleza general de esta invención, también se preparó un complejo que contenía un liposoma modificado. El liposoma usado para formar el complejo se unió a un péptido. El péptido comprendía histidina y lisina, y era un péptido ramificado de una longitud de 31 aminoácidos, y estaba compuesto de una combinación de histidina y aminoácidos que no eran histidina con la estructura 5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'). El liposoma de este estudio estaba compuesto de DOTAP:DOPE (1:1). El péptido HK se conjugó de forma covalente al liposoma por medio de la cisteína terminal y un grupo maleimida del liposoma. El complejo consistió en TfRscFv-HK-liposoma-ADN en el que las proporciones de los componentes fueron las siguientes: TfRscFv respecto de HK-liposoma (µg: µg) de 1 µg:30 µg y ADN respecto de HK-liposoma (µg:nmol) de 1 µg: 14 nmoles. El ADN usado fue p53 (véase el Ejemplo 4) a 18 µg de ADN para 300 µL de volumen total de complejo. Se incluyó un 10% de sacarosa en el complejo final. El complejo se preparó y se liofilizó como se describió en el Ejemplo 1. Tras la liofilización, el complejo se almacenó a 2-8 °C durante 3 días y después se reconstituyó como se describió en el Ejemplo 1. Se midió el tamaño del complejo antes de la liofilización y después de tres días de almacenamiento a 2-8 °C en un Zetasizer 3000H de Malvern. Antes de la liofilización, el tamaño (promedio en número) fue de 601 nm. Tras el almacenamiento y la reconstitución, fue de 588 nm. Así, una vez más, la liofilización del complejo mediante el uso de un 10% de sacarosa no dio como resultado ningún cambio significativo del tamaño del complejo aún con la inclusión del péptido HK.
Ejemplo 13 Estudio In Vitro e In Vivo de un Complejo que Porta un Gen Terapéutico Diferente (RB94) tras la Liofilización y el Almacenamiento a 2-8 °C
Además del gen de luciferasa, un gen que codifica la proteína fluorescente verde mejorada y el gen p53, se puede liofilizar un complejo liposómico que porta otro ADN plasmídico, y que mantiene el tamaño y la actividad biológica. Para demostrarlo, se preparó este complejo que también portaba otro gen terapéutico, el gen inhibidor tumoral RB94. El complejo fue TfRscFv-liposoma A-RB94, en el que el liposoma A es DOTAP:DOPE (1:1). La proporción de los tres componentes (TfRscFV:Liposoma:ADN) fue 0,34 µg : 10 µg: 1 µg. El complejo contuvo también 30 µg de ADN plasmídico de RB94 en un volumen total de 0,5 mL, con un 10% de sacarosa. El complejo se preparó como se describió en el Ejemplo 1 y se liofilizó mediante el uso del método descrito en el Ejemplo 1 para los estudios del tamaño y del potencial zeta, o fue preparado como en el Ejemplo 7 por Cardinal Health para el uso en los estudios de selección del objetivo in vitro e in vivo.
Tamaño y Potencial Zeta
El tamaño y el potencial zeta del complejo preparado como en el Ejemplo 1 y liofilizado, almacenado a 2-8 °C durante cuatro días y reconstituido como en el Ejemplo 1 se comparó antes y después de la liofilización y el almacenamiento mediante el uso de un Zetasizer 3000H de Malvern. Antes de la liofilización, el tamaño (nm) fue y 283 (Intensidad) y 392 (Volumen), mientras que después se halló que era 303 (Intensidad) y 347 (Volumen). Así, no hubo un cambio significativo de tamaño tras la liofilización y el almacenamiento durante cuatro días a 2-8 °C cuando se incluyó un 10% de sacarosa. De forma similar, el potencial zeta no mostró una diferencia importante, ya que ambos estaban en el intervalo de +20 a +30 [19 (pre) y 30,7 (post)].
Selección del Objetivo In Vitro e In Vivo
La capacidad del complejo de seleccionar como objetivo específicamente células tumorales y transfectarlas de manera eficaz tras la liofilización y el almacenamiento a 2-8 °C durante un periodo de tiempo prolongado se ensayó también en un cultivo celular mediante el uso de la línea de células de próstata humana DU145 y la línea de células de carcinoma de vejiga humana HTB-9. Ambas líneas celulares se transfectaron in vitro mediante el uso de un complejo recién preparado o de un complejo que había sido preparado y liofilizado por el contratista comercial (Ejemplo 7) y almacenado a 2-8 °C durante aproximadamente 4 meses antes de la reconstitución como en el Ejemplo 1. El nivel de expresión de la proteína RB94 en las células se determinó mediante un análisis de Western con el uso de los protocolos habituales conocidos para el experto en la técnica. No hubo una diferencia significativa en ninguna de las líneas de células tumorales humanas entre la cantidad de proteína detectada tras la transfección con un complejo recién preparado o liofilizado.
Se inyectó de forma sistémica (i.v. por la vena de la cola) el complejo recién
5 preparado o el complejo que se había preparado con un 10% de sacarosa mediante agitación como en el Ejemplo 1, liofilizado (Ejemplo 7), y almacenado a 2-8 °C durante casi 5 meses antes de la reconstitución como en el Ejemplo 1 a ratones que portaban tumores por xenoinjertos de carcinoma de vejiga humana HTB-9. Los ratones recibieron un total de tres inyecciones i.v. durante 24 horas (40 µg de ADN en 0,67 mL por
10 inyección). Aproximadamente 48 horas tras la última inyección, los animales se sacrificaron humanamente, se extirparon los tumores y el hígado, y se obtuvieron las proteínas y se analizaron mediante transferencia de Western mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-RB94 (QED Biosciences, Inc) por medio de un procedimiento habitual tal como describió Xu, L., et al., Tumor Targeting 4:92-104 (1999). Al igual que
15 con los estudios in vitro, no hubo una diferencia significativa evidente en el nivel de proteína RB94 en los tumores de los animales que recibieron los complejos recientes o liofilizados. En todo caso, la expresión fue aún más elevada en los tumores de los ratones a los que se inyectó el complejo liofilizado. Además, prácticamente no hubo expresión en los hígados en ninguno de los grupos, lo que demuestra que la capacidad
20 de selección como objetivo del tumor del complejo se mantuvo tras la liofilización en presencia de un 10% de sacarosa y el almacenamiento a 2-8 °C durante al menos 5 meses.

Claims (22)

  1. Reivindicaciones
    1. Un método de preparación de un complejo estable de selección como objetivo de células que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico, gen indicador o agente diagnóstico que comprende:
    proporcionar un complejo que comprende un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente diagnóstico, gen indicador o agente terapéutico;
    combinar dicho complejo liposómico con una disolución acuosa que consiste esencialmente en una cantidad estabilizante de sacarosa en agua o en un tampón hasta una concentración final de alrededor de un 1% a alrededor de un 80% de sacarosa;
    liofilizar dicha disolución de complejo liposómico y sacarosa para obtener una preparación liofilizada; en el que, tras la reconstitución, dicha preparación mantiene al menos alrededor de un 80% de su actividad pre-liofilización.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que dicha disolución consiste esencialmente en sacarosa en un tampón PBS, en un tampón HEPES, en un tampón TRIS o en un tampón TRIS/EDTA.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha preparación mantiene al menos alrededor de un 85% o al menos alrededor de un 90%
    o al menos alrededor de un 95% de su actividad pre-liofilización tras la reconstitución.
  4. 4.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho complejo se combina con una disolución de sacarosa hasta una concentración final de alrededor de un 1% a alrededor de un 80%, o de alrededor de un 1% a alrededor de un 50%, o de alrededor de un 1% a alrededor de un 20%, o de alrededor de un 5% a alrededor de un 10%, o alrededor de un 10% de sacarosa.
  5. 5.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ligando comprende un ligando cuyo receptor se expresa en forma diferencial en una célula seleccionada como objetivo.
  6. 6.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ligando es una proteína.
  7. 7.
    El método de la reivindicación 5, en el que dicho ligando comprende transferrina, folato, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
  8. 8.
    El método de la reivindicación 7, en el que dicho ligando comprende un anticuerpo anti-TfR.
  9. 9.
    El método de la reivindicación 7, en el que dicho ligando comprende un fragmento Fv de cadena simple de un anticuerpo.
  10. 10.
    El método de la reivindicación 9, en el que dicho fragmento de anticuerpo comprende un scFv basado en un anticuerpo anti-TfR.
  11. 11.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho liposoma comprende al menos un lípido catiónico y al menos un lípido neutro o auxiliar.
  12. 12.
    El método de la reivindicación 11, en el que dicho lípido catiónico comprende fosfato de dioleoiltrimetilamonio (DOTAP) o bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), y dicho lípido neutro o auxiliar comprende dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) o colesterol (col).
  13. 13.
    El método de la reivindicación 11, en el que dicho liposoma comprende una mezcla de DOTAP y DOPE.
  14. 14.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el liposoma está unido a un péptido de al menos alrededor de 10 aminoácidos, en el que dicho péptido está compuesto de alrededor de un 5-100% de residuos de histidina y un 0-95% de residuos que no son histidina.
  15. 15.
    El método de la reivindicación 14, en el que al menos un 10% de dichos residuos que no son histidina de dicho péptido son residuos de lisina.
  16. 16.
    El método de la reivindicación 15, en el que dicho péptido tiene la estructura 5'-K[K(H)-K-K-K]5-K(H)-K-K-C-3'.
  17. 17.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho agente terapéutico comprende un gen, ADN plasmídico, oligonucleótido, oligodesoxinucleótido, oligonucleótido complementario o siARN.
  18. 18.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho agente diagnóstico comprende un material denso en electrones, agentes de formación de imágenes mediante resonancia magnética o radiofármacos.
  19. 19.
    Una preparación liofilizada que comprende un complejo de un ligando y un liposoma catiónico que encapsula un agente terapéutico, o gen indicador o agente diagnóstico, que es estable a una temperatura en el intervalo de alrededor de -80 °C a 8 °C durante al menos alrededor de seis meses, a la vez que mantiene al menos alrededor de un 80% de actividad, y dicha preparación comprende dicho complejo y alrededor de un 1% a alrededor de un 80% de sacarosa para incrementar la estabilidad de dicho complejo.
  20. 20.
    La preparación liofilizada de la reivindicación 19, que comprende de alrededor de un 1% a alrededor de un 50%, o de alrededor de un 1% a alrededor de un 20%, o de alrededor de un 5% a alrededor de un 10%, o alrededor de un 10% de sacarosa.
  21. 21.
    La preparación liofilizada de la reivindicación 19, que tras la reconstitución mantiene al menos alrededor de un 80% o alrededor de un 85% o alrededor de un 90% o alrededor de un 95% de su actividad pre-liofilización.
  22. 22.
    La preparación liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en la que dicho ligando, dicho agente terapéutico, dicho agente diagnóstico, y dicho liposoma son como se definieron en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 18.
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