ES2242287T3 - Microparticulas para la administracion controlada de moleculas biologicamente activas. - Google Patents
Microparticulas para la administracion controlada de moleculas biologicamente activas.Info
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Abstract
La invención se refiere a micropartículas químicamente homogéneas que permiten liberar de manera regulada moléculas biológicamente activas. Estas micropartículas tienen un núcleo que comprende un componente de naturaleza esencialmente proteico así como un polímero natural, semisintético o sintético. Las micropartículas tiene también una capa externa que se compone de moléculas naturales, semisintéticas o sintéticas. Estas moléculas pueden ser reconocidas por receptores o componentes de la superficie de las células de seres vivos, o también, ser capaces de reconocer estructuras moleculares naturales, semisintéticas o sintéticas.
Description
Micropartículas para la administración controlada
de moléculas biológicamente activas.
La presente invención está relacionada con las
micropartículas para la administración controlada de moléculas
biológicamente activas y para su empleo en el tratamiento,
profilaxis y diagnóstico in vitro e in vivo.
Más particularmente, la presente invención está
relacionada con las micropartículas que presentan una
administración controlada y dirigida de moléculas biológicamente
activas como medicamentos, anticuerpos, marcadores, etc.
En los antecedentes se hace referencia a
numerosas estrategias destinadas al transporte dirigido de material
biológicamente activo in vitro e in vivo de un modo
específico, S. S. Davis; L. Illum, Targeting of Drugs
("Selección del objetivo de fármacos") 4, Ed. por G.
Gregoriadis, Plenum Press, N.Y. (1 994), p. 183 y sig., Targeted
Therapeutic Systems ("Sistemas de tratamiento con selección
del objetivo"), Ed, por P. Tyle; B.P. Ram, Marcel Dekker Inc.
(1990).
Los Autores de la presente invención han expuesto
un nuevo procedimiento para la preparación de partículas que se basa
en la interacción de las proteínas con los polímeros, cuyas
partículas se controlan en cuanto a la forma y a los tamaños y
resultan particularmente ventajosas para el transporte de
compuestos biológicamente activos.
La selección específica del objetivo a
hepatocitos parenquimatosos se ha conseguido por ejemplo empleando
moléculas de distintas estructuras y orígenes, como por ejemplo
proteínas modificadas con hidratos de carbono, M. Monsigny et
al., Advanced Drug Delivery Reviews 14: 1 - 24 (1994), o con
proteínas que contienen hidratos de carbono expuestos en sus
superficies, como por ejemplo asialo-fetuina y
asialo-oroso-mucoide, H. Ibrihara,
Pharmac. Res. 7,: 542 - 546 (1990).
Diversos glucolípidos como los
asialo-gangliósidos, ceramidas, lactosilceramidas,
se han utilizado principalmente en la preparación de liposomas o de
otros sistemas de micropartículas hidrófobas, Leserwan Lee; P.
Machy, Liposomes from biology to therapeutics ("Liposomas
de la biología a la terapéutica"), Ed. por Marc J. Ostro, Marcel
Dekker.
WO 93/25221 se refiere a microsferas de polímeros
biodegradables que contienen un núcleo de material rodeado por una
cápsula membranosa de polímero.
También resultan bien conocidos en los
antecedentes los polímeros sintéticos con hidratos de carbono y que
se emplean como agentes para superficies de revestimiento, K.
Sugiyama; Tokn, Polym. J. 27: 179 - 188 (1995), N. Adachi et
al., J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 6: 463 - 479 (1994), como
medios de transporte dirigido de un modo específico de moléculas
biológicamente activas que se encuentran enlazados a dichos medios
mediante enlaces covalentes. Groman E. et al., PCT Int. App.
WO 95134325.
Debido a sus propiedades hidrófobas, diversos
materiales no resultan aptos para el transporte dirigido de
moléculas hidrófobas.
La presente invención está relacionada con las
micropartículas formadas a partir de un componente proteico y un
componente polimérico, presentando ambos una capa superficial
externa que consiste en moléculas con la propiedad de interactuar
selectivamente con otras moléculas presentes en las zonas receptoras
reactivas. Más particularmente, las partículas de la presente
invención pueden incorporar y transportar material biológicamente
activo hacia células, tejidos u órganos diana y distribuir dicho
material de un modo programado en el tiempo. Por lo tanto, las
partículas de la presente invención pueden aplicarse a los campos
del tratamiento, profilaxis y diagnóstico, tanto in vivo como
in vitro.
Las partículas de la presente invención superan
las desventajas de las técnicas antecedentes que se deben a la pobre
compatibilidad o falta de compatibilidad entre los materiales de
los que las partículas están hechas y el material biológicamente
activo. En efecto, la eficacia en la retención del material
biológicamente activo que casi siempre es hidrosoluble e hidrófilo
no resulta óptima en presencia de materiales de naturaleza
hidrófoba.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
una alta capacidad de carga de moléculas biológicamente activas, así
como proporciona a las mismas una estabilidad superior, en
particular si se trata de proteínas o péptidos que sean sensibles
al calor, disolventes, interferencias estéricas y/o ambientales.
El material biológicamente activo,
preferentemente de tipo proteico, se retiene en una red homogénea
que se forma como consecuencia de interacciones de tipo no
covalente y/o iónico entre un componente básicamente proteico y un
componente básicamente polimérico, cuya red es capaz de retener en
concreto materiales hidrosolubles y mantener sus características
estructurales y biológicas.
El procedimiento para obtener las micropartículas
de la invención consiste en la co-precipitación
controlada de una disolución de un anión polivalente sintético,
semisintético o natural y de una disolución proteica que contiene el
principio activo, tal como ya se ha descrito en la solicitud de
patente co-pendiente presentada simultáneamente por
los mismos Autores, y en la siguiente etapa en el revestimiento con
una capa de un componente capaz de interacciones específicas y
selectivas con las zonas receptoras y reactivas.
Por lo tanto, es un objetivo de la presente
invención una micropartícula químicamente homogénea para la
administración controlada de moléculas biológicamente activas
constituidas por un núcleo que comprende un componente proteico y
un polímero natural, sintético o semisintético, presentando dicho
componente proteico y dicho polímero interacciones no covalentes y/o
de tipo iónico y formando una red homogénea y una capa externa
compuesta de moléculas naturales, sintéticas o semisintéticas que
pueden ser reconocidas por receptores o componentes de la
superficie celular de organismos vivos, o que son capaces de
reconocer estructuras moleculares naturales, sintéticas o
semisintéticas; presentando la micropartícula un tamaño comprendido
entre los 100 nm y los 1000 nm, preferentemente entre 100 nm y 400
nm, con una distribución monomodal y un índice de polidispersión de
valor
limitado.
limitado.
Preferentemente el componente básicamente
proteico está constituido por al menos una proteína seleccionada de
entre la albúmina (humana, bovina u ovoalbúmina), la alfa
1-globulina, la alfa 2-globulina, el
colágeno, el fibrinógeno, la gelatina, y más preferentemente la
seroalbúmina humana natural o recombinante.
De acuerdo con una forma de realización
particular, el núcleo también comprende ciclodextrinas
modificadas.
Preferentemente el polímero natural, sintético o
semisintético consiste en polímeros polianiónicos y mezclas de los
mismos, más preferentemente los polímeros polianiónicos contienen
los grupos carboxilo y/o sulfónico y/o fosfórico.
En una forma de realización particular de la
invención, el polímero consiste en hemiésteres de copolímeros
alternos de anhídrido maleico con oxietilenglicoles de éter de
alquilvinilo con un grado de polimerización 1 \leq n \leq 1000,
y preferentemente 1 \leq n \leq 10.
La capa exterior está constituida preferentemente
por glucolípidos y/o glucoproteínas y polímeros naturales,
sintéticos o semisintéticos que contienen residuos glucósidos o
sacáridos, y/o mono- y/o oligosacáridos, más particularmente los
residuos glucósidos son residuos de galactosa, lactosa o
manosa.
De acuerdo con una forma de realización
particular, la capa exterior esta compuesta por poliaminoácidos que
contienen residuos de galactosa, lactosa o manosa.
Los glucolípidos están compuestos preferentemente
de mono- o di-galactosidilglicéridos, gangliósidos,
lactosilcerebrósidos, neogalactolípidos (lípidos modificados
mediante residuos sacáridos).
Las glucoproteínas están compuestas
preferentemente por asialo-glucoproteínas y
neoglucoproteínas, más preferentemente dichas
asialo-glucoproteínas comprenden
asialo-fetuina,
asialo-oroso-mucoide,
asialo-transferrina. Alternativamente, las
glucoproteínas comprenden la albúmina glucosilada, en particular
galactosilada, lactosilada, manosilada.
De acuerdo con una forma de realización
particular, los mono- y oligosacáridos están compuestos por
galactosa, lactosa y/o manosa.
Los receptores o componentes de la superficie
celular de los organismos vivos se expresan preferentemente en
condiciones normales o patológicas en los hepatocitos,
parenquimatosos o no parenquimatosos, o en la médula ósea, y más
preferentemente los receptores son del tipo selectínico E o P.
Las moléculas biológicamente activas están
compuestas preferentemente por péptidos, polipéptidos, hidratos de
carbono, ácidos nucleicos, lípidos o polisacáridos, de origen
natural, sintético o semisintético, y más preferentemente los ácidos
nucleicos comprenden polinucleótidos, oligonucleótidos
complementarios, conjugados moleculares que contienen ARN o ADN,
vectores de ARN o ADN hidrosolubles. Más preferentemente, los
polipéptidos comprenden citocinas, linfocinas, monocinas,
interferones, y más preferentemente el interferón es un
alfa-interferón natural, sintético o
semisintético.
De acuerdo con una forma de realización
particular, las moléculas biológicamente activas son una vacuna
natural o recombinante.
De acuerdo con una forma de realización
particular, las moléculas biológicamente activas son antígenos
bacterianos o víricos naturales o recombinantes.
De acuerdo con una forma de realización
particular, las moléculas biológicamente activas son potenciadores
inmunológicos.
De acuerdo con una forma de realización
particular, las moléculas biológicamente activas están compuestas
por o unidas a anticuerpos naturales o recombinantes y/o fragmentos
de los mismos.
De acuerdo con una forma de realización
particular, las moléculas biológicamente activas están compuestas
por una sustancia radiactiva, una enzima, un factor de coagulación,
una hormona hidrosoluble, y preferentemente la enzima es la
superóxido dismutasa, incluso modificada, y preferentemente el
factor de coagulación es el factor VIII.
De acuerdo con una forma de realización
particular, las moléculas biológicamente activas están compuestas
por componentes naturales, sintéticos o semisintéticos que
pertenecen al grupo de los antineoplásicos, los antibióticos, los
antiinflamatorios, los inmunoestimulantes y los
inmunodepresores.
Preferentemente la selección de los órganos diana
específicos se efectúa basándose en el tamaño medio de las
micropartículas.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es un procedimiento para la preparación de micropartículas
químicamente homogéneas mediante:
- la mezcla de una disolución acuosa
hidroalcohólica orgánica de un polímero natural, sintético o
semisintético con una disolución proteica;
- la realización de una
co-precipitación controlada a un pH comprendido
entre 3 y 7, preferentemente entre 4 y 5 a una temperatura variable
entre 0ºC y 70ºC, preferentemente entre 10ºC y 40ºC;
- la adición del componente de la capa exterior
mientras se somete a agitación;
- la agitación hasta que se evapora el disolvente
orgánico.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es una sustancia farmacéutica que comprende las micropartículas
dispersas en un medio farmacéuticamente aceptable. Preferentemente
la sustancia se encuentra en la forma de material liofilizado para
preparar con él una disolución, o en forma de suspensión acuosa o
de un gel. La sustancia está destinada a la administración mediante
inyección y/o implantar por las vías subcutánea, intradérmica,
intratecal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e
intraarterial.
A continuación se va a describir la presente
invención mediante ejemplos de la misma que no tienen la intención
de restringirla.
Se hizo gotear una disolución de 100 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 3,0 ml de una mezcla de
proporción 4:1 de acetona y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 33 mg de seroalbúmina humana
(HSA) en 2,5 ml de agua bidestilada que se ha sometido a agitación
magnética a temperatura ambiente. Cuando se hubo terminado la
adición, se mantuvo la agitación durante el tiempo necesario para
que se evaporase completamente el disolvente orgánico. El análisis
dimensional de la dispersión dinámica de luz demostró que las
microsferas presentaban un diámetro medio de 130 nm y un índice de
polidispersión de 0,1 - 0,3.
Se hizo gotear una disolución de 50 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 3,0 ml de una mezcla de
proporción 4:1 de acetona y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 36 mg de seroalbúmina humana
(HSA) en 3,0 ml de agua bidestilada que se ha sometido a agitación
magnética a temperatura ambiente. Se añadió una dispersión de 6,7 mg
de digalactosildiacilglicerina hidrogenada (HDGDH) en 3,0 ml de
agua mientras las microsferas que así se obtenían se sometían a una
agitación magnética intensa. Cuando se hubo terminado la adición,
se mantuvo la agitación durante el tiempo necesario para que se
evaporase completamente el disolvente orgánico. El análisis
dimensional de la dispersión dinámica de luz demostró que las
microsferas presentaban un diámetro medio de 150 nm y un índice de
polidispersión de 0,1 - 0,3.
Se hizo gotear una disolución de 60 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM11) en 2,0 ml de agua mediante una
jeringuilla provista de una aguja 22G en una disolución de 24 mg de
seroalbúmina humana (HSA) en 2,0 ml de agua bidestilada que se ha
sometido a agitación magnética. Se añadió una dispersión de 5,5 mg
de digalactosildiacilglicerina (DGDG) en 2,0 ml de agua a la
dispersión de las microsferas mientras se sometían a una agitación
magnética. Cuando se hubo terminado la adición, se mantuvo la
agitación magnética durante un período adicional de 60 minutos. El
análisis dimensional de la dispersión dinámica de luz demostró que
las microsferas presentaban un diámetro medio de 150 nm y un índice
de polidispersión de 0,1 - 0,3.
Se hizo gotear una disolución de 100 mg de metil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM11) en 1,0 ml de una mezcla de
proporción 1:1 de etanol y agua y se hizo gotear simultáneamente
una disolución de 10 mg de digalactosildiacilglicerina (DGDG) en
2,0 ml de agua mediante dos jeringuillas provistas de una aguja 22G
cada una de ellas en una disolución de 50 mg de mioglobina humana y
seroalbúmina humana (MYO/HSA) en una proporción 1:4 en 8 ml de agua
bidestilada mientras se sometía a agitación magnética. Cuando se
hubo terminado la adición, se mantuvo la agitación magnética
durante un período adicional de 60 minutos. El análisis dimensional
de la dispersión dinámica de luz demostró que las microsferas
presentaban un diámetro medio de 500 nm y un índice de
polidispersión de 0,1 - 0,3.
Se hizo gotear una disolución de 210 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 4,0 ml de una mezcla de
proporción 4:1 de etanol y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 40 mg de seroalbúmina humana
(HSA) y 600 mg de fluoresceinisotiocianato de seroalbúmina humana
(HSA-FITC) en 10 ml de agua bidestilada que
contenía un 10% en peso de manitol (MN). Se añadió una dispersión
de 28 mg de digalactosildiacilglicerina (DGDG) en 3,0 ml de agua a
la dispersión de microsferas. Cuando se hubo terminado la adición,
se mantuvo la agitación magnética durante un período adicional de
90 minutos. El análisis dimensional de la dispersión dinámica de
luz demostró que las microsferas presentaban un diámetro medio de
150 nm y un índice de polidispersión de 0,1 - 0,3.
Se hizo gotear una disolución de 200 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 4,0 ml de una mezcla de
proporción 3:2 de etanol y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 40 mg de seroalbúmina humana
(HSA) y 486 mg de fluoresceinisotiocianato de seroalbúmina humana
(HSA-FITC) en 10,0 ml de agua bidestilada que
contenía un 5% en peso de
glucidil-diisopropilidenarabitol-betaciclodextrina
(GDA-bCD). Se añadió una dispersión de 21 mg de
digalactosildiacilglicerina (DGDG) en 3,0 ml de agua bidestilada a
la dispersión de microsferas mientras se sometía la dispersión de
las microsferas a agitación magnética. Cuando se hubo terminado la
adición, se mantuvo la agitación magnética durante un período
adicional de 60 minutos. El análisis dimensional de la dispersión
dinámica de luz demostró que las microsferas presentaban un
diámetro medio de 200 nm y un índice de polidispersión de 0,1 -
0,2.
Se hizo gotear una disolución de 100 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 2,0 ml de una mezcla de
proporción 3:2 de etanol y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 20 mg de seroalbúmina humana
(HSA) y 243 mg de fluoresceinisotiocianato de seroalbúmina humana
(HSA-FITC) en 5,0 ml de agua bidestilada que
contenía un 5% en peso de
glucidil-diisopropilidenxilitol-betaciclodextrina
(GDX-bCD). Se añadió una dispersión de 13 mg de
digalactosildiacilglicerina (DGDG) en 2,0 ml de agua bidestilada a
la dispersión de microsferas. Cuando se hubo terminado la adición,
se mantuvo la agitación magnética durante un período adicional de 60
minutos. El análisis dimensional de la dispersión dinámica de luz
demostró que las microsferas presentaban un diámetro medio de 200
nm y un índice de polidispersión de 0,1 - 0,2.
Se hizo gotear una disolución de 200 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 4,0 ml de una mezcla de
proporción 3:2 de etanol y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 40 mg de seroalbúmina humana
(HSA) y 418 mg de
galactopiranofenil-fluoresceinisotiocianato de
albúmina bovina (BSA-GAL-FITC) en
10 ml de agua bidestilada. Se mantuvo la agitación magnética de la
dispersión de las microsferas durante 50 minutos. El análisis
dimensional de la dispersión dinámica de luz demostró que las
microsferas presentaban un diámetro medio de 200 nm y un índice de
polidispersión de 0,1 - 0,2.
Se hizo gotear una disolución de 100 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 2,0 ml de una mezcla de
proporción 3:2 de etanol y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 31 mg de seroalbúmina humana
(HSA) y 234 mg de fluoresceinisotiocianato de seroalbúmina humana
(HSA-FITC) en 11 mg de
asialo-fetuina (ASFET) en 5,0 ml de agua
bidestilada. Se mantuvo la agitación magnética de la dispersión de
las microsferas durante 60 minutos. El análisis dimensional de la
dispersión dinámica de luz demostró que las microsferas presentaban
un diámetro medio de 1500 nm y un índice de polidispersión de
0,6.
Se hizo gotear una disolución de 250 mg de metil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM11) en 10,0 ml de una mezcla de
proporción 1:20 de etanol y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 23G en una disolución de 40 mg de seroalbúmina humana
en 25 ml de agua bidestilada que contenía un 5% en peso de
hidroxipropilbetaciclodextrina (HPCD). Se añadió una disolución de
16 mg de hidrocloruro de
1-(2-dimetilamonopropil)-3-etilcarbodiimida
en 2 ml de agua a la dispersión de microsferas mientras se mantenía
la dispersión a agitación magnética durante 2 minutos. A
continuación se añadió a la suspensión una dispersión de 25 mg de
una mezcla de proporción 1:1 de galactolípido y galactolípido
hidrogenado (DGDGHGL) en 5 ml de agua calentada hasta 70ºC,
manteniéndose la agitación magnética de la dispersión de las
microsferas durante 40 minutos. El análisis dimensional de la
dispersión dinámica de luz demostró que las microsferas presentaban
un diámetro medio de 600 nm.
Una dispersión de microsferas (5 ml) que se basan
en el butil hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14), seroalbúmina humana y
fluoresceinisotiocianato de seroalbúmina humana
(HSA/HSA-FITC), y digalactosildiacilglicerina (DGDG)
se colocó en un despodializador (diámetro 10 mm, volumen 5 ml,
punto de corte 100.000). El despodializador se sometió a agitación
magnética durante 48 horas en 28 ml de una disolución amortiguadora
de fosfato isotónico a pH 7,4, que se había colocado en un cilindro
con doble pared de vidrio manteniéndolo a 37ºC. A intervalos de
tiempo determinados se retiraron 5 ml de la disolución dializada y
se sustituyeron por el mismo volumen de la disolución pura. El
contenido de la proteína dializada se analizó mediante
determinaciones de la intensidad de fluorescencia a 520 nm. En las
condiciones empleadas, una cantidad de 405 de la proteína total
presente en la dispersión de microsferas se distribuyó en 3 horas,
con el típico efecto de "estallido", mientras que una cantidad
adicional de 505 se administró a un valor constante en las
siguientes 40 horas.
Una dispersión de microsferas (5 ml) que se basan
en el butil hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14),
galactopiranofenil-fluoresceinisotiocianato de
seroalbúmina humana y de albúmina bovina
(HSA/BSA-GAL-FITC), y
digalactosildiacilglicerina (DGDG) se colocó en un despodializador
(diámetro 10 mm, volumen 5 ml, punto de corte 100.000). El
despodializador se sometió a agitación magnética durante 48 horas
en 28 ml de una disolución amortiguadora de fosfato isotónico a pH
7,4, que se había colocado en un cilindro con doble pared de vidrio
manteniéndolo a 37ºC. A intervalos de tiempo determinados se
retiraron 5 ml de la disolución dializada y se sustituyeron por el
mismo volumen de la disolución pura. El contenido de la proteína
dializada se analizó mediante determinaciones de la intensidad de
fluorescencia a 520 nm. En las condiciones empleadas, una cantidad
del 10% de la proteína total presente en la dispersión de
microsferas se distribuyó durante la primera hora, con el típico
efecto de "estallido", mientras que una cantidad adicional del
80% se administró a un valor constante en las siguientes 30
horas.
Se utilizó aglutinina RCA (SIGMA) de lectina
obtenida a partir de Ricinus communis (semilla de ricino),
que presenta la siguiente actividad de aglutinación: 0,3 \mug/ml
de RCA 120 fueron capaces de aglutinar un 26% en v/v en una
suspensión de eritrocitos.
Se centrifugó una suspensión de micropartículas
basadas en el butil hemiéster de un copolímero alterno de éter
vinílico de anhídrido/metoxietil maleico (PAM14), seroalbúmina
humana (HSA) y digalactosildiacilglicerina (DGDG) a 15.000 G
durante 15 minutos y se resuspendió el residuo en una disolución
amortiguadora isotónica de fosfato (PBXs) a pH 7,4. Se transfirió 1
ml de partes alícuotas a una célula termostática y se mantuvo a
37ºC durante 15 minutos, sometiéndola a agitación. El factor de
transmitancia de las muestras de micropartículas se ajustó al 90% y
se añadió 1 ml de una disolución de 6,6 mM de RCA en PBS a pH 7,4.
Se registró el cambio en la densidad óptica (O. D.) de la
suspensión a 650 nm y se expresó como cambio en tanto por ciento en
relación con el valor inicial. Los resultados demostraron que se
producía la interacción de micropartículas con RCA, tal como se
presenta en la
tabla 1.
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis se basa en la competencia entre los
residuos de galactosa expuestos en los eritrocitos y en las
microsferas por los receptores específicos de la galactosa que se
encuentran presentes en la aglutinina de Ricinus communis
(RCA).
Los eritrocitos de donantes (grupo O, Rh
negativo) en citrato de glucosa (ACD) se separaron de la sangre
mediante centrifugación a 3.000 rpm, a continuación se lavaron dos
veces con una disolución fisiológica amortiguadora de fosfato (PBS)
a pH 7,4 y finalmente se resuspendieron a una concentración del 1%
v/v en la PBS. La aglutinina de Ricinus communis (RCA) se
diluyó con la PBS para obtener una disolución estándar que contenía
20 \mug/ml de RCA. El valor de la aglutinación de dicha
disolución estándar de referencia se determinó en una placa con 96
pocillos añadiendo 50 \mul de la PBS, 50 \mul de la disolución
de control y 100 \mul de la suspensión celular de eritrocitos.
Después de dos horas a temperatura ambiente, el valor de la
aglutinación y la "unidad de aglutinación" (es decir, la mayor
disolución con capacidad de aglutinación) se valoraron
visualmente.
A continuación, 50 \mul de la PBS, 50 \mul de
disoluciones en serie doblando la suspensión de micropartículas, 50
\mul de la disolución de control de RCA (1 y 4 unidades de
aglutinación) se pusieron en este orden en los pocillos de la placa
con 96 pocillos, y después de 30 minutos de incubación a temperatura
ambiente se añadieron 100 \mul de la suspensión de eritrocitos.
Después de una hora de incubación a temperatura ambiente las placas
se examinaron visualmente y la mayor disolución de la suspensión de
micropartículas con capacidad para inhibir la aglutinación de
eritrocitos se determinó como de 1/32 cuando se empleó 1 unidad de
aglutinación y 1/16 cuando se emplearon 4 unidades de
aglutinación.
Se llevó a cabo un análisis de confirmación
empleando D(+)galactosa como inhibidor de la aglutinación de
eritrocitos inducida por la RCA.
La interacción de los residuos galactosil
presente en la superficie de las micropartículas
PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDA-bCD
preparadas en el ejemplo 6 con los receptores específicos de la
galactosa de los hepatocitos se valoró mediante las determinaciones
del citofluorometría de flujo empleando hepatocitos de rata.
Se aislaron las micropartículas mediante la
centrifugación de la suspensión a 14.000 G, a continuación se
lavaron exhaustivamente con una disolución salina y finalmente se
resuspendieron en la PBS a aproximadamente 240 mg/ml. Los
hepatocitos de rata se prepararon mediante la perfusión con
colagenasa siguiendo el método de Seglen, Methods Cell. Biol. 18: 29
(1976), y se hicieron proliferar a 37ºC en substrato Eagle,
modificado de acuerdo con Dulbecco (DMEM) al que se añadió un 0,1%
de albúmina en un ambiente de 5% anhídrido carbónico. Se incubaron
los hepatocitos con 240 mg/ml de la suspensión de micropartículas
durante 2 horas a 37ºC en DMEM al que se había añadido 0,9 mM de
Ca^{+2} en un ambiente de 5% anhídrido carbónico. Se registró la
fluorescencia de cada célula con un analizador FACS (Becton and
Dickinson) a un valor de 300 células/segundo (longitud de onda de
excitación de 488 nm mediante un láser de iones de argón y una
longitud de onda de emisión de 515 nm). Después de la incubación,
se identificaron y se realizó el recuento de las células muertas
con 5 \mug/ml de cloruro de propidio (control negativo). El
análisis estadístico según Kolmogorov-Smirnov, J,
Histochem Cytochem. 25: 935 (1977) proporcionó un valor de 0,21
para el coeficiente D, y D/s(n) = 11,06, con un valor
positivo de umbral: D/s(n) = 8.
Se analizó la falta de capacidad de las
microsferas para interactuar con proteínas opsonizantes como las
inmunoglobulinas G (IgG) y la seroalbúmina humana (HSA) mediante la
determinación de las proteínas no unidas después de la incubación a
37ºC durante distintos períodos de tiempo. Se utilizaron partículas
de poliestireno, de 305 nm de diámetro, como sondas y como patrón de
referencia.
Las muestras de suspensiones de microsferas cuya
área superficial era de 0,05 m^{2}/ml, diluidas con una disolución
fisiológica, se incubaron en cubetas de Rppendorf con disoluciones
de IgG o de HSA, Después de 2 ó 3 horas de incubación a 37ºC y la
separación mediante una máquina centrífuga de Eppendorf a 15.000 G
durante 2 horas, se retiraron los sobrenadantes de las muestras y se
determinó su contenido en proteínas mediante espectrometría (Tablas
2a y 2b).
HSA: máx: 277 nm; absorbancia de una disolución
al 1% = 5,7 (1 = 1 cm).
IgG: máx: 279 nm; absorbancia de una disolución
al 1% = 13,8 (1 = 1 cm).
| Absorción de la HSA en microsfersas | ||||||
| HSA libre | HSA absorbida | |||||
| \mug/ml | \mug | mg/m^{2} | % (1) | |||
| 962 | 31,6 | 0,632 | 15,8 | |||
| 32,1 | 0,656 | 16,4 | ||||
| 466 | 32 | 0,642 | 16,05 | |||
| 33 | 0,642 | 16,05 | ||||
| 217 | 31,8 | 0,636 | 15,9 | |||
| 34 | 0,680 | 17 |
| Absorción de las IgG en microsfersas | ||||||
| IgG libres | IgG absorbidas | |||||
| \mug/ml | \mug | mg/m^{2} | % (1) | |||
| 1250 | 33,2 | 0,664 | 18,9 | |||
| 34,8 | 0,696 | 19,8 | ||||
| 614 | 34,4 | 0,688 | 19,6 | |||
| 35,7 | 0,895 | 25,6 | ||||
| 290 | 34,7 | 0,696 | 19,9 | |||
| 38,2 | 0,955 | 27,3 | ||||
| (1) Porcentaje de proteína absorbida en la muestra en relación con el poliestireno. |
El contenido en residuos de galactosa en diversas
muestras de microsferas se analizó mediante la determinación
colorimétrica de los productos de la reacción de la galactosa con
el fenol en ácido sulfúrico [Dubiois et al., Colorimetric
method for determination of sugars and related substances
("Método de análisis colorimétrico para la determinación de
glúcidos y sustancias relacionadas"), Anal. Chem., 28:
350-356 (1956)].
Se diluyeron las muestras a analizar hasta una
concentración de residuos de galactosa entre 10 y 50 \mug/ml. 2 ml
de la disolución a analizar, 1 ml de una disolución que contenía
5,0 g de fenol en 100 ml de agua y 5 ml de ácido sulfúrico al 96%
se pusieron en un tubo de ensayo de 20 ml en el orden que se acaba
de especificar. Después de 10 minutos la disolución resultante se
mezcló enérgicamente y se calentó hasta 35 - 40ºC durante 10
minutos. El contenido en galactosa se determinó comparando la
absorbancia de la disolución a 490 nm con la absorbancia de los
productos de la reacción de disoluciones de referencia que
contenían aproximadamente 10, 30, 50, 70 y 90 \mug/ml de
galactosa.
Para la comparación, se realizó la determinación
de galactosa en los componentes individuales empleados para la
preparación de microsfera, es decir, agua destilada, PAM14, DGDG,
betaCD-GDA, HSA, HSA-FITC y
BSA-GAL-FITC.
Los resultados obtenidos demuestran que el 5% de
los residuos de galactosa y los de glucolípidos DGDG se encuentran
presentes en el sedimento tras la centrifugación.
Se hizo gotear una disolución de 210 mg de butil
hemiéster de un copolímero alterno de éter vinílico de
anhídrido/metoxietil maleico (PAM14) en 4 ml de una mezcla de
proporción 4:1 de acetona y agua mediante una jeringuilla provista
de una aguja 22G en una disolución de 110 mg de seroalbúmina humana
(HSA) y 3.000.000 U. I. de interferón de
alfa-leucocito (IFNa) en 10 ml de agua bidestilada
que contiene un 5% en peso de
glucidil-diisopropilideno-betaciclodextrina.
Cuando se hubo terminado la adición, se mantuvo
la agitación durante 60 minutos. Se añadió una dispersión de 25 mg
de una mezcla de proporción 1:1 de galactolípido y galactolípido
hidrogenado durante un periodo de 10 minutos a la suspensión
obtenida, manteniéndose en agitación magnética. La agitación se
mantuvo durante 40 minutos.
La determinación de la inhibición de las
microsfera del efecto citopático provocado por el virus de la
estomatitis bovina en las células de Wish, trabajando de acuerdo
con E.A. Havell et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2: 476
(1972), permitió determinar un valor de eficiencia en la
incorporación del IFNa igual a un 90%.
Claims (35)
1. Una micropartícula químicamente homogénea para
la administración controlada de moléculas biológicamente activas,
estando constituida dicha micropartícula de:
i) un núcleo que comprende un compuesto proteico
y un polímero natural, sintético o semisintético, presentando dicho
compuesto proteico y dicho polímero interacciones de tipo no
covalente y/o iónico y formando una red homogénea, y
ii) una capa externa compuesta de moléculas
naturales, sintéticas o semisintéticas que pueden ser reconocidas
por receptores o componentes de la superficie celular de organismos
vivos, o que son capaces de reconocer estructuras moleculares
naturales, sintéticas o semisintéticas;
presentando la micropartícula un tamaño
comprendido entre los 100 nm y los 1000 nm, preferentemente entre
100 nm y 400 nm, con una distribución monomodal y un índice de
polidispersión de valor limitado.
2. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 1, en la que el componente básicamente
proteico está constituido por al menos una proteína seleccionada de
entre la albúmina (humana, bovina u ovoalbúmina), la alfa
1-globulina, la alfa 2-globulina, el
colágeno, el fibrinógeno y la gelatina.
3. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 2, en la que dicha proteína es la
seroalbúmina humana natural o recombinante.
4. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el
núcleo también comprende ciclodextrinas modificadas.
5. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
polímero natural, sintético o semisintético consiste en polímeros
polianiónicos y mezclas de los mismos.
6. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 5, en la que dichos polímeros polianiónicos
contienen los grupos carboxilo y/o sulfónico y/o fosfórico.
7. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho
polímero está constituido por hemiésteres de copolímeros alternos
de anhídrido maleico con oxietilenglicoles de éteres de
alquilvinilo con un grado de polimerización 1 \leq n \leq
1000.
8. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 7, en la que el grado de polimerización es 1
\leq n \leq 10.
9. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha
capa exterior está constituida por glucolípidos y/o glucoproteínas
y polímeros naturales, sintéticos o semisintéticos que contienen
residuos glucosídicos o sacáridos, y/o mono- y/o
oligosacáridos.
10. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 9, en la que dichos residuos glucosídicos
son residuos de galactosa, lactosa o manosa.
11. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 9, en la que la capa exterior esta compuesta
por poliaminoácidos que contienen residuos de galactosa, lactosa o
manosa.
12. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 9, en la que los glucolípidos están
compuestos de mono- o di-galactosidilglicéridos,
gangliósidos, lactosilcerebrósidos, neogalactolípidos (lípidos
modificados mediante residuos sacáridos).
13. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 9, en la que dichas glucoproteínas están
compuestas por asialo-glucoproteínas o
neoglucoproteínas.
14. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 13, en la que dichas
asialo-glucoproteínas comprenden
asialo-fetuina,
asialo-oroso-mucoide,
asialo-transferrina.
15. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 9, en la que dichas glucoproteínas
comprenden la albúmina glucosilada, en particular galactosilada,
lactosilada, manosilada.
16. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 9, en la que dichos mono- y/o oligosacáridos
están compuestos por galactosa, lactosa y/o manosa.
17. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que
dichos receptores o componentes de la superficie celular de los
organismos vivos se expresan en condiciones normales o patológicas
en los hepatocitos, parenquimatosos o no parenquimatosos, o en la
médula ósea.
18. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 17, en la que dichos receptores son del tipo
selectínico E o P.
19. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que
dichas moléculas biológicamente activas están compuestas de
péptidos, polipéptidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos,
lípidos o polisacáridos, sean naturales, sintéticos o
semisintéticos.
20. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 19, en la que dichos ácidos nucleicos
comprenden polinucleótidos, oligonucleótidos complementarios,
conjugados moleculares que contienen ARN o ADN, vectores de ARN o
ADN hidrosolubles.
21. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 19, en la que dichos polipéptidos comprenden
citocinas, linfocinas, monocinas, interferones.
22. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 21, en la que el interferón es un
alfa-interferón natural, sintético o
recombinante.
23. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 18, en la
que dichas moléculas biológicamente activas son una vacuna natural
o recombinante.
24. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 18, en la
que dichas moléculas biológicamente activas están compuestas por
antígenos bacterianos o víricos, naturales o recombinantes.
25. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 18, en la
que dichas moléculas biológicamente activas son potenciadores
inmunológicos.
26. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 18, en la
que dichas moléculas biológicamente activas están compuestas por o
unidas a anticuerpos naturales o recombinantes y/o fragmentos de
anticuerpos.
27. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 18, en la
que dichas moléculas biológicamente activas están compuestas por
una sustancia radiactiva, una enzima, un factor de coagulación, una
hormona hidrosoluble.
28. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 27, en la que dicha enzima es la superóxido
dismutasa, incluso modificada.
29. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 27, en la que dicho factor de coagulación es
el factor VIII.
30. Una micropartícula químicamente homogénea
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 18, en la
que dichas moléculas biológicamente activas están compuestas por
sustancias naturales, sintéticas o semisintéticas que pertenecen al
grupo de los antineoplásicos, los antibióticos, los
antiinflamatorios, los inmunoestimulantes y los
inmunodepresores.
31. Una micropartícula químicamente homogénea
según la reivindicación 1, en la que la selección de los órganos
diana específicos se efectúa basándose en el tamaño medio de las
micropartículas.
32. Un procedimiento para la preparación de
micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
mediante:
- la mezcla de una disolución acuosa
hidroalcohólica orgánica de un polímero natural, sintético o
semisintético con una disolución proteica;
- la realización de una
co-precipitación controlada a un pH comprendido
entre 3 y 7, preferentemente entre 4 y 5 a una temperatura variable
entre 0ºC y 70ºC, preferentemente entre 10ºC y 40ºC;
- la adición del componente de la capa exterior
mientras se somete a agitación;
- la agitación hasta que se evapora el disolvente
orgánico.
33. Una sustancia farmacéutica que comprende las
micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, que
se encuentran dispersas en un medio farmacéuticamente
aceptable.
\newpage
34. Una sustancia farmacéutica según la
reivindicación 33, en la forma de material liofilizado para preparar
con él una disolución, o en forma de suspensión acuosa o de un
gel.
35. Una sustancia farmacéutica según la
reivindicación 33, destinada a la administración mediante inyección
y/o implantación por las vías subcutánea, intradérmica, intratecal,
intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e intraarterial.
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