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Diese
Erfindung betrifft Mikropartikel für die kontrollierte Abgabe
von biologisch aktiven Molekülen
und ihren Einsatz für
Therapien, Prophylaxe und Diagnose in vitro und in vivo.
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Insbesondere
betrifft diese Erfindung Mikropartikel, die sich durch eine kontrollierte
und gezielte Abgabe von biologisch aktiven Molekülen wie Medikamenten, Antikörpern, Tracern
usw. auszeichnen.
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Nach
dem Stand der Technik gibt es eine Vielzahl von Strategien für den gezielten
Transport eines in vitro und in vivo biologisch aktiven Materials
auf einem bestimmten Weg, S. S. Davis; L. Illum, Zielorientierung of
Drugs 4, Ed. by G. Gregoriadis, Plenum Press, N.Y. (1994), S. 183
ff.; Targeted Therapeutic Systems, Ed. by P. Tyle; B. P. Ram, Marcel
Dekker Inc. (1990).
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Die
Autoren dieser Erfindung haben nun ein neues Verfahren zur Herstellung
von Partikeln dargelegt, das aus der Wechselwirkung von Proteinen
mit Polymeren hervorgeht, wobei diese Partikel sowohl in Form und
Größe kontrolliert
werden und insbesondere für
einen gezielten Transport von biologisch aktiven Verbindungen vorteilhaft
sind.
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Die
spezifische Zielorientierung von Leberparenchymzellen wurde zum
Beispiel erreicht, indem Moleküle
mit unterschiedlichen Strukturen und Abstammungen verwendet werden,
wie zum Beispiele mit Kohlenhydratverbindungen modifizierte Proteine,
M. Monsigny et al., Advanced Drug Delivery Reviews 14: 1–24 (1994),
oder Kohlenhydrat enthaltenden Proteinen, die an ihrer Oberfläche zum
Beispiel Asialofetuin und Asialorosomukoid tragen, H. Ibrihara,
Pharmac. Res. 7: 542–546
(1990).
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Für die Herstellung
von Liposomen oder anderen hydrophoben Mikropartikelsystemen wurden
verschiedene Glykolipide wie Asialoganglioside, Ceramide oder Lactosylceramide
eingesetzt, Leserwan Lee, P. Machy, Liposomes from biology to therapeutics,
Ed. by Marc J. Ostro, Marcel Dekker.
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WO
93/25221 betrifft bioabbaubare polymere Mikrosphären, die ein Kernmaterial umgeben
von einer Polymermembrankapsel umfassen.
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Nach
dem Stand der Technik sind auch synthetische Polymere mit Kohlenhydratbestandteilen
wohlbekannt und diese werden als Mittel für das Coating von Oberflächen eingesetzt,
K. Sugiyama; Tokn, Polym. J. 27: 179–188 (1995); N. Adachi et al.,
J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 6: 463–479 (1994), und als Mittel
für den gezielten
Transport auf einem bestimmten Weg von biologisch aktiven Molekülen, die
an diese Mittel über
kovalente Bindungen gebunden sind, Groman E. et al., PCT Int. App.
WO 95/34325.
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Aufgrund
ihrer hydrophoben Eigenschaften sind viele Materialien für einen
gezielten Transport von hydrophilen Molekülen nicht geeignet.
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Diese
Erfindung betrifft nun Mikropartikel, die aus einem Proteinbestandteil
und einem polymeren Bestandteil hergestellt werden, wobei beide
eine äußere oberflächliche
Schicht aufweisen, die aus Molekülen
mit der Eigenschaft besteht, selektiv mit anderen an den reaktiven
Rezeptionsstellen vorhandenen Molekülen zu wechselwirken. Insbesondere
sind die erfindungsgemäßen Partikel
in der Lage, biologisch aktive Materialien einzubauen und zu den
Zielzellen, -geweben oder -organen zu transportieren und diese Materialien
auf eine zeitlich programmierte Weise abzugeben. Demzufolge können die
erfindungsgemäßen Partikel
auf den Gebieten der Therapie, Prophylaxe und Diagnose, sowohl in
vitro als auch in vivo, eingesetzt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Mikropartikel überwinden
die Nachteile nach dem Stand der Technik, die aus einer geringen
Verträglichkeit
oder einem Fehlen von Verträglichkeit
zwischen den Materialien, aus denen die Partikel hergestellt wurden,
und den biologisch aktiven Materialien resultieren. Tatsächlich ist
die Effizienz beim Einschluß von
biologisch aktiven Materialien, die fast immer wasserlöslich und
hydrophil sind, in Gegenwart von Materialien mit hydrophober Natur
nicht optimal.
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Demzufolge
gewährleistet
diese Erfindung eine hohe Beladung mit hydrophilen biologisch aktiven
Molekülen,
und kann diese so mit einer höheren
Stabilität
liefern, insbesondere wenn es sich um Proteine oder Peptide handelt,
die empfindlich auf Hitze, Lösungsmittel,
sterische und/oder Umwelteinflüsse
reagieren.
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Die
biologisch aktiven Materialien, vorzugsweise proteinartige, werden
in einem homogenen Netz eingeschlossen, dass durch die Wirkung einer
nicht-kovalenten und/oder ionischen Wechselwirkung zwischen einem
hauptsächlich
proteinartigen Bestandteil und einem hauptsächlich polymeren Bestandteil
gebildet wird, wobei das Netz insbesondere wasserlösliche Materialien
einschließen
kann und ihre strukturellen und biologischen Eigenschaften beibehält.
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Das
Verfahren, um erfindungsgemäße Mikropartikel
zu erhalten, besteht in der kontrollierten Mitfällung einer Lösung eines
synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Polyanions und einer
Proteinlösung,
die den aktiven Bestandteil enthält,
wie bereits in der ebenfalls anhängigen
Patentanmeldung beschrieben wird, die gleichzeitig von den gleichen
Autoren eingereicht wurde, und in einem nächsten Schritt aus dem Beschichten
mit einer Schicht aus einem Bestandteil, der spezifische und selektive
Wechselwirkungen mit den Rezeptions- und Reaktionsstellen eingehen
kann.
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Demzufolge
ist ein Gegenstand dieser Erfindung ein chemisch homogener Mikropartikel
für die
kontrollierte Freisetzung von biologisch aktiven Molekülen, die
aus einem Kern bestehen, der einen proteinartigen Bestandteil und
ein natürliches,
synthetisches oder halbsynthetisches Polymer umfasst, wobei der
genannte proteinartige Bestandteil und genanntes Polymer nicht-kovalente
und/oder ionische Wechselwirkungen eingehen und ein homogenes Netz
bilden, und aus einer äußeren Schicht,
die aus natürlichen,
synthetischen oder halbsynthetischen Molekülen besteht, die durch Rezeptoren
oder Bestandteilen der Zelloberfläche von lebenden Organismen
erkannt werden können,
oder die natürliche,
synthetische oder halbsynthetische molekulare Strukturen erkennen
können,
wobei die Mikropartikel eine Größe zwischen
100 nm und 1000 nm, vorzugsweise zwischen 100 nm und 400 nm, mit
einer monomodalen Verteilung und einem Grenzwert-Polydispersionsindex aufweisen.
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Vorzugsweise
besteht der hauptsächlich
proteinartige Bestandteil aus mindestens einem Protein, ausgewählt aus
Albumin (human, bovin oder Eialbumin), α1-Globulin, α2-Globulin, Collagen, Fibrinogen oder
Gelatine und mehr bevorzugt aus natürlichem oder rekombinantem
humanem Albumin.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
umfasst der Kern auch modifizierte Cyclodextrine.
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Vorzugsweise
besteht das natürliche,
synthetische oder halbsynthetische Polymer aus polyanionischen Polymeren
und ihren Mischungen, mehr bevorzugt enthalten die polyanionischen
Polymere Carboxyl- und/oder Sulfon- und/oder Phosphorsäuregruppen.
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung besteht das Polymer aus Halbestern von alternierenden
Copolymeren von Maleinsäureanhydrid
mit Oxyethylenglykol-Alkylvinylethern
mit einem Polymerisationsgrad von 1 ≥ n ≥ 1.000 und vorzugsweise 1 ≥ n ≥ 10.
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Die äußere Schicht
wird vorzugsweise aus Glykolipiden und/oder Glykoproteinen und/oder
synthetischen oder halbsynthetischen Polymeren, die Glykosid- oder
Saccharidreste, und/oder Mono- und/oder Oligosacchariden enthalten;
mehr bevorzugt sind die Glykosidreste Galactose-, Lactose- oder
Mannosereste.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
besteht die Außenschicht
aus Polyaminosäuren,
die Galactose-, Lactose- oder Mannosereste enthalten.
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Glykolipide
bestehen vorzugsweise aus Mono- oder Digalactosyldiglyceriden, Gangliosiden,
Lactosylcerebrosiden oder Neogalactolipiden (Lipide, die durch Saccharidreste
modifiziert wurden).
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Glykoproteine
bestehen vorzugsweise aus Asialoglykoproteinen und Neoglykoproteinen,
mehr bevorzugt umfassen die genannten Asialoglykoproteine Asialofetuin,
Asialoorosomukoid und Asialotransferrin. Alternativ umfassen Glykoproteine
Albuminglykosylate, insbesondere Galactosylat, Lactosylat oder Mannosylat.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
bestehen Mono- und Oligosaccharide aus Galactose, Lactose und/oder
Mannose.
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Rezeptoren
oder Bestandteile von Zelloberflächen
von lebenden Organismen werden vorzugsweise unter normalen oder
pathologischen Bedingungen auf Leberzellen, parenchymal oder nicht-parenchymal,
oder im Knochenmark exprimiert, und mehr bevorzugt sind Rezeptoren
vom Typ E- oder P-Selektin.
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Die
biologisch aktiven Moleküle
bestehen vorzugsweise aus Peptiden, Polypeptiden, Proteinen, Kohlenhydraten,
Nukleinsäuren,
Lipiden oder Polysacchariden von natürlicher, synthetischer oder
halbsynthetischer Herkunft, und mehr bevorzugt umfassen die Nukleinsäuren, Polynukleotide,
Antisense-Oligonukleotide, molekulare Konjugate, die RNA oder DNA
enthalten, sowie wasserlösliche
RNA- und DNA-Vektoren. Mehr bevorzugt umfassen die Polypeptide Cytokine,
Lymphokine, Monokine, Interferone und noch mehr bevorzugt ist das
Interferon ein natürliches,
synthetisches oder halbsynthetisches α-Interferon.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
sind die biologisch aktiven Moleküle natürliche oder rekombinante Vakzine.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
sind die biologisch aktiven Moleküle natürliche oder rekombinante bakterielle
oder virale Antigene.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
sind die biologisch aktiven Moleküle immunologische Adjuvantien.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
bestehen die biologisch aktiven Moleküle aus oder sind verknüpft mit
natürlichen
oder rekombinanten Antikörpern
und/oder Fragmenten davon.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
bestehen die biologisch aktiven Moleküle aus einem radioaktiven Mittel,
einem Enzym, einem Koagulationsfaktor oder einem wasserlöslichen
Hormon, und vorzugsweise ist das Enzym eine Superoxiddismutase,
auch eine modifizierte, und vorzugsweise ist der Koagulationsfaktor
der Faktor VIII.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
bestehen die biologisch aktiven Moleküle aus natürlichen, synthetischen oder
halbsynthetischen Verbindungen, die zu den Zytostatika, Antibiotika,
entzündungshemmenden
Wirkstoffen, Immunstimulantien oder Immunsuppressiva gehören.
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Vorzugsweise
wird die Zielorientierung auf ein spezifisches Organ auf Basis einer
durchschnittlichen Größe der Mikropartikel
bewirkt.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von chemisch homogenen Mikropartikeln durch:
- – Mischen
einer wässrigen
hydroalkoholischen organischen Lösung
eines natürlichen,
synthetischen oder halbsynthetischen Polymers mit einer proteinhaltigen
Lösung;
- – Durchführung einer
kontrollierten Mitfällung
bei einem pH-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise zwischen 4 und
5, bei einer Temperatur zwischen 0°C und 70°C, vorzugsweise zwischen 10°C und 40°C;
- – Zugabe
des Bestandteils für
die äußere Schicht
unter Rühren;
- – Rühren bis
der organische Bestandteil abgedampft ist.
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Ein
weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung,
welche die Mikropartikel dispergiert in einem pharmazeutisch zulässigen Medium
umfasst. Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung in Form eines lyophilisierten
Materials zur Rekonstitution oder einer wässrigen Suspension oder eines
Gels vor. Die Zusammensetzung soll der Verbreichung über Injektion
und/oder Implantation über
subkutane, intradermale, intrathekale, intramuskuläre, intraperitoneale,
intravenöse
oder intraarterielle Wege dienen.
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Die
Erfindung wird nun mittels Beispielen derselben beschrieben, welche
die Erfindung keineswegs einschränken
sollen.
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Beispiel 1
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Herstellung von PAM14/HSA-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 100 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 3,0 ml einer 4:1-Aceton/Wasser-Mischung
wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
33 mg humanem Serumalbumin (HAS) in 2,5 ml bidestilliertes Wasser
getropft, das bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer gerührt wurde.
Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren fortgesetzt, bis das organische
Lösungsmittel
vollständig
verdampft war. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung
zeigte, dass die Mikrosphären
durch einen mittleren Durchmesser von 130 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,1–0,3
charakterisiert sind.
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Beispiel 2
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Herstellung von PAM14/HSA/HGL-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 50 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 3,0 ml einer 4:1-Aceton/Wasser-Mischung
wurde unter Rühren
mit einem Magnetrührer
mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
36 mg humanem Serumalbumin (HAS) in 3 ml bidestilliertes Wasser
getropft. Eine Dispersion von 6,7 mg hydrogeniertem Digalactosyldiacylglycerin
(HDGDG) in 3,0 ml Wasser wurde unter starkem Rühren mit einem Magnetrührer zu
der so erhaltenen Mikrosphärendispersion
gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren fortgesetzt, bis das organische
Lösungsmittel
vollständig
verdampft war. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung
zeigte, dass die Mikrosphären
durch einen mittleren Durchmesser von 150 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,1–0,3
charakterisiert sind.
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Beispiel 3
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Herstellung von PAM14/HSA/DGDG-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 60 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 2,0 ml Wasser wurde unter
Rühren
mit einem Magnetrührer
mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
24 mg humanem Serumalbumin (HAS) in 2,0 ml bidestilliertes Wasser
getropft. Eine Dispersion von 5,5 mg Digalactosyldiacylglycerin
(DGDG) in 2,0 ml Wasser wurde unter starkem Rühren mit einem Magnetrührer zu
der so erhaltenen Mikrosphärendispersion
gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren weitere 60 Minuten fortgesetzt.
Eine Analyse der Partikelgröße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 150 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,1–0,3
charakterisiert sind.
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Beispiel 4
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Herstellung von PAM11/MYO/HSA/DGDG-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 100 mg des Methylhalbesters eines alternierenden Copolymers
aus Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM11) in 1,0 ml einer 1:1-Ethanol/Wasser-Mischung
und eine Lösung
von 10 mg Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) in 2,0 ml Wasser wurden
unter Rühren
mit einem Magnetrührer gleichzeitig
mittels zweier Spritzen mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
50 mg einer 1:4-Mischung
aus Myoglobin und humanem Serumalbumin (MYO/HAS) in 8 ml bidestilliertes
Wasser getropft. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren weitere
60 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgöße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 500 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,1–0,3
charakterisiert sind.
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Beispiel 5
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Herstellung von PAM14/HSA,
HSA-FITC/DGDG/MN-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 210 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4,0 ml einer 4:1-Ethanol/Wasser-Mischung
wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
40 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 600 mg humanem Serumalbumin
mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) in 10 ml bidestilliertes,
10 Gew.-% Mannit (MN) enthaltendes Wasser getropft. Eine Dispersion
von 28 mg Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) in 3,0 ml Wasser wurde
zu der Mikrosphärendispersion
gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren mit einem Magnetrührer weitere
90 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 150 nm und einen Polydispersionsindex von
0,1–0,3
charakterisiert sind.
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Beispiel 6
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Herstellung von PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDA-bCD-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 200 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4,0 ml einer 3:2- Ethanol/Wasser-Mischung
wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
40 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 486 mg humanem Serumalbumin
mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) in 10 ml bidestilliertes,
5 Gew.-% Glycidyl-diiopropylidenarabit-β-cyclodextrin (GDA-bCD) enthaltendes
Wasser getropft. Eine Dispersion von 21 mg Digalactosyldiacylglycerin
(DGDG) in 3,0 ml bidestilliertem Wasser wurde unter Rühren mit
einem Magnetrührer
zu der Mikrosphärendispersion
gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren mit einem Magnetrührer weitere
60 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 200 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,1–0,2 charakterisiert
sind.
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Beispiel 7
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Herstellung von PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDX-bCD-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 100 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 2,0 ml einer 3:2-Ethanol/Wasser-Mischung
wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
20 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 234 mg humanem Serumalbumin
mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) in 10 ml bidestilliertes,
5 Gew.-% Glycidyl-diiopropylidenxylit-β-cyclodextrin (GDX-bCD) enthaltendes
Wasser getropft. Eine Dispersion von 13 mg Digalactosyldiacylglycerin
(DGDG) in 2,0 ml bidestilliertem Wasser wurde unter Rühren mit
einem Magnetrührer
zu der Mikrosphärendispersion
gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren mit einem Magnetrührer weitere
60 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 200 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,1–0,2 charakterisiert
sind.
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Beispiel 8
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Herstellung von PAM14/HSA/BSA-GAL-FITC-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 200 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4,0 ml einer 3:2-Ethanol/Wasser-Mischung
wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
40 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 418 mg bovinem Albumin mit
Galactopyranophenylfluoresceinisothiocyanat (BSA-GAL-FITC) in 10
ml bidestilliertes Wasser getropft. Die Dispersion der Mikrosphären wurde
weitere 50 Minuten mit einem Magnetrührer gerührt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 200 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,1–0,2
charakterisiert sind.
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Beispiel 9
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Herstellung von PAM14/HSA/HSA-FITC/ASFET-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 100 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 2,0 ml einer 3:2-Ethanol/Wasser-Mischung
wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von
31 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 234 mg humanem Serumalbumin
mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) und 11 mg Asialofetuin (ASFET)
in 5 ml bidestilliertes Wasser getropft. Die Dispersion der Mikrosphären wurde
weitere 60 Minuten mit einem Magnetrührer gerührt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 1500 nm und einen Polydispersionsindex
von 0,6 charakterisiert sind.
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Beispiel 10
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Herstellung von PAM11/HSA/HGL/DGDG/HPCD-Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 250 mg des Methylhalbesters eines alternierenden Copolymers
aus Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM11) in 10,0 ml einer 1:20-Ethanol/Wasser-Mischung
wurde mittels einer Spritze mit einer 23G-Nadel in eine Lösung von
40 mg humanem Serumalbumin (HSA) in 25 ml bidestilliertes, 5 Gew.-%
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
(HPCD) enthaltendes Wasser getropft. Zu der Dispersion der Mikrosphären wurde
unter zweiminütigem
Rühren
mit einem Magnetrührer
eine Lösung
von 16 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid
in 2 ml Wasser gegeben. Anschließend wurden 25 mg einer auf
70°C erhitzten
1:1-Mischung von Galactolipid/hydrogeniertes Galactolipid (DGDGHGL)
in 5,0 ml Wasser zu der Suspension gegeben und das Rühren mit
einem Magnetrührer
wurde 40 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels
Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch
einen mittleren Durchmesser von 600 nm charakterisiert sind.
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Beispiel 11
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Messungen der kinetischen
Abgabe von Fluoreszenzmarker enthaltenden Proteinen aus Mikrosphärensuspensionen
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Eine
Dispersion von Mikrosphären
(5 ml), die auf einem Butylhalbester eines alternierenden Copolymers
aus Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14), humanem Serumalbumin/humanem
Serumalbumin mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA/HSA-FITC) und Digalactosyldiacylglycerin
(DGDG) basieren, wurde in einen Spectra/Por Dispodialyzer (10 mm
Durchmesser, 5 ml Volumen, cut-off 100.000) gesetzt. Der Dispodialyzer
wurde 48 Stunden in 28 ml einer isotonischen Phosphatpufferlösung bei
pH 7,4, welcher in einen bei 37°C
gehaltenen doppelwandigen Glaszylinder gegeben wurde, mit einem
Magnetrührer
gerührt.
In bestimmten Zeitintervallen wurden 5 ml der dialysierende Lösung entnommen
und durch die gleiche Menge an frischer Lösung ersetzt. Der Gehalt an
dialysiertem Protein wurde mittels Fluoreszenzintensitätsmessungen bei
520 nm bestimmt. Unter den angewandten Bedingungen wurde in 3 Stunden
eine Menge von 405 des gesamten, in der Dispersion vorkommenden
Proteins abgegeben, mit einem typischen „explosiven" Effekt, wobei eine
weitere Menge von 505 mit einer annähernd konstanten Geschwindigkeit
innerhalb der folgenden 40 Stunden abgegeben wurde.
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Beispiel 12
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Messungen der kinetischen
Abgabe von Fluoreszenzmarker enthaltenden Proteinen aus Mikrosphärensuspensionen
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Eine
Dispersion von Mikrosphären
(5 ml), die auf einem Butylhalbester eines alternierenden Copolymers
aus Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14), humanem Serumalbumin/bovinem
Serumalbumin mit Galactopyranophenylfluoresceinisothiocyanat (HSA/BSA-GAL-FITC)
und Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) basiert, wurde in einen Spectra/Por
Dispodialyzer (10 mm Durchmesser, 5 ml Volumen, cut-off 100.000)
gesetzt. Der Dispodialyzer wurde 48 Stunden in 28 ml einer isotonischen
Phosphatpufferlösung
bei pH 7,4, welcher in einen bei 37°C gehaltenen doppelwandigen
Glaszylinder gegeben wurde, mit einem Magnetrührer gerührt. In bestimmten Zeitintervallen
wurden 5 ml der dialysierende Lösung
entnommen und durch die gleiche Menge an frischer Lösung ersetzt.
Der Gehalt an dialysiertem Protein wurde mittels Fluoreszenzintensitätsmessungen
bei 520 nm bestimmt. Unter den angewandten Bedingungen wurde innerhalb der
ersten Stunde eine Menge von 10% des gesamten, in der Mikrosphärendispersion
vorkommenden Proteins abgegeben, mit einem typischen „explosiven" Effekt, wobei eine
weitere Menge von 80% mit einer annähernd konstanten Geschwindigkeit
innerhalb der folgenden 30 Stunden abgegeben wurde.
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Beispiel 13
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Bestimmung der Gegenwart
von oberflächlichen
Galactosylresten mittels Messungen der Mikropartikelbindung mit
Galactose-spezifischem Agglutinin-Lektin aus Ricinus communis (RCA)
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Das
Lektin Agglutinin aus Ricinus communis (Rizinusfrucht) (RCA, Sigma)
wurde verwendet, welches die folgende Agglutinierungsaktivität aufwies:
0,3 μg/ml
von RCA120 konnten 26 Vol.-% einer Erythrozytensuspension agglutinieren.
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Eine
Suspension von Mikrosphären,
die auf einem Butylhalbester eines alternierenden Copolymers aus
Maleinsäureanhydrid
und Methoxyethylvinylether (PAM14), humanem Serumalbumin (HSA) und
Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) basieren, wurde 15 Minuten mit
15.000 G zentrifugiert und der Rückstand
in einer isotonischen Phosphatpufferlösung (PBXs) mit pH 7,4 resuspendiert.
1 ml Aliquots dieser Suspension wurden in eine thermostatische Zelle überführt und
15 min unter Rühren
bei 37°C
gehalten. Die Durchlässigkeit
der Mikropartikelproben wurde auf 90% eingestellt und 1 ml einer
Lösung
von RCA in PBS 6,66 mM bei pH 7,4 wurden zugegeben. Die Veränderung
der optischen Dichte (O.D.) der Suspension bei 650 nm wurde aufgezeichnet
und als prozentuale Veränderung
bezogen auf den Anfangswert ausgedrückt. Die Ergebnisse zeigten,
dass eine Wechselwirkung der Mikropartikel mit RCA auftrat, wie
in Tabelle 1 aufgeführt.
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Beispiel 14
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Bestimmung der Anwesenheit
von oberflächlichen
Galactosylresten mittels Messung der Inhibierung der Agglutination
von roten Blutzellen (RBZ) durch Mikropartikel, induziert durch
Agglutinin aus Ricinus communis (RCA).
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Das
Assay basiert auf der Kompetition zwischen den Galactosylresten
sowohl auf roten Blutzellen und auf Mikrosphären für Galactose-spezifische Rezeptoren,
die auf dem Agglutinin aus Ricinus communis vorkommen.
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Rote
Blutzellen von Spendern (Blutgruppe 0, negativer Rh) in Dextrosecitrat
(ACD) wurden mittels Zentrifugieren mit 3.000 U/min vom Blut abgetrennt,
dann zweimal mit physiologischem Phosphatpuffer (PBS) bei pH 7,4
gewaschen und schließlich
mit einer Konzentration von 1 Vol.-% in PBS resuspendiert. Agglutinin aus
Ricinus communis (RCA) wurde mit PBS verdünnt, um eine Standardlösung mit
20 μg/ml
RCA zu erhalten. Der Agglutinierungstiter einer solchen Standardreferenz-Lösung wurde
auf einer 96-Lochplatte
durch Zugabe von 50 μl
PBS, 50 μl
Kontrolllösung
und 100 μl
Suspension der roten Blutzellen bestimmt. Nach zwei Stunden bei
Raumtemperatur, wurde der Agglutinierungstiter und die „Agglutinierungseinheit" (d.i. die höchste Verdünnung, die
noch eine agglutinierende Wirkung hat) visuell bestimmt.
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Dann
wurden 50 μl
PBS, 50 μl
serieller Verdünnungen
mit Verdoppelung der Mikropartikelsuspension, 50 μl RCA-Kontrolllösung (1
und 4 Agglutinierungseinheiten) in dieser Reihenfolge in die Löcher der
96-Lochplatte gegeben und nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur
wurden 100 μl
Erythrozytensuspension zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei
Raumtemperatur wurden die Platten visuell begutachtet und die höchste Verdünnung von
Mikropartikeln, welche die Agglutinierung von roten Blutzellen noch
inhibieren kann, wurde bei Verwendung von 1 Agglutinierungseinheit
als 1/32 und bei Verwendung von 4 Agglutinierungseinheiten als 1/16
bestimmt.
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Es
wurde ein Bestätigungsassay
unter Verwendung von D-(+)-Galactose als Inhibitor der RCA-induzierten
Agglutinierung von roten Blutzellen durchgeführt.
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Beispiel 15
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Wechselwirkung von Mikropartikeln
mit Hepatozytenrezeptoren für
Asialoglykoproteine
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Die
Wechselwirkung von Galactosylresten, die auf der Oberfläche der
in Beispiel 6 hergestellten PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDA-bCD-Mikrosphären mit
Rezeptoren für
Galactose-spezifische hepatische Zellen wurden mittels Durchflusscytometrie
unter Verwendung von Hepatozyten von Ratten durchgeführt.
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Die
Mikropartikel wurden mittels Zentrifugieren der Suspensionen mit
14.000 G isoliert, dann ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und schließlich mit
240 mg/ml in PBS resuspendiert. Hepatozyten von Ratten wurden mittels
Perfusion mit Collagenase nach dem Verfahren von Seglen, Methods
Cell. Biol. 18: 29 (1976), präpariert
und bei 37°C
auf Eagle-Kulturmedium nach Dulbecco (DMEM), modifiziert mit einem
Zusatz von 0,1% Albumin, in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre vermehrt.
Die Hepatozyten wurden mit 240 mg/ml Mikropartikelsuspension 2 Stunden
bei 37°C
in DMEM mit einem Zusatz von 0,9 mM Ca2+ in
einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre
inkubiert. Unter Anwendung eines FACS-Analyzers (Becton und Dickinson)
wurde die Fluoreszenz jeder Zelle mit einer Geschwindigkeit von
300 Zellen/s (Anregungswellenlänge
488 m mittels eines Argonionenlasers und Emissionswellenlänge 515
nm) aufgezeichnet. Tote Zellen wurden identifiziert und nach Inkubation
mit 5 μg/ml
Propidiumchlorid gezählt
(Negativkontrolle). Eine statistische Aufbereitung der Daten nach
Kolmogorov-Smirnov, J. Histochem. Cytochem. 25: 935 (1977) ergab
einen Wert von 0,21 für
den Koeffizienten D, und D/s(n) = 11,06, mit einem positiven Wert
des Schwellenwerts: D/s(n) = 8.
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Beispiel 16
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Wechselwirkung von Mikrosphären mit
humanen Immunoglobulinen oder humanem Serumalbumin
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Die
mangelnde Fähigkeit
der Mikroshopähren,
mit opsonisierenden Proteinen wie den Immunoglobulinen G (IgG) und
humanem Serumalbumin (HSA) in Wechselwirkung zu treten, wurde mittels
Bestimmung der Proteine ermittelt, die nach einer Inkubation bei
37°C über verschiedene
Zeiträume
nicht gebunden wurden. Es wurden Polystyrol-Mikropartikel, Durchmesser 305 nm, als
Sonden und als Bezugsstandard verwendet.
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Die
Proben einer Mikrosphärensuspension,
deren Oberfläche
0,05 m2/ml betrug, wurden mit physiologischer
Kochsalzlösung
verdünnt
und in Eppendorf-Küvetten
mit IgG- oder HSA-Lösungen
inkubiert. Nach 2 oder 3 Stunden Inkubation bei 37°C und Abtrennung
mittels einer Eppendorf-Zentrifuge mit 15.000 G für 2 Stunden,
wurden die Überstände der
Proben abgenommen und ihr Proteingehalt wurde mittels Spektrometrie gemessen
(Tabellen 2a und 2b).
HSA: max 277 nm; Extinktion einer 1%igen
Lösung
= 5,7 (1 = 1 cm)
IgG: max 279 nm; Extinktion einer 1%igen Lösung = 13,8
(1 = 1 cm)
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Tabelle
2a Absorption
von HSA auf Mikrosphären
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Tabelle
2b Absorption
von IgG auf Mikrosphären
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Beispiel 17
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Eine
quantitative Ermittlung des Gehalts an Galactosylresten Der Gehalt
an Galactosylresten in verschiedenen Mikrosphärenproben wurden mittels kolorimetrischer
Bestimmung von Reaktionsprodukten der Galactose mit Phenol in Schwefelsäure (Dubiois
et al., Colorimetric method for determination of sugars and related
substances, Anal. Chem. 28: 350–356
(1956)) ermittelt.
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Die
zu analysierende Proben wurden auf Galactoserest-Konzentrationen
von 10 bis 50 μg/ml
verdünnt.
2 ml der Lösung
für das
Assay, 1 ml einer Lösung
mit 5,0 g Phenol in 100 ml Wasser und 5 ml einer 95%igen Schwefelsäure wurden
in ein 20-ml-Teströhrchen
in der hier angegebenen Reihenfolge gegeben. Nach 10 Minuten wurden
die resultierenden Lösungen
gut vermischt und dann 10 Minuten lang auf 35–40°C erhitzt. Der Galactosegehalt
wurde durch Vergleich der Extinktion der Lösung bei 490 nm mit der Extinktion der
Reaktionsprodukte der Standardlösung,
die 10, 30, 50, 70 und 90 μg/ml
Galactose enthielten, ermittelt.
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Zum
Vergleich wurde die Galactosebestimmung auch an einzelnen Bestandteilen
durchgeführt,
die für die
Herstellung der Mikrosphären
verwendet wurden, nämlich
an destilliertem Wasser, PAM14, DGDG, β-CD-GDA, HSA, HSA-FITC und BSA-GAL-FITC.
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Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass 5% der Galactosereste und also
der DGDG-Glykolipide
in den zentrifugierten Pellets vorliegen.
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Beispiel 18
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Mikroverkapselung von
Leukozyteninterferon in Mikrosphären
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Eine
Lösung
von 210 mg Butylhalbester eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und
Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4 ml einer 4:1-Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels
einer Spritze, die mit einer 22G-Nadel ausgestattet war, in eine
Lösung
von 110 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 3.000.000 I.U. humanem α-Leukozyteninterferon
(IFNa) in 10 ml bidestilliertes, 5 Gew.-% Glycidyldiisopropyliden-arabit-β-cyclodextrin
enthaltendes Wasser getropft.
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Nach
dem Ende der Zugabe wurde die Dispersion 60 Minuten mittels eines
Magnetrührers
weitergerührt.
Eine Dispersion von 25 mg einer 1/1-Mischung von Galactolipid/hydrogeniertem
Galactolipid wurde innerhalb von 10 Minuten zu der so erhaltenen
Suspension gegeben und weiter mit einem Magnetrührer gerührt. Das Rühren wurde weitere 40 Minuten
fortgesetzt.
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Die
Bestimmung der Mikrospähreninhibition
der zytopathischen Wirkung, die durch bovine Stomatitisviren an
Wish-Zellen verursacht werden, nach Arbeiten von E.A. Havell et
al., Antimicrob. Agents Chemother. 2: 476 (1972), ermöglichte
die Bestimmung eines Werts der Einbaueffizienz von IFNa = 90%.