DE69829975T2

DE69829975T2 - Mikropartikel zur gesteuerten wirkstoffabgabe biologisch aktiver moleküle

Info

Publication number: DE69829975T2
Application number: DE69829975T
Authority: DE
Inventors: Jenny Shrewsbury COWDALL; John Shrewsbury DAVIES; Mark Copthorne ROBERTS; Anders Carlsson; Roberto Solaro; Giuseppe Mazzanti; Elisabetta Chiellini; Federica Chiellini; Erik SÖDERLIND
Original assignee: ISI IST SIEROVACCINOGENO ITAL; Istituto Sierovaccinogeno Italiano Isi SpA Castelvecchio Pascoli
Current assignee: ISI IST SIEROVACCINOGENO ITAL; Istituto Sierovaccinogeno Italiano Isi SpA Castelvecchio Pascoli
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: ITRM970418A0; WO1999002135A1; DE69829975D1; AU8240998A; IT1293088B1; EP1003482A1; ES2242287T3; EP1003482B1; ATE293958T1; ITRM970418A1

Description

Diese Erfindung betrifft Mikropartikel für die kontrollierte Abgabe von biologisch aktiven Molekülen und ihren Einsatz für Therapien, Prophylaxe und Diagnose in vitro und in vivo.
Insbesondere betrifft diese Erfindung Mikropartikel, die sich durch eine kontrollierte und gezielte Abgabe von biologisch aktiven Molekülen wie Medikamenten, Antikörpern, Tracern usw. auszeichnen.
Nach dem Stand der Technik gibt es eine Vielzahl von Strategien für den gezielten Transport eines in vitro und in vivo biologisch aktiven Materials auf einem bestimmten Weg, S. S. Davis; L. Illum, Zielorientierung of Drugs 4, Ed. by G. Gregoriadis, Plenum Press, N.Y. (1994), S. 183 ff.; Targeted Therapeutic Systems, Ed. by P. Tyle; B. P. Ram, Marcel Dekker Inc. (1990).
Die Autoren dieser Erfindung haben nun ein neues Verfahren zur Herstellung von Partikeln dargelegt, das aus der Wechselwirkung von Proteinen mit Polymeren hervorgeht, wobei diese Partikel sowohl in Form und Größe kontrolliert werden und insbesondere für einen gezielten Transport von biologisch aktiven Verbindungen vorteilhaft sind.
Die spezifische Zielorientierung von Leberparenchymzellen wurde zum Beispiel erreicht, indem Moleküle mit unterschiedlichen Strukturen und Abstammungen verwendet werden, wie zum Beispiele mit Kohlenhydratverbindungen modifizierte Proteine, M. Monsigny et al., Advanced Drug Delivery Reviews 14: 1–24 (1994), oder Kohlenhydrat enthaltenden Proteinen, die an ihrer Oberfläche zum Beispiel Asialofetuin und Asialorosomukoid tragen, H. Ibrihara, Pharmac. Res. 7: 542–546 (1990).
Für die Herstellung von Liposomen oder anderen hydrophoben Mikropartikelsystemen wurden verschiedene Glykolipide wie Asialoganglioside, Ceramide oder Lactosylceramide eingesetzt, Leserwan Lee, P. Machy, Liposomes from biology to therapeutics, Ed. by Marc J. Ostro, Marcel Dekker.
WO 93/25221 betrifft bioabbaubare polymere Mikrosphären, die ein Kernmaterial umgeben von einer Polymermembrankapsel umfassen.
Nach dem Stand der Technik sind auch synthetische Polymere mit Kohlenhydratbestandteilen wohlbekannt und diese werden als Mittel für das Coating von Oberflächen eingesetzt, K. Sugiyama; Tokn, Polym. J. 27: 179–188 (1995); N. Adachi et al., J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 6: 463–479 (1994), und als Mittel für den gezielten Transport auf einem bestimmten Weg von biologisch aktiven Molekülen, die an diese Mittel über kovalente Bindungen gebunden sind, Groman E. et al., PCT Int. App. WO 95/34325.
Aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften sind viele Materialien für einen gezielten Transport von hydrophilen Molekülen nicht geeignet.
Diese Erfindung betrifft nun Mikropartikel, die aus einem Proteinbestandteil und einem polymeren Bestandteil hergestellt werden, wobei beide eine äußere oberflächliche Schicht aufweisen, die aus Molekülen mit der Eigenschaft besteht, selektiv mit anderen an den reaktiven Rezeptionsstellen vorhandenen Molekülen zu wechselwirken. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Partikel in der Lage, biologisch aktive Materialien einzubauen und zu den Zielzellen, -geweben oder -organen zu transportieren und diese Materialien auf eine zeitlich programmierte Weise abzugeben. Demzufolge können die erfindungsgemäßen Partikel auf den Gebieten der Therapie, Prophylaxe und Diagnose, sowohl in vitro als auch in vivo, eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Mikropartikel überwinden die Nachteile nach dem Stand der Technik, die aus einer geringen Verträglichkeit oder einem Fehlen von Verträglichkeit zwischen den Materialien, aus denen die Partikel hergestellt wurden, und den biologisch aktiven Materialien resultieren. Tatsächlich ist die Effizienz beim Einschluß von biologisch aktiven Materialien, die fast immer wasserlöslich und hydrophil sind, in Gegenwart von Materialien mit hydrophober Natur nicht optimal.
Demzufolge gewährleistet diese Erfindung eine hohe Beladung mit hydrophilen biologisch aktiven Molekülen, und kann diese so mit einer höheren Stabilität liefern, insbesondere wenn es sich um Proteine oder Peptide handelt, die empfindlich auf Hitze, Lösungsmittel, sterische und/oder Umwelteinflüsse reagieren.
Die biologisch aktiven Materialien, vorzugsweise proteinartige, werden in einem homogenen Netz eingeschlossen, dass durch die Wirkung einer nicht-kovalenten und/oder ionischen Wechselwirkung zwischen einem hauptsächlich proteinartigen Bestandteil und einem hauptsächlich polymeren Bestandteil gebildet wird, wobei das Netz insbesondere wasserlösliche Materialien einschließen kann und ihre strukturellen und biologischen Eigenschaften beibehält.
Das Verfahren, um erfindungsgemäße Mikropartikel zu erhalten, besteht in der kontrollierten Mitfällung einer Lösung eines synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Polyanions und einer Proteinlösung, die den aktiven Bestandteil enthält, wie bereits in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung beschrieben wird, die gleichzeitig von den gleichen Autoren eingereicht wurde, und in einem nächsten Schritt aus dem Beschichten mit einer Schicht aus einem Bestandteil, der spezifische und selektive Wechselwirkungen mit den Rezeptions- und Reaktionsstellen eingehen kann.
Demzufolge ist ein Gegenstand dieser Erfindung ein chemisch homogener Mikropartikel für die kontrollierte Freisetzung von biologisch aktiven Molekülen, die aus einem Kern bestehen, der einen proteinartigen Bestandteil und ein natürliches, synthetisches oder halbsynthetisches Polymer umfasst, wobei der genannte proteinartige Bestandteil und genanntes Polymer nicht-kovalente und/oder ionische Wechselwirkungen eingehen und ein homogenes Netz bilden, und aus einer äußeren Schicht, die aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Molekülen besteht, die durch Rezeptoren oder Bestandteilen der Zelloberfläche von lebenden Organismen erkannt werden können, oder die natürliche, synthetische oder halbsynthetische molekulare Strukturen erkennen können, wobei die Mikropartikel eine Größe zwischen 100 nm und 1000 nm, vorzugsweise zwischen 100 nm und 400 nm, mit einer monomodalen Verteilung und einem Grenzwert-Polydispersionsindex aufweisen.
Vorzugsweise besteht der hauptsächlich proteinartige Bestandteil aus mindestens einem Protein, ausgewählt aus Albumin (human, bovin oder Eialbumin), α1-Globulin, α2-Globulin, Collagen, Fibrinogen oder Gelatine und mehr bevorzugt aus natürlichem oder rekombinantem humanem Albumin.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform umfasst der Kern auch modifizierte Cyclodextrine.
Vorzugsweise besteht das natürliche, synthetische oder halbsynthetische Polymer aus polyanionischen Polymeren und ihren Mischungen, mehr bevorzugt enthalten die polyanionischen Polymere Carboxyl- und/oder Sulfon- und/oder Phosphorsäuregruppen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht das Polymer aus Halbestern von alternierenden Copolymeren von Maleinsäureanhydrid mit Oxyethylenglykol-Alkylvinylethern mit einem Polymerisationsgrad von 1 ≥ n ≥ 1.000 und vorzugsweise 1 ≥ n ≥ 10.
Die äußere Schicht wird vorzugsweise aus Glykolipiden und/oder Glykoproteinen und/oder synthetischen oder halbsynthetischen Polymeren, die Glykosid- oder Saccharidreste, und/oder Mono- und/oder Oligosacchariden enthalten; mehr bevorzugt sind die Glykosidreste Galactose-, Lactose- oder Mannosereste.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform besteht die Außenschicht aus Polyaminosäuren, die Galactose-, Lactose- oder Mannosereste enthalten.
Glykolipide bestehen vorzugsweise aus Mono- oder Digalactosyldiglyceriden, Gangliosiden, Lactosylcerebrosiden oder Neogalactolipiden (Lipide, die durch Saccharidreste modifiziert wurden).
Glykoproteine bestehen vorzugsweise aus Asialoglykoproteinen und Neoglykoproteinen, mehr bevorzugt umfassen die genannten Asialoglykoproteine Asialofetuin, Asialoorosomukoid und Asialotransferrin. Alternativ umfassen Glykoproteine Albuminglykosylate, insbesondere Galactosylat, Lactosylat oder Mannosylat.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform bestehen Mono- und Oligosaccharide aus Galactose, Lactose und/oder Mannose.
Rezeptoren oder Bestandteile von Zelloberflächen von lebenden Organismen werden vorzugsweise unter normalen oder pathologischen Bedingungen auf Leberzellen, parenchymal oder nicht-parenchymal, oder im Knochenmark exprimiert, und mehr bevorzugt sind Rezeptoren vom Typ E- oder P-Selektin.
Die biologisch aktiven Moleküle bestehen vorzugsweise aus Peptiden, Polypeptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Lipiden oder Polysacchariden von natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Herkunft, und mehr bevorzugt umfassen die Nukleinsäuren, Polynukleotide, Antisense-Oligonukleotide, molekulare Konjugate, die RNA oder DNA enthalten, sowie wasserlösliche RNA- und DNA-Vektoren. Mehr bevorzugt umfassen die Polypeptide Cytokine, Lymphokine, Monokine, Interferone und noch mehr bevorzugt ist das Interferon ein natürliches, synthetisches oder halbsynthetisches α-Interferon.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform sind die biologisch aktiven Moleküle natürliche oder rekombinante Vakzine.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform sind die biologisch aktiven Moleküle natürliche oder rekombinante bakterielle oder virale Antigene.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform sind die biologisch aktiven Moleküle immunologische Adjuvantien.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform bestehen die biologisch aktiven Moleküle aus oder sind verknüpft mit natürlichen oder rekombinanten Antikörpern und/oder Fragmenten davon.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform bestehen die biologisch aktiven Moleküle aus einem radioaktiven Mittel, einem Enzym, einem Koagulationsfaktor oder einem wasserlöslichen Hormon, und vorzugsweise ist das Enzym eine Superoxiddismutase, auch eine modifizierte, und vorzugsweise ist der Koagulationsfaktor der Faktor VIII.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform bestehen die biologisch aktiven Moleküle aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Verbindungen, die zu den Zytostatika, Antibiotika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Immunstimulantien oder Immunsuppressiva gehören.
Vorzugsweise wird die Zielorientierung auf ein spezifisches Organ auf Basis einer durchschnittlichen Größe der Mikropartikel bewirkt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von chemisch homogenen Mikropartikeln durch:

– Mischen einer wässrigen hydroalkoholischen organischen Lösung eines natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Polymers mit einer proteinhaltigen Lösung;
– Durchführung einer kontrollierten Mitfällung bei einem pH-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise zwischen 4 und 5, bei einer Temperatur zwischen 0°C und 70°C, vorzugsweise zwischen 10°C und 40°C;
– Zugabe des Bestandteils für die äußere Schicht unter Rühren;
– Rühren bis der organische Bestandteil abgedampft ist.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Mikropartikel dispergiert in einem pharmazeutisch zulässigen Medium umfasst. Vorzugsweise liegt die Zusammensetzung in Form eines lyophilisierten Materials zur Rekonstitution oder einer wässrigen Suspension oder eines Gels vor. Die Zusammensetzung soll der Verbreichung über Injektion und/oder Implantation über subkutane, intradermale, intrathekale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder intraarterielle Wege dienen.
Die Erfindung wird nun mittels Beispielen derselben beschrieben, welche die Erfindung keineswegs einschränken sollen.
Beispiel 1
Herstellung von PAM14/HSA-Mikrosphären
Eine Lösung von 100 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 3,0 ml einer 4:1-Aceton/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 33 mg humanem Serumalbumin (HAS) in 2,5 ml bidestilliertes Wasser getropft, das bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer gerührt wurde. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren fortgesetzt, bis das organische Lösungsmittel vollständig verdampft war. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 130 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,3 charakterisiert sind.
Beispiel 2
Herstellung von PAM14/HSA/HGL-Mikrosphären
Eine Lösung von 50 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 3,0 ml einer 4:1-Aceton/Wasser-Mischung wurde unter Rühren mit einem Magnetrührer mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 36 mg humanem Serumalbumin (HAS) in 3 ml bidestilliertes Wasser getropft. Eine Dispersion von 6,7 mg hydrogeniertem Digalactosyldiacylglycerin (HDGDG) in 3,0 ml Wasser wurde unter starkem Rühren mit einem Magnetrührer zu der so erhaltenen Mikrosphärendispersion gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren fortgesetzt, bis das organische Lösungsmittel vollständig verdampft war. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 150 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,3 charakterisiert sind.
Beispiel 3
Herstellung von PAM14/HSA/DGDG-Mikrosphären
Eine Lösung von 60 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 2,0 ml Wasser wurde unter Rühren mit einem Magnetrührer mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 24 mg humanem Serumalbumin (HAS) in 2,0 ml bidestilliertes Wasser getropft. Eine Dispersion von 5,5 mg Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) in 2,0 ml Wasser wurde unter starkem Rühren mit einem Magnetrührer zu der so erhaltenen Mikrosphärendispersion gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren weitere 60 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 150 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,3 charakterisiert sind.
Beispiel 4
Herstellung von PAM11/MYO/HSA/DGDG-Mikrosphären
Eine Lösung von 100 mg des Methylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM11) in 1,0 ml einer 1:1-Ethanol/Wasser-Mischung und eine Lösung von 10 mg Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) in 2,0 ml Wasser wurden unter Rühren mit einem Magnetrührer gleichzeitig mittels zweier Spritzen mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 50 mg einer 1:4-Mischung aus Myoglobin und humanem Serumalbumin (MYO/HAS) in 8 ml bidestilliertes Wasser getropft. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren weitere 60 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgöße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 500 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,3 charakterisiert sind.
Beispiel 5
Herstellung von PAM14/HSA, HSA-FITC/DGDG/MN-Mikrosphären
Eine Lösung von 210 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4,0 ml einer 4:1-Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 40 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 600 mg humanem Serumalbumin mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) in 10 ml bidestilliertes, 10 Gew.-% Mannit (MN) enthaltendes Wasser getropft. Eine Dispersion von 28 mg Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) in 3,0 ml Wasser wurde zu der Mikrosphärendispersion gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren mit einem Magnetrührer weitere 90 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 150 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,3 charakterisiert sind.
Beispiel 6
Herstellung von PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDA-bCD-Mikrosphären
Eine Lösung von 200 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4,0 ml einer 3:2- Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 40 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 486 mg humanem Serumalbumin mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) in 10 ml bidestilliertes, 5 Gew.-% Glycidyl-diiopropylidenarabit-β-cyclodextrin (GDA-bCD) enthaltendes Wasser getropft. Eine Dispersion von 21 mg Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) in 3,0 ml bidestilliertem Wasser wurde unter Rühren mit einem Magnetrührer zu der Mikrosphärendispersion gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren mit einem Magnetrührer weitere 60 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 200 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,2 charakterisiert sind.
Beispiel 7
Herstellung von PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDX-bCD-Mikrosphären
Eine Lösung von 100 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 2,0 ml einer 3:2-Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 20 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 234 mg humanem Serumalbumin mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) in 10 ml bidestilliertes, 5 Gew.-% Glycidyl-diiopropylidenxylit-β-cyclodextrin (GDX-bCD) enthaltendes Wasser getropft. Eine Dispersion von 13 mg Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) in 2,0 ml bidestilliertem Wasser wurde unter Rühren mit einem Magnetrührer zu der Mikrosphärendispersion gegeben. Nach dem Ende der Zugabe wurde das Rühren mit einem Magnetrührer weitere 60 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 200 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,2 charakterisiert sind.
Beispiel 8
Herstellung von PAM14/HSA/BSA-GAL-FITC-Mikrosphären
Eine Lösung von 200 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4,0 ml einer 3:2-Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 40 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 418 mg bovinem Albumin mit Galactopyranophenylfluoresceinisothiocyanat (BSA-GAL-FITC) in 10 ml bidestilliertes Wasser getropft. Die Dispersion der Mikrosphären wurde weitere 50 Minuten mit einem Magnetrührer gerührt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 200 nm und einen Polydispersionsindex von 0,1–0,2 charakterisiert sind.
Beispiel 9
Herstellung von PAM14/HSA/HSA-FITC/ASFET-Mikrosphären
Eine Lösung von 100 mg des Butylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 2,0 ml einer 3:2-Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze mit einer 22G-Nadel in eine Lösung von 31 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 234 mg humanem Serumalbumin mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA-FITC) und 11 mg Asialofetuin (ASFET) in 5 ml bidestilliertes Wasser getropft. Die Dispersion der Mikrosphären wurde weitere 60 Minuten mit einem Magnetrührer gerührt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 1500 nm und einen Polydispersionsindex von 0,6 charakterisiert sind.
Beispiel 10
Herstellung von PAM11/HSA/HGL/DGDG/HPCD-Mikrosphären
Eine Lösung von 250 mg des Methylhalbesters eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM11) in 10,0 ml einer 1:20-Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze mit einer 23G-Nadel in eine Lösung von 40 mg humanem Serumalbumin (HSA) in 25 ml bidestilliertes, 5 Gew.-% Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD) enthaltendes Wasser getropft. Zu der Dispersion der Mikrosphären wurde unter zweiminütigem Rühren mit einem Magnetrührer eine Lösung von 16 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid in 2 ml Wasser gegeben. Anschließend wurden 25 mg einer auf 70°C erhitzten 1:1-Mischung von Galactolipid/hydrogeniertes Galactolipid (DGDGHGL) in 5,0 ml Wasser zu der Suspension gegeben und das Rühren mit einem Magnetrührer wurde 40 Minuten fortgesetzt. Eine Analyse der Partikelgröße mittels Dynamischer Lichtstreuung zeigte, dass die Mikrosphären durch einen mittleren Durchmesser von 600 nm charakterisiert sind.
Beispiel 11
Messungen der kinetischen Abgabe von Fluoreszenzmarker enthaltenden Proteinen aus Mikrosphärensuspensionen
Eine Dispersion von Mikrosphären (5 ml), die auf einem Butylhalbester eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14), humanem Serumalbumin/humanem Serumalbumin mit Fluoresceinisothiocyanat (HSA/HSA-FITC) und Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) basieren, wurde in einen Spectra/Por Dispodialyzer (10 mm Durchmesser, 5 ml Volumen, cut-off 100.000) gesetzt. Der Dispodialyzer wurde 48 Stunden in 28 ml einer isotonischen Phosphatpufferlösung bei pH 7,4, welcher in einen bei 37°C gehaltenen doppelwandigen Glaszylinder gegeben wurde, mit einem Magnetrührer gerührt. In bestimmten Zeitintervallen wurden 5 ml der dialysierende Lösung entnommen und durch die gleiche Menge an frischer Lösung ersetzt. Der Gehalt an dialysiertem Protein wurde mittels Fluoreszenzintensitätsmessungen bei 520 nm bestimmt. Unter den angewandten Bedingungen wurde in 3 Stunden eine Menge von 405 des gesamten, in der Dispersion vorkommenden Proteins abgegeben, mit einem typischen „explosiven" Effekt, wobei eine weitere Menge von 505 mit einer annähernd konstanten Geschwindigkeit innerhalb der folgenden 40 Stunden abgegeben wurde.
Beispiel 12
Messungen der kinetischen Abgabe von Fluoreszenzmarker enthaltenden Proteinen aus Mikrosphärensuspensionen
Eine Dispersion von Mikrosphären (5 ml), die auf einem Butylhalbester eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14), humanem Serumalbumin/bovinem Serumalbumin mit Galactopyranophenylfluoresceinisothiocyanat (HSA/BSA-GAL-FITC) und Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) basiert, wurde in einen Spectra/Por Dispodialyzer (10 mm Durchmesser, 5 ml Volumen, cut-off 100.000) gesetzt. Der Dispodialyzer wurde 48 Stunden in 28 ml einer isotonischen Phosphatpufferlösung bei pH 7,4, welcher in einen bei 37°C gehaltenen doppelwandigen Glaszylinder gegeben wurde, mit einem Magnetrührer gerührt. In bestimmten Zeitintervallen wurden 5 ml der dialysierende Lösung entnommen und durch die gleiche Menge an frischer Lösung ersetzt. Der Gehalt an dialysiertem Protein wurde mittels Fluoreszenzintensitätsmessungen bei 520 nm bestimmt. Unter den angewandten Bedingungen wurde innerhalb der ersten Stunde eine Menge von 10% des gesamten, in der Mikrosphärendispersion vorkommenden Proteins abgegeben, mit einem typischen „explosiven" Effekt, wobei eine weitere Menge von 80% mit einer annähernd konstanten Geschwindigkeit innerhalb der folgenden 30 Stunden abgegeben wurde.
Beispiel 13
Bestimmung der Gegenwart von oberflächlichen Galactosylresten mittels Messungen der Mikropartikelbindung mit Galactose-spezifischem Agglutinin-Lektin aus Ricinus communis (RCA)
Das Lektin Agglutinin aus Ricinus communis (Rizinusfrucht) (RCA, Sigma) wurde verwendet, welches die folgende Agglutinierungsaktivität aufwies: 0,3 μg/ml von RCA120 konnten 26 Vol.-% einer Erythrozytensuspension agglutinieren.
Eine Suspension von Mikrosphären, die auf einem Butylhalbester eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14), humanem Serumalbumin (HSA) und Digalactosyldiacylglycerin (DGDG) basieren, wurde 15 Minuten mit 15.000 G zentrifugiert und der Rückstand in einer isotonischen Phosphatpufferlösung (PBXs) mit pH 7,4 resuspendiert. 1 ml Aliquots dieser Suspension wurden in eine thermostatische Zelle überführt und 15 min unter Rühren bei 37°C gehalten. Die Durchlässigkeit der Mikropartikelproben wurde auf 90% eingestellt und 1 ml einer Lösung von RCA in PBS 6,66 mM bei pH 7,4 wurden zugegeben. Die Veränderung der optischen Dichte (O.D.) der Suspension bei 650 nm wurde aufgezeichnet und als prozentuale Veränderung bezogen auf den Anfangswert ausgedrückt. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Wechselwirkung der Mikropartikel mit RCA auftrat, wie in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Beispiel 14
Bestimmung der Anwesenheit von oberflächlichen Galactosylresten mittels Messung der Inhibierung der Agglutination von roten Blutzellen (RBZ) durch Mikropartikel, induziert durch Agglutinin aus Ricinus communis (RCA).
Das Assay basiert auf der Kompetition zwischen den Galactosylresten sowohl auf roten Blutzellen und auf Mikrosphären für Galactose-spezifische Rezeptoren, die auf dem Agglutinin aus Ricinus communis vorkommen.
Rote Blutzellen von Spendern (Blutgruppe 0, negativer Rh) in Dextrosecitrat (ACD) wurden mittels Zentrifugieren mit 3.000 U/min vom Blut abgetrennt, dann zweimal mit physiologischem Phosphatpuffer (PBS) bei pH 7,4 gewaschen und schließlich mit einer Konzentration von 1 Vol.-% in PBS resuspendiert. Agglutinin aus Ricinus communis (RCA) wurde mit PBS verdünnt, um eine Standardlösung mit 20 μg/ml RCA zu erhalten. Der Agglutinierungstiter einer solchen Standardreferenz-Lösung wurde auf einer 96-Lochplatte durch Zugabe von 50 μl PBS, 50 μl Kontrolllösung und 100 μl Suspension der roten Blutzellen bestimmt. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur, wurde der Agglutinierungstiter und die „Agglutinierungseinheit" (d.i. die höchste Verdünnung, die noch eine agglutinierende Wirkung hat) visuell bestimmt.
Dann wurden 50 μl PBS, 50 μl serieller Verdünnungen mit Verdoppelung der Mikropartikelsuspension, 50 μl RCA-Kontrolllösung (1 und 4 Agglutinierungseinheiten) in dieser Reihenfolge in die Löcher der 96-Lochplatte gegeben und nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 100 μl Erythrozytensuspension zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten visuell begutachtet und die höchste Verdünnung von Mikropartikeln, welche die Agglutinierung von roten Blutzellen noch inhibieren kann, wurde bei Verwendung von 1 Agglutinierungseinheit als 1/32 und bei Verwendung von 4 Agglutinierungseinheiten als 1/16 bestimmt.
Es wurde ein Bestätigungsassay unter Verwendung von D-(+)-Galactose als Inhibitor der RCA-induzierten Agglutinierung von roten Blutzellen durchgeführt.
Beispiel 15
Wechselwirkung von Mikropartikeln mit Hepatozytenrezeptoren für Asialoglykoproteine
Die Wechselwirkung von Galactosylresten, die auf der Oberfläche der in Beispiel 6 hergestellten PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDA-bCD-Mikrosphären mit Rezeptoren für Galactose-spezifische hepatische Zellen wurden mittels Durchflusscytometrie unter Verwendung von Hepatozyten von Ratten durchgeführt.
Die Mikropartikel wurden mittels Zentrifugieren der Suspensionen mit 14.000 G isoliert, dann ausgiebig mit Kochsalzlösung gewaschen und schließlich mit 240 mg/ml in PBS resuspendiert. Hepatozyten von Ratten wurden mittels Perfusion mit Collagenase nach dem Verfahren von Seglen, Methods Cell. Biol. 18: 29 (1976), präpariert und bei 37°C auf Eagle-Kulturmedium nach Dulbecco (DMEM), modifiziert mit einem Zusatz von 0,1% Albumin, in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre vermehrt. Die Hepatozyten wurden mit 240 mg/ml Mikropartikelsuspension 2 Stunden bei 37°C in DMEM mit einem Zusatz von 0,9 mM Ca²⁺ in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre inkubiert. Unter Anwendung eines FACS-Analyzers (Becton und Dickinson) wurde die Fluoreszenz jeder Zelle mit einer Geschwindigkeit von 300 Zellen/s (Anregungswellenlänge 488 m mittels eines Argonionenlasers und Emissionswellenlänge 515 nm) aufgezeichnet. Tote Zellen wurden identifiziert und nach Inkubation mit 5 μg/ml Propidiumchlorid gezählt (Negativkontrolle). Eine statistische Aufbereitung der Daten nach Kolmogorov-Smirnov, J. Histochem. Cytochem. 25: 935 (1977) ergab einen Wert von 0,21 für den Koeffizienten D, und D/s(n) = 11,06, mit einem positiven Wert des Schwellenwerts: D/s(n) = 8.
Beispiel 16
Wechselwirkung von Mikrosphären mit humanen Immunoglobulinen oder humanem Serumalbumin
Die mangelnde Fähigkeit der Mikroshopähren, mit opsonisierenden Proteinen wie den Immunoglobulinen G (IgG) und humanem Serumalbumin (HSA) in Wechselwirkung zu treten, wurde mittels Bestimmung der Proteine ermittelt, die nach einer Inkubation bei 37°C über verschiedene Zeiträume nicht gebunden wurden. Es wurden Polystyrol-Mikropartikel, Durchmesser 305 nm, als Sonden und als Bezugsstandard verwendet.
Die Proben einer Mikrosphärensuspension, deren Oberfläche 0,05 m²/ml betrug, wurden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und in Eppendorf-Küvetten mit IgG- oder HSA-Lösungen inkubiert. Nach 2 oder 3 Stunden Inkubation bei 37°C und Abtrennung mittels einer Eppendorf-Zentrifuge mit 15.000 G für 2 Stunden, wurden die Überstände der Proben abgenommen und ihr Proteingehalt wurde mittels Spektrometrie gemessen (Tabellen 2a und 2b).
HSA: max 277 nm; Extinktion einer 1%igen Lösung = 5,7 (1 = 1 cm)
IgG: max 279 nm; Extinktion einer 1%igen Lösung = 13,8 (1 = 1 cm)
Tabelle 2a Absorption von HSA auf Mikrosphären
Tabelle 2b Absorption von IgG auf Mikrosphären
Beispiel 17
Eine quantitative Ermittlung des Gehalts an Galactosylresten Der Gehalt an Galactosylresten in verschiedenen Mikrosphärenproben wurden mittels kolorimetrischer Bestimmung von Reaktionsprodukten der Galactose mit Phenol in Schwefelsäure (Dubiois et al., Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal. Chem. 28: 350–356 (1956)) ermittelt.
Die zu analysierende Proben wurden auf Galactoserest-Konzentrationen von 10 bis 50 μg/ml verdünnt. 2 ml der Lösung für das Assay, 1 ml einer Lösung mit 5,0 g Phenol in 100 ml Wasser und 5 ml einer 95%igen Schwefelsäure wurden in ein 20-ml-Teströhrchen in der hier angegebenen Reihenfolge gegeben. Nach 10 Minuten wurden die resultierenden Lösungen gut vermischt und dann 10 Minuten lang auf 35–40°C erhitzt. Der Galactosegehalt wurde durch Vergleich der Extinktion der Lösung bei 490 nm mit der Extinktion der Reaktionsprodukte der Standardlösung, die 10, 30, 50, 70 und 90 μg/ml Galactose enthielten, ermittelt.
Zum Vergleich wurde die Galactosebestimmung auch an einzelnen Bestandteilen durchgeführt, die für die Herstellung der Mikrosphären verwendet wurden, nämlich an destilliertem Wasser, PAM14, DGDG, β-CD-GDA, HSA, HSA-FITC und BSA-GAL-FITC.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass 5% der Galactosereste und also der DGDG-Glykolipide in den zentrifugierten Pellets vorliegen.
Beispiel 18
Mikroverkapselung von Leukozyteninterferon in Mikrosphären
Eine Lösung von 210 mg Butylhalbester eines alternierenden Copolymers aus Maleinsäureanhydrid und Methoxyethylvinylether (PAM14) in 4 ml einer 4:1-Ethanol/Wasser-Mischung wurde mittels einer Spritze, die mit einer 22G-Nadel ausgestattet war, in eine Lösung von 110 mg humanem Serumalbumin (HSA) und 3.000.000 I.U. humanem α-Leukozyteninterferon (IFNa) in 10 ml bidestilliertes, 5 Gew.-% Glycidyldiisopropyliden-arabit-β-cyclodextrin enthaltendes Wasser getropft.
Nach dem Ende der Zugabe wurde die Dispersion 60 Minuten mittels eines Magnetrührers weitergerührt. Eine Dispersion von 25 mg einer 1/1-Mischung von Galactolipid/hydrogeniertem Galactolipid wurde innerhalb von 10 Minuten zu der so erhaltenen Suspension gegeben und weiter mit einem Magnetrührer gerührt. Das Rühren wurde weitere 40 Minuten fortgesetzt.
Die Bestimmung der Mikrospähreninhibition der zytopathischen Wirkung, die durch bovine Stomatitisviren an Wish-Zellen verursacht werden, nach Arbeiten von E.A. Havell et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2: 476 (1972), ermöglichte die Bestimmung eines Werts der Einbaueffizienz von IFNa = 90%.

Claims

Chemisch homogener Mikropartikel zur gesteuerten Wirkstofffreigabe biologisch aktiver Moleküle, bestehend aus: i) einem Kern bestehend aus einem Proteinbestandteil und einem natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Polymer, wobei genannter Proteinbestandteil und genanntes Polymer nichtkovalente und/oder ionische Wechselwirkungen aufweisen und ein homogenes Netz bilden, und ii) einer Außenschicht bestehend aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Molekülen, die durch Rezeptoren oder Verbindungen auf der Zelloberfläche von lebenden Organismen erkannt werden können, oder aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen molekularen Erkennungsstrukturen; wobei die Mikropartikel eine Größe zwischen 100 nm und 1.000 nm, vorzugsweise zwischen 100 nm und 400 nm mit einer monomodalen Verteilung und einem Grenzwert-Polydiserpersionsindex aufweisen.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 1, wobei der wesentliche Proteinbestandteil aus mindestens einem Protein ausgewählt aus Albumin (human, bovin oder Eialbumin), α1-Globulin, α2-Globulin, Collagen, Fibrinogen oder Gelatine besteht.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 2, wobei genanntes Protein ein natürliches oder rekombinantes Humanalbumin ist.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kern weiterhin modifizierte Cyclodextrine umfasst.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das natürliche, synthetische oder halbsynthetische Polymer aus polyanionischen Polymeren und deren Mischungen hergestellt wird.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 5, wobei das genannte polyanionische Polymer Carboxyl- und/oder Sulfonsäure- und/oder Phosphorsäuregruppen enthält.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei genanntes Polymer aus Halbestern von alternierenden Copolymeren aus Maleinsäureanhydrid und Oxyethylenglykol-alkylvinylethern mit einem Polymerisationsgrad von 1 ≤ n ≤ 1000 hergestellt wird.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 7, wobei der Polymerisationsgrad 1 ≤ n ≤ 10 beträgt.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei genannte äußere Schicht aus Glykolipiden und/oder Glykoproteinen und/oder synthetischen oder halbsynthetischen Polymeren hergestellt wird, die glykosidische oder saccharidische Reste und/oder Mono- und/oder Oligosaccharide enthalten.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 9, wobei genannte glykosidische Reste Galactose-, Lactose- oder Mannosereste sind.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 9, wobei die äußere Schicht aus Polyaminosäuren hergestellt wird, die Galactose-, Lactose- oder Mannosereste enthalten.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 9, wobei die Glykolipide bestehen aus Mono- oder Digalactosyldiglyceriden, Gangliosiden, Lactosylcerebrosiden, Neogalactolipiden (wobei die Lipide mittels Saccharidresten modifiziert werden).
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 9, wobei genannte Glykoproteine bestehen aus Asialoglykoproteinen und Neoglykoproteinen.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 13, wobei die Asialoglykoproteine Asialofetuin, Asialoorosomukoid und Asialotransferrin umfassen.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 9, wobei genannte Glykoproteine glykosyliertes Albumin und insbesondere galactosyliertes, lactosyliertes und mannosyliertes Albumin umfassen.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 9, wobei genannte Mono- und/oder Oligosaccharide bestehen aus Galactose, Lactose und/oder Mannose.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei genannte Rezeptoren oder Komponenten der Zelloberfläche von lebenden Organismen unter normalen oder pathologischen Bedingungen auf hepatischen, parenchymalen und nicht-parenchymalen Zellen oder im Knochenmark expressiert werden.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 17, wobei genannte Rezeptoren vom Typ E- oder P-Selektin sind.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei genannte biologisch aktive Moleküle bestehen aus Peptiden, Polypeptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Nukleinsäuren, Lipiden oder Polysacchariden, und zwar in natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Form.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 19, wobei genannte Nukleinsäuren Polynukleotide, Antisense-Oligonukleotide, RNA oder DNA enthaltende molekulare Konjugate oder wasserlösliche RNA- oder DNA-Vektoren umfassen.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 19, wobei genannte Polypeptide Cytokine, Lymphokine, Monokine oder Interferone umfassen.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 21, wobei genanntes Interferon ein natürliches, synthetisches oder rekombinantes α-Interferon ist.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–18, wobei genannte biologische aktive Moleküle natürliche oder rekombinante Vakzine sind.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–18, wobei genannte biologisch aktive Moleküle aus bakteriellen oder viralen, natürlichen oder rekombinanten Antigenen hergestellt werden.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–18, wobei genannte biologisch aktive Moleküle ein immunologisches Adjuvans ist.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–18, wobei genannte biologisch aktive Moleküle hergestellt werden aus oder verknüpft werden mit natürlichen oder rekombinanten Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–18, wobei genannte biologisch aktive Moleküle hergestellt werden aus einem radioaktiven Wirkstoff, einem Enzym, einem Koagulationsfaktor oder einem wasserlöslichen Hormon.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 27, wobei genanntes Enzym, gegebenenfalls auch modifizierte, Superoxiddismutase ist.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 27, wobei genannter Koagulationsfaktor Faktor VIII ist.
Chemisch homogener Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–18, wobei genannte biologisch aktive Moleküle hergestellt werden aus natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Substanzen, die zu den Zytostatika, Antibiotika, entzündungshemmenden Wirkstoffen, Immunstimulantien oder Immunsuppressiva gehören.
Chemisch homogener Mikropartikel nach Anspruch 1, wobei die Zielorientierung auf bestimmte Organe auf Basis der durchschnittlichen Größe der Mikropartikel erreicht wird.
Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln nach einem der vorhergehenden Ansprüche mittels: – Mischen einer wässrigen hydroalkoholischen organischen Lösung eines natürlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Polymers mit einer proteinhaltigen Lösung; – Ausführung einer kontrollierten Mitfällung bei einem pH-Wert zwischen 3 und 7, vorzugsweise zwischen 4 und 5, bei einer variablen Temperatur zwischen 0°C und 70°C, vorzugsweise zwischen 10°C und 40°C; – Zugabe des Bestandteils für die äußere Schicht unter Rühren; – Rühren bis zum Verdampfen des organischen Lösungsmittels.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1–31, welche in einem pharmazeutische zulässigem Medium dispergiert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33 in Form einer lyophilisierten Substanz zur Rekonstitution in einer wässrigen Suspension oder einem Gel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33, zur Verabreichung mittels Injektion und/oder Implantation über subkutane, intrakutane, intrathekale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse oder intraarterielle Wege.