ITRM970418A1 - Microparticelle per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive e loro uso in terapia, profilassi e diagnostica in vitro e in - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo: "Microparticelle per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive e loro uso in terapia, profilassi e diagnostica in vitro e in vivo "
La presente invenzione concerne microparticelle per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive e loro uso in terapia, profilassi e diagnostica in vitro e in vivo.
Più in particolare l'invenzione riguarda microparticelle a rilascio veicolato e controllato di molecole biologicamente attive, quali farmaci, anticorpi, traccianti ecc.
La tecnica anteriore riporta numerose strategie per veicolare in maniera specifica materiale biologicamente attivo in vivo e in vitro, S.S. Davis; L. lllum, Targeting of Drugs 4, Ed. by G. Gregoriadis Plenum Press ΝΎ. (1994) pag. 183 et segg., Targeted Therapeutic Systems Ed. by P.Tyle; B.P. Ram Marcel Dekker Inc. (1990).
Gli autori della presente invenzione hanno messo a punto una nuova metodica per la preparazione di particelle derivanti dall'interazione di proteine con polimeri, di forma e dimensioni controllate, particolarmente vantaggiose per veicolare sostanze biologicamente attive. La particella dell'Invenzione può inoltre essere vantaggiosamente ricoperta di molecole capaci di esplicare interazioni specifiche e selettive con molecole di origine biologica, sintetica, semisintetica.
La veicolazione specifica a cellule parenchimali di fegato è stata ottenuta ad esempio utilizzando moleco e di diversa struttura ed origine quali proteine modificate con componenti carboidratiche, M.Monsigny et al., Advanced Drug Delivery Reviews 14 1-24 (1994). o con proteine contenenti carboidrati esposti alla superficie come asialofetuina e asialorosomucoide, H.lbrihara, Pharmac.Res. 7:542-546 (1990).
Diversi glicolipidi come asialógangliosidi, ceramidi, lattosilceramidi sono stati utilizzati principalmente per la preparazione di liposomi o di altri sistemi di microparticelle idrofobe, Leserwan Lee; P.Machy. Liposomes from biology to therapeutics Ed. by Marc J. Ostro Marcel Dekker.
Anche polimeri sintetici con componènti carboidratiche sono noti dalla tecnica anteriore e sono stati utilizzati come agenti di copertura di superfici, K.Sugiyama; Tokn, Polym.J. 27 : 179-188 (1995). N.Adachi et al., J.Biomater.Sci.Polymer Ed. 6 : 463-479 (1994), come mezzi per veicolare in maniera specifica molecole biologicamente attive legate ad essi con legami covalenti, Groman E. et al., PCT Int.App. WO 95/34325.
A causa dello loro proprietà idrofobe molti materiali non risultano adatti per la veicolazione di molecole idrofile.
La presente invenzione concerne microparticelle composte da una componente proteica ed una polimerica, che vantaggiosamente hanno uno strato superficiale esterno costituì o da molecole aventi la proprietà di interagire selettivamente con altre molecole presenti su siti ricettoriali reattivi. In particolare le particelle dell'invenzione sono in grado di incorporare, di veicolare a cellule, tessuti o organi bersaglio e di rilasciare, in maniera programmata nel tempo, materiale biologicamente attivo. Le particelle dell'invenzione trovano pertanto applicazione nei campo terapeutico, profilattico e diagnostico, sia in vivo che in vitro.
Le microparticelle dell'invenzione superano gli svantaggi della tecnica anteriore dovuti alla scarsità o mancanza di compatibilità tra i materiali che formano le particelle e il materia e biologicamente attivo, Infatti l'efficienza di intrappolamento di materia e biologicamente attivo, quasi sempre solubile in acqua e idrofilo, non è ottimale in presenza di materiali di natura idrofoba.
L'invenzione fornisce pertanto un elevato caricamento di molecole biologicamente attive di natura idrofila conferendo a queste anche una maggiore stabilità, in particolare se trattasi di proteine o polipeptidi sensibili al calore, ai solventi, e interferenze sferiche e/o ambientali.
Il materiale biologicamente attivo, preferibilmente materiale di natura proteica, viene intrappolato in una rete omogenea formata per effetto di interazioni non covalenti e/o di tipo ionico tra una componente essenzialmente proteica ed una componente essenzialmente polimerica, in grado di intrappolare in particolare materiali solubili in acqua e di mantenere le loro caratteristiche strutturali e biologiche.
Il procedimento per ottenere le microparticelle dell’invenzione consiste nella coprecipitazione controllata di una soluzione di poliamone sintetico, semisintetico naturale e di una soluzione proteica contenente il principio attivo, come descritto nella domanda di brevetto copendente depositata contemporaneamente dagli stessi autori, e nel successivo rivestimento con uno strato di una componente capace di interazioni specifiche e selettive con siti recettoriali e reattivi.
Forma pertanto oggetto dell'Invenzione una microparticella chimicamente omogenea per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive costituita da un nucleo comprendente una componente essenzialmente proteica e un polimero naturale, sintetico o semisintetico, e uno strato esterno costituito da molecole naturali, sintetiche o semisintetiche in grado di essere riconosciute da recettori o componenti della superficie cellulare di organismi viventi, o di riconoscere strutture molecolare naturali, sintetiche o semisintetiche.
Preferibilmente la componente essenzialmente proteica è costituita da almeno una proteina tra albumina (umana, bovina, o d’uovo), al globulina, a 2 globulina, collagene, fibrinogeno, gelatina, più preferibilmente albumina umana naturale o ricombinante.
In una forma di attuazione il nucleo comprende ulteriormente ciclodestrine modificate.
Preferibilmente il polimero naturale sintetico o semisintetico è costituito da polimeri polianionici e loro miscele, più preferibilmente i polimeri polianionici contengono gruppi carbossilici e/o solfonici e/o fosforici.
In una forma di attuazione il polimero è costituito da emiesteri di copolimeri alternati dell'anidride maleica con alchilvinileteri ossietilenglicol con grado di polimerizzazione 1 < n < 1000, preferibilmente 1 ≤ n ≤ 10.
Lo strato esterno è preferibilmente costituito da glicolipidi e/o glicoproteine e/o polimeri sintetici o semisintetici contenenti residui glicosidici o saccaridici, e/o mono e/o oligosaccaridi, più preferibilmente i residui glicosidici sono residui di galattosio, lattosio o mannosio.
In una forma di attuazione lo strato esterno è costituito da poliamminoacidi contenenti residui di galattosio, lattosio o mannosio.
I glicolipidi sono preferibilmente costituiti da mono o di galattosildigliceridi, gangliosidi, lattosilcerebrosidi, neogaiattolipidi (lipidi modificati mediante residui saccaridici).
Le glicoproteine sono preferìbilmente costituite da asialoglicoproteine e neoglicoproteine, più preferìbilmente le asialoglicoproteine comprendono asialofetuina, asialoorosomucoide, asialotransferrina. Alternativamente le glicoproteine comprendono albumina glicosilata, in particolare galattosilata, lattosilata, mannosilata.
In una forma di attuazione i mono e/o oligosaccaridi sono costituiti da galattosio, lattosio e/o mannosio.
I recettori o componenti della superfìcie cellulare di organismi viventi sono preferibilmente espressi in condizioni normali o patologiche su cellule epatiche, parenchimali e non parenchimali, o nel midollo osseo, più preferibilmente i recettori sono di tipo selettinico E o P.
Le molecole biologicamente attive sono preferibilmente costituite da peptidi, polipeptidi, proteine, carboidrati, acidi nucleici, lipidi o polisaccaridi, naturali, sintetici o semisintetici, più preferìbilmente gli acidi nucleici comprendono polinucleotidi, oligonucleotidi antisenso, coniugati molecolari, contenente RNA o DNA, vettori di RNA o DNA idrosolubili. Più preferibilmente i polipeptidi comprendono citochine, linfochine, monochine, interferoni, ancora più preferibilmente Γ interferone è α-interferone naturale, sintetico o ricombinante.
In una forma di attuazione le molecole biologicamente attive sono un vaccino naturale o ricombinante.
In una forma di attuazione le molecole biologicamente attive sono costituite da antigeni batterici o virali naturali o ricombinanti.
In una forma di attuazione le molecole biologicamente attive sono un adiuvante immunologico.
In una forma di attuazione le molecole biologicamente attive sono costituite da o sono legate a anticorpi naturali o ricombinanti e/o frammenti di essi.
In una forma di attuazione le molecole biologicamente attive sono costituite da un agente radioattivo, un enzima, un fattore della coagulazione, o un ormone idrosolubile, preferibilmente l'enzima è la superossido-dismutasi, anche modificata, preferibilmente il fattore della coagulazione è il fattore VIII.
In una forma di attuazione le molecole biologicamente attive sono costituite da sostanze naturali sintetiche o semisintetiche appartenenti agli antitumorali, antibiotici, antinfiammatori, immunostimolanti , immunosoppressivi .
Preferibilmente la microparticella chimicamente omogenea dell'invenzione ha dimensioni comprese tra 100 nm e 1000 nm, preferibilmente tra 100 nm e 400 nm, con distribuzione monomodale ed indice di polidispersità limitato.
Preferibilmente il direzionamento versò organi specifici viene attuato sulla base della dimensione media delle microparticelle.
Costituisce ulteriore oggetto dell'invenzione un procedimento per la preparazione di microparticelle chimicamente omogenee a mezzo di:
- miscelazione di una soluzione acquosa idroalcoolica organica di un polimero naturale, sintetico o semisintetico con una soluzione proteica; - coprecipitazione controllata ad un pH compreso tra 3 e 7, preferibilmente tra 4 e 5 ad una temperatura variabile tra 0°C e 70°C, preferibilmente tra 10 e 40°C;
- aggiunta del componente dello strato es erno in condizioni di agitazione;
- agitazione fino ad evaporazione del solvente organico.
Ulteriore oggetto dell’invenzione è una composizione farmaceutica comprendente le microparticelle disperse in un mezzo farmaceuticamente accettabile. Preferibilmente la composizione è in forma di liofilizzato per ricostituzione, sospensione acquosa o gel. La composizione è per somministrazione per iniezione e/o impiantazione per via sottocutanea, intradermica, intratecale, intramuscolare, intraperitoneale, intravenosa, intrarteriosa.
La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi non limitativi.
Esempio 1 Preparazione di microsfere PAM14/HSA
Una soluzione di 100 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossìetil vinil eere (PAM14) in 3,0 mi di una miscela 4:1 acetone/acqua, è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 33 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 2,5 mi di acqua bidistillata, mantenuta sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente. Terminata l'aggiunta, l’agitazione è stata proseguita per il periodo di tempo necessario alla completa evaporazione del solvente organico. L’ana isi dimensionale mediante dynamic tight scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 130 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,3.
Esempio 2 Preparazione di microsfere PAM14/HSA/HGL
Una soluzione di 50 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 3,0 ml di una miscela 4:1 acetone/acqua, è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 36 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 3,0 mi di acqua bidistillata, mantenuta sotto agitazione magnetica. Alla dispersione di microsfere così ottenuta è stata aggiunta, sotto vigorosa agitazione magnetica, una dispersione di 6,7 mg di digalattosildiacilgiiceroio idrogenato (HDGDG) in 3,0 mi di acqua. Terminata l'aggiunta, l'agitazione è stata proseguita per il periodo di tempo necessario alla completa evaporazione del solvente organico. L’analisi dimensionale mediante dynamic tight scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 150 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,3.
Esempio 3 Preparazione di microsfere PAM1 1/HSA/DGDG
Una soluzione di 60 mg di emiestere metilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM11) in 2,0 ml di acqua, è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 24 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 2,0 mi di acqua bidistillata, mantenuta sotto agitazione magnetica. Alla dispersione di microsfere è stata aggiunta, sotto agitazione magnetica, una dispersione di 5,5 mg di digalattosildiacilgiiceroio (DGDG) in 2,0 mi di acqua. Terminata l'aggiunta, l’agitazione magnetica è stata mantenuta per 60 minuti. L'analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 150 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,3.
Esempio 4 Preparazione di microsfere PAM11/MYO/HSA/DGDG Una soluzione di 100 mg di emiestere metilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM11) in 1,0 mi di miscela 1:1 etanolo/acqua ed una soluzione di 10 mg di digalattosildiacilglicerolo (DGDG) in 2,0 ml di acqua sono state gocciolate contemporaneamente mediante due siringhe munite di ago 22G in una soluzione di 50 mg di una miscela 1:4 mioglobina/sieroalbumina umana (MYO/HSA) in 8 mi di acqua bidistillata, sotto agitazione magnetica. Terminata l'aggiunta, l'agitazione magnetica è stata mantenuta per ulteriori 60 minuti. L’analisi dimensionale mediante dynamic tight scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 500 nm e indice di polidispersità di 0, 1-0,3.
Esempio 5 Preparazione di microsfere PAM14/HSA HSA-FITC/DGDG/MN
Una soluzione di 210 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 4,0 mi di miscela 4:1 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 40 mg di sieroalbumina umana (HSA) e 600 mg di sieroalbumina umana fluoresceinisotiocianato (HSA-FITC) in 10 mi di acqua bidistillata contenente il 10% in peso di mannitolo (MN). Alla dispersione di microsfere è stata aggiunta, sotto agitazione magnetica, una dispersione di 28 mg di digalattosildiacilglicerolo (DGDG) in 3,0 ml di acqua. Terminata l'aggiunta, l’agitazione magnetica è stata mantenuta per 90 minuti. L’analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 150 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,3.
Esempio 6 Preparazione di microsfere PAM1 4/HSA/HSA-FlTC/OGDG/GDA-bCD
Una soluzione di 200 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 4,0 mi di miscela 3:2 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 40 mg di sieroalbumina umana (HSA) e 486 mg di sieroalbumina umana fluoresceinisotiocianato (HSA-FITC) in 10,0 mi di acqua bidistillata contenente il 5% in peso di glicidildiisopropilidenarabitolo-betaciclodestrina (GDA-bCD). Alla dispersione delle microsfere è stata aggiunta, sotto agitazione magnetica, una dispersione di 21 mg di digalattosildiacilglicerolo (DGDG) in 3,0 mi di acqua bidistillata. Terminata l'aggiunta, la dispersione è stata mantenuta in agitazione magnetica per 60 minuti. L’analisi dimensionale mediante dynamic tight scattering ha evidenziato che (e microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 200 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,2.
Esempio 7 Preparazione di microsfere PAM14/HSA. HSA-FITC/DGDG/GDX-bCD
Una soluzione di 100 mg di emies ere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 2,0 ml di miscela 3:2 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 20 mg di sieroalbumina umana (HSA) e 243 mg di sieroalbumina umana fluoresceinisotiocianato (HSA-FITC) in 5,0 ml di acqua bidistillata contenente il 5% in peso di glicidildiisopropilidenxilitolo-betaciclodestrina (GDX-bCD). Alla dispersione delle microsfere è stata aggiunta, sotto agitazione magnetica, una dispersione di 13 mg di digalattosildiacilglicerolo (DGDG) in 2,0 mi di acqua bidistillata. erminata l'aggiunta, la dispersione è stata mantenuta in agitazione magnetica per 60 minuti. L'analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 200 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,2.
Esempio 8 Preparazione di microsfere PAM14/HSA/BSA-GAL-FITC Una soluzione di 200 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 4,0 ml di miscela 3:2 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 40 mg di sieroalbumina umana (HSA) e 418 mg di albumina bovina galattopiranofenil fluoresceinisotiocianato (BSA-GAL-FITC) in 10 ml di acqua bidistillata. La dispersione di microsfere è stata lasciata in agitazione magnetica per 50 minuti. L'analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 200 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,2.
Esempio 9 Preparazione di microsfere PAM14/HSA/HSA-FITC/ASFET Una soluzione di 100 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 2,0 ml di miscela 3:2 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 31 mg di sieroalbumina umana (HSA), 243 mg di sieroalbumina umana fluorésceinisotiocianato (HSA-FITC) ed 11 mg di asialofetuina (ASFET) in 5,0 ml di acqua bidistillata. La dispersione di microsfere è stata lasciata; in agitazione magnetica per 60 minuti. L'analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 1500 nm e indice di polidispersità di 0,6.
Esempio 10 Preparazione di microsfere PAM11/HSA/HGL/ DGDG/HPCD
Una soluzione di 250 mg di emiestere metilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM11) in 10,0 mi di miscela 1:2 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 23G in una soluzione di 40 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 25 ml di acqua bidistillata contenente il 5% in peso di idrossipropilbetaciclodestrina (HPCD). Alla dispersione di microsfere è stata aggiunta una soluzione di 16 mg di 1-(3-dimetilamminopropil)-3-etilcarbodiimmide idrocloruro in 2 mi di acqua, mantenendo la dispersione in agitazione magnetica per 2 minuti. Successivamente una dispersione di 25 mg di una miscela 1:1 galattolipide/galattolipide idrogenato (DGDG/HGL) in 5 mi di acqua riscaldata a 70 °C è stata aggiunta alla sospensione e l'agitazione magnetica è stata continuata per 40 minuti. L’analisi dimensionale mediante; dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 600 nm.
Esempio 11 Misure di cinetiche di rilascio di proteine contenenti “marker” fluorescenti da sospensioni di microsfere
Una dispersione di microsfere (5 mi) a base di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14), sieroalbumina umana/sieroalbumina umana fluoresceinisotiocianato (HSA/HSA-FITC) e digalattosildiacilglicerolo (DGDG), è stata posta in uno Spectra/Por dispodyalizer (diametro 10 mm, volume 5 mi, cut-off 100,000). Il dispodyalizer è stato mantenuto sotto agitazione magnetica per 48 h in 28 ml di soluzione tampone fosfato isotonico pH 7,4, posta in un cilindro di vetro a doppia parete, mantenuto alla temperatura di 37 °C. Ad intervalli di tempo definiti sono stati prelevati 5 mi di soluzione dializzante, sostituendoli con la stessa quantità di soluzione fresca. Il contenuto di proteina dializzata è stato valutato da misure di intensità di fluorescenza a 520 nm. Nelle condizioni impiegate il 40% della proteina totale presente nella dispersione delle microsfere viene rilasciato in 3 ore con un tipico effetto “burst”, mentre un altro 50% viene rilasciato a velocità pressoché costante nelle successive 40 ore.
Esempio 12 Misure di cinetiche di rilascio di proteine contenenti “marker'’ fluorescenti da sospensioni di microsfère
Una dispersione di microsfere (5 ml) a base di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14), sieroalbumina umana/albumina bovina galattopiranofenil fluoresceinisotiocianato (HSA/BSA-GAL-FITC) e digalattosildiacilglicerolo (DGDG), è stata posta in uno Spectra/Por dispodyalizer (diametro 10 mm, volume 5 ml, cut-off 100,000). Il dispodyalizer è stato mantenuto sotto agitazione magnetica per 48 h in 28 mi di soluzione tampone fosfato isotonico pH 7,4, posta in un cilindro di vetro a doppia parete, mantenuto alla temperatura di 37°C. Ad intervalli di tempo definiti sono stati prelevati 5 ml di soluzione diaiizzante, sostituendoli con la stessa quantità di soluzione fresca. Il contenuto di proteina dializzata è stato valutato da misure di intensità di fluorescenza a 520 nm. Nelle condizioni impiegate il 10% della proteina totale presente nella dispersione delle microsfere è stata rilasciata nella prima ora con un tipico effetto “burst", mentre un altro 80 % è stato rilasciata a velocità pressoché costante nelle successive 30 ore.
Esempio 13 Determinazione della presenza di residui aalattosilici superficiali mediante misure di legame delle microparticelle con agglutinina lectina da Ricinus Comune (RCA) specifica per il galattosio.
È stata usata lectina da Ricinus Comune (Castor bean) agglutina RCA (SIGMA) avente la seguente attività di agglutinazione: 0.3 μg/ml di RCA120 è in grado di agglutinare una sospensione di eritrociti al 26% v/v.
Una sospensione di microparticelle a base di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14), sieroalbumina umana (HSA) e digalattosildiacilglicerolo (DGDG) è stata centrifugata a 15,000 G per 15 minuti e il residuo è stato risospeso in soluzione tampone fosfato isotonica (PBS) a pH 7.4. Aliquote da 1 mi di questa sospensione sono state trasferito in una cella termostatica e mantenute a 37°C per 15 minuti, sotto agitazione. La trasmittanza dei campioni di microparticelle è stata portata al 90% ed è stato aggiunto 1 ml di soluzione RCA in PBS 6,66 mM pH 7.4. La variazione di densità ottica (O.D.) a 650 nm della sospensione veniva registrata ed espressa come variazione percentuale rispetto al valore iniziale. I risultati hanno evidenziato un’interazione delle microparticelle con RCA come riportato in tabella 1.
Tabella 1
Esempio 14 Determinazione della presenza di residui galatosilici superficiali mediante misure di inibizione da parte delle microparticelle dell'aggluinazione di cellule rosse del sangue (RBC) indotta da agglutinina da Ricinus Comune (RCA),
Il saggio è basato sulla competizione tra residui di galattosio, esposti, sia sulle cellule rosse del sangue che sulle microsfere, per recettori specifici del galattosio presenti sull’agglutinina da Ricinus comunis.
Globuli rossi del sangue da donatori (gruppo O, Rh negativo) in destrosio citrato (ACD) sono stati separati dal sangue per centrifugazione a 3000 rpm, lavate due volte con fisiologica tamponata fosfato (PBS) pH 7.4 ed infine risospesi a 1% v/v in PBS. Agglutinina da Ricinus Comune (RCA) è stata diluita con PBS per ottenere una soluzione di riferimento contenente 20 pg/ml di RCA Il titolo di agglutinazione del campione di controllo è stato determinato in una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 50 μl di PBS, 50 μl di soluzione di controllo e 100 μl di sospensione di globuli rossi. Dopo 2 ore a temperatura ambiente, il titolo di agglutinazione e la “unità di agglutinazione” (la più alta diluizione in grado agglutinare) sono stati valutato visualmente.
Successivamente, in una piastra a 96 pozzetti sono stati posti nell’ordine ordine 50 μl di PBS, 50 μl di diluizioni seriali al raddoppio di sospensione di microparticelle, 50 μl di soluzione di controllo RCA (1 e 4 unità di agglutinazione) e dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente 100 μl di sospensione di eritrociti. Dopo 1 ora di incubazione a temperatura ambiente le piastre sono state ispezionate visivamente e la diluizione più alta della sospensione di microparticelle in grado di inibire la agglutinazione di globuli rossi è stata valutata come 1:32 quando si utilizza 1 unità di agglutinazione e di 1:16 quando si utilizzano 4 unità di agglutinazione.
Un saggio di conferma è stato effettuato utilizzando D(+) galattosio come inibitore della agglutinazione delle cellule rosse del sangue indotta da RCA.
Esempio 15 Interazione delle microparticelle con i recettori degli epatociti per le asialoolicoproteine.
L’interazione dei residui galattosilici presenti sulla superficie di microparticelle PAM14/HSA/HSA-FITC/DGDG/GDA-bCD preparate nell’esempio 6 con recettori delle cellule epatiche specifici per il galattosio è stata valutata mediante misure di citofluorimetria a flusso utilizzando epatociti di ratto.
Le microparticelle sono state isolate per centrifugazione della sospensione a 14,000 G, lavate estensivamente con salina ed infine risospese in PBS a circa 240 mg/ml. Le cellule di fegato di ratto sono state preparate per perfusione con collagenasi secondo il metodo di Seglen, Methods Cell.Biol. 13 : 29 (1976), e cresciute a 37°C in terreno di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) addizionato con 0,1% albumina in ambiente al 5% di anidride carbonica. Gli epatociti sono incubati con 240 mg/ml di sospensione di microcapsule per 2 ore a 37°C in DMEM addizionato con 0,9 mM Ca<2+ >in un ambiente al 5% di anidride carbonica. Utilizzando un analizzatore FACS (Becton and Dickinson), la fluorescenza di ciascuna cellula è stata registrata ad un tasso di 300 cellule/sec (lunghezza d’onda di eccitazione 488 nm a mezzo di un laser a ioni argon e lunghezza d'onda di emissione 515 nm). Le cellule morte sono state identificate e conteggiate dopo incubazione con 5 μg/ml di ioduro di propidio (controllo negativo). Una elaborazione statistica dei dati secondo Kolmogorov-Smimov, J.Histochem.Cytochem 25 : 935 (1977), ha fornito un valore di coefficiente D = 0,21 e D/s(n) = 11 ,06, con un valore di soglia positiva: D/s(n) = 8.
Esempio 16 Interazione delle microsfere con immunoglobuline umane o albumina serica umana.
La mancanza di capacità di interagire con proteine opsonizzanti come immunoglobuline G (IgG) e albumina serica umana (HSA) da parte delle microsfere è stata valutata misurando le proteine non legate dopo incubazione a 37°C per diversi periodi di tempo. Come sonda e come standard di riferimento, sono state utilizzate microsfere di polistirene aventi diametro 305 nm.
I campioni di sospensione di microsfere, aventi superficie 0,05 mq/ml, diluiti in fisiologica, sono stati incubati in cuvette Eppendorf con soluzioni di IgG o di HSA. Dopo 2 o 3 ore di incubazione a 37°C e separazione per mezzo di centrifuga Eppendorf a 15,000 G per 2 ore, i sovranatanti nei campioni sono stati prelevati e il contenuto di proteine è stato misurato mediante spettrofotometria (Ta ibelle 2a e 2b).
HSA: max 277 nm; assorbenza di soluzione 1% = 5,7 (1=1 cm)
IgG: max 279 nm; assorbenza di soluzione 1% = 13,8 (1=1 cm)
Tabella 2a - Assorbimento di HSA sulle microsfere
Tabella 2b - Assorbimento delle IgG sulle microsfere
1) Percentuale di proteina adsorbita sul campione rispetto al polistirene.
Esempio 17 Valutazione quantitativa del contenuto di residui di galatosio.
Il contenuto di residui di galattosio nei diversi campioni di microsfere è stato valutato per determinazione colorimetrica del prodotto di reazione del galattosio con fenolo in acido solforico [Dubiois M. et. al, Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal.Chem., 28: 350-356 (1956)].
I campioni da analizzare sono stati diluiti a una concentrazione di residui di galattosio da 10 a 50 μg/ml. 2 ml della soluzione da saggiare, 1 mi di una soluzione contenente 5,0 g di fenolo in 100 ml di acqua e 5 mi di acido solforico al 96% sono stati posti in una provetta da 20 mi nell’ordine descritto. Dopo 10 minuti, la soluzione risultante è stata mescolata energicamente e riscaldata a 35-40°C per 10 minuti, il contenuto di galattosio è stato valutato paragonando l'assorbanza a 490 nm della soluzione con quella di prodotti di reazione di soluzioni standard contenenti circa 10, 30, 50, 70 e 90 μg/ml di galattosio.
Per paragone, la determinazione del galattosio è stata effettuata anche sui componenti individuali utilizzati nella preparazione di microsfere, cioè acqua distillata, PAM 14, DGDG, βCD-GDA, HSA, HSA-FITC e BSA-GAL-FITC.
I risultati ottenuti indicano che il 5% dei residui di galattosio e pertanto dei glicolipidi DGDG è presente nel pellet centrifugato.
Esempio 18 Microincapsulazione di interferone leucocitario nelle microsfere.
Una soluzione di 210 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 4 mi di miscela 4:1 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante siringa munita di ago 22 G. in una soluzione di 110 mg di albumina umana (HSA) e 3.000.000 U.l. di interferone alfa leucocitario umano (IFNa) in 10 mi di acqua bidistillata contenente il 5% in peso di glicidildiisopropildenarabitolo-betaciclodestrina.
Terminata l'aggiunta la dispersione è stata mantenuta in agitazione magnetica per 60 minuti. Alla sospensione cosi ottenuta è stata aggiunta in 10 minuti sotto agitazione una dispersione di 25 mg di una miscela 1:1 galattolipide/galattolipide idrogenato. L'agitazione è stata continuata per 40 minuti.
La determinazione dell'inibizione da parte delle microsfere dell'effetto citopatico causato su cellule Wish da virus della stomatite bovina operando in accordo ad E.A. Havell et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2:476 (1972), ha permesso di determinare un’efficienza di
Claims (36)
- RIVENDICAZIONI 1. Microparticella chimicamente omogenea per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive costituita da un nucleo comprendente una componente essenzialmente proteica e un polimero naturale, sintetico o semisintetico, e uno strato esterno costituito da molecole naturali, sintetiche o semisintetiche in grado di essere riconosciute da recettori o componenti della superficie cellulare di organismi viventi, o di riconoscere strutture molecolare naturali, sintetiche o semisintetiche.
- 2. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 1 in cui la componente essenzialmente proteica è costituita da almeno una proteina tra albumina (umana, bovina, o d’uovo), al globulina, a2 globulina, collagene, fibrinogeno, gelatina.
- 3. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 2 in cui detta proteina è albumina umana naturale o ricombinante.
- 4. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui il nucleo comprende ulteriormente ciclodestrine modificate.
- 5. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui il polimero naturale sintetico o semisintetico è costituito da polimeri polianionici e loro miscele.
- 6. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 5 in cui detti polimeri polianionici contengono gruppi carbossilici e/o solfonici e/o fosforici.
- 7. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto polimero è costituito da emiesteri di copolimeri alternati dell’anidride maleica con alchilvinileteri ossietilenglicol con grado di polimerizzazione 1 ≤ n < 1000.
- 8. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 7 in cui il grado di polimerizzazione 1 < n < 10.
- 9. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto strato esterno è costituito da glicolipidi e/o glicoproteine e/o polimeri sintetici o semisintetici contenenti residui glicosidici o saccaridici, e/o mono e/o oligosaccaridi.
- 10. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 9 in cui detti residui glicosidici sono residui di galattosio, lattosio o mannosio.
- 11. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 9 in cui lo strato esterno è costituito da poliamrninoacidi contenenti residui di galattosio, lattosio o mannosio.
- 12. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 9 in cui ì glicolipidi sono costituiti da mono o di galattosildigliceridi, gangliosidi, lattosilcerebrosidi, neogalattolipidi (lipidi modificati mediante residui saccaridici).
- 13. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 9 in cui dette glicoproteine sono costituite da asialoglicoproteine e neoglicoproteine.
- 14. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 13 in cui le asialoglicoproteine comprendono asialofetuina, asialoorosomucoide, asialotransferrina.
- 15. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 9 in cui dette glicoproteine comprendono albumina glicosilata, in particolare galattosilata, lattosilata, mannosilata.
- 16. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 9 in cui detti mono e/o oligosaccaridi sono costituiti da galattosio, lattosio e/o mannosio.
- 17. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detti recettori o componenti della superficie cellulare di organismi viventi sono espressi in condizioni normali o patologiche su cellule epatiche, parenchima!) e non parenchimali, o nel midollo osseo.
- 18. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 17 in cui i recettori sono di tipo selettinico E o P.
- 19. Microparticeila chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui dette molecole biologicamente attive sono costituite da peptidi, polipeptidi, proteine, carboidrati, acidi nucleici, lipidi o polisaccaridi, naturali, sintetici o semisintetici.
- 20. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 19 in cui detto acidi nucleici comprendono polinucleotidi, oligonucleotidi antisenso, coniugati molecolari contenente RNA o DNA, vettori di RNA o DNA idrosolubili.
- 21. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 19 in cui detti polipeptidi comprendono citochine, linfochine, monochine, interferoni.
- 22. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 21 in cui l'interferone è α-interferone naturale, sintetico o ricombinante.
- 23. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18 in cui dette molecole biologicamente attive sono un vaccino naturale o ricombinante.
- 24. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18 in cui dette molecole biologicamente attive sono costituite da antigeni batterici o virali naturali o ricombinanti.
- 25. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18 in cui dette molecole biologicamente attive sono un adiuvante immunologico.
- 26. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18 in cui dette molecole biologicamente attive sono costituite da o sono legate a anticorpi naturali o ricombinanti e/o frammenti di essi.
- 27. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18 in cui dette molecole biologicamente attive sono costituite da un agente radioattivo, un enzima, un fattore della coagulazione, o un ormone idrosolubile.
- 28. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 27 in cui detto enzima è la superossido-dismutasi, anche modificata.
- 29. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 27 in cui detto fattore della coagulazione è il fattore VIII.
- 30. Microparticella chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 18 in cui dette molecole biologicamente attive sono costituite da sostanze naturali sintetiche o semisintetiche appartenenti agli antitumorali, antibiotici, antinfiammatori, immunostimolanti, immunosoppressivi.
- 31. Microparticelia chimicamente omogenea secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti aventi dimensioni comprese tra 100 nm e 1000 nm, preferibilmente tra 100 nm e 400 nm, con distribuzione monomodale ed indice di polidispersità limitato.
- 32. Microparticella chimicamente omogenea secondo la rivendicazione 31 in cui il direzionamento verso organi specifici viene attuato sulla base della dimensione media delle microparticelle.
- 33. Procedimento per la preparazione di microparticelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti a mezzo di: - miscelazione di una soluzione acquosa idróalcoolica organica di un polimero naturale, sintetico o semisintetico con una soluzione proteica; - coprecipitazione controllata ad un pH compreso tra 3 e 7, preferibilmente tra 4 e 5 ad una temperatura variabile tra 0°C e 70°C, preferibilmente tra 10 e 40°C; - aggiunta del componente dello strato esterno in condizioni di agitazione; - agitazione fino ad evaporazione del solvente organico.
- 34. Composizione farmaceutica comprendente microparticelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 32 disperse in un mezzo farmaceuticamente accettabile.
- 35. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 34 in forma di liofilizzato per ricostituzione, sospensione acquosa o gel.
- 36. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 34 per somministrazione per iniezione e/o impiantazione per vìa sottocutanea, intradermica, intratecale intramuscolare, intraperitoneale, intravenosa, intrarteriosa.
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