WO2013084207A1 - Formulações micelares proteicas e respectivo método de produção - Google Patents

Formulações micelares proteicas e respectivo método de produção Download PDF

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protein
lipophilic phase
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Artur Manuel Cavaco Paulo
Andreia Ferreira Castro Gomes
Raquel JESUS MARQUES SILVA
Ana Isabel SÁ LOUREIRO
Ana Arminda LOPES PRETO DE ALMEIDA
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Universidade Do Minho
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Definitions

  • the present invention describes in protein micellar formulations for controlled release of natural polymer-based agents, more specifically proteins and peptides. More specifically, the production of micelles with polymeric material is carried out with processes involving high energy, namely ultrasound and high pressure homogenizer, in order to obtain formulations with micelles that have a diameter between 30 and 5000 nm. increase the bioavailability of the active ingredients for different topical and / or intravenous pharmaceutical, cosmetic and detergent applications.
  • Vesicular systems such as liposomes, polymer micelles, polymer conjugates, micro and nanoparticles, have several important applications including microencapsulation of dyes, flavors, perfumes and cosmetics, creams, drug release, magnetic resonance contrast agents and echocardiography. , study of membrane structure, function and reactivity. In fact, vesicular systems are still developing and have attracted great interest in the development of new formulations due to their ability to release different types of hydrophilic and lipophilic drugs in specific areas of the body. Compared to conventional dosage forms, these systems provide numerous advantages, including increased therapeutic index. In addition, these vehicles carriers overcome some stability and solubility problems of drugs in biological fluids.
  • nanoparticles A large part of nanoparticles is obtained from synthetic polymers such as polylactic acid, polyorthoesters, etc. and natural such as lipids, oligopeptides, polysaccharides, chitosan, dextrins, proteins, among others.
  • Nanoparticles are thus considered to be highly promising systems in the field of bioactive agent vectoring, as their physicochemical properties can be modulated through a correct selection of various operating parameters thus presenting a high ability to carry a wide range of substances.
  • Protein nanoparticles have been mentioned in the literature as drug carrier systems or as diagnostic agents. However, some of the obstacles encountered in nanocapsulation are due to the use of high temperature organic solvents that can cause damage to the encapsulating material, such as drugs (in US Nos. 3,886,084; 3,937,668; 4,357,259) (Vassiliades 1975 ; Zolle 1976; Oppenheim 1978). Albumin nanoparticles can be prepared by denaturation from temperature rise or through the use of crosslinking agents. In this process an aqueous protein solution is added to an immiscible liquid or an oil phase.
  • the drops of the protein solution are dispersed by high agitation and then stabilized with a temperature increase (100 ° C and 150 ° C) to form nanoparticles (Leucuta et al. 1988).
  • This method has a limitation of the material to be encapsulated as it does not allow the encapsulation of heat sensitive agents.
  • the method of Chemical crosslinking is based on the addition of glutaraldehyde to the emulsion to make the chemical bond between glutaraldehyde and protein followed by rinsing and storage (Lee et al. 1981).
  • the major disadvantage of this technique is the use of crosslinking agents which are generally highly toxic.
  • the present invention describes protein micellar formulations for controlled release of agents and their method of production.
  • the invention is a novel micelle composition for pharmaceutical applications, cosmetics and detergents.
  • formulations for micelle formation comprising:
  • a lipophilic phase comprising a hydrophobic compound
  • aqueous phase may be water or any buffer best suited for a particular application, such as an aqueous bovine serum albumin (BSA) solution; human serum albumin (HSA); silk fibroin or a polypeptide.
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • the present invention describes formulations for micelle formation comprising:
  • a lipophilic phase comprising a hydrophobic compound
  • the sizes of said micelles range from 30-5000 nm, preferably 30-100 nm.
  • Another embodiment is a formulation containing the following composition: 50-99.5% v / v of the aqueous phase which contains 0.1-8 g / l of a dissolved adjuvant, preferably 2-6 g / l, most preferably 4-5 g / l ;
  • a lipophilic phase preferably between 0.1-5%, even more preferably 0.5-2.5 ⁇ 6.
  • the aqueous phase of the described formulations comprises at least one of the following solutions:
  • BSA bovine serum albumin
  • SAH human serum albumin
  • GAGAGA GAGSGS; GSGSGS; GAGAGL; GAGLGL; GLGLGL; GDGDGD; GAGAGD; GAGDGD;
  • KRSSPDTSGIKSLD KRYYPDTYGIKYLD; KRHHPDTHGIKHLD; KRFFPDTFGIKFLD; KRLLPDTLGIKLLD.
  • the peptides with higher amino acids i.e. from 6 amino acids, preferably from 10 amino acids; these being hydrophobic, they allow the formation of smaller micelles.
  • the variation of the hydrophobic fraction fraction between 0.1-50% v / v which makes up the lipophilic phase, interferes with the micelle diameter as well as the stability over time. (ie, lower% greater stability).
  • the physicochemical properties of micelles are also influenced. Increasing protein concentration and decreasing lipid fraction leads to a reduction in micelle size and more homogeneous and more stable samples, namely concentrations greater than 1 g / L albumin and lipid fractions below 20%.
  • the formulations described in the present invention may optionally contain a hydrophilic active compound namely diclonofenac, or piroxicam, among others.
  • the formulations described in the present invention may further contain a targeting agent - targeting agent for recognizing certain cells in the aqueous phase or lipophilic phase, namely folic acid.
  • the lipophilic phase of the formulations described in the present invention comprises at least one of the following solutions n-dodecane; vegetable oil, cooking oil, among others.
  • the lipophilic phase may further contain:
  • At least one hydrophobic active compound selected from the following group taxol, celecoxib, piroxicam, CORMs or; At least one compound selected from the following group fragrances, perfumes, or essential oils.
  • the adjuvant may be a surfactant or a polymer. Even more preferably the adjuvant may be selected from the following polysorbate group 80; poloxamer 407; sodium dodecyl sulfate; polyvinyl alcohol or pluronic acid, among others.
  • formulations described in the present invention contain an aqueous phase comprising an albumin solution; a lipophilic phase comprises a vegetable oil and the adjuvant is poloxamer.
  • the formulation may further contain additives, active compounds, fragrances, etc.
  • formulations described in the present invention may be used in medicine i.e. as a medicament or as a pharmaceutical composition, or as a cosmetic in particular in cosmetic compositions or as a detergent (solid or liquid).
  • compositions comprising the micellar formulations described in the present invention may be administered topically, orally, parenterally, injectably, in particular for intravenous, subcutaneous and intramuscular application.
  • the cosmetic compositions comprising the micellar formulations described in the present invention may be the above cosmetic compositions characterized in that they are in the form of a cream, lotion or gel, in particular used in the treatment of skin or hair problems.
  • Another preferred embodiment describes a method of preparing the micelle forming formulations described in the present invention, as they are obtained from two different methodologies, namely by ultrasound or by a high pressure homogenizer.
  • micelles are produced by ultrasonification or high pressure homogenization of an aqueous phase containing a natural or synthetic protein or peptide; a lipophilic phase is comprised of a hydrophobic compound and an adjuvant, and no crosslinking agents or primers are required.
  • a lipophilic phase is comprised of a hydrophobic compound and an adjuvant, and no crosslinking agents or primers are required.
  • the present invention consists of a new formulation and its method of preparing micelle formation for pharmaceutical, cosmetic and detergent applications, the formulations described in the present invention allow to increase the micelle formation yield by more than 90% and the encapsulation efficiency of the compounds in Protein micelles obtained by these formulations is greater than 80%.
  • it proposes controlled release protein compositions for "in vivo" applications.
  • controlled release in vivo refers to the release of biological or non-biological material from oral, intravenous, subcutaneous, intramuscular, topical, etc. administration.
  • active compound refers to active pharmaceutical agents such as analgesic agents, anti-inflammatory agents, antibiotic agents, antifungal agents, anticancer agents, among others.
  • non-active compound refers for example to fragrances or essential oils, among others.
  • the method comprises obtaining protein micelles from a high amount of energy.
  • This energy can be obtained from the use of ultrasound, or the use of a high pressure homogenizer or even from a stir plate, depending on whether more homogeneous samples and smaller sizes are to be obtained or whether it is intended to be used. small protein concentrations.
  • protein encompasses natural or synthetic proteins, peptides, polypeptides, polyamino acids.
  • the preparation method involves two distinct phases: aqueous phase and lipophilic phase, using high energy techniques, namely ultrasound and high pressure homogenizer.
  • the solvent may be water or any buffer most suitable for a particular application, such as an aqueous bovine serum albumin (BSA) solution; human serum albumin (HSA); silk fibroin or a polypeptide according to the following sequences (terminal NC: six amino acid peptides GAGAGS; GAGAGA; GAGSGS; GSGSGS; GAGAGL; GAGLGL; GLGLGL; GDGDGD; GAGAGD; GAGDGD; or peptides with different amino acids DAAGAAAA; DDAAGAAAA; DDDAAGAAAA; DDDDAAGAAAA; DAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA; DDDDAAGAAAAGAAAAAAAAAA; DDDDAAGAAAAGAAAAAAAAAA; DDDDAAGAAAAGAAAAAAAAAAAA; DDDDAAGAAAAGAAAAAAAAAAAAAA; DD
  • ILLRKLHVPFFPIGFRGRPAAS ILLRKLHVPI I PIGIRGRPAAS; ILLRKLHVPWWPIGWRGRPAAS ILLRKLHVPYYPIGYRGRPAAS; ILLRKLHVAHGAIGIRGRPAAS ILLRKLHVCHGCIGIRGRPAAS; fourteen amino acid peptides; KRCCPDTCGIKCLD; KRSSPDTSGIKSLD; KRYYPDTYGIKYLD; KRHHPDTHGIKHLD; KRFFPDTFGIKFLD;
  • KRLLPDTLGIKLLD KRLLPDTLGIKLLD.
  • These synthetic peptides vary in their composition with regard to the number and type of amino acids, enabling micelle size control.
  • the most amino acid peptides - i.e. from 6 amino acids, preferably from 10 amino acids; these being hydrophobic, it allows the formation of smaller micelles.
  • This phase may further contain an active compound, which is hydrophilic, such as diclofenac.
  • the lipophilic phase may be any solvent that is immiscible with aqueous phase to form two distinct phases, such as n-dodecane (organic solvent) or vegetable oil or cooking oil, among others.
  • Hydrophobic active compounds such as for example celecoxib, taxol, piroxicam or non-active fragrance compounds should be added at this stage.
  • an adjuvant a third component to this composition, called an adjuvant
  • an adjuvant will influence the properties of micelles: size, polydispersity and surface potential.
  • the process of micelle formation is a complex phenomenon that has not yet been completely clarified.
  • Addition of the adjuvant is carried out in the aqueous phase at room temperature prior to sonication or homogenizer treatment.
  • Adjuvants are the use of any surfactant or any polymer which has the ability to decrease surface tension and stabilize micelles.
  • this adjuvant is not fully understood; a surfactant or polymer capable of decreasing surface tension and stabilizing micelles such as polysorbate 80 (Tween 80) may be used as an adjuvant; poloxamer 407; sodium dodecyl sulfate (SDS); polyvinyl alcohol (PVA) or pluronic acid (F-68 and F-127).
  • Teween 80 polysorbate 80
  • poloxamer 407 sodium dodecyl sulfate
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PVA polyvinyl alcohol
  • pluronic acid F-68 and F-127
  • the physicochemical properties of micelles are also influenced. Increased protein concentration and decreased lipid fraction leads to a reduction in micelle size and more homogeneous and more stable samples, namely, concentrations greater than 1 g / L albumin and lipid fractions below 20%.
  • a targeting agent can also be added. Different targeting agents may be added depending on the target. The objective is to enable specific recognition of certain target cells to be treated, such as micelles can be directed to sites of inflammation since these sites have activated macrophages that have the folate receptor on the surface.
  • the targeting agent may be folic acid.
  • the targeting agent may be bound to the protein used for micelle formation. Thus, a certain ratio of a solution of this folate-bound protein is added to the aqueous phase of the composition at the time of preparation. In the present work, after several optimization steps it was determined that the use of the 1/100 ratio of folate bound BSA / BSA allowed the detection of folate on the micelle surface.
  • Example 1 Obtaining protein micelles containing an anti-inflammatory drug (Piroxicam) from the sonochemical method for application to human skin burns
  • the protein used in this example was bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the composition used for the preparation of these protein micelles consists of a BSA aqueous phase with a concentration of 5 gL -1 (87% aqueous phase), a low percentage lipophilic phase (5% edible oil) and 8 g / L of adjuvant agent, polyvinyl alcohol.
  • the lipophilic drug used was piroxicam
  • the size distribution was obtained by the photon correlation spectroscopy technique in the equipment designated Zeta Sizer NS, presenting micelles with diameters of 280 nm and a polydispersity of 0.090.
  • the surface charge of these micelles was measured in terms of zeta potential obtained in Zeta Sizer NS, presenting negative charge (-4 mV).
  • These micelles were also analyzed by scanning electron microscopy for the purpose of determining morphology, having a spherical shape. These micelles showed great stability over two months. Cytotoxicity assays revealed that these protein micelles showed low cytotoxicity when tested on human cell lines (human fibroblasts-BJ5ta).
  • the protein used in this example was bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the composition used for the preparation of these protein micelles consists of an aqueous BSA phase with a concentration of 10 gL -1 (99% aqueous phase), a low percentage lipophilic phase (0.5% edible oil) and 0.5% adjuvant. polysorbate 80.
  • a targeting agent folic acid (FA).
  • the method of preparing these micelles is to homogenize at room temperature the protein solution containing the adjuvant with the lipophilic phase which contains the lipophilic drug dissolved at a concentration of 20 mg. ml -1 .
  • This composition was subjected to 26 cycles using high pressures at the two pressure stages present in the homogenizer (Stage 1 pressure approximately 580 bar and Stage 2 pressure approximately 240 bar).
  • the size distribution was obtained by the photon correlation spectroscopy technique in the equipment called Zeta Sizer NS, presenting micelles with diameters of approximately 70 nm and a polydispersity of approximately 0.2.
  • the surface charge of these micelles was measured in terms of zeta potential obtained in the Zeta Sizer NS, presenting negative charge (approximately -4 mV).
  • These micelles were also analyzed by scanning electron microscopy for the purpose of determining morphology, having a spherical shape. These micelles showed great stability over five months.
  • the formulations may comprise different ratios of aqueous phase / lipophilic phase in the homogenizer, we compare several ratios below.
  • Poloxamer 407 at a concentration of 0.1-5 g / L is present in the aqueous phase when preparing the protein composition.
  • Table 1 Comparison of mean micelle sizes and polydispersity of compositions without Poloxamer 407 and with two concentrations of this copolymer.
  • the following embodiments contain the targeting agent -targeting: These protein compositions may optionally further contain a targeting agent for recognizing certain target cells.
  • the targeting agent used was folic acid (FA). Internalization tests were performed on cancer cells (CACO-2) as well as activated macrophages, cells that express folate receptor.
  • Grinstaff, MWP, CA Soon-shiong, Patrick (Los Angeles, CA), Wong, Michael (Champagne, IL), Sandford, Paul A. (Los Angeles, CA), Suslick, Kenneth S. (Champagne, IL) , Desai, Neil P. (Los Angeles, CA) (1997).
  • Grinstaff, MWP, CA Soon-shiong, Patrick (Los Angeles, CA), Wong, Michael (Champagne, IL), Sandford, Paul A. (Los Angeles, CA), Suslick, Kenneth S.

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Abstract

A presente invenção descreve em formulações micelares proteicas para libertação controlada de agentes e respetivo método de produção. A invenção descreve numa nova composição de micelas para aplicações farmacêuticas, cosméticas e detergência. Nomeadamente, formulações para a formação de micelas que compreendem: • uma fase aquosa contendo uma proteína ou um péptido natural ou sintético; • uma fase lipofílica que compreende um composto hidrofóbico; • um agente adjuvante dissolvido na fase aquosa que regula o tamanho e estabilidade das micelas; em que os tamanhos das referidas micelas varia entre 30 a 5000 nm, de preferência de 30-100 nm, as referidas micelas podem ser obtidas a partir de duas metodologias diferentes, nomeadamente ultra-sons ou homogeneizador de alta pressão. O método de preparação envolve duas fases distintas: fase aquosa e fase lipofilica. A fase aquosa pode ser água ou qualquer tampão que mais se adeque para uma determinada aplicação, como por exemplo uma solução aquosa de albumina sérica bovina (BSA); albumina sérica humana (HSA); fibroína da seda ou de um polipéptido.

Description

DESCRIÇÃO
FORMULAÇÕES MICELARES PROTEICAS E RESPECTIVO MÉTODO DE
PRODUÇÃO
Campo da invenção
A presente invenção descreve em formulações micelares proteicas para libertação controlada de agentes, com base em polímero naturais, mais concretamente proteínas e péptidos. Mais especificamente, a produção das micelas com material polimérico é efetuada com processos que envolvem elevada quantidade de energia, nomeadamente ultra-sons e homogeneizador de alta pressão, de forma a obter formulações com micelas que possuem um diâmetro entre 30 a 5000 nm com o objetivo de aumentar a biodisponibilidade dos princípios ativos para diferentes aplicações farmacêuticas tópica e/ou intravenosa, cosméticas e detergência.
Antecedentes da invenção
Os sistemas vesiculares, como lipossomas, micelas poliméricas, conjugados de polímeros, micro e nanopartícuias , possuem diversas e importantes aplicações, incluindo a microencapsulação de corantes, aromas, perfumes e cosméticos, cremes, libertação de fármacos, agentes de contraste para ressonância magnética e ecocardiografia, estudo da estrutura da membrana, função e reactividade . Na verdade, os sistemas vesiculares continuam em desenvolvimento e têm atraído grande interesse no desenvolvimento de novas formulações, devido à capacidade que possuem de libertar diferentes tipos de drogas, hidrofílicas e lipofílicas, em áreas específicas do corpo. Em comparação com as formas farmacêuticas convencionais, estes sistemas proporcionam inúmeras vantagens, incluindo o aumento do índice terapêutico. Além disso, esses veículos transportadores superam alguns problemas de estabilidade e solubilidade de fármacos em fluidos biológicos.
Uma grande parte das nanoparticulas é obtida a partir de polímeros sintéticos como o ácido poliláctico, poliortoesteres , etc. , e naturais como por exemplo lipidos, oligopeptidos , polissacarideos , quitosano, dextrinas, proteínas, entre outros.
As nanoparticulas são assim, consideradas sistemas altamente promissores no domínio da vectorização de agentes bioactivos, pois as suas propriedades físico-químicas podem ser moduladas através de uma correcta selecção de diversos parâmetros operacionais apresentando assim uma elevada capacidade de transportarem uma grande diversidade de substâncias .
As nanoparticulas proteicas têm sido mencionadas na literatura, como sistemas transportadores de fármacos ou como agentes de diagnóstico. No entanto, alguns dos obstáculos encontrados à nanoencapsulação devem-se à utilização de solventes orgânicos e de temperaturas elevadas susceptíveis de causar danificação no material a encapsular, como por exemplo nos fármacos (nos documentos US N° 3,886,084; 3,937,668; 4,357,259) (Vassiliades 1975; Zolle 1976; Oppenheim 1978) . As nanoparticulas de albumina podem ser preparadas por desnaturação a partir do aumento de temperatura ou através do uso de agentes "crosslinking" . Neste processo uma solução aquosa de proteína é adicionada a um líquido imiscível ou a uma fase oleosa. As gotas da solução proteica são dispersas através de uma elevada agitação, sendo posteriormente estabilizadas com um aumento de temperatura (100° C e os 150° C) para formar nanoparticulas (Leucuta et al . 1988). Este método possui uma limitação do material a encapsular, pois não permite o encapsulamento de agentes sensíveis ao calor. O método de "crosslinking" químico baseia-se na adição de glutaraldeido à emulsão para que ocorra a ligação química entre o glutaraldeido e a proteína efectuando-se logo de seguida as lavagens para depois proceder-se ao seu armazenamento (Lee et al . 1981) . A grande desvantagem desta técnica é o uso de agentes "crosslinking" que apresentam de uma forma geral uma elevada toxicidade. Mais tarde, surgiram novas técnicas de preparação de nanoparticulas de proteína sem recorrer ao uso de temperaturas elevadas ou até mesmo de agentes "crosslinking", como está referido no documento US N° 4,357,259 (Senyei 1982). Este método refere-se apenas ao encapsulamento de compostos solúveis em água não usando adjuvantes, apresentando tempos de preparação superiores a 1 hora e o envolvimento de múltiplas técnicas (agitação seguida de sonicação) para a obtenção de partículas com tamanhos superiores a 1000 nm.
Diversos documentos e artigos sobre o aperfeiçoamento de produção de nanoparticulas foram surgindo ao longo destes anos (US N° : 5,069,936; WO 91/06286; US N° : 6,592,844; US 2004/0043077; US2007 / 0122465 ; US2008 / 0233201 ) (Yen 1991; Mathiowitz 1993; Coombes 2002; Brown 2004; Royere 2008) . Um elevado número de processos tem sido utilizado na produção de nanoparticulas para uma grande diversidade de aplicações, nomeadamente, sistemas de ultra-sons, e o homogeneizador de alta pressão, uma vez que estes aumentam o potencial efeito de agitação/mistura acelerando uma grande variedade de processos químicos e físicos.
A produção de nanoparticulas de proteínas através de sistemas de ultrasons tem sido explorada. Albunex é um produto aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) , que consiste em micropartícuias de albumina produzidas por ultra-sons sendo estas aplicadas por via intravenosa, como agente de contraste para ultra-sonografia e como um eco- agente de contraste para ecocardiograma (Grinstaff and Suslick 1991) . No entanto, a escolha da proteína, assim como, os materiais a encapsular nestas nanopartícuias , permitem uma infinidade de aplicações biomédicas. Algumas das aplicações das nanoparticulas biocompatíveis incluem agentes de contraste para ressonância magnética e ecocardiografia e novos sistemas de libertação controlada (Suslick and Grinstaff 1990) . Todas estas aplicações e procedimentos estão descritos nos documentos US N° : 5,362,478; 5,439,686; 5,505,932; 5,508,021; 5,512,268; 5,635,207; 5,639,473; 5,650,156; 5,665,382; 5,665,383; 7,217,410 B2 7 (Desai 1994; Desai 1995; Grinstaff 1996; Grinstaff 1996; Grinstaff 1996; Grinstaff 1997; Grinstaff 1997; Grinstaff 1997; Grinstaff 1997; Grinstaff 1997; Desai 2003; Suslick 2007) . Os documentos US N° : 5, 916, 596 e 2003/0133955 (Desai 1999; Desai 2003) mencionam o uso de ultra-sons e homogeneizador de alta pressão, obtendo nanoparticulas de proteínas com diferentes tamanhos, de acordo com a técnica utilizada. Todas estas patentes acima mencionadas, referem a formação de nano/micropartículas a partir de ligações dissulfidicas entre os resíduos Cisteína presentes nas proteínas, e/ou o uso de agentes "crosslinking" capazes de promover essas ligações dissulfidicas ; atribuindo ainda a estabilidade ao longo do tempo destas partículas, a essas ligações que se estabelecem a quando a sua formação.
Sumário da Invenção
A presente invenção descreve formulações micelares proteicas para libertação controlada de agentes e respectivo método de produção. A invenção consiste numa nova composição de micelas para aplicações farmacêuticas, cosméticas e detergentes. Nomeadamente, formulações para a formação de micelas que compreendem:
• uma fase aquosa contendo uma proteína ou um péptido natural ou sintético;
• uma fase lipofílica que compreende um composto hidrofóbico ;
• um agente adjuvante dissolvido na fase aquosa que regula o tamanho e estabilidade das micelas;
em que os tamanhos das referidas micelas varia entre 30 a 5000 nm, de preferência de 30-100 nm, as referidas micelas podem ser obtidas a partir de duas metodologias diferentes, nomeadamente ultra-sons e homogeneizador de alta pressão. O método de preparação envolve duas fases distintas: fase aquosa e fase lipofilica. A fase aquosa pode ser água ou qualquer tampão que mais se adeqúe para uma determinada aplicação, como por exemplo uma solução aquosa de albumina sérica bovina (BSA) ; albumina sérica humana (HSA) ; fibroína da seda ou de um polipéptido.
A presente invenção descreve formulações para a formação de micelas que compreende:
• uma fase aquosa contendo uma proteína ou um péptido natural ou sintético;
• uma fase lipofílica que compreende um composto hidrofóbico ;
• um agente adjuvante dissolvido na fase aquosa que regula o tamanho e estabilidade das micelas;
em que os tamanhos das referidas micelas varia entre 30- 5000 nm, de preferência de 30-100 nm.
Uma outra realização é uma formulação que contem a seguinte composição • 50-99,5 % v/v da fase aquosa a qual contem 0,1-8 g/l de um agente adjuvante dissolvido, de preferência de 2-6 g/L, ainda mais de preferência 4-5 g/L;
• 0,1-50% v/v uma fase lipofilica, de preferência entre 0,1-5 %, ainda mais de preferência de 0,5- 2,5 ~6.
Numa outra realização ainda mais preferencial, a fase aquosa das formulações descritas compreende pelo menos uma das seguintes soluções:
• albumina sérica bovina (BSA) ;
• albumina sérica humana (HSA) ;
• fibroina da seda
• um polipéptido N-C terminal seis aminoácidos GAGAGS;
GAGAGA; GAGSGS; GSGSGS; GAGAGL; GAGLGL; GLGLGL; GDGDGD; GAGAGD; GAGDGD;
• ou péptidos com diferentes aminoácidos DAAGAAAA;
DDAAGAAAA; DDDAAGAAAA; DDDDAAGAAAA; DAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA; DDDDAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA;
• péptidos com vinte e dois aminoácidos ILLRKLHVPFFPIGFRGRPAAS; ILLRKLHVPI I PIGIRGRPAAS ; ILLRKLHVPWWPIGWRGRPAAS ; ILLRKLHVPYYPIGYRGRPAAS ; ILLRKLHVAHGAIGIRGRPAAS ; ILLRKLHVCHGCIGIRGRPAAS ;
• péptidos com catorze aminoácidos; KRCCPDTCGIKCLD;
KRSSPDTSGIKSLD; KRYYPDTYGIKYLD; KRHHPDTHGIKHLD; KRFFPDTFGIKFLD; KRLLPDTLGIKLLD .
Nas diversas realizações da presente invenção, verificou-se que os péptidos com maior número de aminoácidos - isto é, a partir de 6 aminoácidos, de preferência a partir de 10 aminoácidos; sendo estes hidrofóbicos, permitem a formação de micelas com tamanho mais reduzido. No que se refere ao aperfeiçoamento das micelas proteicas, a variação da fracção do composto hidrofóbico entre 0,1-50% v/v, que compõe a fase lipofilica, interfere no diâmetro das micelas, assim como, na estabilidade destas ao longo do tempo (i.e., menores % maior estabilidade). Com diferentes concentrações de proteína, bem como diferentes percentagens de agente adjuvante, as propriedades físico-químicas das micelas são também influenciadas . O aumento de concentração de proteína e a diminuição da fracção lipídica leva a uma redução do tamanho das micelas e a amostras mais homogéneas e mais estáveis nomeadamente, concentrações superiores a 1 g/L de albumina e fracções lipídicas inferiores a 20%.
Numa outra realização ainda mais preferencial, as formulações descritas na presente invenção podem opcionalmente conter um composto ativo hidrofílico nomeadamente o diclonofenac, ou o piroxicam, entre outros.
Numa outra realização ainda mais preferencial, as formulações descritas na presente invenção podem ainda conter um agente alvo - "agente targeting" -_ de reconhecimento de determinadas células na fase aquosa ou fase lipofilica, nomeadamente o ácido fólico.
Numa outra realização ainda mais preferencial, a fase lipofilica das formulações descritas na presente invenção compreende pelo menos uma das seguintes soluções o n- dodecano; óleo vegetal, óleo alimentar, entre outras. Numa outra realização ainda mais preferencial, a fase lipofilica poderá ainda conter:
• pelo menos um composto ativo hidrofóbico, seleccionado do seguinte grupo taxol, celecoxib, piroxicam, CORMs ou; • pelo menos um composto seleccionado do seguinte grupo fragâncias, perfumes, ou óleos essenciais.
Numa outra realização ainda mais preferencial, das formulações descritas na presente invenção o agente adjuvante poderá ser um surfactante ou um polímero. Ainda mais de preferência o agente adjuvante pode ser seleccionado do seguinte grupo polisorbato 80; poloxamer 407; dodecil sulfato de sódio; álcool polivinílico ou ácido plurónico, entre outros.
Numa outra realização ainda mais preferencial, das formulações descritas na presente invenção contem uma fase aquosa que compreende uma solução de albumina; uma fase lipofílica compreender um óleo vegetal e pelo agente adjuvante ser poloxamer. A formulação poderá ainda conter aditivos, compostos activos, fragâncias, etc.
As formulações descritas na presente invenção poderão ser usadas em medicina i.e. como medicamento ou como composição framaçeuticas , ou como cosmético nomeadamente em composições cosméticas, ou como detergente (sólidos ou líquidos) .
Numa outra realização, as composições farmacêuticas que compreendem as formulações micelares descritas na presente invenção poderão ser ministrada por via tópica, oral, parental, injectável, nomeadamente para aplicação intravenosa, subcutânea e intramuscular.
Numa outra realização, as composições cosméticas que compreendem as formulações micelares descritas na presente invenção poderão as composições cosméticas anterior caracterizadas por terem a forma de creme, loção ou gel, nomeadamente usadas no tratamento de problemas de pele ou cabelo . Uma outra realização preferência descreve um método de preparação das formulações para a formação das micelas descritas na presente invenção, por serem obtidas a partir de duas metodologias diferentes, nomeadamente por ultra- sons ou por um homogeneizador de alta pressão.
Descrição detalhada da invenção
Na presente invenção as micelas são produzidas por ultrasonificação ou por homogeneização de alta pressão, de uma fase aquosa contendo uma proteína ou um péptido natural ou sintético; uma fase lipofílica esteja compreendida por um composto hidrofóbico e um agente adjuvante, não sendo necessário a utilização de agentes de "crosslinking" ou iniciadores. Desta forma, é possível a formação de micelas proteicas com um diâmetro reduzido (30 -5000 nm) através de um único passo de processamento da composição descrita, eliminando-se passos intermédios como por exemplo a evaporação de solventes orgânicos utilizados como agentes de "crosslinking" . Pela aplicação destas técnicas de elevada energia e pela presença do adjuvante são obtidas pequenas micelas, onde a proteína se encontra localizada na interface óleo/água, como uma fina camada de revestimento de superfície. As micelas proteicas produzidas são ideais para diversas aplicações que vão desde a indústria farmacêutica, à cosmética e detergência.
A presente invenção consiste numa nova formulação e respectivo método de preparação de formação de micelas para aplicações farmacêuticas, cosméticas e detergência, as formulações descritas na presente invenção permitem aumentar o rendimento de formação de micelas superior a 90% e a eficácia de encapsulamento dos compostos nas micelas proteicas obtidas por estas formulações é superior a 80%. De acordo com a presente invenção, esta propõe composições proteicas para libertação controlada, para aplicações "in vivo ".
0 termo "libertação controlada in vivo" refere-se à libertação de material biológico ou não biológico a partir da administração oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, tópica, etc.
0 termo "composto activo" refere-se agentes farmacêuticos ativos como os agentes analgésicos, agentes anti- inflamatórios , agentes antibióticos, agentes antifúngicos , agentes anticancerigenos , entre outros.
0 termo "composto não activo" refere-se por exemplo a fragrâncias ou óleos essenciais, entre outros.
0 método compreende a obtenção de micelas de proteína, a partir de uma elevada quantidade de energia. Esta energia pode ser obtida a partir de o uso de ultra-sons, ou pelo uso de homogeneizador de alta pressão ou até mesmo a partir de uma placa de agitação, dependendo se se pretende obter amostras mais homogéneas e tamanhos mais pequenos ou se pretende utilizar pequenas concentrações de proteínas.
Qualquer proteína pode formar este tipo de micelas. 0 termo "proteína" engloba proteínas, péptidos, polipéptidos , poliaminoácidos , naturais ou sintéticos.
0 método de preparação envolve duas fases distintas: fase aquosa e fase lipofílica, recorrendo-se a técnicas de elevada energia, nomeadamente o ultra-sons e homogeneizador de alta pressão. Na fase aquosa o solvente poderá ser água ou qualquer tampão que mais se adeqúe para uma determinada aplicação, como por exemplo uma solução aquosa de albumina sérica bovina (BSA) ; albumina sérica humana (HSA) ; fibroína da seda ou de um polipéptido de acordo com as seguintes sequências (N-C terminal: péptidos com seis aminoácidos GAGAGS; GAGAGA; GAGSGS; GSGSGS; GAGAGL; GAGLGL; GLGLGL; GDGDGD; GAGAGD; GAGDGD; ou péptidos com diferentes aminoácidos DAAGAAAA; DDAAGAAAA; DDDAAGAAAA; DDDDAAGAAAA; DAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA; DDDDAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA; péptidos com vinte e dois aminoácidos
ILLRKLHVPFFPIGFRGRPAAS ILLRKLHVPI I PIGIRGRPAAS ; ILLRKLHVPWWPIGWRGRPAAS ILLRKLHVPYYPIGYRGRPAAS ; ILLRKLHVAHGAIGIRGRPAAS ILLRKLHVCHGCIGIRGRPAAS ; péptidos com catorze aminoácidos; KRCCPDTCGIKCLD; KRSSPDTSGIKSLD; KRYYPDTYGIKYLD; KRHHPDTHGIKHLD; KRFFPDTFGIKFLD;
KRLLPDTLGIKLLD . Estes péptidos sintéticos variam na sua composição, no que se refere ao número e tipo de aminoácidos, possibilitando controlo do tamanho das micelas. Os péptidos com maior número de aminoácidos-isto é a partir de 6 aminoácidos, de preferência a partir de 10 aminoácidos; sendo estes hidrofóbicos, permite a formação de micelas com tamanho mais reduzido. Esta fase poderá conter ainda um composto activo, sendo este hidrofilico, tal como por exemplo o diclofenac.
A fase lipofilica poderá ser qualquer solvente que seja imiscivel com fase aquosa de modo a formar duas fases distintas, como por exemplo n-dodecano (solvente orgânico) ou óleo vegetal ou óleo alimentar, entre outros. Os compostos activos hidrofóbicos, tais como por exemplo, o celecoxib, taxol, piroxicam ou compostos não activos como fragâncias deverão ser adicionados nesta fase.
A adição de um terceiro componente a esta composição, designado por agente adjuvante, irá influenciar as propriedades das micelas: o tamanho, polidispersividade e o seu potencial de superfície. O processo de formação de micelas é um fenómeno complexo que ainda não foi completamente esclarecido. A adição do agente adjuvante é efetuada na fase aquosa à temperatura ambiente, antes de submeter ao tratamento do ultra-sons ou do homogeneizador . Como adjuvantes entende-se o uso de qualquer surfatante ou qualquer polímero que tenha a capacidade diminuir a tensão superficial e de estabilizar as micelas. O mecanismo deste agente adjuvante não está totalmente esclarecido, podemos utilizar com agente adjuvante um surfactante ou polímero capaz de diminuir a tensão superficial e de estabilizar as micelas como por exemplo, o polisorbato 80 (Tween 80); poloxamer 407; o dodecil sulfato de sódio (SDS) ; o álcool polivinílico (PVA) ou ácido plurónico (F-68 e o F-127) . Assim, é possível a obtenção de micelas com tamanhos que variam entre os 30- 5000 nm. Os tamanhos obtidos permite com que estas micelas sejam compatíveis com diversas vias de administração, incluindo intravenosa, intradérmica, subcutânea, transdérmica (por exemplo, tópica) e transmucosa.
No que se refere ao aperfeiçoamento das micelas proteicas, a variação da fracção do composto hidrofóbico entre 0,1-50% v/v, que compõe a fase lipofilica, interfere no diâmetro das micelas, assim como, na estabilidade destas ao longo do tempo (i.e., menores % maior estabilidade). Com diferentes concentrações de proteína, bem como diferentes percentagens de agente adjuvante, as propriedades físico-químicas das micelas são também influenciadas . O aumento de concentração de proteína e a diminuição da fracção lipídica leva a uma redução do tamanho das micelas e a amostras mais homogéneas e mais estáveis nomeadamente, concentrações superiores a 1 g/L de albumina e fracções lipídicas inferiores a 20%
Opcionalmente, pode ainda ser adicionado um agente "targeting". Diferentes agentes "targeting" podem ser adicionados consoante o alvo. O objectivo é permitir o reconhecimento específico de determinadas células alvo a serem tratadas, como por exemplo as micelas podem ser direccionadas para locais de inflamação dado que esses locais têm macrófagos activados que possuem o receptor de folato à superfície. Opcionalmente, o agente alvo "targeting" poderá ser o ácido fólico. O agente de "targeting" pode encontrar-se ligado à proteína utilizada para a formação das micelas. Desta forma, uma determinada razão de uma solução desta proteína ligada ao folato é adicionada à fase aquosa da composição aquando da preparação. No presente trabalho, após várias etapas de optimização determinou-se que a utilização da razão de 1/100 de BSA ligada a folato/BSA permitiu a detecção de folato à superfície das micelas.
Descrição detalhada
Seguidamente serão apresentados exemplos que não deverão ser considerados limitativos.
Exemplo 1 - Obtenção de micelas proteicas contendo um fármaco anti-inflamatório (Piroxicam) , a partir do método sonoquimico, para aplicação em queimaduras de pele humana
A proteína usada neste exemplo foi a albumina de sérica bovina (BSA) . A composição utilizada para a preparação destas micelas proteicas consiste numa fase aquosa de BSA com uma concentração de 5 g.L-1 (87% de fase aquosa), numa fase lipofílica presente em baixa percentagem (5% de óleo alimentar) e 8 g/L de agente adjuvante, o álcool polivinílico . O fármaco lipofílico usado foi o piroxicam
(3 mM) , sendo este um anti-inflamatório . A sonda ultrasónica foi posicionada na interface
(aquosa : lipofílica) aplicando uma amplitude de 40% com uma temperatura inicial de 10° C, dentro do reactor de vidro, durante 3 minutos. Após obtenção das micelas acima referidas, estas foram sujeitas a uma exaustiva caracterização fisico-quimica . As micelas foram submetidas à centrifugação e sucessivas lavagens com o objectivo de as separar da solução mãe de proteína e do piroxicam que ficou por encapsular. A capacidade da proteína para formar micelas, foi obtida através da quantificação de proteína que ficou no sobrenadante, verificando-se um rendimento de formação de micelas superior a 90%. A eficácia de encapsulamento do piroxicam nas micelas proteicas foi de 80%. A distribuição de tamanhos foi obtida através da técnica de espectroscopia de correlação fotónica no equipamento designado Zeta Sizer NS, apresentando micelas com diâmetros de 280 nm e com uma polidispersividade de 0.090. A carga superficial destas micelas foi medida em termos de potencial zeta obtido no Zeta Sizer NS, apresentando carga negativa (-4 mV) . Estas micelas foram também analisadas por microscopia electrónica de varrimento com o objectivo de determinar a morfologia, apresentando uma forma esférica. Estas micelas evidenciaram grande estabilidade ao longo de dois meses. Ensaios de citotoxicidade revelaram que estas micelas proteicas apresentaram baixa citotoxicidade quando testadas em linhas celulares humanas ( fibroblastos humanos- BJ5ta) .
A aplicação tópica destas micelas contendo o agente anti- inflamatório, foi efectuada em equivalentes a pele humana com espessura completa. Provocou-se uma queimadura aplicando-se em seguida as referidas micelas, verificando- se que após 6 dias de tratamento houve uma melhor cicatrização quando comparado com o controlo comercial à base de colagénio (Suprasorb C) . Além disso, o custo monetário deste tipo de formulação obtido com micelas proteicas é considerado baixo em comparação com o colagénio que é bastante dispendioso. Exemplo 2 - Obtenção de micelas proteicas contendo iam fármaco anti-inflamatório (celecoxib) , a partir do método por homogeneização de alta pressão, para aplicação intravenosa em doenças anti-inflamatórias .
A proteína usada neste exemplo foi a albumina de sérica bovina (BSA) . A composição utilizada para a preparação destas micelas proteicas consiste numa fase aquosa de BSA com uma concentração de 10 g.L_1(99% de fase aquosa), numa fase lipofílica presente em baixa percentagem (0.5% de óleo alimentar) e 0.5% de agente adjuvante, o polisorbato 80. A esta composição pode ainda ser adicionado um agente de "targeting", ácido fólico (FA) . 0 método de preparação destas micelas consiste na homogeneização, à temperatura ambiente, da solução proteica contendo o agente adjuvante com a fase lipofílica, a qual contem o fármaco lipofílico dissolvido numa concentração de 20 mg. ml-1. Esta composição foi sujeita a 26 ciclos utilizando pressões elevadas nos dois estágios de pressão presentes no homogeneizador (Pressão no estágio 1 de aproximadamente 580 bar e Pressão no estágio 2 de aproximadamente 240 bar) .
Após obtenção das micelas acima referidas, estas foram sujeitas a uma exaustiva caracterização físico-química . A distribuição de tamanhos foi obtida através da técnica de espectroscopia de correlação fotónica no equipamento designado Zeta Sizer NS, apresentando micelas com diâmetros de aproximadamente 70 nm e com uma polidispersividade de aproximadamente 0.2. A carga superficial destas micelas foi medida em termos de potencial zeta obtido no Zeta Sizer NS, apresentando carga negativa (aproximadamente -4 mV) . Estas micelas foram também analisadas por microscopia electrónica de varrimento com o objectivo de determinar a morfologia, apresentando uma forma esférica. Estas micelas evidenciaram grande estabilidade ao longo de cinco meses. Ensaios de citotoxicidade revelaram que estas micelas proteicas apresentaram baixa citotoxicidade quando testadas em linhas celulares humanas ( fibroblastos humanos- BJ5ta) . Micelas preparadas utilizando uma razão de BSA-FA/BSA de 1/100 demonstraram ter capacidade de ser internalizadas com mais eficiência por células com receptores de ácido fólico, quando comparadas com micelas sem ácido fólico à superfície .
Efeito da composição no tamanho
As formulações podem compreender diferentes razões fase aquosa/ fase lipofílica no homogeneizador , comparamos de seguida diversas razões
Comparativo dos tamanhos
Figure imgf000017_0001
Análise do da concentração do poloxamer no tamanho
Foram igualmente testadas diferentes concentrações de proteína, BSA, tendo-se observado que a utilização de maiores concentrações resultava em micelas menores. Sendo a concentração de lOg/L escolhida como sendo a concentração a utilizar na preparação desta composição proteica. Utilizando esta concentração de proteína e a razão para a qual foram obtidas micelas de menores tamanhos, 99,5% v/v solução aquosa de BSA/ 0,5% v/v óleo alimentar procedeu-se à adição do copolímero, Poloxamer 407. Este copolímero é adicinado na fase aquosa, tendo sido testadas diferentes concentrações. A formulação escolhida como sendo a formulação óptima corresponde à composição proteica caracterizada por compreender:
• 99,5% da fase aquosa contendo BSA à concentração de lOg/L
• 0,5% da fase lipidica constituída por óleo alimentar;
• Poloxamer 407 (agente adjuvante) à concentração de 0,l-5g/L encontra-se presente na fase aquosa aquando da preparação da composição proteica.
Tabela 1 : Comparação de tamanhos médios das micelas e polidispersividade das composições sem Poloxamer 407 e com duas concentrações deste copolímero.
Figure imgf000018_0001
Internalização em células - efeito da variação do poloxamer .
As seguintes realizações contem o agente alvo -targeting: estas composições proteicas podem ainda conter opcionalmente um agente targeting de reconhecimento de determinadas células alvo. O agente de targeting utilizado foi o ácido fólico (FA) . Ensaios de internalização foram realizados em células de cancro (CACO-2) bem como em macrófagos activados, células que expressam receptor de folato .
Tabela 2: Percentagens de internalização de diferentes micelas .
Figure imgf000019_0001
Listagem de Peptidos
Tabela 3 - Construção peptidica com seis aminoácidos.
Sequência peptidica (N-C terminal)
SEQ ID NO: 1 - - GAGAGS
SEQ ID NO: 2 - - GAGAGA
SEQ ID NO: 3 - - GAGSGS
SEQ ID NO: 4 - - GSGSGS
SEQ ID NO: 5 - - GAGAGL
SEQ ID NO: 6 - - GAGLGL
SEQ ID NO: 7 - - GLGLGL SEQ ID NO: 8 - GDGDGD
SEQ ID NO: 9 - GAGAGD
SEQ ID NO: 10 - GAGDGD
Tabela 4 - Construção peptídica com diferente número de aminoácidos
Sequência peptidica (N-C terminal)
SEQ ID NO: 11 - - DAAGAAAA
SEQ ID NO: 12 - - DDAAGAAAA
SEQ ID NO: 13 - - DDDAAGAAAA
SEQ ID NO: 14 - - DDDDAAGAAAA
SEQ ID NO: 15 - - DAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA
SEQ ID NO: 16 - - DDDDAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA
Tabela 5- Construção peptidica com vinte e dois aminoácidos
Sequência peptidica
(N-C terminal)
SEQ ID NO: 17 - ILLRKLHVPFFPIGFRGRPAAS
SEQ ID NO: 18 - ILLRKLHVPI I PIGIRGRPAAS
SEQ ID NO: 19 - ILLRKLHVPWWPIGWRGRPAAS
SEQ ID NO: 20 - ILLRKLHVPYYPIGYRGRPAAS
SEQ ID NO: 21 - ILLRKLHVAHGAIGIRGRPAAS
SEQ ID NO: 22 - ILLRKLHVCHGCIGIRGRPAAS Tabela 6 - Construção peptídica com catorze aminoácidos
Sequência peptidica
(N-C terminal)
SEQ ID NO: 23 - - KRCCPDTCGIKCLD
SEQ ID NO: 24 - - KRSSPDTSGIKSLD
SEQ ID NO: 25 - - KRYYPDTYGIKYLD
SEQ ID NO: 26 - - KRHHPDTHGIKHLD
SEQ ID NO: 27 - - KRFFPDTFGIKFLD
SEQ ID NO: 28 - - KRLLPDTLGIKLLD
Tabela 7 - Poli (amino ácidos)
Poli (amino ácidos)
Poli (Lisina)
Poli (Serina)
Poli ( Prolina)
Poli (Alanina)
Referências
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A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum restrito às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral da invenção, tal como definido nas reivindicações.
As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Formulação para a formação de micelas caracterizada por compreender :
• uma fase aquosa contendo uma proteína ou um péptido natural ou sintético;
• uma fase lipofílica que compreende um composto hidrofóbico ;
• um agente adjuvante dissolvido na fase aquosa que regula o tamanho e estabilidade das micelas;
em que os tamanhos das referidas micelas varia entre 30- 5000 nm, de preferência de 30-100 nm.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por
• 50-99, 9 % v/v da fase aquosa a qual contem 0,1-8 g/l de um agente adjuvante dissolvido, de preferência de 2-6 g/L;
• 0,1-50 % v/v uma fase lipofílica.
3. Formulação de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada por a fase aquosa estar compreendida por uma das seguintes soluções:
• albumina sérica bovina (BSA) ;
• albumina sérica humana (HSA) ;
• fibroína da seda;
• um polipéptido N-C terminal seis aminoácidos SEQ ID NO: 1 - GAGAGS; GAGAGA; GAGSGS; GSGSGS; GAGAGL; GAGLGL; GLGLGL; GDGDGD; GAGAGD; GAGDGD;
• ou péptidos com diferentes aminoácidos DAAGAAAA;
DDAAGAAAA; DDDAAGAAAA; DDDDAAGAAAA; DAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA;
DDDDAAGAAAAGAAAAGAAAAGAAAA;
• péptidos com vinte e dois aminoácidos ILLRKLHVPFFPIGFRGRPAAS; ILLRKLHVPI I PIGIRGRPAAS ; ILLRKLHVPWWPIGWRGRPAAS ; ILLRKLHVPYYPIGYRGRPAAS ; ILLRKLHVAHGAIGIRGRPAAS ; ILLRKLHVCHGCIGIRGRPAAS ;
• péptidos com catorze aminoácidos; KRCCPDTCGIKCLD;
KRSSPDTSGIKSLD; KRYYPDTYGIKYLD; KRHHPDTHGIKHLD; KRFFPDTFGIKFLD; KRLLPDTLGIKLLD .
4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por opcionalmente conter um composto ativo hidrofilico.
5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por, a fase lipofilica conter um composto hidrofóbico 0,1-50% v/v da fase lipofilica.
6. Formulação de acordo com a reivindicações anteriores caracterizada por o composto ativo hidrofilico ser diclonofenac, piroxicam.
7. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por conter ainda um agente alvo, de reconhecimento de determinadas células, na fase aquosa ou fase lipofilica .
Formulação de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por opcionalmente o agente targeting ser ácido fólico .
9. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada a fase lipofilica compreender uma das seguintes soluções o n- dodecano; óleo vegetal ou óleo alimentar.
10. Formulação de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por a referida fase lipofilica conter ainda pelo menos um composto ativo hidrofóbico, selecionado do seguinte grupo taxol, celecoxib, piroxicam, CORMs .
11. Formulação de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por a referida fase lipofilica conter ainda pelo menos um composto seleccionado do seguinte grupo fragâncias, perfumes, ou óleos essenciais .
12. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o agente adjuvante ser um surfactante ou um polímero.
13. Formulação de acordo com a reivindicação anteriores, caracterizada por o agente adjuvante ser seleccionado do seguinte grupo polisorbato 80; poloxamer 407; dodecil sulfato de sódio; álcool polivinílico ou ácido plurónico.
14. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por:
• a fase aquosa compreender uma solução de albumina ;
• a fase lipofilica compreender um óleo vegetal; • o agente adjuvante ser poloxamer.
15. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo uso em medicina, ou como cosmético, ou como detergente.
16. Método de preparação da formulação conforme descrita nas reivindicações 1 a 15, caracterizada por utilizar um aparelho de ultra-sons ou um homogeneizador de alta pressão.
17. Composições farmacêuticas caracterizadas por conter as formulações descritas nas reivindicações 1- 14.
18. Composições farmacêuticas caracterizadas por serem ministradas por via tópica, oral, parental, injectável, nomeadamente para aplicação intravenosa, subcutânea e intramuscular.
19. Composições cosméticas caracterizadas por conter as formulações descritas nas reivindicações 1-15.
20. Composições cosméticas de acordo com a reivindicação anterior caracterizadas por terem a forma de creme, loção ou gel.
21. Composições cosméticas de acordo com a reivindicação anterior caracterizadas por serem usadas no tratamento de problemas de pele ou cabelo.
22. Composições de detergentes sólidos ou líquidos caracterizados por conterem a formulação descrita nas reivindicações 1-15.
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