JP2741728B2 - 動物に生理活性物質を経口投与する方法及び組成物 - Google Patents
動物に生理活性物質を経口投与する方法及び組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は抗原（生体活性物質ともいう、これは、生体
組織における反応に影響を与える又は反応をもたらす物
質を意味する）を一種以上の生体内分解性と生体共存性
を有する重合体乃至共重合体賦型剤中にカプセル化して
経口投与することによつて抗原が胃腸管を通過しても効
果を失なうことなく動物のパイアー斑として知られてい
る集合リンパ筋に到達し、吸収されるようにする方法及
び製剤に関するものである。 従来技術 鋭敏な抗原を分解させないように保護するためのマイ
クロカプセル化は周知の事実である。例えば、抗原を一
般に高分子の保護膜物質内にカプセル化するが、この場
合カプセル化される物質は高分子物質の単一膜で被覆さ
れてもよく、また高分子媒質中に均一に分散されてもよ
い。マイクロカプセル内部の抗原の量は希望によつてマ
イクロカプセル材料の95％から極少量まで変化させるこ
とができ、またマイクロカプセルの直径も１μｍから3m
mまで任意に変えることができる。 パイアー斑は回腸すなわち腸下部に位置するリンパ筋
集合体であり、細菌汚染から人体を防衛するための重要
部分である。抗原は抗体の生成を促進する物質であり、
異種蛋白または組織を含むものである。そして抗体は全
て免疫グロブリン（Ig）と呼ばれる種類の蛋白質であ
り、抗原と結合して不活性複合体を生成して抗原を無毒
化させる。 パイアー班はIgAプレＢ細胞を有し、これは胃腸固有
部及び上部の呼吸器管で増殖し、成熟IgA合成プラスマ
細胞に分化する。そしてこのプラスマ細胞が実際に抗体
分子を分泌する。抗原で経口免疫化処理したマウスのIg
A応答の変化を測定したHeremans及びBazinの研究によつ
て、抗原特異性IgAプラスマ細胞の出現が、最初は腸間
膜リンパ筋に、次いで卑臓に、最後に胃腸管の固有部分
に連続的に認められた。 すなわち、パイアー斑はプレIgA細胞の豊富な供給源
であり、抗原刺戟によつてそれらの細胞が循環経路がた
どつて遠くの粘膜表面に出現することは明白である。そ
してこの循環管によつて通常の粘膜免疫システム、すな
わち刺戟されたＢ細胞を粘膜部所に連続的に送つて消化
管に由来する環境抗原や病原菌に対抗させることが可能
となつている。 本発明の本質的重要性は防衛用の抗体を誘起する経口
免疫能力にある。既に知られているように、動物が抗原
を摂取することによつて抗原特異性sIgA抗体が期間支や
鼻洗滌物中に出現する。例えば、人間についての研究で
は、インフルエンザワクチンの経口投与によつて抗イン
フルエンザ抗体を鼻部切片に誘起することができる。 薬理物質の経口投与の方法や製剤においては、薬理物
質が胃腸管を通過する際に分解させないようにする必要
があり、もしもそれができなければ、パイアー斑に到達
する薬理成分の量は不適切のものとなり、効果的のもの
とはならない。抗原が保護されない状態では“ペイヤー
パツチ”に効果的な量のものを到達させるのに大量のも
のが摂取される必要があり、その結果、投与された抗原
のかなりの部分が使用されない結果となる。また、パイ
アー斑に長時間に互つて供給するためには経口投与回数
が増加されなければならならず、このような投与回数と
投与量の増大は無駄であり、不便である。 発明が解決しようとする問題点 従つて粘膜免疫システムを効率よく刺戟し、抗原がパ
イアー斑に向かつて胃腸管を通過する際に分解する問題
を解決する方法が必要であり、抗原を分解させることな
く“ペイヤーパツチ”に到達させるための方法が特に必
要である。 すなわち、本発明の目的は動物に抗原を経口投与して
パイアー斑に到達させて吸収させ、その際に動物の胃腸
管を通過する際に効力を失うことなく粘膜免疫システム
を刺戟する方法を提供することであり、さらにまた、抗
原を芯にしてカプセル用賦型剤で、生体内で分解し、生
体に有害でなく、経口投与に使用し得る製剤を提供する
ことである。 問題点を解決するための手段 本発明により、パイアー斑によって選択的に吸収さ
れ、分解することなく胃腸管を通過できる10μｍ又は10
μｍ以下の大きさのマイクロカプセルを成形すべく、生
分解性で生体適合性、かつ、パイアー斑によって選択的
に吸収されうる賦形剤でカプセル化された有効量の抗原
からなることを特徴とする、ヒトを含む動物に投与さ
れ、該抗原を動物のパイアー斑へ送達するための経口組
成物が提供される。また、本発明により、（ａ）有効量
の抗原を溶解した壁形成用材料を含有する溶媒に分散さ
せて分散系を生成する工程； （ｂ）前記分散系と有効量の連続プロセス媒質と混合し
て、該プロセス媒質および前記抗原、前記溶媒および前
記壁形成用材料からなる微小滴を含有するエマルション
を生成する工程；および （ｃ）前記エマルションを有効量の抽出媒質に迅速に添
加し、前記微小滴から前記溶媒を抽出してマイクロカプ
セル化製品を生成する工程、からなることを特徴とする
パイアー斑によって選択的に吸収され、分解することな
く胃腸管を通過できる10μｍ又は10μｍ以下の大きさの
マイクロカプセルを成形すべく、生分解性で生体適合
性、かつ、パイアー斑によって選択的に吸収されうる賦
形剤でカプセル化された有効量の抗原からなり動物に投
与され、該抗原を動物のパイアー斑に送達するための経
口組成物の製造方法が提供される。 すなわち、本発明は経口投与によつて抗原を動物のパ
イアー斑に送入する方法とそのための製剤に関するもの
で、抗原は生体内分解性と生体無毒性を有する重合体乃
至共重合体内にミクロカプセルとされて、胃腸管を通過
の際にも分解せずもしくは最小限の分解しかせず、それ
によつて抗原を変性させることなく効果的な量でパイア
ー斑に到達させるものである。本発明でいう生体無毒性
とは生体に有害でなく、発がん性がなく、また生体組織
に炎症を生成しない重合性物質として定義されるもので
あり、生体反応により生体によつて容易に分解される生
成物を生じ、しかも生体内に蓄積されないという意味で
生分解性でなければならない。また、このマイクロカプ
セルはパイアー斑において選択的に吸収される寸法のも
のである。従つて本発明によればパイアー斑に到達する
抗原とその吸収の問題は解決される。 実施例 以下、本発明の一具体例として50:50ポリ（DL−ラク
チド−コ−グリコライド）に抗原としてトリニトロフエ
ニル−キイホール−リムペツト−ヘモシアニンをマイク
ロカプセル化してマウスに長時間投与する方法を述べ
る。 こゝで留意すべきことはポリ（DL−ラクチド−コ−グ
リコライド）以外の重合体も使用し得ることであり、そ
れら重合体の例としてはポリ（グリコール酸）、DL−ラ
クチドとグリコライドとの混合物共重合体、コポリオキ
ザレート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−コ−
カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオル
ソエステル、及びポリ（β−ハイドロオキシブチル酸）
等があげられるが、これらは限定の意味ではない。 また、抗原としても別のものを使用でき、それらの例
としては、インフルエンザビールス、パラインフルエン
ザビールス、百日ぜき菌、リン病菌、肺炎菌等のビール
ス、細菌、原生虫等による病気に対して予防接種する際
の抗原や、微生物病原によつて惹き起こされる病気や寄
生虫病原によつて起される病気に対するワクチンのため
の抗原がある。 I.マイクロカプセル化 A.パイアー斑用の色素含有マイクロカプセルの製造（浸
透性の研究） 水不溶性色素であるクマリンを生分解不能の重合体で
あるポリスチレンでマイクロカプセル化してパイアー斑
でのミクロカプセルの浸透性を調べるための着色マイク
ロカプセルとした。製造法は以下の通りであつた。ま
ず、重合体溶液をつくるために、メチレンクロライド2
9.5gにポリスチレン4.95gを溶解した。次いでこの溶液
にクマリン0.05gを添加して電磁撹拌棒で撹拌溶解し
た。別の容器に脱イオン水360gを入れ、これにPVA40gを
溶解して40重量％のポリビニルアルコール（PVA）水溶
液とし、この水溶液にメチレンクロライド6gを加えてメ
チレンクロライドで飽和させてから、これを2.5インチ
のテフロンタービンプロペラと撹拌棒のついた１レジ
ンケトルに入れて380rpmで撹拌した。 次に、このPVA処理媒質を含有したレジンケトルに、
ポリスチレン／クマリン混合物を長軸7mm径の漏斗で注
入した。こうして得られた安定なオイルインウオーター
エマルジヨンを常圧下で約30分間撹拌して適切な寸棒の
油性粒子を得た。次いでレジンケトルを閉じてマノメー
タに連結されたアスピレータによつて徐々に減圧してケ
トル内圧力を520mmHgとした。ケトル内容物は減圧下で
約24時間撹拌にメチレンクロライドを完全に蒸発させ
た。メチレンクロライドが全て蒸発した後、遠心分離に
よつてマイクロカプセルを集め、室温に保つた真空室で
72時間乾燥した。 B.抗原含有マイクロカプセルの製造 水溶性抗原であるTNP−KLHを生体無毒性の生分解性ポ
リエステルであるポリ（DL−ラクチド−コ−グリコライ
ド）でカプセル化した。マイクロカプセルの製造法は以
下の通りであつた。 まず、メチレンクロライド4.0gに50:50ポリ（DL−ラ
クチド−コ−グリコライド）0.5gを溶解して重合体溶液
を製造した。次いでTNP−KLH（46mgTNP−KLH/ml:透析
後）水溶液300μをポリ（DL−ラクチド−コ−グリコ
ライド）溶液に加えて渦巻状にVortex−Genieで処理し
て均一に分散させた。 別の容器に脱イオン水55.2gをとり、これに4.8gのPVA
を溶解して８重量％のPVA水溶液とし、PVAの溶解後、こ
れを撹拌棒と1.5インチテフロンタービンプロペラの付
いた100mlレジンケトルに入れ長軸7mm径の漏斗でこのPV
A処理媒質に先の重合体溶液を添加した。添加中はPVA溶
液は約650rpmで撹拌された。得られたオイルインウオー
ターエマルジヨンをレジンケトル中で約10分間撹拌した
後、レジンケトル内容物を４ビーカー中の脱イオン水
3.5中に移しステンレス製プロペラ（２インチ）で約8
00Ipmで撹拌した。こうして得られたマイクロカプセル
を脱イオン水中で約30分間撹拌し、遠心分離で集め、脱
イオン水で洗滌して残留PVAを除去し、凍結乾燥した。
得られたマイクロカプセルは直径約１〜10μｍの球状で
あつた。 この抗原を含有したマイクロカプセルのTNP−KLH、す
なわちこのマイクロカプセルの芯内容物を測定するため
に、12ml遠心チユーブにマイクロカプセル10mgを入れ
て、これにメチレンクロライド3.0mlを加えてからポリ
（DL−ラクチド−コ−グリコライド）を溶解するために
渦流化し、次いでチユーブに脱イオン水3.0mlを入れて
さらに強く１分間渦流化処理した。遠心チユーブの内容
物を遠心分離で有機層と水層に分け、水層を10ml定量フ
ラスコに移し、水層を含む抽出物もこの定量フラスコに
移した。次いで脱イオン水をフラスコの目印まで満たし
た。フラスコの中のTNP−KLHの量、従つてマイクロカプ
セル中のTNP−KLHの量を蛋白法によつて定量したとこ
ろ、このマイクロカプセルはTNP−KLHを0.2重量％含有
していることが知られた。 II.生物学的研究 A.マウス 研究には生後８〜12週のBALB/Cマウスを使用した。 B.トリニトロフエニルキイホールリムペツトヘモシアニ
ン（TNP−KLH） The Keyhole Limpet Megathura crenulataから得たヘ
モシアニン（KLH）をCalbiochemから購入し、Rittenbur
g及びAmkrautの方法によつて2,4,6−トリニトロベンゼ
ンスルフオン酸を用いてトリニトロフエニルハプテンと
結合させた。（TNP−KLH）置換率は分光学的に測定さ
れ、波長350mmで分子吸光係数15400を用い、この波長で
のKLHの寄与に対して30％の補正を加えTNP−KLHである
ことが決定された。 C.免疫化処理 フイルタ滅菌水道水８部と重炭酸ナトリウム（7.5％
溶液）２部からなる溶液に10μg/mlの濃度の抗原となる
ように、TNP−KLHのマイクロカプセル化したものとしな
いものとを懸濁させた。 D.生体液の補集 1. 血清 血液を目盛り入り毛細管ピペツトで集め、凝固してか
ら血清を集め、遠心分離して赤血球や血小板を除去し、
加熱して不活性化し、−70℃で使用時まで貯蔵した。 2. 腸分泌物 マウスにラベジ溶液（25mM NaCl.40mM Na2SO4,10mM K
Cl,20mM NaHCO3,48.5mMポリエチレングリコール、滲透
性530mosM）0.5mlを４回投与した。最終投与後15分でマ
ウスを麻酔し、さらにそれから15分後に腹腔内注射でパ
イロカルピン0.1mgを投与した。その後、10〜20分にわ
たつて腸内容物を排出するように刺戟した。これを50mM
EDTA中に大豆トリプシンイヒビター0.1mg/mlの割合の
溶液3mlを含むペトリ皿に集めて強く渦流化し遠心分離
で懸濁物を除去した。上澄を円形底のポリカーボネート
製遠心チユーブに移し、PMSF、フエニルメチルスルホニ
ルフルオライド30μを加えて高速遠心分離（27000×
ｇ、20分、４℃）で清澄化してから、PMSF20μと１％
ナトリウムアザイドを加えてFCS中10％の溶液として残
留プロチアーゼに対しての代用基質とした。 3.唾 液 腸内容物の排出と同時に大量の唾液が分泌された。こ
の0.25mlを毛管作用でパスツールピペツトに集め、清澄
化処理に先だつて大豆トリプシンインヒビター、PMSF、
ナトリウムアザイド及びFCSを20μづつ添加した。 E.免疫化試薬 固相吸着された親和性処理されたネズミのIgM、IgG及
びIgAに特異性のポリクローナルのヤギのIgG抗体（市販
品、Southern Biotechnology Associates製）を得、モ
ノクローナル抗体やメロマ蛋白質との結合能力について
の特異性を放射免疫測定法で測定した。 F.固相放射免疫測定法 クロラミンナ法でキヤリアフリーのNa125Iで精製抗体
を標識化した。イムロンリムバウエル測定片（Dynatech
製）を、TNPと結合させたBSA（牛血清アルブミン）でも
つてBBS中１μg/mlで一晩、４℃で被覆した。標準比較
片は被覆しないまゝとして、全試験片をBBS中１％BSAで
室温下で２時間処理した。生体液の試料は問題のイソ型
の抗原特異性抗体が１〜1000mg/mlとなるように希釈さ
れて、洗滌レプリケートウエルに添加され、室温で６時
間接種処理された。洗滌後、125Iで標識化したイソ型特
異性の抗免疫グロブリン100,000cpmを各ウエルに添加し
て一晩４℃で接種処理した。結合しなかつた125I−抗体
を洗滌して除去した後、ウエルをガンマ5500分光計（Be
kman製）で放射測定した。測定はイソ型特異性抗体１μ
g/ウエルで被覆したウエルに、既知量のIgを含有する標
準血清（Miles Scientific社製）を２倍に希釈して使用
した。未知試料の測定曲線や内挿数値はBiomedical Com
puting Technology Center製の「Logit−log」または
「Four Parameter Logistic」というベーシツクプログ
ラムを用いてコンピユーターで求められた。 G. 結 果 1. 色素含有マイクロカプセルの“ペイヤーパツチ”へ
の浸透性 螢光色素クマリンを含有するポリスチレンマイクロカ
プセルをマウスに経口投与することによつて、マイクロ
カプセルの消化管関連リンパ組織への吸収とその寸法限
度について調べた。投与針によつて胃の中に各種寸法の
螢光マイクロカプセル（５μｍ未満と５〜５μｍの直径
のもの）を水道水に100mg/mlで懸濁させたものを0.5ml
を投与した。投与後、0.5、１、及び２時間の時間後
に、マウスを切開して小腸を切除した。消化管を含むパ
イアー斑を1cm切片として分離して腔内物を洗い出し反
転して凍結した。 凍結切片は螢光顕微鏡下で消化管内腔からパイアー斑
に吸収されたマイクロカプセルの数、位置、寸法につい
て調べられた。 絨毛の補促されたマイクロカプセルが洗滌時の除去の
妨げとはなるが組織内への浸透はパイアー斑以外の場所
では認められなかつた。経口投与後0.5時間で、マイク
ロカプセルは小腸の中央部ではなく末端部のパイアー斑
に認められ、時間の経過と共にマイクロカプセルはぜん
動によつて移動して２時間後では胃腸管全体にみられ回
腸のパイアー斑にも認められた、投与されたマイクロカ
プセルは主としてパイアー斑の頂部から離れた周縁部に
位置し、頂部と周縁の絨毛との間にぜん動中に物理的に
補促されて吸収に役立つているという印象を与えてい
る。直径10μｍまでの粒子もパイアー斑中に認められた
が、直径５μｍ未満のマイクロカプセルが大量に吸収さ
れて時間経過と共にパイアー斑の深部に進入することが
知られた。これらの結果は直径１〜５μｍのマイクロカ
プセルが迅速に選択的に消化管内腔からパイアー斑に吸
収されることを示している。そしてこのことは生分解性
被覆材料からなるマイクロカプセルが、消化管関連のリ
ンパ系組織に抗原を送入し、粘膜表面に免疫を誘起させ
るための有力な手段として作用することを示唆してい
る。 2. 抗原含有生分解性マイクロカプセルによる経口免疫
化 ハプテン処理した蛋白抗原、トリニトロフエニルキイ
ホールリムペツトヘモシアニン（TNP−KLH）を含有する
マイクロカプセルを被覆材料としてポリ（DL−ラクチド
−コ−グリコライド）共重合体を用いてつくり、このマ
イクロカプセルを寸法で分離して直径１〜５μｍのもの
を選択した。このマイクロカプセルには0.2％の抗原が
含まれていた。４日間に互つて炭酸塩緩衝滅菌水道水中
10mg/ml懸濁液の0.5ml（10μｇ抗原）を胃に投与するこ
とによつて、抗原の有効な送入システムとして役立つ能
力を調査した。比較するために、別のマウス群がカプセ
ル化されていないTNP−KLHの20μg/ml溶液0.5mlで経口
投与された。比較用の標準マウスは希釈剤だけを経口投
与された。 最終投与日から14日後、及び28日後に、各グループで
５匹の絶食マウスから血清、唾液及び消化管分泌物を得
た。これらの試料はTNPは特異性とIgM、IgG、及びIgAイ
ソ型の全抗体量を測定するためにイソ型特異性放射免疫
測定法によつて調べられた。（第１表）唾液と消化管分
泌物には殆どIgAだけが含まれていた。この結果はこれ
までの研究と一致したもので、これらの分泌物を集める
方法が血清の汚染をもたらさなかった証拠である。免疫
プロトコールは何れも体液中の免疫グロブリンの全量の
著しい変化を示すものでなかつた。免疫化標準マウスで
は天然に存在する抗TNP抗体がIgM及びIgGイソ型血清に
みられ、また血清と消化管分泌物にIgAイソ型がみられ
た。然しながら、３日間のマイクロカプセル化TNP−KLH
30μｇの等量投与によつて分泌物は標準を著しく上まわ
る抗原特異性IgA抗体を有し、投与後14日では全イソ型
の血清中での出現をもたらした。（第１表参照）これら
の抗体量は28日後ではさらに増大した。これに対して、
カプセル化されなかつた抗原は同量経口添加でも特異性
抗体誘起の効果が認められなかつた。 発明の効果 本発明による効果はいくつかの点で注目に値する。第
１の従来の組織免疫法では殆ど誘起されなかつた抗原特
異性抗体を血清や粘膜分泌物中に著しく誘起することが
できるため、この方法は各種のバクテリアやビールス病
原に対しての病理学の入口としての粘膜で著しく強化さ
れた免疫力を与えることが期待される。第２にマイクロ
カプセル化された抗原製剤は経口投与することによつて
有効な免疫原となり得るが、カプセル化しない時は同量
のものはそうならない。そのために、このマイクロカプ
セル化はパイアー斑に到達させ、吸収させることによつ
て画期的な効率の向上をもたらすものとなる。そして第
３に、免疫応答が長時間継続する。アジユバントなしで
は蛋白抗原による組織免疫は７〜14日で抗体量がピーク
になるが、経口投与された抗原含有マイクロカプセルで
は14日よりも28日目に高い免疫応答を示す。このことは
被覆材料の生体内分解と抗原の放出が長時間に亘り、そ
の結果、免疫応答が長時間に亘ることを示すものであ
る。
組織における反応に影響を与える又は反応をもたらす物
質を意味する）を一種以上の生体内分解性と生体共存性
を有する重合体乃至共重合体賦型剤中にカプセル化して
経口投与することによつて抗原が胃腸管を通過しても効
果を失なうことなく動物のパイアー斑として知られてい
る集合リンパ筋に到達し、吸収されるようにする方法及
び製剤に関するものである。 従来技術 鋭敏な抗原を分解させないように保護するためのマイ
クロカプセル化は周知の事実である。例えば、抗原を一
般に高分子の保護膜物質内にカプセル化するが、この場
合カプセル化される物質は高分子物質の単一膜で被覆さ
れてもよく、また高分子媒質中に均一に分散されてもよ
い。マイクロカプセル内部の抗原の量は希望によつてマ
イクロカプセル材料の95％から極少量まで変化させるこ
とができ、またマイクロカプセルの直径も１μｍから3m
mまで任意に変えることができる。 パイアー斑は回腸すなわち腸下部に位置するリンパ筋
集合体であり、細菌汚染から人体を防衛するための重要
部分である。抗原は抗体の生成を促進する物質であり、
異種蛋白または組織を含むものである。そして抗体は全
て免疫グロブリン（Ig）と呼ばれる種類の蛋白質であ
り、抗原と結合して不活性複合体を生成して抗原を無毒
化させる。 パイアー班はIgAプレＢ細胞を有し、これは胃腸固有
部及び上部の呼吸器管で増殖し、成熟IgA合成プラスマ
細胞に分化する。そしてこのプラスマ細胞が実際に抗体
分子を分泌する。抗原で経口免疫化処理したマウスのIg
A応答の変化を測定したHeremans及びBazinの研究によつ
て、抗原特異性IgAプラスマ細胞の出現が、最初は腸間
膜リンパ筋に、次いで卑臓に、最後に胃腸管の固有部分
に連続的に認められた。 すなわち、パイアー斑はプレIgA細胞の豊富な供給源
であり、抗原刺戟によつてそれらの細胞が循環経路がた
どつて遠くの粘膜表面に出現することは明白である。そ
してこの循環管によつて通常の粘膜免疫システム、すな
わち刺戟されたＢ細胞を粘膜部所に連続的に送つて消化
管に由来する環境抗原や病原菌に対抗させることが可能
となつている。 本発明の本質的重要性は防衛用の抗体を誘起する経口
免疫能力にある。既に知られているように、動物が抗原
を摂取することによつて抗原特異性sIgA抗体が期間支や
鼻洗滌物中に出現する。例えば、人間についての研究で
は、インフルエンザワクチンの経口投与によつて抗イン
フルエンザ抗体を鼻部切片に誘起することができる。 薬理物質の経口投与の方法や製剤においては、薬理物
質が胃腸管を通過する際に分解させないようにする必要
があり、もしもそれができなければ、パイアー斑に到達
する薬理成分の量は不適切のものとなり、効果的のもの
とはならない。抗原が保護されない状態では“ペイヤー
パツチ”に効果的な量のものを到達させるのに大量のも
のが摂取される必要があり、その結果、投与された抗原
のかなりの部分が使用されない結果となる。また、パイ
アー斑に長時間に互つて供給するためには経口投与回数
が増加されなければならならず、このような投与回数と
投与量の増大は無駄であり、不便である。 発明が解決しようとする問題点 従つて粘膜免疫システムを効率よく刺戟し、抗原がパ
イアー斑に向かつて胃腸管を通過する際に分解する問題
を解決する方法が必要であり、抗原を分解させることな
く“ペイヤーパツチ”に到達させるための方法が特に必
要である。 すなわち、本発明の目的は動物に抗原を経口投与して
パイアー斑に到達させて吸収させ、その際に動物の胃腸
管を通過する際に効力を失うことなく粘膜免疫システム
を刺戟する方法を提供することであり、さらにまた、抗
原を芯にしてカプセル用賦型剤で、生体内で分解し、生
体に有害でなく、経口投与に使用し得る製剤を提供する
ことである。 問題点を解決するための手段 本発明により、パイアー斑によって選択的に吸収さ
れ、分解することなく胃腸管を通過できる10μｍ又は10
μｍ以下の大きさのマイクロカプセルを成形すべく、生
分解性で生体適合性、かつ、パイアー斑によって選択的
に吸収されうる賦形剤でカプセル化された有効量の抗原
からなることを特徴とする、ヒトを含む動物に投与さ
れ、該抗原を動物のパイアー斑へ送達するための経口組
成物が提供される。また、本発明により、（ａ）有効量
の抗原を溶解した壁形成用材料を含有する溶媒に分散さ
せて分散系を生成する工程； （ｂ）前記分散系と有効量の連続プロセス媒質と混合し
て、該プロセス媒質および前記抗原、前記溶媒および前
記壁形成用材料からなる微小滴を含有するエマルション
を生成する工程；および （ｃ）前記エマルションを有効量の抽出媒質に迅速に添
加し、前記微小滴から前記溶媒を抽出してマイクロカプ
セル化製品を生成する工程、からなることを特徴とする
パイアー斑によって選択的に吸収され、分解することな
く胃腸管を通過できる10μｍ又は10μｍ以下の大きさの
マイクロカプセルを成形すべく、生分解性で生体適合
性、かつ、パイアー斑によって選択的に吸収されうる賦
形剤でカプセル化された有効量の抗原からなり動物に投
与され、該抗原を動物のパイアー斑に送達するための経
口組成物の製造方法が提供される。 すなわち、本発明は経口投与によつて抗原を動物のパ
イアー斑に送入する方法とそのための製剤に関するもの
で、抗原は生体内分解性と生体無毒性を有する重合体乃
至共重合体内にミクロカプセルとされて、胃腸管を通過
の際にも分解せずもしくは最小限の分解しかせず、それ
によつて抗原を変性させることなく効果的な量でパイア
ー斑に到達させるものである。本発明でいう生体無毒性
とは生体に有害でなく、発がん性がなく、また生体組織
に炎症を生成しない重合性物質として定義されるもので
あり、生体反応により生体によつて容易に分解される生
成物を生じ、しかも生体内に蓄積されないという意味で
生分解性でなければならない。また、このマイクロカプ
セルはパイアー斑において選択的に吸収される寸法のも
のである。従つて本発明によればパイアー斑に到達する
抗原とその吸収の問題は解決される。 実施例 以下、本発明の一具体例として50:50ポリ（DL−ラク
チド−コ−グリコライド）に抗原としてトリニトロフエ
ニル−キイホール−リムペツト−ヘモシアニンをマイク
ロカプセル化してマウスに長時間投与する方法を述べ
る。 こゝで留意すべきことはポリ（DL−ラクチド−コ−グ
リコライド）以外の重合体も使用し得ることであり、そ
れら重合体の例としてはポリ（グリコール酸）、DL−ラ
クチドとグリコライドとの混合物共重合体、コポリオキ
ザレート、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド−コ−
カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポリオル
ソエステル、及びポリ（β−ハイドロオキシブチル酸）
等があげられるが、これらは限定の意味ではない。 また、抗原としても別のものを使用でき、それらの例
としては、インフルエンザビールス、パラインフルエン
ザビールス、百日ぜき菌、リン病菌、肺炎菌等のビール
ス、細菌、原生虫等による病気に対して予防接種する際
の抗原や、微生物病原によつて惹き起こされる病気や寄
生虫病原によつて起される病気に対するワクチンのため
の抗原がある。 I.マイクロカプセル化 A.パイアー斑用の色素含有マイクロカプセルの製造（浸
透性の研究） 水不溶性色素であるクマリンを生分解不能の重合体で
あるポリスチレンでマイクロカプセル化してパイアー斑
でのミクロカプセルの浸透性を調べるための着色マイク
ロカプセルとした。製造法は以下の通りであつた。ま
ず、重合体溶液をつくるために、メチレンクロライド2
9.5gにポリスチレン4.95gを溶解した。次いでこの溶液
にクマリン0.05gを添加して電磁撹拌棒で撹拌溶解し
た。別の容器に脱イオン水360gを入れ、これにPVA40gを
溶解して40重量％のポリビニルアルコール（PVA）水溶
液とし、この水溶液にメチレンクロライド6gを加えてメ
チレンクロライドで飽和させてから、これを2.5インチ
のテフロンタービンプロペラと撹拌棒のついた１レジ
ンケトルに入れて380rpmで撹拌した。 次に、このPVA処理媒質を含有したレジンケトルに、
ポリスチレン／クマリン混合物を長軸7mm径の漏斗で注
入した。こうして得られた安定なオイルインウオーター
エマルジヨンを常圧下で約30分間撹拌して適切な寸棒の
油性粒子を得た。次いでレジンケトルを閉じてマノメー
タに連結されたアスピレータによつて徐々に減圧してケ
トル内圧力を520mmHgとした。ケトル内容物は減圧下で
約24時間撹拌にメチレンクロライドを完全に蒸発させ
た。メチレンクロライドが全て蒸発した後、遠心分離に
よつてマイクロカプセルを集め、室温に保つた真空室で
72時間乾燥した。 B.抗原含有マイクロカプセルの製造 水溶性抗原であるTNP−KLHを生体無毒性の生分解性ポ
リエステルであるポリ（DL−ラクチド−コ−グリコライ
ド）でカプセル化した。マイクロカプセルの製造法は以
下の通りであつた。 まず、メチレンクロライド4.0gに50:50ポリ（DL−ラ
クチド−コ−グリコライド）0.5gを溶解して重合体溶液
を製造した。次いでTNP−KLH（46mgTNP−KLH/ml:透析
後）水溶液300μをポリ（DL−ラクチド−コ−グリコ
ライド）溶液に加えて渦巻状にVortex−Genieで処理し
て均一に分散させた。 別の容器に脱イオン水55.2gをとり、これに4.8gのPVA
を溶解して８重量％のPVA水溶液とし、PVAの溶解後、こ
れを撹拌棒と1.5インチテフロンタービンプロペラの付
いた100mlレジンケトルに入れ長軸7mm径の漏斗でこのPV
A処理媒質に先の重合体溶液を添加した。添加中はPVA溶
液は約650rpmで撹拌された。得られたオイルインウオー
ターエマルジヨンをレジンケトル中で約10分間撹拌した
後、レジンケトル内容物を４ビーカー中の脱イオン水
3.5中に移しステンレス製プロペラ（２インチ）で約8
00Ipmで撹拌した。こうして得られたマイクロカプセル
を脱イオン水中で約30分間撹拌し、遠心分離で集め、脱
イオン水で洗滌して残留PVAを除去し、凍結乾燥した。
得られたマイクロカプセルは直径約１〜10μｍの球状で
あつた。 この抗原を含有したマイクロカプセルのTNP−KLH、す
なわちこのマイクロカプセルの芯内容物を測定するため
に、12ml遠心チユーブにマイクロカプセル10mgを入れ
て、これにメチレンクロライド3.0mlを加えてからポリ
（DL−ラクチド−コ−グリコライド）を溶解するために
渦流化し、次いでチユーブに脱イオン水3.0mlを入れて
さらに強く１分間渦流化処理した。遠心チユーブの内容
物を遠心分離で有機層と水層に分け、水層を10ml定量フ
ラスコに移し、水層を含む抽出物もこの定量フラスコに
移した。次いで脱イオン水をフラスコの目印まで満たし
た。フラスコの中のTNP−KLHの量、従つてマイクロカプ
セル中のTNP−KLHの量を蛋白法によつて定量したとこ
ろ、このマイクロカプセルはTNP−KLHを0.2重量％含有
していることが知られた。 II.生物学的研究 A.マウス 研究には生後８〜12週のBALB/Cマウスを使用した。 B.トリニトロフエニルキイホールリムペツトヘモシアニ
ン（TNP−KLH） The Keyhole Limpet Megathura crenulataから得たヘ
モシアニン（KLH）をCalbiochemから購入し、Rittenbur
g及びAmkrautの方法によつて2,4,6−トリニトロベンゼ
ンスルフオン酸を用いてトリニトロフエニルハプテンと
結合させた。（TNP−KLH）置換率は分光学的に測定さ
れ、波長350mmで分子吸光係数15400を用い、この波長で
のKLHの寄与に対して30％の補正を加えTNP−KLHである
ことが決定された。 C.免疫化処理 フイルタ滅菌水道水８部と重炭酸ナトリウム（7.5％
溶液）２部からなる溶液に10μg/mlの濃度の抗原となる
ように、TNP−KLHのマイクロカプセル化したものとしな
いものとを懸濁させた。 D.生体液の補集 1. 血清 血液を目盛り入り毛細管ピペツトで集め、凝固してか
ら血清を集め、遠心分離して赤血球や血小板を除去し、
加熱して不活性化し、−70℃で使用時まで貯蔵した。 2. 腸分泌物 マウスにラベジ溶液（25mM NaCl.40mM Na2SO4,10mM K
Cl,20mM NaHCO3,48.5mMポリエチレングリコール、滲透
性530mosM）0.5mlを４回投与した。最終投与後15分でマ
ウスを麻酔し、さらにそれから15分後に腹腔内注射でパ
イロカルピン0.1mgを投与した。その後、10〜20分にわ
たつて腸内容物を排出するように刺戟した。これを50mM
EDTA中に大豆トリプシンイヒビター0.1mg/mlの割合の
溶液3mlを含むペトリ皿に集めて強く渦流化し遠心分離
で懸濁物を除去した。上澄を円形底のポリカーボネート
製遠心チユーブに移し、PMSF、フエニルメチルスルホニ
ルフルオライド30μを加えて高速遠心分離（27000×
ｇ、20分、４℃）で清澄化してから、PMSF20μと１％
ナトリウムアザイドを加えてFCS中10％の溶液として残
留プロチアーゼに対しての代用基質とした。 3.唾 液 腸内容物の排出と同時に大量の唾液が分泌された。こ
の0.25mlを毛管作用でパスツールピペツトに集め、清澄
化処理に先だつて大豆トリプシンインヒビター、PMSF、
ナトリウムアザイド及びFCSを20μづつ添加した。 E.免疫化試薬 固相吸着された親和性処理されたネズミのIgM、IgG及
びIgAに特異性のポリクローナルのヤギのIgG抗体（市販
品、Southern Biotechnology Associates製）を得、モ
ノクローナル抗体やメロマ蛋白質との結合能力について
の特異性を放射免疫測定法で測定した。 F.固相放射免疫測定法 クロラミンナ法でキヤリアフリーのNa125Iで精製抗体
を標識化した。イムロンリムバウエル測定片（Dynatech
製）を、TNPと結合させたBSA（牛血清アルブミン）でも
つてBBS中１μg/mlで一晩、４℃で被覆した。標準比較
片は被覆しないまゝとして、全試験片をBBS中１％BSAで
室温下で２時間処理した。生体液の試料は問題のイソ型
の抗原特異性抗体が１〜1000mg/mlとなるように希釈さ
れて、洗滌レプリケートウエルに添加され、室温で６時
間接種処理された。洗滌後、125Iで標識化したイソ型特
異性の抗免疫グロブリン100,000cpmを各ウエルに添加し
て一晩４℃で接種処理した。結合しなかつた125I−抗体
を洗滌して除去した後、ウエルをガンマ5500分光計（Be
kman製）で放射測定した。測定はイソ型特異性抗体１μ
g/ウエルで被覆したウエルに、既知量のIgを含有する標
準血清（Miles Scientific社製）を２倍に希釈して使用
した。未知試料の測定曲線や内挿数値はBiomedical Com
puting Technology Center製の「Logit−log」または
「Four Parameter Logistic」というベーシツクプログ
ラムを用いてコンピユーターで求められた。 G. 結 果 1. 色素含有マイクロカプセルの“ペイヤーパツチ”へ
の浸透性 螢光色素クマリンを含有するポリスチレンマイクロカ
プセルをマウスに経口投与することによつて、マイクロ
カプセルの消化管関連リンパ組織への吸収とその寸法限
度について調べた。投与針によつて胃の中に各種寸法の
螢光マイクロカプセル（５μｍ未満と５〜５μｍの直径
のもの）を水道水に100mg/mlで懸濁させたものを0.5ml
を投与した。投与後、0.5、１、及び２時間の時間後
に、マウスを切開して小腸を切除した。消化管を含むパ
イアー斑を1cm切片として分離して腔内物を洗い出し反
転して凍結した。 凍結切片は螢光顕微鏡下で消化管内腔からパイアー斑
に吸収されたマイクロカプセルの数、位置、寸法につい
て調べられた。 絨毛の補促されたマイクロカプセルが洗滌時の除去の
妨げとはなるが組織内への浸透はパイアー斑以外の場所
では認められなかつた。経口投与後0.5時間で、マイク
ロカプセルは小腸の中央部ではなく末端部のパイアー斑
に認められ、時間の経過と共にマイクロカプセルはぜん
動によつて移動して２時間後では胃腸管全体にみられ回
腸のパイアー斑にも認められた、投与されたマイクロカ
プセルは主としてパイアー斑の頂部から離れた周縁部に
位置し、頂部と周縁の絨毛との間にぜん動中に物理的に
補促されて吸収に役立つているという印象を与えてい
る。直径10μｍまでの粒子もパイアー斑中に認められた
が、直径５μｍ未満のマイクロカプセルが大量に吸収さ
れて時間経過と共にパイアー斑の深部に進入することが
知られた。これらの結果は直径１〜５μｍのマイクロカ
プセルが迅速に選択的に消化管内腔からパイアー斑に吸
収されることを示している。そしてこのことは生分解性
被覆材料からなるマイクロカプセルが、消化管関連のリ
ンパ系組織に抗原を送入し、粘膜表面に免疫を誘起させ
るための有力な手段として作用することを示唆してい
る。 2. 抗原含有生分解性マイクロカプセルによる経口免疫
化 ハプテン処理した蛋白抗原、トリニトロフエニルキイ
ホールリムペツトヘモシアニン（TNP−KLH）を含有する
マイクロカプセルを被覆材料としてポリ（DL−ラクチド
−コ−グリコライド）共重合体を用いてつくり、このマ
イクロカプセルを寸法で分離して直径１〜５μｍのもの
を選択した。このマイクロカプセルには0.2％の抗原が
含まれていた。４日間に互つて炭酸塩緩衝滅菌水道水中
10mg/ml懸濁液の0.5ml（10μｇ抗原）を胃に投与するこ
とによつて、抗原の有効な送入システムとして役立つ能
力を調査した。比較するために、別のマウス群がカプセ
ル化されていないTNP−KLHの20μg/ml溶液0.5mlで経口
投与された。比較用の標準マウスは希釈剤だけを経口投
与された。 最終投与日から14日後、及び28日後に、各グループで
５匹の絶食マウスから血清、唾液及び消化管分泌物を得
た。これらの試料はTNPは特異性とIgM、IgG、及びIgAイ
ソ型の全抗体量を測定するためにイソ型特異性放射免疫
測定法によつて調べられた。（第１表）唾液と消化管分
泌物には殆どIgAだけが含まれていた。この結果はこれ
までの研究と一致したもので、これらの分泌物を集める
方法が血清の汚染をもたらさなかった証拠である。免疫
プロトコールは何れも体液中の免疫グロブリンの全量の
著しい変化を示すものでなかつた。免疫化標準マウスで
は天然に存在する抗TNP抗体がIgM及びIgGイソ型血清に
みられ、また血清と消化管分泌物にIgAイソ型がみられ
た。然しながら、３日間のマイクロカプセル化TNP−KLH
30μｇの等量投与によつて分泌物は標準を著しく上まわ
る抗原特異性IgA抗体を有し、投与後14日では全イソ型
の血清中での出現をもたらした。（第１表参照）これら
の抗体量は28日後ではさらに増大した。これに対して、
カプセル化されなかつた抗原は同量経口添加でも特異性
抗体誘起の効果が認められなかつた。 発明の効果 本発明による効果はいくつかの点で注目に値する。第
１の従来の組織免疫法では殆ど誘起されなかつた抗原特
異性抗体を血清や粘膜分泌物中に著しく誘起することが
できるため、この方法は各種のバクテリアやビールス病
原に対しての病理学の入口としての粘膜で著しく強化さ
れた免疫力を与えることが期待される。第２にマイクロ
カプセル化された抗原製剤は経口投与することによつて
有効な免疫原となり得るが、カプセル化しない時は同量
のものはそうならない。そのために、このマイクロカプ
セル化はパイアー斑に到達させ、吸収させることによつ
て画期的な効率の向上をもたらすものとなる。そして第
３に、免疫応答が長時間継続する。アジユバントなしで
は蛋白抗原による組織免疫は７〜14日で抗体量がピーク
になるが、経口投与された抗原含有マイクロカプセルで
は14日よりも28日目に高い免疫応答を示す。このことは
被覆材料の生体内分解と抗原の放出が長時間に亘り、そ
の結果、免疫応答が長時間に亘ることを示すものであ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 トーマス・アール・テイス
アメリカ合衆国アラバマ州35216．バー
ミンガム．オーバーランド・ドライブ
1305
(72)発明者 リチヤード・エム・ジリイ
アメリカ合衆国アラバマ州35243．バー
ミンガム．ロイヤル・オーク・サークル
4020
(72)発明者 ジエイ・ケー・スタース
アメリカ合衆国アラバマ州35126．ピン
ソン．ダーレン・ドライブ5679
(72)発明者 ジヨン・エツチ・エルドリツジ
アメリカ合衆国アラバマ州35216．バー
ミンガム．デイアーウツド・ロード2335
(56)参考文献 特表 昭60−501595（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．パイアー斑によって選択的に吸収され、分解するこ
となく胃腸管を通過できる10μｍ又は10μｍ以下の大き
さのマイクロカプセルを成形すべく、生分解性で生体適
合性、かつ、パイアー斑によって選択的に吸収されうる
賦形剤でカプセル化された有効量の抗原からなることを
特徴とする、ヒトを含む動物に投与され、該抗原を動物
のパイアー班へ送達するための経口組成物。 ２．前記マイクロカプセルが１μｍ〜10μｍの大きさを
有する特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３．マイクロカプセルの直径が５μｍ以下である特許請
求の範囲第２項記載の組成物。 ４．マイクロカプセルの直径が３μｍ以下である特許請
求の範囲第３項記載の組成物。 ５．前記賦型剤が重合体である特許請求の範囲第１項記
載の組成物。 ６．賦型剤が共重合体である特許請求の範囲第５項記載
の組成物。 ７．前記賦型剤が異なる共重合体比をもった第１および
第２の共重合体賦型剤からなる特許請求の範囲第１項又
は第２項記載の組成物。 ８．賦型剤がポリ（グリコール酸）、DL−ラクチドとグ
リコライドの混合共重合体、コポリオキザレート、ポリ
カプロラクトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクト
ン）ポリ（エステルアミド）、ポリオルトエステル及び
ポリ（β−ハイドロオキシ酪酸）よりなる群から選ばれ
る特許請求の範囲第１項または第２項記載の組成物。 ９．共重合体賦型剤がポリ（DL−ラクチド−コ−グリコ
ライド）である特許請求の範囲第８項記載の組成物。 １０．共重合体賦型剤のラクチド対グリコライドのモル
比が50:50乃至90:10である特許請求の範囲第９項記載の
組成物。 １１．抗原の少なくとも一種が原生動物、ビールス、菌
類、バクテリア抗原である特許請求の範囲第１項又は第
２項記載の組成物。 １２．抗原がトリニトロフエニルキイホームリムペット
ヘモシアニンである特許請求の範囲第11項記載の組成
物。 １３．マイクロカプセルの直径が１〜５μｍで、抗原が
トリニトロフエニルキイホールリムペットヘモシアニン
であり、賦型剤が50:50ポリ（DL−ラクチド−コ−グリ
コライド）である特許請求の範囲第12項記載の組成物。 １４．抗原がトクソイドである特許請求の範囲第１項又
は第２項記載の組成物。 １５．トクソイドがスタフイロコカルエントロトキシン
である特許請求の範囲第14項記載の組成物。 １６．（ａ）有効量の抗原を溶解した壁形成用材料を含
有する溶媒に分散させて分散系を生成する工程； （ｂ）前記分散系と有効量の連続プロセス媒質と混合し
て、該プロセス媒質および前記抗原、前記溶媒および前
記壁形成用材料からなる微小滴を含有するエマルション
を生成する工程；および （ｃ）前記エマルションを有効量の抽出媒質に迅速に添
加し、前記微小滴から前記溶媒を抽出してマイクロカプ
セル化製品を生成する工程、からなることを特徴とする
パイアー斑によって選択的に吸収され、分解することな
く胃腸管を通過できる10μｍ又は10μｍ以下の大きさの
マイクロカプセルを成形すべく、生分解性で生体適合
性、かつ、パイアー斑によって選択的に吸収されうる賦
型剤でカプセル化された有効量の抗原からなり動物に投
与され、該抗原を動物のパイアー斑に送達するための経
口組成物の製造方法。 １７．前記マイクロカプセル化製品が、動物のパイアー
斑によって前記マイクロカプセル化製品を吸収させるた
めに10μｍ以下の直径を有する特許請求の範囲第16項記
載の方法。 １８．前記抗原が前記溶媒に分散する前記溶液中にある
特許請求の範囲第16項記載の方法。 １９．前記プロセス媒質か水性ポリ（ビニルアルコー
ル）溶液である特許請求の範囲第16項記載の方法。 ２０．前記抽出媒質が水である特許請求の範囲第16項記
載の方法。 ２１．前記溶媒が塩化メチレンである特許請求の範囲第
16項記載の方法。 ２２．さらに、前記分散系を前記連続プロセス媒質へ添
加する工程の前に、前記プロセス媒質に前記溶媒を飽和
させる工程からなる特許請求の範囲第16項記載の方法。 ２３．さらに、前記抽出媒質から、前記マイクロカプセ
ル化製品を分離する工程からなる特許請求の範囲第16項
記載の方法。 ２４．パイアー斑によって選択的に吸収され、分解する
ことなく胃腸管を通過でき、かつ、抗原を動物のパイア
ー斑へ送達するための10μｍ又は10μｍ以下の大きさの
マイクロカプセルを成形すべく、生分解性で生体適合
性、かつ、パイアー斑によって選択的に吸収されうる賦
形剤でカプセル化された有効量の抗原からなることを特
徴とする、動物に全身および粘膜免疫を提供するための
動物に経口投与される組成物。 ２５．前記マイクロカプセルが１μｍ〜10μｍの大きさ
を有する特許請求の範囲第24項記載の組成物。
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