DK158138B

DK158138B - Fremgangsmaade til fremstilling af immunoglobulin-igg-holdig maelk eller herudfra afledt produkt til behandling af rheumatoid arthritis

Info

Publication number: DK158138B
Application number: DK049479A
Authority: DK
Inventors: Ralph J Stolle; Lee R Beck
Original assignee: Stolle Res & Dev
Priority date: 1978-02-06
Filing date: 1979-02-06
Publication date: 1990-04-02
Also published as: JPS54113425A; DE2904044C2; SE7900798L; GB2013691A; DK49479A; FR2416015A1; IT7947888A0; JPH0160455B2; DK158138C; NL7900766A; DE2904044A1; FR2416015B1; CH651210A5; HK30283A; SE448344B; IT1116524B; GB2013691B

Description

i

DK 158138 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af immunoglobulin-IgG-holdig mælk eller herudfra afledt produkt til behandling af rheumatoid arthritis, ved hvilken fremgangsmåde der anvendes en vaccine, som er fremstillet ud fra kulturer af bakte-5 riestammer, der er dyrket i passende dyrkningsmedier, hvorefter bakterierne er blevet dræbt, indhøstet, vasket, lyofiliseret og suspenderet i en til injektion passende vehikel.

For et antal år siden var det almindeligt antaget, at rheumatoid 10 arthritis havde en infektiøs ætiologi. Denne opfattelse er ikke vel anset idag, endskønt de betændelsesagtige aspekter og væsentlige manifestationer ved rheumatoid arthritis - synovitis (ledbetændelse) og granulomatøse læsioner, feber, tachycardia, leukocytose, lympha-denopati og lejlighedsvis splenomegali, den accelererede erythrocyt-15 sedimentationshastighed og andre forandringer hos "akut-fase-reak-tanter" - alle er kompatible med en infektiøs proces. Kompetente og gentagne bakteriologiske studier har ikke været i stand til på overensstemmende måde at udvinde et enkelt infektiøst agens fra blod, synovial væske (ledvæske), synovial væv (ledvæv) eller subkutane 20 noduli (underhudsknuder). Forsøg på at overføre sygdommen ved injektion af ledvæske fra patienter med rheumatoid arthritis i led på andre humane individer har været uden succes. Subkutane noduli har ikke været i stand til at overleve efter en homolog transplantation (Bauer, W., Clark, W.S. og Dienes, L, The Practitioner, 166: 25 5 (1961)).

En infektiøs proces synes at fremme sygdommens indtræden ved rheumatoid arthritis hos et betydeligt antal patienter og kan udøve en skadelig virkning på forløbet af sygdommen, når den allerede er ind-30 trådt. Der er statistisk sandsynlighed for dette kliniske indtryk (Lewis-Fanning, E., Ann. Rheum. Dis.. Supplement 9 (1950)).

Der er blevet gjort mange forsøg på at frembringe en sygdom i dyr svarende til rheumatoid arthritis. Endskønt et antal forskellige 35 bakterier kan frembringe arthritis i dyr, er de ikke i stand til at reproducere de kliniske og patologiske træk ved rheumatoid arthritis, navnlig de seivvedvarende karakteristika ved den proliferative arthritis. En arthritis, der har nogen lighed med den humane lidelse, er blevet frembragt i mus med pleuro-pneumonialignende

DK 158138 B

2 organismer (Sabin, A.B., Science, 89: 228 (1939)) og i svin med Erysipelothrix rhusiopathiae (Sikes, D., Neher, G.M., og Doyle, L.P., Am. J. Vet. Res.. 16 (1955)). Det er blevet postuleret, at disse organismer initierer en hypersensitivitetsmekanisme (Sikes, 5 D., Neher, G.M., og Doyle, L.P., Am. J. Vet. Res.. 16 (1955)).

Forskere af rheumatoid arthritis fortsætter ikke desto mindre med at blive indfanget af visse genopdukkende temaer, der formoder forbindelser mellem infektioner og ledlidelser. F.eks. er gonorré i stand 10 til at frembringe ikke blot typisk gonorré-arthritis men også lejlighedsvis at indlede en kronisk arthritis, der udvikler sig til typisk rheumatoid arthritis. Der foreligger ingen statistik om den hyppighed, hvormed dette indtræder, så man kan ikke vide, hvor megen vægt man kan lægge på sammenhængen. Tonsillitis (betændelse i 15 mandlerne) eller pharyngitis (betændelse i svælget) kan også efterfølges af en polyarthritis, som først synes at være rheumatisk feber, men som udvikler sig til rheumatoid arthritis. Akutte virusinfektioner, især rubella hos unge kvinder, kan efterfølges af vedvarende polyarthritides, der involverer de små led såvel som de 20 store; disse arthritides har almindeligvis et forløb på adskillige måneder med vedvarende ledlidelse, der ligner rheumatoid arthritis, inden de gradvist aftager.

Selvom kronisk infektion med et ukendt agens forbliver en populær 25 antagelse som ætiologi for rheumatoid arthritis, findes der ingen publicerede data til støtte for denne formodning. Nogle af sygdommens udforskere nærer formodning om, at hvis infektion er en faktor, er det måske ikke en infektion med en specifik type mikroorganismer, men snarere infektion med et bredt spektrum af banale mikroorganis-30 mer i forbindelse med et ændret værtsrespons frembragt af de infektioner, der er ansvarlige for sygdommen. Den foreliggende opfindelse er baseret på denne teori om oprindelsen til rheumatoid arthritis.

Endskønt en infektiøs ætiologi aldrig er blevet fastslået, synes 35 adskillige af den senere tids opdagelser relevante som støtte for denne teori.

Nogle af disse er følgende:

DK 158138 B

3 1. Patienter med rheumatoid arthritis har lavere IgAværdier end normalt; IgA er den klasse af immunoglobuliner, der findes i mave-tarmkanalens sekreter.

5 2. Immunoglobulin A fremkommet som respons på immunisering via spytkirtlerne findes i serum kolostrum og mælk såvel som i spyttet. Det formodes, at IgA transporteres til disse forskellige væsker via mave-tarmkanal en og det lymfatiske system (Michelok, S.M., Rolman, A.F.R., og McGhee, J.R., Proc. Soc.

10 Exptl. Biol. Med.. 148; 1114 (1975)).

3. Efter en tarmomføringsoperation ved morbus obesicas udvikler nogle patienter symptomer, som faktisk er identisk med rheumatoid arthritis. Udbruddet af arthritis ledsages af fremkomsten 15 i blodserum af cirkulerende kryoproteiner, der er proteiner, som udfældes eller danner gel ved henstand ved køleskabstemperatur, i nogle tilfælde også ved noget højere temperatur, og som atter går i opløsning ved 37°C sammensat af IgG, IgM, IgA, komplementkomponenter C3, C^, C5 og IgGantistof mod E. coli og 20 B. fragil is. Fjernelse af tarmomføringen resulterer i fuld stændig forsvinden af symptomerne (Woods, J.R., La Mont, J.T.,

Maur, E., Isselbacher, K.J., New Enol. J. Med.. 294: 121 (1976)).

25 4. En type af Diplostreptococcus agalactiae tilhørende streptococ- gruppen B er blevet inddraget som et ætiologisk agens ved rheumatoid arthritis (Svartz, N., Acta. Med. Scand., 192: 231 (1972)). Denne streptococ er til stede i det meste, kommercielt tilgængelige, pasteuriserede mælk, men ikke i immun mælk.

30 5. En prædisposition for rheumatiske lidelser synes at være arvelig via de histokompatible antigener (HL-A). Disse antigener bestemmer sandsynligvis værtsorganismens respons på infektiøse agenser.

35 På basis af disse indicier konkluderes det, at rheumatoid arthritis har en infektiøs oprindelse, at infektionen finder sted i fordøjelseskanalen, at et antal forskellige bakteriestammer er involveret i infektionen, at infektionen sandsynligvis opstår som følge af en

DK 158138 B

4 fejl i værtsorganismens immunforsvarsmekanisme, og at den mest effektive måde at behandle sygdommen på er at reetablere immunbeskyttelsen mod det infektiøse agens i fordøjelseskanalen.

5 Basalt er der to måder, som kan anvendes til behandling af infektion: Immunmetoden, som involverer enten aktiv eller passiv immunisering mod det infektiøse patogen, og anvendelsen af antibiotika, såsom penicillin, tetracyclin, ampicillin, o.l. Antibiotika er ikke specifikke i deres virkning, og de dræber et bredt spektrum af 10 gavnlige såvel som skadelige bakterier. På den anden side er immunmetoden højst specifik. Baktericide antistoffer frembragt mod en specifik bakteriestamme reagerer kun med denne stamme og har ingen skadelige virkninger på andre typer bakterier. Desuden er antistoffer - modsat antibiotika -naturlige legemsprodukter, som ikke har 15 kendte bivirkninger. Da formålet med opfindelsen er at kontrollere infektion med en specifik bakteriegruppe uden at skade gavnlige bakterier i fordøjelseskanalen, er immunmetoden den valgte fremgangsmåde.

20 Der findes to forskellige metoder til at opnå immunbeskyttelse på.

Aktiv immunisering er en metode, ved hvilken værtsorganismen immuniseres aktivt med en vaccine, der stimulerer værtsorganismens immunsystem til produktion af beskyttende antistoffer mod faktorer, der er indeholdt i vaccinen. Aktiv immunisering indtræder under natur-25 lige forhold, når værtsorganismen udsættes for infektiøse patogener.

Passiv immunisering er en metode, ved hvilken antistoffer, der er opnået fra et individ, som er blevet immuniseret aktivt, gives til et andet individ. Ved denne metode overføres de beskyttende antistoffer fra den immune værtsorganisme til modtageren. Passiv immun-30 beskyttelse er midlertidig og varer kun så længe som de passivt erhvervede antistoffer fortsat er til stede i modtagerens organisme.

F.eks. kan antistoffer, der er opnået fra heste, som er blevet immuniseret mod tetanustoxin, gives til mennesker, som er blevet inficeret med tetanus, til opnåelse af en midlertidig immunbe-35 skyttel se mod det toxin, der produceres af tetanus-bakterier.

I beskrivelsen til et tidligere patent (USA patent nr. 3.626.057) er der beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af tetanusantitoxin i mælk. Dette patentskrift lærer, at koen kan immuniseres aktivt mod

DK 158138 B

5 tetanustoxin, at antistoffer frembragt af koen mod toxinet kan opnås fra koens mælk, og at disse antistoffer kan anvendes til behandling af dyr, som er blevet inficeret med tetanusbakterier, på en sådan måde, at antistofferne neutraliserer toxinet. Patentskriftet lærer, 5 at den passive administration af antistoffer neutraliserer det livstruende toxin, som frembringes af bakterierne, og derved tilvejebringer midlertidig immunitet mod toxinet.

Passiv immunisering adskiller sig fra aktiv immunisering derved, at 10 immunbeskyttelsen er midlertidig og kun varer så længe som de beskyttende antistoffer er til stede. Aktiv immunisering er mere permanent, fordi værtsorganismens immunsystem fortsætter med at producere beskyttende antistoffer ved tilstedeværelsen af det stimulerende antigen.

15

Den senere tids undersøgelser inden for området fordøjelseskanal s-immunologi har vist eksistensen af en lokal immunmekanisme i fordøjelseskanalen. Dette immunsystem i fordøjelseskanalen producerer en speciel type antistof, der virker kontrollerende på bakterielle 2o angreb i fordøjelseskanalens hulrum. Antistoffet, der kaldes sekre-tionsimmunoglobulin eller IgA, produceres som respons på lokal, aktiv immunisering af fordøjelseskanalens slimhinde med antigenet. Sekretionsimmunsystemet i fordøjelseskanalen virker forhindrende på koloniseringen og formeringen af skadelige bakteriearter i dette 25 miljø. Det antages, at svigt hos det lokale immunsystem i fordøjelseskanalen tillader ukendte, skadelige bakterier at etablere sig, og at disse bakterier forårsager rheumatoid arthritis. Ifølge denne teori opstår rheumatoid arthritis som følge af en svigtende evne hos det lokale immunsystem i fordøjelseskanalen til at producere og 3Q sekretere beskyttende antistoffer mod skadelige bakterier. Den manglende evne hos værtsorganismen til at reagere på aktiv immunisering udelukker således denne metode som en fremgangsmåde til behandling af rheumatoid arthritis.

35 Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde af immunoglobulin-IgG-holdig mælk eller herudfra afledt produkt til behandling af rheumatoid arthritis, ved hvilken fremgangsmåde der anvendes en vaccine, som er fremstillet ud fra kulturer af bakteriestammer, der er dyrket i passende dyrkningsmedier, hvorefter

DK 158138 B

6 bakterierne er blevet dræbt, indhøstet, vasket, lyofiliseret og suspenderet i en til injektion passende vehikel, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at vaccinen, der fremstilles ud fra bakteriekulturer af følgende mikroorganismer: 5 ORGANISME ATCC NR.

Staphylococcus Aureus 11631

Staphylococcus epidermidis 155

Streptococcus pyogenes, A. type 1 8671 10 - type 3 10389 type 5 12347 type 8 12349 type 12 11434 type 14 12972 15 - type 18 12357 type 22 10403

Aerobacter aerogenes 884

Escherichia coli 26

Salmonella enteritidis 13076 20 Pseudomonas aeruginosa 7700

Klebsiella pneumoniae 9590

Salmonella typhimurium 13311

Haemophilus influenzae 9333

Streptococcus viridans 6249 25 Proteus vulgaris 13315

Shigella dysenteriae 11835

Streptococcus, gruppe B Diplococcus pneumoniae Streptococcus mutans 30 Corynebacterium, Acne, type 1 og 2, ugentligt injiceres intramuskulært i sunde køer i fire på hinanden følgende uger og derefter to gange månedligt, at hver injektion

O

omfatter 20 x 10 bakterieceller, at mælken fra de immuniserede køer 35 fra den fjerde uges begyndelse indsamles og prøves for titer til sikring af, at minimumstiteren af antistof mod hver af de af vaccinen omfattende bakterier er 1-500 bestemt ved reagensgiasagglutinationsmetoden til prøvning for antistoftiter.

DK 158138 B

7

Immunoglobul intypen er vigtig at tage i betragtning, hvad angår patenterbarheden af opfindelsen, eftersom der er fem kendte immunogl obul i nklasser, der betegnes IgG, IgM, IgA, IgD og IgE (Nisonoff, A., Molecules of Immunity in Immunobiology. (Editors Good R.A. og 5 Fisher, W.) Sinauer Associates, Stamford, Connecticut (1971)). Hver immunoglobul intype adskiller sig strukturelt (Waldman, T., Blaese, R.M. og Strobe, W., Plasma Protein Metabolism. (Editors Rothschild, M. og Waldman, Academic Press, side 269 (1970)) og har en forskellig biologisk funktion i legemet (Waldman, T., Immune Mechanisms on 10 Secretory Surfaces, Post Grad. Med.. 50: 78 (1971), og Franklin, E.C., Proo. Al 1 erg.. bind 8, side 57 (1964)). Desuden er der en påfaldende variation i lokaliseringen af immunoglobul i nerne i legemet. F.eks. adskiller fordelingen klart immunoglobul i nklasserne IgA og IgG. Det mest påfaldende træk ved IgA er dets høje koncen-15 tration i legemets eksterne sekretioner, inklusive mave-tarmkanalens væsker. Det er klart blevet påvist, at det immunsystem, som leverer IgA til mave-tarmkanalens saft, er et særskilt system forskelligt fra det, som producerer IgG.

2o I mennesket findes IgG primært i legemets vaskulære og intracellu-lære rum (Waldman et al, 1970 (se ovenfor)), og meget lidt IgG finder vej til mave-tarmkanalens væsker. En anden vigtig forskel mellem immunoglobul inklasserne vedrører deres metaboliske hastighed.

Uanset dets lokalisering i legemet synes nedbrydningen af hver 25 immunoglobulinklasse at være under særskilt kontrol. Den funktio nelle kataboliske hastighed varierer fra så lavt som 6,5% for IgG til så højt som 90% for IgE og med andre immunogl obul i nklasser liggende derimellem (Waldman et al, 1970 (se ovenfor)). Desuden adskiller de forskellige immunoglobul inklasser sig også hvad angår 3Q deres iver efter at bindes til antigener, og hvad angår deres evne til at kombinere med kompliment, som er en af de nødvendige elementer for at dræbe levende bakterieceller (Heremans, J.F., Les Golbulenes Serioues du Svsteme Gamma Leur Nature et Leur Patholoqie.

Arscia, Brusseles & Masson, Paris (1960)). Det er vigtigt at under-35 strege disse forskelle hos antistoftyperne, eftersom immunvirkninger kan variere i afhængighed af den involverede antistoftype.

Den mest almindeligt antagne teori er, at de forskellige immuno-globulinklasser har udviklet sig til funktion i forskellige miljøer 8

DK 158 138 B

i legemet. Det er f.eks. kendt, at der eksisterer et specielt og særskilt immunsystem til produktion af antistoffer, som virker i fordøjelseskanalens miljø. Der er desuden almindelig enighed om, at fordøjelseskanalens immunfunktioner kontrolleres specielt af IgA-5 antistoffer og ikke af IgG. Under naturlige forhold er IgA derfor den immunoglobul i nklasse, som regulerer immunkontrollen over bakterielle infektioner, der optræder i mave-tarmkanalens hulrum hos mennesket. Eftersom IgG, IgM, IgD og IgE normalt ikke findes i tarmsekreterne, er det ikke logisk at forvente, at disse antistof-10 typer ville være effektive ved behandling af infektioner i fordøjelseskanalens miljø.

Det væsentligste immunoglobulin i mælk fra køer er IgG og ikke IgA (Sullivan, A.L., Pendergast, R.A., Antunes, L.J., Silverstein, A.S., 15 og Tomasi, Jr., T.B. Jour, of Immunol., bind 2, side 103, (1969)).

Mælk fra kvæg er derfor ikke en nærliggende kilde for antistof til behandling af bakterielle infektioner i menneskets fordøjelseskanal på grund af dets høje koncentrationer af IgG og lave koncentrationer af IgA.

20

Immuniseringsmetoden er en anden vigtig parameter at tage i betragtning ved de forskellige immunoglobul inklasser. Det er velkendt for fagfolk inden for området, at forskellige immuniseringsmetoder resulterer i den fortrinsvise produktion af forskellige antistofty-25 per. Lokal immunisering af sekretionsvæv opnået ved at udsætte vævet for antigener stimulerer f.eks. den fortrinsvise produktion og sekretion af immunoglobul iner af IgA-typen. Teknikken ved intra-mammal perfusion, som den er beskrevet i beskrivelsen til USA patent nr. 3.376.198, er et eksempel på lokal immunisering. Denne 30 metode stimulerer produktion og sekretion af IgA-antistoffer og er ikke en effektiv metode til fremstilling af IgG.

Ifølge den foreliggende opfindelse benyttes intramuskulær injektion ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, eftersom IgG er hovedimmuno-35 globulinet i komælk, ikke IgA, og i koen, og systemisk immunisering er den foretrukne metode til frembringelse af antistoffer af IgG-typen i mælk. Denne skelnen mellem immunoglobulin af IgG- og IgA-typen er vigtig, eftersom den lærer, at systemisk immunisering og ikke lokal immunisering er den foretrukne metode til opnåelse af mælk

DK 158138 B

9 med høj antistoftiter. Denne skelnen lærer desuden, at de immunopro-dukter, der produceres ved den mammale perfusion ved en vaccine, er tydeligt forskellig fra det immunprodukt, der produceres ved intra-muskulær injektion med den identiske vaccine. Produktet (IgG-anti-5 stoffer) fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er således klart forskellig fra det produkt, der opnås ved fremgangsmåden ifølge ovennævnte USA patentskrift.

Immunproduktet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den forel ig-10 gende opfindelse er en forbedring i forhold til produktet ifølge opfindelsen i ovennævnte USA patentskrift, eftersom koncentrationen af antistoffer af IgG-typen er væsentlig højere end koncentrationen af antistoffer af IgA-typen. Der findes ingen vidnesbyrd i litteraturen til støtte for den påstand, at IgG-antistoffer kan frem-15 stilles ved intramammal perfusion af antigener. Eftersom omfanget af IgA-immunoglobuliner desuden enten er ikke-forekommende eller er ekstremt lav i komælk, er det absurd at foreslå, at læren fra ovennævnte USA patentskrift har nogen relevans i forbindelse med fordringen på den foreliggende opfindelse. Læren fra det nævnte USA 20 patentskrift leder derimod bort fra opdagelsen ifølge den foreliggende opfindelse, eftersom den forudsætter, at IgA er en biologisk aktiv faktor i komælk med potentiel terapeutisk anvendelsesmulighed.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes en 25 vaccine, som er fremstillet ud fra en unik kombination af bakteriearter, hvilken vaccine gives til sunde malkekøer. De opnåede immuno-globuliner fra mælken fra de immuniserede køer kan anvendes til passiv immunisering af en patient ved oral indgivelse af immunoglobu-linet, der passivt immuniserer imod et blandet spektrum af infek-30 ti øse bakterier, som holder til i mave-tarmkanalen. Denne behandling eliminerer tilstande i mave-tarmkanalen, som forårsager rheumatoid arthritis.

Der skal i det følgende gives en kort beskrivelse af tegningen, 35 hvor:

Fig. 1 er et eksemplar af et spørgeskema, der er omtalt i beskrivelsen,

DK 158138 B

10

Fig. la er en fortsættelse af spørgeskemaet i fig. 1, og

Fig. 2 er kurver, der viser resultaterne af afprøvningen udtrykt ved RF-titer afsat mod tiden over en 12 måneders periode, 5 6 måneder på immunmælk og 6 måneder på placebo.

Ved en udføre!sesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles en lavfedtholdig pulvermælk, der indeholder en population af naturlige antistoffer af IgG-typen, som reagerer med de bakte-10 riearter, der er anført i tabel 1.

TABEL 1

Bakterielle Antigener 15 ORGANISME ^ATCC NR.

Staphylococcus aureus 11631

Staphylococcus epidermidis 155

Streptococcus pyogenes, A. type 1 8671 20 - type 3 10389 type 5 12347 type 8 12349 type 12 11434 type 14 12972 25 - type 18 12357 type 22 10403

Aerobacter aerogenes 884

Escherichia coli 26

Salmonella enteritidis 13076 30 Pseudomonas aeruginosa 7700

Klebsiella pneumoniae 9590

Salmonella typhimurium 13311

Haemophilus influenzae 9333

Streptococcus viridans 6249 35 Proteus Vulgaris 13315

Shigella dysenteriae 11835

Streptococcus, gruppe B Diplococcus pneumoniae Streptococcus mutans

DK 158138 B

π

Corynebacterium, Acne, type 1 og 2 x) American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852.

5

Den antibakterielle mælk indeholder alle de stoffer, der normalt findes i lavfedtholdig pulvermælk. De hovedbestanddele, der udgør den antibakterielle mælk, er vist i tabel 2.

10 TABEL 2

Kvantitativ og kvalitativ analyse af antibakteriel mælk

Proteiner 35,6% 25 Fedt 1,0%

Carbohydrater 52 %

Mineraler 7,8%

Fugtighed 3,5%

Hver genopløst liter af 90-120 gram af 20 ikke-fedtholdig tørmælk indeholder ca: 1200 mg calcium 157% 935 mg phosphor 125% 0,3 mg thiamin 32% 1,78 mg riboflavin 140% 25 M4 m9 niacin 10% 324 kalorier

Antibakteriel mælk og normal komælk indeholder i vægtprocent omtrent de samme bestanddelskoncentrationer. Desuden er koncentrationen af 30 immunoglobulin af IgG-typen i antibakteriel mælk og normal mælk identisk. Det er derfor kun specificiteten af de antistoffer, der er indeholdt i den antibakterielle mælk, som adskiller den fra normal mælk. Ved immunoglobulinets specificitet menes det spektrum af bakteriearter, som antistofferne reagerer med.

Antibakteriel mælk indeholder ingen medikamentelle tilsætninger eller eventuelle andre komponenter, som ikke er naturlige levnedsmiddelprodukter fra koen.

35 n DK 158138 Β

Immunmælken fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er også anvendelig til kontrol af autoimmune lidelser, f.eks. lupus erythematosus o.1., som forårsages eller forværres af bakterielle invasioner i mave-tarmkanalen.

5

Det polyvalente antigen, der benyttes til frembringelse af anti-bakteriel mælk, fremstilles som følger:

Fremstilling af vaccinen 10

De i tabel 1 anførte bakteriestammer blev opnået fra American Type Culture Collection, hvilket sikrer bakteriestammernes autenticitet og den højeste renhedsstandard, der er tilgængelig. Efter modtagelsen blev hver enkelt bakteriestamme dyrket på en bl od-agarplade til 15 undersøgelse af kulturens levedygtighed og til bestemmelse af, om vækstmønsteret var typisk eller atypisk for den pågældende bakterie.

En enkelt koloni fra hver af undersøgelseskulturerne blev udtaget til histologisk undersøgelse for yderligere at sikre kulturens autenticitet og renhed. En enkelt koloni fra hver kultur blev 20 anvendt til inokulering af 500 ml standard-dyrkningsmedium. Der blev benyttet af American Type Culture Collection anbefalede medier til dyrkning af hver af de i tabel 1 anførte specifikke bakterier.

Alle organismer blev inkuberet som statiske kulturer med undtagelse 25 af den 12., 13., 14. og 16. bakteriestamme i tabel 1, der blev inkuberet i en ryster til tilvejebringelse af omrystning. Identifikationen af bakteriestammerne og American Type Culture Collection's katalognumre er vist i tabel 1. Hver kultur blev dyrket i 48 timer ved 37°C. Efter inkubationen blev kulturerne dræbt ved opvarmning 30 til 60°C i to timer. Der blev benyttet prøver af de dræbte bakterier til inokulering af frisk dyrkningsmedium, som derpå blev inkuberet i 24 timer ved 37°C til bestemmelse af, at drabsprocessen var komplet.

Kun kulturer, der ved denne procedure havde vist sig sterile, blev benyttet til videre behandling. Sterile kulturer blev derpå vasket 5 35 gange i destilleret vand, og cellerne blev genvundet ved centrifugering. Bakteriecellerne blev frosset ved neddykning i flydende nitrogen og frysetørret ved lyophili seringsmetoden. Lyophili serede celler blev opbevaret i sterile småflasker, indtil de blev anvendt til frembringelse af den polyvalente vaccine. Den polyvalente

13 DK 158138B

vaccine blev fremstillet ved at afveje 1 gram af hver bakteriestamme. De tørre celler blev sammenblandet, og blandingen blev suspenderet i steril fysiologisk saltvand (20 gram bakterier pr. 500 ml saltvand).

5

En prøve af den koncentrerede opløsning blev på seriemæssig måde fortyndet med saltvand til bestemmelse af den fortynding, der gav en koncentration på 4x10 celler pr. cm . Den koncentrerede polyval ente stamvaccine blev fordelt i et antal beholdere og opbevaret frossen.

10 Der blev i hver enkelt beholder inkluderet tilstrækkelig mængde koncentreret antigen til at immunisere 50 køer. Den endelige fortynding af koncentratet blev udført lige forud for immuniseringen.

Den foretrukne fremgangsmåde er at fjerne et tilstrækkeligt antal små flasker til at immunisere det antal køer, der skal behandles. De 15 små flasker fjernes f.eks. 24 timer forud for det planlagte immuniseringstidspunkt; en prøve af koncentratet fortyndes derpå i en

Q

steril beholder til en endelig koncentration på 4x10 celler pr. ml.

O

Det maksimale respons i køer opnås ved injektion af 20x10 bakte- 3 8 rieceller eller 5 cm af det sterile præparat, hvilket er 4x10 20 celler pr. ml, ifølge den nedenfor beskrevne immuniseringsmetode.

Foretrukken fremgangsmåde til immunisering af køer

Antistofproduktet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 25 frembringes ved immunisering af køer med det polyvalente antigen 3 fremstillet som beskrevet ovenfor. Køerne injiceres 5 cm af poly-

O

valent antigen indeholdende 20x10 bakterieceller. Injektionen foretages intramuskulært i gluteus maximum musklen i bagbenet. Denne procedure gantages med 1 uges mellemrum i 4 på hinanden følgende 30 uger begyndende 2-3 uger forud for den forudsagte kælvningsdato.

Efter den primære immunisering gives der under anvendelse af den samme antigenkoncentration booster-injektioner hver 14. dag. Denne immuniseringsmetode giver maksimal antistoftiter.

35 Indsamling, transport og behandling af mælken Mælken fra immuniserede køer indsamles i et moderne malkerum. Et fuldt automatiseret malkningssystem indsamler og opbevarer mælken under fuldkommen hygiejniske forhold. Malkningssystemet består af

DK 158138 B

14 automatiserede maskiner, der med et lukket rørsystem er forbundet direkte med kølede opbevaringstanke. Hele systemet renses og steriliseres efter hver malkning til sikring af maksimale hygiejniske forhold. Det er vigtigt ved behandling af immunmælk at tage omhyg-5 gelige forholdsregler til forhindring af bakterievækst, eftersom disse bakterier kan nedsætte mælkens antistoftiter.

Mælken transporteres dagligt med mælketransportlastbiler fra de kølede opbevaringstanke til et mælkebehandlingsanlæg. På mælkebe-10 handlingsanlægget benyttes et højtemperatur-korttidssystem til pasteurisering af den antibakterielle mælk. Specielt mælkebehandlingsmaskineri tilvejebringer lynopvarmningen af en kontinuerlig strøm af mælk til 68,3°C i et tidsrum på ikke mere end 15 sekunder. Temperatur og tid er kritisk, eftersom antistof er nedbrydningsføl-15 somt overfor varme. Mælkeantistof destrueres ved temperaturer over 73,9°C, hvis det holdes der i et tidsrum på mere end 1 minut. Efter pasteuriseringen afkøles fuldmælken øjeblikkeligt, fedtet fjernes ved centrifugering, og den skummede antibakterielle fuldmælk overføres til pulverform ved en spraytørrings-proces. Spraytørrings-20 processen udføres i et stort tørringskammer, i hvilket der indblæses varm luft (176,7°C) med stor hastighed. Den skummede mælk forstøves ind i kammeret, hvor de findelte mælkepartikler tørres øjeblikkeligt, medens de falder til bunden af kammeret. Den tørrede mælk fjernes automatisk ved hjælp af mekaniske redskaber, og mælkepulve-25 ret emballeres under hygiejniske forhold. Forud for forstøvningen koncentreres den skummede mælk ved kogning i et kammer under vacuum (37,8-43,3°C). På hvert trin er det kritisk at holde mælken fri for kontaminering med bakterier, eftersom dette nedsætter antistof-titeren.

30

Afprøvningsprocedure

Immunmælk blev fremstillet med indavlede Hol stener-køer. Køerne blev immuniseret ved intramuskulær injektion med en blanding af de i 35 tabel 1 identificerede bakterieantigener. Vaccinen blev fremstillet ved den ovenfor beskrevne metode. Køernes immunologiske respons blev fremskyndet ved to ugentlige injektioner med vaccinen. Mælken fra disse køer blev samlet, fedtet fjernet, og den ikke-fedtholdige mælk blev pasteuriseret ved udsættelse for 71,1°C i 16 sekunder

DK 158138 B

15 efterfulgt af en spray-tørringsproces, ved hvilken mælkens temperatur ikke kom over 29,4°C. Mælken blev emballeret i "kvarte" poly-ethylenbeholdere. Kontrolmælk (placebo) var ikke-fedtholdigt pulvermælk indkøbt fra en lokal producent.

5

Erythrocytsedimentationshastigheder blev bestemt på friskt indsamlet blod ved metoden af Westergren og korrigeret for hæmatocrit ifølge metoden af Wintrobe, M.M. og Langsberg, J.W., Am. J. Sci., 189:102 (1935). Rheumatoide faktortiterværdier blev bestemt efter Singer, 10 J.M. og Plotz, C.M., Am. J. Med.. 21:888 (1966) makroskopiske reagensrørstest.

Patienter til undersøgelsen blev accepteret på grundlag af en forhøjet erythrocytsedimentationshastighed og en positiv rheumatoid 15 faktortiter. Ni patienter blev studeret i 12 måneder, og 11 patienter blev studeret i 18 måneder. Patientgruppen var sammensat af 13 kvinder af kaukasisk race med en alder på fra 32 til 69 år med en gennemsnitsalder på 50,4 år og af 7 mænd af kaukasisk race-med en alder på fra 43 til 70 år og med en gennemsnitsalder på 58,1 år.

20 Middel varigheden af arthritis var 10,8 år for kvinderne og 11,0 for mændene. Patienterne blev på tilfældig måde behandlet med enten immunmælk eller ikke-immunmælk (et kommercielt produkt, der indkøbt i Dayton-området tjente som et placebo). Begge mælkeprodukter blev emballeret i identiske beholere og blev identificeret som værende 25 immunmælk eller placebo ved en blå henholdsvis rød trykfølsom mærkat, der blev fæstnet til hver beholder på det tidspunkt, hvor den blev fyldt. Mærkaterne blev fjernet lige forud for udlevering af mælken til patienterne. På intet tidspunkt vidste patienterne således, om de modtog immunmælk eller placebo. Patienterne blev på 30 tilfældig måde (bestemt ved møntkast) udvalgt til enten at modtage immunmælk eller placebo i den første 6-måneders priode. Ved afslutningen på denne periode blev de, der modtod immunmælk, anbragt på placebo, og de, der modtog placebo, blev anbragt på immunmælk i den næste 6-måneders periode.

35

Ved afslutningen af denne anden 6-måneders periode meldte 11 patienter sig frivilligt til at fortsætte undersøgelsen i yderligere 6 måneder. Mælketypen (immun eller placebo) blev på dette tidspunkt igen ændret, og observationerne fortsattes. Undersøgelsen omfattede

DK 158138 B

16 således tre 6-måneders perioder med 11 patienter deltagende i tre perioder og ni deltagende i to perioder.

Patienterne var i konsultation med månedligt mellemrum, på hvilket 5 tidspunkt der blev udleveret én måneds mælkeforsyning, et evalueringsspørgeskema blev udfyldt, og en blodprøve blev taget til bestemmelse af rheumatoid faktortiter, erythrocytsedimentationshas-tighed og hæmatocrit.

10 Patienterne blev instrueret om at tage en mængde ikke-fedtholdig mælketørstof ækvivalent med én liter mælk efter maden to gange daglig. Mælketørstoffet blev frisk opløst i ½ liter ledningsvand umiddelbart inden indtagelsen kort efter opvågningen om morgenen og igen lige forud for sengetid om aftenen. De blev instrueret om at 15 konsultere deres læge som sædvanlig og at følge de af ham fore skrevne behandlingsordinationer. Medikamenter kunne indtages ad libitum eller som foreskrevet af deres almindelige læge. De blev kun bedt om at rapportere mængden af den indtagne medicin.

20 Et spørgeskema blev udfyldt af hver patient med månedligt mellemrum.

Det var opdelt i seks afsnit, der omhandlede: 1) Morgenstivhedens varighed, 25 2) Graden af smerter, som optrådte i hvert af otte led, 3} Type og mængde af indtagne medikamenter med korttidsvirkning, 4) Type og mængde af indtagne medikamenter med langvarige virk- 30 ni nger, 5) Patientens evne til at udføre sine normale aktiviteter, og 6) Graden af symptomer på rheumatoid arthritis.

35

De i rubrikkerne efter hvert svar viste tal angiver den værdi, der blev tillagt svaret ved evalueringen af spørgeskemaerne. Ved pointtildelingen blev der lagt vægt på, at de afsnit, der omhandlede medicineringen, afspejlede den relative anti-inflammatoriske og

DK 158138 B

17 analgetiske virkning af de forskellige, benyttede medikamenter. En 324 mg aspi ri ntablet blev tillagt værdien én. Alle andre medikamenter (med undtagelse af guld, Plaquenil® (varemærke for hydroxychlor-quinolylsulfat) og cortison indsprøjtninger, der blev vurderet 5 særskilt) blev arbitrært tillagt værdier i forhold til aspirin. Alle salicylat-præparater, Tylenol®, Darvon, Motrin®, etc. blev således regnet for ækvivalente med en 324 mg aspirin-tablet og blev også tildelt værdien én. Antallet af mg Prednison blev multipliceret med fire, antallet af indtagne Indocin-kapsl er blev multipliceret med 10 2,5. For hver 64,8 mg codein blev der multipliceret med to, og antallet af indtagne Butazoladin-tabletter blev multipliceret med syv.

Middelværdien af pointtildelingen i hver kategori blev beregnet for 15 hver 6-måneders periode. Forskellen mellem middelværdierne blev derpå beregnet ved at subtrahere middelværdierne opnået under indgivelse af immunmælk fra dem, der blev opnået under indgivelse af placebo. Når resultaterne blev beregnet på denne måde, blev en forbedring i patientens tilstand i den periode, han modtog immunmælk, 20 indiceret ved negative værdier for spørgsmål 1 og 6 og ved positive værdier for alle andre spørgsmål. Middel korrigerede erythrocytsedi-mentationshastigheder (ESR) og rheumatoide faktortitere (RF) blev vist respektivt på lignende måde. De blev beregnet på en sådan måde, at positive værdier afspejlede en lavere erythrocytsedimentations-25 hastighed eller rheumatoid faktortiter under indgivelse af immun mælk. Dataerne blev behandlet statistisk, idet Goodnight et al's "Statistical Analysis System" blev benyttet (SAS Institute, Raleigh, N.C.). Beregningerne blev udført ved hjælp af en IBM, model 370/155 computer.

30

Resultater

Immunmælken blev tolereret godt af alle patienter med undtagelse af én, der havde perniciøs anæmi. Denne patient klagede over diarré og 35 blev udeladt fra undersøgelsen. Nogle patienter rapporterede om en vægtforøgelse i løbet af undersøgelsen. Dette kan have sin årsag i den forøgede kalorieindtagning fra mælken eller afspejler muligvis en generel forbedring i deres fysiske tilstand.

18

DK 158138 B

«—i oi—i o ·—i w in r>. o m co oo

CM »—) i I pH C 1 i—I CM pH O hn CM

o «3-ΙΛΟΟΟΟ·—IO M- CM O

0-1 O OOOOOOOO O O O

«S Λ Λ V» O OOOOOOOO o o o <u cj c ·—* id) rv. co cn in in co <—i cm σι oo *—< o ,— S_ -M- COOOOO'M-OCMCMp—i "M" CO m

cu CU ΓΟ CM r—i CM CM CO CM *—* CM «—< O CO

T5 M- * Λ..·.·*«.·.«.·- *· *" ~

X) <+_ O OOOOOOOO O O

-Γ--Ι— i + + + + + + + + + + +

ZE XJ

. co cm cn co in o o i— σι co co p—< > lo olom-colocdloo i—i m o o co cocor^incoincoin o i— cm· C i—I '—i '—* 3

E

£ i—< (— cu cn locotnwsnoioi m m- m- s_ xj r-. i—i i—i co cm cm co m cm *-h m- f~- co rs -O co i-vpioincocMiocor-'. m cm co

_I W ZEL O OOOOOOOO CO o p-H

lu σ 1-1 co c: <C ·>- I— r—

"O

co x r-. i—irH.cor^cO'—icni^p ·—< i— (¾ O · «s «* »* **

r— dj > LD r^COCOM-O-M-COCO «d- O CO

cu o · cn 10001--1001--1010 o m- co CO <T3 O p-i i—i SI «—i r— cm 'iCMctnfO'iHCO co m Μα; co inincMt-'-coocOM- co cm cm ό co or-.ooomor--o co co cm "O - --------- - - -

-r- o ooo·—lOOOO o o CM

s: cm

3 M- M-M-M-M-M-M-CMCM μ- μ- ΜΕ CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

i E

as S- t—t > cu

S- XJ

O) o CO -i— i— JO i- o o <D S- r-» t-— C-. Γ~» I—. S CO CO I— I''

Q +J CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

i— on c ccf c o +-> o c -r- C +J xs £= cu -1- J= o > s- z:

•I- CU XJ

+J +J <y

<Λ S- S- E

c: cu cu S- ί-

αι EXJCU4-> CU I— cu CU C X

σ Ml— 3C0X3+J CU XJ r— CU XI

s_ xioo^c't-a^x >— XJ —j

O cu-Χι— S- ·Π3 O C COl ·!- £= Q

s: um<>xijc:<u- ci- < *=c ,-h CM COJO OT3 CU <+I cn £ CO M- in

DK 158138 B

19

CO

CSJ «3- lO CO OO

«d* CM i—I l~- CO

O O O CO UO

o o o r·^ cn CCS

„ ^ fs c r* I—I

o o o o o cn •i— U- > ·<-} »d· CTl CO r-1 tO I— <i (O cn s o ns ro cm i—i co *—> +f o o o o o <e I I I + > +-* C *1—

O

CL

i—i «d- CO cu r~^ oo „ c 'd- cm ro CO —i <u t—( i—( *—t CO "ί- 00 ρ| g, c σ> oo ^ I— cm 'd· oo ry t~- «d· r^. cm ro S-

0 ^d* LO «—t cn 00 <U

LL- CM CM 1—1 ~ Ό li__ Λ a *» LO LO L- CM CM CM CO 3 co -g

_I CD

LU

CO +->

<C 00 00 CD I— on CCS

1 n a i> i· ii l—L

i—i oo t— cn lo CM i—li—I CM "d" cj U- ro tn "d* co oo Ό O 00 CM CD cn 3

CD CD CD CM CD

r> fi r* c» c% +J

i—I 1 ( i—i CO CO 01

CO C

cn

CD

s-

CD JO

*d" M" "d* ro 00

CM CM CM CM CM

+-> tu

C TO

(U c •r— •ΙΟ </) •i—

Cfj i— I—i LO h"« 4-CD

C CM CM CM CM CM M- +-> -r- CU ·ι- S- o > -O ^ -r- C 00 +-> to c: .x

S- O CO

o ·<“ <4- +-> CJ> <0 '·!— D "Γ- 1—

•I- S- T5 (U S- CD

i— (U CU 00 Λ CCS

Ό +-> J= i— > Q

<U S- > tu

C CU ·*— > CC\ II II

c(d ε 4-» ft) CO I Lul

s: co co n: lu| α:I

. . . c C c X

CO nj JO O t'-. 00 XX

DK 158138 B

20

Som vist i tabel 3 blev patienterne observeret over ialt 27 kontrolperioder (6-måneders perioder, i hvilke de modtog placebo) og 24 testperioder (6-måneders perioder, i hvilke de modtog immunmælk). Én patient havde fået en fysisk læsion af den ene ankel og fod. Smerten 5 i disse led blev ikke evalueret, hvilket forklarer det mindre antal evalueringsperioder for disse led. Erythrocytsedimentationshastig-hederne for en patient var så ekstremt anormale (afveg med mere end to standardafvigelser fra gennemsnittet af værdierne for de andre patienter), at de ikke blev medtaget. Denne udeladelse forklarer det 10 mindre antal rapporterede observationer for denne variabel.

Middelværdierne og variationskoefficienterne (C.V.) er for hver variabel anført i tabellen. Differencerne mellem middelværdierne blev beregnet ved at subtrahere middelværdien opnået i de perioder, 15 hvor patienterne modtog immunmælk, fra den, der blev opnået i de perioder, hvor de modtog placebo. Et gunstigt respons på immunmælk indiceres ved negative værdier for morgenstivhed (spørgsmål 1) og målelig forandring (spørgsmål 6a, b og c) og ved positive værdier for alle andre variable. Der blev opnået en effektiv respons på 20 immunmælk for alle de ud fra spørgeskemaerne opnåede data. Sandsynlighederne (P) indicerer en høj grad af statistisk signifikans i hvert tilfælde. Den lille middelforskel, der blev opnået for ery-throcytsedimentationshastigheden og rheumatoid faktortiter, var ikke signifikant. Når erythrocytsedimentationshastighederne blev vurderet 25 på individuel basis, havde fire af de 20 undersøgte patienter imidlertid statistisk signifikante formindskelser, medens de modtog immunmælk.

Endskønt immunmælk ikke havde nogen signifikant virkning på middel-30 værdierne for rheumatoid faktortiter, afslørede en undersøgelse af de individuelle patienter interessante respons. Syv af de 20 undersøgte patienter havde negative rheumatoide faktortitere ved i det mindste én lejlighed i den periode, hvor de modtog immunmælk. Fire af dem blev negative i løbet af den periode, hvor de modtog immun-35 mælk, og deres titere blev ikke positive igen i løbet af den følgende 6-måneders periode, i hvilken de modtog kontrolmælken (placebo) som vist i fig. 2. Fortsættelse af undersøgelsen forbi denne rapporteringsperiode afslører, af 13 af 25 patienter mistede den rheumatoide faktor i deres blod.

DK 158138 B

21

Diskussion

Videnskabsmanden, der stod for denne undersøgelse, interviewede personligt hver patient med månedligt mellemrum og nedskrev deres 5 svar på spørgsmålene. Der blev gjort al mulig anstrengelse for ikke at påvirke patienternes svar. Patienterne blev indledningsvis informeret om og blev ofte mindet om, at de i visse perioder af undersøgelsen ville modtage et placebo. Det blev antaget, at denne viden ville tjene som en tilskyndelse for patienterne til at besvare 10 spørgsmålene objektivt og uden tendentiøs forudindtagethed. Patienterne blev på intet tidspunkt informeret om, hvorvidt de modtog immunmælk eller placebo.

Spørgsmålet, der angår indtagen medicin "igår" (sp. nr. 3), og 15 spørgsmålet, der angår guld-, Plaquenil- og cortison-indsprøjtninger (sp. nr. 4), er objektive og er af primær vigtighed ved vurdering af de svar, der er givet på de andre spørgsmål. Disse spørgsmål er vigtige af to grunde: 20 1) Hvis immunmælken er effektiv til lindring af sygdommens symp tomer, må det forventes, at patienten vil tage færre af de medikamenter, der var tilladt ad libitum. Som gennemsnit rapporterede patienterne, at de tog fire færre aspiriner eller hermed ækvivalente pr. dag i de perioder, hvor de modtog 25 immunmælk. De rapporterede også, at de modtog færre guld-ind sprøjtninger, Plaquenil- og cortison-indsprøjtninger i disse perioder, og 2) hvis patienterne tog mindre mængder af analgetika og andre 30 medikamenter, der er nyttige i behandlingen af rheumatoid arthritis, ville man forvente, at de rapporterede om forøget ubehag, med mindre immunmælken påvirkede lidelsen på gunstig måde.

35 Som anført i tabel 2 blev der rapporteret om signifikant mindre ledkomplikationer i de perioder, hvor patienterne modtog immunmælk, selvom de tog færre medikamenter mod deres arthritis.

Patienterne begyndte på undersøgelsen med månedlige mellemrum i

DK 158138 B

22 løbet af en 1-årig periode, og den mælkeprodukttype (immunmælk eller placebo), som de modtog indledningsvis, blev givet tilfældigt. Den observation, at der blev opnået positiv respons eller forbedring for alle spørgeskemaets parametre, og at disse middelresponsa var 5 statistisk signifikante, indicerer kraftigt, at immunmælken havde en gunstig virkning på patienterne. Denne konklusion underbygges af den iagttagelse, at 20% af patienterne udviste en statistisk signifikant (p<0.05) formindskelse af erythrocytsedimentationshastigheden, medens de modtog immunmælk.

10

Resultaterne af de rheumatoide faktortitere er vanskelige at bedømme. Dette skyldes i det mindste delvis det forhold, at de rheumatoide faktorers oprindelse og rolle i ætiologi og for prognose ved rheumatoid arthritis ikke forstås. Rose, H.W., Rogan, C., Pearce, E.

15 og Lipman, M.O., Proc. Soc. Exo. Biol. Hed.. 68:1 (1948) viste, at røde fåre-blodlegemer, der var blevet sensitiviseret med kanin-antistof, undergik agglutination i nærværelse af blodserum fra patienter med rheumatoid arthritis. Prøven afhænger af den specifikke reaktion mellem normal immunoglobulin (enten kanin- eller human-IgG) og 20 rheumatoide faktorer. De af rheumatoid faktor udviste specificiteter er som dem,; der ville forventes af antistof mod IgG (Epstein, W., Johnson, A.M. og Rogan, C., Proc. Soc. Exd. Biol. Med.. 91:235 (1956)). Forekomsten af rheumatoide faktorer er blevet korreleret med sygdomsgraden ved rheumatoid arthritis og kan identificeres i 25 proteiner, der udfældes i væv hos patienter med rheumatoid arthritis. Endskønt en lille procentdel af patienterne med rheumatoid arthritis ikke har positive rheumatoide faktortitere, er der almindelig enighed blandt de fleste rheumatologer om, at positive agglutinationreaktioner ikke vender tilbage til negative, selv når 30 sygdommen er i remission. DeForrest, G.K., Mucci, M.B. og Biosvert, P.L., Arth. & Rheum.. 1:387 (1958) rapporterede imidlertid om et lille antal patienter, som havde positive rheumatoide faktortitere, der efter en remission igen blev negative. Når der indtrådte et udbrud af sygdommen, blev prøven igen positiv. Aho, K., Kirpila, J.

35 og Wayner, 0., Ann. Exd. Fenn.. 37:377 (1959) bemærkede imidlertid, at de fleste patienter, hvis sygdom var blevet inaktiv, forblev serologisk positive. Det forhold, at der blev observeret negative titere hos 60% af patienterne i den foreliggende undersøgelse, og at hos halvdelen af disse forblev titerne negative i seks måneder,

DK 158138 B

23 beviser, at immunmælk påvirker en primær ætiologisk faktor, der er ansvarlig for den rheumatoide arthritis.

Immunmælkens lindrende virkning på symptomerne på rheumatoid arthri-5 tis er navnlig relevant, når den betragtes på baggrund af den i den senere tid beskrevne forbindelse mellem histokompatibilitets-anti-generne (HL-A) og modtageligheden for rheumatisk lidelse (Brewerton, D.A., Arth. & Rheum.. 19:656 (1976). Histokompatibilitet-antigener er genetisk bestemte antigener, som findes på alle humane celler. De 10 gener, som kontrollerer deres arv, kaldes histokompatibilitetsgener.

Der kendes nu over 40 af disse genetisk bestemte antigener. De er ansvarlig for afstødning for vævstransplantationer, der er udført mellem individer bortset fra identiske tvillinger. Overfladisk ligner HL-A-antigenerne ABO-bl odtyperne derved, at de arves for 15 livstid. Deres funktion kendes endnu ikke, bortset fra i den højst kunstige situation, der frembringes ved transplantation. Det vides imidlertid, at histokompatibilitetsgenerne er tæt forbundet med immunresponsgenerne på det sjette kromosom. I denne forbindelse kan de bestemme individets immunrespons på en fremmed invadør, såsom en 20 bakterie.

Personer med HLAB27 synes at være særligt modtagelige for et antal rheumatiske lidelser. Det postuleres, at dette histokompatibilitetsantigen dikterer en type af immunrespons, som i nærvær af andre præ-25 disponerende faktorer fører til rheumatoid arthritis. Efter en tarminfektion med versi nia enterocolitica udvikler nogle patienter en akut periferisk arthritis (Ahvonen, P., Sievers, K. og Aho, K.,

Acta. Rheum. Scand.. 15:232 (1969)). Ligeledes udvikler ca. 2% af patienterne efter en Salmonella-infektion akut periferisk arthritis 30 (Warren, C.P.W., Ann. Rheum. Dis.. 29:484 (1970)). HLAB27 blev fundet hos 43 ud af 49 patienter med yersinia arthritis og hos 15 ud af 16 med salmonella arthritis (Aho, K., Ahvonen, P., Lassus, A. et al., Arth. & Rheum.. 17:521 (1974)). Den mulighed virker tillokkende, at infektiøse agenser eventuelt kan trives i tarmkanalen uden 35 at give anledning til lokale symptomer. Hos patienter med HLAB27 fremkommer et værtsrespons, der resulterer i arthritis. Det er således ikke nødvendigt for det infektiøse agens at få adgang til leddene. Immunmælk virker gunstig på patienter med rheumatoid arthritis, fordi den indeholder antistoffer, der effektivt 5

DK 15 813 8 B

24 inaktiverer eller neutraliserer skadevoldende bakterier oq/eller deres metabolske produkter.

10 15 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af immunoglobulin-IgG-holdig mælk eller herudfra afledt produkt til behandling af rheumatoid 5 arthritis, ved hvilken fremgangsmåde der anvendes en vaccine, som er fremstillet ud fra kulturer af bakteriestammer, der er dyrket i passende dyrkningsmedier, hvorefter bakterierne er blevet dræbt, indhøstet, vasket, lyofiliseret og suspenderet i en til injektion passende vehikel, kendetegnet ved, at vaccinen, der 10 fremstilles ud fra bakteriekulturer af følgende mikroorganismer: ORGANISME ATCC NR. Staphylococcus Aureus 11631 Staphylococcus epidermidis 155

15 Streptococcus pyogenes, A. type 1 8671 type 3 10389 type 5 12347 type 8 12349 type 12 11434 20. type 14 12972 type 18 12357 type 22 10403 Aerobacter aerogenes 884 Escherichia coli 26

25 Salmonella enteritidis 13076 Pseudomonas aeruginosa 7700 Klebsiella pneumoniae 9590 Salmonella typhimurium 13311 Haemophilus influenzae 9333

30 Streptococcus viridans 6249 Proteus vulgaris 13315 Shigella dysenteri ae 11835 Streptococcus, gruppe B Diplococcus pneumoniae 35 Streptococcus mutans Corynebacterium, Acne, type 1 og 2. ugentligt injiceres intramuskulært i sunde køer i fire på hinanden følgende uger og derefter to gange månedligt, at hver injektion DK 158138 B O omfatter 20x10 bakterieceller, at mælken fra de immuniserede køer fra den fjerde uges begyndelse indsamles og prøves for titer til sikring af, at minimumstiteren af antistof mod hver af de af vaccinen omfattede bakterier er 1-500 bestemt ved reagensgiasagglutina-5 tionsmetoden til prøvning for antistoftiter.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den indsamlede, immunoglobulin-IgG-holdige mælk omdannes til mælkepulver. 10

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at den indsamlede, immunoglobulin-IgG-holdige mælk omdannes til et ikke-fedtholdigt mælkepulver.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at immunoglobulinet i mælken eller mælkepulveret udvindes som rent antistof.

5. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-4, kendeteg-20 net ved, at mælken, mælkepulveret, eller det rene antistof optages i en oralt indgivelig vehikel, der ikke er skadelig for antistoffet, og som hjælper med til at forhindre immunoglobulinets destruktion i mave-tarmkanal en som følge af virkningen af proteo-lytiske enzymer og pH-ændringer. 25

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af af de foregående krav, k e n d e t e g n e t ved, at de i vaccinen anvendte bakterier er blevet dræbt ved varmedrab og er blevet indvundet ved centrifugering. 30 35