SE448062B - Sett att framstella ett proteinkoncentrat innehallande immunologiska faktorer herrorande fran mjolk - Google Patents

Description

15 20 25 35 40 448 062 2 i 0 Det anar nu påvisats att satt att 1 man-seriell skala. fram- ställa ett proteinkoncentrat som innehåller immunoglobuliner utan denaturering av dessa under den tekniska processens förlopp.

Denna produkt åstadkommer en lokal, passiv immunisering i tarmen utan resorption och.utan någon märkbar nedbrytning av dess akti- vitet 1 mazsmaitningskañaisn. a i Sättet enligt uppfinningen kännetecknas av följande steg: a Mjölken utvinnes från hyperimmuniserade, mjölkbärande honor.å Grädden och föroreningar frånskiljes, och den klarnade och skummade mjölken koaguleras, varefter kaseinet frånskiljes och proteinerna i vasslan filtreras, ultrafiltreras och steriliseras genom ultrafiltrering, samt produkten indrives och torkas under betingelser som icke denaturerar immunoglobulinerna.och som bi-7 behåller sterila förhållanden. l l D I den medföljande ritningen visas schematiskt de olika stegen i processen. på å l De mjölkbärande honor som användes utgöres av nöt, speci- ellt då av kor. g 1 Den mjölk som behandlas kan vara.av olika typer som är mer eller mindre rika på antikroppar, såsom râmjölk (cclostrum), övergångsmjölk (mjölk från de 8 dagarna.efter kalvning) eller mjölk från laktationsperiodens slut (de 2 sista månaderna av W mjölkutsöndringen). Lämpligen behandlas en blandning av dessa mjölktyper för erhållande av en hög antikropphalt under så lång tidsperiod som möjligt. i 7 Hyperimmuniseringen av kon genomföres medelst en kombinerad. vaccination. Exempelvis åstadkommes den genom intracisternal in- fusion i mjölkkörteln, parenteral injektion (subkutan eller intra- venös), injektion i det retromammära ganglionsystemet, skarifi~ kation, oral intagning eller genom en kombination av flera av dessa sätt. D l Det är att föredraga att en kombination av dessa sätt an- vändes enligt ett immuniseringsschema som är noggrant uppgjort för erhållande av en tillfredsställande antikropphalt i varje typ av använd mjölk. Förframjöiksn och övargangsmjöiken är sålunda vaccineringen parenteral och intracisternal under de 8-2 veckorna före kalvningen, och oral under veckan före kalv- lningen. i i a É För mjölken vid laktationstidens slut genomföres alter- nerande en parenteral, lokal och oral vaccination med början F” 10 15 20 25r as 448 062 3 2 och en halv månad före det antagna slutet av mjölkutsönd- . uringen. _ Det använda vaccinet utgör lämpligen en blandning av den utvalda antigenen och ett tillsatsmedel på basis av homologt blodserum från immuniserade kor, vilket på detta sätt möjliggör en detoxifiering av vaccinet och bildning av immunokomplex. j När kor användes som produktionsdjur utgöres de Ig som ingår i proteinkoncentratet väsentligen av IgG (speciellt av IgGl) till skillnad från modersmjölk, vilken som övervägande Ig innehåller IgA.' j de Halten av lg i det proteinkoncentrat, vari proteinerna utgör 70-80 viktprocent; utgör 25-35 viktprocent. Vissa fördelar när förbundna.med det förhållandet, att vid genomförande av pro- _cessen Ig icke skiljes från de övriga vassleproteinerna, vilka således även föreligger i det erhållna koncentratet. På detta _ sätt undvikes processerna.med selektiv_utfällning, exempelvis med ammoniumsulfat, och dialys.

Vidare återfinnas 1 proteinkoncentratet vissa bakterio- _ statiska eller antivirala faktorer,_exempelvis laktoferrin ueller enzymsystem, såsom laktoperoxidas och ribonukleas, vilka finnes närvarande i vasslan. nivarje typ av antigen av viralt eller bakteriellt ursprung kan-användas, och de erhållna.antikropparna.är beroende av typen av de antigener som administreras till kon. Man kan exempelvis erhålla ett skydd mot enteropatogena bakterier och virus som åstadkommer gastroenteriter, åtföljda av kraftig diarré med dehydratisering, genom införlivande av det protein- koncentrat som innehåller Ig 1 varje bärare som är lämplig för oral administrering. Denna bärare kan utgöras av någon excipi- ent, eller företrädesvis av en dietisk produkt, såsom mjölk eller mjölkpulver för småbarn, s.k. "humaniserad" eller för 7 spädbarn anpassad mjölk, eller en mjölk som är speciellt an- passad till en speciell grupp av nyfödda, exempelvis en mjölk till för tidigt födda barn eller barn med undervikt vid föd- seln, etc. Öm man exempelvis önskar använda ett koncentrat som inne- _håller Ig anti E. coli i profylaktisk dos med en mjölk som bärare, införlivas 0,8 - 3 gram koncentrat i 100 gram torrsub- ugstans, och upp till 6 gram i terapeutisk dos. lo ' 15 20 25 35 448 D62. 8 84 lFör genomförande av förfarandet är-det nödvändigt att se till att skumnings- och klarningsprocesserna är mycket långt- gående för att en följande igensättning av filtren och ultra- filtren skall undvikas. Skumningen genomföres lämpligen i två steg, först i kyla för att avlägsna huvuddelen av fettsubstan- ser och föroreningar (exempelvis det blod som ofta ingår i rå- mjöiken), och seaan_i värme för att fu11standigfi frånskilga dem.

Koaguleringen kan genomföras vid kaseinets isöelektriska pH- värde i närvaro av löpe med tillsats av svra,_exempelvis citron- syra. Det är lämpligt att genomföra koaguleringen genom till- sats av syra, exempelvis saltsyra, till ett pH av cirka 4,6, samt värmn1ng_t111 4o°c. Frånsk11¿anaee av kaseinet åtföijes av en klarning av vasslan för att frånskilja fint material.

Det är vidare nödvändigt att genomföra de processer som erfordrar en värmebehandling (indrivning och torkning) under sådana betingelser att inaktivering av Ig undvikes.

För att minska förlusterna av Igg av vilket en del bort-l går med grädden vid skumningen och en ytterligare del med kaseinet när detta frånskiljes, är det lämpligt att extrahera grädden och ostmassan med vatten och att behandla det tvätt- vatten som innehåller Ig för återvinning.

De följande eåemplen, i vilka mängder och andelar är räknade efter vikt, såvida intet annat angives, visar hnr uppfinningen kan genomföras. 8 _ Exempel 1.8 Kor av olika raser hyperimmuniseras enligt det följande schemat med ett vaccin, vars framställning angives i det följande, och mjölken uppsamlas från de två sista månaderna av mjölkutsöndringen och från de 8 första dagarna efter kalv- ning. 7 8 7 7 Framställning av vaccinet1l De följande enteropatogena.serotyperna.av E.coli användes: o 18 =lK 76g (B 20) g g- o 111 = K 58 g(B 4) o 20 = Kl17 (L) 8 112 = K 68 (B 11) o 26 : K 6o l(B 6) 119 = K 69 (B 14) go 44 = K 74 (L) 124 : K 72 (B 17) 0æ=Kæ mm 1æ=KwABm o 78 = K 80 (-) 126 3 K 71 (B 16) o 86 = K 61A (B 7) 127 ; K 63 (B 8) 4' “ 4 128 =8K 68 (B 12) O_OOO_OOO t: LL I) 15 20 448 062 5 De olika stammarna.härrör från fall av gastroenterit hos barn, inlagda på sjukhus. Serotyperingen genomfördes med anti- sera av multityp och envärda sera (Difco). Bakterierna odlades i minimal vätskemiljö, innehållande 2% aminosyror, härrörande från kasein (kasaminosyror Difco) och 2% glukos under 2& timmar vid 3700 utan omblandning i odlingskärlen.'För inaktivering av bak- terierna uppdelades odlingarna genom centrifugering i sedimen- terade celler och överstående vätskefas. Cellerna.bringades åter i suspension och inkuberades vid 3?°C under QÄ timmar i närvaro av 0,5% formaldehyd, medan överfasen inaktiverades på angivet sätt, men med 0,05 %'formaldehyd. Efter en ny centrifugering och eliminering av överfasen bringades bakterierna åter i suspension i den ursprungliga, inaktiverade överfasen. Detta.förfarande möjliggör bibehållande av överfasen, vilken innehåller bakteri- ella exotoxiner-för vaccinet. Ett vaccin erhölls med 1-2 x l09 bakterier per ml, vilket därefter späddes genom blandning med en 2-procentig lösning av Al(OH)3 och homologt blodserum från immuniserade kor. - Immuniseringsförfarande A. Följande schema visar immuniceringen för erhållande av råmjölk och övergångsmjölk som innehåller immunoglobiner för anti-E.coli. Den antagna dagen för kalvningen betecknas med-Xf Behandlingstid Vaccin + ev. tillsats Administreringssätt X --8 veckor 05 ml vaccin (5 x'1o7 X - 7 vegkor X - 6 veckor X - 5 1/2 veckorg X - 5 veckor X - 4ïl/2 veckor bakterier/ml + 5 ml serum 5 ml vaccin (5 x 1070 bakterier/ml) 0 c+ 5 ml 2% A1K(oH) + 5 ml serum 10 mi vaecin (5 x 107 bakterier/ml 20 m1 vaccin (5 X 107 bakterier/ml) W + 10 ml 2% Al (OH)3 40 ml vaccin (5 x 107 -(bakterier/ml) + 20 ml serum 24 ml vaccin (5 x 10 bakterier/mlx 8 _+ 8 ml serum subkutan injektion intravenös injektion subkutan injektion injektion i det retro- mammära ganglio- systemet infusion av 4 X-15 ml i ijuvret genom spen- kánalerna subkutan injektionxx 10 448 062 forts} Behandlingstid Vaccin + ev. tillsats Administreringssätt X - 4 veckor 40 ml vaccin (5 x 107 bakterier/ml) + 20 ml serum infusion av 4 X 15 ml i juvret geno spen- kanalerna X - 3 veckor 10 ml vaccin (5 x lO8 subkutan injektion j bakterier/ml) X - 2 veckor 5 ml vaccin (5 x 108 intravenös injektion bakterier/ml ' + 5 ml 2% Al (OH)3 X - l.vecka ' 100 ml accin oral intagning (l x 10 bakterier/ml) under idisslandet X - l vecka 100 ml accin oral intagning (l X 10 bakterier/ml) under idisslandet K Dessa serumtillsatser genomföres endast i de fall när kon immuniserats för första gången. xx Denna.subkutana injektion fördelas i lymfsystemet på följande sätt: 5 2 x 4 ml i de preskapulära lymfkörtlarna 2 x 4 ml de postskapulära lymfkörtlarnaa 2 x 4 ml i ljumskens lymfkörtlar 2lx 4 ml i knäveckens lymfkörtlar |Jå B. Följande schema visar immunisering för erhållande ay emjölk från laktationsperiodens slut (de 2 sista.mânaderna.aNe laktationen), innehållande immunoglobulin anti-E.coli. Denna immunisering genomföres endast på kor,.vilka redan immuniserats under perioden med råmjölk och övergångsmjölk. Den antagna dagen för mjölkutsöndringens slut betecknas med X.

»Behandlingstid Vaccin + ev. tillsats Administreringssätt x - 70 dagar 5 mi vaeein (5 x 1o7_ intrarenöe injektion 5 bakterier/ml i i + 5 m1 2% A1 (oH)a3 X - 65 dagar 20 ml vaccin (5 x 1082 injektion i det retro- .~ bakterier/ml) mammära ganglionsystemet x - 60 dagar 24 mi vaeein (5 x 108 eublewean injektion” 5 bakterier/ml som i A enligt ovan) X - 55 dagar 1oo mi vaeein (1 x 109 erai incagning under 2 “ ibakterier/ml) A idisslande X - 50 dagar 40 ml vaccin (5 X 107 infusion i juvret som bakterier/ml) _ " enligt A ovan f ve) *(1 EE* '10 15 20 25,- 448 062 bakterier/ml) 7 ' forts.

Behandlingstid Vaccin + ev; tillsats Administreringssätt .X - 40 dagar- 5100 ml vaccin (l-X 109 oral intagning under bakterier/ml) idisslandet X - BQ dagar ' 20 ml vaccin (5 X 108 injektion i det- D bakterier/ml) ' rektromammära ganglion- 0 ' systemet _ X - 25 dager 40 ml vaccin (5 x 107 infusion 1 juvret som 5 bakterier/ml) enligt A ovan X --10 dager 5 100 ml vaccin (1 X 109 oral intagnlng under idisslandet c - Exempel 2. Mjölken från de åtta första dagarna efter kalvning, uppsamlad från kor som vaccinerats enligt exempel 1, behandlas på följande sätt: Skumningen genomföras i två steg, Steg A i kyla och Steg B ä ei värme.

A: 1100 kg mjölk ledes i kyla.genom en centrifugalsepara- (tor till ett buffertkärl om 2500 liter, varefter den pumpas till en centrifugavskiljare med hög acceleration (cirka ll OOO g) för-avlägsnande av blod och föroreningar (slam).

B: Den kalla, renade mjölken lagras i en behållare om - 2500 liter och pumpas genom en till 400 inställd värmare till den separator, som redan i det föregående använts, så att på detta 'sätt frånskiljes 110 kg grädde, vilken tillveraxeges, och 5 kg slam, vilket förstöras. Som variant kan en självrenande skumnings- anordning användas i skumningsprocesserna i kyla och i värme, och en_renare mellan dessa processer, så att på detta sätt tiden för skumningen minskas.

Den skummade och renade, varma mjölken (985 kg) fördelas därefter i 4 fyrkantiga koaguleringskar om vardera 750 liter och försedda med omblandare för koaguleringsprocessen, En l N saltsyralösning tillsättes vid 37°c tills ett pH av cirka 4,6 - stabiliserats och temperaturen upprätthålles under omblandning i 20 minuter. Därefter kyles det hele till cirka l5°c§ 5 Den följande processen utgöres av frànskiljande av kaseih.

Den består av två centrifugeringar i serie av den skummade, koae lgulerade och brutna.mjölken. I den första frånskiljes huvuddelen av det koagulerade kaseinet medelst en självrenande klarnare, vilken frånskiljer 150 kg kasein, och vasslan ledes till en buffertbehållare. Den andra centrifugeringen avlägsnar varje 10 ,l5 20' 25 35 40 448 062 7 8 , spår av partiklar som skulle kunna.hindra.den följande filtrerings- och ultrafiltreringsprocessen, och exempelvis användes en oentri- fugrenare, som använts i processen A för skumningen. 854,7 kg renad vassla erhålles, vilken pumpas till en behållare om 2500 liter.

Därefter genomföras en filtrering och sedan en ultrafiltre- ring av vasslan. Filtreringen bör vara mycket ingående för att undanröja varje svårighet vid ultrafiltreringen. och frånskilja mycket fina kaseinpartiklar. Den genomföras medelst filter Seitz Supra 100 i plattor om 20 x 20 cm. Filtratet förvaras i en behållare på 3000 liter, varefter det pumpas till ultrafiltret.

Ultrafiltreringen genomföres i två eller tre steg med återföring av retentatet till behållaren. Två seriekopplade centrifugal- pumpar åstadkommer tillförseln mot ax inloppstryck i ultra- filtrets inloppsbehållare av cirka 700 kPa, och vid utträdet hålles trycket vid cirka 450 kPa. För att undvika en återvärmning av retentatet genom den från pumparna.tillförda energin, kyles det till cirka. io-1;z°c. 0 Det första steget i själva.ultrafiltreringen_möjliggör fràn- skiljande av löst material med hög molvikt, proteiner, vilka kvarhålles av membranet ooh återfinnes i retentatet, medan en del av laktosen, vitaminer, mineralsalter och vatten avgår med per- meatet. Med användning av en modul DDS med membran 800 (membran- yta 7 m2) är förhållandet mellan retentat och permeat cirka l till 3,1, varvid erhålles 580 kg permeat I och 274,7 kg retentat med en medelavgivning av 14,17 kg permeat per m2 och timme.

Det andra steget utgör en diafiltrering, under vilken till retentatet kontinuerligt sättes 825 kg vatten, och lösningen bringas att cirkulera under samma betingelser som i det första .ja steget. Diafiltreringen avbrytes när permeatets elektriska led- ningsförmåga uppnår det önskade värdet, varvid förhållandet mellan retentat och tillsatt vatten är cirka l till 3. På detta sätt åtskiljes 825 kg permeat II och 274,7 kg retentat med en medelavgivning av 11,77 kg permeat per m2 och timme. Det tredje steget utgör en koncentrering, vilken eventuellt genomföras medelst återföring av retentatet till membranet till en torr- \ substanshalt av cirka l0 %, genom eliminering avf82,5 kg permeat III. På detta. sätt erhålles 192,2 kgpförkoncentrerad lösning.

I en variant uteslutas detta tredje steg, och sterilfiltreringen 'ha genomföras direkt. 'Én ß f io 15f 20"' 25, - 35 40 448 Û62f 9 a _ Sterilfiltreringen utgör ett viktigt steg i de samlade pro- ' cesstegen, eftersom värmebehandlingar icke kan tillämpas för sterilisering, då de medför en denaturering av immunoglobulinerna.

Sterilfiltreringen avlägsnar från retentatet de mikroorganismer som fortfarande kan föreligga (huvuddelen av dessa har redan peliminerats vid fränskiljande av grädden, kaseinet och slam).

För att undvika igensättning av sterilfiltren erfordras en slam- avlägsning genom centrifugering och-en trippelfiltrering av retentatet. Efter avlägsnandet av slam lagras retentatet i en behållare och ledes genom en filtreringslinje, innefattande en förfiltrering genom trippelfilter Seitz Supra.l00, EK och EKS, anbringade i serie, âtföljd av sterilfiltrering genom filterf Seitz Supra 20 och Millipore HA 0,45 pm, anbringade i serie och fi förväg steriliserade med överhettat vatten. Det sterila retentatecg1agras_1_en steril benå11are_om 5oo liter.

Samtliga.av de slutliga processerna genomföres under ste- rila betingelser. Överföringen till det följande indrivninge- esteget kan exempelvis åstadkommas med hjälp av komprimerad och sterilfiltrerad kvävgas.

Indrivningen åstadkommes med en tunnskiktsindunstare (med fallande vätskefilm med ytan 1 m2) vid en värmningstempera- tur av 7500, varvid produktens temperatur är cirka 30°C, till en -torrsubstanshalt av minst 20 %; För undvikande av varje infektion genomföres överföringen medelst en peristaltisk pump från reten-_ tatbehållaren till koncentratbehållaren, vilken är förbunden W med ett kretslopp som innefattar indunstaren, så att koncentre- ringsprocessen genomföres i sluten krets. Detta.arbetssätt på- verkar icke aktiviteten hos immunoglobulinerna. 7 _Koncentratet (96 kg) torkas därefter medelst någon lämplig metod, exempelvis genom frysning, åtföljd av frystorkning. Frys- ningen kan genomföras på plattor vid -40°C. Immunoglobulierna _kan förvaras vid -3006 utan aktivitetsförlust under cirka 45 in dygn; Produkten vid -30°C frystorkas på plattor vid ett tryck av 66 Pa och en temperatur i kondensorn om -5000 och plattorna värmda till 30-35°C. Torkningssättet påverkar icke aktiviteten fnos immunogiobuiinernal På detta sätt erhålles 19,1 kg torr pprodukt, innehållande-25-35 % immunoglobuliner,'vilken förvaras sterilt.

»Exempel 3. Vid förfarande som i exempel 2 med behandling av mjölk från de första àtta.dagarna.efter kalvning och den mjölk 10 15 20 25 35 ÄO 448 062 _ 10 som uppsamlas under de sista 4 veckorna av laktationen erhålles ett proteinkoncentrat med följande medelsammansättningz Proteiner 75 Ü 5 % J |+ 40 _ 15 35 5 5 51% immunoglobuliner |+ 5 % a-laktalbuminer 5 ä ß-iakvógloßïiimaeí- l+ |+ 2 %dseruma1buminer l+ 2l% andra proteiner i mindre mängder kvarvarande fukthait _ 4 “I o, 5 e 'laktos , ' i e “ 1o “S 2 yá mineralsalter _ f5 É 2o % kvävehaltiga substanser, andra _+, -an proteiner 5 5 - 2 % Exemgel 4. Förfarandet genomföres som 1 exempel 2, med den skill- naden att grädden och kaseinet extraheras med vatten för åter- vinnande av en del av de förlorade immunoglobulinerna, varvid tvättvattnen återföres till framställningskedja.

Skumingen i kyla (Steg A) genomföras med en parallell linje för vattenextraktión av de proteiner som innehåller immuno» globuliner som medförts av grädden. Grädden från den första centrifugeringen (115 kg) förvaras 1 en behållare på 1000 liter smed omrörare och blandas med 150 kg ljummet vatten vid 40°C, var» efter det hela omblandas i'30 minuter och centrifugeras i sepa~ rator. På detta sätt åtskiljes ll5 kg grädde och 150 kg lösning, vilken sammanslås med den skummade och renade mjölken. Härvid erhålles 1130 kg vätska, vilken ledes till sknmningen i värme (Steg B) och koaguleringen.

Frånskiljandet av kaseinet ger med utgående från 1145 kg skummad, med löpe försatt och surgjord mjölk 991 kg vassla och 154 kg kasein. En parallell produktionslinje möjliggör en extrak~ tion av den proteinandel som innehåller immunoglobulinerna med vatten från koagulatet.oKoagulatet förvaras vid utträdet från klarnings- och reningscentrifugen i en omrörarförsedd behållare och omblandas med 300 kg ljummet vatten vid 4000 under 30 minuter, samt ledes till en kolloidkvarn. Den finfördelade koagulatsuspen~ sionen uppdelas därefter i en klarnings- och reningsanordning. 154 kg tvättat kasein utvinnes och 300 kg tvättvätska, vilken sammanslås med vasslan för de följande processerna. 1291 kg vassla filtreras och ultrafiltreras, varvid erhålles 2010 kg per- meat (I, II och III) och 2l6 kg förkoncentratß Indnnstningen ger 0,-, 10 15 20 25 ss, no, 448 062 ll 108 kg koncentrat, vilket vid torkning ger 21,6 kg torr produkt.

På detta sätt utvinnes cirka l4í% mer av immunoglobuliner i förhållande till processen enligt exempel 2.o Exempel 5._ l kg av det enligt exempel 2 eller 4 framställda ,pulvret, respektive 2_kg av det enligt_exempelf3 framställda pulvret blandas homogent med lOO kg mjölkpulver, och blandningen konditioneras sterilt för erhållande av en produkt, vilken inne- ghäller en profylaktisk dos av immunoglobulin; för en närings- tillförsel av 587 kJ per kg och dag, svarande mot 250 mg Ig- koncentrat per kg och dag, framställt enligt exempel 2 eller 4, "V respektive 500 mg Ig-koncentrat per kg och dag, framställt enligt exempel 3. e f- 'i - Exempel 6. Olika prov in vitro och in vivo har genomförts med proteinkoncentratet enligt exemplen 2 och 4, i det följande be-, nämnda "Ig-koncentrat", för att påvisa dels att immunoglobu- linerna från mjölk har en specifik antikroppverkan som normalt påvisas hos mänskliga immunoglobuliner, och att denna bibehålles under framställningsprocessen, dels att de specifika immuno- globulinerna från mjölk uppvisar en skyddande verkan och inverkar -på de patogena verkningarna hos de cnteropatogena.mikroorganis- amerna. 9 Passiv hemagglutinering a _ _ Röda blodkroppar från får.sensibi1iserades med ett karba- midextrakt av“en specifik serotyp av E.coli} Detta.extrakt fram- ställdes enligt Brodhage IH. Brodhage, (1961), J. Hyg., 1961, lšê, 9H1Å Bakterierna odlades på näringsagar (Difco) vid 3700 under.3O timmar i Roux-kolvar. Odlingen uttogs med 10 ml fosfat- buffraa saltlösning (8,8 g Nasi + 1,86 g Na2HPo4.2H2o + 0,43 g KH2PO¿ per 1000 ml H20) vid pH 7,2. Efter tillsats av 10 gram karbamid (Merk), fick suspensionen stå under 90 timmar vid 37°C med långsam omrörning. Efter centrifugering dialyserades över- a fasen-fullständigt mot en fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,2, späddes till en slutvolym av 50 ml med fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,2 och frystes i smàportioner vid -20°C. Sensibiliseringen av röda blodkroppar från får med detta.antigen genomfördes medelst en kombination av metoder enligt Avrameas et coll. (S.Avrameas, B. Taudou, S. Chuilon, Immunochemistry, 1969, Q, 67) och enligt Otto et coll. (H. Otto, H, Takamíya, A. Vogt, J. Immunol.Methods, 1973, Q, 137). De röda b1odkropparna.från får förbehanaiaaes X med glutaraldehyd (slutlig halt av röda blodkroppar från får 5 % p448 oe2_ D 12 och 0,5 % glutaraldehyd) varefter de tvättades och bringades i suspension till 20 %oi fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,2, samt blandades med samma volym karbamidextrakt. Efter 16 timmars inkubering vid 2000 under mild omrörning tvättades de sensibili- serade röda blodkropparna.från får flera gånger och bringades i suspension till l % för omedelbar användning. De röda blodkrop- parna från får kan förvaras i 10-procentig suspension vid 400 under flera veckor. p Före filtrering skall varje undersökt prov absorberas på 'röda blodkroppar av får som förbehandlats med glutaraldehyd (0,1 ml sedimenterade röda blodkroppar från får till 1 ml Ig- koncentrat, 37°C, 60 minuter). p Titreringarna.genomfördes enligt systemet Microtiter (J.L. Sever, J. Immunol,, 1962, §§, 320, och T.B. Conrath, Handbook of Microtiter Procedures, l972) med användning av poly- styrenplattor med V-formade håligheter. En serie utspädningar om vardera 50 pl genomfördes med normalt kaninserum, utspätt till l/200, och 25 pl av sensibilisezade röda blodkroppar från får i l % sattes till varje utspädnirg. En serie bereddes med t de icke sensibiliserade röda blodkro1parna.från får som kontroll- prov för icke specifik agglutinering. Resultaten avlästes efter 2 timmar, och titern-för hemagglutineringen angavs av en sista utspädning som gav en tydligt positiv reaktion." De resultat som erhållits för 5 serotyper av E. coli an- gives i följande tabell: Serotyp av E.coli W Agglutin titer of 55 p 1/2561 o p111 1 1/ 64 o - 119 ' 1 1/128 o 127 of 1/128 o 128 1/ 64 kontroll Bakteriostatisk aktivitet in vitro .

Den bakteriostatiska aktiviteten på tillväxten av olika serotyper av E.coli vid tillsats av Ig-koncentrat till odlings- miljön undersöktes.-Systemet Microtiter användes, anpassat för odlingen, vilket sålunda möjliggjorde användning av minimala provmängder och samtidig undersökning av ett maximalt antal prover. D o u få: flïë. m 1o 5 15 20 25 30 448 062 13 I Varje odling hade en slutvolym av 0,25 ml, antingen i en minimimiljö som innehöll l % glukos, eller i en rik odlingsmiljö.

För varje undersökt värde på inkuberingstiden uttogs två prover för att minska riskerna för fel från volymvariationer. Utvärde- ringen genomfördes genom dubbel beräkning av prover på 10 pl på 5 plattor av näringsagar.

Bakterieympkulturen bestod av en utspädning av en 16 timmars iodling i minimal-miljö, innehållande l-2 x lO« bakterier per ml.

Inkuberingen genomfördes i fuktig atmosfär vid 37°C. Ig-koncentra- P tet sattes i sluthalter av-l ag/ml, 10 pg/ml,*lOD ug/ml och 1 mg/ml till odlingsmiljön före inympning med 2 x 10 E.coli/ml.

En tydlig inhibering pàvisades av tillväxten hos E.coli O lll: B4 dunder de 4 första timmarna av inkuberingen vid en halt av Ig- xoncentrat av 10 ng/mi. I Jämförelse med xontroliprovet, be- g stående av enbart odlingsmiljön,_visade sig en överlägsen till- växt i närvaro av l mg/ml av normala proteiner från vassla, er- hållna med utgående-från icke immuniserade kor, Eliminering av E.ooli O lll:B4 hos möss För varje provning användes 8 möss (schweiziska vita han- n möss, på 20-24 gram), 2 som kontrollprov och 6 för 3 prövningar, åvardera utfört två gånger; Samtliga möss erhöll en subkutan in- jektion av 0,1 ml heparin (500 IE/ml), En lösning från 16 timmars odling av E.coli O lll:B4 späddes till en tiondel med steril saltlösning och späddes sedan till en hundradel genom tillsats av serum från kalvfoster (Difco), utspätt till en tiondel för kontrollproven och innehållande 3 valda halter av Ig-koncentrat. 0,2 ml av den erhållna lösningen injicerades intravenöst i svansvenen; varvid varje mus (2 möss §ör_kontrollprovet och 52 x 3 för proven) erhöll cirka 2 x 100 bakterier; där utgångs- bakteriesuspensionen innehöll 109 bakterier per ml. Omedelbart efter injektionen (vid tiden-O) och efter 20, 40 och 60 minuter genomfördes enïflodpunktion av 50 pl från ögonvenernas plexus medelst kalibrerade och heparinbehandlade kapillärrör, och lproverna överfördes omedelbart till 5 ml steril saltlösning (blodutspädning lO'2) och späddes därefter till lO'3 och lO"A i saltlösning. Räkningen genomfördes på agarplattor (Difco) medf l ml av varje utspädning och index för fagocytos k bestämdes enligt Biozzi et.coll. (G. Biozzi, C. Stiffel, B.N. Halpern,' L. Le minor; D. masten, J; Immunoi., 1961, §1, 296): 10 15 448 062 14 log C - log C K _ l 2 i Ta ' Ti _, Cl och 02 betecknar-resultatet från räkningarna vid tiderna ” Tl Och T2.

På detta sätt observerades en normal minskning av bakterie- antalet genom eliminering i det retikulo-indoteliala systemet i närvaro av fosterserum från kalv, medan en tillsats av 10 pg av Ig-konoentratet till injektionslösningen åstadkom en elimine- ring av 99,6 % av bakterierna från blodströmmen inom 20 minuter.

Resultaten sammanfattas i följande tabell: tid bakterier i % av ursprungliga antalet (minuter efter ' vid tiden60 efter intravenös injektion injektion av av 2 x 10 E.coli 0 lll:B4 E.coli) Kontrollprov 1:10 Prover, Igfkonoentrat fosterserum av kalv 1000 ng 100 pg 10 pg O 2 0 0 100 100 100 100 20 _ 27,8 0,14 i 0,22 0,4 40 ._l5,5 0,02 0,02 7 0,12 600 - 10,0 0,02 0,02 0,06 Specificiteten hos behandlingen kontrollerades genom ut- tömmande absorption av Ig-koncentrat med serotypen 0 ll1:BÄ av 0E.coli, och det har visat sig att denna absorption förintar praktiskt taget all förstärkande aktivitet av fagooytosen, även med en mängd av 1 mg Ig-koncentrat. 6 t Den följande tabellen visar fagooytosindex K, erhållna på 20 minuter: * 0 Kontrollprov l000 pg Ig- 1000 pg 1:10 fosterserum koncentrat, Ig-koncentrat, av kalv icke absorberat absorberat K 0,015 0,128 0,039 Skvddsnrov hos möss ' Logaritmiska utspådningar (logïo) bereddes|av en odling av - E.co1i 0 lll:B4 1 näringsbuljong (Difoo), innehållande 103 bakte~ ricr par ml för erhållande av utspädningar med l0"n, l0'5, l0“Ö och 10-7 i 5 % mucin (kornat mucin av typen 1701-W för potentie- ring av virulensen hos bakterier från Wilson Laboratories, Chicago, Ilimois) . i ' 3,.

(El.

'Vf i' lO '15 20 paktiva fragment i matsmältningsapparaten. 5448 062 15 3 ml av varje utspädning blandades därefter med 0,6 ml provlösning, av saltlösning, respektive av lg-koncentrat och av proteiner från normal vassla (icke immunicerade kor). Med an- vändning av 5 möss för varje utspädning injicerades 0,6 ml av den erhållna blandningen på varje mus intraperitonealt. Resul- taten från utvärderingen av antalet döda möss per 5 behandlade möss efter 48 timmar angives i följande tabell: Antal döda möss per _5 behandlade möss Provat material 5 Halt av bakterier i behandlingen 5 x 10' 5 5 X 103 5 X 102 5 x 101 saltlösning a 5 5 5_ 5 5 ~5 10 p 5 Ig-koncentrat x ' 5 ' a 5 5 3 25 .n a ' Ig-koncentrat x ~ ' 5* p p 5 5 0 0_ 100 y 5 5 5 lg-koncentrat x - O. pp O O 0 10 p 7 I proteinerpfrån normal vassla d(icke immuniserade kor) 5 5- 5 5 - 5 25 M proteiner från _ normal vassla 5 5 5 5 l00 M proteiner från normal vassla ~ 5 5 5 5 X beräknat som totalproteiner, innehållande 35-45 % immuno- giobuiiner från mjölk.

Det har visat sig att lOO pg av Ig-koncentrat gav ett full- dständigt skydd för samtliga provade bakteriehalter, medan 100 pg -av proteiner från vassla.som isolerats med utgående från mjölk av icke immunicerade kor icke gav något skydd.

Exempel 7. ' - _ a I: En första.serie av kliniska försök_visar att immunoglobu- liner från mjölk motstår den proteolytiska.nedbrytningen till in- ll barn (9 pojkar, 2 flickor), vilka inlaàts på sjukhus av olika orsaker, men som icke led av gastroenteriter, och vars ålder varierade från 2 veckor till l år erhöll till näring en mjölk, innehållande ett lg-koncentrat som framställts enligt exempel 2 eller 4 i en isokalorisk dos, svarande mot 2 g per kg V1' 10 15 20 25 35 40 448 062 « 16 kroppsvikt och jämnt fördelad över 24 timmar. Den första.och den sista måltiden med införlivandet av lg-koncentratet märktes med 0,2 g karminrött. Minst ett avföringsprov upptogs före tillför- seln av Ig-koncentratet, och systematiskt tillvaratogs samtlig följande avföring under 72 timmar, varvid proverna förvarades vid -2o°c, i i i , vtrakt av avföringen framställdes genom tillsats av tvâ delar avföring till en del fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,2 och dispersion av avföringen vid 0°C med en glasstav. Suspensionen omblandades därefter under 20 minuter med en miniblandare (400 varv per minut) vid rumstemperatur, Därefter kyldes suspensionen snabbt vid 0°C och centrifugerades vid denna temperatur med 3500 g under 15 minuter. Överstående vätska tillvaratogs där- efter noggrant. i p -Närvaron av aktiva immunoglobuliner i avföringsextrakten bekräftades genom dubbel immunodiffusion (Ouohter1ony's prov) och genom immunoelektrofores. De antisera som användes i dessa provningar framställdes genom upprepade subkutana.och intra- venösa injektioner av l mg antikroppar från mjölk eller 0,1 mg Ig Gl hos kanin. För Ouchterlony's prov belades glasplattor (94 x 84 mm) med ett skikt av l % agargel i en fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,2, och i skiktet upptogs håligheter om 4 mm med 9,5 mm avstånd med en hålpipa (LKB-produkter AB), med användning av ett antiprotein-antiserum från vassla av rå- mjölk från nöt och ett specifikt, envärt antiserum-anti-IgG från komjölk. _ För immunoelektroforesen.belades glasplattor (100 x 85 mm) med 12 ml l-procentigt agargel i 0,05 M barbiturat, buffrat till pH 8,3 (lO,3 g natriumbarbiturat + 0,5 g oitronsyra.+ 0,5 g oxal- syra till l liter vatten) och den elektroforetiska separationen genomfördes vid rumstemperatur under 90 minuter vid 4 volt/cm.

Efter diffusion av antisera (2Ä timmar) tvättades plattorna.med saltlösning, torkades och framkallades med azokarbin B.

Närvaron av immunoglobuliner från mjölk påvisades i av- föringcn trots avsevärda variationer i tiden för deras upp- trädande och i tiden för utsöndrandet av immunoglobulin, liksom även en god motsvarighet mellan uppträdandet och'försvinnandet av den röda karminmärkningen och immunoglobulinerna.

För bekräftande av aktiviteten hos dessa immunoglobuliner 1 från mjölk genomfördes provet in vivo med serumskydd hos möss fä.

UV 10 15 __ 5448 062 17 (som beskrives i exempel 6) med användning av 6 avföringsextrakt U från varje serie, och resultaten sammanfattas i följande tabell: Antal döda möss per _Avföringsextrakt Ia-intensitet i 5 behandlade möss âšíâïiâšâïšíïššëšo- 13,333;- ggrgfigråefâ m- foretisk undersökning lingeh e an ' _5><1o4 5x1o3 5x1o2 sxioï Barn M.D, I _____ 5 5 5 5 (2 veckor) II _ 5 5 5 5 i i Iv ' I i ++++ 2 1 o o V _ _ ++++ O O 0 O i VI f +++ 1 1 o o in i ' _____ 5 5 3 4 BarnlS.G. j i I + 5 ' 5 5 5 (1. månad) III t - 4 5 5 5 i Iv . » ++++ o o o o VI i ++++ o o o ,o X pt, ++ 53 0 l O XI ' + 5 2 o o _Ett klart samband kan påvisas nellan de positiva resultaten vid immunoelektroforesen och den_skycdande verkan hos det material som ingår i avföringsextrakten. Speciellt kan det uppskattas att halterna av immunoglobulin från mjölk i extrakten V (barnet M.D.)5 och IV och VI (barnet S;G.)_svarar mct minst l mg av lg-koncentrat.

II: rI en andra serie av klinifika försök har de terapeu- 5 tiska och profylaktiska egenskaperna.undersökts hos Ig-koncentrat, framställt enligt-exempel 2 eller 4. tTerapeutiska egenskaper Denna undersökning genomfördes med barn upp till 5 månader och som drabbats av godartade till akuta gastroenteriter, fram- kallade av E.coli. I olika provserier administrerades till totalt 152 patienter antingen 2 gram lg-koncentrat per kg och dag under 5 dagar, eller l gram per kg och dag under 10 dagar i deras näring. 1Patienterna erhöll icke något läkemedel, såsom sulfamider eller dantibiotika, vare sig oralt eller parenteralt. Faecesodlingar genomfördes varje dag efter en administrering, den sista mellan 36 och 48 timmar efter den sista administreringen av Ig-koncentrat. 43 patienter behandlades på samma sätt, varvid dock Ig-koncentratet 20 25 35 40 448 062 ' 18 utbyttes mot proteiner från vassla, härrörande från icke immuni- serade kor. 5 __ï, 1 5 » 'T Negativa faeoesodlingar erhölls för 90 barn (57,? %) under 5 behandlingens förlopp. I kontrollserien visade endast I4 barn (27,7 %) ett spontant försvinnande av E.coli i faecesodlingarna.

Det är att beakta, att de nativa proteinerna från vassla som härrör från icke immuniserade kor innehåller en liten mängd av, immunoglobulinet anti-E.cdïi.'Det visade sig_även, att frånvaron av framgång.med behandlingen observerades oftare i de fall som erhöll den högre dosen under en kortare tid. __Ha_ w_ Konsistensen hos avföringen undersöktes i vart fall. Ett försvnmanaet av diarrén och en väsentlig klinisk .förbättring visade sig i ett-stort antal fall, även fastän faecesodlingarna förblev positiva. I de fall då faecesodlingarna.blev negativa, förbättrades konsistensen hos avföringen snabbare när Ig-kon- centratet administrerades i en mjölkkomposition som var fattig på laktos.6 nu Profylaktiska egenskaper e u ,_ För tidigt födda barn utgör en grupp som är ytterst käns- lig för gastroenteriter genom E.coli, och denna grupp utvaldes för kliniska undersökningar av profylaxen. fi* Denna undersökning genomfördes under 6 månader i 2 rum med 8 kuvöser i vardera rummet. Proven och kontrollproven för- delades i vardera.rummet, för att samtliga.patienter skulle ut- sättas för samma betingelser, och 14 kuvöser användes för provning och 4 för kontrollprov. Varje fall stannade i medeltal 41 dagar, .och ett barn uttogs efter tillfrisknande och ersattes av ett annat oavsett dess tillhörighet (provgrupp eller kontrollgrupp). 70 fall följdes, 36 som kontrollgrupp och 34 för provningsgruppen.

Provningsgruppen erhöll Ig-koncentratet vid varje mål, fördelad över 24 timmar i en mängd av 0,25 gram per kg och dag. En faeces- odling genomfördes från försökets början, och faecesodlingarna undersöktes var femte dag. Av en totalmängd på 666 faecesodlingar härrörde 339 från kontrollgruppen och 327 från provgruppen. Bland de sistnämnda visade 33 närvaro av E.coli (lO,l %) medan 96 av de 5 339 odlingarna från kontrollgruppen var positiva (28,3 %). Vid a en undersökning av enbart serotypen E.coli O ll9!B14, vilken ofta; finnes förbunden lmed akuta. former av gastroenterit, var 7 frekvensen för positiva.faecesodlingar 5,5 % i provgruppen, mot 9 23,3 % i kontrollgruppen. ny. 448 062 19 Den slutsatsen, kan åragas, att införlivande a.v protein- koncentrat, innehållande specifika imrnunoglobuliner från mjölk som-är anti-Ewan -1 mjölken till för tidigt födda. avsevärt minskar infektionsgraden a.v E.coli hos denna. specieilt känsliga. grupp av nyfödda..

Claims (9)

20 448» 062 I Eatentkrav

1. Sätt att framställa ett proteinkoncentrat, inne- hållande ímmunologiska faktorer härrörande från mjölk, spe- ciellt då aktiva, icke-denaturerade immunoglobuliner, k ä n n e t e c k n a t av följande arbetssteg: a), 'mjölken utvinnes från mjölkbärande nötkreatur, vilka hyper- immuniserats_genom vaccination, innefattande en serie succes- siva admlnistreringar av antigener på parentoral och lokal väg vid den åttonde till den andra veckan före kalvning och på oral väg under de två veckorna före kalvning, och en serie successivayadministreringar av antigener med början cirka 2 1/2 månad före det antagna slutet av mjölkut- söndringen med alternerande mellan parenteral, lokal och oral administrering, varvid mjölken utgöres av råmjölk från_ 1-2 dagar efter kalvning, övergångsmjölk från 3-8 dagar efter kalvníng, och slutlig mjölk från de sista 60 dagarna av laktationsperioden, 7 b) grädden och föroreningar frånskiljes, c) “den skummade och renade mjölken bringas att koagulera, ad) kaseinet frânskiljes, och proteínerna i vasslan filt- reras, ultrafiltreras och steriliseras genom filtrering, samt e) produkten indunstas och torkas under betingelser som icke denaturerar immunoglobulinerna och som bibehåller steriliteten. _

2. “2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att vaccinet är grundat pá antigener till Escherichia coli som orsakar neonatala gastroenteríter.

3. I 3. Sätt enligt krav 1, k ü n n e t e c k n a t därav, att koagulcringen genomföres genom tillsats av salt- syra till ett pH~av ca 4,6 och värming till 40oC.

4. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att för undvikande av en följande igensättning av filter och ultrafilter, skumningen genomföres i två steg, först i kyla och därefter i värme, och att skumningen och frånskiljandet av kaseinet åtföljes av långtgående rening från slam och föroreningar.

5. S. Sätt enligt krav 1, k Ü n ngc t e c k n n t därav, att ultrafiltreringen av vasslan genomföres med tvättning av retentatet och återföring av det tvättade rctcntatet så, att dess halt av proteiner ökas. ”a .

6. N 448 062 0. Sätt onlígt_krav I; k ü n n 0 t eyc k n u t därav, att den förkoncentrerude-vnsslun underkastas en för- filtrering, ütföljd av on stcrilfilfroring.

7. Häll vn||gl krav I, k H n n v t 9 C k n n t düruv, att indunstningcn av don förkonconrrcrudc och steri- líserude vasslan genomföras i ett slutet kretslopp under sterila betingelser.

8. Sätt enligt krav 1, k ä n n c t e c k n a t därav,_att den koncentrerade produkten torkas genom frysning, åtföljd av frystorkning och steril förpackning.

9. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att i stegen b) och d) grädden och koagulatet extra- heras med vatten och att extraktionsvattnen sammanslås med den skummade mjölken, respektive med vasslan för återvínnande av immunoglobulincr som bortgått under dessa processer.