JPH02503802A - 抗炎症因子、その単離方法、およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：抗炎症因子、その単離方法、およびその使用本出願は、１９８２年 ６月３日出願の米国出願第３８４．６２５号（現在、放棄）の一部継続出願であ る１９８７年１月９日出願の米国出願第００１，８４８号の一部継続出願であり ；そして、１９８３年１０月２７日出願の米国出願第５４６．１６２号、および １９８３年１月１日出願の米国出願第５７６．００１号（現在、放棄）のファイ ルラッパー継続出願である１９８６年９月１７日出願の米国出願第９１０，２９ ７号の分割８願である。

及■９宣屡 Ｒ咀史分！ 本発明は、抗炎症因子（ＡＰ）、その実質的な純粋物の製造法、および炎症処置 におけるその使用に関する。

炎症とは、ドーランド医学辞典の定義によれば、「組織に傷害や破壊があったと きにその傷害の原因と傷害組織の両方を破壊、希薄化または隔離するような局在 性の保護応答」である。これは、微小血管の穿孔、血液成分の間隙空間への漏出 、および炎症組織への白血球の遁走によって特徴付られる。巨視的には、これは 、しばしばよく見掛ける臨床徴候である紅斑、浮腫、圧痛（痛覚過敏症）、およ び疼痛を伴う。この複雑な応答時には、ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプタミ ン、種々の走化因子、ブラジキニン、ロイコトリエン類、およびプロスタグラン ジン類などのケミカルメディエータ−が局所的に遊離される。食作用細胞はその 領域に移動し、細胞のライソゾーム膜を破壊して細胞溶解酵素を放出させ得る。

これらの事象のすべてが炎症反応の一因となり得る。

リウマチ様関節炎に罹患した患者の炎症は、白血球を引き付ける走化因子を局所 的に放出させる抗体くリウマチ因子）および補体と抗原（γ−グロブリン）との 結合におそらくは関係している。白血球は、抗体−抗原および補体の複合体を食 菌し、さらにそれらのうイソシームに含まれた多（の酵素を放出させる。そして 、これらのライソゾーム酵素は軟骨および他の組織の損傷を誘発し、炎症程度を 増加させる。この過程においては、プロスタグランジン類も放出される。

炎症時に生成されると思われるプロスタグランジン類は、紅斑を誘発し、局所血 流を増大させる。プロスタグランジン類の２つの重要な血管作用−長期の血管拡 張作用、およびノルエピネフリンおよびアンジオテンシンなどの物質の血管収縮 作用に対抗するカーは、一般的には、炎症時の他のメディエータ−にはない。

炎症における幾つかのメディエータ−は、後毛細血管および集合線静脈の血管透 過性（漏出）を増大させる。さらに、白血球の炎症領域への遊走は炎症反応にお いて重要な局面である。プロスタグランジンは走化性反応には直接関係していな いようであるが、アラキドン酸のもう１つの代謝産物であるロイコトリエンは非 常に強力な走化性物質である。

抗炎症応答は、上述した炎症によって特徴付られるあらゆる応答である。炎症応 答が、種々の疾患および損傷を伴った身体的不快感、すなわち疼痛、および機能 低下の原因であることは、当業者には周知である。したがって、炎症応答を中和 させる作用を有する薬理学的物質を投与することは通例の医療処置である。これ らの性質を備えた物質は抗炎症薬として分類される。抗炎症薬は、広範囲の障害 を処置するために使用され、この同一薬物が別の疾患の処置に使用されることは 多い。抗炎症薬による処置は疾患のためにではなく、徴候、すなわち炎症のため に為されることが非常に多い。

抗炎症性の鎮痛および抗解熱薬は、化学的には関連性がないことの多い雑多な化 合物群であるが、それにも拘わらず、それらは特定の治療効果および副作用を共 有している。コルチコステロイド類は、抗炎症応答の処置に、最も広範に使用さ れている化合物群である。

タンパク質分解酵素は、抗炎症作用を有すると主張されている他のクラスの化合 物群である。副腎皮質に直接的または間接的に作用してステロイドを産生、分泌 させるホルモンは他のクラスの抗炎症性化合物である。多数の非−ホルモン抗炎 症物質が記載されている。

これらの中で最も広く使用されているものは、サリチル酸塩類（サリチレート類 ）である。アセチルサリチル酸、すなわちアスピリンは最も広範に処方されてい る鎮痛性−解熱および抗炎症薬である。

ステロイド系および非−ステロイド系の抗炎症薬の例は、フィジシャンズ・デス ク・リファレンス（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’　ｓ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ）、　１９８７（このような製剤のインデックスは２０７頁および２０８頁を参 照）に挙げられている。

天然および合成のフルチフステロイド剤は、血圧の上昇、塩および水の保持、な らびに増大したカリウムおよびカルシウム排泄などの幾つかの重大な副作用を引 き起こす。さらに、フルチフステロイドは感染の徴候を隠し、感染性微生物を広 く伝播させる。これらのホルモンは妊婦への使用は安全でないと考えられ、また 長期のコルチコステロイド処置は、胃の過剰活性および／または消化性潰瘍を引 き起こす。これらの化合物による処置は、高用量のインスリンが必要となること から糖尿病を悪化させる場合があり、さらに精神障害を引き起こす場合もある。

間接的に内生コルチコステロイドの産生を増大させるホルモン抗炎症薬は、有害 な副作用について前記と同じ可能性がある。

非−ホルモン抗炎症薬は、高用量では広い範囲の望ましくない副作用を伴った毒 性を示し得る合成生化学化合物である。たとえば、サリチレート類は、このよう な化合物群による中毒の特徴である重篤な酸−塩基平衡障害の一因となる。サリ チレート類は呼吸を直接的および間接的に刺激する。サリチレート類はその毒性 用量では中枢呼吸麻痺、および血管運動低下に伴う循環虚脱を引き起こす。サリ チレート誘発性の胃出血はよく知られている。サリチレート類は肝傷害を生じさ せ、全凝固時間を長引かせ得る。したがって、重篤な肝障害、低プロトロンビン 血症、ビタミンに欠乏症、または血友病の患者においては、サリチレート類によ って血小板止血作用が阻害を受け、出血傾向が招来しかねないので、アスピリン の使用は排除スべきである。サリチレート中毒は普通のことであり、毎年米国で は、１０，０００症例以上の重篤なサリチレート中毒が確認されており、その幾 つかは致死性であり、多くは子供に起こっている。

グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉｌ＋ｎａｎ’　ｓ）、　Ｔｂｅ　Ｐ ｈａｒｍａｃｏ］ｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　。

ｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、７版、　１９８５を参照。したがって、現在市 販されている抗炎症薬は非常に多いにも拘わらず、副作用および冑害な反応が排 除された、安全かつ有効な抗炎症性生成物が依然として求められている。

たとえばミルクから得られるような天然食品産物が抗炎症活性を有しているとし たなら、それは、投与が簡単であり、容易に入手できる安全な治療用組成物とな るであろう。

従来、種々の治療効果を有するミルクの調製が知られている。たとえば、ベック （Ｂｅａｋ）は、う蝕阻害効果を有するストレプトコッカス・ミニウタンス（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）に対する抗体を含有するミルクを開 示している［米国特許第４，３２４，７８２号］。このミルクは、乳牛（ＣＯＶ ）をＳ、ミｘウタンス抗原で２段階免疫して入手され、それから治療用ミルクを 得ている。

ストール（Ｓｔｏｌ　ｌｅ）らは、さ過免疫（ｈｙｐｅｒｉｏｖ＋ｕｎｅ）状態 下に維持さ物の喫煙に伴う血管障害または肺不全の治療法を開示している［米国 特許第４．６３６，３８４号］。ベックは、抗炎症因子産生状態下に維持された 乳牛から採取したミルクの抗炎症性有効量を動物に投与することを特徴とする、 動物の炎症を治療する方法を開示している［米国特許第４，２８４．６２３号］ 。バインバッハ（Ｈｅ　１ｎｂａｃｈ）は、米国特許第３．１２８．２３０号に おいて、乳牛を抗原性混合物で接種することによって得られるグロブリンのα、 β、γ成分を含有するミルクを記載している。ベターマン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ） ら（米国特許第３゜３７６．１９８号）、ホルム（Ｈｏ１ｍ）（米国出願（発行 済）番号第６２８゜９８７号）、ツナツバ（Ｔｕｎｎａｈ）ら（英国特許第１， ２１１，８７６号）およびバイオケ？　（Ｂｉｏｋｅ＋ａａ　Ｓ、　Ａ、　）（ 英国特許第１，４４２，２８３号）にも、抗体−含有ミルクが記載されている。

しかし、これらの文献はいずれも、所望の治療効果を生み出す治療用ミルクの成 分または成分群の本体については同等開示していない。たとえば、ベックの米国 特許第４．２８４．６２３号では、治療手段に用いたミルク産物は、流動性全ミ ルク、流動性の脂肪不含乳清、または全ミルク粉末のいずれかから構成されてい る。これらのミルク産物はいずれも抗炎症特性を有しているが、実際に治療上の 有益性を提供している因子または因子群はいまだに単離も同定もされていない。

発明の要旨 本発明は、単離され、精製された抗炎症性のミルク産物が動物の抗炎症障害を処 置するのに非常に有用であるのではないか、という本発明者らの考察に基づくも のである。

この点に関し、本発明者らは、過免疫したウシ（ｂｏｖｉｄ）のミルク由来の抗 炎症因子（以下、ミルク抗炎症因子（ＭＡＩＦ）と呼ぶ）を単離し、部分的に精 製し、特性化した。

さらに研究を行い、このミルク産物が炎症における臨床上の徴候を防ぎ、あるい は緩和することを証明した。したがって、本発明は、特定の多価抗原群に対して 前もって過免疫したミルク産生動物由来のミルクから単離精製された抗炎症因子 が抗炎症効果を生じる程に十分な投与計画および量で投与された場合に、該因子 は炎症状態に有効である、という発見に基づくものである。このような発見は、 多価抗原ワクチン自身はＭＡＩＦを含有していないことから、特に驚くべき事項 である。過免疫したウシのミルク由来の活性因子を単離することにより、ＭＡＩ Ｆは通常のウシミルクでは少量しか存在しないという意外な知見が得られた。通 常のウシミルク中のＭＡＴＦの濃度は低すぎるので感知できる程の抗炎症特性を ミルクに付与できないことから、このような発見が隠されていた。しかし、通常 ミルクのＭＡ　Ｉ　Ｆは、本発明の単離方法によって濃縮することができ、次い で炎症の処置に有効に使用することができる。

図面の簡単な説明 添付の図面に関して考える場合は以下の詳細な説明を参照することによって、本 発明のより完全な理解およびそれに伴う多くの利点が容易に得られ、それが良好 に理解できるようになるであろう：第１図、好ましい方法の工程２におけるＤＥ ＡＥ−セルロースのイオン交換クロマトグラフィーによるＭＡＩＦの単離。

第２図、好ましい方法の工程３におけるセファデックスＧ−１０分子ふるいカラ ムのＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー（第１図）からのＭＡＩＦピーク （２番目）の分画＠好ましい態様の詳細な説明 本発明は、ＭＡＩＦの単離および精製、ならびに抗炎症疾患の処置を目的として 該ＭＡＩＦを動物に投与することからなる。

「ミルク抗炎症因子（ＭＡＩＦ）Ｊなる用語は、過免疫ミルクまたは通常乳牛ミ ルクのいずれかから入手される因子を意味する。「実質的に純粋なＭＡＩＦＪな る用語は、本発明の目的では、高分子量の物質群（＞１０．０００ダルトン）を 除去し、イオン交換クロマトグラフィーによって低分子量の負に帯電した種を単 離した後、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにおいて単一の主要な左右対称のピーク として溶出される抗炎症因子を意味する。通常ミルクおよび過免疫ミルクの両者 から、本明細書に記載された方法により加工することによって、ＭＡ　Ｉ　Ｆを 得ることができる。

「過免疫ミルク（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ　ｍ１ｌｋ）Ｊなる用語は、本発明の 目的では、過免疫状態下に維持されたミルク産生動物から入手したミルクを意味 する（過免疫の詳細に関しては、以下により詳しく述べる）。

「乳清」なる用語は、本発明の目的では、クリームが除かれたミルクを意味する 。

「通常ミルク（ｎｏｒｍａｌ　ｍ１ｌｋ）Ｊなる用語は、本発明の目的では、通 常の手段と酪農処理によってミルク産生動物から入手されたミルクを意味する。

「ミルク産生動物」なる用語は、本発明の目的では、商業的に適した量のミルク を産する哺乳動物を意味し、好ましくは乳牛、ヒツジ、およびヤギがあり、さら に好ましくはウシ属（ウシ）の乳用牛であり、特に好ましくは最も多い量でミル クを産する乳牛種、たとえばホルスタインである。

「細菌抗原」なる用語は、本発明の目的では、熱殺菌した細菌細胞の凍結乾燥調 製物を意味する。

「マイクロカプセル剤」なる用語は、本発明の目的では、ミルク産生動物に投与 するための１つまたはそれ以上の細菌抗原がカプセル化されているポリマー性の 微小粒子を意味する。

「炎症」なる用語は、本発明の目的では、組織に傷害や破壊があったときにその 傷害の原因と傷害組織の両方を破壊、希薄化または隔離するような局在性の保護 応答を意味し、その急性型は、古典的な一連の疼痛、熱、発赤、膨潤および機能 喪失によって特徴付られ、そして増大した透過性および血流を伴った細動脈、毛 細血管および細静脈の膨張、血漿タンパク質などの体液の滲出、および炎症巣へ の白血球の遊走などの一連の複雑な事象が、組織学的には関連している。

「処置」なる用語は、本発明の目的では、障害の徴候、および／または障害の病 因源を改善し、または完全に排除することを意味する。

「投与」なる用語は、本発明の目的では、経口、鼻腔内、腸管外（静脈内、筋肉 内、または皮下）、または直腸などから物質で患者を処置するあらゆる方法を意 味する。

「動物」なる用語は、本発明の目的では、炎症を受は易いあらゆる生き物を意味 し、ヒト、農場動物、家畜動物、または動物園の動物などが挙げられる。

本発明の単離精製したミルク産物によって処置することのできる炎症症状の例と しては、急性および亜急性滑液嚢炎、急性の非特異的謎炎、全身性エリテマトー デス、全身性皮膚筋炎、急性リウマチ性心臓炎、天庖癒、水泡性皮膚炎、ヘルペ テホルミス（ｈｅｒｐｅｔｅｆｏｒ■ｉｓ）、重篤な紅斑、多形性剥脱性皮膚炎 、肝硬変、季節的宿根鼻炎（Ｓｅａｓｏｎａｌ　ｐｅｒｅｎｎｉａｌ　ｒｈｉｎ ｉｔｉｓ）、気管支喘息、異所性皮膚炎、血清病、角膜炎、オプサルミクス（ｏ ｐｔｈａｌｍｉｃｕｓ）虹彩炎、広汎性ウレイチス（ｄｉｆｆｕｓｅ　ｕｒｅｉ ｔｉｓ）、コリジチス（ｃｈｏｒｉｄｉｔｉｓ）、視神経炎、交感性眼炎、症候 性サルコイド−シス、レフラー症候群、ベリリウム症、溶血性貧血、乳腺炎、乳 突炎、接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、転置性関節炎、強直性を椎炎、急性 痛風関節炎、および帯状庖疹から選択される症状が挙げられる。さらに、本発明 の単離精製したミルク産物は、炎症を起こす可能性のある起炎物質に暴露されて いる個体を処置するのに使用することができる。

本発明の基礎として一部分寄与する発見は、ウシなどのミルク産生動物を過免疫 という特別な状態に置いた場合に該動物が、ヒトおよび他の動物における炎症の 徴候を抑制するばかりか、受容動物の炎症原因の存在を予期して使用される予防 物質でもある非常に有益なＭＡＩＦを正常域を越えたレベルで含有しているミル クを産生ずるということである。「正常域を越えたレベル（ｓｕｐｒａｎｏｒｍ ａｌ　１ｅｖｅｌｓ）Ｊなる用語は、過免疫されていない動物から得られたミル ク中で見いだされるレベルよりも多いレベルを意味する。免疫感受性のみの誘導 は、ミルク中のＭＡ　Ｉ　Ｆを正常域を越えたレベルで出現させるには十分でな く、このことは、乳牛疾患に対する通常の免疫時および環境への通常の暴露時に 乳牛が種々の抗原に対して感作されたとしても、通常の乳牛ミルクは正常域を越 えたレベルでないことによって明らかである。ミルクが正常域を越えた所望のレ ベルを示すのは、特定の過免疫状態にある時だけである。

このような特殊な状態にするには、初期免疫を投与した後、十分高用量の特定の 抗原群で定期的にブースターすればよい。ブースターの好ましい投与量は、ウシ の一次免疫を起こすのに必要な投与量の５０％と等量であるか、またはそれ以上 の投与量である。したがって、關値ブースター投与量というものが存在し、この 値以下では、乳牛は通常、免疫状態と呼ばれているような状態にある場合でさえ 、そのような性質がミルクに惹起されない。必要な過免疫状態にするためには、 初期の一連のブースター投与の後に、過免疫ミルクを試験することが必要である 。有益な因子がミルク中に存在していない場合は、その性質がミルクに現れるま で高用量でさらにブースター投与する。

正常域を越えたレベルのＭＡ　Ｉ　Ｆを含有する過免疫ミルクの製造方法は、１ ９８７年７月２日出願の同時係属出願第０６９．１３９号、および１９８３年２ 月１日出願の米国特許出願第５７６．　Ｏ０１号のファイルラッパー継続出願で ある１９８６年９月１７日出願の同時係属出願第９１０，２９７号に開示されて いるくこれらを引用して本発明に包含させる）。要約すれば、正常域を越えたレ ベルのＭＡＩＦを含有する過免疫ミルクの１つの製造方法は、以下の工程からな ることを特徴としている：（１）抗原の選択、（２）ウシの一次免疫、（３）感 受性誘導を確認するための血清の試験、（４）適当な投与量のブースターによる 過免疫、そして要すれば（５）抗炎症特性についてのミルクの試験、（６）過免 疫ウシのミルク採取、そして（７）ＭＡＩＦを単離するためのミルクの加工。

工程１：あらゆる抗原または抗原群の組合わせを使用することができる。その抗 原は、細菌、ウィルス、原生動物、真菌、細胞、またはミルク産生動物の免疫系 が反応する他のあらゆる物質が考えられる。この工程で重要な点は、抗原（群） がミルク産生動物の免疫および過免疫状態を誘発するだけでなく、ミルク中に正 常域を越えたレベルのＭＡ−ＩＦを製造できなければならない点である。どの抗 原を使用しても正常域を越えたレベルのＭ、ＡＩＦを製造することができる。１ つの好ましいワクチンは、１００ワクチン系列と称される多価細菌抗原群の混合 物であり、これについては以下の実施例ＩＡで詳細に説明する。

工程２：抗原（群）は、感作を惹起させるあらゆる方法で投与することができる 。１つの方法では、熱−死滅細菌Ｉ　Ｘ　１０＠から１×１．０”、好ましくは １０＠から１０Ｉ０、最も好ましくは２Ｘ１０”から構成されるワクチンを筋肉 内注射によって投与する。しかし、静脈内注射、腹腔内注射、直腸坐剤、または 経口投与などの他の方法を使用することもできる。

工程３：ミルク産生動物が抗原に対して感受性になったか否かを決定することが 必要である。感受性を試験するための幾つかの方法は当業者に既知である［メソ ッズ・イン・イムノロジー・アンド・イムノケミストリー（Ｉｌ！ｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）＋ウ ィリアム（Ｗｉｌｌｉａｍ、　Ｃ，Ａ、　）、およびチェイス（Ｃｈａｓｅ、　 Ｌ　Ｍ、　）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニニ ーヨーク、１−５巻（１９７５）］。

好ましい方法は、抗原として種々の細菌種からなる多価ワクチンを使用し、ワク チンによるチャレンジの前および後にその動物の血清中の凝集性抗体の存在につ いて試験することである。そのワクチンによって免疫した後のミルク抗体の出現 は、感受性を示すものであり、この時点で、工程４に進むことができる。

工程４：これは、感作された動物における過免疫状態の誘発および維持に関する 。このことは、感作させるために使用したものと同一の多価ワクチンによるブー スター投与を一定の時間間隔で繰り返すことによって行われる。２ｉ！間のブー スター間隔が多価細菌抗原にとっては最適である。しかし、動物を、過免疫状態 から、その抗原に対する免疫寛容状態にまで移行させないようにすることが必要 である。

好ましい態様では、以下の実施例ＩＢに説明するように調製したマイクロカプセ ル化ワクチンを１回だけ投与することによってウシを過免疫状態にすることがで きる。この過免疫の制御放出法の利点は、抗原に対する継続した暴露により、動 物が過免疫状態のままでいられることである。

他の態様では、別の免疫操作法、たとえばマイクロカプセル化抗原と液状抗原と の同時投与、または−次免疫としての筋肉内注射、およびマイクロカプセル化手 段による経口投与または腸管外投与に基づくブースター投与などを組み合わせる こともできる。−次および過免疫の多（の異なる組合わせが当業者により知られ ている。

工程５：抗炎症活性のレベルについてミルクを試験する必要がある。これは、過 免疫ミルクまたはそれから誘導された産物のいずれかの炎症に対する作用を試験 するあらゆる研究法によって行うことができる。うｙ）の四肢に化学的に誘発さ せた炎症が、抗炎症薬の標準的な検定法である。

工程６：これは、ミルクの採取および加工に関する。ミルクは通常の方法によっ て採取すればよい。ＭＡ　Ｉ　Ｆを単離するためのミルクの加工について、以下 説明する。

ＭＡＩＦを単離し、精製し、試験するための最も単純な方法は下記の工程からな る： １、過免疫ミルクを脱脂してスキムミルク（脱脂乳）を調製し、２、スキムミル クからカゼインを除去して乳清を調製し、３、限外濾過によって約１０，０００ ダルトンよりも大きい分子量の巨大分子を乳清から除去し、 ４、イオン交換樹脂カラムを使用して工程３の産物を分画し、約１０．０００ダ ルトンよりも小さい分子量の負に帯電したＭＡ　Ｉ　Ｆ種を単離し、 ５、分子ふるいクロマトグラフィーによって負に帯電している工程４０種を分別 し、そして ６、工程５のＭＡＩＦを生物学的に検定する。

７、ラットの足にカラゲナン溶液を注射して誘発させた浮騰によって、このミル ク因子の抗炎症作用を試験する。このラット足試験は、抗炎症薬についての標準 的な動物試験である。ウィンターＱｉｎｔｅｒ。

Ｃ，Ａ、　）、リスレイ（Ｒｉｓｌｅｙ、　Ｇ、　Ａ、　）、ヌス（Ｎｕｓｓ、 　Ａ、　１．　）のプロシーディング・オプ・ナシヲナル・アカデミ−・オブ・ サイエンスＵ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、 　Ｌｌ、　Ｓ、　Ａ、　）、　３：５４４　（１９６７）、　ｒ抗炎症薬検定の ためのラット後脚のカラゲニン誘発性浮Ｗ（Ｃａｒｒａｇｅｅｎｉｎ−１ｎｄｕ ｃｅｄ　Ｅｄｅｍａｉｎ　ｔｈｅ　１ｌｉｎｄ　Ｐａｗ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒａｔ 　ａｓ　ａｎ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａ＋ｎａｔｏｒｙ　Ｄ ｒｕｇｓ＞Ｊ。他の種々の試験も使用することができる。ウェットニック（ｌｅ ｔｎｉｃｋ、　Ａ、　Ｓ、　）およびサピン（Ｓａｂｉｎ、　Ｃ）のＪａｌ）、 　Ｊ、　Ｐｈａｒｔ　２２ニア４１　（１９７２）、　ｒラットにおけるアジ− パント誘発性関節炎および実験アレルギー性脳を髄炎に対するクロニキシンおよ びベサウレサソンの効果（丁ｈｅ　　Ｅｆｆｅｃｔｓ　　ｏｆ　　Ｃ１ｏｎｉｘ ｉｎ　　ａｎｄ　　Ｂｅｔｈａｕｒｅｔｈａｓｏｎｅ　　ｏｎ　　Ａｄｊｕｖａ ｎ煤|１ ｎｄｕｃｅｄ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｌ ｌｅｒｇｉｃ　Ｅｎｃｅｐｈａｌｏ＋ｌ１ｙｅｌｉｔｉｓｉｎ　Ｒａｔｓ）Ｊ。

しかし、上記のラット足試験は利用可能な最も簡単な直接試験であり、これはす べての抗炎症薬について申し分ないことが示されている。本試験は、ベック（Ｂ ｅｃｋ）の米国特許第４，２８４．６２３号に詳細に記載されており、そのラッ ト足試験の記載に限り、引用によって本発明に包含される。簡単に説明すれば、 本試験は、少量のカラゲニンを成熟白ラットの足跡（ｆｏｏｔｐａｄ）に注射す る。このことにより、炎症応答が誘発されることは知られている。

得られた膨潤の程度を測定することができる。ＡＦを含有する試料を適当な経路 、好ましくは腹腔内注射によってラットに投与し、容量分析法または重量分析法 によって炎症過程の遮断または改善を測定する。

要約すれば、抗炎症因子は、過免疫したミルクから欠配の工程によって単離する ことができる：ミルクを脱脂し、カゼインを除去し、１０．０００ダルトンより も大きな巨大分子を除去し、そしてイオン交換および分子ふるいクロマトグラフ ィーを続けて行う。抗炎症因子の適当な調製物の生物活性は、本明細書で説明す るようなラットの用量−作用実験を行うことによって試験することができる。

本発明は、ＭＡ　Ｉ　Ｆが単離、精製することができ、そしてそれがヒトおよび 動物における種々の炎症過程を処置するのに有効である、という予想外の発見に 一部分基づくものである。好ましい態様では、ＭＡ　Ｉ　Ｆは、細菌抗原ワクチ ンでミルク産生動物を過免疫することによって産生される。動物の過免疫に使用 されるワクチンは抗炎症活性を有していない。したがって、混合細菌抗原ワクチ ンで免疫した動物から単離し、精製して得られた因子によって処置することが炎 症過程を改善し、または消去する上に有効であることは驚くべきことである。

このように本発明を一般的に説明してきたが、次ぎに特定の特徴的な実施例に言 及することによって本発明をさらに詳述するが、これらは説明のみを目的とする ものであって、特に明記しない限り、本発明の限定を意図するものでない。

ミルクの調製 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ５ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手される以下の第１表に示す細 菌スペクトルを含有する細菌培養物を、培地１５ｉｆｆで再構成し、３７℃で一 晩インキニベートした。良好な成長が得られたなら、細菌懸濁液の約半量をブロ ス１リツトルに接種し、得られた接種物を３７℃でインキュベートした。残った 懸濁液を滅菌グリコール管に移し、この培養物中で良好な成長が観察された後、 懸濁液を２０分間遠心して培地を除去することによって細菌細胞を採取した。得 られた細菌ベレットを滅菌生理食塩水に再懸濁し、細菌試料を３回遠心して細胞 から培地を洗い流した。３回目の滅菌生理食塩水洗浄後、遠心して得られた細菌 ベレットを少量の２回蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ　ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ ）に再懸濁した。

得られた培地不含の細菌懸濁液をガラスフラスコ中、８０℃の水浴中に一晩入れ て加熱殺菌した。少量の加熱殺菌した細菌を使用し、このブロス培養物の生存率 を試験した。細菌をワクチンに使用するためには殺菌しなければならないので、 ブロスに加熱殺菌した細菌を接種し、３７℃で５日間インキュベートし、増殖が ないかを毎日チェックした。

加熱殺菌した細菌を凍結乾燥して乾燥させた。次いで、得られた乾燥細菌を滅菌 生理食塩水と混合したく濃度、２．２Ｘ１０”細菌細胞／ｍ（ｌ生理食塩水。こ れは６６０ｎｍにおける光学密度値１，０である）。

第１表 Ｓ−１００細菌の一覧 ダラム染色 名　　称　　　　　　　　　　　　　　培地　　＋ｏｒ　−ＡＴＣＣＮｏ。

１、スタフィロコッカス・アウレウス　　　　　Ｂ旧　　＋　　１１６３１（Ｓ ｔａｐｈ、　ａｕｒｅｕｓ） ２、スタフィロコッカス・エビデルミゾイス　ＢＨＩ　　　＋　　　　１５５（ Ｓｔａｐｈ、　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）３、ストレプトフッカス・ピオゲネス 　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　８６７１人、タイプ１　（Ｓｔｒｅｐ、　Ｉ ））’Ｏｇｅｎｅｓ、　Ａ、　Ｔｙｐｅ　１）４、ストレプトコッカス・ピオゲ ネス　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　１０３８９＾、タイプ３　（Ｓｔｒｅｐ 、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、　Ａ、　Ｔｙｐｅ　３）５、ストレプトコッカス・ピオ ゲネス　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　１２３４７Ａ、タイプ５　（Ｓｔｒｅ ｐ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、　Ａ、　Ｔｙｐｅ　５）６゜ストレプトコッカス・ピ オゲネス　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　１２３４９Ａ、タイプ８　（Ｓｔｒ ｅｐ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ＋　Ａ、　Ｔｙｐｅ　８）７、ストレプトコッカス・ ピオゲネス　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　１１４３４Ａ、タイプ１２　（Ｓ ｔｒｅｐ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、　Ａ、　Ｔｙｐｅ　１２）８、ストレプトコッ カス・ピオゲネス　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　１２９７２Ａ、タイプ１４ 　（Ｓｔｒｅｐ、　Ｐｙｏｇｅｎｅｓ、　Ａ、　Ｔｙｐｅ　１４）９、ストレプ トコ、ツカス・ピオゲネス　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　１２３５７Ａ、タ イプ１８　（Ｓｔｒｅｐ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、　Ａ、　Ｔｙｐｅ　１８）１０ 、ストレプトコッカス・ピオゲネス　　　　　ＡＰＴ　　　＋　　　　１０４０ ３Ａ、タイプ２２　（Ｓｔｒｅｐ、　ｐＶＯｇｅｎｅｓ、　Ａ、　Ｔｙｐｅ　２ ２）１１、アエロバクタ−・アエロバクタ　　　　　　Ｂｉｌ！　　　−８８４ （Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）１２、ニジエリシア・フリ　　 　　　　　　　　　ＢＨＩ　　　　−２６（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ）１３、サルモ不う・ニンテリチジス　　　　　　　ＢＨＩ　　　−１３０７６ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）１４、シュードモナス・ア エルギノーザ　　　　Ｂｌ（＋　　　−７７００（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ ｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１５、クレブシェラ・ニューモニエ　　　　　　ＢＨＩ　 　　−９５９０（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）１６、サルモ ネラ・チフィムリウム　　　　　　　ＢＨＩ　　　−１３３１１（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ＋ｍｕｒｉｕｍ）１７、ヘモフィルス・チフィムリウム　 　　　　　Ｂｌ（！　　　−９３３３（Ｈａｅ＋ａｏｐｈｉｌｕｓ　ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）１８、ストレプトコッカス・ミチス　　　　　　　ＡＰＴ　　　 ÷　　　６２４９（Ｓｔｒｅｐ、　ｍ１ｔｉｓ） １９、プロテウス・ブルガリス　　　　　　　　Ｂ１１１　　−　　１３３１５ （Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）２０、シゲラ・ディセンテリエ　　　　 　　　　　ＢＨＩ　　　　−１１８３５（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒ ｉａｅ）２１、　ティプロコノカス・ニューモニエ　　　　ＡＰＴ　　　＋　　 　　６３０３（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕａ＋ｏｎｉａｅ）２２、プロ ピオニバクター・アクネス　　　　　ブロス　　＋　　　１１８２７アクチノマ イセス（アナエローブ） （Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒ　ａｃｎｅｓ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（ａｎ ａｅｒｏｂｅ））２３、ストレプトコッカス・サンダイス　　　　　ＡＰＴ　　 　＋　　　１０５５６（Ｓｔｒｅｐ、　ｓａｎｇｕｉｓ） ２４、ストレプトコッカス・サリバリウス　　　ＡＰＴ　　　＋　　　１３４１ ９（Ｓｔｒｅｐ、　ｓａｌ　１ｖａｒｉｕｓ）２５、ストレプトコッカス・ミュ ータンス　　　　Ｂ）Ｉ＋　　　　＋　　　　２５１７５（Ｓｔｒｅｐ、　ｍｕ ｔａｎｓ） ２６、ストレプトコッカス・アガラクチェ　　　ＡＰＴ　　　＋　　　１３８１ ３（Ｓｔｒｅｐ、　ａｇａｌａｃｔ　１ａｅ）５ｘ（ｌ試料の多価液体ワクチン を毎日、乳牛に注射した。この注射した畜生の抗体（ＩｇＧ）力価のレベルを、 この多価抗原に対するウシ抗体に関して酵素結合免疫検定法を行うことによって 定期的に測定した。

実施例ＩＢ 加熱殺菌した細菌を上述のようにして調製した。得られた多価抗原試料（Ｓ−１ ００）を通常の相分離方法によってマイクロカプセル化し、多価抗原を含有する 微小粒子製品を調製した。一般には、抗原を含有する成形マトリックスの材料は 、生体適合性の物質、好ましくは生体分解性または生体減退性（ｂｉｏｅｒｏｄ ａｂｌｅ）の物質のポリマー、好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸お よびグリコール酸のコポリマー（共重合体）、ポリカプトラクトン、コポリオキ サレート類、コラーゲンなどのタンパク質、グリセロールの脂肪酸エステル、お よびセルロースエステルのポリマーから形成される。

これらのポリマーは、当業界では周知であり、たとえば米国第３゜７７３．９１ ９号、米国第３，８８７，６９９号、米国第４．１１８゜４７０号、米国第４， ０７６．７９８号に記載されている（これを引用して本発明に包含させる）。使 用した重合マトリックス材料は生体分解性のラクチド−グリコリド・コポリマー であった。

加熱殺菌した細菌抗原を、好ましくは、直径１−５００ミクロン、好ましくは１ ０−２５０ミクロンのミクロスフェアなどのマトリックス材料中にマイクロカプ セル化する。このカプセル化の方法は常法であり、相分離法、界面反応、および 物理学的方法からなる。微小粒子から宿主体への細菌抗原の最適の放出率を得る ためには、マトリックスの多くの組合わせ、および適合抗原の種々の濃度を使用 することができる。これらの組合わせは、過度の実験を行うことなく当業者なら ば決定することができる。

本実施例の微小粒子は、直径が２５０ミクロンよりも小さかった。

次いで、２２％多価抗原（１６，５ｍｇ）を含有する微小粒予約７５０ｘｇをビ ヒクル（水中、１重量％Ｔｗｅｅｎ２０および２重量％カルボキシメチルセルロ ース）約３ｃｃ中に懸濁した。

比較的大きな牛集団の中から小さい畜生群を選択した。これらの中から５頭を無 作為に選択して対照とした。４頭の牛に多価抗原を含有する微小粒子を筋肉内注 射した。微小粒子試料は、２．ＯｍＲａｄのガンマ放射線によって滅菌した。接 種した乳牛、および対照乳牛から得た乳牛ミルクにおける抗体（ＩｇＧ）力価レ ベルを定期的に測定した。

実施例２ 過免疫したミルクからのＭＡＩＦ因子の単離工程１ニー（北乏ｍ引製り 過免疫した乳牛由来の新鮮なミルク２０リツトルをクリーム分離器［デラバル１ ０２型（ＤｅＬａｖａｌ　Ｍｏｄｅｌ　１０２）］に供し、脂肪を除去した。

得られたスキムミルク１６リツトルを中空ファイバー（ホロファイバー）シア濾 過／濃縮器［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　Ｄ　Ｌ　−１０Ｌ　］によって限外濾 過し、高分子量（１０，０００ダルトン以上）種を除去した。この濃縮器は１０ ，０００ダルトンの分子量を遮断する２つのカートリッジＦアミコンＨ，Ｐ、。

−４３］が備えられている。得られたスキムミルクをポンプ速度８ｏで計量器（ インレットおよびアウトレットの圧力それぞれ３０ｐｓｉおよび２５ｐｓｉ）に 供した。

保存のため、およびさらに精製するために、１時間当たりに４す。

トルの流速でカー）ＩＪッジから排出された濾液（＜１０，０００ダルトン）１ ２リツトルを凍結または凍結乾燥した。

工程２：盃ヱＺ２洪又三ヱ上グ５７４ユ上記濾液中のミルク抗炎症因子、ＭＡＩ Ｆを陰イオン交換クロマトグラフィーカラムによってまず単離した。

この操作では、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−８Ｂゲル［ファルマシア（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）コを５Ｘ１０ｃｉのガラスカラムに充填し、滅菌した２回蒸留水 （ｐ　Ｈ７，０）で平衡化させた。

濾液１リツトル（＜１０．０．００）をこのカラムに適用し、流速１６０　ｚＱ ／時間で滅菌２回蒸留水（ｐＨ７，０）を用いて溶出した。

１０ｍｆｆのフラクションを採取し、２８０ｎｍにおいてモニターするに当たり ウビコード（Ｌｌｖｉｃｏｒｄ）　４７００吸収計を用い、接続した記録器（フ ァルマシアＲＥＣ−４，８２）によって光学密度を記録した。

ＭＡＩＦ以外の陽性および中性の電荷を有する物質はＤＥＡＥ−セファロースゲ ルに結合しない。これらは、素通りするピークとして溶出される（第１のピーク ）。陰電荷を有するＭＡ　Ｉ　Ｆはゲルに保持される。

ＭＡＩＦを遊離させるため、カラムを滅菌生理食塩水（ｐＨ７゜０）で段階的勾 配溶液で溶出した。典型的なプロフィルを第１図に示す。得られた個々のフラク シヨンをバイオアッセイ（生物検定）することにより、２番目のピークにＭＡ　 Ｉ　Ｆが含まれることが判明した。２番目のピークおよびそのシリルダ−（肩） 部分からなるフラグ２５フ群をさらに精製するために使用した。回収試験によっ て、この工程から乾燥粉末８．８ｇが得られたことが示される。

工程３ニゲル濾過クロマトグラフイ一 工程２から得られた２番目のピークはＭＡ　Ｉ　Ｆおよび他の陰電荷分子を含有 しているので、さらに精製する工程が必要であった。さらに精製するためには、 ゲル濾過カラムを使用して分子量に基づき各種成分を分離するのが常法である。

この工程では、セファデックスＧ−１０樹脂（ファルマシア）を２．５Ｘ８０ｃ ｚガラスカラムに充填し、滅菌した２回蒸留水（ｐＨ７，０）で平衡化する。工 程２から得られた２番目のフラクション２ｇを滅菌２回蒸留水に再度溶解し、カ ラム上に適用する。このカラムを１時間当たり流速３０ｘＱで溶出する。フラク シヨン（３，３Ｘａ＞を採取し、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにおいてモニター し［ファルｖシフ　Ｄｕｏ　０ｐｔｉｃａｌ　Ｕｎｉｔ］　、接Ｖｔした記録器 （ファルマシアＲＥＣ−４８２）で光学密度を記録した。

通常は、第２図に示されるように、溶出プロフィルには３つのピークがあった。

第１および第２のピークがＭＡＩＦ活性を含有していた。

この第１のピークは、活性ＭＡＩＦを含有するＧ−１０カラムにおいて形成され る凝集体である。

第２のピークは、ＭＡ　Ｉ　Ｆの非凝集体を含有している。凝集体（ピーク１） および非凝集体（ピーク２）の両者はラフトバイオアッセイにおいて生物学的に 活性である。

ミルク抗炎症因子の特性化 上述の方法によって調製された非凝集体のＭＡＩＦの分子量は１ｏ、ｏｏｏダル トンよりも小さいことが判明した。これは、乳清からＭＡ　Ｉ　Ｆを単離する第 １工程が＞１０，０００ダルトンの分子雪掻を通過させない膜を使用した限外濾 過によるものであったことから推論されることであった。

ＭＡＩＦは陰電荷を有している。これは、ミルク限外濾液をＤＥＡＥセルロース イオン交換カラムに適用することに基づいて決定された。ＭＡｌＦは水を用いた 場合、カラムから溶出されなかった。

溶出媒質を塩化ナトリウム（０，９％ｐＨ）に変更することにより、幾つかのピ ークの溶出が得られた（第１図）。中性および陽性の電荷を有している種はこの イオン交換樹脂に結合せず、陰電荷を有する種が塩濃度を高くすることによって 溶出される。１０．０００ダルトンよりも小さな分子量の透過物をＤＥＡＥカラ ムに適用した場合、中性塩および糖類が水で溶出された（ピーク１、第１図）。

緩衝液を生理食塩水に変更したとき、３つの際立ったピークが溶出した（ピーク ２−４）。第２のピークおよびそのショルダーはう、トの検定においてＭＡ　Ｉ 　Ｆ生物活性を含有していた。したがって、ＭＡＩＦは陰電荷を有していると結 論される。

ＭＡＩＦの他の化学的特性は、それが塩の除去工程時に凝集体になることである 。この特性は、＜１０，０００ダルトンの分子量の透過物を２回蒸留水（ｄｏｕ ｂｌｅ　ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ）で平衡化したセファデックスＧ−１ ０カラムに通し、ｐＨ７の水で溶出した場合に現れる（第２図）。３つのピーク がＧ−１０カラムから溶出されたが、分子量が１０．０００ダルトンと同じ、ま たはそれよりも大きいことを示す第１のピークがわずかな容量ながらも溶出され た。１０゜０００ダルトンよりも大きな分子は限外濾過によって既に除去された はずであったので、このことは予期していなかった。２番目のピークは抗炎症因 子について期待される位置で溶出した。第１および第２のピークは共に、ラット 足検定において抗炎症生物活性を示したが、第３のピークは活性を欠いていた。

意外なことに、第１″！６よび第２の両ピークは抗炎症生物活性を有しているこ とが見ｔＸだされた。Ｇ−１０カラムの第１のピークから回収された物質（工程 ３）を凍結乾燥し、Ｇ−１００カラムに適用した：単一のピークがわずかな量で 溶出され、これは分子量が１０，０００ダルトンと同じ、またはそれよりも大き いことを示していた。工程３のＧ−１０カラムは、異なる分子量の種を分離する と同時に、塩を除去する。したがって、結論されることは、Ｇ−１０カラムの通 過時および塩の除去時に、抗炎症因子が大きな分子量の凝集体となることである 。凝集の程度は塩濃度によって種々異なる。

この凝集の性質は、抗炎症因子の存在に起因して抗炎症生物活性を有する広いス ペクトルの種々の分子雪積が形成され得る可能性を示唆するものである。この性 質の発見は、最終産物の凝集程度に応じて広いスペクトルの種々の生化学的性質 を有するミルク抗炎症因子群を製造することができることを示唆している。たと えば、加工時に分子量の分配を塩濃度によって制御し、比較的大きなまたは比較 的小さな分子量の凝集体を使用することによって、比較的長いまたは比較的短い 生物学的寿命を有する製剤を調製することができるであろう。本明細書に記載し ているカラムクロマトグラフィー法によって、生物活性を有する最も小さな分子 雪積が得られる（すなわち、工程３０Ｇ−１０カラムからのピーク２）。この観 察も、凝集体を形成するための他の方法の使用を示唆するものである。たとえば 、水による希釈によって、凝集が誘発される。塩類、特にカルシウムと結合する 化学物質は、凝集体の形成を誘発することができる。

この発見がなされたことによって、凝集体を形成させ、ＭＡＩＦを分離するため の他の方法が当業者により明白となるであろう。

実施例３ 生物学的活性検定 カラゲニンの溶液をラットの足１！（ｆｏｏｔｐａｄ）に注射することにより誘 発させた浮腫について、ＭＡＩＦの抗炎症作用を試験した。ＭＡＩＦの凍結乾燥 した試料を適当なビヒクルに溶解し、実験動物に腹腔内投与した。次いで、各後 脚足跡に１％生理食塩溶液０．１１量中カラゲニンをラットに投与した。注射す る前、および注射の２゜５時間後に、隙間ゲージを使用して足跡を計測した。得 られた結果を第２表および第３表に示す。

対照および過免疫ミルク由来の非−凝集型のＭＡＩＦ（Ｇ−１０カラムのピーク ２）により、投与量１１１ｇから０．２５ｍｇでラットの足の炎症が減少した（ 第２表）。過免疫ミルクおよびレギュラーミルク（ｒｅｇｕｌａｒ　ｍ１ｌｋ） 共に活性を示した。しかし、過免疫の物質のほうが高い活性であった。このこと から、ＭＡＩＦは、過免疫乳牛由来のミルクに比較的高い濃度で存在すると結論 された。

ＤＥＡＥカラム由来の２番目のピークは、過免疫ミルクまたはレギュラーミルク のいずれかから単離した場合も活性を示した。この活性は、比較すれば過免疫ミ ルクにおいて実質的に高い（第３表）。

凝集型のＭＡ　Ｉ　Ｆである、Ｇ−１０カラムからの第１のピークはラット足試 験で活性を示した（第２表）。しかし、その凝集体は、同重量を基準とした非凝 集体と比較すれば、同程度には高い活性でない。

これらの試験から、ＭＡＩＦ因子は乳牛ミルク中に天然で存在していると結論さ れる。乳牛を過免疫することにより、ミルク中のＭＡＴＦｌｌ［が高くなる。Ｍ ＡＩＦは、種々の方法によってミルクから分離することができる小さな負電荷の 分子である。このＭＡＩＦ因子は、ミルク中では天然に存在していないが加工時 に形成される大きな分子量の凝集体になることができる。

第２表 ラット炎症の減少に対するミルク抗炎症因子（Ｍ　Ａ　Ｉ　Ｆ　）の作用通常乳 牛ミルクからＲ製 第３表 ラットにおける炎症に対するミルクの半精製フラクシジンの比較（過免疫したレ ギニラーミルクから調製）抗炎症因子の試料を化学的に分析した。ＭＡＩＦは、 Ｘ線回折実験から決定されるように、結晶構造を示さない。ＭＡＩ　Ｆｇ製物は 、炭水化物組成と一致した元素分析値を示した。そのＣ，Ｈ，Ｏ比率は、酸化さ れてカルボキシ基になる幾つかのカルビノール基を含有するポリマー性またはオ リゴマー性物質に対応していた。塩素イオンよりも若干過剰のカルシウム当量は 一部、カルボン酸塩に由来するものと考えられる。残りはナトリウム塩またはカ リウム塩であるかもしれない。しかし、融解する態様、というよりも非−融解の 態様は、塩一様のおよび／または高分子量の組成物であることを示していた。現 在の精製状態の物質は、明らかに種々の量のカルシウムと塩素との塩、おそらく はＣａＣ（１，を含有している。

いずれの調製物も、その組成中にペプチド成分が存在することを示唆する有意な 量で窒素を含有していない。同様に、このような窒素が存在しないことにより、 アミノ糖、および種々の複合脂質などの他の窒素含有物質をその主要な成分（群 ）として存在する可能性を排除することができる。

熱分解の質量スペクトルにより、１８炭素の脂肪酸の有意なトレースが示された 。このことは、ＮおよびＰのトレースとも考え合わせ、本因子中に複合脂質が存 在することを示唆するものである。

赤外吸収スペクトル分析により、カルビノールおよびカルボキシレート基と一致 した吸収が見いだされた。紫外部、可視部、および蛍光分析では、赤外吸収によ って示された以上の発色団は有意な量として示されなかった。

これらの化学試験は、カルボニル官能基（アルデヒドまたはケトン）がサブユニ ’ｙ　）連鎖に関与しているオリゴマー性炭水化物と矛盾がない。このオリゴマ ー性炭水化物もカルボキシレートへの酸化側鎖を幾つか含有している。

ＭＡ　Ｉ　Ｆ調製物は実質的に（完全にではない）純粋である。

上記のように本発明を一般的に説明してきたが、本発明の思想または範囲に影響 を与えることなく、これらに多くの変化および改良を施すことができることは、 当業者にとっては容易に知れるところであろう。

穴７単序し凛　（丁九）亭ｆうｔジ に甲玄・／１　（千九１事卓１幻 国際調査報告

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）ミルク産生動物のミルクから脂肪を除去してスキムミルクを調製し、 （ｉｉ）該スキムミルクからカゼインを除去して乳清を調製し、（ｉｉｉ）約１ ０，０００ダルトンよりも大きな分子量の巨大分子を該乳清から除去し、 （ｉｖ）イオン交換クロマトグラフィーによって、前工程で得られた低分子量の 産物を分画し、 （ｖ）分子ふるいクロマトグラフィーによって、前工程で得られた抗炎症因子を さらに精製し、そして （ｖｉ）該抗炎症因子を採取する、 ことを特徴とする方法によって調製される、実質的に純粋な形態にある抗炎症因 子。
2. ２．該ミルク産生動物がウシである請求項１に記載の抗炎症因子。
3. ３．該ミルク産生動物がヒツジである請求項１に記載の抗炎症因子。
4. ４．該ミルク産生動物が過免疫状態にある請求項１に記載の抗炎症因子。
5. ５．スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス 、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ１、ストレプトコッカス・ピオゲ ネスＡ．タイプ３、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ５、ストレプト コッカス・ピオゲネスＡ．タイプ８、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイ プ１２、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ１４、ストレプトコッカス ・ピオゲネスＡ．タイプ１８、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ２２ 、アエロバククー・アエロゲネス、エシェリシア・コリ、シュードモナス・アエ ルギノーザ、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモネラ・チフィムリウム、ヘモ フィルス・インフルエンザ、ストレプトコッカス・ミチス、プロテウス・ブルガ リス、シゲラ・ディセンテリエ、ディプロコッカス・ニューモニエ、プロピオニ バクター・アクネス・アクチノマイセス（アナエロープ）、ストレプトコッカス ・ミュータンス、またはストレプトコッカス・アガラクチェ からなる細菌抗原群の多価混合物を投与することによって該過免疫状態を誘発さ せる請求項４に記載の抗炎症因子。
6. ６．該多価細菌抗原を該動物に経口投与する請求項５に記載の抗炎症因子。
7. ７．該多価ワクチンを陽管外投与する請求項５に記載の抗炎症因子。
8. ８．分子量が約１０，０００ダルトンよりも大きな該巨大分子の除去を、約１０ ，０００ダルトンの分子を保持する分子ふるい膜に該乳清を通す限外濾過により 行う請求項１に記載の抗炎症因子。
9. ９．分子量が約１０，０００ダルトンよりも大きな該巨大分子を分子ふるいクロ マトグラフィーによって除去する請求項１に記載の抗炎症因子。
10. １０．該因子が相対分子量０から１０，０００ダルトンを有している請求項１に 記載の抗炎症因子。
11. １１．（ｉ）ミルク産生動物のミルクから脂肪を除去してスキムミルクを調製し 、 （ｉｉ）該スキムミルクからカゼインを除去して乳清を調製し、（ｉｉｌ）約１ ０，０００ダルトンよりも大きな分子量の巨大分子を該乳清から除去し、 （ｉｖ）イオン交換クロマトグラフィーによって、前工程で得られた低分子量の 産物を分画し、 （ｖ）分子ふるいクロマトグラフィーによって、前工程で得られた抗炎症因子を さらに精製し、そして （ｖ１）該抗炎症因子を採取する、 ことを特徴とする、実質的に純粋な形態にある抗炎症因子をミルクから単離する 方法。
12. １２．該ミルク産生動物が過免疫状態にある請求項２０に記載の方法。
13. １３．スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディ ス、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ１、ストレプトコッカス・ピオ ゲネスＡ．タイプ３、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ５、ストレプ トコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ８、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タ イプ１２、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ１４、ストレプトコッカ ス・ピオゲネスＡ．タイプ１８、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ．タイプ２ ２、アエロバククー・アエロゲネス、エシェリシア・コリ・シュードモナス・ア エルギノーザ、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモネラ・チフィムリゥム、ヘ モフィルス・インフルエンザ、ストレプトコッカス・ミチス、プロテウス・ブル ガリス、シゲラ・ディセンテリエ、ディプロコッカス・ニューモニエ、プロピオ ニバクター・アクネス・アクチノマイセス（アナエロープ）、ストレプトコッカ ス・ミュータンス、またはストレプトコッカス・アガラクチェ からなる細菌抗原群の混合物を投与することによって該過免疫状態を誘発させる 請求項１３に記載の方法。
14. １４．該多価細菌抗原を該動物に経口投与する請求項１２に記載の方法。
15. １５．該多価ワクチンを腸管外投与する請求項１２に記載の方法。
16. １６．分子量が約１０，０００ダルトンよりも大きな該巨大分子の除去を、約１ ０，０００ダルトンよりも大きな分子を保持する分子ふるい膜を介する限外濾過 によって行うことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
17. １７．約１０，００００ダルトンよりも大きな該巨大分子を分子ふるいクロマト グラフィーにより除去する請求項１２に記載の方法。
18. １８．オリゴマー性炭水化物を含有する、ミルク由来の実質的に純粋な形態にあ る抗炎症因子。
19. １９．該炭水化物のカルボニル官能基がサブユニット連鎖に関与している請求項 １８に記載の抗炎症因子。
20. ２０．該炭水化物がカルボキレートイオンヘの酸化側鎖を含有する請求項１８に 記載の抗炎症因子。
21. ２１．該炭水化物がカルシウムイオンと複合体化している請求項１８に記載の抗 炎症因子。
22. ２２．該炭水化物が脂肪酸と複合体化している請求項１８に記載の抗炎症因子。
23. ２３．該炭水化物が窒素化合物を伴う請求項１８に記載の抗炎症因子。
24. ２４．該炭水化物がリン化合物を伴う請求項１８に記載の抗炎症因子。
25. ２５．該炭水化物が複合脂質を伴う請求項１８に記載の抗炎症因子。
26. ２６．該炭水化物がイオウ化合物を本質的に欠いている請求項１８に記載の抗炎 症因子。
27. ２７．抗炎症作用に有効な量の請求項１に記載の抗炎症因子を動物に投与するこ とを特徴とする該動物の炎症を処置する方法。
28. ２８．抗炎症作用に有効な量の請求項１８に記載の抗炎症因子を動物に投与する ことを特徴とする、該動物の炎症を処置する方法。
29. ２９．該炎症が、急性および亜急性滑液嚢炎、急性非特異的腱炎、全身性エリテ マトーデス、全身性皮膚筋炎、急性リウマチ性心臓炎、天疱瘡、水泡性皮膚炎、 ヘルベテホルミス、重篤な紅斑、多形性剥脱性皮膚炎、肝硬変、季節的宿根鼻炎 、気管支喘息、異所性皮膚炎、血清病、角膜炎、オプサルミクス虹彩炎、広汎性 ウレイチス、コリジチス、視神経炎、交感性眼炎、症候性サルコイドーシス、レ フラー症候群、ベリリウム症、溶血性貧血、および乳腺炎の中から選択される症 状によって引き起こされるものである請求項１７に記載の方法。