FI78483B - Rening av modulatorer foer immunsystem. - Google Patents

Description

1 78483

Immuunisysteemin modulaattorien puhdistaminen

Keksinnön kohteena on menetelmä ihmisen leukosyyttien uutteesta saatujen vahvistajien 1-6 ja/tai L- ja/tai S-vai-5 mentimen puhdistamiseksi ja niiden erottamiseksi toisistaan ja muista vahvistavia, vaimentavia ja indusoivia vaikutuksia omaavista materiaaleista sekä oleellisesti kaikista fluoresamiinille reaktiivisista materiaaleista.

Mainitut immuniteettijärjestelmän moduloivat aineet, 10 ts. vahvistajat 1-6 ja L- ja S-vaimentimet vaikuttavat merkittävästi solujen välittämien immuniteettireaktioiden laatuun ja määrään ja niitä voidaan käyttää erilaisten kliinisten tilojen hoidossa, joille on tunnusomaista yliherkkyys tai riittämätön reaktio määrätyn antigeenin suhteen, ja mää-15 rättyjen vastustuskyvyttömyyden tilojen lievittämiseen.

Ihmisen immuniteettijärjestelmä on erittäin monimutkainen ja se tunnetaan nykyisin vain epätäydellisestä. Sen katsotaan nykyisin käsittävän kaksi pääkohtaa, humoraalinen immuniteetti, jonka välittäjinä toimivat kehossa kiertävät 20 vasta-aineet ja solujen välittämä immuniteetti, jonka välittäjinä toimivat, kuten nimi osoittaa, imusolut. Humoraalinen immuniteetti siirtyy immuunista antajasta ei-immuuniseen vastaanottajaan seerumin immunoglobuliinien vaikutuksesta ja tällaiset seerumin välittämät siirrot aiheuttavat immuuni-25 reaktioita, jotka voidaan todeta lähes välittömästi. Solujen välittämä immuniteetti siirtyy pintaverileukosyyttien vaikutuksesta. Solujen siirtämä immunisuus kehittyy hitaasti, useiden tuntien aikana.

Solujen välittämän immuniteetin tyypillinen ilmene-30 minen on hidastunut yliherkkyysreaktio, joka lyhennetään kirjaimin "DH" tässä. DH-ihoreaktio havaitaan, jos asianmukaista antigeeniä ruiskutetaan ihonalaisesti. Paikallista tulehtumista (eryteema) ja turpoamista sekä paksuuntumista (induraatio) havaitaan 24-48 tunnin aikana herkillä yksilöillä ja herkkyys-35 aste voidaan mitata reaktion koon ja vaikeusasteen perusteella. DH-reaktio aiheuttaa myös luonteenmaisia histologisia löytöjä, erikoisesti lymfosyyttien ja monosyyttien perivas-kulääristä tihkumista tulehtuneeseen alueeseen. DH-reaktion 2 78483 kohdassa nähdyt solut ovat peräisin pintaverileukosyyteistä.

Solujen välittämän immuniteetin mekanismia ei vielä täysin tiedetä. Tiedetään, että solut, jotka välittävät reaktion, pystyvät reagoimaan useilla tavoilla antigeeni-5 ärsytykseen. Näihin reaktioihin kuuluvat: solujen lisääntyminen, jotka omaavat määrätyn herkkyyden annetulle antigeenille; solujen kehittyminen ja lisääntyminen, jotka välittävät erilaisia immuunitoimintoja mukaan luettuna vasta-aineiden muodostuminen; ja reaktiot vieraita soluja ja kas-10 vannaisia vastaan. Näiden reaktiokuvioiden laatuun ja määrään vaikuttavat useat tekijät mukaan luettuina kilpirauhasen ja aivolisäkkeen etulohkon hormonit; interferonit; ja muut solureaktioiden aiheuttajat, kuten histamiini, sero-toniini ja prostaglandiinit.

15 Vuonna 1954 H.S. Lawrence esitti, että lysaatti val mistettuna tuberkuliinille herkkien antajien leukosyyteistä voi siirtää tämän herkkyyden tuberkuliinille reagoimattomille vastaanottajille (Journal of Clinical Investigation, 33, 951 (1954). Katso Lawrence H.S., The Harvey Lectures, 20 68, 239 (1974) ja Transfer Factor: Basic Properties and

Clinical Applications, M.S. Ascher, A.A. Gottlieb ja C.H. Kirkpatrick, Eds., Academic Press, Inc., New York (1976) ja Immune Regulators in Transfer Factor, A. Kahn et. al, toim., Academic Press, Inc. New York (1979). Herkkyyden siirtymi-25 sen oletettiin aiheutuvan leukosyyttilysaatissa olevasta tekijästä, jolle myöhemmin annettiin nimi "siirtotekijä" (Lawrence H.S., kommentti J.S. Najarian'in ja J.D. Feldman'in kirjoitukseen julkaisussa Cell-Bound Antibodies (B. Amos ja H. Koprowski toim.). "Siirtotekijä"-ilmiö voidaan osoittaa 30 vain ihmisillä. Tutkimuksen edistyminen eristettäessä ja luonnehdittaessa vaikutusperiaatetta on sitten ollut hidasta.

Siirtotekijän osoittamiseksi täytyy valita kaksi potilasta, luovuttaja, jonka tiedetään omaavan DH-reaktion 35 annetulle antigeenille ja vastaanottaja, jonka tiedetään olevan vastustuskykyisen DH-reaktiolle ärsytettynä samalla antigeenillä (ja jolta siten oletettavasti puuttuu solujen välittämä immuniteetti tämän antigeenin suhteen). Luovuttajan verestä saadut leukosyytit murskataan ja solujen 3 78483 sisällöt dialysoidaan. Väkevöityä dialysaattia, sopivassa puskurissa, injektoidaan ihonalaisesti vastaanottajan kyynärvarteen tai muuhun sopivaan kohtaan. Noin kahden vuorokauden kuluttua ärsytetään vastaanottajaa injektoimalla 5 ihonalaisesti antigeeniä samaan tai toiseen kohtaan. Tyypillinen DH-reaktio voidaan havaita noin viikon kuluttua. Täten siirretyn immuniteetin on ilmoitettu säilyvän vastaanottajassa jopa kaksi vuotta.

Edistystä siirtotekijän eristämiseksi ja tutkimi-10 seksi on hidastanut siihen liittyvien rakenteellisten tai kemiallisten tietojen puute sekä se, että fraktioinnin jälkeen havaitut ilmiöt ovat usein laadullisesti eroavia alkuperäisen dialysaatin aiheuttamista ilmiöistä. Vaikka termi "Siirtotekijä" esiintyy kirjallisuudessa liitettynä frak-15 tioituihin valmisteisiin ja sitä tarkkaillaan muiden kuin DH-ihoreaktion kriterioiden avulla, on epäselvää, tarkoittaako tämä termi todella yhtä ainoaa biokemiallista kokonaisuutta tai vaikutusta, joka aiheutuu yhdestä ainoasta biologisesta toiminnasta. Tässä käytettynä termi "siirto-20 tekijä" rajoitetaan raakaan leukosyytti-dialysaattiin eristettynä Lawrence'n esittämällä tavalla ja jonka vaikutuksen on Lawrence alunperin luonnehtinut, so. kyky siirtää immuniteetti määrättyä antigeeniä vastaan erittäin herkältä luovuttajalta epäherkkään vastaanottajaan.

25 Aikaisempi ihmisen siirtotekijän fraktiointi on osoittanut useiden aktiivisten materiaalien läsnäolon. Vandenbark, A.A., et ai, J. Immunol. 118, 636 (1977) on esittänyt leukosyyttiuutteiden kromatografiset tulokset Sephadex G-25 materiaalia käytettäessä (kauppanimi, 30 Pharmacia, Inc., Uppsala, Ruotsi). Biologisen vaikutuksen in vivo havaittiin esiintyvän vain liittyneenä kahteen optisen tiheyden päähuippuun aallonpituuksilla 254 nm tai 280 nm. Yhden tällaisen huippujakeen on esitetty siirtävän merkittävää ihon koereaktiivisuutta antigeenille reagoivil-35 ta luovuttajilta aikaisemmin reagoimattomille vastaanottajille. Toinen huippu antoi spontaanin vaikutuksen (ihoreaktion ilman antigeenin lisäämistä) ja myös huomattavasti 4 78483 suurentuneen ihoreaktion antigeenin kanssa. Huippujakeet fraktioitiin edelleen isoelektrisen fokusoinnin ja kään-teisfaasikromatografisen menetelmän avulla käyttäen liuo-tinsysteeminä 1 %:ista etikkahappoa tai 5 %:ista metanolia 5 pylväässä, joka oli täytetty oktadekyylisilaanihartsilla. Kuitenkaan tuloksia biologisista vaikutustesteistä jatko-fraktioinnin jälkeen ei ilmoitettu.

Gottlieb, A.A., et ai, Transfer Factor: Basic Properties and Clinical Applications, sivulla 263 esittää 10 fluoresamiinin käytön leukosyyttidialysaattien fraktioinnin valvontatapana. Fluoresamiini (tunnetaan myös nimellä "Fluram", kauppanimi, Hoffman-LaRoche, Inc, Nutley, N.J.) reagoi primäärisiä aminoryhmiä sisältävien aineiden kanssa erittäin fluoresoivien tuotteiden muodostuessa, jotka 15 sallivat proteiinien ja muiden primäärisiä aminoryhmiä sisältävien yhdisteiden erittäin herkän analyysin. Dialy-soitavaa leukosyyttiuutosmateriaalia fraktioitiin Sephadex G-10 pylväässä (kauppanimi, Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi) ja biologisen vaikutuksen havaittiin liittyvän korkeim-20 paan fluoresamiini-reaktiiviseen huippuun. Hidastuneet yliherkkyysreaktiot havaittiin riippumatta siitä, käytettiinkö antigeeniä vai ei, vaikka reaktio oli hieman voimakkaampi antigeeniä käytettäessä.

Gottlieb A.A., et ai fraktioivat edelleen dialysoi-25 tavia leukosyyttiuutteita, kuten julkaisussa J.

Reticuloendothelial Soc., 21, 403 (1977) on esitetty. Uutoksille suoritettiin ensin differentiaalinen molekyyli-painodialyysi käyttäen dialyysimembraaneja, joiden nimelliset molekyylipainon erottelurajät olivat vastaavasti 30 12 000 ja 3 500. Materiaalia, joka läpäisi jälkimmäisen membraanin ja jonka molekyylipainoalue oli yleensä pienempi kuin 3 500, kutsuttiin nimellä "S"-jae ja materiaalia, jonka yleinen molekyylipainoalue on välillä 3 500 - 12 000, kutsuttiin nimellä "L"-jae. Molemmille jakeille suoritet-35 tiin geelisuodatus Sephadex G-10 pylväässä. Biologinen aktiivisuus liittyi jälleen fluoresamiini-reaktiivisiin huippuarvoihin. Aktiivisuus ei kuitenkaan osoittaudu olevan 5 78483 riippuvainen luovuttajan immunologisesta tilasta. Lisäksi havaittiin kaksi erillistä vaikutusta. Ensimmäinen oli DH-reaktion kehittyminen antigeeniä lisäämättä ja riippumatta luovuttajan tai vastaanottajan immunologisesta tilasta. Tä-5 tä vaikutusta kutsutaan tässä "vaikuttajaksi", kuten myöhemmin esitetään. Toinen vaikutus oli edistää intradermaa-lisia reaktioita antigeenien suhteen, joille vastaanottaja oli herkkä, mutta ei niiden antigeenien suhteen, joille vastaanottajaa ei aikaisemmin oltu altistettu. Tämä vaiku-10 tus, joka havaittiin fluoresamiinille reagoivissa kromatografisissa jakeissa, osoitti edistävän vastaanottajan DH-herkkyyttä antigeenin suhteen, jolle hän oli ennestään altis. Molemmissa tapauksissa luovuttajan herkkyys osoittautui olevan merkityksetön. S-jakeen jatkofraktiointi hydrok-15 syyliapatiittikromatografiaa käytettäessä osoitti, että biologinen aktiivisuus, joka aiheuttaa DH-reaktion antigeeniä lisäämättä, ei liity polypeptidin pääjakeeseen mitattuna reaktion avulla fluoresamiinin kanssa.

Gottlieb, A.A. et ai esittivät lisätietoa (J. Immunol., 20 124, 885 (1980) saatuna fraktioimalla "vaikuttajaa" (muo dostaa DH-reaktion ilman antigeenin lisäystä) ja "vahvistajaa" (muodostaa DH-reaktion antigeenin läsnäollessa, jolle vastaanottajan tiedetään olevan herkän) 150 cm pituisen Sephadex G-10 pylvään avulla. "Vahvistaja" pysyi liittynee-25 nä fluoresamiinille reaktiivisiin pääjakeisiin, kun taas "vaikuttaja" ei pysynyt. Fraktioitaessa edelleen hydroksyy-liapatiitilla "vahvistajan" vaikutus säilyi liittyneenä fluoresamiinille reaktiiviseen huippuun. Valvotut tutkimukset osoittivat, että esitettyjä vaikutuksia ei havaittu 30 punaisten verisolujen samalla tavalla käsitetyissä lysaa-teissa eikä mitään aktiivisuutta liittynyt suolaliuokseen käsiteltynä saman puhdistusmenettelyn avulla.

Gottlieb A.A. et ai (Immune Regulators in Transfer Factor), A. Kahn, C. Kirkpatrick ja Hill, toimittajat, 35 Academic Press, Inc, New York (1979), sivu 339, mainitsevat ilman numerotietoja olevassa raportissa, että lisävaikutus, jota kutsutaan "valmentajaksi", voidaan erottaa 6 78483 "lisääjästä" hydroksyyliapatiittikromatografiän avulla. "Lisääjä" löydettiin "S"-dialyysijakeessa ja se oli aina liittynyt fluoresamiinille reaktiiviseen päähuippuun. "Lisääjä"- jakeen oletettiin vaikuttavan systemaattisesti ai-5 kaisemmin BCG-herkistettyihin energisiin potilaisiin. Lisäksi "vaimennin"-vaikuttajän todettiin "L"-dialyysissä eluoivan suuremmilla suolapitoisuuksilla kuin fluoresamii-nireaktiivinen materiaali hydroksyyliapatiittikromatogra-fiässä. Toisessa tutkimuksessa, jolloin dialysoituja leu-10 kosyyttiuutoksia fraktioitiin, Wilson G.B. et ai /J. Lab. Clin. Med. 93, 819 (1979)J ilmoittivat neljä vaikutusta, jotka aiheuttivat in vitro leukosyyttimigraatiota: kaksi antigeenistä riippumatonta vaikutusta (aiheuttavat reaktion ilman antigeeniä), antigeenistä riippuvan määrätyn vaimen-15 tajän ja antigeenistä riippuvan vahvistajan. Antigeenistä riippuvan valmentajan ominaisuudet olivat yhteisiä "siirto-tekijän" kanssa, koska vain asianmukaiselle luovuttajalle spesifinen antigeeni aiheutti in vitro leukosyyttien migraation eston. Leukosyyttien migraation antigeenistä riip-20 puvaan kasvuun ei vaikuttanut antigeenin spesifisyys. Tällä vaikutuksella kuitenkaan ei tiedetä olevan vaikutusta mihinkään ihmisen immuunijärjestelmän in vivo toimintaan eikä sillä ole mitään ennustettavaa terapeuttista käyttöä.

Tämä keksintö liittyy ihmisen immuunijärjestelmää 25 moduloiviin aineisiin. Tässä määriteltynä moduloiva aine on aine, joka aiheuttaa eläimen tai ihmisen kehon, sen osan tai siitä otetun aineen suoran tai epäsuoran reaktion antigeenin suhteen, jolle mainittu keho on aikaisemmin altistettu, jolloin tällainen reaktio liittyy erikoisesti 30 mainitun eläimen tai ihmisen immuniteettijärjestelmän toimintaan. Aineet, joilla on yleisiä vaikutuksia, joihin voivat kuulua vaikutukset immuunireaktioihin, eivät siten kuulu tässä määriteltyyn termiin "moduloiva aine". Nämä tässä esitettävät moduloivat aineet osoittavat vaikutuk-35 sensa DH-ihoreaktiotestissä ja siten niiden päävaikutus osoittautuu kohdistuvan soluvälitteiseen immuniteettijärjestelmään. On kuitenkin otettava huomioon, että esitettä- 7 78483 villä moduloivilla aineilla on laajoja vaikutuksia koko immuniteetti järjestelmään ja ne voivat vaikuttaa humoraali-seen immuniteettijärjestelmään. Tässä esitettävää tarkastelua varten termit "siirtotekijä", "vaikuttaja", "vahvis-5 taja" ja "valmentaja" on jokainen määritelty niiden vastaavien vaikutusten mukaan DH-vasteen parantamiseksi ihoreaktioissa.

Termi "siirtotekijä" kohdistuu raa'an leukosyytti-uutteen dialysaattiin, kuten myöhemmin esitetään. "Siirto-10 tekijän" vaikutus todetaan, kun siirtotekijävalmiste tehdään luovuttajan leukosyyteistä, jonka tiedetään olevan herkän annetulle antigeenille ja siten injektoidaan ihonalaisesti vastaanottajaan, jonka tiedetään olevan epäher-kän mainitun antigeenin suhteen. Vastaanottajaa ärsytetään 15 myöhemmin antigeenillä ja DH-reaktio havaitaan. Normaalisti vastaanottaja, injektoidun siirtotekijän vaikutuksen puuttuessa, ei reagoisi. On ymmärrettävä, että siirtotekijät eivät ole moduloivia aineita, kuten myöhemmin määritetään, koska siirtotekijän vaikutus havaitaan vastaanottajassa, 20 jota ei aikaisemmin ole altistettu annetulle antigeenille, kun taas vahvistajat ja valmentajat tässä esitettyinä aiheuttavat määrittämättömiä vaikutuksia jokaisen antigeenin suhteen, jolle vastaanottaja on aikaisemmin altistettu.

"Vaikuttaja" määritellään aktiivisuutena, joka ai-25 heuttaa DH-reaktion ilman antigeenin lisäystä ja riippumatta luovuttajan ja vastaanottajan herkkyydestä.

"Vahvistimelle" on tunnusomaista normaalia suuremman vasteen muodostuminen herkässä vastaanottajassa sen antigeenin injektion jälkeen, jolle vastaanottaja on herkkä. 30 Vahvistimen vaikutus ei riipu luovuttajan määrätystä immunologisesta herkkyydestä.

"Valmentajan" vaikutus havaitaan herkässä vastaanottajassa, kun vaimenninta ja sitä antigeeniä, jolle vastaanottaja on herkkä, injektoidaan yhdessä, jonka tulokse-35 na vastaanottajassa ilmenee normaalia pienempi DH-reaktio.

Esiteltävän keksinnön mukaan ihmisen immuniteetti-järjestelmän moduloivia aineita eristetään leukosyyttiuut- 8 78483 teiden dialysaateista. Kuudella tällaisella moduloivalla aineella on vahvistava vaikutus ja kahdessa on vaimentava vaikutus. Vahvistimia pidetään käyttökelpoisina anergisten tilojen hoidossa sekä immuunin yliherkkyystilan hoidossa 5 sekä paikallisesti että elimistöllisesti, kun taas vaimen-timia pidetään käyttökelpoisina paikallisten yliherkkyys-tilojen, kuten myrkkymuratin aiheuttamina, hoidissa ja käsittelyssä. Näitä vahvistimia kutsutaan vahvistimiksi 1-6. Vaimentimia kutsutaan S-vaimentimiseksi ja L-vaimentimeksi. 10 Esiteltävän keksinnön tavoitteena on aineiden saami nen, joiden tehtävänä on moduloida immuunireaktioita. Nykyisten menetelmien avulla on mahdollista moduloivien aineiden tunnistaminen, jotka vahvistavat tai vaimentavat reagointia antigeenien suhteen, joille yksittäiset ihmiset 15 on aikaisemmin altistettu. On kuitenkin ilmeistä, että useita moduloivia toimintoja voidaan todeta näiden aineiden vaikutuksesta mukaan luettuina reaktion kesto, herkkyyskyn-nys ja reaktiotyyppi joko tulehduksellinen, lymfosyyttien kasvu tai kiertävien vasta-aineiden muodostuminen. Ilmei-20 sesti nämä moduloivat toiminnat voidaan määritellä testi-järjestelmien mukaan, joita käytetään niiden ilmaisemiseen ja mittaamiseen. Esiteltävään keksintöön liittyviin moduloiviin aineisiin eivät kuulu pelkästään vahvistajat ja valmentajat DH-reaktion suhteen, vaan myös muut sellaiset 25 immuniteettia moduloivat vaikutukset, jotka voidaan ilmaista ja mitata muiden sopivien testijärjestelmien avulla.

Tässä esitetyt moduloivat aineet muodostavat siten vain osan moduloivien aineiden järjestelmästä, jotka muodostavat luonnollisen tavan solujen välistä yhteyttä var-30 ten immuunijärjestelmän osien välillä, jolloin immuunivasteen tilaa jatkuvasti valvotaan ja muutetaan kulloisenkin antigeeniärsytyksen tason ja aktiviteetin mukaan. Siten όη mahdollista löytää muitakin moduloivia aineita. Lisätutkimusten avulla, joissa käytetään muita puhdistusmenetelmiä 35 ja testimenettelyjä, voidaan tunnistaa ja puhdistaa näitä moduloivia aineita.

9 78483

Keksinnön mukaiselle menetelmälle vahvistajien 1-6 ja/tai L- ja/tai S-vaimentimen puhdistamiseksi ja erottamiseksi on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

5 Vahvistimelle 1 on tunnusomaista kiihdyttävä ja li säävä vaikutus annetulle antigeenille herkän vastaanottajan DH-ihoreaktioihin. Vahvistimen 1 aiheuttamat reaktiot annosteltuna antigeenin kanssa saavuttavat huippuvoimakkuu-den noin 6-14 tunnin kuluttua ihonalaisesta injektiosta ja 10 heikkenevät nopeasti sen jälkeen. (Tästä poiketen, normaali DH-reaktio ilman vahvistajaa saavuttaa huipun 24-30 tunnin kuluttua antigeenin injektion jälkeen.) Vahvistaja 1 voidaan eristää muista edellä mainituista moduloivista aineista käänteisfaasikromatografisella menetelmällä käyttä-15 mällä oktadekyylisilaanipylvästä eluoituna nollasta 100 %:iin (tilav./tilav.) olevalla etanoli/vesigradienttieluen-tilla. Vahvistaja 1 voidaan eluoida pylväästä vähintään 15 %:isella (tilav./tilav.) etanolilla vedessä ja pääosa tästä vahvistajasta voidaan eluoida noin 15-20 %:isella (tilav./ 20 tilav.) etanolilla vedessä. Vahvistajan 1 ei voida osoittaa reagoivan fluoresamiinin kanssa ja se eristetään fluores-amiinireaktiivisuuden päähuipusta käänteisfaasikromatogra-fisen menetelmän avulla. Vahvistaja 1 läpäisee dialyysi-membraanin, jonka nimellinen molekyylipainon (MP) erotus-25 raja on 3 500.

Vahvistaja 2 aiheuttaa myös sekä kiihtyneen ja lisääntyneen reaktion antigeenin suhteen, vaikka kiihtymis-aste on hieman hitaampaa kuin vaste vahvistajaan 1. Reak-tiokohdat ovat rajoitetumpia kuin vahvistajan 1 sekä anti-30 geenin aiheuttamat ja ne säilyvät huomattavasti kauemmin (7 vuorokauteen asti). Mitä yllättävintä, suurin vahvistava teho havaitaan vain optimaalisella pitoisuudella, kun taas suuremmat kuin optimaaliset pitoisuudet pienentävät vahvistusta tai jopa vaimentavat DH-reaktiota. Vahvistaja 2 10 73483 voidaan eluoida oktadekyylisilaanista vähintään 45 %:isella (tilav./tilav.) etanoli/vesi-liuoksella ja pääosa tästä vahvistajasta voidaan eluoida noin 45 tilavuus-%:isesta noin 53 tilavuus-%:iseen asti olevalla etanoli/vesiseoksella. Sen 5 ei voida osoittaa reagoivan fluoresamiinin kanssa ja se voidaan erottaa muista esitetyistä moduloivista aineista, jotka on eristetty leukosyyttiuutteiden dialysaatista ja myös näissä uutteissa olevien fluoresamiinireaktiivisten materiaalien päähuipusta käänteisfaasikromatografisen mene-10 telmän avulla. Vahvistajan 2 molekyylipaino ja koko ovat sellaiset, että se läpäisee dialyysimembraanin, jonka nimellinen molekyylipainon erotusraja on noin 3 500.

Vahvistajat 3, 4 ja 5 aiheuttavat kasvaneen vasteen antigeenin suhteen. Laimennustutkimukset osoittavat, että 15 vahvistimien 3 ja 5 teho kasvaa laimennettaessa niin, että vahvistajan 4 tehoa voidaan myös parantaa, vaikka arvot ovat hieman enemmän epävarmoja. Vahvistajat 3, 4 ja 5 voidaan eluoida oktadekyylisilaanista vastaavasti 70-tilavuus-%:isen, 80 tilavuus-%:isen ja 89 tilavuus-%:isen etanoli/ 20 vesi-liuoksen avulla. Pääosa näistä vahvistajista voidaan eluoida seuraavilla etanoli/vesi-pitoisuusalueilla: vahvistaja 3 70 tilavuus-%:sta 74 tilavuus-%:iin; vahvistaja 4 80 tilavuus-%:sta 84 tilavuus-%:iin; vahvistaja 5 89 tilavuus-%:sta 94 tilavuus-%:iin. Minkään näistä vahvis-25 tajista ei voida osoittaa reagoivan fluoresamiinin kanssa ja kaikki voidaan erottaa kaikista toisista ja muista tässä esitetyistä moduloivista aineista käänteisfaasikromatografisen menetelmän avulla. Vahvistajat 3, 4 ja 5 ovat kaikki kooltaan sellaisia, että ne läpäisevät dialyysi-30 membraanin, jonka nimellinen molekyylipainon erotusraja on noin 3 500.

Vahvistaja 6 aiheuttaa lisääntyneen vasteen antigeenille DH-reaktiossa ja sillä on osoitettu olevan myös elimistöllisiä vaikutuksia. Tässä esitetyille vahvistavil-35 le moduloiville aineille lukuun ottamatta vahvistajaa 1 on yhteistä se, että voimakkainta reaktiota vastaa optimian-nos, mikä reaktio havaitaan verrattaessa eristettyjen n 78483 näytteiden vaikutusta laimennuksen kasvaessa. Vahvistaja 6 voidaan eluoida oktadekyylisilaanista 100 tilavuus-%:isella etanolilla. Sen ei voida osoittaa reagoivan fluoresamiinin kanssa ja se voidaan eristää muista tässä esitetyistä modu-5 loivista aineista käänteisfaasikromatografisen menetelmän avulla. Vahvistimen 6 molekyylipaino ja koko ovat sellaiset, että se läpäisee dialyysimembraanin, jonka nimellinen molekyylipainon erotusraja on noin 3 500.

S-vaimennin eristetään dialysaatista, joka lävistää 10 membraanin, jonka nimellinen molekyylipainon erotusraja on 3 500. S-vaimennin voidaan todentaa ja ainakin osaksi erottaa vahvistajista 1 ja 2 käänteisfaasikromatografisen menetelmän avulla ja eluoimalla 0-100 tilavuus-%:isella etanoli/vesi-gradienttiliuottimella. S-vaimennin voidaan 15 eluoida oktadekyylisilaanista alueella 67-100 tilavuus-% olevalla etanoli/vesi-seoksella ja sitä on selvästi läsnä jakeissa, jotka on eluoitu 96-100 tilavuus-%:isella seoksella. S-vaimentimen ei voida osoittaa reagoivan fluoresamiinin kanssa, mikä voidaan havaita sen erotettavuuden 20 vuoksi fluoresamiinireaktiivisesta huipusta käänteisfaasikromatografisen menetelmän avulla. DH-ihoreaktion vaimeneminen todetaan, jos S-vaimenninta injektoidaan ennen tai samanaikaisesti testiantigeenin injektoinnin kanssa, jolle vastaanottajassa tapahtuu DH-reaktio. Vaimentuminen on 25 käänteinen tai lyhytaikainen ja se hidastaa DH-reaktion esiintymistä noin 72 tuntia. Vaimentumista ei havaita, jos vahvistajaa 2 injektoidaan samanaikaisesti S-vaimentimen kanssa.

L-vaimennin on havaittu siinä leukosyyttiuutteen ja-30 keessa, joka läpäisee dialyysimembraanin, jonka molekyyli-painon nimelliserotusraja on 12 000, mutta siirtyminen estyy membraanin vaikutuksesta, jonka erotusraja on 3 500. Samoin kuin S-vaimentimen vaikutus, L-vaimentimen vaikutus on käänteinen ja sen vaimennuskyky kestää noin 35 72 tuntia. L-vaimennin ei ole fluoresamiinireaktiivinen, mitä osoittaa se, että se voidaan erottaa fluoresamiinille 12 78483 reaktiivisesta päähuipusta hydroksyyliapatiitti-kromatogra-fian avulla.

Seuraavissa esimerkeissä on esitetty menettelyjä, jolloin materiaalit saatiin ihmisluovuttajilta ja koemit-5 taukset suoritettiin ihmisvastaanottajilla. Niissä käytetyt menettelyt ja reagentit on valittu siten, että saadaan steriilejä ja myrkyttömiä tuotteita ihmisten hoitoa varten. Luovuttajien ja vastaanottajien herkkyydet valitun antigeenin suhteen tutkittiin etukäteen.

10 Esimerkki 1

Puhdistusmenettely A. Leukosyyttien valmistus

Leukosyytit valmistettiin standardimenetelmien mukaan käyttäen joko täysverinäytteiden tai leukoforeesien 15 fraktiointia. Edellisessä menettelyssä fraktioitiin 450 ml:n täysverinäyte laskeuttamalla 1 x g-arvolla Macrodex-laitteessa (kauppanimi, Pharmacia Corporation, Piscataway, N.J., 6-paino/tilavuus-%:isessa dekstraani 70:ssä normaalissa suolaliuoksessa) punaisten verisolujen g 20 erottamiseksi leukosyyteistä. Noin 1-2 x 10 leukosyyttiä otettiin talteen tällä menetelmällä. Leukoforeesi on suositeltava suurempien solumäärien saamiseksi. Haemonetics (kauppanimi, Haemonetics Corp., Braintree, Mass.) model 30 S soluerotuslaitetta käytettiin. Seos esikäsiteltiin 3 25 30 cm :llä 46,7 %:ista trinatriumsitraattia (Haemonetics,

Braintree, Mass.) ja 500 ml:lla 6 paino/tilavuus-%:ista Volex-materiaalia (kauppanimi, McGaw Co., Irvine, Calif.), joka on suurimolekyylinen tärkkelysvalmiste, jota käytetään leukosyyttien talteenoton parantamiseksi pintaverestä ja 30 punaisten verisolujen poistamiseksi lopullisesta, laskeut-tamiseen käytetystä leukosyyttivalmisteesta. Molemmissa tapauksissa saatiin leukosyyttejä runsaasti sisältävää plasmaa, jota inkuboitiin sitten 60 minuuttia 37°C:ssa. Leukosyytit otettiin talteen plasmasta linkoamalla 400 x g-ar-35 volla 15 minuuttia ja pestiin sitten kolme kertaa 0,5 M

suolaliuoksella. Pesun jälkeen leukosyyttirakeita varastoitiin jäädytettyinä -20°C lämpötilassa. Leukosyyttien 13 78483 keskimääräinen saanto kuudesta läpäisystä soluerottimessa oli 1 x 10^ solua.

B. Dialyysi

Leukosyyttiuutteet valmistettiin steriileissä olo-5 suhteissa. Leukosyyttirakeet suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan 5 mM ammoniumbikarbonaattiliuosta ja niihin kohdistettiin sitten 10 kertaa jäädytys/sulatuskäsittely kuivaa jäätä ja asetonia sisältävässä hauteessa. Lysaatti dialysoitiin ensin 5 mmoolin väkevyyden omaavaa ammoniumbikarbonaattia vas-10 taan käyttäen selluloosadialyysiputkia, joiden nimellinen molekyylipainon erotusraja oli 12 000 (Arthus H. Thomas,

Inc. Chicago, 111.). Puskurin kolmen vaihdon jälkeen yhdistetyt dialysaatit lyofiloitiin, liuotettiin uudestaan pieneen tilavuusmäärään ammoniumbikarbonaattia ja dialysoitiin 15 selluloosaputkissa, joiden nimellisraja-arvo on 3 500, 5 mM ammoniumbikarbonaattia vastaan, kuten edellä. Toisesta dialyysistä saatu jäännös, jota tässä kutsutaan "L"-jakeeksi ja dialysaatti, jota tässä kutsutaan "S"-jakeeksi, lyofi-lioitiin molemmat ja niitä varastoitiin jäädytettyinä 20 -20°C:ssa, kunnes ne käytettiin edelleen.

C. Geelisuodatus

Sephadex G-10 materiaalia (kauppanimi, Pharmacia,

Inc. Uppsala, Ruotsi) turvotettiin yön ylitse 5 mM ammo-niumbikarbonaattiliuoksessa ja käsiteltiin sitten autoklaa-25 vissa. Erittäin hienojakoisten osasten poistamisen jälkeen valmistettiin kooltaan 1,5 cm x 151 cm oleva pylväs ja se tasapainotettiin 5 mM ammoniumbikarbonaattiliuoksessa. Pylvääseen panostettiin 400 mg uudelleenliuotetusta S-jakees-ta saatua fluoresamiinille reagoivaa materiaalia /laskettu-30 na standardianalyysin avulla härän seerumin albumiinista,

Bohlen P., et ai, Arch. Biochem. Biophys., 155, 213 (1973),/. Näyte eluoitiin 5 mM ammoniumbikarbonaatilla virtausnopeudella 13 ml/h. Yksi täydellinen pylvään tilavuus (254 ml) otettiin talteen 0,8 ml:n jakeina. Mitattiin ultravioletti-35 absorptio arvolla 254 nm ja fluoresamiinireaktiivisuus käyttäen 100 mikrolitran näytteitä. Tulokset on esitetty kuviossa 1.

n 7 O 4 δ 3

Havaittiin fluoresamiinille reaktiivinen päähuippu. Kuvio oli oleellisesti vakio yksittäisten luovuttajien suhteen. Modulaattorivaikutusten paikat fluoresamiinireaktii-visuuden suhteen tutkittiin DH-reaktion analyysin avulla 5 käyttäen 10-kertaista laimennussarjaa. DH-reaktion luonne vaihteli yllättävällä tavalla laimennuksen mukaan. Laimen-tamattomat näytteet fluoresamiinihuipun alueella antoivat alentuneen DH-reaktion antigeenille vertailuvasteen suhteen pelkästään antigeeniä käytettäessä. Yllättävästi havaittiin 10 laimennuksilla 10 ja 10 DH-reaktion voimistuminen vertailun suhteen. Vielä yllättävämpää oli, että suuruusluokkaa 10 ^ olevilla laimennuksilla havaittiin DH-reaktion vaimentuminen. Jakeet, jotka osoittivat näitä epätavallisia reaktio-ominaisuuksia ja joita kutsutaan tässä "modulaatto-15 ri-analysoiduiksi" jakeiksi, erotettiin ja niille suoritettiin lisäpuhdistus. Näiden kokeiden perusteella mielenkiintoiset vaikutukset ("modulaattori-analysoidut") paikallistettiin alueelle, joka sisälsi fluoresamiinireaktiivisen päähuipun ja fluoresamiinireaktiivista päähuippua edeltä-20 vän pienemmän fluoresamiinireaktiivisen huipun. Seuraavissa puhdistusvaiheissa jakeet 152-178 (esitetty kuviossa 1) yhdistettiin ja lyofilioitiin. On olemassa mahdollisuus, että lopullisia saantoja voidaan parantaa yhdistämällä lisäja-keita molemmin puolin valittuja jakeita. Jakeiden optimaa-25 lista valintaa ei vielä ole määrätty.

Eräissä kokeissa suoritettiin geelisuodatus käyttäen lyhyempää (80 cm) Sephadex G-10 pylvästä. Tulokset olivat toisiinsa verrattavia paitsi, että pitempi pylväs antoi paremman resoluution. Erikoisesti antigeenistä riippumaton 30 indusoiva aine erottui fluoresamiinireaktiviisesta päähui-pusta pitemmässä pylväässä.

Geelisuodatuksen asemesta puhdistus voidaan suorittaa suuritehoisen poissulkevan geelisuodatuksen avulla käyttäen 1 x 25 cm sulfonoidun polystyreenidivinyylibentseenin 35 pylvästä, jonka molekyylipainon rajakynnysarvo on 5 000 (Shodex S-802/S, valmistaa Showa Denko KK, Tokio, Japani) eluoituna vedellä nopeudella 0,8 ml/min.

is 78403 D. Käänteisfaasikromatografia

Jatkopuhdistus suoritettiin käyttäen suuripaineista, nestemäistä käänteisfaasikromatografista menettelyä oktade-kyylisilaanipylvässä eluoituna 0-100 tilavuus-%:isella 5 etanoli/vesigradienttiliuottimella. Pylvääseen panostettiin 30 mg näytettä (laskettuna fluoresamiinireaktiivisuuden mukaan) ja eluoitiin nopeudella 0,5 ml/min ottaen talteen 1 ml:n jakeet. Eräissä valmisteissa etanoli/vesigradientti-eluointia seurasi eluointi 100 %:isella etanolilla samalla 10 nopeudella.

Jakeet lyofilioitiin ja liuotettiin uudestaan 0,5 ml:aan normaalia suolaliuosta. Jakeet, kukin 0,1 ml, injektoitiin intradermaalisesti yhdessä antigeenin kanssa, jolle vastaanottajan etukäteen tiedettiin olevan herkän ja 15 mitattiin dermaalivaste 24 tunnin kuluttua. Tulokset on esitetty kuviossa 2.

Kuviossa 2 esitetyssä erotuksessa saatiin materiaali luovuttajalta, joka oli epäherkkä streptokinaasiantigeeniä vastaan (kutsutaan tämän jälkeen nimellä "SK"). Vastaanot-20 tajan tiedettiin olevan herkän streptokinaasille. Hänen ihoreaktionsa laajuus SK:n suhteen ilman moduloivia aineita on esitetty vaakasuorana viivana kuviossa 2. Viivan yläpuolella olevat DH-vasteet osoittavat vahvistajan vaikutusta, kun taas normaalitason alapuolella olevat vasteet esit-25 tävät vaimennusvaikutusta. Vertailun vuoksi on kuviossa 2 esitetty kohdat jakeille, jotka sisältävät fluoresamiini-reaktiivista materiaalia ja erilaisia pieniä molekyylejä (serotoniinia, histamiinia, askorbiinihappoa, nikoriiniami-dia ja hydrokortisonifosfaattia), joiden tiedetään olevan 30 vasoaktiivisia, tulehduksia aiheuttavia tai tulehduksia estäviä. Kiinteä viiva esittää yksittäisten jakeiden der-maalista reaktiivisuutta gradientista saatuina pitoisuuksina.

Yksittäisten jakeiden tuloksia verrattiin vaikutus-35 testeihin suoritettuina yhdistetyille jakeille (0-10, 10-20, 20-30) annosteltuina eri laimennuksilla. Paradoksaalisesti voimakkaammalla laimennuksella yhdistetyt jakeet 16 78 483 10-20 osoittivat suurimman havaitun vahvistavan aineen vaikutuksen. Yksittäisen jakeen 5, joka omaa vahvistajan 1 suurimman tehon ja jakeen 14 laimennus mitattiin yksittäisen SK-herkkyyden suhteen. Tulokset on annettu mittauksis-5 sa millimetreinä eryteema- ja induraatioalueiden mitoista seitsemän tunnin, 12 tunnin ja 24 tunnin kuluttua antigeenin ja moduloivan aineen injektiosta. Moduloivat aineet laimennettiin normaalilla suolaliuoksella. Nämä arvot on esitetty taulukossa 1.

10 Vahvistajan 1 tapauksessa (jae 5 kuviossa 2) havait tiin voimakkaasti kiihdyttäviä ja vahvistavia vaikutuksia kaikilla tutkituilla laimennustasoilla, mikä osoittaa kyllästymistä tutkimuskohdassa kaikilla tutkituilla pitoisuuksilla. Kuitenkin jakeella 14 havaittiin merkittävä vahvis-15 tus vain laimennettaessa tekijällä 10-1 000. Siten vahvistajalle 2 havaittiin selvä optimipitoisuus. Myös havaittiin kiihdyttävä vaikutus, vaikka se ei ollut niin voimakas kuin vahvistajan 1 aiheuttama.

Kaksi selvää vahvistusvaikutuksen huippua saatuina 20 mitattaessa kuvion 2 mukaisia laimentamattornia näytteitä, eivät välttämättä vastaa vahvistajien todellisia kohtia kaikissa valmisteissa. Tähän on useita syitä. Ensiksikin eri luovuttajilla on erilaiset moduloivien aineiden tasot niiden leukosyyteissä. Niiden leukosyyteissä voi olla myös 25 muita aineita, jotka vaikuttavat haitallisesti valmisteeseen. Vastaanottajissa esiintyy myös biologisia vaihteluita. Lopuksi on pitoisuuden paradoksinen vaikutus vahvistajan 2 tapauksessa. Erikoisesti, kuviossa 2, vähentynyt teho jakeiden 12-18 alueella on ilmeinen seuraus vahvistajan 2 30 optimiarvon yläpuolella olevista pitoisuuksista tällä alueella. Optimaalisesti laimennettuna vahvistajan 2 vaikutus-huippu täytyisi olla havaittavissa jakeiden 14-16 alueella. Tätä johtopäätöstä esittää katkoviiva kuviossa 2, mikä on vahvistajan 2 vaikutuksen hypoteettinen käyrä optimilai-35 mennuksella mitattuna.

Yhdistetyillä jakeilla 21-30 on S-vaimentimen vaikutus. Injektoituna samanaikaisesti antigeenin kanssa.

i7 78483 5- vaimennin estää tehokkaasti DH-reaktion esiintymisen 6- 24 tunnin ajan injektion jälkeen. Poikkeavasti selvä DH-vaste havaittiin 24 tunnin kuluttua injektoitaessa pelkästään antigeeniä ja vielä voimakkaampi vaste havaittiin, 5 jos vahvistajaa 1 tai 2 oli myös läsnä. Tulokset on esitetty kuviossa 3. Potilaan vasempaan käsivarteen injektoitiin useita ihonalaisia ruiskeita PPD:tä sekoitettuna kuviossa 2 esitettyjen yhdistettyjen gradienttijakeiden kanssa laimennuksilla 1:10 ja 1:100 merkittyinä potilaan käsi-10 varteen: HP-1 (yhdistetyt jakeet 1-10) merkitty lyhenteellä HP-PK-1 potilaan käsivarteen; HP-2 (jakeet 11-20) merkitty lyhenteellä HP-PK-2; ja HP-3 (jakeet 21-30) merkitty lyhenteellä HP-PK-3. Vertailuinjektio käyttäen yksinomaan PPD:tä tehtiin myös potilaan oikeaan käsivarteen. Kasvanut tuleh-15 tuminen vertailuinjektioon verrattuna voidaan havaita kohdissa, joihin oli ruiskutettu yhdistettyjä HP-1 ja HP-2 ja-keita vahvistajien läsnäolon vuoksi näissä jakeissa. Kuitenkin havaittiin tulehtumisen pienentymistä HP-3 jakeella käsitellyllä kohtaa vaimentimen läsnäolon vaikutuksesta, 20 mikä osoittautuu olevan voimakkaamman kuin minkään vahvistajan vaikutus tässä jakeessa. S-vaimentimen vaikutus havaittiin yhdistetyillä jakeilla 21-30 saatuina käänteisfaa-sikromatografisen erottelun avulla useimmissa luovuttajissa. Eräissä tapauksissa voitiin S-vaimentimen vaikutus ha-25 väitä yksittäisissä jakeissa, esimerkiksi jakeessa 29 kuviossa 2. Kuitenkaan vaimentavaa vaikutusta yksittäisissä jakeissa ei yhtenäisesti havaittu kaikilla valmisteilla ja tämän vaikutuksen läsnäolo osoittautui riippuvan yksittäisestä luovuttajasta.

30 Kun käänteisfaasikromatografisesta erotuksesta saa tuja, alueella 20-30 olevia yksittäisiä jakeita analysoitiin eri laimennuksilla, vahvistajien 3, 4 ja 5 olemassaolo tuli ilmeiseksi. Vahvistajan 3 vaikutuksen huippu esiintyi jakeissa 21 ja 22, kun taas vahvistajan 4 vaikutus keskit-35 tyi jakeeseen 25 ja vahvistajan 5 vaikutusta havaittiin pääasiassa jakeissa 27 ja 28. S-vaimennin havaittiin jakeissa 29 ja 30. Tulokset on esitetty kuviossa 4, jossa on ie 7 8 483 esitetty analyysit edustavista kromatografisista käsittelyistä. Kuviossa 4 DH-vaste vertailujen suhteen on piirretty dermaalisen reaktion laajuuden mukaan määritettynä + + lausekkeen (a x b) - (a x b ) mukaan, jossa a ja b ovat 5 erytreemisten vammojen läpimitat millimetreinä aiheutuneina injektoitaessa jaetta sekä antigeeniä ja mitattuina toisiaan vastaan kohtisuorassa olevien akselien suhteen ja a+ sekä b+ ovat vastaavat läpimitat vertailuvammalle aiheutuneena injektoitaessa pelkästään antigeeniä. Ihoreaktion 10 laajuus on siten vammojen likimääräisten pinta-alojen välinen ero aiheutuneina pelkästään antigeenistä ja antigeenistä sekoitettuna moduloivan aineen kanssa. Arvot, jotka ovat huomattavasti vertailutason nolla alapuolella, kuten jakeilla 29 ja 30 saadut, osoittavat vaimentimen vaikutuk-15 sen, kun taas arvot merkittävästi nollan yläpuolella osoittavat vahvistajan vaikutuksen. On huomattava, että kuvion 4 mukainen kuvio on yhteensopiva kuvion 2 kanssa, jos otetaan huomioon parittomien jakeiden antamat tulokset, jotka ovat ainot analysoidut jakeet kuviossa 2 esitetyssä kokeessa.

20 Vahvistaja 6 eluoitiin käänteisfaasipylväästä, kun etanoli/vesigradientti oli saavuttanut 99,9 % risen etanoli-pitoisuuden, jatkamalla pylvään eluointia 100 %:isella etanolilla nopeudella 0,5 ml/min ja ottaen talteen 1 ml:n jakeet. Vahvistaja 6 ilmaistiin putkissa 32-34 näissä olo-25 suhteissa suurimman näennäisen pitoisuuden ollessa putkessa 33.

Vahvistaja 6 aiheutti kiihtyneen ja kasvaneen vasteen antigeenille, jolle vastaanottaja oli herkkä. Annos,

Q

joka vastasi 2 x 10 leukosyytin saantoa esitetyssä puhdis-30 tuksessa, paransi ja eräissä tapauksissa palautti ennalleen potilaiden, jotka oli saatettu hieman herkiksi väliaikaisen taudin avulla, DH-vasteen antigeenin suhteen, jolle he olivat aikaisemmin altistetut. Yleensä vaste vahvistimen 6 suhteen parani laimennettaessa, vaikkakin optimaalinen lai-35 mennus vaihteli yksittäisillä vastaanottajilla ja riippui mahdollisesti myös antigeenistä. Taulukossa 4 on esitetty kahdella laimennuksella saadut tulokset. Osassa A

19 78483 streptokinaasille herkkä vastaanottaja sai 2,5 yksikköä streptokinaasia samanaikaisesti vahvistajan kanssa. Kään-teisfaasipylväästä saatuja 1,0 ml jakeita vahvistajaa lyo-filioitiin ja liuotettiin uudestaan 0,3 ml:aan normaalia 5 suolaliuosta. Injektoitiin 0,1 ml mainittuja jakeita laimennettuna esitetyllä määrällä normaalia suolaliuosta.

Osassa B PPD-herkkään vastaanottajaan injektoitiin 0,05 ml 1/10-laimennuksena standardi-Aplisoli PPD:tä yhdessä vahvistajan 6 kanssa esitetyllä tavalla laimennettuna 0,1 mlrssa 10 suolaliuosta tai pelkästään 0,1 ml:n kanssa normaali suolaliuosta.

Vahvistavan vaikutuksen omaavaa materiaalia voidaan uuttaa vesiliuoksesta eetterillä. Uutettava materiaali vaatii laimennuksen maksimivaikutusta varten. Eetteriuut-15 teiden oletetaan siten sisältävän vähintään joitakin mainituista vahvistajista. Ei kuitenkaan tiedetä, mitkä esitetyistä vahvistajista ovat uutettavissa eetterillä. Edellä esitettyjen moduloivien aineiden käänteisfaasi-kromato-grafinen erotus voidaan suorittaa käyttäen useita alalla 20 tunnettuja käänteisfaasipylväsmateriaaleja. Koska eluointi-olosuhteet voivat vaihdella, optimaaliset olosuhteet edellä esitettyjen moduloivien aineiden erottamiseksi voidaan helposti määrittää alan asiantuntijoiden toimesta.

E. L-dialyysijakeen fraktiointi 25 L-dialyysijae fraktioitiin edelleen kromatografises- ti hydroksyyliapatiitilla. Hienojakoisten osasten poistamisen jälkeen etukäteen 5 mM ammoniumbikarbonaatilla tasapainotettua hydroksyyliapatiittia pakattiin 1,5 x 20 cm pylvääseen. L-jaetta, lyofiloituna ja uudelleenliuotettuna 30 0,05 M ammoniumbikarbonaattiin, lisättiin pylvääseen. Pyl västä eluoitiin 0,05 M - 0,2 M olevalla ammoniumbikarbonaa-tin vesigradientilla (115 ml) ja sitten 0,2 M - 0,6 M am-moniumbikarbonaatin gradientilla (65 ml). Yhden ml;n ja-keet tutkittiin absorbanssin suhteen arvolla 260 nm ja 35 niiden reaktiivisuuden suhteen fluoresamiinin kanssa. Yksittäiset jakeet yhdistettiin seitsemäksi yhdistetyksi ja-keeksi, jotka peittivät suurimmaksi osaksi gradientin.

20 7 8 483

Yhdistetyt jakeet analysoitiin biologisen vaikutuksen suhteen injektoimalla jokaista jaetta ihonalaisesti antigeenin läsnäollessa, jolle vastaanottava yksilö oli herkkä. Tulokset on esitetty taulukossa 2. Suhteellinen DH-vaste on esi-5 tetty taulukossa 2 induraatioalueen läpimitan avulla millimetreinä mitattuna 25 ja 43 tunnin jälkeen ja verrattuna vertailureaktioalueeseen, johon injektoitiin pelkästään antigeeniä. Jakeet 450 ja 451 eluoituna välillä 0,1 M ja 0,15 M olevalla ammoniumbikarbonaatilla vaimensivat voimak-10 kaasti DH-reaktiota vähintään 43 tuntia. 72 tunnin kuluttua reaktioita, joiden mitat olivat 10 x 10 mm, voitiin havaita kohdissa, joihin jakeita 450 ja 451 oli injektoitu, osoittaen, että valmentajan vaikutus on käänteinen ajan suhteen.

15 Esimerkki 2

Luonnehdinta ja vertailukokeet A. Dialysoituja punaisten verisolujen uutteita valmistettiin samalla tavalla kuin leukosyyttiuutteita valmistettiin esimerkissä IB. Differentiaalidialyysi, pylväskro- 20 matografisesti Sephadex G-10 pylväässä, suoritettiin esimerkin 1 mukaisesti. Mitään immuunimodulaattorivaikutusta ei havaittu saaduissa jakeissa. Täten havaittavaa biologista vaikutusta ei aiheutunut uutos- ja puhdistusvaiheissa. Lisäksi verihiutaleiden uutteissa, joille suoritettiin sa-25 mat puhdistusvaiheet, ei esiintynyt moduloivaa vaikutusta. Eräille puhdistetuille vahvistajille suoritettiin uudestaan kromatografinen käsittely ja niiden todettiin käyttäytyvän oleellisesti alkupuhdistuksessa havaitulla tavalla.

B. Otettaessa huomioon alan aikaisempi siirtoteki-30 jään kohdistunut voimakas tutkimus, oli tärkeää osoittaa mahdollisimman selvästi, että vastaanottajan herkkyyden havaittu vahvistuminen ei aiheudu aikaisemmin luovuttajalla havaitsemattoman matalatasoisen herkkyyden siirtymisestä, mikä, keskittyneenä, voi ilmetä vahvistuneena herkkyy-35 tenä vastaanottajassa. Tässä käytetty koejärjestely perustui antigeenien testaukseen, jotka maantieteellisesti ovat paikallisesti määrääviä tai joilla on lääketieteellisesti 21 78483 jäljitettävä lähde. PPD, tuberkelibakteerin puhdistettu proteiinijohdannainen, on sekä lääketieteellisesti jäljitettävissä että maantieteellisesti paikallistettavissa. Herkkyyttä PPD:n suhteen esiintyy yksilöillä, jotka on ai-5 kaisemmin rokotettu BCG:llä (Bacille Calmette-Guerin), jota on laajalti käytetty rokotteena tuberkuloosia vastaan Euroopassa. Sen käyttöä ei kuitenkaan ole hyväksytty Yhdysvalloissa. Histoplasmiini on maantieteellisesti paikallistettava antigeeni. Herkkyys histoplasmiinin suhteen on 10 levinnyt laajalti Yhdysvaltojen eteläosassa ja trooppisilla alueilla, missä histoplasmoosi on endeeminen, mutta sitä ei ole havaittu Euroopan pohjoisosissa.

Vertailukokeessa luovuttaja, alkuasukas Yhdysvaltojen kaakkoisosasta, oli herkkä ihotestissä histoplasmii-15 nille mutta ei reagoinut PPD:lie. Vastaanottajat olivat elinaikaisia Ison Britannian asukkaita, joilla esiintyi joko havaittavaa herkkyyttä ihotestissä PPD:n suhteen ja jotka oli aikaisemmin rokotettu BCG:llä. Tässä tutkimuksessa käytetty vahvistajavalmiste oli puhdistettu esitetyl-20 lä tavalla Sephadex G-10 fraktiointivaiheen avulla, vaikka käytettiin hieman lyhyempää, 80 cm pituista pylvästä, jonka resoluutio oli hieman pienempi. Täten testimateriaali oli vahvistajien 1-6 ja S-vaimentimen seos lisättynä fluo-resamiinille reaktiivisella materiaalilla. Tulokset eivät 25 kuitenkaan ole sitovia todisteina siirtotekijän vaikutuksen puuttumisesta valmisteessa.

Tulokset on esitetty taulukossa 3. Kaksi vastaanottajaa testattiin kumpikin kahdella fluoresamiinireaktiivi-suuden huipun jakeella (numerot 33 ja 39 Sephadex-pylvääs-30 sä). Jokaista jaetta injektoitiin 2,4 mg fluoresamiinireak-tiivisuuden mukaan laskettuna joko yksinään tai 25 yksikön kanssa PPD:tä. 14 tunnin kuluttua alkuinjektoinnista kohtia, jotka eivät aikaisemmin olleet saaneet antigeeniä, ärsytettiin histoplasmiinilla, 0,1 ml histoplasmiinianti-35 geeniä (valmistaa Parke-Davis Corp., Detroit, Mich., myydään 1/100 paino/tilavuus-%:isena laimennuksena normaalissa suolaliuoksessa). Valmistettiin myös vertailukohdat, 22 78483 joihin injektoitiin PPD:tä tai histoplasmiinia yksinomaan asianmukaisina aikoina. Taulukossa 3 on esitetty dermaali-sen ihoreaktion voimakkuus injektiokohtaa ympäröivän indu-raatioalueen läpimitan mukaan millimetreinä. Arvot osoit-5 tavat, että vastaanottajat eivät reagoineet lainkaan histo-plasmiinille, ei ennen leukosyyttiuutosjakeiden injektoin-tia tai sen jälkeen. Vahvistajan vaikutuksen sekä kiihdyttävä että voimistava ominaisuus oli havaittavissa. Toisaalta mitään histoplasmiinin herkkyyden siirtoa ei voitu ha-10 väitä.

C. Tässä esitettävien vahvistajien vaikutusten tärkeä piirre on, että kaikki testatut, mukaan luettuina kiihdyttävä (vahvistaja 1) ja voimistava (vahvistaja 2) vaikutus sekä vahvistaja 6 vaikuttavat koko elimistöön. Vaikutuksia 15 elimistöön voidaan lisäksi havaita anergisilla potilailla (jotka ovat menettäneet normaalin immunologisen vastustuskykynsä sairauden vuoksi). Potilaat, jotka ovat saaneet BCG-rokotuksen ja jotka tutkimusaikana eivät olleet herkkiä PPD:lle sairauden vuoksi, voidaan herkistää PPD:lle in-20 jektoimalla ihonalaisesti esimerkissä 2B esitettyä vahvis-tajajaetta, supra, käyttäen 10-100 -kertaisesti suurennettuja annoksia vahvistajaa. Antigeenin vastetta ei paikallistettu vahvistajan injektointikohtaan.

Elimistölliset vaikutukset voitiin dramaattisesti 25 osoittaa sarjalla kokeita vahvistajaa 6 käyttäen. Potilaan, joka oli neljä vuotta potenut sarkoiditautia, vaste kaikille antigeeneille oli erittäin heikko. Seuraavat kokeet suoritettiin. Kokeen ensimmäisenä päivänä annosteltiin potilaalle tetanus-toksoidia pelkästään ja yhdessä 30 vahvistajan 6 kanssa useina laimennuksina. Taulukossa 5 esitetyt tulokset osoittavat heikon eryteemisen vasteen ilman induraatiota pelkästään tetanus-toksoidin suhteen ja vasteen heikon vahvistumisen vahvistajaa 6 käytettäessä. Kuitenkaan yhdessäkään testikohdassa ei esiintynyt induraa-35 tiota osoittaen, että potilas ei reagoinut asianmukaisesti. Testin toisena päivänä potilaaseen injektoitiin ihonalaisesti vahvistajaa 6 käänteisfaasikromatografisesta jakeesta 23 78483 o 33 määrä, joka vastasi noin 2 x 10 leukosyytistä uuttamalla saatua määrää. Testin 8. vuorokautena ärsytettiin potilasta uudestaan tetanus-toksoidilla pelkästään ja yhdessä vahvistajan 6 useiden laimennusten kanssa, kuten edellä.

5 Tällöin kuitenkin esiintyi huomattava vaste vahvistajaan 6 ja havaittiin hieman induraatiota, kuten taulukossa 5 on esitetty. Tulokset osoittavat huomattavan vasteen kasvun antigeenin suhteen moduloituna 2. vuorokautena annostetun vahvistajan 6 injektion elimistöllisen vaikutuksen mukaan.

10 Lisäosoitusta vahvistajan 6 systeemisestä vaikutuk sesta saadaan mittaamalla potilaan pintaveren lymfosyyttien vaste aktivointiin in vitro. Lymfosyyttien aktivoituminen on hyvin tunnettu ilmiö. Normaaliyksikön pintaveren lymfosyyttien näytteen annetaan lisääntyä soluviljelmässä usei-15 den tunnettujen aktivointiaineiden vaikutuksesta, mukaan luettuina erilaiset kasvimitogeenit ja fytohemaglutiini 3 (tämän jälkeen PHA). Lisääntyminen todetaan H-tymidiinin oton avulla viljelyväliaineesta jakautuvien solujen DNA:han. Testimenettelyn ovat esittäneet Oppenheim J.J. et ai, kir-20 joituksessa In Vitro Methods of Cell Mediated and Tumor Immunity (Bloom and David, toim.) sivut 573-585, Academic Press, New York, N.Y. (1976).

Pintalymfosyyttien näytteitä otettiin potilaasta edellä esitetyn testin 2. ja 8. vuorokautena ja ne analy-25 soitiin useiden aktivoivien aineiden vasteen suhteen. Tulokset on esitetty taulukossa 6. Toisena vuorokautena lymfosyytit olivat hyvin normaalivasteen alapuolella, kun taas 8. vuorokautena lymfosyytit osoittivat normaalin tai kasvaneen vasteen kahdelle kolmesta aktivaattorista. Täten 30 oli tapahtunut huomattava systeeminen vaste vahvistajan 6 ihonalaisen injektoinnin suhteen.

Edellä esitettyjä kokeita varten Phytolacca americana -mitogeeni saatiin toiminimeltä Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y.; PHA ja konkanavaliini A saatiin toimi-35 nimeltä Difco Laboratories, Detroit, Michigan. Tulokset 3 taulukossa 6 on esitetty H-tymidiinin oton lukumäärinä minuutissa.

24 73483

Esimerkki 3

Yksittäisille vapaaehtoisille suoritettujen kokeiden tulosten perusteella on ilmeistä, että vastaanottajia, joissa esiintyy ei-geneettisiä anergisiä tai hypoimmuunisia ti-5 loja, voidaan käsitellä immuunisen vasteen parantamiseksi edellä esitettyjen vahvistajien avulla. Eräät koetulokset vapaaehtoisilla saatiin käyttäen Sephadex G-10 kromatogra-fian avulla puhdistettua materiaalia, joka todennäköisesti muodostui vahvistajien seoksesta. Seuraavassa esitetään 10 hoitomenetelmän suositeltava toteutus.

Vahvistajat 1-6 valmistetaan ja puhdistetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla käänteisfaasikromatografista menetelmää käyttäen. Aktiiviset jakeet yhdistetään, lyo-filioidaan ja liuotetaan uudestaan normaaliin suolaliuok-15 seen tai muuhun fysiologisesti hyväksyttävään kantajaan.

7

Tehokas annos, esimerkiksi 0,1 ml, joka sisältää 5 x 10 leukosyytistä puhdistettua vastaavan määrän vahvistajia 1-6, injektoidaan ihonalaisesti. Immuunivasteen kasvua seurataan potilaan reaktion avulla antigeenin suhteen, jol-20 le hänen tiedetään olevan herkän, vertaamalla reaktiota ennen vahvistajan annostusta ja sen jälkeen. Vahvistajat annostellaan joko yksittäin tai yhdistettyinä halutuista vaikutuksista riippuen. Vahvistajien annostuksen aiheuttaman systeemisen vasteen modulaatio vaihtelee potilaasta toiseen 25 ja sitä täytyy siten tarkkailla ajoittain sopivan herkkyys-testin avulla, kuten on esitetty. Lisäannoksia annostellaan tarvittaessa immuniteetin halutun vahvistumisen ylläpitämiseksi hoitavan lääkärin ammatillisen arvioinnin mukaan.

Esimerkki 4 30 Vahvistajia, joko yksittäin tai yhdistettyinä, käy tetään aiheuttamaan immuunivaste heikoille rokotteille.

Useat patogeenit, mukaan luettuina monet Staphylococcus-la-jit ja sienet, jotka aiheuttavat histoplasmoosia tai kandi-diaasia, eivät pysty aiheuttamaan voimakasta immuunivas-35 tetta määrättyihin potilaisiin. Lisäksi ei ole olemassa tunnettua rokotetta immuniteetin muodostamiseksi näihin potilaisiin. Tällaiset sieni-infektiot ovat erikoisen vaarallisia 25 78483 potilaille, joita hoidetaan kemoterapeuttisesti syöpää vastaan tai joille annostellaan immuniteettia alentavia lääkkeitä. Parantamalla potilaan immuunivastetta heikkojen antigeenien suhteen kuitenkin annostelemalla samanaikaisesti 5 esitettyjä vahvistajia joko yksittäin tai yhdistettyinä, on mahdollista valmistaa rokotteita näitä patogeenejä vastaan. Potilaat, joita hoidetaan kemoterapeuttisesti tai joille suoritetaan kudossiirtokirurgisia toimenpiteitä, voidaan täten rokottaa ennen hoitoa alentamaan heidän aitio tiuttaan histoplasmoosiin tai kandidiaasiin.

Rokote valmistetaan edullisesti yhdistämällä halutun patogeenin antigeenejä valmistettuina alalla tunnettujen menetelmien mukaan riittävän vaimennuksen ja steriliteetin takaamiseksi esimerkissä 1 esitetyllä tavalla val-15 mistettujen vahvistajien 1-6 kanssa. Rokotetta annostellaan standardimenettelyjen mukaisesti.

Edellä esitetyllä tavalla käytettyinä vahvistajien 1-6 odotetaan laajentavan estävien toimenpiteiden aluetta lääketieteessä sekä suurentavan mahdollisten immuniteetti-20 antigeenien aluetta.

Esimerkki 5

Myrkkymuratin aiheuttamat vaikeat ihoreaktiot tai muut yliherkkyysreaktiot voidaan estää hoitamalla S-vaimen-tajalla. Tällainen käsittely tapahtuu seuraavasti sen tun-25 netun tosiasian pohjalta, että suurin osa dermatiittisista ihoreaktioista, kuten esimerkiksi myrkkymuratin tai muun allergiaa aiheuttavan tekijän aiheuttamina ovat DH-reak-tiot. S-vaimennin voidaan puhdistaa esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Käänteisfaasikromatografisesta menettelystä saa-30 dut aktiiviset jakeet voidaan yhdistää ja lyofilioida ja lisätä sitten voiteisiin tai salvoihin, jotka soveltuvat paikallisesti levitettäviksi, kuten esimerkiksi ihovoide-valmisteisiin. Jos reaktio on yleistynyt, esimerkiksi kudokseen tai siirrettävään elimeen, parenteraalinen annostus 35 voi olla suositeltava. Koska yksittäisillä vastaanottajilla havaitun vaimentumisen määrä vaihtelee, täytyy käytettävä annos ilmaista aktiiviyksikköinä. Yksi aktiivisuusyksikkö 26 78483 voidaan määrittää siksi minimimääräksi, joka tarvitaan alentamaan yksilön DH-reaktion induraation läpimittaa 5 mm.

Tätä määritelmää käytettäessä käsiteltävän ihoalueen täy- 2 tyisi saada annos, joka on vähintään 1 yksikkö 100 cm koh-5 ti ja annostamalla suurempia annoksia, jos kliinisesti osoittautuu tarpeelliseksi. Käsittelyä on jatkettava niin kauan kuin esiintyy vaaraa altistumiselle suorittamalla annostus vähintään seitsemän vuorokauden välein tai useammin, jos kliinisesti todetaan tarpeelliseksi. Yksittäisten poti-10 laiden vaste vaihtelee riippuen heidän herkkyysasteestaan antigeenin suhteen ja heidän alttiudestaan valmentajalle. Nämä valmisteet voivat edullisesti sisältää myös steroideja tai muita tulehduksia vastustavia aineita terapeuttisen vaikutuksen parantamiseksi.

15 Esimerkki 6

Vaikeat myrkkymuratin aiheuttamat ja muut kosketus-ihoreaktiot ovat estettävissä annostelemalla L-vaimmenninta valmistettuna esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Jälleen tällaisen ihoreaktion tunnettu DH-komponentti osoittaa selväs-20 ti tämän terapeuttisen käsittelyn tehokkuuden. Hydroksyyli-apatiitilla suoritetusta kromatografisesta menettelystä saadut aktiiviset jakeet yhdistetään, lyofilioidaan ja lisätään voiteeseen tai salvaan, joka soveltuu levitettäväksi paikallisesti. Jos reaktio on laajentunut, esimerkiksi 25 kudoksen tai elimen siirrossa, voi parenteraalinen annostus olla suositeltava. Annostus ja käsittelymenetelmä tapahtuvat oleellisesti esimerkissä 3 esitetyllä tavalla.

L-vaimenninta ja S-vaimenninta voidaan annostella erikseen tai sekoittaa yhteen yhdeksi koostumukseksi.

30 Edellä esitettyjä immuunijärjestelmiä moduloivia ai neita pidetään aineina, joiden luonnollinen toiminta on immunologisen vasteen säätäminen suoraan soluvälitteisen immuniteetin tapauksessa ja ehkä epäsuoraan vaikuttaen humo-raalisen immuniteetin tapauksessa. Näitä aineita on valmis-35 tettu erittäin puhtaina niin, että niiden ominaisuudet on nyt tunnistettu ja niiden on osoitettu olevan täysin ja odottamattomasti erilaisia kuin siirtotekijä ja sen alalla 27 78483 aikaisemmin esitetyt osittaisjakeet. Tässä esitetyt vahvistajat ja valmentajat ovat lääketieteellisesti käyttökelpoisia ihmispotilaiden hoidossa, jotka potevat erilaisia hyperimmuunisia ja hypoimmuunisia tiloja. On erikoisen mer-5 kittävää, että näitä aineita voidaan eristää normaaleista yksilöistä erikoisesti valittujen luovuttajien asemesta niin, että suurimittakaavainen puhdistus yhdistetyistä lähteistä on mahdollista. On huomattava, että moduloivat aineet, joiden puhdistukseen ja erottamiseen patenttivaatimuk-10 set kohdistuvat, määritellään niiden biologisten vaikutusten ja fysikaalisten ominaisuuksien mukaan, eivätkä ne välttämättä muodostu yhdestä ainoasta kemiallisesta aineesta .

Vaikka keksintöä on esitelty sen määrättyjen ja suo-15 siteltavien toteutusten avulla, on huomattava, että sitä voidaan muunnella poikkeamatta keksinnön hengestä ja alueesta. Tämän patenttihakemuksen on tarkoitettu peittävän kaikki keksinnön muunnokset, käytöt ja sovellutukset, jotka seuraavat yleisesti keksinnön periaatteita ja kuuluvat nii-20 hin sellaiset poikkeamat tästä esityksestä, jotka ovat alalla tunnettujen tai tavanomaisten käytäntöjen mukaisia, joita keksinnössä käytetään. Esimerkiksi termeihin "dialyysi" ja "dialysoitu dialyysimembraanin lävitse" tässä käytettynä on tarkoitettu kuuluvan vastaavat menetelmät 25 erikokoisten ja/tai eripainoisten molekyylien ja/tai biologisesti "vaikuttavien aineiden" erottamiseksi toisistaan. Täten "dialyysiin" tässä käytettynä kuuluvat ultrasuodatus, ultralinkoaminen ja elektroforeesi.

28 78 483 _ O o ίγ e ra <r O H » j ^ OI H H H M » H rA rH ^ rH -p -g * <3 χ X X X * * $ o o X * * * j Λ S » ^ in ra ui ro u> **

o CO -o- O' 2 p rl H rl IN

g ,3 rH H . ^ •H Τί CÖ β

P β Ή H

g M P

+3 . § o oo M <* rHOc-t·» P £ OI rl H rl CN 40

4 5 a M rH rl σι H a „ v V

C\J g ,, * .p οι x χ χ x x * d χ X X x X * OJd) Λ _ 0) p m <n ro ro ro ^ P p O O co en en £») p rl H rl ra Π) S rl Cl rl rl β

-P U W

m w ai •rl lp ai 60 O . o o <N ° ° ^

O -H UI in IN · H . IN rl in CN CM

P P ^| r-l rH -P-VVfXXO

ai 10 ,, v * x o X μ X X X x S.g0**X0 go ^oou, P.Hd ui m IN u> h OI rl IN IN Is ΛίΡΌ r-lr-tr-4 CÖ^ •rl g β ·Η β

CO 3 H PH

ai P g «e pj0oinhu> P C\J O a, m n m ui ρ ai oi oi in ra in n MH'rlpollNINrorl g .. „ •rl P „ (ΛΙΦχΧΧΧΧΧ a> ϋ x X x x x X H Φ „ p ai P m ro ro H ro ra §P „ ro ro H » in ^ oi in m cn in >1 P IN IN IN H β

:ai β W

H Λί W

O P ri d M co

^j^r. 9 Π UI CO CO O

5 -H .H H oi H H H n.

+£ 5 O X X X ° ° S- n' 3 ai ^ o o co ro o p p ro UI UI ^ IN IN H H ™ co ai d p p p aJiö 3 ·η Ti ·η a

β P β PH

§ i h §

• H^cd ^ Cd o ui ro o O

ai t— g p ro ro o C— S oi h h h in

H ω H h H IN ^vWXXXO

φ v * X X o o φΧΧΧΧΛ

c/Λ "P X X X X ° If O o ro ro O

"5 ^ ΰ 2 P P £ OI IN H H IN

• n w H H H n w .h

CO

-=* 5 i—I Oi « e

β Ui ω -H

d CO M

-d + o

•rl + ^ d P

ij p- . se * >i * p CP a ui ΙΛ U> Ui ^ gi c§ H g ro ro ro ro ,H S . . + + cd β ι-o 3 ... j. ai d p + p p ai p + + * T p cdö ρω

ai ö ii i-3 <0 <D

c-jCLJ ω 0 p oi ro -» > Il S p oi ro it P- * cd ’ · 1 * Λ ,,

•H | I i i L cd o o ° ® ^ W

CÖ o O o o « h) H H H H CO CO

t-0 rH «H Ή ^ w 29 78483

Taulukko 2 ”L"-jae hydroksyyliapatlitista_ 25 tuntia 43 tuntia

Jae Induraatio (mm) Induraatio (mm) 5 448 14 x 17 14 x 14 449 25 x 25 20 x 18 450 3x3 3x3 451 3x2 3x4 452 16 x 16 15 x 14 10 453 12 x 16 18 x 17 454 14 x 10 15 x 14

Vertailu PPD

(2,5 yksikköä) 26 x 24 16 x 13

Taulukko 3 15 Luovuttaja: TK Induraatio mm

Vastaanottaja: SS -

Jae nro 2h4h8h24h 48 h 33 5 Histo 0 34 0 Histo 0 20 33 + PPD 25 30 34 + PPD 35 50 PPD 8 30

Histo 0

Luovuttaja: TK Induraatio mm 25 Vastaanottaja: SJ -—

Jae nro_ 2h 4h 8h 24 h_48 h 33 8 7 8 8 Histo 0 34 0 0 0 0 Histo 0 33 + PPD 7 7 20 20 30 30 34 + PPD 0 5 3 35 50 PPD 0 0 0 25 20

Histo 0 30 78483

Taulukko 4 A. Dermaalireaktion laajuus annettuna aikana Jae_5,5 h 12,5 h 24 h 32 96 36 15 5 32 (10 2 laimennus) 120 360 173 35 90 156 -14 35 (10 2 laimennus) 132 428 129 37 36 75 -7 37 (10 2 laimennus) 132 356 159 10 B. Dermaalireaktion laajuus annettuna aikanax

Jae _4 h_11 h_ 33 (10 ^ laimennus) 8 41 33 (10 2 laimennus) 41 48 33 (10 ^ laimennus) 99 255 15 33 (10 ^ laimennus) 89 167 x(a x b) - (a+ x b+) mm2:nä 31 78483

Taulukko 5 A. 1. päivän reaktio

Vamman mitat millimetreissä _10/5 h 23 h 45 h 5 Tetanus toxoid (TT) 15 x 20 10 x 10 15 x 15 TT + vahvistaja 6 (10 6 laimennus) 20 x 25 14 x 12 20 x 25 TT + vahvistaja 6 (10 2 laimennus) 20 x 20 14 x 10 20 x 20 10 TT + vahvistaja 6 (10 3 laimennus) 10 x 10 10 x 11 15 x 15 TT + vahvistaja 6 (5 x 10 3 laimennus) 15 x 20 7x7 10 x 10 _B. 8. päivän reaktio_ 15 Vamman mitat millimetreissä __8_h_20 h TT (vertailu) 10 x 15 10 x 10 TT + vahvistaja 6 (10 ^ laimennus) C 10 x 8 /40 x 36 20 TT + vahvistaja 6 ) i (10 2 laimennus ^ 15 x 8 TT + vahvistaja 6 (10 3 vahvistaja) 15 x 15 10 x 15 TT + vahvistaja 6 25 (5 x 10 3 laimennus) 15 x 15 10 x 10 32 73 483

Taulukko 6

Lymfosyyttiaktivointi 3 H-tymidiinin otto, cpm

Aktivaattori Potilas/ Normaali Potilas/ 5 _ päivä 2__päivä 8

Ei (väliaineen valvonta 491,0 530,1

Pokeweek-mitogeeni 8 001,7 >20 000 17 279,9

Konkavaliini A 9 173,1 >20 000 34 066,3 PHA-P 1:50 20 208,3 >40 000 27 889,2 10 PHA-P 1:200 6 605,1 7 257,1 PHA-P 1:800 551,1 1 710,3

Claims (8)

33 78483

1. Menetelmä ihmisen leukosyyttien uutteesta saatujen vahvistajien 1-6 ja/tai L- ja/tai S-vaimentimen 5 puhdistamiseksi ja niiden erottamiseksi toisistaan ja muista vahvistavia, vaimentavia ja indusoivia vaikutuksia omaavista materiaaleista sekä oleellisesti kaikista fluo-resamiinille reaktiivisista materiaaleista, tunnet-t u siitä, että 10 1) haluttaessa puhdistaa L-vaimennin vahvistajis ta 1 - 6 ja S-vaimentimesta sekä sen erottamiseksi oleellisesti kaikista fluoresamiinille reaktiivisista materiaaleista, mainittu uute dialysoidaan dialyysimembraanin (A) lävitse, jonka nimellinen molekyylipainon erotusraja on noin 15 12 000, jolloin saadaan dialysaatti (a), ja/tai 2. a) haluttaessa puhdistaa L-vaimennin dialysaatti (a), tai b) haluttaessa puhdistaa vahvistajat 1 - 6 ja S-vaimennin ja erottaa ne mahdollisesti läsnäolevasta L-20 vaimentimesta ja muista vahvistavia, vaimentavia ja indusoivia vaikutuksia omaavista materiaaleista sekä oleellisesti kaikista fluoresamiinille reaktiivisista materiaaleista, mainittu uute dialysoidaan dialyysimembraanin (B) lävitse, jonka nimellinen molekyylipainon erotusraja on 25 noin 3 500, jolloin saadaan dialysaatti (b 1) sekä reten-taatti (b 2), ja/tai 3. haluttaessa puhdistaa L-vaimennin retentaatti (b 2) johdetaan hydroksyyliapatiittikromatografiseen pylvääseen ja pylväs eluoidaan ammoniumbikarbonaattigradien- 30 tiliä, jonka pitoisuus on välillä 0,05 - 0,6 M, ja otetaan talteen eluoituva materiaali, joka sisältää puhtaan L-vai-mentimen, ja/tai 4. haluttaessa puhdistaa vahvistajat 1 - 6 ja S-vaimennin dialysaatti (b 1) fraktioidaan geelisuodatuksen 35 avulla, jolloin muodostetaan useita dialysaattijakeita, 5. moduloivia aineita sisältäviksi analysoidut dialysaatti jakeet valitaan ja yhdistetään, 34 78483 6. yhdistetyt, moduloivia aineita sisältäviksi analysoidut dialysaattijakeet johdetaan käänteisfaasisuur-painenestekromatografiseen pylvääseen, joka on täytetty oktadekyylisilaanilla, 5 7) mainittu pylväs eluoidaan etanoli/vesi-gradient- tieluentilla, jolloin saadaan useita effluenttijakeita ja 8. valitaan ennalta määrätyt etanoli/vesi-eluentti-jakeet etanolipitoisuuden perusteella ja otetaan talteen effluenttijakeet, jotka sisältävät kulloinkin joko puh- 10 distetun vahvistajan tai S-vaimentimen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä vahvistajan 1 puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että vaiheessa 8) mainittu gradienttieluentti sisältää etanoli/ve-si-seosta, joka sisältää etanolia noin 15 tilavuus-%:sta 15 noin 20 tilavuus-%:iin ja mainitulla alueella eluoitunut materiaali otetaan talteen oleellisesti puhtaana vahvistajana 1.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä vahvistajan 2 puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että 20 vaiheessa 8) otetaan talteen materiaali, joka eluoituu eluentin avulla, joka sisältää etanolia vedessä noin 45 tilavuus-%:sta noin 53 tilavuus-%:iin, ja joka materiaali on oleellisesti puhdas vahvistaja 2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä vah- 25 vistajan 3 puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että vaiheessa 8) otetaan talteen materiaali, joka eluoituu eluentin avulla, joka sisältää etanolia vedessä noin 70 tilavuus-%:sta noin 74 tilavuus-%:iin, ja joka materiaali on oleellisesti puhdas vahvistaja 3.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä vah vistajan 4 puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että vaiheessa 8) otetaan talteen materiaali, joka eluoituu eluentin avulla, joka sisältää etanolia vedessä noin 80 tilavuus-%:sta noin 84 tilavuus-%:iin, ja joka materiaali 35 on oleellisesti puhdas vahvistaja 4. 35 78483

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä vahvistajan 5 puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että vaiheessa 8) otetaan talteen materiaali, joka eluoituu eluentin avulla, joka sisältää etanolia vedessä noin 89 5 tilavuus-%:ista noin 94 tilavuus-%:iin, ja joka materiaali on oleellisesti puhdas vahvistaja 5.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä vahvistajan 6 puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen pylvään eluoimiseksi 100 10 %:isella etanolilla ja mainitulla etanolilla eluoitunut materiaali otetaan talteen oleellisesti puhtaana vahvistajana 6.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä S-vai-mentimen puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että 15 vaiheessa 8) otetaan talteen materiaali, joka eluoituu eluentin avulla, joka sisältää etanolia vedessä noin 96 tilavuus-%:sta noin 99 tilavuus-%:iin, ja joka materiaali on oleellisesti puhdas S-vaimennin. 36 78483