NO156516B - Fremgangsmaate for fremstilling av modulatorer for immunsystemet. - Google Patents

Description

Det humane immunsystem er meget kompleks og for tiden utilfredsstillende forstått. Det er for tiden ansett for å ha to prinsipale sider, humoral immunitet som formidles av sirkulerende antistoffer, og celleformidlet immunitet som, hvilket navnet antyder, formidles av lymfoidceller. Humoral immunitet overføres fra en immun donor til en ikke-immun resipient ved hjelp av serum immunoglobuliner, og slike serum-formidlede overføringer resulterer i immune responser, som viser seg praktisk talt umiddelbart. Celleformidlet immunitet overføres ved hjelp av perifere blodleukocytter. Immun-responser overført av celler utvikles langsomt, over en peri-ode på flere timer.

Et typisk utslag av celleformidlet immunitet er den forsinkede hypersensibilitetsreaksjon, her forkortet til "DH". En DH hudreaksjon observeres når det egnede antigen injiseres subcutant. Innen 24 - 48 timer observeres en lokal inflammasjon (erythema) og en opphovning- og fortykkelse (induration)

i et følsomt individ, og sensibilitetsgraden kan måles ved reaksjonens størrelse og strenghet. DH reaksjonen gir også karakteristiske histologiske resultater, spesielt perivascu-lær infiltrasjon av lymfocytter og monocytter i det betente område. Cellene som sees ved stedet for en DH reaksjon er avledet fra den perifere blodleukocytt populasjon.

Mekanismene ved celleformidlet immunitet er ennu ikke fullt ut forstått. Det er kjent at cellene som formidler responsen er istand til å svare på et utall måter på en antigen utfordring. Disse responser omfatter: vegetativ formering av celler som bærer spesifikk sensibilitet overfor et gitt antigen; induksjonen og mangedobling av celler som formidler en mangfoldighet av immunfunksjoner, omfattende antistoffproduk-sjon; og reaksjoner mot fremmede celler og tumorer. Disse responsmønstres kvalitet og kvantitet påvirkes av mange faktorer, omfattende hormoner fra thymus og binyrebarken; interfe-roner og andre fremkallere av cellulære responser innbefattende histamin, serotonin og prostaglandinene.

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen av modulatorer for immunsystemet, isolert fra dialyserte ekstrakter av leukocytter, som påvirker kvaliteten og kvanti-teten av celleformidlede immunitetsresponser; og er tjenlige i behandlingen av et utall kliniske tilstander, karakterisert ved overreaksjon eller ved utilstrekkelig reaksjon overfor et spesifikt antigen, og ved lindring av visse anergiske tilstander.

I 1954 rapporterte H.S. Lawrence at et lysat fremstilt av leukocyttene fra tuberkulinfølsomme givere kan overføre denne følsomhet til tuberkulin-ikke-reaktive resipienter [Journal of Clinical Investigation, 33.» 951 (1954)]. Se Lawrence, H.S., The Harvey Lectures, 68, 239 (1974) for en senere omtale av dette arbeide, og Transfer Factor: Basic Properties and Clinical Applications, M.S. Ascher, A.A. Gottleib (søkeren) og C.H. Kirkpatrick, Eds., Academic Press, Inc., New York (1976) og Immune Regulators in Transfere Factor, A. Kahn et al, Eds., Academic Press, Inc., New York

(1979) . Overføringen av sensibilitet var antatt å skyldes

en faktor i leukocyttlysatet som senere ble gitt benevnelsen "overføringsfaktor" (Lawrence, H.S., commenting on paper of Najarian, J.S., and Feldman, J.D., i Cell-Bound Antibodies (B. Amos and and H. Koprowski, Eds.). "Overføringsfaktor"-fenomenet var demonstrerbart bare i mennesker. Følgelig har forskningen når det gjelder isolering og karakterisering av den aktive bestanddel gått langsomt.

For å demonstrere overføringsfaktoren må to pasienter identifiseres, en giver kjent for å utvise en DH reaksjon overfor et gitt antigen, og en resipient kjent for å ikke gi noen DH reaksjon når han utfordres med samme antigen (og derfor sannsynligvis mangler celleformidlet immunitet overfor dette antigen). Leukocytter fremstilt av giverens blod lyseres

og celleinnholdet dialyseres. Det konsentrerte dialysat, i en egnet buffer, injiseres subcutant i underarmen eller annen hensiktsmessig sted på pasienten. Efter ca. 2 dager mottar resipienten derefter en subcutan injeksjon av antigenet ved det samme eller annet sted. En typisk DH reaksjon kan observeres efter ca. 1 uke. Slik overført immunitet er angitt å kunne vare i mottageren så lenge som 2 år.

Fremskritt i fraksjonering og karakterisering av over-føringsfaktor er blitt vanskeliggjort på grunn av mangel på tilknyttede strukturelle eller kjemiske kriterier, og av det faktvjn at. fenomenet observert efter fraksjonering ofte er kvalitativt forskjellig fra det fenomen som fremkalles av det opprinnelige dialysat. Selvom uttrykket "overføringsfaktor" finnes i litteraturen anvendt på fraksjonerte preparater, og som observeres ved kriterier forskjellige fra en DH hudrespons, er det uklart hvorvidt en slik terminologi virkelig angir en enkel biokjemisk enhet eller en aktivitet som representerer en enkel biologisk funksjon. Som anvendt her er uttrykket "overføringsfaktor" begrenset til det urene leukocyttdialy-sat som isolert av Lawrence, og som har en aktivitet som opp-rinnelig karakterisert av Lawrence, dvs. evnen til å overføre immunitet til et spesifikt antigen fra en meget følsom giver til en ikké-følsom resipient.

Tidligere kjent fraksjonering av human overføringsfak-tor har vist nærvær av et utvalg aktive materialer. Vandenbark, A.A. et al, J. Immunol., 118, 636 (1977) rapporterte resultatene av Sephadex ®G-25 kromatografi av dialysatet av leukocyttekstrakter. Biologisk aktivitet in vivo ble bare funnet i forbindelse med to hovedtopper med optisk densitet ved 254 nm eller 280 nm. En slik toppfraksjon ble rapportert å overføre signifikant hudtestreaktivitet fra an-tigenfølsomme givere til tidligere ikke-reaktive resipienter. Den annen topp fremkalte spontan aktivitet (en hudrespons uten tilsatt antigen) og øket også betydelig hudresponsen når den ble kombinert med antigen. Toppfraksjonene ble ytterligere fraksjonert ved isoelektrisk fokusering og ved omvendt fasekromatografi under anvendelse av et oppløsningsmiddelsy-stem på 1 % eddiksyre eller 5 % methanol på et kolonneskikt pakket med octadecylsilanharpiks. Imidlertid ble resultatene av biologiske aktivitetstester efter under-fraksjonering ikke rapportert.

Gottlieb, A.A., et al, i Transfer Factor: Basic Properties and Clinical Applications, på side 263 innførte bruken av fluorscamin som et middel for overvåkning av frak-sjoneringen av leukocyttdialysater. Fluorscamin ("Fluram"), Bohlen, P., et al, Arch. Biochem. Biophys., 155, 213 (1973) reagerer med substanser inneholdende primært aminogrupper under dannelse av høyfluorescente produkter, som gir en meget følsom test for proteiner og andre forbindelser som bærer primære aminogrupper. Det dialyserbare leukocyttekstrakt-materiale ble fraksjonert på en Sephadex ®G-10 kolonne, og biologisk aktivitet ble funnet knyttet til en hovedfluor-scamin-reaktiv topp. Forsinkede hypersensibilitetsresponser ble observert enten antigen var tilsatt eller ikke, selvom responsen var noe større i nærvær av antigen.

Dialyserbare leukocyttekstrakter ble ennvidere fraksjonert av Gottlieb, A.A., et al., som rapportert i J. Reticuloendothelial Soc., 21, 403 (1977). Ekstraktene ble først underkastet en differensiell molekylvektdialyse under anvendelse av dialysemembraner med nominelle molekylvektav-brytelser på ca. 12000 og ca. 3500. Materialer som passerer gjennom den sistnevnte membran med en molekylvekt som generelt er mindre enn 3500, ble betegnet "S" fraksjonen, mens materiale som generelt har molekylvekt som varierer fra 3500 til 12000 ble betegnet "L" fraksjonen. Begge fraksjoner ble underkastet gelfiltrering på Sephadex ®G-10. Biologisk aktivitet ble igjen forbundet med de fluorscaminreaktive topp-funksjoner. Imidlertid synes ikke aktivitet å være en funksjon av immunologisk tilstand av giveren. I tillegg ble to særpregede virkninger observert. Den første var en fremkal-lelse av DH respons i fravær av tilsatt antigen og uavhengig av den immunologiske tilstand av giveren eller resipienten. Slik aktivitet er her angitt som "fremkaller". Den annen aktivitet var evnen til økende intradermale reaksjoner overfor antigener som resipienten var følsom overfor, men ikke overfor antigener som resipienten tidligere ikke var utsatt for. Denne aktivitet funnet i de fluorscaminreaktive kromatografi-ske fraksjoner, syntes å øke resipientens DH respons overfor et antigen overfor hvilket han allerede var følsom. I begge tilfeller synes giverens sensibilitet å være irrelevant. Ytterligere fraksjonering av 9-fraksjonen på hydroxylapatittkromatografi viste at den biologiske aktivitet som gir en DH respons i fravær av tilsatt antigen ikke var forbundet med hovedpolypeptidfrak-sjonen som målt ved reaksjon med fluorscamin.

<y>tterligere data presentert av Gottlieb, A.A., et al.,

i J. Immunol., 124, 885 (1980) angikk fraksjonering av "fremkaller" (som gir en DH reaksjon i fraværet av tilsatt antigen) og "forsterker" (som gir en DH reaksjon i nærværet av antigener overfor resipienten, er kjent for å være følsom), ved hjelp av en lang, 150 cm's Sephadex ®G-10 kolonne. "Forsterkeren" forble forbundet med hovedfluorescaminreaktive fraksjoner, mens "fremkalleren" ikke var dette. Efter ytterligere fraksjonering på hydroxylapatitt forble "forsterker"-aktiviteten forbundet med den fluorescaminreaktive topp. Re-gulerte undersøkelser viste at de rapporterte aktiviteter ikke ble funnet i lignende behandlede lysater av røde blodceller, heller ikke var der noen aktivitet knyttet til en fysiologisk saltvannoppløsning bearbeidet efter samme rensepro-sedyre.

Gottlieb, A.A., et al. (Immune Regulators in Transfer Factor), A. Kahn, C. Kirkpatrick and Hill, Eds., Academic Press, Inc., New York (1979), side 339 har i en rapport som ikke er ledsaget av data, antydet at en ytterligere aktivitet, angitt som "suppressor", kunne separeres fra en "forøknings"-aktivitet ved hydroxylapatittkromatografi. "Forøkeren" ble funnet i "S" dialysefråksjonen og var altid assosiert med ho-vedf luorescaminreaktiv topp. "Forøker"-fraksjonen ble antatt å være systemisk effektiv i tidligere BCG-utsatte anerge pasienter. I tillegg ble en "suppressor" aktivitet funnet i "L" dialysefraksjonen angitt å elueres ved en høyere saltkon-sentrasjon enn det fluorescaminreaktive materiale ved hydrox-ylapatittkromatograf i . I en annen undersøkelse hvor dialyserte leukocyttekstrakter ble fraksjonert, har Wilson, G.B. et al. J. Lab. Clin. Med., ^3, 819 (1979) rapportert fire aktiviteter som påvirker in vitro leukocyttvandring: to antigen-uavhengige aktiviteter (som gir en respons i fravær av et hvilket som helst antigen), en antigen-avhengig spesifikk inhibitor og en antigen-avhengig forøker. Den antigen-avhengige inhibitor hadde egenskaper tilfelles med "overføringsfak-tor", da bare antigen med den egnede giver spesifisitet fremkalte signifikant inhibering av in vitro leukocyttvandring. Den antigen-avhengige økning av leukocyttvandring var ikke karakterisert med hensyn til antigenspesifisitet. Denne aktivitet er imidlertid ikke kjent for å ha noen forbindelse med noen in vivo funksjon i det humane immunsystem eller noen forutsigelig terapeutisk nytte.

En modulator spm her definert, er enhver

substans som bevirker direkte eller indirekte respons av et dyr eller menneskelegeme, en del derav eller substans tatt derfra, på antigener for hvilke angitte kropp tidligere er blitt utsatt, hvor slik respons spesifikt tilskrives funksjo-nen av immunsystemet i nevnte dyr eller menneske. Substanser som har generelle" virkninger som kan omfatte virkninger på den immune respons er derfor ikke innordnet under uttrykket "modulator", som her definert. Disse modulatorer som her beskrevet, viser sin aktivitet i en DH hudreaksjonstest, og synes derfor å utvise sin primære virkning på det celle-formid-lede immunsystem. Det vil imidlertid forståes at de beskrevne modulatorer har brede effekter på hele immunsystemet, og kan påvirke det humorale immunsystem. For diskusjonsformål er uttrykkene "overføringsfaktor", "fremkaller", "forsterker" og "suppressor" hver definert ved sine respektive aktiviteter som utløser en DH respons i en hudreaksjon.

Uttrykket "overføringsfaktor" betegner et dialysat av urent leukocyttekstrakt som ovenfor beskreve t. En "overfør-ingsfaktor" aktivitet viser seg når overføringsfaktorpreparatet fremstilles fra leukocytter i en giver som er kjent for å være følsom overfor et gitt antigen, og injiseres subcutant på en mottager som er kjent for å være ufølsom overfor samme antigen. Mottageren mottar på et senere tidspunkt antigenet og en DH respons observeres. Normalt ville mottageren i fravær av injisert overføringsaktivitet være ufølsom. Det skal forståes at overføringsfaktorer ikke er modulatorer som tidligere definert, da virkningen av overføringsfaktor observeres i en mottager som ikke tidligere er blitt utsatt for et gitt antigen. Videre er overføringsfaktoreffekter spesifikke når det gjelder et gitt antigen, mens forsterkere og suppressorer som her beskrevet, utviser ikke-spesifikke effekter når det gjelder et hvilket som helst antigen overfor hvilket mottageren tidligere var utsatt.

"Fremkaller" er definert som den aktivitet som gir en DH respons i fravær av tilsatt antigen og uten hensyn til sen-sibiliteten av giver og mottager.

"Forsterker" er karakterisert ved produksjonen av en større enn normal respons i en følsom mottager, efter injeksjon av det antigen som mottageren er følsom for. Forsterkeraktivitet er ikke avhengig av den spesifikke immunologiske sensibilitet hos giveren.

"Suppressor" aktivitet observeres i en følsom mottager når suppressoren og et antigen overfor hvilke mottageren er følsom, injiseres sammen, med det resultat at resipienten viser en mindre enn normal DH respons.

Modulatorer for det humane immunsystem

er blitt isolert fra dialysater av leukocytt-

ekstrakter. Seks slike modulatorer har forsterkeraktivitet, og to har suppressoraktivitet. Forsterkere betraktes som nyttige i behandlingen av anerge tilstander og tilstander av immun hyposensibilitet, både lokalt og systemisk, mens suppressorer betraktes som nyttige ved preparering og behandling av lokale hypersensibilitetstilstander, slik som gift-sumak. Disse forsterkere betegnes som forsterkere 1-6. Suppres-sorene identifiseres som S-suppressor og L-suppressor.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av forsterkere 1 - 6 og S-suppressor ved rensning av et ekstrakt av humane leukocytter, og separering av disse fra L-suppressor og andre materialer med forsterker, suppressor og fremkalleraktiviteter og fra hovedsakelig alt fluorescamin-reaktivt materiale, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at 1) ekstraktet dialyseres gjennom en dialysemembran med en nominell molekylvektavbrytning på 3500, 2) dialysatet fraksjoneres ved gelfiltrering under dannelse av et flertall fraksjoner,

3) modulatoraktiviteten av dialysatfraksjonene bestemmes,

4) de modulatorbestemte fraksjoner som utviser en betydelig modulatoraktivitet, utvelges og oppsamles, 5) de utvalgte og oppsamlede fraksjoner tilsettes en høy-trykks-omvendt-fasekromatografikolonne pakket med octadecylsilan,

6) kolonnen elueres med en ethanol-i-vann-gradient og

7) på forhånd bestemte fraksjoner basert på ethanolkonsen-trasjonen deri utvelges og oppsamles.

J. Clin. Hematology and Oncology, vol. 8, nr. 4 (1978), art. 36, angår fremstilling av overføringsfaktor og ikke modulatorer. Det er i publikasjonen ikke angitt noe løs-ningsmiddel eller løsningsmiddelgradient for ekstraksjon av materialet. Et vesentlig trekk ved foreliggende oppfinnelse er tilveiebringelse av et system som ekstraherer ut de ønskede substanser. Det finnes heller ingen antydning om at multiple immunologiske faktorer skulle være tilstede i humane sera slik som seks forsterkere og én eller flere suppressorer, og at forsterkere og suppressorer må separeres for å for-hindre at disse opphever hverandre.

J. Immun., vol. 122, nr. 3 (1979), s. 1091-8 og Chem. Abstracts, vol. 92 (1980), 196150r, angår også fremstilling

av overføringsfaktorer og ikke modulatorer. I den grad løsningsmiddelsystemer er angitt, gjelder disse 1% eddiksyre (fig. 2, 5) og ikke ethanol i vann fra 0% til 100%.

J. Clin. Invest., vol. 53, nr. 6, s. 55a og 56a, beskriver overføringsfaktor. Det anvendte løsningsmiddel er 0,01M NH^HCO^ og ikke ethanolsystemet ifølge foreliggende krav 1 - 8.

Chem. Abstracts, vol. 87 (1977), 66487s, beskriver et produkt som undertrykker opptaket av thymidin. Artikkelen angir ikke at produktet undertrykker responsen av det humane immunsystem på antigener. Enn videre er det i publikasjonen ikke beskrevet noen kromatografiprosess.

Chem. Abstracts, vol. 91 (1979), 37394m, angår over-føringsfaktor og ikke modulatorer. Det er i publikasjonen ikke beskrevet noen kromatografiprosess under anvendelse av et ethanolsystem hvori de forskjellige forsterkere elueres ut ved forskjellige gradientområder.

Fed. Proe, vol. 35, nr. 3, s. 337, art. 737, er en tidlig publikasjon av søkeren, dr. Gottlieb, som beskriver dialyse og gelfiltrering. Produktet er overføringsfaktor.

Scand. J. Imm., vol. 2, nr. 4 (1973), s. 450,

beskriver en ionebytter-kromatografiprosess under anvendelse av DEAE-cellulose, og ingen høytrykks-omvendt-fasekromatografi-prosess under anvendelse av octadecylsilan, eluert med 0-100% ethanol i vann.

Til grunn for foreliggende oppfinnelse ligger oppdagelsen av substanser hvis funksjon er å modulere immun følsomhet. Foreliggende teknikker har muliggjort identifi-sering av modulatorer som forsterker eller undertrykker responsen på antigener overfor hvilke et individuelt menneske er blitt utsatt. Imidlertid er det klart at et utvalg av mo-dulerende funksjoner kan vise seg av slike substanser, omfattende responsvarighet, sensibilitetsterskel og responstype, enten inflammatorisk, vegetative formering av lymfocytter eller produksjon av sirkulerende antistoff. Slike moduler-ende funksjoner vil bli definert uttrykt av det testsystem som anvendes for å påvise og måle disse. Modulatorene

omfatter ikke bare forsterkere og suppressorer av en DH respons, men også andre slike manifestasjoner av immunmodulering som kan påvises og måles i andre egnede testsystemer.

De her beskrevne modulatorer er derfor endel av et system av modulatorsubstanser som utgjør et naturlig middel for intracellulær kommunikasjon mellom komponenter i immunsystemet hvorved tilstanden av immun følsomhet kontinuerlig overvåkes og modifiseres i henhold til nivået og aktiviteten av gjeldende antigen utfordring. Derfor er det sannsynlig at andre modulatorer vil bli oppdaget, da der fra foreliggende beskrivelse fremgår at et slikt system av modulatorer eksi-sterer. Ytterligere forskning under anvendelse av andre renseteknikker og andre testprosedyrer vil resultere i iden-tifisering og rensning av slike modulatorer.

Forsterker 1 er karakterisert ved å ha en akselererende og forøkende effekt på DH hudresponsen hos resipienter som er følsomme overfor et gitt antigen. Reaksjonene fremkalt av forsterker 1 administrert med antigen når toppinten-sitet 6-14 timer efter subcutan injeksjon og avtar derefter hurtig. (Normal DH respons i fravær av forsterker når derimot en topp 24 - 30 timer efter injeksjon av antigen). Forsterker 1 er separerbar fra de andre modulatorer

ved omvendt fasekromatografi under anvendelse av

en octadecylsilankolonne eluert med en 0 - 100 % (v/v) ethanol-i-vann gradient. Forsterker 1 er eluerbar fra kolonnen fra 0 til 12% (v/v) ethanol-i-vann-konsentrasjon.

Forsterker 1 er ikke påviselig reaktiv^med fluor-

escamin, og separeres fra hovedtoppen av fluorescaminaktivi-tet ved motsatt fasekromatografi. Forsterker 1 passerer gjennom en dialysemembran som har en nominell molekylvekt (M.W.) avbrytning på 3500.

Forsterker 2 fremkaller også en akselerert og forøket respons på antigen, selvom akselerasjonsgraden er noe mindre hurtig enn responsen til forsterker 1. Reaksjonsseter er mer avgrenset enn de som fremkalles av forsterker 1 pluss antigen, og de varer betydelig lengere (opp til 7 dager). Mest overraskende er den maksimale forsterkende aktivitet observerbar bare ved en optimal konsentrasjon hvor større enn optimale konsentrasjoner gir redusert forsterkning eller faktisk en nedsettelse av DH responsen. Forsterker 2 er eluerbar fra octadecylsilan med 28 til 50% ethanol-vann-løsning. Den er ikke påviselig reaktiv med fluorescamin, og er separerbar fra de andre beskrevne modulatorer isolert fra et dialysat av leukocyttekstrakter, og også fra hovedtoppen av fluorescamin-reaktivt materiale i slike ekstrakter ved omvendt fasekromatografi. Molekylvekten og størrelsen på forsterker 2 er slik at den passerer gjennom en dialysemembran med en nominell molekylvektavbrytning på 3500.

Forsterkere 3, 4 og 5 bevirker forøkede responser på antigen. Fortynningsstudier har indikert at aktiviteten av forsterkere 3 og 5 økes ved fortynning ved at aktiviteten av forsterker 4 også kan økes, selvom dataene er noe mer tvety-dige. Forsterkere 3, 4 og 5 er eluerbare fra octadecylsilan i 65 til 80% (v/v), 81 til 91% (v/v) og 92 til 97% (v/v) ethanol-vann-løsninger. Ingen av disse forsterkere er påviselig reaktive med fluorescamin, og alle er separerbare fra hverandre og fra de andre her beskrevne modulatorer ved omvendt fasekromatografi. Forsterkere 3, 4 og 5 er hver av slik størrelse av de passerer gjennom en dialysemembran med en nominell molekylvektavbrytning på 3500.

Forsterker 6 bevirker en forøket respons på antigen i en DH reaksjon og er også blitt vist å ha systemisk effekt. Tilfelles med de fleste her beskrevne forsterkende modulatorer, unntatt forsterker 1, er det et doseoptimum for maksimal respons som observeres ved å sammenligne effektene av økende fortynning av den isolerte prøve. Forsterker 6 er eluerbar fra octadecylsilan i 99 til 100% (v/v) ethanol. Den er ikke påviselig reaktiv med fluorescamin, og er separerbar fra de andre her beskrevne modulatorer ved omvendt fasekromatografi. Molekylvekten og størrelsen på forsterker 6 er slik at den passerer gjennom en dialysemembran med en nominell molekylvektavbrytning på 3500.

S-suppressoren isoleres fra det dialysat som passerer gjennom en membran med en nominell molekylvektavbrytning på 3500. S-suppressor er identifiserbar og i det minste delvis separerbar fra forsterkere 1 og 2 ved omvendt fasekromatografi og eluering med en 0 - 100 % (v/v) ethanol-i-vanngradi-ent. S-suppressor er eluerbar fra octadecylsilan med ethanol i vann varierende fra 97 til 99%. S-suppressor er ikke påviselig reaktiv med fluorescamin, som bedømt ved dets separerbarhet fra den hovedfluorescamin-reaktive topp ved omvendt fasekromatografi. Undertrykkelse av en DH hudreaksjon viser seg når S-suppressoren injiseres før eller samtidig med et testantigen overfor hvilket resipienten gir en DH respons. Undertrykkelsen er reversibel eller kortvirkende, som faktisk forsinker starten på DH 72 timer. Undertrykkelse observeres ikke når forsterker 2 injiseres samtidig med S-suppressor.

L-suppressoren finnes i den fraksjon av leukocytteks-traktet som passerer gjennom dialysemembran med en nominell molekylvektavbrytning på 12000, men holdes tilbake av membra-nen med en molekylvektavbrytning på 3500. Som S-suppressoren er L-suppressoraktiviteten reversibel, med en undertrykkende effekt som varer ca. 72 timer. L-suppressoren er ikke fluor-escaminreaktiv, som bedømt ved det faktum at den er separerbar fra den hovedfluorescaminreaktive topp ved hydroxylapatittkromatografi.

I de etterfølgende eksempler er der beskrevet prosedy-rer hvori materialer erholdes fra menneskegivere og hvor testmålinger er foretatt på menneskemottagere. Prosedyrene og reagensene som anvendt her, ble valgt for å tilveiebringe sterile og ikke-toksiske produkter for menneskebehandling. Følsomheten for giverne og resipientene overfor valgte antigener var testet på forhånd.

EKSEMPEL 1 Rens epr o sedyr e

A. Fremstilling av leukocytter

Leukocytter ble fremstilt ved standardmetoder under anvendelse av enten fraksjonering av helblodprøver eller leuko-foresis. I den førstnevnte metode ble en 450 ml's prøve av helblod fraksjonert ved sedimentering ved 1 x g i Macrodex ®

(6 %'s (W/V) Dextran 70 i normalt fysiologisk saltvann) for å separere røde blodceller fra leukocytter. Ca.

9

1-2 x 10 leukocytter ble gjenvunnet ved denne metode. Leuko-foresis var foretrukket for oppnåelse av større mengder celler. En "Haemonetics" modell 30S celleseparator ble anvendt. Systemet ble startet med 30 cm 3 46,7 % trinatriumcitrat og

500 ml 6 %'s (W/V) Volex ®, et høymolekylært stivelsesprepa-rat anvendt for å øke gjenvinning av leukocytter fra perifer-isk blod og fjerne de røde blodceller fra det endelige leuko-cyttpreparat ved sedimentering. I hvert tilfelle ble leuko-cyttrik plasma erholdt efter en 60 minutters inkubering ved 37°C. Leukocyttene ble gjenvunnet fra plasmaen ved sentrifu-gering ved 400 x g i 15 minutter fulgt av tre vaskninger med 0,5 M fysiologisk saltvann. Efter vaskning ble leukocytt-pellettene lagret frosset ved -20°C. Et midlere utbytte av

leukocytter fra seks gjennomganger i celleseparatoren var 1 x IO<10> celler.

B. Dialyse

Leukocyttekstrakter ble fremstilt under sterile betingelser. Leukocyttpellets ble resuspendert i 10 ml 5mM ammoniumbicarbonat, derefter underkastet 10 cykluser med frys-ning-tining i et tørris og acetonbad. Lysa tet ble først dialysert mot 5 mM ammoniumbicarbonat, under anvendelse av en cellulosedialyseslange med en nominell molekylvektavbrytning på 12000. Retenatet ble kastet. Efter tre forandringer av buffer ble de kombinerte dialysater lyofilisert, oppløst pånytt i et lite volum ammoniumbicarbonat, og dialysert i en celluloseslange med nominell molekylvektavbrytning på 3500, mot 5 mM ammoniumbicarbonat som før. Det tilbakeholdte materiale fra den annen dialyse, angitt som "L" fraksjonen, og dialysatet, angitt som "S" fraksjonen, ble hver lyofilisert og lagret frosset ved -20°C inntil videre bruk.

C. Gelfiltrering ( r) i ammonium-SephadexWG-10 ble svellet over natten i 5mM ammoniumbicarbonat og derefter autoklavert. Efter fjernelse av fine bestanddeler ble en 1,5 cm x 151 kolonne fremstilt og ekvilibrert i 5 mM ammoniumbicarbonat. Kolonnen ble fylt med 400 mg fluorescamin-reaktivt materiale av den gjenoppløste S-fraksjon (basert på kvegserumalbumin som forsøksstandard ifølge Bohlen, P., et al, Arch. Biochem. Biophys., 155, 213

(1973) . Prøven ble eluert med 5 mM ammoniumbicarbonat ved

en strømningshastighet på 13 ml/time. Et totalt kolonnevolum (254 ml) ble oppsamlet i 0,75 ml<1>s fraksjoner. Ultrafiolett absorpsjon ved 254 nm og fluorescaminreaktivitet, basert på 100 -liters alikotter ble målt. Resultatene er vist i fig.l.

En hovedfluorescamin-reaktiv topp ble observert. Møn-stret var hovedsakelig konstant fra den ene giver til den annen. Lokaliseringen av modulatoraktiviteter i forhold til fluorescaminreaktivitet ble oppdaget ved prøver (modulatorprøver) på DH-respons over en serie på 10-dobbelte fortynninger. DH-responsarten varierte på en uventet måte med fortynning. Ufortynnede prø-ver i området av fluorescamintoppen gav en redusert DH respons på antigen i forhold til kontrollresponsen på antigen alene. Ved fortynninger på 10 -2 og 10 -3ble der ganske overraskende observert fors terkning av DH responsen i forhold til kontrollen. Ved fortynninger av størrelsesordenen 10 ^ ble der enda mer overraskende observert en nedsettelse av DH responsen. Fraksjonene som utviste slike uvanlige responsegen-skaper, benevnt "modulatorprøvede" fraksjoner, ble utvalgt og underkastet ytterligere rensning. Fra slike forsøk ble de materialer av interesse ("modulatorprøvede") lokalisert i et område inneholdende hovedfluorescaminreaktiv topp og en mindre fluorescamin-reaktiv topp som gikk foran den hovedfluorescamin-reaktive topp. For etterfølgende rensetrinn ble fraksjoner 152 - 178 (vist i fig. 1) oppsamlet og lyofilisert. Muligheten foreligger for at de endelige utbytter kan forbed-res ved å oppsamle ytterligere fraksjoner på hver side av de valgte. Det optimale valg av fraksjoner er hittil ikke be-stemt .

I enkelte forsøk ble gelfiltrering utført under anven-deise av en kortere (80 cm) kolonne av Sephadex ^ G-10. Resultatene var sammenlignbare unntatt at den lengere kolonne gav forbedret oppløsning. Særlig ble en antigen uavhengig fremkaller separert fra den hovedfluorescamin-reaktive topp på den lengere kolonne.

Som et alternativ til gelfiltrering kunne rensning ut-føres med geleksklusjonkromatografi med ydeevne, under anvendelse av en 1 x 25 cm's kolonne av sulfonert polystyrendivin-ylbenzen med en molekylvekteksklusjonsgrense på 5000

("Shodex S-802/S") eluert med vann ved en hastighet på 0,8 ml/minutt.

D. Omvendt fasekromatografi

Ytterligere rensning ble utført ved omvendt fasehøy-trykksvæskekromatografi under anvendelse av en octadecylsilankolonne eluert med en 0 - 100 % (v/v) gradient av ethanol i vann. Kolonnen ble fylt med 30 mg prøve (basert på fluorescamin-reaktivitet) og eluert med en hastighet på 0,5 ml/ minutt, og hvor der ble oppsamlet 1 ml<1>s fraksjoner. I enkelte prepareringer ble ethanol-vanngradienten efterfulgt av eluering med 100 % ethanol ved samme hastighet.

Fraksjonene ble lyofilisert og oppløst pånytt i 0,5 ml normal fysiologisk saltvannsoppløsning. Fraksjonene, 0,1 ml hver, ble injisert intradermalt i kombinasjon med et antigen overfor hvilket resipienten tidligere hadde vist seg å være følsom, og hudresponsene 24 timer senere ble målt. Resultatene er vist i fig. 2.

I den separasjon som er vist i fig. 2 var materialet erholdt fra en giver som var ufølsom overfor antigenet streptokinase (herefter "SK"). Mottageren var kjent for å være føl-som overfor streptokinase. Graden av hans hudreaksjon overfor SK i fravær av enhver modulator er vist som en horisontal linje i fig. 2. DH responser over denne linje viser forsterkeraktivitet, mens responser under det normale nivå antyder suppressoraktivitet. For referanse er stillingene antydet i fig. 2 for fraksjonene inneholdende fluorescamin-reaktivt materiale og for forskjellige små molekyler (serotonin, histamin, ascorbinsyre, nikotinamid og hydrocortisonfosfat) kjent for å være vasoaktiv, inflammatorisk eller anti-inflammatorisk. Den heltrukne linje viser hudreaktiviteten av individuelle fraksjoner i konsentrasjonene erholdt fra gradienten.

Resultatene av individuelle fraksjoner ble sammenlignet med aktivitetstester foretatt med oppsamlede fraksjoner (0 - 10, 10 - 20, og 20 - 30) administrert ved flere fortynninger. Ved høyere fortynning viste paradoksalt nok de oppsamlede

10 - 20 fraksjoner den maksimalt observerte forsterkeraktivitet. Fortynningseffekten av den individuelle fraksjon 5 med maksimal forsterker 1 aktivitet, og fraksjon 14, ble målt i et individ som var følsomt overfor SK. Resultatene var uttrykt ved måling i millimeter av dimensjonene av områdene med erythema og indurasjon, 7 timer, 12 timer og 24 timer efter injeksjon av antigen og modulator. Modulatorene var fortynnet i normalt fysiologisk saltvann. Disse data er angitt i tabell 1.

Når det gjelder forsterker 1 (fraksjon 5 i fig. 2) ble sterk akselerasjon og forsterkningseffekter observert ved alle de testede fortynningsnivåer, som antyder metning av teststedet ved alle de studerte konsentrasjoner. Med fraksjon ble det imidlertid observert en betydelig forsterkning bare ved fortynning med en faktor på 10 til 1000. Derfor ble der observert en skarp optimal konsentrasjon for forsterker 2 aktivitet. En grad av akselerasjon ble også observert, selvom denne var mindre uttalt enn den som ble dannet av forsterker 1.

De to tydelige topper for forsterkeraktivitet erholdt ved måling av ufortynnede prøver i fig. 2 gjenspeiler ikke nødvendigvis de riktige stillinger av forsterkerne i alle prepareringer. Der er flere grunner for dette. For det før-ste har forskjellige givere forskjellige nivåer av modulatorene i sine leukocytter. De kan også ha andre substanser i leukocyttene som kan påvirke prepareringen. Der er også biologisk variabilitet i testresipienten. Endelig er der den paradokse effekt av konsentrasjonen når det gjelder forsterker 2. Den nedsatte aktivitet i området for fraksjoner 12 - 18 i fig. 2 er særlig en klar følge av de ovenfor angitte optimale konsentrasjoner av forsterker 2 i dette område. Ved optimal fortynning skulle en topp for forsterker 2 aktivitet kunne observeres i området for fraksjoner 14 - 16. Denne konklusjon er representert ved den stiplede linje i fig. 2, som er en hypotetisk kurve for forsterker 2 aktivitet målt ved optimal fortynning.

Oppsamlede fraksjoner 21 - 30 hadde S-suppressoraktivitet. Når S-suppressor ble injisert sammen med antigen, for-hindret den effektivt tilsynekomst av en DH respons ved 6 eller 24 timer efter injeksjon. Derimot ble der observert en skarp DH respons ved 24 timer hvor antigen ble injisert alene, og en enda sterkere respons ble observert hvor forsterker 1 eller 2 også var tilstede. Resultatene er vist i fig. 3. Pasientens venstre arm mottok en serie subcutane injeksjoner av PPD blandet med oppsamlede fraksjoner av den gradient som er vist i fig. 2 ved 1:10 og 1:100 fortynninger, som indikert på pasientens arm: HP-1 (oppsamlede fraksjoner 1 - 10) betegnet HP-PK-1 på pasientens arm; HP-2 (fraksjoner 11 - 20) betegnet HP-PK-2; og HP-3 (fraksjoner 21 - 30) betegnet HP-PK-3. Kontrollinjeksjonen av PPD alene ble foretatt på pasientens høyre arm. Øket inflammasjon, i sammenligning med kontrollen var observerbar på stedene injisert med oppsamlet HP-1 og HP-2, på grunn av nærvær av forsterkere i disse fraksjoner. Imidlertid ble redusert inflammasjon observert ved HP-3 behandlede steder, på grunn av nærvær av suppressoraktivitet som syntes å dominere over aktiviteten av enhver forsterker i denne fraksjon. S-suppressor-aktiviteten ble observert i oppsamlede fraksjoner 21 - 30 ved motsatt fasekromatografi-separasjon, i de fleste givere. I enkelte tilfeller kunne S-suppressoraktivitet finnes i enkle fraksjoner, f.eks. fraksjon 29 i fig. 2. Suppressoraktivitet av enkle fraksjoner ble imidlertid ikke gjennomført observert i alle prepareringer, og nærvær av slik aktivitet viste seg å avhenge av gi-verindividet.

Når individuelle fraksjoner i området fra 20 til 30 ved omvendt fasekromatografisk separasjon ble anvendt ved flere fortynninger, ble eksistensen av forsterkere 3, 4 og 5 tyde-lig. Toppen av forsterker 3 aktivitet fremkom i fraksjoner 21 og 22, mens forsterker 4 aktivitet var sentrert i fraksjon 25, og forsterker 5 aktivitet ble hovedsakelig funnet i fraksjoner 27 og 28. S-suppressor ble funnet i fraksjoner 29 og 30. Resultatene er vist i fig. 4 som viser analyse av et re-presentativt kromatografisk forsøk. I fig. 4 ble DH respons

i forhold til kontrollene nedtegnet som graden av hudreaksjon definert som (a x b)-(a x x b x) hvor a og b er diametre i millimeter av den erythematøse lesjon resulterende fra injeksjon av fraksjon pluss antigen, målt langs innbyrdes vinkelrette akser, og a x og b x er de respektive diametere for kontroll-lesjon resulterende fra injeksjon av antigen alene. Graden av hudreaksjon er derfor forskjellen mellom de tilnærmede om-råder av lesjon fremkalt av antigen alene og antigen blandet

med modulator. Verdier merkbart under kontrollnivået for null, slik som de som observeres i fraksjoner 29 og 30, indikerer suppressoraktivitet mens verdier merkbart over null, indikerer forsterkeraktivitet. Det skal bemerkes at mønstret i fig. 4 er forenelig med det i fig. 2 når man betrakter resultatene av de odde-tall nummererte fraksjoner som var de eneste prøvede fraksjoner i forsøkene vist i fig. 2.

Forsterker 6 ble eluert fra den motsatte fasekolonne efter at ethanol-vanngradienten var nådd en konsentrasjon på 99,9 % ethanol, ved fortsatt eluering av kolonnen med 100 % ethanol ved 0,5 ml/minutt, og oppsamling av 1 ml's fraksjoner. Forsterker 6 ble påvist i rør 32 - 34 under disse betingelser med den tydeligste konsentrasjon i rør 33.

Forsterker 6 fremkalte en akselerert og forøket respons på antigener som resipienten var følsom for. ■■ En dose ekvivalent med utbyttet av 2 x 10 Q leukocytter i den beskrevne rensning forbedret, og i noen tilfeller restituerte DH responsen til pasienter som var blitt gjort mindre følsomme av interkurrent sykdom, på antigener overfor hvilke de tidligere var utsatt. Generelt ble responsene på forsterker 6 øket ved fortynning, selvom den optimale fortynning varierte med den individuelle resipient og kanskje også avhengig av antigenet. Tabell 4 viser resultatene av to fortynningsforsøk. I del A mottok en streptokinase-følsom resipient 2,5 enheter streptokinase samtidig med forsterkeren. 1,0 ml<1>s fraksjoner av forsterker oppsamlet fra den motsatte fasekolonne ble lyofilisert og oppløst pånytt i 0,3 ml normalt fysiologisk saltvann.

0,1 ml av de angitte fraksjoner, fortynnet til den viste grad med normalt fysiologisk saltvann, ble injisert. I del B ble en PPD følsom resipient injisert med 0,05 ml av en

1/10 fortynning av standard "Aplisol PPD" sammen med den in-dikerte fortynning av forsterker 6 i 0,1 ml fysiologisk saltvann, eller med 0,1 ml av normalt fysiologisk saltvann alene som kontroll.

Materiale med forsterkeraktivitet er ekstraherbart

fra vandig oppløsning med ether. Den ekstraherbare aktivitet

krever fortynning for maksimal aktivitet. Ethereks traktet er derfor antatt å inneholde minst noen av de beskrevne forsterkere. Det er imidlertid ikke kjent hvilke av de beskrevne forsterkere som er ether-ekstraherbare. Omvendt fasekromatografisk separasjon av de ovenfor beskrevne modulatorer kan utføres under anvendelse av et flertall kjente motsatt fase-kolonnematerialer. Selvom betingelsene ved eluering kan variere, vil de optimale betingelser for separering av de ovenfor beskrevne modulatorer lett kunne bestemmes av fagman-nen .

E. Fraksjonering av L- dialysefraksjorten

L-dialysefraksjonen ble ytterligere fraksjonert ved kromatografi på hydroxylapatitt. Efter fjerning av fine bestanddeler ble hydroxylapatitt som på forhånd var ekvilibrert med 5 mil ammoniumbicarbonat, pakket i en 1,5 x 20 cm's kolonne. L-fraksjonen, lyofilisert og oppløst pånytt i 0,05 M ammoniumbicarbonat ble tilført kolonnen. Kolonnen ble eluert med en gradient av 0,05 M til 0,2 M vandig ammoniumbicarbonat (115 ml), fulgt av en gradient på 0,2 M til 0,6 M ammoniumbicarbonat (65 ml). 1 ml's fraksjoner ble overvåket for absorbans ved 260 nm og reaktiviteter med fluorescamin. Individuelle fraksjoner ble oppsamlet i syv kombinerte fraksjoner som spen-ner over det meste av gradienten. De kombinerte fraksjoner ble analysert med hensyn til biologisk aktivitet ved injiser-ing av hver fraksjon intradermålt i nærvær av et antigen overfor hvilket mottageren var følsom. Resultatene er vist i tabell 2. Relativ DH respons er indikert i tabell 2 av diameteren av indurasjonsområdet, i millimeter, målt efter 25 og 43 timer, sammenlignet med et kontrollreaksjonssted hvori antigen ble injisert alene. Fraksjoner 450 og 451, som eluerte ut mellom 0,1 M og 0,15 M ammoniumbicarbonat, undertrykket sterkt DH reaksjonen i minst 43 timer. Efter 72 timer ble der observert reaksjoner som målte 10 mm x 10 mm ved steder som mottok fraksjoner 450 og 451, som indikerer at suppressoraktiviteten er reversibel med tiden.

EKSEMPEL 2 Karakterisering og kontrollforsøk

A. Dialyserte røde blodcelleekstrakter ble fremstilt på samme måte som leukocyttekstrakter ble fremstilt i eksempel IB. Differensialdialyse, kolonnekromatografi på Sephadex<® >G-10 ble utført som beskrevet i eksempel 1. Ingen immun modulatoraktivitet ble observert i de resulterende fraksjoner. Derfor ble den observerte biologiske aktivitet ikke introdu-sert ved ekstraksjons- og rensetrinnene. I tillegg var ekstrakter av blodplater underkastet identiske rensetrinn, frie for modulatoraktivitet. Noen av de rensede forsterkere var blitt rekromatografert og funnet å oppføre seg på hovedsakelig samme måte som observert under begynnelsesrensningen.

B. I lys av den store mengde litteratur som angår overfø-ringsfaktor, var det viktig å vise, så utvetydig som mulig,

at de observerte forsterkninger av resipientsensibilitet ikke i realitet skyldes overføringen av en lav-nivå sensibilitet, tidligere ikke påvist i giveren, som når denne ble konsentrert ville fremkomme som forsterket sensibilitet i en resipient. Den her anvendte forsøksmetodikk var basert på testing med hensyn til antigener som har en geografisk utbredelse eller har en medisinsk påviselig kilde. PPD, et renset proteinderi-vat av tuberkelbaciller, er både medisinsk påviselig og geografisk lokalisert. Følsomhet overfor PPD oppstår i individer som tidligere er vaksinert med BCG (Bacille Calmette-Guerin). , vidt anvendt for å immunisere mot tuberkulose i Europa. Imidlertid har dens bruk ikke vært godkjent i USA. Histoplasmin er et geografisk lokalisert antigen. Følsomhet overfor histoplasmin er vidt utbredt i det sydlige USA og i tropiske områ-der hvor histoplasmose er endemisk, men finnes ikke i Nord-Europa.

I kontrollforsøket var giveren, en innbygger i det sørøstlige av USA, hudtestfølsom overfor histoplasmin, men var ikke-reaktiv overfor PPD. Mottagerne hadde hele livet bodd i Storbritannia med enten en demonstrerbar hudtestføl-somhet overfor PPD, eller var tidligere vaksinert med BCG. Forsterkerpreparatet som ble anvendt i dette forsøk var renset som beskrevet gjennom Sephadex ®G-10 fraksjoneringstrinn med den unntagelse at en kortere, 80 cm's kolonne med en noe lavere oppløsning ble anvendt. Følgelig var testmaterialet en blanding av forsterkere 1 - 6 og S-suppressor, i tillegg til fluorescamin-reaktivt materiale. Resultatene er ikke de-sto mindre signifikante som bevis på mangel av overførings-faktoraktivitet i preparatet.

Resultatene er vist i tabell 3. To mottagere ble hver testet med to fluorescamin-reaktive toppfraksjoner (nr. 33 og 39 i Sephadex ®kolonnen). Hver fraksjon, 2,4 mg basert på fluorescamin-reaktivitet, ble injisert enten alene eller med

25 enheter PPD. Fjorten timer efter den første injeksjon ble de steder som tidligere ikke hadde mottatt antigen, utfordret med histoplasmin, 0,1 ml histoplasmin antigen (solgt som en 1:100 W/V fortynning i normalt fysiologisk saltvann). Kon-trollsteder med PPD eller histoplasmin injisert alene ved det passende tidspunkt, ble også fremstilt. I tabell 3 er hudre-aksjonens intensitet uttrykt i diameteren i mm av indurasjons-sonen som omgir injeksjonsstedet. Dataene viser at mottagerne manglet enhver evne til å reagere med histoplasmin, enten før eller efter injeksjon av leukocyttekstraktfraksjoner. Både de akselererende og forøkende aspekter ved forsterkeraktivitet var påviselige. På den annen side var ingen overføring av hi-stoplasminsensibilitet påviselig. C. En viktig side ved forsterkeraktivitetene som er beskrevet, er at alle disse innbefattende den akselererende (forsterker 1) og forøkende (forsterker 2) og forsterker 6 er systemisk effektive. Ennvidere kan de systemiske effekter observeres i anerge pasienter (de som har tapt sin normale im-munfølsomhet på grunn av sykdom).. Pasienter som er blitt BCG-vaksinert og- som fortiden var ikke-følsomme overfor PPD som et resultat av sykdom, kunne gjøres følsomme overfor PPD ved subcutan injeksjon av den forsterkerfraksjon som er beskrevet i eksempel 2B, under anvendelse av en 10 - 100 ganger høyere dose av forsterkeren. Respons på antigen var ikke lokalisert til stedet for forsterkerinjeksjon.

Systemiske effekter ble dramatisk vist i en serie for-søk under anvendelse av forsterker 6. En pasient med 4 år gammel sarcoidose utviste ekstremt svake responser overfor alle antigener. Den følgende serie tester ble utført. På dag 1 i testen ble pasienten administrert tetanus toksoid, alene og i kombinasjon med forsterker 6 ved flere fortynninger. Resultatene, vist i tabell 5, viste en svak erythematøs respons uten indurasjon på tetanus toksoid alene, og en noe svak forsterkning av respons med forsterker 6. Imidlertid var der ingen indurasjon ved noen av teststedene, som indikerer at pasienten ikke reagerer passende. På dag 2 i testen mottok pasienten en subcutan injeksjon av forsterker 6 fra fraksjon 33 av motsatt fasekromatografi, i en mengde ekvivalent med det ekstraherbare fra ca. 2 x 10 Q leukocytter. På dag 8 i testen ble pasienten utfordret med tetanus toksoid, alene og i kombinasjon med flere fortynninger av forsterker 6 som tidligere. Denne gang var det imidlertid en betydelig respons på forsterker 6, med en viss indurasjon som vist i tabell 5. Resultatene indikerer en betydelig øket følsomhet på antigenet, modulert av en systemisk effekt av injeksjonen av forsterker 6 administrert på dag 2.

Ytterligere tegn på den systemiske effekt av forsterker 6 ble tilveiebragt ved måling av følsomheten av pasientens perifere blodlymfocytter på aktivering in vitro. Lymfo-cyttaktivering er et velkjent fenomen. En prøve av perifere blodlymfocytter fra normale individer ble påskyndet vegetativ formering i cellekultur ved et flertall kjente aktiverende midler, omfattende forskjellige plantemitogener og fytohemag-glutinin (herefter PHA). Graden av vegetativ formering viste seg ved opptagelse av <3>H-thymidin fra dyrkningsmediet inn i DNA av de delende celler. Testprosedyren er beskrevet av Oppenheim, J.J., et al, i In Vitro Methods of Cell Mediated and Tumor Immunity (Bloom and David, Eds.), s. 573 - 585, Academic Press, New York, N.Y. (1976)

Prøver av perifere lymfocytter ble erholdt fra pasienten på dag 2 og dag 8 i den ovenfor beskrevne test, og prøvet med hensyn til respons på et flertall aktiverende midler. Resultatene er vist i tabell 6. Lymfocytter fra dag 2 var godt under det normale responsnivå, mens lymfocytter fra dag 8 utviste normal eller forøket følsomhet, overfor to av de tre ak-tivatorer. Derfor var der oppstått en betydelig systemisk

respons på den subcutane injeksjon av forsterker 6.

Resultatene i tabell 6 er uttrykt som tellinger pr. minutt av <3>H-thymidin opptagelse.

GENERELLE KONKLUDERENDE BEMERKNINGER

De ovenfor beskrevne modulatorer av immunsystemet betraktes som substanser hvis naturlige funksjon er regulering av immunresponsen, direkte når det gjelder celleformidlet immunitet, og som kanskje indirekte påvirker humoral immunitet. Substansene er blitt fremstilt med høy grad av renhet slik at deres egenskaper nu er blitt karakterisert og vist seg å være fullstendig og uventet forskjellige fra overføringsfaktor og partialfraksjoneringer derav som beskrevet i den kjente litteratur. De her beskrevne forsterkere og suppressorer er medisinsk nyttige ved behandlingen av humane pasienter som lider av et flertall hyperimmune og hypoimmune tilstander. Det er spesielt signifikant at disse substanser kan isoleres fra normale individer heller enn fra spesifikke identifiserte givere, slik at rensning i stor skala fra oppsamlede kilder er enkel. Det vil forståes at de her beskrevne modulatorer defineres uttrykt i biologisk aktivitet og fysikalske egenskaper, og består ikke nødvendigvis av enkelte kjemiske substanser .

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av forsterkere 1 - 6 og S-suppressor ved rensning av et ekstrakt av humane leukocytter, og separering av disse fra L-suppressor og andre materialer med forsterker, suppressor og fremkalleraktiviteter og fra hovedsakelig alt fluorescamin-reaktivt materiale, karakterisert ved at

1) eksttaktet dialyseres gjennom en dialysemembran med en nominell molekylvektavbrytning på 3500,

2) dialysatet fraksjoneres ved gelfiltrering under dannelse av et flertall fraksjoner,

3) modulatoraktiviteten av dialysatfraksjonene bestemmes,

4) de modulatorbestemte fraksjoner som utviser en betydelig modulatoraktivitet, utvelges og oppsamles,

5) de utvalgte og oppsamlede fraksjoner tilsettes en høy-trykks-omvendt-fasekromatografikolonne pakket med octadecylsilan,

6) kolonnen elueres med en ethanol-l-vann-gradient og

7) på forhånd bestemte fraksjoner basert på ethanolkonsen-trasjonen deri utvelges og oppsamles.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gradienten innbe-fatter ethanol i vann fra en konsentrasjon på 0% (v/v) til 12% (v/v), og at avløpet eluert i dette område oppsamles, hvorved en første forsterker ekstraheres i hovedsakelig renset form.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gradienten innbe-fatter ethanol i vann fra en konsentrasjon på 28% (v/v) til 50% (v/v), og at avløpet eluert i dette område oppsamles, hvorved en andre forsterker ekstraheres i hovedsakelig renset form.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gradienten innbe-fatter ethanol i vann fra en konsentrasjon på 65% (v/v) til 80% (v/v), og at avløpet eluert i dette område oppsamles, hvorved en tredje forsterker ekstraheres i hovedsakelig renset form.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gradienten innbe-fatter ethanol i vann fra en konsentrasjon på 81% (v/v) til 91% (v/v), og at avløpet eluert i dette område oppsamles, hvorved en fjerde forsterker ekstraheres i hovedsakelig renset form.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gradienten innbe-fatter ethanol i vann fra en konsentrasjon på 92% (v/v) til 97% (v/v), og at avløpet eluert i dette område oppsamles, hvorved en femte forsterker ekstraheres i hovedsakelig renset form.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gradienten innbe-fatter ethanol i vann fra en konsentrasjon på 97% (v/v) til 99% (v/v), og at avløpet eluert i dette område oppsamles, hvorved en S-suppressor ekstraheres i hovedsakelig renset form.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gradienten innbe-fatter ethanol i vann fra en konsentrasjon på 99% (v/v) til ren ethanol, og at avløpet eluert i dette område oppsamles, hvorved en sjette forsterker ekstraheres i hovedsakelig renset form.