CH622701A5

CH622701A5 -

Info

Publication number: CH622701A5
Application number: CH1548575A
Authority: CH
Inventors: Torsten Bertil Dr Helting
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1974-12-03
Filing date: 1975-11-28
Publication date: 1981-04-30
Also published as: DE2457047A1; ATA915575A; AU8716775A; AU504575B2; IL48571A0; BE836228A; US4029765A; IL48571A; FR2293217A1; LU73900A1; IE42760B1; DE2457047C3; CA1066621A; IE42760L; SE7513606L; JPS5182719A; AT342764B; NL7513941A; SE431401B; GB1531417A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins.

Die herkömmlichen Tetanusimpf stoffe zur aktiven Immunisierung enthalten fast ausschliesslich durch Inaktivierung des Tetanustoxins mit Formaldehyd hergestelltes Antigen. Diese als Toxoid bezeichnete Substanz ist mit einer Vielzahl von antigenen Determinanten ausgestattet, wovon nur einige für die Erzeugung von schützenden Antikörpern gegen Tetanus eine Rolle spielen dürften. Die Abtrennung von für den Schutz nicht erforderlichen Determinanten ist wünschenswert, um zu antigenen bzw. immunogenen Stoffen zu kommen, die wegen eines engeren Spektrums von determinanten Gruppen eine erhöhte Spezifität und eine verbesserte Verträglichkeit erwarten lassen.

Tetanustoxin wird von Zellen der CI. tetani synthetisiert und kann sowohl aus der Zellmasse als auch aus dem Kulturfil-trat gewonnen werden. Während das extrazellulär gewonnene Toxin aus zwei Polypeptidketten besteht, die nach Behandlung mit Disulfid-Brücken reduzierenden Mitteln (z. B. Dithiothrei-tol (DTT), Dithioerythrit (DTE), Mercaptoäthanol, Cystein) unter denaturierenden Bedingungen getrennt werden können, besteht das intrazelluläre Toxin aus einer einzigen Polypeptidkette, die in bekannter Weise durch eine milde Trypsinbe-handlung in ein dem extrazellulären Toxin identisches Produkt überführt werden kann. Die beiden davon zu erhaltenden Bruchstücke, hier bezeichnet als die leichte Kette (Mol.-Gew. s ca. 50 000) und die schwere Kette (Mol.-Gew. ca. 100 000) sind bisher nur durch Massnahmen, die unter denaturierenden Bedingungen, z. B. in Natriumdodecylsulfat-haltiger Lösung, durchgeführt werden, trennbar, und die getrennten Fragmente können nach dem bisherigen Stand der Technik nur durch io denaturierende Mittel in Lösung gehalten werden [C. J. Craven und D. J. Dawson, Biochim. Biophys. Acta 317 (1973) 277 bis 285; M. Matsuda und M. Yoneda, Biochem. Biophys. Res. Commun. 57 (1974) 1257 bis 1262 und Infection und Immu-nity 12 (1975) 1147 bis 1153],

15 Der hier vorgelegten Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die leichte Kette des Tetanustoxins in einer Weise zu modifizieren, dass es ohne Verlust der Antigenität in einem physiologisch verträglichen Medium gehalten werden kann. Im besonderen soll die leichte Kette als wesentlicher immunoge-20 ner Bestandteil von Tetanusimpfstoffen zur Verfügung stehen und darin das herkömmliche Toxoid ersetzen.

Es wurde gefunden, dass dieses Ziel dadurch erreicht werden kann, dass man die leichte Kette entweder vor oder nach Abtrennung der schweren Kette aus dem Molekülver-25 band des Tetanustoxins, das einen Komplex der leichten und schweren Kette darstellt, einer geringgradigen chemischen Modifizierung unterwirft. Dadurch lässt sich die spontane, irreversible Ausfällung der leichten Kette, die nach Entfernung von denaturierenden Agenzien, wie Harnstoff, beobachtet 30 wird, vermeiden.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine wässrige Lösung des Tetanustoxins mit einem aliphatischen Mono- oder 35 Dialdehyd der Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehydkonzentration von 0,01 bis 0,05 M Aldehyd bei 1 bis 20° C 5 Minuten bis 50 Stunden behandelt, vor oder nach der Aldehydbehandlung das Toxin in Gegenwart einer Disul-fidbrücken reduzierenden Verbindung und einem denaturie-40 renden Agens umsetzt, anschliessend das Derivat der leichten Kette in Gegenwart des denaturierenden Agens mit proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt und zweckmässig vom denaturierenden Agens abtrennt.

Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass man 45 eine wässrige Lösung des Tetanustoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, mit einer Aldehydkonzentration von 0,02 bis 0,03 M bei 1 bis 6° C 2 bis 20 Stunden behandelt, die das so modifizierte Toxin enthal-50 tende Lösung mit einem Disulfidbrücken-reduzierenden Agens versetzt, das Derivat der leichten Kette aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt und zweckmässig vom denaturierenden Mittel abtrennt.

55 Nach der Isolierung des Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins kann das denaturierende Agens durch Dialyse oder andere vergleichbare Methoden, die die Abtrennung von niedermolekularen Stoffen von hochmolekularem Protein gestattet, beispielsweise durch Gelchromatographie entfernt 60 werden. Mit gleichen Massnahmen ist auch der zur Umsetzung eingesetzte und dabei nichtverbrauchte Aldehyd aus den Ansätzen zu beseitigen.

Das entsprechend dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Derivat zeigt danach in physiologisch verträgli-65 chen, isotonisch wässrigen Medien nicht mehr die von der leichten Kette bekannten Denaturierungs- und Ausfällungserscheinungen. Das Derivat hat nicht mehr die vom Tetanustoxin bekannte giftige Eigenschaft. Es verhält sich als Antigen

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und ist in der Lage, schützende Antikörper gegen Tetanus im menschlichen oder tierischen Organismus zu induzieren.

Das erfindungsgemäss hergestellte Derivat ist mit üblichen proteinchemischen Methoden weiter zu reinigen. Bei der bekannt hohen Toxizität des nativen Tetanustoxins und der ebenso bekannten Tatsache, dass Eiweissfraktionierungsme-thoden nur in den seltensten Fällen zu einer 100%igen Abtrennung von Begleitsubstanzen, insbesondere ähnlich strukturierten Eiweisskörpern, führen, ist es jedoch vorteilhaft, das erfindungsgemäss hergestellte Produkt einer weiteren Aldehydbehandlung zu unterziehen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,05 bis 0,2 M, vorzugsweise 0,08 bis 0,15 M, versetzt und 14 bis 28 Tage bei 20 bis 37° C stehen lässt, den Aldehyd z.B. durch Dialyse entfernt und das modifizierte Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins gewinnt.

Die zusätzliche Aldehydbehandlung führt zu einer weiteren Stabilisierung der leichten Kette des Tatanustoxins und zur Beseitigung eventuell noch vorhandener Resttoxizität.

Es ist naheliegend, dass ein stabiles Derivat der leichten Kette auch dadurch hergestellt werden kann, dass man natives Tetanustoxin, gewonnen aus Kulturfiltraten der CI. tetani in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit Disulfidbrük-ken-reduzierenden Stoffen, z. B. Thiolverbindungen, behandelt, die Abtrennung der leichten Kette von der schweren Kette unter denaturierenden Bedingungen vornimmt, vorteilhaft durch Chromatographie in beispielsweise harnstoffhaltigen Pufferlösungen, anschliessend durch Massnahmen, die die Abtrennung von niedermolekularen Stoffen von hochmolekularem Protein gestatten, das denaturierende Mittel zweckmässig durch Gelchromatographie entfernt und die leichte Kette sofort mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd mit einer Aldehydkonzentration von 0,01 bis 0,05 M, 5 Minuten bis 50 Stunden bei 1 bis 20° C stehen lässt. Gewünschtenfalls kann eine zweite Aldehydbehandlung zur Modifizierung des Derivates angeschlossen werden. Es kann jedoch auch die leichte Kette unmittelbar nach deren Isolierung mit der für die Modifikation des Derivates verwendeten höheren Aldehydmenge umgesetzt werden. Diese Verfahren bieten jedoch keinen Vorteil, da die Ausbeute des Derivates der leichten Kette, die nach dem letztgenannten Verfahren hergestellt wird, erheblich unter der liegt, wie sie nach dem erstgenannten Verfahren erhalten werden kann.

Als Ausgangsmaterial benötigt man Tetanustoxin, welches aus Kulturfiltraten der CI. tetani in bekannter Weise gewonnen wurde (extrazelluläres Toxin). Als Alternative kann man ein nach beschriebenen Verfahren hergestelltes Tetanustoxin verwenden, das durch Extraktion der Cl. tetani-Bakterien gewonnen wurde (intrazelluläres Toxin). Hier ist jedoch eine nach bekannter Methode durchzuführende Trypsinbehandlung vor oder nach der Umsetzung mit Aldehyd notwendig. Falls die leichte Kette erst nach Abtrennung von der schweren Kette mit Aldehyd umgesetzt werden soll, muss bei intrazellulärem Toxin selbstverständlich eine Trypsinbehandlung tot der Aldehydumsetzung erfolgen, da der proteolytische Schritt eine Voraussetzung zur Isolierung der leichten Kette aus diesem Ausgangsmaterial darstellt. Die als Ausgangsmaterial verwendete Tetanustoxin-Lösung enthält das Toxin zweckmässig in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mg/ml.

Als Disulfidbrücken-reduzierende Verbindungen werden Thiolverbindungen bevorzugt. Hierfür kommen beispielsweise in Frage Cystein, Merkaptoäthanol, Dithioerythrit, vorzugsweise jedoch Dithiothreitol. Sie werden in Mengen zugesetzt, die eine Konzentration der Disulfid-Brücken-reduzierenden

Verbindungen im Reaktionsgemisch von 0,05 bis 0,3 M bewirken.

Unter denaturierenden Agenzien im Sinne des vorgelegten Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Dissoziation von Proteinmolekülen in Untereinheiten, insbesondere durch Lösung von Wasserstoffbindungen, bewerkstelligt werden kann. Bekannte Wasserstoffbin-dungen-lösende Agenzien sind beispielsweise Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid. Harnstoff hat sich vorzugsweise in einer Konzentration von 4 bis 6 M, Guanidinhydrochlorid bei 2 bis 4 M besonders bewährt.

Die Isolierung einer modifizierten leichten Kette aus dem herkömmlichen Tetanustoxoid ist nicht möglich, da hier durch Einsatz von wesentlich höheren Formaldehydmengen eine kovalente Quervernetzung zwischen der leichten und der schweren Kette stattgefunden hat. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, jede die nichtdenaturierte leichte Kette enthaltende Lösung mit Aldehyden umzusetzen, um zu Derivaten mit den vorteilhaften Eigenschaften bezüglich Stabilität und Antigenität zu kommen.

Neben den aufgezeigten Verfahrensmöglichkeiten sind Gegenstand der Erfindung ferner Derivate des Tetanustoxins, welche nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden.

Die erhaltenen Derivate des Tetanustoxins können zur Herstellung von Tetanus-Impfstoffen zur Prophylaxe der Tetanus-Erkrankung oder zur Herstellung von therapeutisch oder diagnostisch verwendbaren Tetanus-Antiseren, aber auch diagnostischen Präparaten, die Tetanustoxin-Derivate oder davon gewonnene Antiseren enthalten, verwendet werden. Zur Erhöhung der Lösungsstabilität des erfindungsgemäss hergestellten Produktes kann es zweckmässig sein, dem physiologisch verträglichen, wässrigen Medium, in dem dies gelöst ist, zur Stabilisierung von Proteinlösungen verwendete Verbindungen, wie Aminosäuren oder Kohlenhydrate, zuzusetzen.

Es ist zum Schutz gegen mikrobielle Kontamination empfehlenswert, den gebrauchsfertigen Lösungen antimikrobielle Substanzen, wie z. B. Natrium-timerfonat, zuzusetzen. Die Tetanustoxin-Derivate können zur Herstellung eines polyvalenten Impfstoffes mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden in herkömmlicher Weise vermischt werden.

Die Eignung der Produkte als Impfstoffe wird im folgenden durch Versuche bewiesen, die eine gute Wirksamkeit des Produktes bescheinigen.

Wirksamkeitstest a) in vitro

Um eine Auffassung über die protektive Wirksamkeit der determinanten Gruppen, die auf der leichten Kette vorhanden sind, zu bekommen, wurde folgender Versuch durchgeführt: Tetanus-Antitoxin-Serum vom Pferd wurde mit steigenden Mengen des Produktes laut Beispiel 1 absorbiert. Durch Prüfung der Überstände mittels der immunologischen Doppeldiffusionstechnik wurde die Äquivalenzzone, in der sämtliche Antikörper, die gegen das Derivat der leichten Kette gerichtet waren, präzipitiert wurden, ermittelt. Die Auswertung der Antikörper im Tierversuch ergab, dass bis zu 40% der schützenden Antikörper aus dem Antiserum von dem erfindungsgemässen Produkt absorbiert werden konnten.

b) in vivo

Gruppen à 10 Meerschweinchen erhielten subkutan 1 ml (20 jug) einer Suspension des Produktes nach Beispiel 1, adsorbiert an 0,2% Al(OH)3-Gel. Nach 4 Wochen wurden die Tiere mit Tetanustoxin, entsprechend 100 minimal-tödlicher Dosen (= dlm) vergiftet. Die Überlebensrate betrug 100%.

2 Kaninchen wurden in einem Intervall von 14 Tagen zweimal mit dem erfindungsgemässen Produkt nach Beispiel

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3 immunisiert (160/ig Tetanustoxin-Derivat in 1 ml kompletten Freundschem Adjuvans suspendiert je Applikation und Tier). Drei Tage nach der 2. Injektion wurden Blutproben vorgenommen. Die Auswertung der Tetanusantitoxintiter im Serum betrug 100 IE/ml bzw. 50 IE/ml.

Die Erfindung soll in den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Tetanustoxin, gewonnen aus dem Kulturfiltrat der CI. tetani (40 000 Lf-Einheiten, entsprechend ca. 100 mg Protein) wird in 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, aufgenommen und mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,03 M Aldehyd versetzt und 16 Stunden bei 4° C stehengelassen. Die Lösung wird anschliessend gegen isotonische phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, dialysiert, danach auf ca. 20 ml eingeengt; 150 mg Dithiothreitol und Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 6 Mol/1 werden hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur wird diese Lösung auf eine Säule (4,5 x 100 cm) von Sephadex®*-G 150, äquilibriert mit 6 M Harnstoff in 0,1 M Trishydroxymethyl-aminomethan-HCl-Puffer (Tris), pH 8,0, und einem Zusatz von Dithiothreitol, 0,001 M, aufgetragen. Die Elution erfolgt mit dem Äquilibrierungsgemisch. Bei der Chromatographie werden durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm zwei Pro-teinpeaks erkennbar. Dem ersten Peak entsprechendes Material wird verworfen. Der zweite Peak enthält das Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins. Die Lösung des isolierten Derivates der leichten Kette wird gegen 0,1 M Phosphatpuffer dialysiert und in einer Proteinkonzentration von 100/ig Protein/ml mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M Aldehyd versetzt und drei Wochen bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach einer abschliessenden Dialyse gegen 0,15 M NaCl zur Entfernung von freiem Formaldehyd wird das modifizierte Derivat der leichten Kette gewonnen. Es kann durch Ultrafiltration ankonzentriert und in bekannter Weise zu einer Vakzine verarbeitet werden. Dabei können als Stabilisator Glycin oder Lysin verwendet werden. Als Adjuvans wird s eine Suspension von Al(OH)3 verwendet. Statt Formaldehyd kann auf die molare Aldehydmenge bezogen auch Glutardial-dehyd, Propionaldehyd oder Butyraldehyd entweder in beiden Stufen oder auch nur in einer Stufe verwendet werden. * Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala.

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Beispiel 2

Tetanustoxin aus Zellextrakten wird in einer Proteinkonzentration von 0,1% in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, mit 100 jig Trypsin versetzt und während 60 Minuten bei Zimmertem-is peratur stehengelassen. Anschliessend wird Trypsininhibitor aus Rinderlunge (150/ig) hinzugefügt und das Produkt laut Beispiel 1 mit Formaldehyd umgesetzt, dialysiert, mit Dithiothreitol reduziert und in Harnstofflösung chromatographiert.

20 Beispiel 3

Tetanustoxin (20 ml, 0,5% Protein) in 0,1 M Tris, pH 8,0, wird mit Dithioerythrit (150 mg) und Guanidinhydrochlorid bis zu einer Endkonzentration von 4 Mol/1 umgesetzt und analog Beispiel 1 chromatographiert. Der zweite Peak wird 25 gepoolt, das Volumen wird auf 400 ml eingestellt und das Guanidinhydrochlorid wird durch Chromatographie auf einer Säule mit Sephadex®-G 25 (Säuleninhalt 2000 ml) mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, zusammen mit niedrigmolekularen Bestandteilen des Reaktionsgemisches eluiert. Die leichte 30 Kette wird dann mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M Aldehyd versetzt und 3 Wochen bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Verarbeitung zu einer Vakzine erfolgt laut Beispiel 1.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des Tetanustoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd mit einer Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bei einer Aldehydkonzentration von 0,01 bis 0,05 M bei 1 bis 20° C während 5 Minuten bis 50 Stunden behandelt, vor oder nach der Aldehydbehandlung das Toxin in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit einer Disulfid-brücken reduzierenden Verbindung umsetzt und anschliessend das Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins in Gegenwart des denaturierenden Agens mit Hilfe proteinchemischer Isolierungsverfahren gewinnt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aldehyd Formaldehyd verwendet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als denaturierendes Agens Harnstoff verwendet.

4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man extrazelluläres Tetanustoxin einsetzt.

5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Trypsin vorbehandeltes intrazelluläres Tetanustoxin verwendet.

6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man vom Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins das denaturierende Agens abtrennt.

7. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 ein Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins herstellt und dieses mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd mit einer Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,05 bis 0,2 M versetzt und 14 bis 28 Tage bei 20 bis 37° C stehen lässt, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins gewinnt.

8. Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.

9. Modifiziertes Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 7.