DD292262A5

DD292262A5 - USE OF MODIFIED NYLON FILMS FOR CLEANING PROTEINS

Info

Publication number: DD292262A5
Application number: DD32015088A
Authority: DD
Inventors: Gerd Birkenmeier; Goetz Gaertner; Monika Himmel; Eberhard Hofmann; Klaus Huse; Gerhard Kopperschlaeger
Original assignee: Karl-Marx-Universitaet Leipzig,De
Priority date: 1988-09-27
Filing date: 1988-09-27
Publication date: 1991-07-25

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer kommerziell zur kovalenten Fixierung von Proteinen hergestellten Nylonfolie fuer die Anreicherung von Proteinen aus Zellhomogenaten oder anderen Quellen, indem die nicht vorhersehbare Eigenschaft der Folie zur selektiven und nicht-kovalenten Bindung von Proteinen und deren selektive Abloesung ausgenutzt wird. Dadurch lassen sich Enzyme und andere Proteine aus Homogenaten in einem einzigen Schritt 10-100fach anreichern, bzw. bereits teilgereinigte Proteine bis zur Homogenitaet reinigen oder unerwuenschte Enzymaktivitaeten aus Proteinpraeparaten entfernen. So aufbereitete Proteine finden u. a. in der medizinischen Diagnostik und Forschung und in der Lebensmittelindustrie Anwendung.{Affinitaetschromatographie; Enzyme; Kinase; Proteine; Affinitaetselution; Serumproteine; Nukleotide; Proteinreinigung; Membranen; Nylonfolien}The invention relates to the use of a nylon film commercially produced for the covalent fixation of proteins for the enrichment of proteins from cell homogenates or other sources, by taking advantage of the unpredictable property of the film for the selective and non-covalent binding of proteins and their selective separation. As a result, enzymes and other proteins from homogenates can be enriched 10-100 times in a single step, or even purify partially purified proteins to homogeneity or remove undesired enzyme activities from protein preparations. So processed proteins find u. a. in medical diagnostics and research and in the food industry application {affinity chromatography; enzymes; kinase; proteins; affinity elution; Serum proteins; nucleotides; Protein purification; membranes; Nylon films}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

The invention relates to the use of modified nylon films for the purification of proteins.

Charakterisierung des Standes der TechnikCharacterization of the prior art

Zur Reinigung von Proteinen finden eine Reihe von allgemeinen und spezifischen Techniken Anwendung. So sind Fällungsreaktionen durch Salze, organische Lösungsmittel u.a. Substanzen, Ionenaustausch-, Affinitäts- u.a.For purification of proteins, a number of general and specific techniques are used. Thus, precipitation reactions by salts, organic solvents, etc. are. Substances, ion exchange, affinity and the like.

chromatographische Verfahren, die Unterschiede in Ladung, Molekülgröße und spezifischen Bindungseigenschaften ausnutzen, gebräuchlich. Zum Beispiel, wird bei der Affinitätschromatographie ein mehr oder weniger spezifischer Ligand an eine unlösliche Matrix gebunden. Durch Bindung der Proteine aus Zellhomogenaten oder anderen biologischen Flüssigkeiten, durch Waschen der Matrix zur Entfernung ungebundener Eiweiße und Fremdsubstanzen und durch nachfolgende spezifische Ablösung lassen sich in der praktischen Anwendung mit einer solchen Technik Reinigungsfaktoren bis etwa 100 erreichen. Derartige Affinitätssorptionen sind in Batch- oder säulenchrcmatographischen methodischen Anwendungen gebräuchlich. Die Wahl der Liganden und Matrizen sowie die Kopplungsmethoden der Liganden an die Träger variieren und erfordern oftmals einen beträchtlichen AufwandChromatographic methods that exploit differences in charge, molecular size and specific binding properties, common. For example, affinity chromatography binds a more or less specific ligand to an insoluble matrix. By binding the proteins from cell homogenates or other biological fluids, by washing the matrix to remove unbound proteins and foreign substances, and by subsequent specific detachment, purification factors up to about 100 can be achieved in practical use with such a technique. Such affinity sorptions are common in batch or column chromatographic methodological applications. The choice of ligands and templates as well as the coupling methods of the ligands to the supports vary and often require considerable effort

Zusammenfassende Darstellungen dieser Methodik finden sich bei Summaries of this methodology are included

Lowe, C. R. und Dean, P. D. G. Affinity chromatography, John Wiley & Sons, London, 1974Lowe, C.R. and Dean, P.D. Affinity chromatography, John Wiley & Sons, London, 1974

Eckstein, F. und Sundaram, P.V. (Hrsg.), Theory and practice in affinity chromatography. Academic Press, New York, 1978. Die Nachteile dieser Techniken liegen in der teilweise instabilen Matrix, die durch chemische Agentien oder mikrobiologische Zersetzung Veränderungen unterliegen können oder in der zu starken Hydrophobizität von chemisch inerten Trägern, was in der Regel zu einer unspezifischen Bindung führt. Im allgemeinen müssen partikelfreie Lösungen als Quelle der zu reinigenden Enzyme eingesetzt werden, um Verstopfungen oder unerwünschte Verunreinigungen der Affinitätsgele zu vermeiden, was zusätzliche Aufarbeitungen (Filtrationen, Zentrifugationen) von Zellhomogenaten erfordert.Eckstein, F. and Sundaram, P.V. (Ed.), Theory and practice in affinity chromatography. Academic Press, New York, 1978. The disadvantages of these techniques reside in the partially unstable matrix, which may undergo changes by chemical agents or microbiological degradation, or in the too high hydrophobicity of chemically inert supports, which usually results in nonspecific binding. In general, particle-free solutions must be used as the source of the enzymes to be purified in order to avoid clogging or undesired contamination of the affinity gels, which requires additional work-up (filtration, centrifugation) of cell homogenates.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Affinitätssorbens aufzufinden, das frei ist von den Nachteilen bekannter Sorbentien. Es soll leicht zugänglich ssin, hinreichende Selektivität aufweisen und regenerierbar sein. Eine Vorbehandlung zu Beginn des Einsatzes soll sich cuf einfache Schritte beschränken, um die Adsorption von Proteinen und deren nachfolgende Desorption kostengünstig zu gestalten.The object of the invention is to find an affinity sorbent which is free of the disadvantages of known sorbents. It should be readily available ssin, have sufficient selectivity and be regenerable. Pretreatment at the beginning of the application should be limited to simple steps in order to make the adsorption of proteins and their subsequent desorption cost-effective.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein stabiles Affinitätssorbens vorzuschlagen, das zur affinitätschromatographischen Proteinbindung geeignet ist und in technisch einfacher Weise die Adsorption von Proteinen aus partikelhaltigen Lösungen zu deren Gewinnung bewirkt oder zur Reinigung entsprechender Lösungen von speziellen Proteinen geeignet ist.The object of the invention is to propose a stable affinity sorbent which is suitable for affinity chromatographic protein binding and in a technically simple manner effects the adsorption of proteins from particle-containing solutions for their recovery or is suitable for purifying corresponding solutions of specific proteins.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß Nylonmembranen mit der Bezeichnung IMMUNODYNE® der Firma PALL Filtralionstechnii' diese Anforderungen erfüllt. Die genannte Folie wird produziert zum Zwecke der irreversiblen Fixierung von Proteinen, z. B. von Antikörpern, was durch eine reaktive Gruppe bewirkt wird, die auf die Folienoberfläche aufgebracht ist. Nach dar Proteinfixierung wird die Folie für entsprechende Zwecke eingesetzt. Unerwartet läßt sich die Proteinbindung reversibel gestallen, wenn auf die Ligandierung verzichtet wird und die Folien durch Behandlung mit alkalischer Lösung zunächst inaktiviert werden und anschließend ohne weitere Veränderung in technisch sehr einfacher Weise als Äff initätssorbens eingesetzt werden. Es zeigte sich, daß aus einem Zellhomogenat die Bindung von Proteinen hinreichend selektiv ist und daß mit der Desorption durch Zusatz eines biospezifischen Liganden zum VWschpuffer eine noch höhere Selektivität in bezug auf die Art der abgelösten Proteine erreicht wird. Nach der Verwendung der Folien lassen diese sich durch Behandlung mit alkalischen Lösungen oder mit Detergentien regenerieren und beliebig oft wiederverwendenIt has surprisingly been found that nylon membranes designated IMMUNODYNE® from PALL Filtralionstechnii fulfill these requirements. The said film is produced for the purpose of irreversible fixation of proteins, eg. As antibodies, which is caused by a reactive group which is applied to the film surface. After protein fixation, the film is used for appropriate purposes. Unexpectedly, the protein binding can be reversible when the ligand is dispensed with and the films are first inactivated by treatment with alkaline solution and then used without further modification in a very simple manner as Äff sitätssorbens. It was found that the binding of proteins from a cell homogenate is sufficiently selective and that with the desorption by addition of a biospecific ligand to the VWschpuffer an even higher selectivity with respect to the nature of the detached proteins is achieved. After use of the films, they can be regenerated by treatment with alkaline solutions or with detergents and reused as often as desired

Die Erfindung soll an nachstehenden Durchführungsbeispielen erläutert werden: The invention will be explained with reference to the following implementation examples:

Ausführungsbeispieleembodiments

Vorbeugung der Immup.odyne-MembranPrevention of the Immup.odyne membrane

Die Membran wird auf eine Größe von 1Ox 15cm geschnitten und an die Innenseite einer Kunststoffflasche angelegt. In waagerechter Lage wird die Flasche an eine drehbare Achse angelegt. In dieser Anordnung läßt sich die Folie mit den angegebenen Lösungen behandeln. Das Volumen der eingesetzten Lösungen muß so groß sein, daß die Folie über ihre gesamte Breite etwa 1 cm (abhängig vom Durchmesser der verwendeten Flasche) benetzt wird.The membrane is cut to a size of 1Ox 15cm and applied to the inside of a plastic bottle. In a horizontal position, the bottle is applied to a rotatable axle. In this arrangement, the film can be treated with the specified solutions. The volume of the solutions used must be so large that the film over its entire width about 1 cm (depending on the diameter of the bottle used) is wetted.

Vor jedem Einsatz wird die Folie mit 0,01 N Natronlauge behandelt und danach mit Wasser gewaschen. War die Folie bereits benutzt, wird sie durch mehrfache Behandlung mit 0,01 N NaOH oder mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat regeneriert. Vor der unmittelbaren Verwendung wird sie mit dem angegebenen Puffersystem äquilibriert.Before each use, the film is treated with 0.01 N sodium hydroxide solution and then washed with water. If the film has already been used, it is regenerated by repeated treatment with 0.01 N NaOH or with 0.1% sodium dodecyl sulfate. Prior to immediate use, it is equilibrated with the specified buffer system.

Example I

3g Hefemasse werden in 3ml Phosphatpuffer (5OmM Na-Phosphat, 5mM Mercaptoethanol, pH7,2) suspendiert und mit 5g Glasperlen (Durchmesser 0,5 mm) vermischt. Der Ansatz wird in mehreren Zyklen intensiv geschüttelt, was zum Aufschluß der Hefezellen führt. Die Glasperlen setzen sich innerhalb von Sekunden am Boden ab. Der Überstand wird abgetrennt und als Zellhomogenat verwendet.3 g yeast mass are suspended in 3 ml phosphate buffer (50 mM Na phosphate, 5 mM mercaptoethanol, pH 7.2) and mixed with 5 g glass beads (diameter 0.5 mm). The batch is shaken intensively in several cycles, resulting in the digestion of the yeast cells. The glass beads settle to the ground within seconds. The supernatant is separated and used as a cell homogenate.

4 ml des Zellhomogenates werden auf die Folie gegeben und der Ansatz zwei Stunden bei Raumtemperatur oder unter Kühlraumbedingungen unter Drehen inkubiert. Das Zellhomogenat wird anschließend verworfen und die Folie mit dem Aufschlußpuffer gewaschen. Anschließend wird die Folie mit 3ml Aufschlußpuffer, der 1OmM ATP enthält, 20 min behandelt. Im Ablösepuffer befinden sich dann Proteine in vom Homogenat abweichenden qualitativen und quantitativen Verhältnis. So ergeben sich für das Enzym Phosphofruktokinase spezifische Aktivitäten von 15p/mg und für das enzym Phosphoglyceratkinase von 200p/mg. Vergleicht man die erhaltenen spezifischen Aktivitäten mit denen im Überstand des hochtourig zentrifugieren Homogenates ergeben sich Reinigungsfaktoren von 40 für Phosphofruktokinase bzw. von 100 für Phosphoglyceratkinase. Im Ablösepuffer ist ATP durch AMP und NADP substituierbar. Die Bindungskapazität der Membran beträgt etwa 10pg/cm² für beide Enzyme.4 ml of the cell homogenate are added to the film and the batch is incubated for two hours at room temperature or under cooling room conditions with rotation. The cell homogenate is then discarded and the film washed with the digestion buffer. The film is then treated with 3 ml digestion buffer containing 10 mM ATP for 20 min. The release buffer then contains proteins in a qualitatively and quantitatively deviating from the homogenate. Thus, for the enzyme phosphofructokinase specific activities of 15p / mg and for the enzyme phosphoglycerate kinase of 200p / mg. If one compares the specific activities obtained with those in the supernatant of the high-speed centrifuging homogenate, purification factors of 40 for phosphofructokinase and of 100 for phosphoglycerate kinase result. In the release buffer, ATP is substitutable by AMP and NADP. The binding capacity of the membrane is about 10 pg / cm ² for both enzymes.

Example Il

Hefezellen werden wie in Beispiel I behandelt und 4 ml des Zellhomogenates auf die Folie gegeben. Nach Inkubation über zwei Stunden wird die Folie von ungebundenem Material mit Aufschlußpuffer frei gewaschen und anschließend 30min mit 3ml Aufschlußpuffer, der 5 mM NAD⁺ enthält, behandelt. Die Lösung wird erneuert und die Folie für weitere 30 min gewaschen. Nach zweimaligem Waschen mit Aufschlußpuffer werden Phosphofruktokinase und Phosphoglyceratkinase durch 1OmMATP, 1OmM AMP oder 1OmM NADP selektiv wie in Beispiel I abgelöst. Die spezifischen Aktivitäten liegen dann für Phosphofruktokinase bei 25U/mg und für Phosphoglyceratkinase bei 320U/mg.Yeast cells are treated as in Example I and 4 ml of the cell homogenate are added to the foil. After incubation for two hours, the film is washed free of unbound material with digestion buffer and then treated for 30 min with 3 ml digestion buffer containing 5 mM NAD ⁺ . The solution is renewed and the film is washed for a further 30 min. After washing twice with digestion buffer, phosphofructokinase and phosphoglycerate kinase are selectively replaced by 1OmMATP, 10 mM AMP or 10 mM NADP as in Example I. The specific activities are then for phosphofructokinase at 25U / mg and for phosphoglycerate kinase at 320U / mg.

Example Hf

Glycerolphosphatdehydrogenase, die nach SCOPES und STOTER (Meth.Enzymol.90,479 [19821) aus Kaninchenmuskel gereinigt worden war, enthält als Fremdaktivität bis zu 15% Phosphofruktokinase.Glycerophosphate dehydrogenase purified from rabbit muscle according to SCOPES and STOTER (Meth. Enzymol. 90, 479 [19821] contains as extraneous activity up to 15% phosphofructokinase.

Zur Entfernung dieser Fremdaktivität werden 600U Glycerolphosphatdehydrogenase in einem Volumen von 4ml 20min wie in Beispiel I mit der Immunodyne-Folie behandelt. Die Folie war mit 0,02 M Trirnethylamin behandelt worden. Das Enzvmpräparat war gegen 5OmM Natriumphosphatpuffer dialysiert worden. Nach 20 min wird die Behandlung mit einer neuen Folie fortgesetzt.To remove this foreign activity, 600 U glycerophosphate dehydrogenase in a volume of 4 ml for 20 min as in Example I are treated with the immunodyne foil. The film had been treated with 0.02 M Trirnethylamine. The enzyme preparation had been dialyzed against 50 mM sodium phosphate buffer. After 20 minutes, the treatment is continued with a new film.

590 U der Glycerolphosphatdehydrogenase werden danach wiedergefunden. Die Aktivität von Phosphofruktokinase liegt dann590 U of glycerol phosphate dehydrogenase are then recovered. The activity of phosphofructokinase is then

Die an die Folie gebundene Kaninchenmuskel-Phosphofruktokinase läßt sich mit 10mM ATP spezifisch ablösen (siehe Beispiel I).The rabbit muscle phosphofructokinase bound to the film can be specifically detached with 10 mM ATP (see Example I).

Example IV

Die Folie wird mit 2OmM r atriumphosphatpu'.er, pH7,0, äquilibriert. 0,5ml frisches Human-Plasma, dialysiert gegen den Äqulibrierungspuffer, werden 30 min mit der Folie wie in Beispiel I behandelt. Das Plasma ist anschließend frei von ß-Lipoprotein. Die Kontrolle des an die Folie gebundenen Proteins nach dessen Ablösung mit 0,01 M Natronlauge zeigt die Anwesenheit von ß-Lipoprotein neben einem im Makroglobulinbereich lokalisierten Protein.The film is equilibrated with 20 mM of atrium phosphate powder, pH 7.0. 0.5 ml of fresh human plasma, dialyzed against the equilibration buffer, are treated with the film for 30 minutes as in Example I. The plasma is subsequently free of β-lipoprotein. The control of the protein bound to the foil after its detachment with 0.01 M sodium hydroxide solution shows the presence of β-lipoprotein next to a macroglobulin-localized protein.

Claims

1. Use of modified nylon films for the purification of proteins, characterized in that a film with the name IMMUNODYNE® from PALL Filtrationstechnik is used.

2. Use of modified nylon films for the purification of proteins according to claim 1, characterized in that the film is treated with inorganic or organic alkaline solutions, z.3. by wetting with dilute NaOH, Na ₂ COa, trimethylamine or the like.

3. Use of modified nylon films for the purification of proteins according to claim 1,

characterized in that the film can be reused after regeneration with alkaline solutions or detergents.

4. Use of modified nylon films for the purification of proteins according to claim 1 to 3, characterized in that enzymes are bound from biological fluids adsorptive and further desorbed and recovered pure.

5. Use of modified nylon films for the purification of proteins according to claim 1 to 4,

characterized in that ATP-dependent enzymes, in particular kinases, are selectively adsorbed.

6. Use of modified nylon films for the purification of proteins according to claim 1 to 3, characterized in that non-ATP-dependent proteins such as β-lipoproteins, subclasses of immunoglobulins such as IgM, IgE are selectively adsorbed.