CN113546177A - 一种胆固醇单胍偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胆固醇单胍偶联物的应用，所述胆固醇单胍偶联物通过包载药物制备成微粒给药系统。本发明公开的胆固醇单胍偶联物具有两亲性，其作为药物载体一方面能够包载脂溶性药物，一方面由于单胍基团的存在使得化合物带正电，也可以通过静电吸附的方式包载带负电的水溶性药物。胍基的存在还有利于药物的细胞膜内转运，因此单胍胆固醇偶联物可以作为优良的微粒型制剂的载体材料包载药物。单胍胆固醇偶联物与常用载体辅料的相容性较好，该类化合物溶血性低，可以作为静脉给药的剂型辅料；当以其作为药物载体时，有助于发挥更好的药效。本发明还公开了上述胆固醇单胍偶联物的制备方法，该方法重现性好，可制备得到高纯度的产物。

Description

一种胆固醇单胍偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，涉及一种胆固醇单胍偶联物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤等疾病一直严重威胁人类健康，该类疾病采用药物治疗的关键是提高药物的靶向性和滞留性，减少其在非靶部位的聚集，从而解决治疗效果差，毒副作用大等问题。通过合适的载体技术，将药物直接靶向病变组织、细胞或亚细胞器是解决该类问题的重要手段之一。
随着纳米技术的发展，将药物装载于载体中制备成纳米粒、脂质体等微粒制剂，发挥纳米尺寸等效应，从而透过各种生物屏障，这种策略已成为抗癌药物新型给药系统研究的热点。胆固醇单胍偶联物是一种两亲性化合物，一端为胆固醇基，另一端为含单胍基团，两者可通过酰胺键进行偶联。胆固醇为生理相容性成分，具有安全性高、与其它脂溶性辅料或药物相容的特点。含胍基的化合物在促进药物制剂被细胞摄取以及实现药物制剂细胞内溶酶体逃逸等方面具有优势。因此，许多胍基化合物被用于微粒型给药体系中，用于提高细胞摄取以及实现溶酶体逃逸，从而提高疗效。除此之外，含胍基化合物本身带正电，可用于吸附带负电的药物，如很多生物技术药物，有利于后期制备成各种微粒制剂。目前已报导的胆固醇单胍偶联物的合成方法具有可重复性差等缺点，且尚未看到关于胆固醇单胍偶联物应用于微粒型给药体系中的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种胆固醇单胍偶联物的应用，所述胆固醇单胍偶联物用于制备微粒给药系统。
本发明的目的之二在于提供一种胆固醇单胍偶联物。
本发明的目的之三在于提供上述胆固醇单胍偶联物的合成制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种胆固醇单胍偶联物的应用，所述胆固醇单胍偶联物用于制备微粒给药系统。
优选地，微粒给药系统为微粒、纳米粒、脂质体、乳剂、聚合物胶束、凝胶或上述类型的混合物。
进一步地，所述胆固醇单胍偶联物通过自组装包载药物制备成微粒给药系统的应用，或所述胆固醇单胍偶联物通过与其他载体辅料共用包载药物制备成微粒给药系统的应用。
进一步地，所述胆固醇单胍偶联物通过自组装包载药物制备成微粒给药系统为微粒、纳米粒、凝胶中的一种；所述胆固醇单胍偶联物通过与其他载体辅料共用包载药物制备成微粒给药系统为微粒、微球、纳米粒、脂质体、乳剂、聚合物胶束中的一种。
进一步地，所述胆固醇单胍偶联物通过自组装包载药物制备成微粒给药系统的过程如下：
当待包载药物为脂溶性药物时，其制备过程为：将胆固醇单胍偶联物与待包载药物溶于有机溶剂中混合得到有机混合液，将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂，得到胆固醇单胍偶联物包载脂溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
当待包载药物为水溶性药物时，其制备过程可分为两种，其一为：将胆固醇单胍偶联物与有机溶剂混合得到有机混合液，将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；将水溶性药物或其水溶液加入到上述悬浊液中孵育，即得胆固醇单胍偶联物包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
其二为：将胆固醇单胍偶联物与有机溶剂混合得到有机混合液，将水溶性药物或其水溶液、水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；即得胆固醇单胍偶联物包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
所述水系溶液为水或溶解水性辅料的水溶液。
进一步地，所述胆固醇单胍偶联物与包载药物的质量比为10000～0.1:1。
优选地，上述水系溶液为水或溶解有水溶性辅料的水溶液，所述水溶性辅料为稳定剂、表面活性剂、pH调节剂、渗透压调节剂或抗氧剂等。
优选地，所述表面活性剂或稳定剂为PVA、PEG、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、透明质酸或吐温80。常见的pH调节剂、渗透压调节剂或抗氧剂均可以用于该制剂。
偶联物的浓度影响制剂的最终形态，在低浓度时，制剂为流动性良好的纳米粒或微粒；在较高浓度时，制剂在先形成纳米粒或微粒后，后期在室温下会形成凝胶。一般偶联物的浓度在40mg/mL以下，制剂流动性良好。该自组装纳米粒或微粒或后期形成的凝胶，均具有载药功能。因此，脂溶性药物可与偶联物共溶于有机溶剂中，再进行后期的制备。水溶性药物如带负电的水溶性药物则可以溶解于适量水性溶液中，再与制备好的纳米粒共孵育而载药。
进一步地，所述胆固醇单胍偶联物与其他载体辅料共用包载药物制备成微粒给药系统的过程如下：
当待包载药物为脂溶性药物时，其制备过程为：将胆固醇单胍偶联物、其他载体辅料与待包载药物溶于有机溶剂中得到有机混合液，或者将胆固醇单胍偶联物、待包载药物分散于其他载体辅料中得到有机混合液；将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂，得到胆固醇单胍偶联物与载体辅料共用包载药物的微粒给药系统；
与其它载体合用时，可以根据载体的性质，灵活采用相应的制备方法，例如，当合用载体辅料为固体脂质时，可以将脂质加热熔融以后，再加入药物和胆固醇单胍偶联物混匀；当合用辅料为液体脂质，如制备乳剂时，可以将药物和胆固醇单胍偶联物溶解于液体脂质中。因此制备方法中的有机溶剂并非不可或缺。
当待包载药物为水溶性药物时，其制备过程可分为两种，其一为：将胆固醇单胍偶联物、其他载体辅料与有机溶剂混合得到有机混合液，或者将胆固醇单胍偶联物分散于其他载体辅料中得到有机混合液；将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；将水溶性药物或其水溶液加入到上述悬浊液中孵育，即得胆固醇单胍偶联物与载体辅料共用包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
其二为：将胆固醇单胍偶联物、其他载体辅料与有机溶剂混合得到有机混合液，或者将胆固醇单胍偶联物分散于其他载体辅料中得到有机混合液；将水溶性药物或其水溶液、水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；即得胆固醇单胍偶联物与载体辅料共用包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
所述水系溶液为水或溶解水性辅料的水溶液。
进一步地，所述胆固醇单胍偶联物与载体辅料的质量总和与药物的质量比为10000～0.1:1；所述胆固醇单胍偶联物与载体辅料的质量比为1:0.001～1000。
含有胆固醇单胍偶联物的制剂，可以吸附带负电的水溶性药物，因此对该类药物包封率和载药量高。同时该类制剂也可以利用其它剂型或载体的优势，包载不同性质的水溶性药物。例如，如果制备成脂质体，则可以利用pH梯度法，包载适宜的药物，通常为弱酸或弱碱型药物，如盐酸阿霉素。因此本发明保护水溶性药物不局限于带负电的水溶性药物。
进一步地，所述其他载体辅料为磷脂、胆固醇、脂肪酸单甘油脂、脂肪酸二甘油酯、脂肪酸三甘油酯、脂肪酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、甲氧基聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物、甲氧基聚乙二醇聚已内酯或甲氧基聚乙二醇聚丙交酯，以及上述载体材料与小分子功能基团合成的产物中的一种或几种的混合物。
优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO中的一种或几种。
很多药物都可以被该胆固醇单胍偶联物包载，如厚朴酚、和厚朴酚、紫杉醇、姜黄素、葫芦素、SN-38、多西他赛、喜树碱、5-氟尿嘧啶、阿霉素、靛玉红、IR-780碘化物、5-氨基乙酰丙酸、醋酸棉酚、花氰荧光素、替尼泊苷、甲氨喋呤、冬凌草甲素、水飞蓟宾等。本发明实施例以抗肿瘤药物为主，但是并不局限于此。因为本发明所指的胆固醇单胍偶联物，主要作为一种无毒的辅料，因此其使用范围并不受疾病的限制。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种胆固醇单胍偶联物，具有结构通式Ⅰ
Figure BDA0003164879470000041
式中X为CnH2n，n为大于2的整数，优选为2-22。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
胆固醇单胍偶联物的制备方法，包括以下步骤：
Figure BDA0003164879470000042
(1)在-20℃～10℃、不断搅拌的条件下，向双胺溶液中加入胆固醇甲酰氯溶液，惰性气体保护下搅拌反应8～24h，得到中间产物a；
(2)按照中间产物a与单氰胺、催化剂三氯化铁的摩尔比为1:1～9:0.1～1.0，将步骤(1)得到的中间产物a、单氰胺及催化剂三氯化铁分散在溶剂中，于75℃～120℃、惰性气体中搅拌反应15～24h，即得胆固醇单胍偶联物Ⅰ。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供了胆固醇单胍偶联物的应用，所述胆固醇单胍偶联物通过包载药物制备成微粒给药系统。本发明提供的胆固醇单胍偶联物具有两亲性，其作为药物载体一方面能够包载脂溶性药物，一方面由于单胍基团的存在使得化合物带正电，也可以通过静电吸附的方式包载带负电的水溶性药物。胍基的存在还有利于药物的细胞膜内转运，因此单胍胆固醇偶联物可以作为优良的微粒型制剂的载体材料包载药物。单胍胆固醇偶联物与常用载体辅料的相容性较好，该类化合物溶血性低，可以作为静脉给药的剂型辅料；当将其作为药物载体时，有助于发挥更好的药效。本发明还提供了上述胆固醇单胍偶联物的制备方法，该方法重现性好，可制备得到高纯度的产物。
附图说明
图1为本发明胆固醇单胍偶联物的合成路线图；
图2为本发明实验例1至10制剂的数码照片。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
胆固醇单胍偶联物的合成路线图如图1所示。
实施例1
胆固醇单胍偶联物及其制备方法：
(1)取8mL无水二氯甲烷加入8mL丁二胺并滴加0.3mL吡啶，配成溶液1；称取0.45g胆固醇甲酰氯加入4mL无水二氯甲烷溶解，配成溶液2；冰浴下将溶液2滴加到溶液1中，然后在氮气保护下室温搅拌20h，离心，取上清液，向其中加入50mL乙腈并旋蒸至干燥，用超纯水洗涤干燥物并干燥，得到中间产物，产率97％，中间产物的结构式如下：
Figure BDA0003164879470000051
H1-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.04(T,1H,-N31-H),5.34(T,1H,＝C11-H),4.30(m,1H,-O-C17-H)2.94(dd,2H,-N-C33-H2-),2.54(T,2H,N-C36H2-),0.65-2.4(m,49H,分子中余下的49个H).
(2)取步骤(1)得到的中间产物236.2mg、单氰胺178.41mg、无水FeCl3 61.36mg置于圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇溶解；然后在上述圆底烧瓶上装配冷凝管，置于85℃油浴锅中磁力搅拌，充氮气保护回流反应21h；离心去除底部的红色沉淀，即得到含有AG-Chol的上清液，产率约为10％，高纯度产物可通过硅胶柱层析得到(氯仿：甲醇＝10:1)，得到化合物1(AG-Chol)，其结构式如下：
Figure BDA0003164879470000061
H1-NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：δ7.05(s,1H,N8-H),5.91(s,1H,C2＝N13-H),5.35(s,3H,N1-H&C15＝C19-H),4.30(s,1H,C11-H),3.17(d,J＝5.1Hz,1H),2.93(s,3H),2.38～2.09(m,2H),2.06～1.67(m,5H),1.62～0.74(m,38H),0.65(s,3H).
实施例2
胆固醇单胍偶联物及其制备方法：
(1)取8mL无水二氯甲烷加入8mL乙二胺并滴加0.3mL吡啶，配成溶液1；称取0.45g胆固醇甲酰氯加入4mL无水二氯甲烷溶解，配成溶液2；冰浴下将溶液2滴加到溶液1中，然后在氮气保护下室温搅拌20h，离心，取上清液，向其中加入50mL乙腈并旋蒸至干燥，用超纯水洗涤干燥物并干燥，得到中间产物，产率98％，中间产物的结构式如下：
Figure BDA0003164879470000062
H1-NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.04(T,1H,-N31-H),5.34(T,1H,＝C11-H),4.30(m,1H,-O-C17-H)2.94(dd,2H,-N-C33-H2-),2.54(T,2H,N-C36H2-),0.65-2.4(m,49H,分子中余下的49个H).
(2)取步骤(1)得到的中间产物222.7mg、单氰胺178.41mg、无水FeCl3 61.36mg置于圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇溶解；然后在上述圆底烧瓶上装配冷凝管，置于85℃油浴锅中磁力搅拌，充氮气保护回流反应21h；离心去除底部的红色沉淀，即得到含有AE-Chol的上清液，产率约为10％，高纯度产物可通过硅胶柱层析得到(氯仿：甲醇＝10:1)，得到化合物2(AE-Chol)其结构式如下：
Figure BDA0003164879470000071
H1-NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：δ7.17(s,1H,N8-H),5.91(s,1H,C2＝N13-H),5.35(s,3H,N1-H&C15＝C19-H),4.30(s,1H,C11-H),3.27(s,2H),3.03(s,2H),2.38～2.09(m,2H),2.06～1.67(m,5H),1.56～0.82(m,34H),0.65(s,3H).
实验例1至10所制备得到的制剂外观数码照片如图2所示。
实验例1
单纯AG-Chol纳米粒的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 5mg，溶于1mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(二氯甲烷与无水乙醇的体积比V:V＝4:1)，然后加入5mL超纯水，细胞粉碎机超声分散后(功率360W，时间5min)，旋蒸除去有机溶剂，过0.22μm孔径的滤膜后得到AG-Chol纳米粒混悬液，测得的平均粒径为56.75nm，多分散系数(PDI)为0.133，zeta电位为+10.1mV，且所制备的AG-Chol纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例2
单纯AG-Chol凝胶的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 40mg，溶于1mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(二氯甲烷与无水乙醇的体积比V:V＝4:1)，然后加入1mL质量分数为2％的泊洛沙姆188水溶液，细胞粉碎机超声分散后(功率360W，时间5min)，旋蒸除去有机溶剂，得到AG-Chol凝胶，所制备的单纯AG-Chol凝胶4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好
实验例3
包载紫杉醇的AE-Chol纳米粒的制备与表征
精密称取实施例2得到的AE-Chol 5mg、紫杉醇1mg，溶于0.5mL二氯甲烷与甲醇的混合溶液中(V:V＝5:1)，然后加入2mL质量分数为2％的泊洛沙姆188水溶液，细胞粉碎机超声分散后(功率360W，时间5min)，磁力搅拌12h，过0.22μm孔径的微孔滤膜，得到包载紫杉醇的AE-Chol纳米粒。
上述包载紫杉醇的AE-Chol纳米粒测得平均粒径为78.71nm，PDI为0.150，zeta电位+0.223mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例4
包载阿霉素的AG-Chol纳米粒的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 5mg，阿霉素1mg，溶于0.5mL无水乙醇，然后加入2mL质量分数为2％的泊洛沙姆188水溶液，细胞粉碎机超声分散后(功率360W，时间5min)，磁力搅拌15h，过0.22μm的滤膜后得到包载阿霉素的纳米粒。
上述包载阿霉素的纳米粒测得的平均粒径为66.93nm，PDI为0.145，zeta电位+15mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例5
包载盐酸阿霉素的AG-Chol脂质体的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 5mg，蛋黄卵磷脂15mg，溶于2mL氯仿与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝6:1)，蒸去有机溶剂后，加入1mL硫酸铵水溶液，细胞粉碎机超声分散(功率360W，时间5min)，透析4h，加入2mg盐酸阿霉素(DOX)溶于500μL的超纯水中，得到包载盐酸阿霉素的脂质体混悬液。
上述包载盐酸阿霉素的AG-Chol脂质体混悬液平均粒径为105.7nm，PDI为0.110，zeta电位+8.04mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例6
包载紫杉醇的AG-Chol脂质体的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 5mg、蛋黄卵磷脂15mg、紫杉醇2mg，溶于2mL氯仿与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝6:1)，然后加入4mL水溶液，细胞粉碎机超声分散(功率360W，时间5min)，磁力搅拌14h，过0.22μm的滤膜，得到包载紫杉醇的脂质体混悬液。
上述包载紫杉醇的AG-Chol脂质体混悬液平均粒径为115.2nm，PDI为0.213，zeta电位-4.99mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例7
包载STAT-siRNA的AG-Chol纳米粒的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 50mg溶于2.0mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝4:1)，然后加入10mL质量分数为1.5％的PVA1788水溶液，细胞粉碎机超声分散(功率360W，时间5min)后，磁力搅拌12h，挥发掉有机溶剂，过0.45μm的滤膜后得到纳米粒混悬液，然后加入1μg的STAT-siRNA，涡旋混合10s，静置1h，即得到包载siRNA的AG-Chol纳米粒混悬液。
上述包载siRNA的AG-Chol纳米粒混悬液平均粒径为84.55nm，PDI为0.080，zeta电位+1.84mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例8
含有紫杉醇、AG-Chol及PLGA的纳米粒的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 3mg、紫杉醇2mg，PLGA9k 5mg，溶于1mL二氯甲烷：无水乙醇的有机相中(V:V＝4:1)，待溶解完全后，加入质量分数为2％泊洛沙姆188水溶液5mL，细胞粉碎机超声分散后，通风橱中开口磁力搅拌12h，过0.22μm的滤膜，得到含有紫杉醇的纳米粒混悬液。
上述含有紫杉醇的纳米粒混悬液平均粒径为122.4nm，PDI为0.219，zeta电位-0.838mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例9
含有紫杉醇、AG-Chol和mPEG-PLGA的纳米粒的制备与表征
称取实施例1得到的AG-Chol 3mg、紫杉醇2mg、mPEG3.5k-PLGA9k 5mg溶于1mL二氯甲烷、无水乙醇(V:V＝3:1)的混合有机相中，待溶解完全后，加入2wt％泊洛沙姆407水溶液5mL，细胞粉碎机超声分散后，磁力搅拌12h，过0.22μm的滤膜后得到含有紫杉醇、AG-Chol及mPEG-PLGA的纳米粒混悬液。
上述含有紫杉醇、AG-Chol及mPEG-PLGA的纳米粒混悬液平均粒径为134.5nm，PDI为0.180，zeta电位-0.636mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例10
含有紫杉醇、AG-Chol的固体脂质纳米粒的制备与表征
精密称取实施例1得到的AG-Chol 5mg、紫杉醇2mg，将单硬脂酸甘油酯0.075g、precirol ATO5 0.175g、poloxamer 188 0.125g加热熔融后，加入处方量的紫杉醇和AG-Chol，快速搅拌使药物分散，然后放到冰箱冷冻层固化4h。将恒温水浴锅中的水加热到60℃，将固化后的混合物转移到连有恒温水浴设备的保温套管中，在保温套管中加入处方量的超纯水，细胞粉碎机超声分散后，趁热过滤，得到包载紫杉醇的固体脂质纳米粒。
上述包载紫杉醇的固体脂质纳米粒测得的平均粒径为238.0nm，PDI为0.310，zeta电位-12.7mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。
实验例11
含有IR780、AEAA-PEG-PLGA、AG-Chol的脂质体的制备
取15mg蛋黄卵磷脂、5mg实施例1得到的AG-Chol和1mg AEAA-PEG3.5K-PLGA9K(AEAA为氨基乙基茴香酰胺基的缩写)、1mg IR780溶于2mL乙醇和氯仿的混合溶液中(V:V＝1:1)，用旋转蒸发仪在50℃水浴中减压蒸去有机溶剂，形成一层均匀的脂膜，加入1mL PBS溶液，40℃超声(5min，工作3s，间歇5s，功率360W)使之水化，形成均匀的乳黄色脂质体。
实验例12
单纯AG-Chol纳米粒的溶血性实验
用干净的烧杯盛取新鲜小鼠血浆，用玻璃棒搅拌将小鼠血浆中的纤维蛋白凝块去除。向去除纤维蛋白凝块的血将加2～3倍体积的0.9％生理盐水注射液充分混匀后，分装于10mL离心管内离心，转速为1500r/min，时间为5min。弃去上清液，重复上述操作，直到上清液无红色为止，得到离心管底部的红细胞(RBC)。将RBC加生理盐水注射液转移到100mL容量瓶，配成2％RBC，置于4℃冰箱待用。将实验例1得到的AG-Chol纳米粒加入至2％RBC中，配制一系列不同浓度的样品在37℃孵育4h。以不产生溶血现象的空白对照组作为阴性对照，以完全溶血的水为稀释液作为阳性对照。孵育结束后，3000r/min离心10min，观察上清是否保持澄清透明，判断是否有溶血现象发生。吸取各组上清移至96孔板，用酶标仪测定波长545nm处吸光度值计算溶血率。溶血率高于5％即为发生溶血。
实验结果显示当AG-Chol的给药浓度小于37.5mg/kg时，样品的溶血率小于5％，静脉注射安全，表明AG-Chol可以作为静脉给药的剂型辅料。
实验例13
包载盐酸阿霉素的AG-Chol脂质体对鼠肝癌H22细胞活性的影响
本发明采用CCK-8法测定H22细胞抑制率，将对数生长期的H22细胞收集、离心、稀释后，将细胞以细胞浓度为1×104个/孔铺在96孔板24h，加入含药培养基孵育24h后，避光加入10μL超高灵敏型CCK-8试剂，在微量振荡器上避光震荡10min后，继续培养4h后，用酶标仪测定在490nm处各孔的吸光度值(OD值)。实验盐酸阿霉素(DOX)浓度设计：0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/mL；分别设置空白对照组和调零组，每个浓度设置5个复孔。
结果显示，随浓度升高，实验例5所制备的包载盐酸阿霉素的AG-Chol脂质体对鼠肝癌H22细胞毒性增加，IC50值为0.137±0.003μg/mL。与普通脂质体的IC50(0.198±0.002μg/mL)相比，实验例5所制备的脂质体对H22细胞具有更强的毒性。
实验例14
体内药效学研究
从-80℃冰箱中取出冻存的H22肝癌细胞，快速放置于37℃水浴中解冻后，接种于雌性昆明种小鼠腹腔中。一周后用10mL注射器抽取荷瘤小鼠腹水，取40只小鼠以100万/100μL/只的细胞浓度接种于昆明鼠的腋下，接种后5-7天，当种瘤体积达到100mm3左右时，把28只小鼠分为4组，每组7只，每3天给药一次(DOX浓度为5mg/kg)，给药途径为静脉注射。实验分组为空白对照组、DOX溶液组、DOX脂质体组、实验例5组，治疗8天后，处死全部小鼠，观察其外观、解剖检测瘤重，瘤重抑瘤率的计算公式如下：
Figure BDA0003164879470000111
结果表明，上述各组的体重均无显著差异，小鼠状态较好，说明制剂的毒性较低。与空白对照组相比，DOX溶液组、DOX脂质体组、实验例5组的瘤重抑瘤率分别为64.28％、81.70％和94.61％，结果表明以本发明制备得到的AG-Chol脂质体包载盐酸阿霉素有助于其发挥更高的抑瘤作用。
综上，本发明提供了胆固醇单胍偶联物的应用，所述胆固醇单胍偶联物通过包载药物制备成微粒给药系统。本发明提供的胆固醇单胍偶联物具有两亲性，其作为药物载体一方面能够包载脂溶性药物，一方面由于单胍基团的存在使得化合物带正电，也可以通过静电吸附的方式包载带负电的水溶性药物。胍基的存在还有利于药物的细胞膜内转运，因此单胍胆固醇偶联物可以作为优良的微粒型制剂的载体材料包载药物。单胍胆固醇偶联物与常用载体辅料的相容性较好，该化合物溶血性低，可以作为静脉给药的剂型辅料；当以其作为药物载体时，有助于发挥更好的药效。本发明还提供了上述胆固醇单胍偶联物的制备方法，该方法重现性好，可制备得到高纯度的产物。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述胆固醇单胍偶联物用于制备微粒给药系统。
2.如权利要求1所述的胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述胆固醇单胍偶联物通过自组装包载药物制备成微粒给药系统，或所述胆固醇单胍偶联物通过与其他载体辅料共用包载药物制备成微粒给药系统。
3.如权利要求2所述的胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述胆固醇单胍偶联物通过自组装包载药物制备成微粒给药系统为微粒、纳米粒、凝胶中的一种；
所述胆固醇单胍偶联物通过与其他载体辅料共用包载药物制备成微粒给药系统为微粒、微球、纳米粒、脂质体、乳剂、聚合物胶束中的一种。
4.如权利要求3所述的胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述胆固醇单胍偶联物通过自组装包载药物制备成微粒给药系统的过程如下：
当待包载药物为脂溶性药物时，其制备过程为：将胆固醇单胍偶联物与待包载药物溶于有机溶剂中混合得到有机混合液，将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂，得到胆固醇单胍偶联物包载脂溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
当待包载药物为水溶性药物时，其制备过程可分为两种，其一为：将胆固醇单胍偶联物与有机溶剂混合得到有机混合液，将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；将水溶性药物或其水溶液加入到上述悬浊液中孵育，即得胆固醇单胍偶联物包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
其二为：将胆固醇单胍偶联物与有机溶剂混合得到有机混合液，将水溶性药物或其水溶液、水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；即得胆固醇单胍偶联物包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
所述水系溶液为水或溶解水性辅料的水溶液。
5.如权利要求4所述的胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述胆固醇单胍偶联物与包载药物的质量比为10000～0.1:1。
6.如权利要求2所述的胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述胆固醇单胍偶联物与其他载体辅料共用包载药物制备成微粒给药系统的过程如下：
当待包载药物为脂溶性药物时，其制备过程为：将胆固醇单胍偶联物、其他载体辅料与待包载药物溶于有机溶剂中得到有机混合液，或者将胆固醇单胍偶联物、待包载药物分散于其他载体辅料中得到有机混合液；将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂，得到胆固醇单胍偶联物与载体辅料共用包载药物的微粒给药系统；
当待包载药物为水溶性药物时，其制备过程可分为两种，其一为：将胆固醇单胍偶联物、其他载体辅料与有机溶剂混合得到有机混合液，或者将胆固醇单胍偶联物分散于其他载体辅料中得到有机混合液；将水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；将水溶性药物或其水溶液加入到上述悬浊液中孵育，即得胆固醇单胍偶联物与载体辅料共用包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
其二为：将胆固醇单胍偶联物、其他载体辅料与有机溶剂混合得到有机混合液，或者将胆固醇单胍偶联物分散于其他载体辅料中得到有机混合液；将水溶性药物或其水溶液、水系溶液与有机混合液混合得到悬浊液；然后将悬浊液分散，除去有机溶剂；即得胆固醇单胍偶联物与载体辅料共用包载水溶性药物的微粒给药系统的水系溶液；
所述水系溶液为水或溶解水性辅料的水溶液。
7.如权利要求6所述的胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述胆固醇单胍偶联物与载体辅料的质量总和与药物的质量比为10000～0.1:1；
所述胆固醇单胍偶联物与载体辅料的质量比为1:0.001～1000。
8.如权利要求2所述的胆固醇单胍偶联物的应用，其特征在于，所述载体辅料选自为磷脂、胆固醇、脂肪酸单甘油脂、脂肪酸二甘油酯、脂肪酸三甘油酯、脂肪酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、甲氧基聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物、甲氧基聚乙二醇聚义内酯或甲氧基聚乙二醇聚丙交酯，以及上述载体材料与小分子功能基团合成的产物中的一种或几种的混合物。
9.如权利要求1至8任一项所述的胆固醇单胍偶联物，其特征在于，具有结构通式Ⅰ
Figure FDA0003164879460000021
式中X为CnH2n，n为大于2的整数。
10.如权利要求9所述的胆固醇单胍偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Figure FDA0003164879460000031
(1)在-20℃～10℃、不断搅拌的条件下，向双胺溶液中加入胆固醇甲酰氯溶液，惰性气体保护下搅拌反应8～24h，得到中间产物a；
(2)按照中间产物a与单氰胺、催化剂三氯化铁的摩尔比为1:1～9:0.1～1.0，将步骤(1)得到的中间产物a、单氰胺及催化剂三氯化铁分散在溶剂中，于75℃～120℃、惰性气体中搅拌反应15～24h，即得胆固醇单胍偶联物Ⅰ。
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