CN115896103A - 鹿茸由RBPMS介导的microRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
鹿茸由RBPMS介导的microRNA及其应用，它涉及一种小RNA(microRNA)，本发明提供了来源于东北马鹿(Cervus elaphus)鹿茸茸皮并对细胞迁移和增殖起促进作用的因子，其命名为：microRNA PC‑3p‑40996，其序列为UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU，具有高效下调RBPMS蛋白表达的作用，可促进细胞迁移和增殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种小RNA(microRNA)，调控细胞的迁移和增值。
背景技术
在哺乳动物中，只有鹿茸角是目前所知唯一的具有表形态再生能力的器官，即在失去后还能完全再生出来。在再生周期里，鹿茸从顶部生长点平均每天延伸1-2cm，又会在近百天的快速生长后最终自动停止，茸性皮肤会慢慢死亡脱落。鹿茸角再生机理很复杂，目前仍然是再生生物学领域的重要研究模型。
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度为18-24个核苷酸、重要的基因表达的负调控因子，通过调节目标基因mRNA稳定性或翻译效率来表现其功能。其来源于长的具有发卡样二级结构的转录子，并被两种核酸内切酶Drosha和Dicer剪切，形成双链的miRNA。其中一条链形成成熟的miRNA，另一条链降解。成熟miRNA通过与靶标基因mRNA的3’非翻译区(Untranslated Regions，UTR)目标位点结合而对其进行调控。一个miRNA的选择性活性依赖于与这个同源mRNA互补的miRNA的种子序列(seed region)(图1所示)。因为miRNA 种子内的不完美碱基配对代表这个核心5-7核苷酸序列可以潜在地结合很多mRNA序列，一个miRNA可同时调控多个目标基因的mRNA。研究表明miRNA在很多细胞的增殖、分化、器官形态发生和肿瘤发生等生物学过程中起非常关键的调节作用。miRNA通过抑制目标基因起到癌基因或肿瘤抑制的作用，目前，越来越多的miRNA被证明在癌症发生和发展过程中发挥非常重要的作用，所以miRNA可以作为治疗癌症的潜在新靶标。
具有多重剪接的RNA结合蛋白(RNA Binding Protein With Multiple Splicing，RBPMS，又名Hermes)基因是一个编码蛋白的基因，位于人类染色体8p11-12。该基因编码的蛋白质是具有单个RNA识别基序(RRM)的保守RNA结合蛋白，长度80-100个氨基酸，由两个较短的保守序列以及一些高度保守的疏水残基组成。目前，关于RBPMS的功能研究较少，但RRM家族的蛋白质大多在mRNA预处理(剪接，加帽和多聚腺苷酸化)，RNA稳定性，转运，定位和mRNA翻译调控方面具有重要作用。同时，也有少量研究表明，RBPMS可通过抑制某些癌基因(例如MYC和抗凋亡蛋白Bcl-2)或激活细胞周期抑制剂(包括p15INK4b，p21CIP1/WAF1 和p57KIP2)来阻滞细胞周期进程，从而导致细胞周期停滞或细胞凋亡。
发明内容
本发明确定了东北马鹿(Cervus elaphus)鹿茸茸皮来源的，通过靶向调控RBPMS促进细胞增殖，迁移的正调控因子，并确定这种因子的名称、序列。本发明从马鹿鹿茸茸皮组织的microRNA数据库中筛选得到的microRNA PC-3p-40996(以下简称PC-40996)，是一种在鹿茸茸皮中特异性表达的miRNA，长度22nt。序列如SEQ ID NO：1所示(UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU)。
本发明经过293T细胞的Western Blotting、双荧光素酶报告实验和MCF-7细胞的Wound healing assays、CCK8细胞增殖检测等实验证明了PC-40996能够直接靶向调控RBPMS的表达 (图2、3所示)，并促进细胞迁移和增殖(图4、5所示)。
本发明包含以下有益效果：
作为基因表达的负调控因子，microRNA在细胞生长、器官发育、个体生长及各种疾病的进程中都起到非常重要的作用。从快速生长的鹿茸顶端茸皮组织中分离出来的microRNA对鹿茸的再生生长会起非常重要的调控作用。
因此，本发明从快速生长期的新生马鹿鹿茸顶端茸皮组织microRNA测序结果中得到一个 miRNA PC-40996，其转录前体长约95nt，可形成发卡结构，成熟miRNA全长22nt，在miRBase 数据库(Release 22.1)中无同源序列。BLAST结果显示，无论是成熟miRNA全长还是其seed 序列，在人、黑猩猩、猕猴、小鼠、大鼠、豚鼠、鼩鼱、狗、猫、马、牛等模式物种基因组中均无同源序列。
通过TargetScan预测鹿茸茸皮发育的关键性因子RBPMS是PC-40996的靶基因之一，通过 293T和MCF-7细胞中进行的Western Blotting、双荧光素酶报告实验、Woundhealing assays(细胞划痕实验)和CCK8细胞增殖检测等实验，确定了PC-40996对RBPMS具有直接靶向作用(实验结果如图2、3所示)，并能促进MCF-7细胞的迁移和增殖(实验结果如图4、5所示)。
本发明筛选的基因序列如下：
名称：microRNA PC-3p-40996
序列：UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU。
附图说明
图1为多种模式生物RBPMS mRNA 3’UTR区具有与潜在PC-40996seed序列(小写序列) 互补结合的保守位点(大写加下划线序列)。
图2为将野生型重组表达载体PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR-WT和突变型重组表达载体PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR-MUT与miRNA PC-40996mimics或NC共转染入293T细胞中所得到的双荧光素酶实验结果。Firefly Luciferase作为内参。如图所示，与NC+RBPMS-WT 组相比，40996+RBPMS-WT组(WT-RBPMS)的相对Renilla荧光素酶活性显著性下降；与 40996+RBPMS-WT组相比，40996+RBPMS-MUT组(MUT-RBPMS)的相对Renilla荧光素酶活性显著性上升。这正反回复的变化趋势充分说明了miRNA PC-40996与RBPMS之间存在直接靶向调控关系。
图3为miRNA PC-40996mimics下调MCF-7细胞内源RBPMS蛋白水平。将miRNA PC-40996mimics与NC分别转染MCF-7细胞，36小时后收蛋白并进行western检测，内参为GAPDH。如图所示，与NC组相比，实验组的RBPMS表达量显著性降低。MCF-7细胞内源实验进一步验证了293T细胞外源Western blot和双荧光素酶的实验结果。
图4为Wound healing assays检测转染miRNA PC-40996mimics对MCF-7细胞迁移能力的影响，NC为阴性对照组。如图所示，与NC组相比，实验组中细胞迁移能力得到显著提升。实验独立重复三次，p<0.05具有显著性差异(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。
图5为CCK8细胞增殖实验检测miRNA PC-40996mimics对MCF-7细胞增殖能力的影响， NC为阴性对照组。如图所示，与NC组相比，实验组中细胞增殖能力得到显著提升。实验独立重复三次，p<0.05具有显著性差异(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的鹿茸由RBPMS介导的microRNA，它命名为：microRNA PC-3p-40996，其序列为UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU(如Seq ID No：1所示)。
具体实施方式二：本实施方式的鹿茸由RBPMS介导的microRNA的应用，抑制具有多重剪接的RNA结合蛋白(RBPMS)的表达。
具体实施方式三：本实施方式的鹿茸由RBPMS介导的microRNA的应用，它具有通过抑制RBPMS的表达促进细胞迁移和增值的生物学功能。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、鹿茸软骨miRNA PC-40996的获取过程
1)材料获取：实验所用材料为处于快速增长期约70天的东北马鹿鹿茸茸皮组织。锯茸后立即用消毒的剪刀将鹿茸顶端组织切成厚度小于0.5cm的薄片，立即放入装有防止RNA降解的保护液(RNA later)中，置于低温保存箱中并带回实验室保存。
2)mRNA的提取：将实验室保存鹿茸的茸皮组织分离后称取30mg，在超净工作台中快速切碎置于无菌1.5mL试管中，利用QIAGEN公司(德国)试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat.No.69504)提取鹿茸茸皮中的总RNA，并将提取的总RNA最终溶解于RNAse-free的水中，提取的总RNA经过分光光度检测均具有较高的质量(OD260 nm/OD280nm： 1.74-1.83)。
3)鹿茸茸皮small RNA高通量测序：将提取的总RNA递交到美国联川公司(杭州)通过Illumina miRNA Solexa测序平台进行鹿茸茸皮组织small RNAs文库高通量测序后，用ACGT101-miR v4.2(LC Sciences)软件进行数据处理。
4)鹿茸茸皮的新microRNA(miRNA)，miRNA PC-40996的获取：对鹿茸茸皮组织的small RNA文库Solexa深度测序后获得的序列原始数据进行综合分析，得到一种新microRNA，miRNA PC-40996，序列可以比对到马鹿(Cervus elaphus)基因组的6号和7号染色体上。
5)靶基因预测：通过TargetScan预测miRNA PC-40996的靶基因之一为具有多重剪接的 RNA结合蛋白(RBPMS)基因。
实施例2、miRNA PC-40996在细胞水平上能够下调具有多重剪接的RNA结合蛋白RBPMS的表达
1)miRNAPC-40996合成：将miRNA PC-40996序列递交到苏州泓迅生物公司(中国)合成mimics和相应的Negative Control(NC)。
2)构建PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR野生型(WT)和突变型(MUT)载体：序列比对分析得知多种模式生物RBPMS mRNA 3’UTR区具有潜在的与miRNAPC-40996seed序列(小写序列)互补结合保守位点(大写加下划线序列)(图1所示)。本实施例根据人、黑猩猩、猕猴、小鼠、大鼠、豚鼠、鼩鼱、狗、猫、马、牛等物种中保守的RBPMS的3’UTR区序列合成了71bp的片段(Invtrogene公司，上海)，其中包括miRNA PC-40996种子序列的互补序列，将合成片段插入到PSI-CHECK2载体Renilla luciferase报告基因的3’UTR区，构建野生型载体PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR-WT。插入片段(如Seq ID NO：2所示)序列如下： TCGAGTGGGTATTAATGCAATCTTCAGTGGTGGCTACTGTTCTCTAGCTGTTCTACAAAA CTGGAGCATGC，其中下划线部分为与MIRNA PC-40996seed序列互补结合的保守位点。在此基础上，将GCTGTTC序列突变为CACTGCG，构建PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR的突变型(MUT)载体，插入片段(如Seq ID NO：3所示)序列如下：TCGAGTGGGTATTAATGCAATCTTCAGTGGTGGCTACTGTTCTCTACACTGCGTACAAAA CTGGAGCATGC。
PSI-CHECK2双荧光素酶报告载体是Promega公司(美国)设计的用于RNAInterference 实验的特异性载体，具有Firefly luciferase和Renilla luciferase两个荧光素酶报告基因。其中， Firefly luciferase作为内参基因，Renilla luciferase报告基因用来衡量miRNA的功能。当miRNA PC-40996mimics和PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR-WT载体共转染293T细胞时，如果Renilla luciferase的蛋白表达量相对下调，说明miRNA PC-40996对RBPMS的表达有靶向调控作用。
3)细胞培养：293T细胞和MCF-7细胞均购自吉满生物科技(上海)有限公司(中国)，培养基为DMEM(10569010，Gibco，美国)，均添加10％的胎牛血清(110099141，Gibco，美国)。置于37℃，5％二氧化碳条件下培养。
4)转染：细胞以6×105个/孔接种于6孔培养板上，培养24小时，细胞汇合度达60％～70％，以Lipo8000TM(C0533，碧云天，中国)为介导，用合成的miRNA PC-40996mimics、NC、PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR-WT或PSI-CHECK2-RBPMS 3’UTR-MUT载体转染293T或 MCF-7细胞，转染的重组质粒量为1.5ug/孔。
5)双荧光素酶报告载体实验检测：Dual Luciferase Reporter Assays Kit(DL101-01 Vazyme，中国)用于本检测中。在细胞培养36h后，吸弃培养液，PBS洗涤两次，加入适量的Cell Lysis Buffer，室温静置或振摇裂解5min，吹打并吸取细胞裂解产物至1.5ml离心管中，12000g常温离心2min，取上清液用于后续检测。将100ul平衡至室温的Luciferase Substrate加入检测管或酶标仪中，小心吸取20ul细胞裂解上清至检测管或酶标仪中，迅速均匀后立即放于酶标仪中检测Firefly Luciferase报告基因活性。在以上反应液中加入100ul新鲜配制的Renilla底物工作液，迅速均匀后立即放于酶标仪中检测Renilla Luciferase报告基因活性。检测结果表明miRNA PC-40996直接靶向RBPMS并有效下调其表达(图2所示)。
6)Western检测：细胞培养36小时后收细胞，对蛋白进行变性处理，然后利用4％～12％的PAGE预制胶(NP0335BOX，Invitrogen，美国)电泳。转硝酸纤维膜后，用5％脱脂奶粉的TBST混合液封闭1小时，然后硝酸纤维膜分别在Firefly Luciferase一抗(Sc74548，Santa Cruz Biotechnology，美国)、Renilla luciferase(ab185926，abcam，美国)或RBPMS一抗 (15187-1-AP，Proteintech，中国)中孵育1小时，荧光标记的二抗(Lico Bioscience，美国) 中孵育1小时，以β-actin(Sc47778，Santa Cruz Biotechnology，美国)或GAPDH(Sc47724，Santa Cruz Biotechnology，美国)为内参，Odyssey红外激光成像系统扫膜。检测结果表明 miRNA PC-40996有效下调RBPMS的表达(图3所示)。
实施例3、miRNA PC-40996在细胞水平上通过抑制多重剪接的RNA结合蛋白(RBPMS) 促进MCF-7细胞迁移和增殖的功能
1)细胞培养与转染：MCF-7细胞购自吉满生物科技(上海)有限公司，培养基为DMEM(Gibco，美国)，培养方法同实施例2中3)。细胞转染同实施例2中的4)。
2)Wound healing assays检测：将MCF-7细胞接种到6孔板中，每孔5×105个细胞。等细胞汇合度达到95％左右，用200μl移液器吸头在细胞单层上制作划痕，并在0h、48h的时候拍摄照片以估算迁移细胞所占的面积。细胞划痕实验结果表明，相比于对照组(NC)，实验组的细胞迁移能力得到了显著的提升(图4所示)。
3)CCK8细胞增殖检测：Cell Counting Kit-8(B34304，bimake，美国)试剂被用于本次实验，将100ul的MCF-7细胞培养液以每孔3×103个细胞的密度接种在96孔板中，培养4-24h 后，在指定的时间点(0h，24h，48h，72h，96h)，用10ul CCK-8溶液处理细胞，并在黑暗中孵育2小时左右，使细胞液颜色变为橙色。最后用酶标仪在450nm的波长处读取光吸收值。CCK8细胞增殖实验结果表明，相比于对照组(NC)，实验组的细胞增殖能力得到了显著的提升(图5所示)。
序列表
<110> 东北林业大学
<120> 鹿茸由RBPMS介导的microRNA及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 东北马鹿(Cervus elaphus)
<400> 1
ugaacagcag uugaacaugg gu 22
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 2
tcgagtgggt attaatgcaa tcttcagtgg tggctactgt tctctagctg ttctacaaaa 60
ctggagcatg c 71
<210> 3
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(“人工序列”)
<400> 3
tcgagtgggt attaatgcaa tcttcagtgg tggctactgt tctctacact gcgtacaaaa 60
ctggagcatg c 71
Claims (3)
1.鹿茸由RBPMS介导的microRNA，其特征在于它命名为：microRNA PC-3p-40996，其序列为UGAACAGCAGUUGAACAUGGGU。
2.鹿茸由RBPMS介导的microRNA应用，其特征在于它促进细胞迁移和增殖。
3.根据权利要求1所述的鹿茸由RBPMS介导的microRNA及其应用，其特征在于通过抑制具有多重剪接的RNA结合蛋白(RBPMS)的表达介导促进细胞迁移和增殖生物学功能的完成。
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