CN111234030A - 一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用 - Google Patents

一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种线粒体靶向光敏剂Sarm1‑mtKR及其制备方法和应用，其特征在于：所述线粒体靶向光敏剂Sarm1‑mtKR的融合蛋白序列大小为810bp，序列如SEQ ID NO 1所示；所述制备方法为将Sarm1线粒体定位信号序列构建到KillerRed(KR)序列的上游，形成融合蛋白表达载体Sarm1‑mtKR。本发明的有益之处在于：本发明提供的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1‑mtKR具有在线粒体内定位，并表达蛋白的功能，而且在光照后导致活性氧ROS的爆发式生成，增强辐射诱导的线粒体失能以及凋亡和自噬，从而发挥光敏剂的作用，增强了肿瘤的光动力治疗和放疗的联合应用效果。

Description

一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于光动力疗法技术领域，涉及到一种光敏剂，具体涉及一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是一种联合利用光、光敏剂和氧分子，通过光动力反应选择性地治疗肿瘤、老年黄斑变性、鲜红斑痣等血管性疾病，以及组织体局部增生和感染的靶向疗法，甚至应用于医学美容。激发光、光敏剂和组织氧含量是PDT的三大要素，缺一不可，光敏剂的靶向性及氧的产量等性能决定着PDT的疗效。随着第一个光敏剂Poifrme Sodium于1993至1997年在美国、加拿大、欧盟、日本及韩国陆续被批准上市，PDT领域的研究、开发和应用迅速活跃起来。
迄今全世界合成或提取的光敏剂约15000种，但是批准临床应用的仅有十几个，这主要是因为这些光敏剂都存在一定的的局限性，不能很好的满足临床使用的要求，其中表现最突出的问题就是生物相容性不好。
为了解决生物相容性的问题，现在急需开发一种具有主动靶向功能的光敏剂，尤其是细胞器靶向的光敏剂。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明开发了一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用。
本发明提供了一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其融合蛋白序列大小为810bp，序列如SEQ ID NO 1所示。
优选的，所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR具有线粒体基质靶向作用。
优选的，所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR经可见光诱导后，具有爆发式生成大量活性氧ROS，抑制细胞增殖的特性。
优选的，所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR经可见光诱导后，具有增强辐射诱导的线粒体失能以及凋亡特性。
优选的，所述增强辐射诱导的线粒体失能以及凋亡特性包括：ATPase活性、ATP生成、线粒体呼吸链复合物I和III活性以及线粒体膜电位降低，膜通透性增加，可增强辐射诱导的表型变化。
优选的，所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR通过诱导活性氧作用线粒体，导致细胞自噬和凋亡的方式发挥作用。
本发明还提供了一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法，包括以下步骤：
(1)线粒体靶向蛋白选择性雄激素受体调节剂Sarm1基因引物设计：根据Sarm1基因的线粒体定位序列设计上游引物和下游引物，上游引物(NotⅠ)5ˊ-A
AGGAAAAAAGCGGCCGCAATGGTCCTGACGCTG-3ˊ，下游引物(EcoRⅠ)5ˊ-CGGAATTCCCGATCGGCGCCCGGCCGTG-3ˊ；
(2)KillerRed和mcherry引物设计：根据mcherry的基因序列设计上游引物和下游引物，mcherry上游引物(EcoRⅠ)5ˊ-GGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGG，mcherry下游引物(BamHⅠ)5ˊ-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3ˊ；根据KillerRed的基因序列设计上游引物和下游引物，KR上游引物(EcoRⅠ)5ˊ-GGAATTCATGGGTTCAGAGGGC-3ˊ，KR下游引物(BamHⅠ)5ˊ-CGGGATCCCTAGATCTCGTCG-3ˊ；
(3)目的片段扩增：分别以pGW1-Myc-SARM1质粒、plxsp-TetA-mcherry质粒和plxsp-TetA-killerRed质粒为模板，以步骤(1)和(2)中设计上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得目的片段Sarm1(SEQ ID NO 8)、mcherry(SEQ ID NO 9)和KR(SEQ ID NO 10)；
(4)plxsp-flag-mcherry载体构建及鉴定：将plxsp-flag空载体利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切得到载体1，将步骤(3)获得的所述目的片段mcherry插入连接到载体1上，获得plxsp-flag-mcherry载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-mcherry载体进行鉴定，确认序列正确后进行后续步骤；
(5)plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体构建：将所述plxsp-flag-mcherry载体利用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切得到载体2，将步骤(3)获得的所述目的片段Sarm1插入连接到载体2上，获得plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体进行鉴定，确认序列正确后进行后续步骤；
(6)plxsp-flag-Sarm1-KR载体构建：将所述plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切得到载体3，将步骤(3)获得的所述目的片段KR插入连接到载体3上，获得plxsp-flag-Sarm1-KR载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-Sarm1-KR载体进行鉴定，确认序列正确后将其命名为一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR。
作为一种优选的方案，一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法中步骤(3)中所述PCR扩增的体系为：
Figure BDA0002373201830000031
步骤(3)中所述PCR扩增的条件为：98℃ 30秒，(98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃30秒)×30循环，72℃ 2分钟，4℃；
步骤(4)中所述利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure BDA0002373201830000041
步骤(4)中所述利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h；
步骤(5)中所述利用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure BDA0002373201830000042
步骤(5)中所述利用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h；
步骤(6)中所述利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure BDA0002373201830000043
步骤(6)中所述利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h。
本发明还提供了一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的应用，即所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR应用于光动力疗法领域，通过光动力反应选择性地治疗肿瘤、老年黄斑变性、血管性疾病以及组织体局部增生和感染。
本发明还提供了一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的应用，即所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR应用于医学美容领域。
本发明的有益之处在于，本发明提供的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用具有以下
①本发明提供的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法，将Sarm1线粒体定位信号序列构建到KillerRed序列的上游，形成融合蛋白表达载体Sarm1-mtKR。
②本发明提供的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的设计思路非常巧妙，很好的利用了线粒体以及KillerRed蛋白的特性：
首先，线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为“能量工厂”；而且线粒体也是活性氧(ROS)生成和作用的靶点；ROS作用线粒体后可以诱导细胞凋亡、自噬和线粒体DNA损伤；
其次，KillerRed蛋白中存在一个长的水通道，在540～580nm的光照时可以产生致细胞损伤的ROS，一般为超氧阴离子(O2·―)和过氧化氢(H2O2)，同时蛋白失去活性。
③本发明提供的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR具有在线粒体内定位，并表达蛋白的功能，而且在光照后导致活性氧(ROS)的爆发式生成，增强辐射诱导的线粒体失能以及凋亡，从而发挥光敏剂的作用，增强了肿瘤的光动力治疗和放疗的联合应用效果。
附图说明
图1为实施例1一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法中步骤(3)获得目的片段mcherry和KR的电泳图；
图2为实施例1一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法中步骤(3)获得目的片段Sarm1的电泳图；
图3为实施例1一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法中步骤(4)的plxsp-flag-mcherry载体测序图；
图4为实施例1一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法中步骤(5)的plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体测序图；
图5为实施例1一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法中步骤(6)的plxsp-flag-Sarm1-KillerRed载体测序图；
图6为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR在靶向性验证实验中线粒体定位鉴定的结果；
图7为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR在HeLa细胞中生成活性氧能力验证实验中光敏剂转入HeLa细胞后测定活性氧ROS产生的检测模式图；
图8为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR在线粒体膜电位变化实验中线粒体膜电位改变流式细胞术检测图；
图9为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的在细胞凋亡改变实验中细胞凋亡改变流式细胞术检测图；
图10为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的在细胞凋亡下相关蛋白表达变化实验中Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达图；
图11为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的在细胞自噬的变化实验中细胞自噬变化流式细胞术检测图；
图12为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的在细胞自噬相关分子的表达实验中Western blot检测细胞自噬相关蛋白的表达图；
图13为实施例2一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR作用细胞后增强辐射杀伤HeLa细胞的凋亡和自噬模式图。
图中附图标记的含义：目的片段mcherry
图1中，Lane 1为100bp DNA marker，Lane 2和Lane 3为目的片段mcherry，Lane 4和Lane 5为目的片段KR；
图2中，Lane 1为100bp DNA marker，Lane 7和Lane 8为目的片段Sarm1；
图6中，S-mtmcherry代表plxsp-flag-Sarm1-mcherry；黑色箭头标记为mcherry蛋白表达，白色箭头所示为线粒体示踪蛋白COXⅣ表达，结果显示二者定位相同，暗示靶向线粒体。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法，包括以下步骤：
(1)线粒体靶向蛋白选择性雄激素受体调节剂Sarm1基因引物设计：根据Sarm1基因的线粒体定位序列设计上游引物和下游引物，上游引物(NotⅠ)5ˊ-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAATGGTCCTGACGCTG-3ˊ，下游引物(EcoRⅠ)5ˊ-CGGAATTCCCGATCGGCGCCCGGCCGTG-3ˊ；
(2)KillerRed和mcherry引物设计：根据mcherry的基因序列设计上游引物和下游引物，mcherry上游引物(EcoRⅠ)5ˊ-GGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGG，mcherry下游引物(BamHⅠ)5ˊ-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3ˊ；根据KillerRed的基因序列设计引物上游引物和下游引物，KR上游引物(EcoRⅠ)5ˊ-GGAATTCATGGGTTCAGAGGGC-3ˊ，KR下游引物(BamHⅠ)5ˊ-CGGGATCCCTAGATCTCGTCG-3ˊ；
(3)目的片段扩增：分别以pGW1-Myc-SARM1质粒、plxsp-TetA-mcherry质粒和plxsp-TetA-killerRed质粒为模板，以步骤(1)和(2)中设计上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得目的片段Sarm1、mcherry和KR；
PCR扩增的体系为：
Figure BDA0002373201830000081
PCR扩增的条件为：98℃ 30秒，(98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃30秒)×30循环，72℃2分钟，4℃；
PCR扩增结果，参见图1和图2，目的片段mcherry的大小为711bp，目的片段KR的大小为723bp，目的片段Sarm1大小为81bp
(4)plxsp-flag-mcherry载体构建及鉴定：将plxsp-flag空载体(采购自美国Addgene公司)利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切得到载体1；
利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure BDA0002373201830000082
利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h；
将步骤(3)获得的所述目的片段mcherry插入连接到载体1上，获得plxsp-flag-mcherry载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-mcherry载体进行鉴定：将plxsp-flag-mcherry载体转化到制备好的感受态细胞DH5α中，之后培养细胞，并通过质粒小提的方法提取质粒，测序鉴定。具体方法为：将制备好的感受态细胞DH5α进行转化，质粒冰上融化后，放置30分钟，42℃条件下热激90秒，取出后冰浴2分钟，将其加入到1ml不含Amp的LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养1小时，取出200μl培养产物涂布于含有Amp的LB平板上，37℃过夜孵育，挑取平板上阳性克隆进行鉴定，并挑取后培养，小量提取后进行测序鉴定。plxsp-flag-mcherry载体测序结果参见图3，确认序列正确后进行后续步骤；
(5)plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体构建：将所述plxsp-flag-mcherry载体利用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切得到载体2；
利用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure BDA0002373201830000091
步骤(5)中所述利用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h；
将步骤(3)获得的所述目的片段Sarm1插入连接到载体2上，获得plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体进行鉴定：将plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体转化到制备好的感受态细胞DH5α中，之后培养细胞，并通过质粒小提的方法提取质粒，测序鉴定，具体方法同步骤(4)；plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体测序结果参见图4，确认序列正确后进行后续步骤；
(6)plxsp-flag-Sarm1-KR载体构建：将所述plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切得到载体3；
利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure BDA0002373201830000101
利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h。
将步骤(3)获得的所述目的片段KR插入连接到载体3上，获得plxsp-flag-Sarm1-KR载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-Sarm1-KR载体进行鉴定：将plxsp-flag-Sarm1-KR载体转化到制备好的感受态细胞DH5α中，之后培养细胞，并通过质粒小提的方法提取质粒，测序鉴定，具体方法同步骤(4)；plxsp-flag-Sarm1-KR载体测序结果参见图5，确认序列正确后将其命名为一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR。且所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的融合蛋白序列大小为810bp，序列如SEQ ID NO 1所示。
实施例2
对实施例1中制备得到的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR进行性能验证，具体包括以下几个方面：
1.靶向性验证
因为KillerRed具有光照失活的特点，利用mcherry蛋白替代KillerRed蛋白，进行定位验证，结果参见图6，从图中可见，线粒体示踪蛋白COXⅣ的位置为线粒体位置，而mcherry表达在相同位置，说明光敏剂Sarm1-mtKR可以定位于线粒体基质，即光敏剂Sarm1-mtKR具有线粒体靶向性，具有线粒体基质亚定位作。
2.在HeLa细胞中生成活性氧能力验证
实验分组：样品质粒分为对照组(Con)、空载体plxsp-flag组(Empty vector)和Sarm1-mtKR(S-mtKR)组。
实验方法：HeLa细胞密度达到80％时，0.25％胰酶消化，加入含有10％FBS无抗生素的MEM稀释，按照0.8×104个/孔接种到96孔板中，分组样品质粒0.2μg/每孔，转染试剂0.2ul/每孔，转染结束后用锡纸包裹96孔板，避光在37℃、5％CO2条件下培养24h，转染结束后加入完全培养基100μl，进行可见光照射，分别于与照射后10、30和60min加入DCFH-DA探针标记，并上机检测，结果以平均荧光强度表示活性氧(ROS)产生量，实验设6个复孔；具体检测方法参见图7检测模式图。
实验结果：线粒体靶向光敏剂质粒S-mtKR转染后避光培养30h，可见光照射，结果参见表1，从表1可知，与Con组比较，Empty vector组可见光照射60min后加入探针，在30min时MFI显著增加(P<0.05)，而S-KR组MFI则在照射10min后60min加入探针，照射30min后10min加入探针，照射60min时较30min加入探针显着增加(P<0.05)。由此可见，线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR可以实现HeLa细胞中ROS的生成增加。
表1光照10、30和60min后不同时间HeLa细胞中ROS的生成(n＝6，
Figure BDA0002373201830000111
)
Figure BDA0002373201830000112
Figure BDA0002373201830000121
*P<0.05vs Control group3.对HeLa细胞增殖抑制的验证
实验分组：样品质粒分为对照组(Con)、空载体plxsp-flag组(Empty vector)和Sarm1-mtKR(S-mtKR)组。
实验方法：取对数生长期的HeLa细胞用只有血清无抗生素的MEM培养基接种于96孔板中，细胞密度为0.8×104个/孔，每组6复孔；24h后进行瞬时转染(DNA 0.2μg/孔，转染试剂0.2μl/孔)，避光培养于培养箱内，转染后6h换液。样品质粒转染后，30h进行可见光照射30min，12h后进行4Gy X射线照射，计为0h，分别于4、10、24和48h时，更换新培养基，每孔加入10μl CCK-8试剂，继续避光培养1.5h，轻轻震荡后采用酶标仪在450nm处检测各孔吸光度A450值，以此表示各组细胞增殖活性。
结果：各组可见光均照射30min，12h后进行4Gy X射线照射，结果参见表2，S-mtKR组在不同时间A450值均小于Con组与Empty vector组，其中4、10和24h时，S-mtKR组较Con组显著降低(P<0.05)，说明在光诱导条件下，与Con组和Empty vector组相比，S-mtKR组的HeLa细胞增殖受抑制；光照和电离辐射联合作用时，三组细胞在各时间点A450值均小于只光照的各组，说明在光照和电离辐射联合作用时，三组细胞都产生增殖抑制作用，但S-mtKR组细胞增殖受抑制更加明显，细胞增殖检测结果表明了线粒体亚定位的S-mtKR在可见光诱导下可以引起HeLa细胞增殖抑制，且显著增强辐射对HeLa细胞的增殖抑制。
表2 HeLa细胞4、10、24和48h的吸光度值(n＝6，
Figure BDA0002373201830000122
)
Figure BDA0002373201830000123
Figure BDA0002373201830000131
*P<0.05vs Control group；#P<0.05vs Control+4Gygroup；
△P<0.05vsS-mtKRgroup。
4.一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR诱导的线粒体失能指标
4.1ATP酶和ATP生成
4.1.1实验方法
HeLa细胞接种在6孔板中，2×105个/孔，每组3复孔，细胞密度80％左右用MEM进行转染(DNA 3μg/孔，转染试剂6μl/孔)，转染后避光放入培养箱中，6h更换完全培养基；30h后可见光照30min，12h后进行4Gy X射线照射，继续培养24h，弃去培养基，PBS洗1次，胰酶消化，室温1000rpm离心10min，弃上清留细胞沉淀；细胞沉淀中加入1ml PBS，轻轻颠倒混匀，1000rpm离心10min，重复1次。弃废液留下细胞沉淀，加入200μl裂解液(加PMSF，与裂解液比例1:100)，吹打均匀，4℃匀浆器匀浆1h后，4℃低温离心机12000rpm离心20min；将蛋白上清液吸出，装入标记好的新的EP管中，-80℃冰箱保存备用。
表3 ATP酶活性测试实验表
Figure BDA0002373201830000132
Figure BDA0002373201830000141
注：A管为对照管；B管为Na+-K+-ATP酶管；E管为Ca2+-Mg2-ATP酶管。
4.1.1.2ATP含量检测
混合试剂配置：工作液A，按试剂一：试剂二：试剂三应用液＝100:200:30的比例配置，现配现用按需配置；工作液B，按试剂一：试剂二＝100:200的比例配置，现配现用按需配置。混合液试剂配完后按表4操作：
表4操作步骤表
Figure BDA0002373201830000142
Figure BDA0002373201830000151
4.1.2实验结果
Emptyvector和S-mtKR质粒转染Hela细胞，30h后给予可见光照射30min，12h时再给予4Gy X射线照射，随后对每组中的Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase进行检测，具体结果参见表5，结果显示：在HeLa细胞中，Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase变化趋势相同，光照与4Gy联合作用细胞时，ATPase活性明显低于只进行光照组；无论是只光照还是光照与4Gy联合作用，S-mtKR组Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase活性均显著低于Con组与Emptyvector组(P<0.05)。ATP酶活性减弱表明线粒体功能受损，光诱导的线粒体靶向光敏剂载体产生ROS会导致线粒体中ATPase活性改变，电离辐射在此基础上所引起的ATPase活性减弱更明显。
线粒体靶向光敏剂质粒转染HeLa细胞，给予可见光和4Gy X射线照射，检测各组ATP含量变化，发现光照与4Gy联合作用HeLa细胞时，ATP产生含量明显低于只进行光照组；且无论是只光照还是光照与4Gy联合作用，转染S-mtKR组ATP产生含量均显著低于Con组和Empty vector组(P<0.05，表5)。这一结果表明了线粒体靶向光敏剂质粒在可见光照射下会引起线粒体ATP生成减少，线粒体功能受损，与电离辐射联合作用ATP含量降低得更明显。
表5 Hela细胞ATP酶活性及ATP含量变化(n＝6，
Figure BDA0002373201830000161
)
Figure BDA0002373201830000162
*P<0.05vs Control group；#P<0.05vs Control+4Gy group；
△P<0.05vs S-mtKR group。
4.2线粒体膜电位变化
4.2.1检测方法
取对数生长期的HeLa细胞接种于用只有血清无抗生素的MEM培养基的24孔板中，细胞密度为0.7×105个/孔，每组3复孔。细胞密度80％左右进行瞬时转染(DNA 0.5μg/孔，转染试剂1.0μl/孔)，避光培养于培养箱内，转染后6h换液。30h时进行可见光照射30min(加药组光照前1h加)，12h后进行4Gy X射线照射，此时记为0，12和24h后弃去培养基，PBS洗一遍细胞，加500μl胰酶进行消化，加入有血清培养基终止消化，转移到流式管中，1000rpm离心5min。弃废液，用PBS洗涤细胞3次，1000rpm离心5min，弃废液，加300μl PBS，重悬细胞，加罗丹明123(终浓度5μM/L)避光37℃反应30min，上机检测线粒体膜电位(Δψm)。
4.2.2实验结果
如表6和图8所示，HeLa细胞转染后，进行可见光与4Gy X射线照射，用胰酶消化收集细胞，PBS洗3次，加入罗丹明123，流式细胞术检测各组12h和24h的Δψm变化。光照后12h和24h，S-mtKR组Δψm较Con组显著降低(P<0.05)，说明S-mtKR质粒光照后可诱导线粒体膜电位降低；且与只光照的细胞相比，光照和4Gy联合时HeLa细胞的Δψm发生改变，有明显下降趋势，说明S-mtKR组细胞因光照及电离辐射产生的ROS发挥作用，引起线粒体外膜产生动作电位，导致去极化，且S-mtKR组Δψm低于Con组和Empty vector组；膜电位在12h变化较明显，而24h时无论是只光照还是光照和电离辐射联合作用，S-mtKR组与其他两组结果变化均不明显，这可能与膜电位发生去极化改变是早期发生所引起的有关。
表6 HeLa细胞中线粒体膜电位的改变(n＝3，
Figure BDA0002373201830000171
)
Figure BDA0002373201830000172
*P<0.05vs Con；#P<0.05vs Con+4Gy，△P<0.05vs S-mtKR
4.3线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ的变化
4.3.1检测方法
4.3.1.1线粒体呼吸链复合体I活性检测
用无抗生素只加血清的MEM培养基在10ml培养皿中培养HeLa细胞，细胞密度80％左右用MEM进行转染(DNA 12μg，转染试剂20μl)，转染后避光放入培养箱中，6h更换完全培养基，30h时光照30min，12h后进行4Gy X射线照射，继续培养24h，弃去培养基，PBS洗1次，计数，按5×107个细胞加入1.0ml提取液的比例，加入提取液，用匀浆器在冰上匀浆。
4℃ 600g离心10min；将上清液转移至另一离心管中，4℃ 11 000g离心15min；上清液即胞浆提取液，在沉淀中加入400μl提取液，进行超声破碎(功率20％，超声5s，间隔10s，重复15次)，用于复合物I酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
测定步骤：紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；试剂一37℃(哺乳动物)预热15min；在1ml石英比色皿中分别加入表7所列试剂，迅速吹打混匀，记录第10s的吸光度A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃的水浴中准确反映2min，之后迅速取出比色皿并擦干，记录2min时的吸光度A2，计算△A＝A1-A2。
计算公式：
复合体I活力(U/mg prot)＝[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T＝1608×△A÷Cpr
公式中，V反总为反应体系总体积，10-3L；ε为NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为比色皿光径，1cm；V样为加入样本体积，0.05ml；V样总为加入提取液体积，0.4ml；T为反应时间，2min；Cpr为样本蛋白质浓度，mg/ml。
表7试剂名称及加量表
试剂名称 测定管(μl)
样本 50
试剂一 770
工作液 100
试剂四 80
4.3.1.2线粒体呼吸链复合体III活性检测
细胞培养与转染方法同线粒体呼吸链复合体I活性检测；
4℃ 600g离心分钟；将上清液转移至另一离心管中，4℃ 11 000g离心15min；上清液即胞浆提取液，在沉淀中加入200μl提取液，进行超声破碎(功率20％，超声5s，间隔10s，重复15次)，用于复合物I酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
测定步骤：酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零；工作液的配置，临用前把试剂二转移到试剂一中混合溶解；在96孔板中分别加入表8所列试剂，立即混匀，记录550nm处初始吸光度A3和2min的吸光度A4，分别记为A3测定、A4测定、A3对照、A4对照，计算△A＝(A4测定-A3测定)-(A4对照-A3对照)。
计算公式：
复合体III活力(U/mg prot)＝[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T＝436×△A÷Cpr
公式中V反总为反应体系总体积，2×10-4L；ε为NADH摩尔消光系数，1.91×104L/mol/cm；d为96孔板光径，0.6cm；V样为加入样本体积，0.02ml；T为反应时间，2min；Cpr为样本蛋白质浓度，mg/ml。
表8试剂名称及加量表
Figure BDA0002373201830000191
4.3.2实验结果
HeLa细胞的线粒体呼吸链复合物I和Ⅲ在光条件诱导下，活性变化规律相似，S-mtKR转染后均会引起复合物活性显著下降(P<0.05)，再给予4Gy X射线后，活性下降更为显著(结果参见表9)。结果表明：S-mtKR在可见光照射下因ROS生成增多，损伤线粒体后可引起线粒体呼吸链复合物活性的下降，导致线粒体失活，ATP含量生成减少等一系列线粒体功能的改变。
表9可见光和X射线照射后24h，线粒体呼吸链复合物I和Ⅲ活性的变化(n＝3，
Figure BDA0002373201830000201
)
Figure BDA0002373201830000202
*P<0.05vs Con；#P<0.05vs Con+4Gy，△P<0.05vs S-mtKR
5.细胞凋亡改变
5.1检测方法
取对数生长期的HeLa细胞用只有血清无抗生素的MEM培养基接种于24孔板中，细胞密度为0.7×105个/孔，每组3复孔。细胞密度80％左右进行瞬时转染(DNA 0.5μg/孔，转染试剂1.0μl/孔)，避光培养于培养箱内，转染后6h换液。30h时进行可见光照射30min，12h后进行4Gy X射线照射，此时记为0h，12h后弃去培养基，PBS洗一遍细胞，加入有血清培养基终止消化，转移到流式管中，1000rpm离心5min。弃废液，用PBS洗涤细胞3次，最后一遍用400目网过滤，1000rpm离心5min，弃废液，加500μl 1×Binding Buffer，重悬细胞，PI和FITC各加5μl，避光孵育30min，上机检测。
5.2实验结果
S-mtKR转染HeLa细胞后，流式细胞术结果显示(具体结果参见表10和图9)：S-mtKR组早期凋亡细胞百分比高于Con组和Empty vector组(P<0.05)；4Gy照射后S-mtKR组细胞早期凋亡率高于Control+4Gy组，且光照和4Gy X射线联合作用时，Con组、Emptyvector组和S-mtKR组凋亡率均显著高于光照时的各组(P<0.05)，说明线粒体靶向的光敏剂载体S-mtKR转染HeLa细胞后，诱导的ROS增加，可导致线粒体失能，甚至凋亡的增加。
表10可见光和X射线照射后12h细胞凋亡的改变(n＝3，
Figure BDA0002373201830000211
)
Figure BDA0002373201830000212
*P<0.05vs Con；#P<0.05vs Con+4Gy，△P<0.05vs S-mtKR
5.细胞凋亡下相关蛋白表达变化
5.1检测方法
5.1.1细胞总蛋白提取
用无抗生素只加血清的MEM培养基在10ml培养皿中培养细胞，细胞密度80％左右用MEM进行转染(DNA12μg，转染试剂20μl)，转染后避光放入培养箱中，6h更换完全培养基，30h时光照30min，12h后进行4Gy X射线照射，继续培养24h，弃去培养基，PBS洗一遍，加1mlPBS，用细胞刮刮下全部细胞，放入1.5ml EP管中，4℃低温离心机12000rpm离心2min；
弃废液留下细胞沉淀，加入200μl裂解液(加PMSF，与裂解液比例1:100)，吹打均匀，4℃匀浆器匀浆1h后，4℃低温离心机12000pm离心20min；将蛋白上清液吸出，装入标记好的新的EP管中，-80℃冰箱保存。
5.1.2线粒体蛋白提取
10ml培养皿培养HeLa细胞，细胞密度80％左右进行转染，30h后光照30min，12h后进行4Gy X射线照射，继续培养24h弃去培养基，PBS洗一遍，加1ml 0.25％胰酶消化3min，加3ml MEM终止消化，吹打细胞悬液后，转移至15ml离心管中，1500rpm离心7min。弃去细胞废液，加1ml PBS吹打后取20μl计数，然后600g，4℃离心5min，弃上清，按1×106个细胞加入50μl线粒体分离剂(加PMSF)的比例，加入到细胞沉淀中，吹打均匀，冰浴10～15min。冰浴结束，将细胞悬液转移到玻璃匀浆器中，匀浆10～15次。取2μl细胞匀浆，加8μl PBS，10μl台盼蓝染色，计数，若阳性率>50％，停止匀浆，600g，4℃离心10min；若阳性率<50％，继续匀浆。
离心后将上清液转移到新的1.5ml EP管中，11000g，4℃离心10min。
再次离心后的上清液另存在新的EP管中，即浆细胞蛋白；沉淀按1×106个细胞加入8μl线粒体裂解液(加PMSF)的比例加入线粒体裂解液，进行超声破碎(功率20％，超声5s，间隔10s，重复15次)，12000rpm离心20min后，上清液即线粒体蛋白。
5.1.3蛋白浓度测定
在96孔板中将蛋白标准品和PBS按照表11所示的体系和顺序依此加入到96孔板内；将2μl待测蛋白和18μl PBS加入到蛋白样品孔内；配制BCA工作液，试剂A和B(50:1)的比例；将96孔板晃匀后，37℃孵箱中放置20min，用酶标仪检测562nm波长处的吸光度值，根据标准曲线的公式来计算蛋白样品的浓度。
表11加样顺序
Figure BDA0002373201830000221
5.1.4Western Blot
①样品制备：蛋白样品按照浓度与上样体系计算后，按比例加入5×LoadingBuffer及裂解液，每个全细胞样品的蛋白量为40μg，总体系为20μl；线粒体样品的蛋白量为15μg，总体系为40μl。
②蛋白变性：用金属浴100℃煮蛋白样品7min；
③制胶：根据待测蛋白分子量的大小制备不同浓度的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶(8％和15％)；
④上样：将制胶板装入电泳槽，加入电泳缓冲液，缓慢拔出梳子，用移液器加入Marker和蛋白样品，缓慢注入以减少样品溢出并减少气泡生成；
⑤电泳：连接好电泳槽和电泳仪，浓缩胶电压设为80V，当样品进入分离胶后电压调为120V，根据蛋白大小及Marker分散程度及时停止电泳；
⑥转膜：卸下并撬开灌胶玻璃板，切掉多余的浓缩胶，转膜夹顺序为：黑色夹子→海绵→三层滤纸→分离胶→NC膜→三层滤纸→海绵→白色夹子，确保膜与胶之间无气泡后，装好转膜夹，放入转膜槽加入转膜液，为防止转膜过程中产热对蛋白有影响，适当放入冰袋，一起安好后冰浴，电压调至90V，时间设为90min；
⑦封闭：用丽春红染膜，观查到有条带后，用TBST洗净红色，按照Marker的位置裁剪所需要的目的条带，放入5％脱脂奶粉中，室温条件下封闭1h；
⑧孵育一抗：封闭结束去掉封闭液，加入用TBST稀释的一抗(1:1000)，置于摇床上，4℃冰箱过夜；
⑨孵育二抗：回收一抗，用1×TBST洗膜3次，每次10min，加入用TBST稀释的相应二抗(1:10000)，在室温条件下摇床孵育1h；
⑩曝光：去掉二抗，用1×TBST洗膜3次，每次10min，在暗室中加入ECL化学发光液进行显影2min，然后进行曝光，曝光结束进行蛋白条带分析。
5.2实验结果
由图10所见，S-mtKR组中细胞色素C(cytochrome c,Cyt c)蛋白在总蛋白中表达含量高于Con组和Empty vector组，而在线粒体蛋白中Cyt c含量则显著低于其他两组；在总蛋白中，S-mtKR组半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specificproteinase9,caspase-9)和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartatespecific proteinase3,caspase-3)蛋白表达与其他两组相比也有增加趋势，且电离辐射增强了这一现象。因此，可认为线粒体靶向光敏剂S-mtKR在可见光作用下诱导的Hela细胞凋亡是通过ROS增多引起线粒体失活，膜通透性改变而Cyt c外流，激活caspase通路，引起了以Cyt c/caspase-3为主的凋亡途径，进而导致HeLa细胞的损害，而电离辐射可与可见光发生协同作用，对细胞进行更进一步的伤害。
6.细胞自噬的变化
6.1检测方法
取对数生长期的HeLa细胞用只有血清无抗生素的MEM培养基接种于24孔板，中，细胞密度为0.7×105个/孔，每组3复孔。细胞密度80％左右进行瞬时转染(DNA 0.5μg/孔，转染试剂1.0μl/孔)，避光培养于培养箱内，转染后6h换液。30h时进行可见光照射30min(加药组光照前1h加)，12h后进行4Gy X射线照射，此时记为0h，12h后弃去培养基，PBS洗一遍细胞，加500μl胰酶进行消化，加入有血清培养基终止消化，转移到流式管中，1000rpm离心5min。弃废液，PBS洗2次，加入10μl MDC(5mmol/L)，终浓度50μmol/L，37℃静置30min后，PBS洗1次，1000rpm离心5min，弃废液，加1ml的4％多聚甲醛，避光静置15min，离心后加PBS清洗1次，弃废液，加300μl适量PBS上机，检测自噬率变化。
6.2实验结果
线粒体靶向光敏剂载体S-mtKR转染HeLa细胞后用流式细胞术检测，结果显示(具体结果参见表12和图11)：S-mtKR组自噬细胞百分比高于Con组和和Empty vector组(P<0.05)；4Gy照射后S-mtKR组细胞自噬发生率高于Con+4Gy组，且光照和4Gy X射线联合作用时，Con组、Empty vector组和S-mtKR组自噬率均显著高于光照时的各组(P<0.05)，说明线粒体靶向的光敏剂载体S-mtKR转染HeLa细胞后，诱导的ROS增加，可导致线粒体失能，增强辐射诱导的自噬。
表12可见光和电离辐射后12和24细胞自噬的变化(n＝3，
Figure BDA0002373201830000251
)
Figure BDA0002373201830000252
*P<0.05vs Con；#P<0.05vs Con+4Gy，△P<0.05vs S-mtKR
7.细胞自噬相关分子的表达
7.1实验方法
总蛋白和线粒体蛋白提取方法同上，采用Western blot检测Pink1、帕金蛋白(parkin)、微管相关蛋白1轻链3(Microtubulesas sociated protein light chain3,LC3)、p62、电压依赖性阴离子通道蛋白1(Voltage Dependent Anion Channel Protein 1,VDAC1)、线粒体外膜转换酶20(translocase of outer mitochondrial membrane 20,TOM20)和热休克蛋白60的表达。
7.2实验结果
由图12可见，S-mtKR组中Tom20蛋白在总蛋白和线粒体蛋白中表达含量均高于Con组和Empty vector组；在总蛋白中Pink1、parkin表达含量升高幅度较小，而在线粒体蛋白中两者表达含量明显高于其他两组；在总蛋白中LC3I蛋白表达减少，而LC3II和p62蛋白表达显著增加(P<0.05)，且电离辐射增强了这一趋势。因此，可认为S-mtKR在可见光作用下诱导的Hela细胞自噬是通过ROS增多引起线粒体失活，线粒体损伤，膜电位去极化而Pink1在外膜大量蓄积，招募更多的parkin蛋白使其磷酸化从而引起了以线粒体自噬为主的自噬途径，进而导致HeLa细胞的损害，同时电离辐射可与可将光发生协同作用，对细胞进行更进一步的伤害。
8.一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的作用方式及相关机制
由图13可见，线粒体靶向光敏剂S-mtKR能够定位于线粒体，而且S-mtKR转染的HeLa细胞经光照后可以诱导ROS增加，同时ATP酶活性和ATP产生和线粒体呼吸链复合物I、III降低，线粒体膜电位也降低，线粒体通道蛋白VDAC1表达增加。由辐射诱导的细胞凋亡和自噬可以被S-mtKR所增加，且涉及到Cytc/caspase-3凋亡通路，以及Pink1/Parkin线粒体自噬途径S-mtKR引起的线粒体失能和最终的细胞死亡为肿瘤的辐射增敏提供了很好的思路。
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR及其制备方法和应用
<130> 2019
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atggtcctga cgctgcttct ctccgcctac aagctgtgtc gcttcttcgc catgtcgggc 60
ccacggccgg gcgccgagcg ggaattcatg ggttcagagg gcggccccgc cctgttccag 120
agcgacatga ccttcaaaat cttcatcgac ggcgaggtga acggccagaa gttcaccatc 180
gtggccgacg gcagcagcaa gttcccccac ggcgacttca acgtgcacgc cgtgtgcgag 240
accggcaagc tgcccatgag ctggaagccc atctgccacc tgatccagta cggcgagccc 300
ttcttcgccc gctaccccga cggcatcagc catttcgccc aggagtgctt ccccgagggc 360
ctgagcatcg accgcaccgt gcgcttcgag aacgacggca ccatgaccag ccaccacacc 420
tacgagctgg acgacacctg cgtggtgagc cgcatcaccg tgaactgcga cggcttccag 480
cccgacggcc ccatcatgcg cgaccagctg gtggacatcc tgcccaacga gacccacatg 540
ttcccccacg gccccaacgc cgtgcgccag ctggccttca tcggcttcac caccgccgac 600
ggcggcctga tgatgggcca cttcgacagc aagatgacct tcaacggcag ccgcgccatc 660
gagatccccg gcccacactt cgtgaccatc atcaccaagc agatgaggga caccagcgac 720
aagcgcgacc acgtgtgcca gcgcgaggtg gcctacgccc acagcgtgcc ccgcatcacc 780
agcgccatcg gtagccacga cgagatctag 810
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
aaggaaaaaa gcggccgcaa tggtcctgac gctg 34
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cggaattccc gatcggcgcc cggccgtg 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggaattcgcc accatggtga gcaaggg 27
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cgggatcctt acttgtacag ctcgtccatg 30
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ggaattcatg ggttcagagg gc 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
cgggatccct agatctcgtc g 21
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
atggtcctga cgctgcttct ctccgcctac aagctgtgtc gcttcttcgc catgtcgggc 60
ccacggccgg gcgccgagcg g 81
<210> 9
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711
<210> 10
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
atgggttcag agggcggccc cgccctgttc cagagcgaca tgaccttcaa aatcttcatc 60
gacggcgagg tgaacggcca gaagttcacc atcgtggccg acggcagcag caagttcccc 120
cacggcgact tcaacgtgca cgccgtgtgc gagaccggca agctgcccat gagctggaag 180
cccatctgcc acctgatcca gtacggcgag cccttcttcg cccgctaccc cgacggcatc 240
agccatttcg cccaggagtg cttccccgag ggcctgagca tcgaccgcac cgtgcgcttc 300
gagaacgacg gcaccatgac cagccaccac acctacgagc tggacgacac ctgcgtggtg 360
agccgcatca ccgtgaactg cgacggcttc cagcccgacg gccccatcat gcgcgaccag 420
ctggtggaca tcctgcccaa cgagacccac atgttccccc acggccccaa cgccgtgcgc 480
cagctggcct tcatcggctt caccaccgcc gacggcggcc tgatgatggg ccacttcgac 540
agcaagatga ccttcaacgg cagccgcgcc atcgagatcc ccggcccaca cttcgtgacc 600
atcatcacca agcagatgag ggacaccagc gacaagcgcg accacgtgtg ccagcgcgag 660
gtggcctacg cccacagcgt gccccgcatc accagcgcca tcggtagcca cgacgagatc 720
tag 723

Claims (10)

1.一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于：所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的融合蛋白序列大小为810bp，序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)线粒体靶向蛋白选择性雄激素受体调节剂Sarm1基因引物设计：根据Sarm1基因的线粒体定位序列设计上游引物和下游引物，上游引物(Not Ⅰ)5ˊ-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAATGGTCCTGACGCTG-3ˊ，下游引物(EcoRⅠ)5ˊ-CGGAATTCCCGATCGGCGCCCGGCCGTG-3ˊ；
(2)KillerRed和mcherry引物设计：根据mcherry的基因序列设计上游引物和下游引物，mcherry上游引物(EcoR Ⅰ)5ˊ-GGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGGG，mcherry下游引物(BamHⅠ)5ˊ-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3ˊ；根据KillerRed的基因序列设计上游引物和下游引物，KR上游引物(EcoR Ⅰ)5ˊ-GGAATTCATGGGTTCAGAGGGC-3ˊ，KR下游引物(BamH Ⅰ)5ˊ-CGGGATCCCTAGATCTCGTCG-3ˊ；
(3)目的片段扩增：分别以pGW1-Myc-SARM1质粒、plxsp-TetA-mcherry质粒和plxsp-TetA-killerRed质粒为模板，以步骤(1)和(2)中设计上游引物和下游引物进行PCR扩增，获得目的片段Sarm1、mcherry和KR；所述目的片段Sarm1、mcherry和KR的序列分别见序列表SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10；
(4)plxsp-flag-mcherry载体构建及鉴定：将plxsp-flag空载体利用EcoR Ⅰ酶和BamHⅠ酶进行双酶切得到载体1，将步骤(3)获得的所述目的片段mcherry插入连接到载体1上，获得plxsp-flag-mcherry载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-mcherry载体进行鉴定，确认序列正确后进行后续步骤；
(5)plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体构建：将所述plxsp-flag-mcherry载体利用NotⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切得到载体2，将步骤(3)获得的所述目的片段Sarm1插入连接到载体2上，获得plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体进行鉴定，确认序列正确后进行后续步骤；
(6)plxsp-flag-Sarm1-KR载体构建：将所述plxsp-flag-Sarm1-mcherry载体利用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切得到载体3，将步骤(3)获得的所述目的片段KR插入连接到载体3上，获得plxsp-flag-Sarm1-KR载体；之后通过测序的方法对所述plxsp-flag-Sarm1-KR载体进行鉴定，确认序列正确后将其命名为一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR。
3.根据权利要求2所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增的体系为：
Figure FDA0002373201820000021
步骤(3)中所述PCR扩增的条件为：98℃30秒，(98℃10秒、58℃30秒、72℃30秒)×30循环，72℃2分钟，4℃；
步骤(4)中所述利用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure FDA0002373201820000022
Figure FDA0002373201820000031
步骤(4)中所述利用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h；
步骤(5)中所述利用Not Ⅰ酶和EcoR Ⅰ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure FDA0002373201820000032
步骤(5)中所述利用Not Ⅰ酶和EcoR Ⅰ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h；
步骤(6)中所述利用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶进行双酶切的酶切体系为：
Figure FDA0002373201820000033
步骤(6)中所述利用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶进行双酶切的条件为：37℃酶切3h。
4.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于：所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR具有线粒体基质靶向作用。
5.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于：所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR经可见光诱导后，具有爆发式生成大量活性氧ROS，抑制细胞增殖的特性。
6.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于：所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR经可见光诱导后，具有增强辐射诱导的线粒体失能以及凋亡特性。
7.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于，所述增强辐射诱导的线粒体失能以及凋亡特性包括：ATPase活性、ATP生成、线粒体呼吸链复合物I和III活性以及线粒体膜电位降低，膜通透性增加，可增强辐射诱导的表型变化。
8.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于，所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR通过诱导活性氧作用线粒体，导致细胞自噬和凋亡的方式发挥作用。
9.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于，所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR应用于光动力疗法领域，通过光动力反应选择性地治疗肿瘤、老年黄斑变性、血管性疾病以及组织体局部增生和感染。
10.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR，其特征在于，所述线粒体靶向光敏剂Sarm1-mtKR应用于医学美容领域。
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