JP2014025764A - Pink1のユビキチン化アッセイ及びスクリーニングへの利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で接触させ、PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6との複合体形成を検出することを含む、PINK1のユビキチン化を検出する方法。
【選択図】なし
Description
[1] PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で接触させ、PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6との複合体形成を検出することを含む、PINK1のユビキチン化を検出する方法。
[2] in vitroで行う、[1]のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[3] プルダウンアッセイを用いて行う、[1]又は[2]のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[4] ペプチドタグと融合したPINK1、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で、in vitroで反応させ複合体を形成させ、PINK1と融合したエピトープと特異的に結合する化合物を結合させた担体を用いて複合体を回収したのち、抗ユビキチン抗体を用いて複合体中のユビキチンを検出することにより、PINK1がユビキチンと結合しユビキチン化したかどうかを検出する、[3]のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[5] SARM1αが第1〜106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、[1]〜[4]のいずれかのPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[6] ユビキチン結合酵素(E2)がUbcH13/Uev1aである、[1]〜[5]のいずれかのPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[7] in vivoで行う、[1]のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[8] 培養細胞中でPINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)を発現させることを含む、[7]のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[9] SARM1αが第1〜106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、[7]又は[8]のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[10] ユビキチン結合酵素(E2)がUbc H13/Uev1aである、[7]〜[9]のいずれかのPINK1のユビキチン化を検出する方法。
[11] [1]〜[10]のいずれかのPINK1のユビキチン化を検出する方法を用いて、PINK1が関与する疾患の予防又は治療に用い得る薬剤をスクリーニングする方法であって、[1]〜[10]のいずれかのPINK1のユビキチン化を検出する方法において、候補薬剤を添加し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進されたかどうかを測定し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進された場合に、候補薬剤がPINK1が関与する疾患の予防又は治療に用い得ると評価する、スクリーニング方法。
[12] PINK1が関与する疾患が、神経変性疾患、がん又は糖尿病である、[11]のスクリーニング方法。
[13] 神経変性疾患が、パーキンソン病である、[12]のスクリーニング方法。
[14] PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)並びにATPを含む、[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。
[15] PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)をコードするDNAを含む、[7]〜[10]のいずれかの方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。
[16] 433番目のリジンを介してユビキチン化されたPINK1を認識する抗体。
[17] [16]の抗体を用いて、PINK1のユビキチン化を検出する方法。
HEK293細胞からPINK1遺伝子のクローニングを行い、遺伝子をタンパク質発現ベクターに組み込み大腸菌を用いて発現・精製を行った。
HEK293細胞からSARM1α遺伝子のクローニングを行った。SARM1β遺伝子はPCR法にてSARM1α遺伝子のN末端側を変換し、作成した。それぞれの遺伝子を発現ベクターに組み込み、HEK293細胞を用いて発現・精製を行った。
PCR法にてSARM1α遺伝子の各ドメインをコードするDNA断片を増幅し、発現ベクターに組み込んだ。
Openbiosystems社からTRAF2遺伝子を購入し、遺伝子を発現ベクターに組み込みHEK293細胞を用いて発現・精製を行った。
Openbiosystems社からTRAF6遺伝子を購入し、遺伝子を発現ベクターに組み込みHEK293細胞を用いて発現・精製を行った。
これまでに膜電位を失ったミトコンドリア上でPINK1が安定化するメカニズムはわかっていなかった。このメカニズムを明らかにするために、内在性のPINK1に結合する新規結合タンパク質の探索を行った。
次にPINK1と結合するSARM1のドメインを検索した。方法としてはFlagタグを付けた全長SARM1α(724アミノ酸)及び各SARM1αドメイン(全長アミノ酸配列の1〜550番目のアミノ酸からなるドメイン(1-550 a.a.)、全長アミノ酸配列の1〜404番目のアミノ酸からなるドメイン(1-404 a.a.)、全長アミノ酸配列の405〜550番目のアミノ酸からなるドメイン(405-550 a.a.)及び全長アミノ酸配列の551〜724番目のアミノ酸からなるドメイン(551-724 a.a.))を発現させ、PINK1-HAと共発現を行い、抗HA抗体アガロース(SIGMA社)で免疫沈降を行った後、ウエスタンブロッティング(WB)で検出した。その結果、PINK1はSARM1のN末端側(1-404 a.a.)の部位に結合することが判明した(図2−1)。ヒトにおいて、SARM1は2つのアイソフォーム(SARM1α(724アミノ酸)及びSARM1β(690アミノ酸)をもつことが知られている(図2−2)。図2−2に示すように、2つのアイソフォームの違いはN末端の配列のみが異なることである。そこでPINK1と2つのSARM1アイソフォームの結合を図2−1に結果を示す実験と同様の方法で確認した。その結果、PINK1はSARM1αとのみ結合し、SARM1βとは結合しないことが判明した(図2−3)。この結果は、PINK1との結合に必要な配列はSARM1αの1〜106番目のアミノ酸配列中に含まれていることを示している。
SARM1αとSARM1βの違いを確認するために、細胞内の局在を免疫染色法にて検討した。Flagタグを付けた2つのSARM1アイソフォームをSH-SY5Y細胞で発現させ、抗Flag抗体(MBL社)とMitoTracker Oranege CMTMRos(ミトコンドリア染色色素、Life technologies (Molecular probes)社)による共染色を行った。その結果、SARM1αは主にミトコンドリアに局在し、SARM1βは主に細胞質に局在することが判明した(図3−1)。図3−1において、左のパネルはミトコンドリアの位置を示し、中央のパネルはSARM1αの局在を示し、右のパネルはSARM1βの局在を示す。ミトコンドリアは赤く染色され(モノクロ写真では灰色に見える)、SARM1α及びSARM1βは緑色に染色されている(モノクロ写真では白っぽく見える)。図3−1の中央パネルに示されるように、SARM1αの染色位置とミトコンドリアの染色位置が重なっている。
さらに、SARM1αとSARM1βの違いをより明確にするために、N末端側の配列の違いを詳細に検討した。その結果、SARM1αのN末端配列(1-106 a. a.)には、PREVSP(PxExxAr/AcがTRAF6の結合配列である。xは任意のアミノ酸、Arは芳香環を含むアミノ酸、Acは酸性アミノ酸を示す)で示されるTRAF6結合配列が含まれていることがわかった。そこで2つのSARM1アイソフォームとTRAF6及びTRAF6と機能がよく似ているTRAF2との結合を確認した。方法としては、Flagタグを付けた2つのSARM1アイソフォームとMycタグを付けたTRAF2及びTRAF6をHEK293細胞に共発現させ、抗Flag抗体で免疫沈降後、ウエスタンブロッティング(WB)にて検出を行った。その結果、SARM1αのみがTRAF2とTRAF6に結合し、SARM1βは結合しないことがわかった(図4−1及び4−2)。図4−1がSARM1α、SARM1βとTRAF2の結合を、図4−2がSARM1α、SARM1βとTRAF6の結合を示す。次にPINK1-SARM1α複合体中にTRAF2、TRAF6が含まれているかを免疫沈降法によって確認したところ、内在性のTRAF2、TRAF6が複合体中に含まれていることがわかった(図4−3)。このことは、SARM1αとPINK1複合体中にTRAF6が、SARM1αと結合することによりリクルートされることを示している。
TRAF2及びTRAF6はユビキチンE3リガーゼである。このことから、TRAF2及びTRAF6がPINK1をユビキチン化するか否かを検討した。方法としては、PINK1-HA、His(ヒスチジンタグ)-ユビキチン、TRAF2/6-Mycの強制発現を行い、抗HA抗体アガロースで免疫沈降後、ウエスタンブロッティング(WB)にて検出を行った。ユビキチンは、BostonBiochem社より入手した。TRAF2及びTRAF6はPINK1をユビキチン化する能力を有していた(図5−1)。次にこのPINK1のユビキチン化がどのリジンを介して行われているかを検討した。タンパク質のユビキチン化は主にリジン48番目を介して行われるものと、リジン63番目を介して行われるものがある。リジン48番目を介したユビキチン化はタンパク質の分解シグナルとして、リジン63番目を介したユビキチン化は細胞内シグナルの増強などに利用される。PINK1-HAとTRAF6-Myc及び野生型His-ユビキチン(WT)またはユビキチンのリジン48番をアルギニンに置換したK48R、ユビキチンのリジン63番をアルギニンに置換したK63Rを発現させ、図5−1に結果を示す実験と同様の方法で検出を行った。その結果、K63Rを用いた時にPINK1のユビキチン化が減少した(図5−2)。この結果は、TRAF6によるPINK1のユビキチン化はリジン63番を介して行われていること、すなわちK63鎖型ユビキチン化が起こることを示す。
次にin vitroでPINK1のユビキチン化をアッセイする系を確立した。反応溶液は50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、5 mM MgCl2、2 mM DTT、2 mM ATPを使用した。その溶液中に大腸菌から精製したGST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)融合型のPINK1(GST-PINK1、PINK1の112-581 a. a.を含む)2μg、50μMユビキチン(BostonBiochem社)、50 nM E1(ユビキチン活性化酵素、BostonBiochem社)、500 nM UbcH13/Uev1a(ユビキチン結合酵素(E2)、BostonBiochem社)、50 nM TRAF2/6、50 nM SARM1αを加え、37℃で2時間反応を行った。グルタチオンを結合させたSepharose(登録商標) 4Bビーズ(GE Healthcare社)を用いてGST-PINK1のプルダウンを行い、SDS-PAGEで展開後、ウエスタンブロッティング(WB)にてユビキチン及び関連タンパク質の検出を行った。結果を図6−1に示す。図6−1に示すように、PINK1、ユビキチン、E1、UbcH13/Uev1a、TRAF2若しくはTRAF6、並びにSARM1αを混合した場合にin vitroでPINK1のユビキチン化を検出することができた。細胞内でも同様にPINK1のユビキチン化を確認した(図6−2)。図6−2に示すように、PINK1のユビキチン化はSARM1αによって増強されるが、SARM1βでは増強されなかった。また、SARM1αの共発現によってPINK1複合体中にリクルートされるTRAF6の量が増加した。さらに、図6−1及び図6−2に示す結果より、SARM1αの共存によってPINK1のユビキチン化が促進されることがわかった。このことは、SARM1αの発現を高めるプラスミドベクターや化合物は、PINK1のユビキチン化を促進する物質として使用することが可能であることを示す。
次に内在性のPINK1がどのような時にユビキチン化されるのかを検討した。これまでの実験から、PINK1の全長タイプのタンパク質量がTRAF6やSARM1αを共発現させた時に増加することを見出していた。またこれまでの報告から、ミトコンドリアの膜電位が消失した際にPINK1がミトコンドリア上で蓄積することがわかっていた(PLoS Biol., 8, 2010、J. Cell Biol., 189, 2010)。そこでミトコンドリアの膜電位を消失させる試薬であるCarbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone(CCCP)(SIGMA社)で処理を行った時にPINK1のユビキチン化が起こるか否かを確認した。方法としては、SH-SY5Y細胞をCCCPで処理し、抗PINK1抗体で免疫沈降後、ウエスタンブロッティング(WB)にて検出を行った。PINK1のユビキチン化はCCCPの濃度依存的に増加した(図7−1)。それに伴ってSARM1α及びTRAF2のPINK1への結合量が増加した。またPINK1のユビキチン化は3〜6時間あたりがピークで12、24時間では減少していった(図7−2)。ユビキチン化の減少に伴い、一旦増加したPINK1タンパク質量も減少していった。またミトコンドリア外膜タンパク質であるTom20も12〜24時間で分解されていった。逆にオートファジー(マイトファジー)のマーカーであるLC-3B IIの量は増加した(図7−3)。この結果から、PINK1はミトコンドリアの膜電位消失をきっかけとしてユビキチン化され、ミトコンドリア上で安定化し、その後マイトファジーによって膜電位を失ったミトコンドリアと共に分解されることがわかった。
最後にパーキンソン病治療薬として使用されているアポモルフィンによってPINK1がユビキチン化されるか否かを検討した。方法としては、SH-SY5Y細胞を0 〜 50μMのアポモルフィン(Apomorphine)(SIGMA社)で処理し、抗PINK1抗体で免疫沈降後、ウエスタンブロッティング(WB)にて検出を行った。PINK1のユビキチン化はアポモルフィンの濃度依存的に増加した(図8)。この結果より、パーキンソン病候補治療薬となる薬剤をPINK1のユビキチン化を指標としてスクリーニングできることが示された。
PINK1がTRAF6によってユビキチン化されるアミノ酸部位の同定を行った。K63鎖型のユビキチン化はリジン(K)を介して行われ、PINK1には生物種(ヒト、マウス、ショウジョウバエなど)を超えて保存されたリジンが存在する。具体的にはK135、K137、K164、K219、K266、K319、K364、K433である。これらのリジンをアルギニンに置換したPINK1変異体を作製し、野生型PINK1(WT)との比較を行った。PINK1-HA及びPINK1の8つのリジンをそれぞれアルギニンに置換したPINK1変異体-HAとFlag-ユビキチン、TRAF6-Myc、SARM1a-Hisを発現させ、抗HA抗体アガロースで免疫沈降後、ウエスタンブロッティング(WB)にて検出を行った。リジン433番をアルギニンに置換した変異体において、PINK1のユビキチン化が消失した(図9−1)。またユビキチン化に伴うPINK1の安定化も起こらなかった。次にこのユビキチン化の消失がミトコンドリアの膜電位を低下させた場合にも同様に観察されるか否かについて検討した。野生型PINK1-HA(WT)及びリジン433番をアルギニンに置換したPINK1変異体-HAとFlag-ユビキチンを発現させ、CCCP処理によってミトコンドリアの膜電位を低下させた。その後、図9−1に示す実験と同様の方法で検出を行った。リジン433番をアルギニンに置換したPINK1変異体は野生型PINK1と異なり、ミトコンドリアの膜電位低下時にユビキチン化と安定化が観察されなかった(図9−2)。これらの結果より、TRAF6によるPINK1のユビキチン化はリジン433番を介して行われ、このユビキチン化がPINK1の安定化に重要であることが示された。
Claims (17)
- PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で接触させ、PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6との複合体形成を検出することを含む、PINK1のユビキチン化を検出する方法。
- in vitroで行う、請求項1記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- プルダウンアッセイを用いて行う、請求項1又は2に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- ペプチドタグと融合したPINK1、ユビキチン、SARM1α並びにTRAF2及び/若しくはTRAF6とをユビキチン活性化酵素(E1)及びユビキチン結合酵素(E2)並びにATPの存在下で、in vitroで反応させ複合体を形成させ、PINK1と融合したエピトープと特異的に結合する化合物を結合させた担体を用いて複合体を回収したのち、抗ユビキチン抗体を用いて複合体中のユビキチンを検出することにより、PINK1がユビキチンと結合しユビキチン化したかどうかを検出する、請求項3記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- SARM1αが第1〜106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- ユビキチン結合酵素(E2)がUbcH13/Uev1aである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- in vivoで行う、請求項1記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- 培養細胞中でPINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)を発現させることを含む、請求項7記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- SARM1αが第1〜106番目のアミノ酸配列からなるドメインを含む、SARM1αの断片である、請求項7又は8に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- ユビキチン結合酵素(E2)がUbcH13/Uev1aである、請求項7〜9のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法を用いて、PINK1が関与する疾患の予防又は治療に用い得る薬剤をスクリーニングする方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載のPINK1のユビキチン化を検出する方法において、候補薬剤を添加し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進されたかどうかを測定し、候補薬剤の添加によりPINK1のユビキチン化が促進された場合に、候補薬剤がPINK1が関与する疾患の予防又は治療に用い得ると評価する、スクリーニング方法。
- PINK1が関与する疾患が、神経変性疾患、がん又は糖尿病である、請求項11記載のスクリーニング方法。
- 神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項12記載のスクリーニング方法。
- PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)並びにATPを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。
- PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)、ユビキチン、SARM1α、TRAF2及び/若しくはTRAF6、ユビキチン活性化酵素(E1)並びにユビキチン結合酵素(E2)をコードするDNAを含む、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法でPINK1のユビキチン化を検出するためのキット。
- 433番目のリジンを介してユビキチン化されたPINK1を認識する抗体。
- 請求項16に記載の抗体を用いて、PINK1のユビキチン化を検出する方法。
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JP6024953B2 (ja) | 2016-11-16 |
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