KR20180101052A - BAG2 및 Cathepsin B 상호결합 억제 물질 스크리닝 방법 - Google Patents
BAG2 및 Cathepsin B 상호결합 억제 물질 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 시료와 피검물질을 접촉시키는 단계; 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및상기 결합 정도가 대조군 시료와 비교하여 감소한 시료를 선별하는 단계를 포함하는, BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 방법을 위한 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
Description
BAG2 단백질의 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 pro-cathepsin B 단백질의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 시료에 시험물질을 접촉시켜 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 항 종양물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
BAG (co-chaperone Bcl-2-associated athanogene) 단백질 패밀리는 세포 내 단백질 폴딩, 스트레스 반응, 신경 분화, 세포 사멸, 세포 증식 등을 포함하는 다양한 생리학적 과정을 매개하고 다양한 협력 단백질들과 기능적으로 결합한다 (Takayama and Reed., 2001; Doong et al., 2002). 이들 중 항-세포 사멸 활성을 갖는 BAG 도메인 패밀리 구성원 중 하나인 BAG2는 샤페론-관련 유비퀴틴 리가제인 CHIP (C-terminus of Hsc70-interacting protein)의 음성 조절자로서 알려져 있다 (Arndt et al., 2005; Dai et al., 2005). CHIP 활성을 억제를 통한 단백질의 조절에서 BAG2의 주 역할은 PINK1 및 CFTR과 같은 샤페론 관련 단백질의 안정화를 통해 신경퇴행성 질환 및 상염생체 열성 장애와 관련되어 있다 (Qu et al., 2015; Arndt et al., 2005). 그러나, 암에서의 BAG2 역할은 잘 알려져 있지 않고, 종양 발생 조절에서의 역할은 논쟁 중에 있다. 그 중 알려진 바에 따르면, BAG2의 발현은 프로테아좀 억제자-유도된 세포사멸을 증가시키고, BAG2 녹다운은 갑상선 암종 세포를 프로테아좀 억제자인 MG132에 노출시키는 경우, 세포 사멸을 부분적으로 억제함으로써, BAG2가 향-세포사멸(pro-apoptotic) 활성을 가질 수 있음이 제시된바 있다(Wang et al., 2008). 한편, 다양한 돌연변이 K-Ras-유도된 종양에서, BAG2의 과발현이 강력한 종양 유전자인 STK33 단백질의 안정화를 촉진시켜 종양 발생을 촉진시킬 수 있음이 제시된 바 있다 (Azoitei et al., 2012). 그러나 이러한 발견들에도 불구하고, 암 진행 및 전이에서의 BAG2 역할, 특히 유방암에 있어서는 집중적으로 연구되어 분명하게 밝힌바 없다.
Cathepsin B (CTSB)는 내재적 및 외래적 펩티다제 활성을 갖는 리소조말 시스테인 프로테아제로서, 단백질 순환 역할을 하는 것으로 생각된다 (Mort and Buttle, 1997). CTSB는 불활성/미성숙 전-형태(pro-form) 효소 (41/43 kDa)로서 합성되어, N-말단의 62개 아미노산 전-펩티드의 단백질 가수분해 과정을 통해 활성 단쇄 형태 (31 kDa) 또는 이중쇄 형태 (중쇄(heavy chain), 25/26 kDa; 경쇄 (light chain), 5 kDa)로 전환된다. CTSB의 이상적(aberrant) 발현/활성은 종종 악성 종양과 연결되어 왔다 (Joyce et al., 2004; Withans, 2012). 그러나, 성숙한 CTSB는 일반적으로 리소좀에 위치하여 리소좀-매개된 자가포식(autophagy)/세포사멸 동안 억제자 프로테아제로서 단백질 순환에서 기능함으로써 세포질 CTSB의 향-세포사멸적 역할을 나타내는 것으로 인식된다 (Stoka et al., 2001; Foghsgaard et al., 2001; Bhoopathi et al., 2010). 그러나, 암 진행에서의 이러한 CTSB의 이중적 기능의 조절자는 명확히 밝혀지지 않았다.
본 발명자들은 BAG2가 CTSB에 결합하여 CTSB의 전-형태에서 성숙한 CTSB 형태로 전환시키고, 결과적으로 CTSB의 이중적 기능을 조절할 수 있음을 발견하였다.
일 양상은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 시료와 피검물질을 접촉시키는 단계; 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및상기 결합 정도가 대조군 시료와 비교하여 감소한 시료를 선별하는 단계를 포함하는, BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는 이들의 조합을 포함하는 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는 이들의 조합을 포함하는 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 키트를 제공한다.
일 양상은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 시료와 피검물질을 접촉시키는 단계; 상기 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편과 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및 상기 결합 정도가 대조군 시료와 비교하여 감소한 시료를 선별하는 단계를 포함하는, BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따르면, BAG2 단백질이 pro-cathepsin B 단백질에 결합하여 종양 세포의 세포 사멸 조절에 영향을 미치는 성숙한 형태의 cathepsin B 단백질로 전환되는 것을 억제함을 확인하였으므로, BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질이 세포 사멸을 촉진시켜 항암제로서 이용가능한 후보물질이 될 수 있다.
본 명세서에서 pro-cathepsin B는 미성숙 cathepsin B 또는 미성숙 CTSB와 동일한 의미로 사용된 것일 수 있다. cathepsin B의 형태에 대한 별도의 수식이 없는 경우, pro-cathepsin B와 동일한 의미로 사용된 것일 수 있다. 본 명세서에서 상기 '폴리펩티드'는 '단백질'과 상호 교환적으로 쓰인다.
상기 대조군 시료는 피검물질을 접촉시키기 않은 시료, 피검물질을 용해시키기 위해 사용된 용매와 접촉된 시료를 의미하는 것일 수 있다. 상기 대조군 시료는 기존의 항암제보다 뛰어난 효과를 갖는 물질을 스크리닝하기 위한 목적으로, 기존에 항암제로서 이용가능한 것으로 알려져 있거나, 기존의 항암제 중 세포 사멸을 촉진시키는 것으로 알려져 있거나, 또는 당업계에서 이와 유사한 스크리닝 방법에서 대조군으로 사용될 수 있는 것으로 알려진 모든 물질과 접촉된 시료를 의미하는 것일 수 있다.
상기 BAG2 및 pro-cathepsin B는 각각 인간(Homo sapiens) 또는 마우스(Mus
musculus) 유래의 단백질이나, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현될 수 있다. 상기 BAG2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 GenBank Accession No. NM_004282.3 및 NM_145392.2 중 각각 BAG2로 발현되는 부분인 서열번호 1 또는 2를 포함하는 것일 수 있고, 상기 pro-cathepsin B를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 GenBank Accession No. NM_001908.4, NM_147780.3, NM_147781.3, NM_147782.3, 및 NM_147783.3 중 cathepsin B로 발현되는 부분인 서열번호 3, 또는 GenBank Accession No. NM_007798.3 중 cathepsin B로 발현되는 부분인 서열번호 4를 포함하는 것일 수 있다. 상기 BAG2 단백질은 서열번호 5 또는 6을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 pro-cathepsin B 단백질은 서열번호 7 또는 8을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 4를 포함하는 mRNA로부터 각각 서열번호 5 내지 8의 폴리펩티드로 번역될 수 있으나, 상기 서열번호 1 내지 4의 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열과 서열번호 5 내지 8의 아미노산 서열이 서로 일부 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖도록 하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 BAG2 또는 pro-cathepsin B를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 mRNA, 또는 BAG2 또는 pro-cathepsin B 폴리펩티드로 간주될 수 있다.
상기 BAG2 또는 pro-cathepsin B를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 1 또는 2, 및 서열번호 3 또는 4 중 어느 하나와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 BAG2 또는 pro-cathepsin B를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 상기 서열번호 1 또는 2, 및 서열번호 3 또는 4 중 어느 하나의 서열에서 1개 이상의 염기, 2개 이상의 염기, 3개 이상의 염기, 4개 이상의 염기, 5개 이상의 염기, 6개 이상의 염기 또는 7개 이상의 염기가 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 BAG2 또는 pro-cathepsin B 폴리펩티드는 각각 서열번호 5 또는 6, 및 서열번호 7 또는 8 중 어느 하나와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 BAG2 또는 pro-cathepsin B 폴리펩티드는 각각 상기 서열번호 5 또는 6, 및 서열번호 7 또는 8 중 어느 하나의 서열에서 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 스크리닝 방법은 상기 피검물질이 첨가된 시료에서 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편과 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편이 형성한 복합체를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 복합체의 검출은 당업계 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 시료는 세포 배양물일 수 있고, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 상기 시료 중 세포 내에 존재하는 것일 수 있다. 상기 세포는 개체의 조직을 이루는 세포를 의미하는 것일 수 있고, 상기 개체로부터 분리된 세포를 의미하는 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 정상 세포일 수 있으나, 다른 구체예에서 종양세포 또는 암세포일 수 있다. 따라서, 상기 '접촉'은 세포에 특정 물질이 상기 세포막 또는 세포벽에 결합하거나, 상기 세포 내로 주입되는 것을 의미하는 것으로서, 상기 접촉시키는 단계는 예를 들어, 상기 세포를 포함하는 배지에 첨가되거나, 상기 세포를 포함하는 조직에 직접 주입되거나, 또는 개체에 적용되는 경우 혈액에 주입하여 목적하는 상기 세포에 도달되도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포 내에 존재하는 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 내재적(endogenous), 외래적(exogenous) 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 외래적 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 세포 내로 도입된 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 것으로서, 상기 외래적 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 2를 포함하거나 그의 일부인 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4를 포함하거나 그의 일부인 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 외래적 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편을 세포 내에 발현시키기 위해, 종래에 당업계에 알려진 방법을 이용할 수 있고, 안정적 또는 일시적으로 세포 내에서 발현되도록 할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 세포 외에 존재하는 것일 수 있다. 세포 외에 존재하는 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 세포 또는 E.
coli
내에 과발현시킨 후 그 용해물로부터 단리된 것, 고체상 또는 액체상의 화학적 합성, 또는 고분자 펩티드 자동합성기를 이용하여 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드의 단편은 서열번호 7 또는 8 중 N-말단으로부터 1 내지 80번째의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, BAG2 단백질이 pro-cathepsin B 단백질 중 N-말단으로부터 1 내지 80번째의 프로펩티드 영역에 결합하여 성숙한 cathepsin B로서 활성화되는 것을 억제함이 확인되었으므로, pro-cathepsin B 단백질 중에서도 상기 프로펩티드 영역에 대한 BAG2 단백질의 결합을 억제하는 물질이 특히 항암제로서 이용가능한 후보물질이 될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질은 항암제일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항암제의 암은 유방암, 대장암, 폐암, 육종, 흑색종, 두경부암, 자궁경부암, 자궁암, 간암, 신장암, 췌장암, 및 신경아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
다른 양상은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는 이들의 조합을 포함하는 BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 스크리닝용 조성물은 세포 내 뿐만 아니라 세포 외에서도 BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 측정하는데 이용될 수 있으므로, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 더 포함하는 BAG2와 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 조성물은 세포 외에서 BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 측정하는데 더 유용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물의 BAG2 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물의 pro-cathepsin B 폴리펩티드 단편은 pro-cathepsin B 폴리펩티드의 서열번호 7 내지 8 중 1 내지 80번의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물에 의해 스크리닝된 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질은 항암제일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항암제의 암은 유방암, 대장암, 폐암, 육종, 흑색종, 두경부암, 자궁경부암, 자궁암, 간암, 신장암, 췌장암, 및 신경아세포종으로부터 선택된 것일 수 있다.
또 다른 양상은 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는 이들의 조합을 포함하는 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 키트를 제공한다.
용어 "항체"란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 BAG2 및 pro-cathepsin B 각각에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합을 의미하며, BAG2 또는 pro-cathepsin B 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 각 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 BAG2 또는 pro-cathepsin B 단백질로부터 당업계 통상적인 방법에 따라 각 단백질에 대해 특이적인 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함한다.
일 구체예에서, 상기 키트는 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝용 키트는 세포 외에서도 BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 측정하는데 이용될 수 있으므로, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 더 포함하는 BAG2와 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 키트는 세포 외에서 BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 측정하는데 더 유용할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 키트는 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝용 키트는 세포 내의 BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 측정하는데 이용될 수 있으므로, 상기 AG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 스크리닝용 키트는 세포 내, 또는 BAG2 또는 pro-cathepsin B를 발현하지 않거나 발현량이 적은 세포 내에서 BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 측정하는데 더 유용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝용 키트는 결합 정도를 측정하는데 요구되는 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 BAG2 또는 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물 또는 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 스크리닝 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 청구된 스크리닝 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 시료와 피검물질을 접촉시키는 단계; 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및상기 결합 정도가 대조군 시료와 비교하여 감소한 시료를 선별하는 단계를 포함하는, BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 이용하여 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질을 효율적으로 발굴할 수 있고, 결과적으로 유망한 항암제 후보물질을 효율적으로 개발하는데 기여할 수 있다.
다른 양상에 따른 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는 이들의 조합을 포함하는 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 조성물을 이용하여, 키트로 제작할 수 있고, 항암제 후보물질을 개발하는 산업체 등이 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 쉽게 이용가능 하도록 한다.
또 다른 양상에 따른 BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는 이들의 조합을 포함하는 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 키트를 이용하여 항암제 후보물질을 개발하는 산업체 등이 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 쉽게 이용가능 하도록 한다.
도 1은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusive chromatography)에 의한 CTSB(cathepsin B)의 크기 분포를 나타낸 것이다. (Pro, 전(pro)-형태: SC (single chain), 단쇄 형태; DC (double chain), 이중쇄 형태의 중쇄)
도 2는 BAG2 및 cathepsin B 사이의 상호작용 영역을 확인하기 위한 면역침강 (immunoprecipitation) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 세포로부터 단리된 세포질, 시토졸, 및 리소좀-고함량(rich) 분획의 면역 블롯 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4A는 대조군 세포 및 BAG2 결실 세포에서 크기 배제 크로마토그래피에 의한 CTSB의 크기 분포를 나타낸 것이고, 도 4B는 상기 크기 배제 크로마토그래피로부터 용리된 각 분획의 CTSB의 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5A는 BAG2 결실 세포에서 BAG2 회복에 따른 CTSB의 형태 변화를 나타낸 것이고, 도 5B는 상기 CTSB의 형태 변화에 따른 CTSB의 활성 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 BAG2 및 cathepsin B 사이의 상호작용 영역을 확인하기 위한 면역침강 (immunoprecipitation) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 세포로부터 단리된 세포질, 시토졸, 및 리소좀-고함량(rich) 분획의 면역 블롯 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4A는 대조군 세포 및 BAG2 결실 세포에서 크기 배제 크로마토그래피에 의한 CTSB의 크기 분포를 나타낸 것이고, 도 4B는 상기 크기 배제 크로마토그래피로부터 용리된 각 분획의 CTSB의 활성을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5A는 BAG2 결실 세포에서 BAG2 회복에 따른 CTSB의 형태 변화를 나타낸 것이고, 도 5B는 상기 CTSB의 형태 변화에 따른 CTSB의 활성 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
CTSB의
형태에 따른
BAG2와의
상호작용 확인
1-1.
CTSB의
형태 분석 및
BAG2와의
결합능
확인
CTSB 항체는 전-형태(pro-form) 및 성숙한 형태의 CTSB (SC(single chain) 및 DC(double chain))를 모두 인지하므로, CTSB의 형태에 따른 BAG2와의 상호작용을 파악하기 위해, CTSB의 형태의 분석이 가능한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적으로, 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포를 배양하여 용해시킨 세포 용해물을 크기 배제 크로마토그래피 (Bio-rad)를 이용하여 판매자의 지침에 따라 분획화하였다. 세포 용해물을 판매자의 지침에 따른 용액, 헤모글로빈 (65 kDa), 및 비타민 B12 (1.350 kDa)과 혼합한 다음 상이한 크기의 내려진 분획을 미세 구멍 비드(microscopic porous bead)를 포함하는 크로마토그래피 컬럼을 통해 수집하였다. 그런 다음 각 분획으로부터 동일한 부피의 시료를 채취하여 용리된 단백질을 SDS=폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 분리시키고, PVDF 막(Millipore)으로 이동시키고, 항-CTSB 및 항-BAG2를 이용하여 면역블롯함으로써 각 단백질을 검출하였다.
그 결과, BAG2 및 전-형태 CTSB가 같은 분획 (분획 5 및 6)에 존재하는 반면, SC 또는 DC 형태는 BAG2가 존재하는 분획에 함께 존재하지 않는 것으로 보였다 (도 1). 이는 BAG2 및 전-CTSB가 하나의 복합체를 형성하여 동시에 존재할 수도 있음을 의미한다.
1-2.
CTSB
중 구체적인 결합 위치의 확인
CTSB에서 BAG2가 구체적으로 결합하는 위치를 확인하기 위해, CTSB의 도메인을 상세히 구분한 후, 각 폴리펩티드에 따른 BAG2와의 결합 여부를 면역침강 분석 을 수행하였다.
먼저, Myc-tag BAG 발현 벡터 및 CTSB 각 영역을 발현시키는 GFP-결합된 결실 돌연변이 벡터로 293T 세포를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 판매자의 지침에 따라 공동-형질주입하였다. 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고 포스파타제 및 프로테아제 저해제 (Roche)를 포함하여 IP 완충액 (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100,0.5% 소디움 데옥시콜레이트, 2 mM EDTA 및 10% 글리세롤)으로 용해시켰다. 전체-세포 추출물을 항-Myc 항체, 항-β-액틴 항체, 및 항-GFP 항체와 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 항체가 결합된 단백질을 단백질 A/G 비드를 이용하여 판매자의 지침에 따라 침강시켰다. 상기 비드를 용해 완충액으로 세 번 세척하고 2 x SDS 샘플 로딩 완충액으로 용리시켰다. 용리된 단백질을 상기 실시예 1-1과 같이 도 2에 표시한 항체를 이용하여 면역블롯하여 검출하였다.
그 결과, 전-CTSB의 프로펩티드 영역에 BAG2가 특이적으로 결합하는 것으로 보였다 (도 2). 이러한 결과는 BAG2가 전-CTSB의 활성 여부를 조절하는 분열 과정에 관련된 프로펩티드 영역과 상호작용할 수 있음을 보여주며, 구체적으로는, 전-CTSB의 프로펩티드 영역이 전-CTSB를 SC CTSB로 전환시키기 위한 절단 영역을 포함하므로, BAG2가 전-CTSB로부터 성숙한 CTSB 형태인 SC CTSB 형태로 전환되는데 영향을 미칠 수 있음을 의미한다.
실시예
2.
CTSB의
형태에 따른 세포 사멸 활성 확인
2-1. 각
CTSB의
형태 존재 영역에 따른 세포 분할
리소좀의 CTSB는 적절한 리소좀 분열의 결과로 시토졸로 분비되어 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명자들은 등장성 수크로즈 또는 상이한 원심분리에 의해 BAG2-결실 세포로부터 단리된 세포질(cytoplasm), 시토졸(cytosol), 및 리소좀-고함량 분획을 이용하여 BAG2 상호 작용에 의한 CTSB의 이동 및 세포 사멸에 대한 효과를 평가하였다.
구체적으로, BAG2-결실 세포주를 제작하기 위하여 먼저 BAG2-특이적 shRNA를 Mission-shRNA (Sigma)으로부터 구매하였다. BAG2-특이적 shRNA 렌티 바이러스 제작을 위하여, 293T 세포를 pLKO-BAG2 또는 스크램블된 대조군 pLKO-pGL2를 Δ8.9 및 VSV-G를 코딩하는 패키징 플라스미드와 함께 형질주입시켰다. (사용된 BAG2 shRNA의 표적 서열 (5'→ 3'): GTACTAGGATCTAGCATATTT)
형질 주입 후 36 내지 48 시간 후 바이러스 상등액을 수집하고 0.45 ㎛ 여과기를 통해 여과하였다. MDA-MB-231 (ATCC)을 6웰 플레이트에 1 x 105 세포/웰로 접종(seed)하고 바이러스 입자(particle) 및 폴리브렌(8㎍/ml)으로 감염시켰다. 감염 후, 상기 바이러스를 함유하는 배지를 일반 베지로 교체한 다음 상기 세포를 푸로미신 (2㎍/ml)으로 선택하였다.
리소좀 단리는 조직 및 배양된 세포에 대한 lysosome enrichment kit(Thermo Scientific)를 이용하여 판매자의 지침에 따라 수행하였다. 대조군 및 BAG2-결실 MDA-MB-231 세포를 수확하여 3 분간 850 x g에서 원심 분리하였다. 상등액을 제거한 후, 펠렛을 lysosome enrichment reagent A로 재현탁시키고 2 분간 얼음 위에 두었다. 상기 세포를 얼음 위에서 Dounce tissue grinder로 파괴시키고, lysosome enrichment reagent B를 첨가하였다. 그런 다음 상기 세포를 4℃에서 10분 간 500 x g에서 원심 분리하고 상등액을 밀도 구배 상에 오버레이(overlay)시켜 4℃에서 4시간 동안 145,000 x g에서 추가적으로 울트라 원심 분리하였다. 울트라 원심 분리 후, 상기 농도 상위에 위치한 리소좀 밴드를 조심스럽게 제거하였다. 상기 시료를 3배 부피의 PBS로 희석시키고 4℃에서 1시간 동안 18,000 x g로 원심 분리시켰다. 상기 리소좀 펠렛을 얼음 위에 사용할 때까지 두었다. 그런 다음 상기 리소좀 펠렛을 SDS-PAGE 샘플 완충액와 끓이고 도 3에 표시된 바와 같은 항체를 이용하여 면역블롯으로 분석하였다.
시토졸의 단리는 상기 세포 균질화물을 1시간 동안 160,000 x g에서 원심분리시킨 다음 상등액 분획을 시토졸 분획으로서 수집하였고, 상기 리소좀 펠렛에 대해 수행된 것과 마찬가지로 면역블롯을 수행하였다.
그 결과, BAG2 결실은 리소좀으로부터 시토졸로 caspase-3 활성화와 함께 SC CTSB의 상당한 분비를 유도하여, SC CTSB의 시토졸로의 분비의 증가를 매개함으로써 세포사멸이 증진됨을 보였다 (도 3).
실시예
3.
BAG2의
CTSB의
형태 조절로 인한
CTSB
활성 조절 확인
3-1.
BAG2
과발현 여부에 따른
CTSB의
형태 변화 분석
BAG2가 CTSB에 미치는 영향을 보다 구체적으로 알아보기 위해 BAG2 과발현 여부에 따른 CTSB의 각 형태의 존재량 평가 및 상기 각 형태 따른 CTSB 활성 변화를 평가하고자 하였다. 이에 CTSB의 성숙한 SC 및 DC 형태 모두 일반적으로 단백질 가수분해적 활성을 갖는 것으로 생각되므로, 크기 배제 크로마토그래피로부터 수득된 분획을 이용하여 세포 내 CTSB의 활성을 시험하여 BAG2-결실 세포에서의 성숙한 CTSB의 활성 형태를 결정하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서의 대조군 및 BAG2-결실 MDA-MB-231 세포를 이용하여 상기 실시예 1-1과 동일하게 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여, 도 4A에 표시한 항체를 이용하여 면역블롯 하였다.
3-2.
CTSB의
형태에 따른 단백질
가수분해적
활성 평가
리소좀의 성숙한 CTSB의 단백질 가수분해적 활성은 caspase-3의 활성에서 중요한 역할을 하므로, 본 발명자들은 상기 수득된 각 분획에 대해 성숙한 CTSB의 기질 서열인 합성 Arg-Arg를 이용함으로써 SC CTSB의 활성을 시험하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-2에서의 분획을 형광형성 cathepsin B 기질(200 μM Ac-RR-AFC; Abcam)의 존재 중 37℃에서 1시간 동안 판매자의 지침에 따라 인큐베이션하였다. 형광 측정은 다중플레이트 검출기인 Wallac 1440 Victor2 (PerkinElmer) 상에서 수행하였고 상대적인 형광 유닛을 355 nm의 여기(excitation) 파장을 이용하여 460 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 4A 및 4B를 참조하면, 대조군 세포 중 분획 7 내지 8은 DC 형태가 검출되고 SC 형태가 관찰되는 분획 9 내지 11에 비해 낮은 CTSB 활성을 보였다. 이는 CTSB의 DC 형태가 SC 형태보다 덜 낮은 활성을 가짐을 의미한다. 이를 고려하여 BAG2-결실 세포의 분획을 관찰한 결과, BAG2-결실 세포의 분획에서 CTSB의 SC 형태가 대조군의 것보다 훨씬 더 많은 양이 발현됨을 알 수 있으며, 이와 일치하여 CTSB 활성 시험에서도 대조군에 비해 현저히 높은 CTSB 활성을 나타냄을 알 수 있다. 이는 BAG2가 caspase-3 매개된 세포사멸을 촉진시키는 CTSB의 성숙한 SC 형태의 세포 내 활성을 억제할 수 있음을 의미한다.
3-3.
BAG2
결실 세포에서의
CTSB의
활성 평가 및 그 회복
CTSB 활성 조절에 대한 BAG2의 역할을 보다 확실히 하기 위해 BAG2-결실 세포에서 증가하는 CTSB의 활성이 BAG2의 회복으로 인해 다시 감소하는지 여부를 알아보았다.
구체적으로, 상기 실시예 2-1에서와 같이 대조군 shRNA 또는 BAG2-특이적 shRNA에 의한 대조군 및 BAG2-결실 MCF10CA1a 세포를 제작하고, BAG2 발현 벡터를 실시예 1-2와 같이 형질주입하여 BAG2를 과발현 시키거나, BAG2-결실 MCF10CA1a 세포에 BAG2 발현을 회복시켰다.
그 결과, 도 5A 및 5B를 참조하면, 상기 결과들과 일치하여 BAG2-결실 MCF10CA1a 세포에 BAG2를 다시 도입한 결과 활성 Caspase-3의 발현 및 성숙한 SC CTSB의 발현을 BAG2-과발현 세포(BAG2 OV) 정도로 감소시킴을 보였다. BAG2 결실로 증가된 CTSB 활성 또한 BAG2-회복 세포에서는 현저히 약화되는 것으로 나타났다. 이는 BAG2가 성숙한 SC CTSB로의 CTSB 활성화 저해 및 순차적으로 caspase-3 매개된 세포사멸을 저해시킴으로서 종양 세포의 생존을 유지하도록 하는 것일 수 있음을 의미한다.
<110> AICT (ADVANCED INSTITUTES OF CONVERGENCE TECHNOLOGY)
<120> A method of screening materials for inhibition of interaction
between BAG2 and Cathepsin B
<130> PN115802
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 636
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggctcagg cgaagatcaa cgctaaagcc aacgaggggc gcttctgccg ctcctcctcc 60
atggctgacc gctccagccg cctgctggag agcctggacc agctggagct cagggttgaa 120
gctttgagag aagcagcaac tgctgttgag caagagaaag aaatccttct ggaaatgatc 180
cacagtatcc aaaatagcca ggacatgagg cagatcagtg acggagaaag agaagaatta 240
aatctgactg caaaccgttt gatgggaaga actctcaccg ttgaagtgtc agtagaaaca 300
attagaaacc cccagcagca agaatcccta aagcatgcca caaggattat tgatgaggtg 360
gtcaataagt ttctggatga tttgggaaat gccaagagtc atttaatgtc gctctacagt 420
gcatgttcat ctgaggtgcc acatgggcca gttgatcaga agtttcaatc catagtaatt 480
ggctgtgctc ttgaagatca gaagaaaatt aagagaagat tagagactct gcttagaaat 540
attgaaaact ctgacaaggc catcaagcta ttagagcatt ctaaaggagc tggttccaaa 600
actctgcaac aaaatgctga aagcagattc aattag 636
<210> 2
<211> 633
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 2
atggcccagg cgaagatcag cgccaaggcc cacgagggcc gcttctgccg ctcgtcttcc 60
atggccgacc gctccagccg cctgctggag agtctggacc agctggagct cagggtggaa 120
gctttgagag acgcagctac tgctgttgag caggagaaag aaatccttct ggagatgatc 180
cacagtatcc aaaacagcca ggacatgagg cagattagcg atggagaaag agaggaacta 240
aacctgactg ccaaccgtct gatgggccgg accctcacgg ttgaggtctc ggtggaaacg 300
atccgaaacc cccagcagga ggaatccttg aagcatgcca cgaggattat agacgaggtg 360
gtcagcaagt tcctagatga cctggggaat gccaagagcc acttaatgtc actttacagt 420
gcctgctcat cggaggtgcc gcctgggccg gtggaccaga agtttcaatc gatagtcatc 480
ggttgcgctc ttgaggatca gaagaaaatc aagaggcgat tggagactct gctgaggaac 540
attgacaact ccgacaaggc cattaaactc ctagagcatg ctaaaggagc tggttccaaa 600
agcctgcaga acactgacgg caaatttaat tag 633
<210> 3
<211> 1020
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgtggcagc tctgggcctc cctctgctgc ctgctggtgt tggccaatgc ccggagcagg 60
ccctctttcc atcccctgtc ggatgagctg gtcaactatg tcaacaaacg gaataccacg 120
tggcaggccg ggcacaactt ctacaacgtg gacatgagct acttgaagag gctatgtggt 180
accttcctgg gtgggcccaa gccaccccag agagttatgt ttaccgagga cctgaagctg 240
cctgcaagct tcgatgcacg ggaacaatgg ccacagtgtc ccaccatcaa agagatcaga 300
gaccagggct cctgtggctc ctgctgggcc ttcggggctg tggaagccat ctctgaccgg 360
atctgcatcc acaccaatgc gcacgtcagc gtggaggtgt cggcggagga cctgctcaca 420
tgctgtggca gcatgtgtgg ggacggctgt aatggtggct atcctgctga agcttggaac 480
ttctggacaa gaaaaggcct ggtttctggt ggcctctatg aatcccatgt agggtgcaga 540
ccgtactcca tccctccctg tgagcaccac gtcaacggct cccggccccc atgcacgggg 600
gagggagata cccccaagtg tagcaagatc tgtgagcctg gctacagccc gacctacaaa 660
caggacaagc actacggata caattcctac agcgtctcca atagcgagaa ggacatcatg 720
gccgagatct acaaaaacgg ccccgtggag ggagctttct ctgtgtattc ggacttcctg 780
ctctacaagt caggagtgta ccaacacgtc accggagaga tgatgggtgg ccatgccatc 840
cgcatcctgg gctggggagt ggagaatggc acaccctact ggctggttgc caactcctgg 900
aacactgact ggggtgacaa tggcttcttt aaaatactca gaggacagga tcactgtgga 960
atcgaatcag aagtggtggc tggaattcca cgcaccgatc agtactggga aaagatctaa 1020
1020
<210> 4
<211> 1020
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 4
atgtggtggt ccttgatcct tctttcttgc ctgctggcac tgaccagtgc ccatgacaag 60
ccttccttcc acccgctgtc ggatgacctg attaactata tcaacaaaca gaatacaaca 120
tggcaggctg gacgcaactt ctacaatgtt gacataagct atctgaagaa gctgtgtggc 180
actgtcctgg gtggacccaa actgccagga agggttgcgt tcggtgagga catagatcta 240
cctgaaacct ttgatgcacg ggaacaatgg tccaactgcc cgaccattgg acagattaga 300
gaccagggct cctgcggctc ttgttgggca tttggggcag tggaagccat ttctgaccga 360
acctgcattc acaccaatgg ccgagtcaac gtggaggtgt ctgctgaaga cctgcttact 420
tgctgtggta tccagtgtgg ggacggctgt aatggtggct atccctctgg agcatggagc 480
ttctggacaa aaaaaggcct ggtttcaggt ggagtctaca attctcatgt aggctgctta 540
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gaaggagata ctcccaggtg caacaagagc tgtgaagctg gctactcccc atcctacaaa 660
gaggataagc actttgggta cacttcctac agcgtgtcta acagtgtgaa ggagatcatg 720
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aaccttgact ggggtgataa tggcttcttt aaaatcctca gaggagagaa ccactgtggc 960
attgaatcag aaattgtggc tggaatccca cgcactgacc agtactgggg aagattctaa 1020
1020
<210> 5
<211> 211
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Ala Gln Ala Lys Ile Asn Ala Lys Ala Asn Glu Gly Arg Phe Cys
1 5 10 15
Arg Ser Ser Ser Met Ala Asp Arg Ser Ser Arg Leu Leu Glu Ser Leu
20 25 30
Asp Gln Leu Glu Leu Arg Val Glu Ala Leu Arg Glu Ala Ala Thr Ala
35 40 45
Val Glu Gln Glu Lys Glu Ile Leu Leu Glu Met Ile His Ser Ile Gln
50 55 60
Asn Ser Gln Asp Met Arg Gln Ile Ser Asp Gly Glu Arg Glu Glu Leu
65 70 75 80
Asn Leu Thr Ala Asn Arg Leu Met Gly Arg Thr Leu Thr Val Glu Val
85 90 95
Ser Val Glu Thr Ile Arg Asn Pro Gln Gln Gln Glu Ser Leu Lys His
100 105 110
Ala Thr Arg Ile Ile Asp Glu Val Val Asn Lys Phe Leu Asp Asp Leu
115 120 125
Gly Asn Ala Lys Ser His Leu Met Ser Leu Tyr Ser Ala Cys Ser Ser
130 135 140
Glu Val Pro His Gly Pro Val Asp Gln Lys Phe Gln Ser Ile Val Ile
145 150 155 160
Gly Cys Ala Leu Glu Asp Gln Lys Lys Ile Lys Arg Arg Leu Glu Thr
165 170 175
Leu Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ser Asp Lys Ala Ile Lys Leu Leu Glu
180 185 190
His Ser Lys Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu Gln Gln Asn Ala Glu Ser
195 200 205
Arg Phe Asn
210
<210> 6
<211> 210
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Met Ala Gln Ala Lys Ile Ser Ala Lys Ala His Glu Gly Arg Phe Cys
1 5 10 15
Arg Ser Ser Ser Met Ala Asp Arg Ser Ser Arg Leu Leu Glu Ser Leu
20 25 30
Asp Gln Leu Glu Leu Arg Val Glu Ala Leu Arg Asp Ala Ala Thr Ala
35 40 45
Val Glu Gln Glu Lys Glu Ile Leu Leu Glu Met Ile His Ser Ile Gln
50 55 60
Asn Ser Gln Asp Met Arg Gln Ile Ser Asp Gly Glu Arg Glu Glu Leu
65 70 75 80
Asn Leu Thr Ala Asn Arg Leu Met Gly Arg Thr Leu Thr Val Glu Val
85 90 95
Ser Val Glu Thr Ile Arg Asn Pro Gln Gln Glu Glu Ser Leu Lys His
100 105 110
Ala Thr Arg Ile Ile Asp Glu Val Val Ser Lys Phe Leu Asp Asp Leu
115 120 125
Gly Asn Ala Lys Ser His Leu Met Ser Leu Tyr Ser Ala Cys Ser Ser
130 135 140
Glu Val Pro Pro Gly Pro Val Asp Gln Lys Phe Gln Ser Ile Val Ile
145 150 155 160
Gly Cys Ala Leu Glu Asp Gln Lys Lys Ile Lys Arg Arg Leu Glu Thr
165 170 175
Leu Leu Arg Asn Ile Asp Asn Ser Asp Lys Ala Ile Lys Leu Leu Glu
180 185 190
His Ala Lys Gly Ala Gly Ser Lys Ser Leu Gln Asn Thr Asp Gly Lys
195 200 205
Phe Asn
210
<210> 7
<211> 339
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Trp Gln Leu Trp Ala Ser Leu Cys Cys Leu Leu Val Leu Ala Asn
1 5 10 15
Ala Arg Ser Arg Pro Ser Phe His Pro Leu Ser Asp Glu Leu Val Asn
20 25 30
Tyr Val Asn Lys Arg Asn Thr Thr Trp Gln Ala Gly His Asn Phe Tyr
35 40 45
Asn Val Asp Met Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Cys Gly Thr Phe Leu Gly
50 55 60
Gly Pro Lys Pro Pro Gln Arg Val Met Phe Thr Glu Asp Leu Lys Leu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Pro Gln Cys Pro Thr Ile
85 90 95
Lys Glu Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Gly
100 105 110
Ala Val Glu Ala Ile Ser Asp Arg Ile Cys Ile His Thr Asn Ala His
115 120 125
Val Ser Val Glu Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr Cys Cys Gly Ser
130 135 140
Met Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ala Glu Ala Trp Asn
145 150 155 160
Phe Trp Thr Arg Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu Tyr Glu Ser His
165 170 175
Val Gly Cys Arg Pro Tyr Ser Ile Pro Pro Cys Glu His His Val Asn
180 185 190
Gly Ser Arg Pro Pro Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr Pro Lys Cys Ser
195 200 205
Lys Ile Cys Glu Pro Gly Tyr Ser Pro Thr Tyr Lys Gln Asp Lys His
210 215 220
Tyr Gly Tyr Asn Ser Tyr Ser Val Ser Asn Ser Glu Lys Asp Ile Met
225 230 235 240
Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Ser Val Tyr
245 250 255
Ser Asp Phe Leu Leu Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Gln His Val Thr Gly
260 265 270
Glu Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val Glu
275 280 285
Asn Gly Thr Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp Asn Thr Asp Trp
290 295 300
Gly Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Arg Gly Gln Asp His Cys Gly
305 310 315 320
Ile Glu Ser Glu Val Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Gln Tyr Trp
325 330 335
Glu Lys Ile
<210> 8
<211> 339
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Met Trp Trp Ser Leu Ile Leu Leu Ser Cys Leu Leu Ala Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ala His Asp Lys Pro Ser Phe His Pro Leu Ser Asp Asp Leu Ile Asn
20 25 30
Tyr Ile Asn Lys Gln Asn Thr Thr Trp Gln Ala Gly Arg Asn Phe Tyr
35 40 45
Asn Val Asp Ile Ser Tyr Leu Lys Lys Leu Cys Gly Thr Val Leu Gly
50 55 60
Gly Pro Lys Leu Pro Gly Arg Val Ala Phe Gly Glu Asp Ile Asp Leu
65 70 75 80
Pro Glu Thr Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Ser Asn Cys Pro Thr Ile
85 90 95
Gly Gln Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Gly
100 105 110
Ala Val Glu Ala Ile Ser Asp Arg Thr Cys Ile His Thr Asn Gly Arg
115 120 125
Val Asn Val Glu Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr Cys Cys Gly Ile
130 135 140
Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ser Gly Ala Trp Ser
145 150 155 160
Phe Trp Thr Lys Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Val Tyr Asn Ser His
165 170 175
Val Gly Cys Leu Pro Tyr Thr Ile Pro Pro Cys Glu His His Val Asn
180 185 190
Gly Ser Arg Pro Pro Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr Pro Arg Cys Asn
195 200 205
Lys Ser Cys Glu Ala Gly Tyr Ser Pro Ser Tyr Lys Glu Asp Lys His
210 215 220
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225 230 235 240
Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Thr Val Phe
245 250 255
Ser Asp Phe Leu Thr Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Lys His Glu Ala Gly
260 265 270
Asp Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val Glu
275 280 285
Asn Gly Val Pro Tyr Trp Leu Ala Ala Asn Ser Trp Asn Leu Asp Trp
290 295 300
Gly Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Arg Gly Glu Asn His Cys Gly
305 310 315 320
Ile Glu Ser Glu Ile Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Gln Tyr Trp
325 330 335
Gly Arg Phe
Claims (18)
- BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 시료와 피검물질을 접촉시키는 단계;
상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
상기 결합 정도가 대조군 시료와 비교하여 감소한 시료를 선별하는 단계를 포함하는,
BAG2와 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 세포 배양물로서, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 세포 내에 존재하는 것인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 세포 내에 존재하는 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 내재적, 외래적 또는 이들의 조합인 것인 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 외래적 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 것으로서, 상기 외래적 BAG2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 2를 포함하는 것이고, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편은 세포 외에 존재하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 BAG2 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드의 단편은 서열번호 7 또는 8 중 N-말단으로부터 1 내지 80번째의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질은 항암제인 것인 스크리닝 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 항암제의 암은 유방암, 대장암, 폐암, 육종, 흑색종, 두경부암, 자궁경부암, 자궁암, 간암, 신장암, 췌장암, 및 신경아세포종으로부터 선택된 것인 방법.
- BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합;
pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는
이들의 조합을 포함하는 BAG2 및 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 조성물. - 청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 더 포함하는 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 BAG2 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 갖는 것이고, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 pro-cathepsin B 폴리펩티드 단편은 pro-cathepsin B 단백질의 서열번호 7 또는 8 중 1 내지 80번의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 BAG2 및 pro-cathepsin B의 결합을 억제하는 물질은 항암제인 것인 조성물.
- 청구항 14에 있어서, 상기 항암제의 암은 유방암, 대장암, 폐암, 육종, 흑색종, 두경부암, 자궁경부암, 자궁암, 간암, 신장암, 췌장암, 및 신경아세포종으로부터 선택된 것인 조성물.
- BAG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합;
pro-cathepsin B 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드, 또는 이들의 조합; 또는
이들의 조합을 포함하는 BAG2 및 pro-cathepsin B 간의 결합을 억제하는 물질의 스크리닝용 키트. - 청구항 16에 있어서, BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 더 포함하는 것인 키트.
- 청구항 16에 있어서, BAG2 및 pro-cathepsin B 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 더 포함하는 것인 키트.
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020170027775A KR102039624B1 (ko) | 2017-03-03 | 2017-03-03 | BAG2 및 Cathepsin B 상호결합 억제 물질 스크리닝 방법 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020165794A1 (en) * | 2019-02-12 | 2020-08-20 | Medpacto, Inc. | Anti-bag2 antibody and methods of treating cancer |
| KR20200098329A (ko) * | 2019-02-12 | 2020-08-20 | 주식회사 메드팩토 | Bag2 항체를 이용한 암 진단용 조성물 및 이를 이용한 방법 |
| KR20200098338A (ko) * | 2019-02-12 | 2020-08-20 | 주식회사 메드팩토 | Bag2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 |
| RU2815586C2 (ru) * | 2019-02-12 | 2024-03-19 | Медпакто, Инк. | Антитело к bag2 и способы лечения онкологического заболевания |
-
2017
- 2017-03-03 KR KR1020170027775A patent/KR102039624B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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| JP2022521706A (ja) * | 2019-02-12 | 2022-04-12 | メドパクト，インコーポレイテッド | 抗ｂａｇ２抗体および癌を治療する方法 |
| JP2022525843A (ja) * | 2019-02-12 | 2022-05-20 | メドパクト，インコーポレイテッド | 抗ｂａｇ２抗体を用いて癌を診断するための方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102039624B1 (ko) | 2019-11-01 |
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