CN117106040A - 一种转录调控因子BgaR的突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明以涉及一种新型的转录调控因子BgaR突变体，属于代谢工程领域。所述突变体是在来源于产气荚膜梭菌野生型BgaR的基础上发生P120L，I123V，S187N和Y226C突变获得的，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明首次利用BgaR作为生物传感器中的识别元件构建乳糖生物传感器，使乳糖浓度与菌株的生长情况偶联，用于测定/表征细胞中的乳糖含量；并对BgaR进行优化，获得对乳糖灵敏度更高，响应范围更宽的乳糖生物传感器，BgaR突变后对乳糖的响应范围由5‑10g/L增加到0‑12g/L，乳糖浓度为12g/L时，表达BgaR突变体菌株的生长情况明显优于表达野生型BgaR菌株，是野生型BgaR的3.3倍，对乳糖检测及乳糖生产菌株的筛选具有重要意义。
Description
技术领域：
本发明以一种新型的转录调控因子BgaR突变体及受其调控的启动子为研究对象，特别涉及所述突变体在代谢工程中调控基因表达和菌株筛选方面的应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
生物体内广泛存在转录调控因子，能够结合细胞内特定的化合物，发生构象变化，并结合在受其调控的基因的启动子特定部位，进而调控该基因的转录水平。生物传感器基于这一原理，将转录调控因子作为特定化合物的识别元件，使其能够响应胞内特定化合物浓度，并将其转化为易于识别的输出信号，通过检测输出信号的强弱，快速便捷获知胞内特定化合物浓度。例如，如果受转录调控因子调控的基因(下称报告基因)能够影响生物体特定的性状(如荧光强度、细胞生长状况等)，可通过特定化合物的浓度来调控生物体呈现的荧光强弱，或在抗生素存在时生物体生长的快慢，构建出一种能够响应特定化合物浓度的生物传感器，将其应用于突变菌株筛选中，以便在大量突变菌株中快速高效获得高产特定化合物的菌株。在生物传感器的另一种应用中，可将代谢途径中的相关基因作为受生物传感器调控的基因，通过特定化合物的浓度来调控相关基因的表达水平，从而控制代谢途径的强弱，用于代谢途径基因的动态调控等方面。
来源于产气荚膜梭菌的转录调控因子BgaR，属于AraC/XylS亚家族，能够响应细胞内乳糖，当存在乳糖时，乳糖作用于BgaR，使得BgaR与bgaL基因的启动子区PbgaL结合，启动bgaL基因(β-半乳糖苷酶)的转录。相关研究报道，将乳糖作为诱导剂，能够促进BgaR调控的PbgaL启动子下游β-葡萄糖醛酸酶基因表达，使β-葡萄糖醛酸酶表达活性提高2倍(APPLIEDAND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2011，77(No.2)，p.471–478)。
BgaR及其调控区目前仅作为乳糖诱导型启动子使用，未将其作为生物传感器进行应用。并且，在利用生物传感器对突变菌株进行筛选时，转录调控因子对特定化合物的灵敏度(特定化合物浓度变化导致的输出信号的差值)和响应范围(能够使输出信号处于最低值和最高值的特定化合物的最小浓度范围)等直接影响生物传感器的效率，改造优化转录调控因子的结构能够提高生物传感器的效率。目前尚无对BgaR进行改造优化的报道。因此，利用产气荚膜梭菌来源的BgaR及其调控区构建生物传感器，有可能构建出受乳糖诱导的生物传感器；另外，对BgaR优化改造，构建出更高效的乳糖生物传感器，对于相关代谢工程调控和菌株筛选具有重要意义。
发明内容：
为解决上述问题，本发明利用转录因子BgaR构建了一种乳糖生物传感器，并对BgaR进行改造，获得了一种对乳糖响应更灵敏，响应范围更宽的BgaR突变体，可以在乳糖生产菌株以及利用乳糖合成高附加值化合物的菌株的筛选中发挥更加有效的作用。
本发明提供的技术方案之一，是一种转录调控因子BgaR的突变体，是在来源于产气荚膜梭菌野生型BgaR的基础上发生P120L，I123V，S187N和Y226C突变获得的，具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，命名为BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C，相对于野生型BgaR，BgaRP120L ,I123V,S187N,Y226C受乳糖诱导后提高PbgaL转录起始水平，可通过调控乳糖的浓度，更加高效地调控其下游基因的表达。
本发明提供的技术方案之二，是BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C的编码基因，具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
本发明提供的技术方案之三，是转录调控因子BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C的应用，特别是在检测乳糖浓度或筛选乳糖生产菌株中的应用，更特别地是在构建检测乳糖的生物传感器中的应用。
本发明提到的技术方案之四，是一种生物传感器，所述生物传感器包含BgaRP120L ,I123V,S187N,Y226C编码基因、启动子PbgaL，以及指示基因；
进一步地，所述启动子PbgaL，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
进一步地，所述指示基因包括但不限于荧光蛋白编码基因、抗性基因等；
进一步地，所述荧光蛋白包括但不限于黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等；
进一步地，所述抗性基因包括但不限于四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等；
优选地，所述生物传感器包含BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C编码基因、启动子PbgaL，以及四环素抗性基因tetA，并将上述基因在质粒pSB4K5或质粒pSB4K5-I52002上表达；
进一步地，所述四环素抗性基因tetA具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
进一步地，所述质粒pSB4K5-I52002的GenBank编号为：EU496099.1；
进一步地，所述质粒pSB4K5以pSB4K5-I52002质粒为模板，使用引物k5-fp-f和k5-fp-r，PCR扩增得到的线性pSB4K5载体；
所述k5-fp-f序列：CGGGCCACCTCGACCTGAAACCCTTCTCACCTCGGCCGATAAG；
所述k5-fp-r序列：TAAATAAACCAAGTATTTAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGT。
本发明提到的技术方案之五，是技术方案四所述生物传感器的应用，特别是在检测乳糖，或在乳糖生产菌株筛选中的应用。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用单字母或三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.BgaR突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示BgaR突变体中突变的氨基酸。如P120L，表示位置120的氨基酸由野生型BgaR的P替换成L，位置的编号对应于SEQ ID NO.5中野生型BgaR的氨基酸序列编号。具体信息如下表：
有益效果：
本发明通过对BgaR进行点突变获得BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C突变体，在菌株中分别利用野生型和突变型BgaR调控PbgaL启动子下游四环素抗性基因的表达，构建传感器。对菌株进行四环素耐受和乳糖诱导测试，检测在四环素存在下，添加不同浓度乳糖后菌株的生长情况，以菌株生长作为对乳糖的响应。结果发现，当四环素浓度为20μg/mL时，BgaR突变后对乳糖的响应范围由5-10g/L增加到0-12g/L。四环素浓度为20μg/mL，乳糖浓度为12g/L时，表达BgaR突变体传感器菌株生长12h后的菌体密度OD600为0.83±0.01，明显优于表达野生型BgaR传感器菌株的生长水平(OD600为0.25±0.01)，是表达野生型BgaR传感器菌株菌体密度的3.3倍，表明含有BgaR突变体的生物传感器对乳糖的灵敏度更高、响应范围更宽，证明了突变后的BgaR在乳糖检测及乳糖生产菌株筛选方面的优越性。
本发明首次利用BgaR作为生物传感器中的识别元件构建乳糖生物传感器，使乳糖浓度与菌株的生长情况偶联，用于测定/表征细胞中的乳糖含量；并对BgaR进行了突变优化，获得对乳糖灵敏度更高，响应范围更宽的乳糖生物传感器，对乳糖检测及乳糖生产菌株的筛选具有重要意义。
附图说明：
图1质粒p1示意图。
图2质粒p2示意图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
来源于产气荚膜梭菌的转录调控因子BgaR结合乳糖后，发生构象变化，进而调控下游启动子PbgaL的转录能力。因此，将BgaR作为乳糖识别元件、受其调控的启动子PbgaL作为调控元件、抗性基因作为报告基因构建一种响应乳糖的生物传感器。
本发明在质粒pSB4K5-I52002(GenBank：EU496099.1)或pSB4K5中整合转录调控因子BgaR(GenBank：989029，核苷酸序列SEQ ID NO.5，氨基酸序列SEQ ID NO.6)及受其调控的启动子PbgaL(核苷酸序列SEQ ID NO.3)和四环素抗性基因tetA(核苷酸序列SEQ IDNO.4)，构建出能够响应乳糖的生物传感器，随后将BgaR进行点突变，获得带有BgaRP120L ,I123V,S187N,Y226C(氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列SEQ ID NO.2)的乳糖生物传感器，将乳糖生物传感器转化到敲除乳糖分解基因(β-半乳糖苷酶基因，lacZ)的大肠杆菌菌株中进行功能验证。
首先，通过在不含乳糖的培养体系中外加不同浓度的四环素，测定菌株生长情况，考察乳糖生物传感器中启动子PbgaL的本底表达对菌株耐受四环素水平的影响；其次，在含有能够抑制菌株生长的四环素的培养体系中加入不同浓度乳糖测定菌株生长情况，考察该传感器对乳糖响应的灵敏度和响应范围。结果显示，四环素浓度为20μg/mL时，BgaR突变后对乳糖的响应范围由5-10g/L增加到0-12g/L。四环素浓度为20μg/mL，乳糖浓度为12g/L时，表达BgaR突变体传感器菌株的生长情况(OD600为0.83±0.01)明显优于表达野生型BgaR传感器菌株(OD600为0.25±0.01)，是野生型BgaR的3.3倍，表明含有BgaR突变体的生物传感器对乳糖的灵敏度更高、响应范围更宽，证明了突变后的BgaR在乳糖生产菌株筛选方面的优越性。
本发明及实施例主要培养基和抗生素如下：
(1)LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L，其余为水。
(2)卡那霉素配置成50g/L，乳糖配制成250g/L，四环素配制成40g/L的母液，根据需要进行添加。
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：质粒p1的构建
以pSB4K5-I52002质粒为模板，使用引物k5-fp-f和k5-fp-r，PCR扩增得到线性pSB4K5载体，PCR扩增体系为：19μL无菌水、2μL k5-fp-f、2μL k5-fp-r、2μL pSB4K5-I52002质粒和25μL PrimeSTAR(TaKaRa)，扩增条件为：98℃2min，(98℃10s，55℃15s，72℃，20s，30个循环)，72℃10min，4℃。
产气荚膜梭菌strain 13(NCBI accession number：BA000016.3)中编码转录因子BgaR基因(SEQ ID NO.6)及其启动子PbgaL(SEQ ID NO.3)进行基因合成，用引物bgaR-f和bgaR-r扩增出包含bgaR和PbgaL的bgaR-PbgaL片段；以pDM1质粒(NCBI accession number：MN128719.1)为模板，用引物tet-F和tet-R，PCR扩增出四环素抗性片段。将上述片段进行纯化回收，利用全式金公司无缝克隆酶(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit)，将载体pSB4K5线性片段、四环素抗性基因片段和bgaR-PbgaL片段进行同源重组连接，转化到E.coli Trans1-T1感受态中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板中，在37℃条件下培养12h，挑出转化子进行测序验证，获得含有正确片段的重组质粒pSB4K5-bgaR-PbgaL-tetA，简称为质粒p1，质粒示意图如图1所示。
表1构建质粒p1所用引物
| 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| k5-fp-f | CGGGCCACCTCGACCTGAAACCCTTCTCACCTCGGCCGATAAG |
| k5-fp-r | TAAATAAACCAAGTATTTAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGT |
| bgaR-f | AGCGCATTGTTAGATTTCATTTTACCCTCCCAATAC |
| bgaR-r | TTAAATACTTGGTTTATTTAC |
| tet-F | ATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTC |
| tet-R | TCAGGTCGAGGTGGCCCG |
实施例2：质粒p2的构建
设计BgaR上P120和I123位点的突变引物TB1-F、TB1-R；S187位点的突变引物TB2-F、TB2-R；Y226位点的突变引物TB3-F、TB3-R。以质粒p1为模板进行突变，获得表达含有P120L，I123V，S187N和Y226C四个突变位点的BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C的质粒，简称p2。具体如下：
以上述质粒p1为模板，以表2中引物TB1-F、TB1-R，PCR扩增，纯化回收。将上述回收产物通过全式金公司无缝克隆酶(pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit)进行同源重组连接，转化到E.coli Trans1-T1感受态中，涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，在37℃条件下培养12h，获得表达含有P120L，I123V突变位点BgaR的质粒pSB4K5-bgaRP120L,I123V-PbgaL-tetA。以上述突变质粒为模板，继续利用引物TB2-F、TB2-R扩增，片段纯化回收、无缝克隆酶连接，转化感受态细胞后挑选正确转化子，获得表达含有S187N突变位点BgaR的质粒pSB4K5-bgaRP120L,I123V,S187N-PbgaL-tetA。再以上述突变质粒为模板，继续利用引物TB3-F、TB3-R扩增，片段纯化回收、无缝克隆酶连接，转化感受态细胞后挑选正确转化子，获得表达含有P120L，I123V，S187N和Y226C四个突变位点BgaR的质粒pSB4K5-bgaRP120L ,I123V,S187N,Y226C-PbgaL-tetA，简称质粒p2，质粒图谱如图2所示。
表2构建质粒p2所用引物
实施例3：乳糖生物传感器功能的测定
1、构建敲除lacI-lacZ的大肠杆菌重组菌株
大肠杆菌E.coli K12 MG1655(GeneBank accession NO.NC_000913.3)中的乳糖操纵子能将乳糖转运至胞内分解代谢，为防止宿主菌将乳糖分解，利用CRISPR/Cas9技术将lacI-lacZ敲除，因乳糖操纵子中的启动子在lacI-lacZ之间，为使下游基因lacY正常表达，在原lacI-lacZ位点构建Ptrc启动子以过表达lacY，发挥乳糖转运的功能，获得能将乳糖转运至胞内而不被分解代谢的宿主菌。
实验中所用的CRISPR/Cas9技术参考前期的研究报道(Zhao D,et al.CRISPR/Cas9-assisted gRNA-free one-step genome editing with no sequence limitationsand improved targeting efficiency.Sci Rep 7,16624)。首先，构建第一步同源重组片段，包含上下游同源臂、Ptrc启动子序列、氯霉素抗性基因cat和通用的N20序列(TAGTCCATCGAACCGAAGTAAGG)，将第一步同源重组片段通过电转化导入含有pCAGO质粒的大肠杆菌E.coli K12 MG1655中，进行第一步重组，pCAGO质粒含有重组酶基因，以及cas9和gRNA基因等。挑选正确克隆，进行第二次同源重组。挑取第二次同源重组后的正确克隆，通过传代培养丢失pCAGO质粒，从而获得敲除lacI-lacZ并过表达了lacY的重组菌株。
具体方法如下：
1、同源重组片段的构建。以大肠杆菌E.coli K12 MG1655基因组为模板，用表3中的引物up-f和up-r、down-f和down-r，PCR扩增同源重组的上、下游同源臂。以pTrc99a质粒(GenBank:U13872)为模板，利用引物Ptrc-f和Ptrc-r进行PCR扩增，获得启动子Ptrc序列片段。以人工合成的含有氯霉素抗性基因cat、cat启动子和N20序列载体为模板，利用引物cm-f和cm-r进行PCR扩增，获得带有cat-N20序列片段。以四个片段，包括上下游同源臂、cat-N20序列片段、Ptrc序列片段，通过重叠PCR得到同源重组片段。
2、第一步同源重组。制备大肠杆菌MG1655化学转化感受态细胞并将质粒pCAGO转化到菌株中。利用含有1％(w/v)葡萄糖和0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的LB培养基制备感受态，利用电转化方法导入同源重组片段，涂布于含有1％(w/v)葡萄糖、100mg/mL氨苄霉素和25mg/mL氯霉素的LB平板上，在30℃条件下培养，挑取转化子进行菌落PCR鉴定。
3、第二步同源重组。将第一步同源重组正确的菌株接种于含有100mg/mL氨苄霉素、0.1mM IPTG和2g/L阿拉伯糖的LB液体培养基中，在30℃条件下培养，在含有100mg/mL氨苄霉素的LB平板中划线分离单菌落，挑选出能在100mg/mL氨苄霉素LB平板中生长，但不能在含有25mg/mL氯霉素的LB平板中生长的单克隆，进行菌落PCR验证。挑取正确克隆在37℃条件下传代培养，丢失pCAGO质粒，从而获得敲除了lacI-lacZ，并过表达lacY的菌株。
表3敲除lacI-lacZ基因所用引物
2、随后将构建的质粒p1和质粒p2分别导入步骤1敲除了lacI-lacZ基因(SEQ IDNO.7)并在原lacI-lacZ位点用Ptrc启动子(SEQ ID NO.8)过表达lacY的大肠杆菌E.coliK12 MG1655中，获得菌株A和菌株B。
将菌株A和菌株B分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB试管中，37℃，220rpm培养12h，按照接种量1％(v/v)分别接种于含有10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL四环素的LB培养基中，上述LB培养基中同时含有10g/L乳糖作为实验组，含有0g/L乳糖作为对照组，在37℃条件下培养12h，吸取100μL，通过酶标仪进行OD600检测分析，生长情况如表4所示。
可知，未添加乳糖时，四环素浓度为10μg/mL，菌株A和菌株B均能生长(OD600＞0.4)，而四环素浓度高于20μg/mL，菌株A和菌株B生长受抑制(OD600＜0.2)；在添加10g/L乳糖，四环素浓度为10μg/mL条件下，菌株A和菌株B的OD600值均高于1.0，生长情况较未添加乳糖时明显改善，四环素浓度为20μg/mL时，菌株B的生长状况(OD600为0.73±0.01)明显好于菌株A(OD600为0.25±0.00)，四环素浓度为30μg/mL时，菌株A仍无法生长，而菌株B能快速生长，OD600为0.69±0.03。相比A菌株，菌株B抵抗四环素浓度有了显著性提高。
以上结果表明，未添加乳糖时，菌株A和菌株B能在含有较低浓度的四环素条件下生长，表明该传感器具有本底表达。若选择较低抗性浓度对突变菌株进行筛选，各菌株的生长状况不易区分，而使用更高浓度的抗性抑制菌株生长，可排除本底表达的影响，提高筛选的有效性。随后，在更高浓度的四环素中添加乳糖，菌株A依然无法生长，菌株B生长状况良好，可见BgaR突变后提高了报告基因的转录水平，使菌株对四环素的耐受性提高，表明BgaR突变体对乳糖响应的灵敏度优于野生型BgaR。因此，后续以四环素浓度20μg/mL为例，对乳糖生物传感器的响应范围进行测定。
表4菌株A、B在不同浓度四环素和乳糖存在下的生长水平
实施例4：乳糖生物传感器的响应范围的测定
将菌株A和菌株B分别接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB试管中，在37℃，220rpm条件下培养12h，按照接种量1％(v/v)分别接种于含有0g/L、1g/L、2g/L、5g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L乳糖的LB培养基中，并含有20μg/mL四环素，在37℃条件下培养12h，吸取100μL，通过酶标仪进行OD600检测分析，生长情况如表5所示。
不添加乳糖时，培养12h后，菌株A和菌株B均不能生长；添加乳糖时，菌株B的生长情况明显优于菌株A，菌株A在乳糖浓度为5-10g/L范围内有生长差异，而菌株B在乳糖浓度为0-12g/L范围内均有明显的生长差异。当乳糖浓度为12g/L时，菌株B的OD600值为0.83±0.01，菌株A的OD600值为0.25±0.00，表明BgaR突变后使菌株对四环素的耐受性提高，是野生型的3.3倍。
在所测试条件下，表达野生型BgaR的菌株A生长差异不明显，而表达BgaR突变体的菌株B生长情况有明显差异，且与乳糖浓度成正比。以上结果表明，BgaR突变后对乳糖的响应范围由5-10g/L增加到0-12g/L；在不同浓度乳糖的作用下，菌株生长情况具有差异，以乳糖浓度由5g/L增加到8g/L为例，菌株A的OD600差值为0.2-0.17＝0.03，菌株B的OD600差值为0.54-0.44＝0.1，输出差值更大了，说明灵敏度提高了。
因此，含有BgaR突变体的乳糖生物传感器对乳糖的灵敏度更高、响应范围更宽，且呈线性检测关系，能够更好的应用于乳糖检测。
表5乳糖生物传感器输出信号差异
本申请中的使用的四环素抗性基因，只是用作验证BgaR及其突变体BgaRP120L ,I123V,S187N,Y226C受乳糖诱导调控基因表达的一个例子，具有相关知识背景的研究人员很容易知道，这种诱导与所测试的基因无关，因此，在代谢工程，高通量筛选等实际应用中，可以根据具体需求，将四环素抗性基因替换为其它基因后，例如氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等，也具有同样的效果。
本发明涉及的部分序列如下：
突变体BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MQILWKKYVKENFEMNVDECGIEQGIPGLGYNYEVLKNAVIHYVTKGYGTFKFNGKVYNLKQGDIFILLKGMQVEYVASIDDPWEYYWIGFSGSNANEYLNRTSITNSCVANCEENSKILQIVLNMCEISKTYNPSRSDDILLLKELYSLLYALIEEFPKPFEYKDKELHTYIQDALNFINSNYMHNITVQEIADYVNLSRSYLYKMFIKNLGISPQRYLINLRMCKATLLLKSTKLPIGEVASSVGYSDSLLFSKTFSKHFSMSPLNYRNNQVNKPSI*
突变体BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C，核苷酸序列SEQ ID NO.2所示、：ATGCAAATATTGTGGAAAAAGTATGTTAAAGAAAACTTTGAAATGAATGTAGATGAATGTGGTATAGAACAAGGTATACCAGGATTAGGATATAACTATGAAGTATTGAAAAATGCTGTTATTCATTACGTAACTAAGGGATATGGAACTTTTAAATTTAATGGTAAGGTATATAACTTAAAACAAGGTGATATTTTTATACTACTAAAAGGTATGCAAGTTGAGTATGTGGCTTCTATTGATGATCCTTGGGAATACTACTGGATAGGATTTAGTGGTTCAAATGCTAATGAGTATTTAAATAGAACTTCTATTACTAACTCCTGTGTTGCTAATTGTGAAGAAAACTCAAAAATTCTACAGATAGTTTTAAATATGTGCGAAATATCAAAAACTTATAATCCTTCAAGATCTGATGACATACTATTACTAAAAGAACTTTACTCATTATTGTACGCACTTATAGAAGAATTCCCAAAACCTTTTGAATACAAAGATAAGGAATTACACACATATATTCAAGATGCTCTTAATTTCATTAATTCTAATTACATGCATAACATAACTGTTCAAGAAATTGCTGATTATGTGAACTTAAGTAGAAGTTATTTATATAAAATGTTCATAAAAAACCTTGGAATTTCTCCTCAAAGATATTTAATAAACCTTAGAATGTGCAAAGCCACCCTTTTATTAAAAAGCACTAAACTTCCTATAGGAGAAGTCGCAAGTAGTGTAGGTTATAGTGACTCCCTGTTATTTTCAAAAACTTTTTCAAAACATTTTTCAATGTCTCCACTAAATTACAGAAATAATCAAGTAAATAAACCAAGTATATAA
启动子PbgaL，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
TTTACCCTCCCAATACATTTAAAATAATTATGTATTCATGAAACATGATTGTATATTTAAGA
AACATAATTCCATATAAATCATTTTTCAAAATAGTTTTTACCCATAATTAAATGTTAATATGT
AAATTAATCTTTTAGAATAGTTAAAAAGTTCTAAAATATGTTATAATGTTTCTTATAATCTT
ATAAATTTTAATAACTAATATATAAAGATATTTCTTTAAAATATTCTTATATTTAGAAGAATT
TATTTTAAAATAAAAAGCTTTTATGTTGATAAACTGCTTTGCAAAGCTCTCATGTAAATGT
TTAATATAAGACTACTATAAAATTGGCTAATTTTATAGGTTAGGAGGTAGAA
四环素抗性基因tetA，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
ATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGC
ATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGC
ATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCAC
CCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTA
CTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTAC
GCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATAT
CGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTT
TCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTG
CATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTT
CCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACC
CAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCT
TCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAG
GACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTG
CACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGC
AGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCG
ACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATG
CCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCA
AGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGG
CGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCC
CTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGAC
CTGA
野生型BgaR，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：
MQILWKKYVKENFEMNVDECGIEQGIPGLGYNYEVLKNAVIHYVTKGYGTFKFNGKVYN
LKQGDIFILLKGMQVEYVASIDDPWEYYWIGFSGSNANEYLNRTSITNSCVANCEENSKIPQI
ILNMCEISKTYNPSRSDDILLLKELYSLLYALIEEFPKPFEYKDKELHTYIQDALNFINSNYMH
SITVQEIADYVNLSRSYLYKMFIKNLGISPQRYLINLRMYKATLLLKSTKLPIGEVASSVGYSDSLLFSKTFSKHFSMSPLNYRNNQVNKPSI*
野生型BgaR，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
ATGCAAATATTGTGGAAAAAGTATGTTAAAGAAAACTTTGAAATGAATGTAGATGAATGT
GGTATAGAACAAGGTATACCAGGATTAGGATATAACTATGAAGTATTGAAAAATGCTGTTA
TTCATTACGTAACTAAGGGATATGGAACTTTTAAATTTAATGGTAAGGTATATAACTTAAA
ACAAGGTGATATTTTTATACTACTAAAAGGTATGCAAGTTGAGTATGTGGCTTCTATTGAT
GATCCTTGGGAATACTACTGGATAGGATTTAGTGGTTCAAATGCTAATGAGTATTTAAATA
GAACTTCTATTACTAACTCCTGTGTTGCTAATTGTGAAGAAAACTCAAAAATTCCACAGA
TAATATTAAATATGTGCGAAATATCAAAAACTTATAATCCTTCAAGATCTGATGACATACTA
TTACTAAAAGAACTTTACTCATTATTGTACGCACTTATAGAAGAATTCCCAAAACCTTTTG
AATACAAAGATAAGGAATTACACACATATATTCAAGATGCTCTTAATTTCATTAATTCTAAT
TACATGCATAGCATAACTGTTCAAGAAATTGCTGATTATGTGAACTTAAGTAGAAGTTATT
TATATAAAATGTTCATAAAAAACCTTGGAATTTCTCCTCAAAGATATTTAATAAACCTTAG
AATGTACAAAGCCACCCTTTTATTAAAAAGCACTAAACTTCCTATAGGAGAAGTCGCAA
GTAGTGTAGGTTATAGTGACTCCCTGTTATTTTCAAAAACTTTTTCAAAACATTTTTCAAT
GTCTCCACTAAATTACAGAAATAATCAAGTAAATAAACCAAGTATATAA
lacI-lacZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
GCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTT
ATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCA
GGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCT
GAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTG
GCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAA
TCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCG
TCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATC
ATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTT
CCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATG
AAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGC
GCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAA
ATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCA
TGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATG
CTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCT
GCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTA
TATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGG
ACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTC
TCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCG
CGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAG
TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTT
TATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAA
CAGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAA
ACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTA
ATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAA
TGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCG
ATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATG
CGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGG
AGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAA
GGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGG
CGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATT
TTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGT
TATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTG
CATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCA
GCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGG
GTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGG
CGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGT
CGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAAC
TGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGA
GGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCG
TTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTG
CAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCG
AACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGC
CAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCT
ACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGT
GTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTA
TCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCG
ACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCC
TTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCG
CCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAA
ATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGT
GGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTG
ATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACC
GCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCG
TTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGA
GCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTC
TGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAG
AGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGT
CAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGT
GACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTT
GCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGA
TGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCA
CCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGT
CGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACG
GCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGG
GAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGAT
TACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACT
GCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAA
CTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACAT
GTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGA
ATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAA
CAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGC
TGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTAT
CGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAA
TAATAATAACCGGGCAGGCCATGTCTGCCCGTATTTCGCGTAAGGAAATCCATT
Ptrc启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
ATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTAT
GGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTG
GATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTG
ACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGA。
Claims (10)
1.一种转录调控因子BgaR的突变体，其特征在于，是在来源于产气荚膜梭菌野生型BgaR的基础上发生P120L，I123V，S187N和Y226C突变获得的，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，命名为BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C。
2.权利要求1所述转录调控因子BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述转录调控因子BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C或权利要求2所述编码基因的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，是在检测乳糖或筛选乳糖生产菌株中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，是在构建检测乳糖的生物传感器中的应用。
7.一种生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包含BgaRP120L,I123V,S187N,Y226C编码基因、启动子PbgaL，以及指示基因。
8.如权利要求7所述的一种生物传感器，其特征在于，所述指示基因包括荧光蛋白编码基因或抗性基因；
所述荧光蛋白包括黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白；
所述抗性基因包括四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因。
9.如权利要求7所述的一种生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包含BgaRP120L ,I123V,S187N,Y226C编码基因、启动子PbgaL，以及四环素抗性基因tetA，并将上述基因在质粒pSB4K5或质粒pSB4K5-I52002上表达所得；
所述启动子PbgaL，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述四环素抗性基因tetA，具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
10.权利要求7-9任意一项所述生物传感器的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310830437.7A CN117106040A (zh) | 2023-07-06 | 2023-07-06 | 一种转录调控因子BgaR的突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117106040A true CN117106040A (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=88799124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117106040A (zh) |
-
2023
- 2023-07-06 CN CN202310830437.7A patent/CN117106040A/zh active Pending
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