CN103421876A - 抗菌化合物高通量筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽医微生物学和兽药学技术领域。具体涉及一种抗菌化合物高通量筛选方法及应用。以对6种抗生素有抗性的胸膜肺炎放线杆菌分离株HB0503作为靶标菌，以四环素为阳性对照，利用不透明的96孔板为筛选载体，用化学发光法测定活细菌数，鉴定化合物的抗菌效果。根据高通量筛选方法质量判定标准，分别计算了细菌比浊法、化学发光法，确定化学发光法为优选方案，鉴定出八种化合物对胸膜肺炎放线杆菌耐药菌株具有抑制活性，其中四种化合物对副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪链球菌2型和金黄色葡萄球菌也具有较好的抑菌活性。

Description

抗菌化合物高通量筛选方法及应用

技术领域

本发明属于兽医微生物学和兽药学技术领域。具体涉及抗菌化合物高通量筛选方法及应用，本发明筛选得到一些具有抗菌活性的化合物。

背景技术

随着抗生素的滥用，细菌耐药性的现象越来越严重，近年来，细菌耐药性的发展速度已超过了新药的研发速度(David ML.Discovery research：the scientific challenge of finding newantibiotics.J Antimicrob Chemother，2011，66(9)：1941-1944)，多重耐药现象日益严重(DonadioS，Carrano L，Brandi L，Serina S，Soffientini A，Raimondi E，Montanini N，Sosio M，Gualerzi CO.Targets and assays for discovering novel antibacterial agents.J Biotechnol，2002，99：175-185；Walsh FM，Amyes SG.Microbiology and drug resistance mechanisms of fully resistant pathogens.Curr Opin Microbiol，2004，7：439-444)，严重威胁着人类的健康和畜牧业的发展。因此，新药的研发及其研发手段的创新具有重大意义。随着基因组时代的迅速发展，研发者将新抗菌药物的发现寄望于全基因组测序和药物靶标的预测上，但很多新的靶标抑制剂在体外针对特定靶点的实验中表现出很高的活性，但是在整个病原体细胞的检测中却不显示抑制活性(RichardLM and John FB.Antibacterial drug discovery-Then，now and the genomics future.Biochemicalpharmacology，2006，71：901-909)。针对单一靶标的传统开发模式正在受到严峻挑战，而行之有效的解决办法之一是利用全菌细胞代替单一的靶点作为筛选载体，得到的先导化合物具有直接的抗菌活性，且因为可能针对细菌上的多个靶标而不易使细菌产生耐药性。

目前，结构生物学，组合化学等新技术的应用，以及组合化学与计算机辅助设计的结合，加速了合成化合物的合成速度，增加了化合物库的容量，大量天然物质中也存在很多潜在的抗菌活性物质，筛选的速度也成了药物研发的瓶颈之一，因此高通量的筛选方法(Highthroughput screening，HTS)显得越来越重要。HTS以分子水平或细胞水平的实验方法为基础，以96孔板或384孔板等微板形式作为实验工具的载体，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，用计算机对实验数据进行分析，同一时间能够检测数以千万的样品(Macarron R.Critical reviewof the role of HTS in drug discovery.Drug Discov Today，2006，11(7-8)：277-279)。计算机、分子生物学、组合化学的发展以及基于荧光、化学发光、放射性检测技术的应用，都推动了HTS技术的应用和发展。

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起猪传染性胸膜肺炎(PorcineContagious pleuropneumonia)，对全世界和我国的养猪业都造成了严重了的经济损失。而用该胸膜肺炎放线杆菌筛选出有效的抗菌药物尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立抗菌化合物高通量筛选方法并将之应用于新型抗菌药物的筛选。本发明的核心是利用一个具有对六种抗生素有抗性的靶标菌胸膜肺炎放线杆菌地方分离株HB0503作为筛选菌株，建立一种快速、直接、高通量、低成本的抗菌化合物高通量筛选方法，并将该方法应用于新型抗菌化合物的筛选。

申请人所在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室于2005年在中国湖北分离了一株多重耐药的APP地方分离株HB0503，该菌株具有对磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine)、庆大霉素(Gentamicin)、氯霉素(Chloramphenicol)、链霉素(Streptomycin)、氨苄西林(Ampicillin)和卡那霉素(Kanamycin)六种抗菌药物的抗性，为本发明提供了一个非常有价值的抗菌药物筛选工具，因为用多抗性菌株筛选出的化合物的抗菌作用机制可能有别于这些已知抗菌药物的抗菌机制，从而发现具有新型抗菌机制的化合物。

具体地，本发明的技术方案如下所述。

基于化学发光法的抗菌化合物高通量筛选方法，其特征在于，以胸膜肺炎放线杆菌HB0503菌株为靶标菌，以四环素为阳性对照，用BacTiter-Glo^TMMicrobial Cell Viability Assay试剂检测靶标菌数量；

其步骤如下所示：

1.在不透明96孔板的第二列加入96μL TSB培养基，在第3-9列分别加入50μLTSB培养基，分别在第二列加入4tL若干待筛选化合物，并依次倍比稀释至第9列，在最后一列弃去50μL混合均匀的TSB培养基；在第10列设置无化合物的阴性对照组，在第11列设置四环素阳性对照组，在第1列和第12列各孔中分别加满灭菌水以防止板内液体的蒸发；

2.在每个孔中加入50tL含有10⁵CFU的复苏后的靶标菌胸膜肺炎放线杆菌HB0503菌液；

3.将步骤2中的96孔板置于37℃，180r/min摇床上培养5h后，加入100tL BacTiter-Glo^TM试剂反应10min，在化学发光检测仪上检测化学发光值；

4.采用下列公式计算待测抗菌化合物的抑菌率：

待测抗菌化合物的抑菌率＝(无化合物的阴性对照组化学发光平均值-化合物组化学发光值)/无化合物的阴性对照组化学发光平均值；

5.将检测的化合物与已知化合物库进行了比对，筛选得到下列抑菌化合物：

1)化合物编号A111：放线酰胺素，

3-[[1-[(2-(Hydroxymethyl)-1-pyrrolidinyl)carbonyl]-2-methylpropyl]carbamoyl]octanohydroxamicacid；其结构式为：

对应的分子量为385.5；

2)化合物编号E85：二苯基氯化碘盐，[1，1′-Biphenyl]-2，2′-diyiodonium chloride，其结构式为：

对应的分子量为314.55；

3)化合物编号G76：5-氟脲嘧啶，5-Fluorouracil，其结构式为：

对应的分子量为130.08；

4)化合物编号L65：喷他脒羟乙磺酸盐，

4′4-[1，5-Pentanediylbis(oxy)]bis-benzenecarboximidamide isethionate，其结构式为：

对应的分子量为592.68；

5)化合物编号M63：1，10-菲咯啉一水合物，1，10-Phenanthroline monohydrate，其结构式为：

对应的分子量为198.22；

6)化合物编号M85：N7-[(1′R，2′S，3′R，4′S)-2′，3′-二羟基-4′-氨基环戊基]-4-氨基-5-碘代吡咯嘧啶二盐酸盐，

N7-[(1′R，2′S，3′R，4′S)-2′，3′-dihydroxy-4′-aminocyclopentyl]-4-amino-5-iodopyrrolopyrimidinedihydrochloride hydrate，其结构式为：

对应的分子量为448.09；

7)化合物编号M96：(E)-3-(4-甲基苯磺酰)丙烯腈

(E)-3-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-propenenitrile，其结构式为：

对应的分子量为207.25；

8)化合物编号N91：6-硝基苯[b]噻吩-1，1-二氧化物，6-Nitrobenzo[b]thiophene-1，1-dioxide，其结构式为：

对应的分子量为211.09。

上述步骤1中的TSB培养基为商业培养基，购自美国Difco Laboratories公司。

上述8种化合物的结构式如附图1所示。

上述8种化合物对不同菌株的90％抑制浓度(MIC₉₀)如附表1所示。

本发明与现有的比浊法相比的优点：本发明中的高通量筛选方法具有灵敏度高、检测周期短，本发明中发现的8种化合物对当前流行的多耐药菌株具有抗菌活性，可作为候选抗菌化合物进行新药研发。

附图说明

图1：本发明筛选的对靶标菌HB0503菌株具有较高抑制活性的化合物的结构式。

图2：测定细菌数量的试剂的线性范围。

图3：细菌接种数量与细菌培养时间的确定。其中：图3A为OD值法检测得到的生长曲线，图3B为化学发光法检测得到的生长曲线。

图4：DMSO对细菌生长的影响。

图5：LOPAC库中化合物的抑菌率。其中：图5A为OD值法对LOPAC库中化合物抑菌活性的初筛结果，图5B为化学发光法对抑菌活性≥30％的89个化合物的第二轮筛选结果。

具体实施方案

实施例1.抗菌化合物高通量筛选方法的建立

本发明以胸膜肺炎放线杆菌HB0503(在本说明书中申请人简称其为HB0503菌株或简称为靶标菌，二者为同一菌株)为筛选菌株。该菌株是申请人于2005年分离于中国湖北省(KangM，Zhou R，Liu L，Langford PR，Chen H.Analysis of an Actinobacillus pleuropneumoniaemulti-resistance plasmid，pHB0503.Plasmid，2009，61(2)：135-9)，该菌株对磺胺二甲基嘧啶、庆大霉素、氯霉素、链霉素、氨苄西林和卡那霉素六种抗菌药物具有耐药性。该菌株可以在含有10％过滤牛血清和10μg/ml NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的TSA或TSB培养基(购自美国Difco Laboratories公司)中正常培养生存。

1.线性范围的确定

将HB0503菌株单菌落接种于含有10％过滤牛血清和10μg/ml NAD的TSB培养基中培养过夜(约12小时)，第二天将培养过夜后的HB0503菌株按1∶100(体积比)转接，待该菌增殖到最大值(对数生长期晚期，OD值约为1.5)时，对靶标菌培养液进行10倍(体积比)的倍比稀释，将稀释后的菌液转到孔壁不透明的96孔培养板中，每个稀释度做3个重复，每孔添加量为100μl。然后加入等量预先准备好的BacTiter-Glo^TMKit中的细菌数量检测试剂(购自美国promega公司)，用微量振荡器短暂的混匀后置于室温孵育3min，利用多功能酶标仪(SynergyHT Multi-Detection Reader，美国BioTek Instruments公司)检测每孔样品的化学发光值(RLU)。同时对每个稀释度的靶标菌数量进行常规的平板计数，以靶标菌数量为横坐标，以相应稀释度的靶标菌的化学发光值为纵坐标作图，确定两者间的关系。结果表明，当靶标菌个数在10⁴～10⁸CFU/孔时，化学发光值和靶标菌数量之间存在很好的线性(见图2)，因此，在10⁴～10⁸CFU范围内，化学发光值都能准确反映活菌数量。

2.靶标菌接种数量及培养时间的选择

将靶标菌HB0503菌株在37℃摇床上180r/min培养过夜，第二天在孔壁不透明的96孔培养板上分别以10³CFU/孔，10⁴CFU/孔，10⁵CFU/孔和10⁶CFU/孔为初始接菌量转接到新鲜的TSB培养基中，每个接菌量做3列的重复，置于37℃摇床培养，180r/min，从2.5h起每隔1h用多功能酶标仪读取菌液的OD_600nm吸光值，同时用BacTiter-Glo^TMKit检测活菌的化学发光强度，用OD值和化学发光法同时记录靶标菌HB0503在各接菌量条件下的生长曲线。结果表明，当接菌量为10³CFU/孔时，靶标菌增殖过慢，不利于高通量操作。当接菌量为10⁶CFU/孔时，靶标菌进入平台期过快，影响化合物活性的检测。当接菌量为10⁴CFU/孔和10⁵CFU/孔时，靶标菌的初始活力较好，增殖时间也相对适中(5～6h进入对数生长后期)，适合进行高通量的操作且化合物能有足够时间发挥作用(见图3)。多次重复试验表明，接菌量为10⁵CFU/孔时，生长速度最稳定，因此本发明采用初始接菌量为10⁵CFU/孔，经过5h培养后测定细菌数量。

3.DMSO的使用浓度确定

用多通道移液器向孔壁不透明的96孔培养板的第2列中加入47μl TSB，第3列加入96μlTSB，第4～11列加入50μl TSB，然后再向第2列加入3μl的二甲基亚砜(DMSO)，第3列加入4μl的DMSO混匀后转移50μl到下一列的孔中，进行倍比稀释直到第10列混匀后弃50μl液体，最后移取50μl稀释好的菌液到各孔中，使靶标菌的终浓度为10⁵CFU/孔，DMSO的含量从0.16％-3％，经过5h培养，用BacTiter-Glo^TMKit检测活菌的化学发光强度，并与细菌对照比较，得到DMSO对靶标菌生长的影响(图4)。当DMSO的含量为2％时，只有1.2％的靶标菌生长受到抑制，对靶标菌的生长几乎没有抑制作用，而当DMSO含量为3％时，15.9％的靶标菌生长受到抑制。因此，本发明采用DMSO≤2％的浓度稀释待测化合物。

4.高通量筛选方法的评价

选择靶标菌HB0503菌株敏感的四环素作为参照化合物进行高通量筛选方法进行评价。在孔壁不透明的96孔培养板中按1∶1(体积比)加入稀释好的靶标菌菌液，使靶标菌HB0503的初始接菌量为10⁵CFU/孔，四环素为10μg/ml，同时设培养基(TSB)、细菌(即靶标菌)和DMSO对照。将培养板置于37℃摇床，180r/min培养5h，采用OD值和化学发光法同时检测每孔细菌(靶标菌)的生长情况。参照高通量筛选方法的指标(Zhang JH，Chung TD and OldenburgKR.A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High ThroughputScreening Assays.J Biomol Screen，1999，4(2)：67-73)，统计数据并计算Z值和S/B值，其中Z＝1-((3SD S+3SD B)/｜MeanS-MeanB｜)(SD代表standard deviation即标准差；S代表signal即信号值，为待测化合物的信号值；B代表background即背景值，在抑制剂筛选实验中为阴性对照的信号值，Mean代表平均值)，S/B＝加入化合物后的发光值/细菌对照的发光值。检测结果为：OD值法的Z值＝0.952±0.018，S/B值＝0.061±0.004；化学发光法的Z值＝0.824±0.067，S/B值＝0.005±0.001。根据高通量筛选方法的评价标准(Zhang JH，Chung TD and Oldenburg KR.ASimple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput ScreeningAssays.J Biomol Screen，1999，4(2)：67-73)，本发明中OD法值法和化学发光法均为优质的高通量筛选方法。根据S/B值，化学发光法较OD值法能更敏感的区别待测化合物的信号值与背景值即阴性对照的信号值，优于OD值法。

实施例2.八种化合物的抗菌活性

1.利用LOPAC化合物库筛选抗菌化合物

本实施例利用的Library of Pharmacologically Active Compounds(药物学活性化合物库，即LOPAC)购自Sigma公司，含有1280个化合物，溶解在DMSO中，储存浓度为10mM，-80℃保存备用。

首先将化合物库中的1280种化合物稀释至终浓度分别为50μM、25μM、12.5μM，用OD值法做了抑菌活性的初筛，计算了化合物浓度为50μM时对靶标菌HB0503菌株的抑菌率(见图5中A)，抑菌率计算公式为：抑菌率＝(细菌对照数值-化合物作用后的数值)/细菌对照数值。在第一次筛选的基础上，选出抑菌活性≥30％的化合物89个，用化学发光法进行第二轮筛选，并计算了化合物浓度为50μM时的抑菌率(见图5中B)。化合物浓度为25μM时，抑菌率≥85％的化合物有32种，其中有13种是已知的抗菌药物，19种为新的抗菌化合物。由此证明了本发明可以用于新型的抗菌化合物的高通量筛选。

2.抑菌化合物的抗菌活性和细胞毒性

从筛选出来的19种新的抗菌化合物中选取了效果较好的8个化合物(其化学结构式见图1)，这些抗菌化合物的编号分别为A111、E85、G96、L65、M63、M85、M96和N91作为先导化合物测定了对胸膜肺炎放线杆菌(APP)4074株(由澳大利亚昆士兰州动物研究所Blackall博士惠赠)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)0165株(2001年分离于中国某发病猪场，为强毒株；参见文献xu ZF，Yue M，Zhou R，Jin Q，Fan Y，Bei WC*，Chen HC*.Genomic characterization ofHaemophilus parasuis SH0165，a highly virulent strain of serovar5prevalent in China.PLoS ONE，2011，6(5)：e19631.)、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC25922株(来自美国菌种保藏中心)、猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2)SC-19株(即猪链球菌2型野生菌(地方分离株)SCl9，该菌株2005年5月分离自四川省猪链球菌病中的一头病猪，为强毒株，具有MRP+EF+SLY+表型；参见文献Li W，Liu L，Qiu D，Chen H and Zhou R.Identification of Streptococcus suisserotype2genes preferential expressed in the natural host.Int J Med Microbiol，2010，300：482-488)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213株(来自美国菌种保藏中心)的抑菌活性，并计算了对各菌的MIC₉₀值。同时用CellTiter

AQueous One Solution CellProliferation Assay试剂盒(购自美国promega公司)检测了上述8个化合物对仓鼠肾细胞BHK-21(购自中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心)的细胞毒性，计算了对该细胞的半数抑制浓度(CC₅₀)。从测得的抑菌效率和细胞毒性结果(表1)可以得知：化合物A111、E85、M96和N91具有广谱抑菌活性；化合物A111显示出较好的抑菌活性且细胞毒性也很小；化合物L65和M63抑菌活性一般，细胞毒性也很小；化合物E85、M96和N91抑菌活性很好，但是细胞毒性较大。这三类化合物经过进一步的结构研究和优化，可望开发为广谱性抗菌药物。此结果说明本发明可以用于新型的抗菌化合物的高通量筛选。

表1化合物的抗菌活性(MIC₉₀)和细胞毒性(CC₅₀)测定

表1中抗菌化合物的说明：

1)化合物编号A111：放线酰胺素，

3-[[1-[(2-(Hydroxymethyl)-1-pyrrolidinyl)carbonyl]-2-methylpropyl]carbamoyl]octanohydroxamicacid；其结构式为：

对应的分子量为385.5；

2)化合物编号E85：二苯基氯化碘盐，[1，1′-Biphenyl]-2，2′-diyiodonium chloride，其结构式为：

对应的分子量为314.55；

3)化合物编号G76：5-氟脲嘧啶，5-Fluorouracil，其结构式为：

对应的分子量为130.08；

4)化合物编号L65：喷他脒羟乙磺酸盐，

4′4-[1，5-Pentanediylbis(oxy)]bis-benzenecarboximidamide isethionate，其结构式为：

对应的分子量为592.68；

5)化合物编号M63：1，10-菲咯啉一水合物，1，10-Phenanthroline monohydrate，其结构式为：

对应的分子量为198.22；

6)化合物编号M85：N7-[(1′R，2′S，3R，4′S)-2′，3′-二羟基-4′-氨基环戊基]-4-氨基-5-碘代吡咯嘧啶二盐酸盐，

N7-[(1′R，2′S，3′R，4′S)-2′，3′-dihydroxy-4′-aminocyclopentyl]-4-amino-5-iodopyrrolopyrimidinedihydrochloride hydrate，其结构式为：

对应的分子量为448.09；

7)化合物编号M96：(E)-3-(4-甲基苯磺酰)丙烯腈

(E)-3-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-propenenitrile，其结构式为：

对应的分子量为207.25；

8)化合物编号N91：6-硝基苯[b]噻吩-1，1-二氧化物，6-Nitrobenzo[b]thiophene-1，1-dioxide，其结构式为：

对应的分子量为211.09。

Claims (2)

1.基于化学发光法的抗菌化合物高通量筛选方法，其特征在于，以胸膜肺炎放线杆菌HB0503菌株为靶标菌，以四环素为阳性对照，用BacTiter-Glo^TMMicrobial Cell ViabilityAssay试剂检测靶标菌数量；

其步骤如下所示：

(1)在不透明96孔板的第二列加入96μL TSB培养基，在第3-9列分别加入50μL TSB培养基，分别在第二列加入4μL若干待筛选化合物，并依次倍比稀释至第9列，在最后一列弃去50μL混合均匀的TSB培养基；在第10列设置无化合物的阴性对照组，在第11列设置四环素阳性对照组，在第1列和第12列各孔中分别加满灭菌水以防止板内液体的蒸发；

(2)在每个孔中加入50μL含有10⁵CFU的复苏后的靶标菌胸膜肺炎放线杆菌HB0503菌液；

(3)将步骤(2)中的96孔板置于37℃，180r/min摇床上培养5h后，加入100μLBacTiter-Glo^TM试剂反应10min，在化学发光检测仪上检测化学发光值；

(4)采用下列公式计算待测抗菌化合物的抑菌率：

待测抗菌化合物的抑菌率＝(无化合物的阴性对照组化学发光平均值-化合物组化学发光值)/无化合物的阴性对照组化学发光平均值；

(5)将检测的化合物与已知化合物库进行比对，筛选得到如下所示的抑菌化合物：

1)A111：放线酰胺素，

3-[[1-[(2-(Hydroxymethyl)-1-pyrrolidinyl)carbonyl]-2-methylpropyl]carbamoyl]octanohydroxamic acid；其结构式为：

对应的分子量为385.5；

2)L65：喷他脒羟乙磺酸盐，4′4-[1，5-Pentanediylbis(oxy)]bis-benzenecarboximidamideisethionate，其结构式为：

对应的分子量为592.68；

3)E85：二苯基氯化碘盐，[1，1′-Biphenyl]-2，2′-diyiodonium chloride，其结构式为：

对应的分子量为314.55；

4)G76：5-氟脲嘧啶，5-Fluorouracil，其结构式为：

对应的分子量为130.08；

5)N91：6-硝基苯[b]噻吩-1，1-二氧化物，6-Nitrobenzo[b]thiophene-1，1-dioxide，其结构式为：

对应的分子量为211.09；

6)M63：1，10-菲咯啉一水合物，1，10-Phenanthroline monohydrate，其结构式为：

对应的分子量为198.22；

7)M85：N7-[(1′R，2′S，3′R，4′S)-2′，3′-二羟基-4′-氨基环戊基]-4-氨基-5-碘代吡咯嘧啶二盐酸盐，

N7-[(1′R，2′S，3′R，4′S)-2′，3′-dihydroxy-4′-aminocyclopentyl]-4-amino-5-iodopyrrolopyrimidinedihydrochloride hydrate，其结构式为：

对应的分子量为448.09；

8)M96：(E)-3-(4-甲基苯磺酰)丙烯腈

(E)-3-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-propenenitrile，其结构式为：

对应的分子量为207.25。

2.权利要求1所述的方法在胸膜肺炎放线杆菌抗菌化合物高通量筛选中的应用。

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