CN111286525A - 用于体外活细胞的耐药性检测的方法及培养液 - Google Patents
用于体外活细胞的耐药性检测的方法及培养液 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及细胞耐药性快速检测领域，公开了一种用于活体细胞的耐药性快速灵敏精准的检测方法，包括以下具体步骤：在对待检测的活体细胞进行检测前先对所述待检测的活体细胞进行孵育，于孵育后的不同时间点连续检测标志物的浓度实现上述检测；在孵育前加入能够被所述待检测的活体细胞利用的检测试剂混合物以及进行耐药性检测的待测化合物；所述孵育是指将待检测的活体细胞加入确定浓度的培养液培养。本发明的优点在于，能够快速灵敏地对活体细胞的生长进行检测，包括其细胞耐药性的检测，发现目前方法不能检测到的“隐藏”耐药性,预防超级细菌和耐药肿瘤,开发高效新药等方面具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞耐药性快速高灵敏性检测领域，特别涉及一种细胞部分耐药性的检测方法及相应的检测化合物。
背景技术
大量超级细菌和肿瘤耐药性的出现,是目前急待解决的共公卫生问题.除了新药,一种能早期发现耐药性的方法也许能从源头上解决超级细菌和肿瘤耐药性的出现。
目前实验室常用检测方法主要分三大部分，即细菌学、免疫学、分子生物学。我国目前临床微生物现代药敏实验，存在些许问题，比如，检测时间久，结果不够精确，影响诊断结果，且某些鉴定设备价格昂贵，一些中小医院无力使用。
目前细菌药敏检测方法主要有定性测定的纸片扩散法(K-B法)，定量测定的稀释法，E法和全自动药敏仪法，一般都需要1天时间，才能出结果。
目前，实验室以及临床上有多种方法可以用来检测结核菌，最常用的主要有痰涂片镜检法、罗氏固体培养法、BACTEC MGIT960系统培养法、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)等等。
现有的结核分枝杆菌药敏检测方法存在着以下问题：痰涂片对于制片要求高，镜检需要依靠人力完成，这大大加大了临床实验人员的工作量，也容易遗漏；由于结核分枝杆菌自身生长的特点，导致固体培养法耗时时间长；利用分枝杆菌快速培养仪和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)可以缩短培养时间，且操作便利，但是不是活菌，正确度不高，价格昂贵，不利于推广。
上述现有技术中存在的问题，部分是由于检测手段本身的局限性所致，但对细胞耐药性检测过程中，需要经过培养才能获得所需浓度的标志物的特性导致上述检测手段所需时间长，精确度不高等缺点。
由此，需要在现有技术的基础上，结合细胞药敏检测的特点，制定更好的检测手段。
发明内容
本发明针对现有技术中对细胞进行药敏检测时间长的缺点，提供了一种用于活体细胞的耐药性快速灵敏精准的检测方法。
在实验过程中，我们发现使用现有的检测方法，似乎不能够检测到细胞的“一些”耐药性，在通过现有的检测方法进行检测后呈现阴性(无耐药性或者低耐药性)的细胞，在后继的应用中，却仍然发现存在耐药性。尽管目前的理论尚无法准确解释该种细胞耐药性存在的机理，但通过改变现有的检测手段，我们发现一些新的快速检测方法，似乎可以通过提高对于细胞耐药性检测指标的“下限”，来达到检测上述“无法”检测的细胞耐药性的效果。通过这些新的快速检测方法，那些使用现有的检测手段呈现阴性的细胞，却可以检测出较为明显的耐药性。同时，这些新的快速检测方法相比现有的检测手段，具有检测快速、灵敏、精准的优点。
另外，在实际应用中发现，上述的快速检测方法还具有检测准确性高，可以进行定量检测，可靠的发现目前各类终点法或浊度法不能发现的“隐藏”的耐药性(10-30％),可以预防超级细菌和肿瘤耐药性的出现,并提高新药评价的标准,有利于开发真正有效的药物。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
一种用于活体细胞的耐药性快速灵敏精准的检测方法，包括以下具体步骤：在对待检测的活体细胞进行检测前先对所述待检测的活体细胞进行孵育，于孵育后检测标志物的浓度实现上述检测；在孵育前加入能够被所述待检测的活体细胞利用的检测试剂混合物以及进行耐药性检测的待测化合物；所述孵育是指将待检测的活体细胞加入确定浓度的培养液培养；耐药性是指待测化合物不能完全抑制待检测的活体细胞的生长。或者也可以于孵育后检测标志物的浓度的过程中，按照预定的时间间隔连续检测标志物的浓度。
还包括以下步骤：在优化的条件下，检测试剂混合物可以用速率法跟踪给药后细胞的生长，检测细胞耐药性；速率法是指按照预定的时间间隔连续检测标志物的浓度信号随时间的变化；细胞耐药性包括用常规方法能检测到的高于20％细胞生长的耐药性,和常规方法不能检测到的低于20％的细胞生长的耐药性。
需要指出的是，本申请中所指的:耐药性(R耐药:其细胞生长率是不给药细胞的20％以上),敏感性(S敏感：其细胞生长率是不给药细胞的2％以下),以及常规方法不能检测到的低于20％的细胞生长的I部分耐药性(PR；其细胞生长率是不给药细胞的2-20％)。
还包括浓度调整步骤：在孵育前调整用于孵育的细胞培养液浓度(包括达到改变培养液中单位体积细胞数量的目的)令所述待检测的活体细胞大致达到更优的生长速度。在浓度调整步骤完成后，对细胞在培养液的浓度进行稀释(包括减少培养液中单位体积的细胞数量)，稀释范围是麦氏0.5稀释2-4000倍。在所述体外活细胞为快生长菌的情况下，使用40倍稀释。还包括加快培养步骤：在能够获得所述待检测活体细胞最优生长率的培养液浓度后，在孵育过程中提高所述培养液的浓度。
所述利用是指所述检测试剂混合物能够进入所述待检测活体细胞内。所述利用是指所述检测试剂混合物能够与所述待检测细胞的至少一部分成分反应。所述标志物为具有颜色的产物。所述检测试剂混合物包括能够在所述待检测活体细胞内被氧化或者还原成可显现出颜色的产物的化合物。检测试剂混合物可以选择EZMTT和电子偶联剂。
还包括抑制率检测步骤：在孵育所述待检测活体细胞同时，将等量的待检测活体细胞加入相同浓度的培养液中制成阳性对照组，并用相同浓度的培养液不加待检测活体细胞制成阴性对照组；进一步与阳性和阴性对照组孵育后检测标志物的浓度进行比对，得到所述待测化合物对所述待检测活体细胞的抑制率；
抑制率的计算为＝1-(化合物-阴性)/(阳性-阴性)。还包括对细胞耐药性的鉴定步骤：具体包括检测给药后细胞生长速率变化，与相对应的野生型细胞进行比较 (分别在给药(0％生长)和不给药(100％生长)条件下进行比对)。
通过连续检测标志物的浓度,检测抑菌物和杀菌剂对细胞的抑制作用。所述活体细胞包括能产生NAD(P)H的真菌、细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、传染性生物体、各种耐药和不耐药细胞、及动物和人体细胞。
结核杆菌类慢生长细胞培养液中还包括抑菌剂；慢生长细胞指倍增时间超过12小时的细胞。
此外，申请还公开了用于对待检测的活体细胞进行孵育，包括培养基以及检测试剂混合物；所述检测试剂混合物包括具有以下结构通式的化合物
其中，
A1为和所述
相连接的芳香基或杂环基团；
A2为和所述
相连接的芳香基或杂环基团；
A3为和所述
相连接的苯基；
R1为H或者和所述A1相连接的至少一个R1取代基，所述R1取代基分别独立地选自-NO2、-SO3H、-SO2NH2、卤族元素、和所述A1稠合的杂环基团、烷基；
R2为H或者和所述A2相连接的至少一个R2取代基，所述R2取代基分别独立地选自NO2,甲氧基，烷基，通过叠氮基连接的苯基及其衍生物、卤素原子, 磺酸基及其盐、和所述A2稠合的苯基或杂环基团；
R3为和所述A3相连接的R3取代基；所述R3取代基分别独立地选自磺酸基，羧酸基，取代磺酸基，取代羧酸基；
所述杂环基团包括1-2个杂原子，所述杂原子分别独立地选自Se，N、S或 O。
可以使用的活体细胞包括真菌、细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、传染性生物体、各种耐药和不耐药细胞、及动物和人体细胞等，但已经死亡的细胞无法在本方法记载的步骤下进行检测，因为死亡其活细胞的数目为零无法利用检测试剂混合物；此外，尽管本申请的实施例中使用的检测仪器包括可以对溶液的吸光度进行检测或者类似的可以检测溶液颜色的仪器，这些仪器可以是现有的仪器，或者是具有本申请所要求的检测功能的仪器。所述的孵育是指通过培养液对所述待检测活体细胞进行的培养，一般的培养结果是所述待检测活体细胞的数量发生增加，但本申请记载的技术方案不要求在孵育前加入检测试剂混合物的时刻存活的活体细胞在孵育完成后继续存活，也不要求孵育后的活体细胞数量绝对增加。通常，本申请的技术方案只要求检测试剂混合物可以被活体细胞利用即可，通过检测细胞利用后的产物即可以实现快速检测的目的。在孵育过程中使用的培养液可以使用任意的可供待检测的活体细胞生长的混合溶液，例如细菌用MH肉汤,真菌用RPMI，结核菌用7H9培养基。本申请的实施例中使用的检测试剂混合物为EZMTT，也可以选择其它水溶性的双磺酸四氮唑盐WST系列、WST8、WST1、XTT、MTS等等，因此尽管EZMTT对细胞无毒或者基本无毒，但那些对细胞具有一定毒性的化合物仍然可以作为检测试剂混合物使用，但明显地，由于对细胞的生长具有毒性，生长收到抑制但未达到无法生长的程度，本申请记载的方法仍然可以使用，尽管得到的结果存在偏差，也能提供一定的IC50和生长速率值。本申请中使用的待测化合物为需要对特定细胞进行药敏(耐药性)试验的化合物，本申请的实施例中使用了氨苄西林、链霉素，异烟肼，利福平，乙胺丁等作为待测化合物，使用的活体细胞为大肠杆菌、结核分枝杆菌、革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌、白色念珠菌、哺乳类动物细胞、革兰氏阳性菌、真菌细胞、肿瘤细胞，血细胞，尤其包括各种耐药和不耐药细胞。本领域技术人员可以根据细胞、需进行药敏试验的化合物的需要来对上述活体细胞、待测化合物进行确定。
进一步地，本申请记载的检测方法主要对那些标志物为细胞利用后生成产物的情况下进行使用，换而言之，该种检测试剂混合物被活体细胞所利用后，持续地生成可供检测的标志物且该标志物的生成速率和细胞生长速率或者检测试剂混合物对细胞的抑制率相关；因此，若一种检测试剂混合物可以直接地和细胞中或者细胞膜上现有的化合物发生反应,但与活体细胞的生长无关或者关系甚微的，则无需使用本申请记载的步骤。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，还包括孵育浓度调整步骤：在孵育前调整用于孵育的培养液中各组分的浓度令所述待检测的活体细胞大致达到优化的生长速度，这里的生长速度是指在整个孵育时间段内而言的。所述的优化的生长速度是指在该培养液的浓度下，在其它孵育条件给定的前提下，在一定的孵育时间内待检测的活体细胞具有最大或者接近于最大的生长率的培养液浓度。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，还包括预培养步骤：在孵育所述待检测的活体细胞前，对所述待检测的活体细胞进行培养并确定能够获得所述待检测活体细胞最佳细胞在培养液中的密度，本步骤使用的培养液和上述步骤中使用的培养液是相同的。本步骤通常用于确定能够令所述待检测的活体细胞大致达到优化的生长速度的培养液的浓度。本步骤中无需加入检测试剂混合物。此外，本步骤的作用在于可以根据细胞的特异性，来选择实验中的细菌的浓度(相对于培养液浓度而言)。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，还包括加快培养步骤：在能够获得所述待检测活体细胞最优生长率的培养液浓度后，在孵育过程中提高所述培养液中的加快细胞生长的组分的浓度。相比预培养步骤，本步骤通过增加培养液的浓度来提高短时间内的细胞生长率，缩短所需要的检测时间，提高检测速度。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述利用是指所述检测试剂混合物能够进入所述待检测活体细胞内，一般情况下，也包括和位于细胞膜上的成分进行反应。此外，利用后的产物是否可以继续停留在活体细胞内还是被细胞释放到体外或者孵育过程中因为细胞的死亡而将利用后的产物释放到培养液中不影响本申请所述的方法的使用。进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述利用是指所述检测试剂混合物能够与所述待检测细胞的至少一部分成分反应。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述标志物为具有颜色的产物，这里的颜色是指具有光谱上一定波长区间的颜色，因此白色不是本申请所述的颜色。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述检测试剂混合物为能够在所述待检测活体细胞内被氧化或者还原成可显现出颜色的产物的化合物，视使用的检测试剂混合物不同而不同。在使用EZMTT的情况下，其产物为橙黄色的甲臜。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，所述检测试剂混合物为能够与所述待检测活体细胞内的NAD(P)H反应并在电子偶联剂的存在下被还原成可显现出颜色的产品的化合物。
进一步地作为一种可选的方案，在本申请的实施例中，还包括抑制率检测步骤：在孵育所述待检测活体细胞的同时将等量的待检测活体细胞加入相同浓度的培养液中制成对照组，在将对照组进行孵育前加入和所述待测化合物等量且相同浓度的对照化合物，在将对照组孵育后检测标志物的浓度并进行比对，通过使用不同毒性的测试化合物得到所述测试化合物对所述待检测活体细胞的抑制率。
此外，本发明还公开了一种可以用于上述的活细胞孵育的培养液，包括培养基以及检测试剂混合物；所述检测试剂混合物具有以下的结构通式：
其中，
A1为和所述
相连接的芳香基或杂环基团；
A2为和所述
相连接的芳香基或杂环基团；
A3为和所述
相连接的苯基；
R1为H或者和所述A1相连接的至少一个R1取代基，所述R1取代基分别独立地选自-NO2、-SO3H、-SO2NH2、卤族元素、和所述A1稠合的杂环基团、烷基；尤其是位于A1的对位的R1取代基；
R2为H或者和所述A2相连接的至少一个R2取代基，所述R2取代基分别独立地选自NO2,甲氧基，烷基，通过叠氮基连接的苯基及其衍生物、卤素原子, 磺酸基及其盐、和所述A1稠合的苯基或杂环基团；尤其是位于A2的邻位或者对位的R2取代基。
R3为和所述A3相连接的R3取代基；所述R3取代基分别独立地选自磺酸基，羧酸基，取代磺酸基，取代羧酸基；尤其是选自
尤其是位于A3的邻位的R3取代基。
所述杂环基团包括1-2个杂原子，所述杂原子分别独立地选自Se，N、S或 O。
上述的芳香基或杂环基团各自独立地选自
此外，上述的培养液中还可以被加入额外的增敏剂，例如PMS(通常称为吩嗪硫酸甲酯)衍生物，尤其是其甲基或者乙基衍生物，或者可以选用其它具有类似电子偶联剂效果的化合物。
培养液可以选用以下的培养基配比而成：LB，MH肉汤用于革氏阴性、阳性细菌；(0.5-2倍)苏通(Sauton)培养基、Middle brook 7H9、Middle brook 7H10、 Middle brook7H11、Middle brook 7H12、匡氏培养基、Proskauer培养基、丙酮酸钠细胞色素C培养基、BACTEC MGIT 960培养基用于结核杆菌；RPMI培养基用于真菌；Basel medium Eagle、RPMI、DMEM、DMEM/F12、RPMI-HEPES、 MEM、IMDM、HamF10、M199、L15、McCoy5A用于动物细胞的培养等，通常将上述培养基稀释0.5-2倍后使用。为清晰起见，上述名称中相当部分使用的是市场上可以购买到的培养基的商品名称。
此外上述培养液中可以加入生长加快剂、抗菌剂、抑菌增效剂；生长加快剂可以选用各种类型的血液、激素、平菇液、豆浸液、OADC等，以及抑制杂菌的微量孔雀绿、青霉素、萘啶酸、多黏菌素B、羧苄青霉素C、两性霉素B、三甲氧氨嘧或mgit Pant抗菌素用于结核杆菌培养基的添加；1-20％BSA或B-27等无血清培养基用于哺乳类动物细胞的培养基的添加；
所选的检测试剂混合物EZMTT是一种新型合成的单磺酸四氮唑盐，其检测原理是基于活细胞体内的NAD(P)H可以使EZMTT在电子偶联剂存在下还原成可溶的橙黄色的甲臜产物，可用酶标仪在450nm处可测定该甲臜产物的光吸收值，而死细胞则无该作用。通过酶标仪检测吸光度来间接反应细菌存活情况，在一定范围内，EZMTT的颜色变化量与细菌量成正比,而且无毒。因此有可能用于建立快速药敏方法。
本发明具有以下的显著技术效果：
本发明能够根据细菌特异性，选择药敏实验中细菌的浓度。本发明能够对细菌没有致死影响，可以连续检测，数据可靠。本发明能够做到药敏检测时间短(临床快生长细菌检测EZMTT需3-4小时；传统需1天；结核菌EZMTT需4-6天；传统需液体4-10天；固体1个月)，可以检测出部分抑制(EZMTT获％抑制率；而传统目测法只能定性“有/没有”)，快速得到精准结果。本发明能够高通量大批量检测多个细菌，多种抗菌素，快速检测。本发明能够为临床提供药物的最佳搭配，实现精准治疗。本发明检测试剂混合物相较于其他相比价格低廉，易于推广化，减轻经济负担。
附图说明
图1为采用24小时的终点法,为了获得最优检测条件,使用不同四氮唑盐检测活菌E.coli体外生长的信号；水溶性四氮唑盐均有信号；LB培养基作为阴性对照。
图2为采用七天的终点法,为了获得最优检测条件,使用不同四氮唑盐跟踪活菌结核杆菌体外生长信号；其中，使用EZMTT实验结果信号最好。
图3为采用七天的终点法,为了获得最优检测条件,使用不同培养基跟踪活菌结核杆菌生长的信号。使用培养基Middle brook7H9结核杆菌生长后得到信号最好。
图4采用七天的终点法,为了获得最优检测条件,使用不同添加剂跟踪结核杆菌体外生长的信号。使用生长加快剂OADC信号最好。
图5.采用5天的连续跟踪速率法,为了获得最优检测条件,为使用不同培养基对体外培养的H22肿瘤细胞跟踪5天的结果。
图6-1、6-2.为采用4小时的终点法使用EZMTT在最优条件下检测，不同细胞量(稀释0.5MFC细胞,从20倍到640倍的单位细胞量)的耐药大肠杆菌 (图6-1)及敏感大肠杆菌(图6-2)在体外培养时对氨苄西林的耐药性检测； 4h检测结果表明，在较高细菌浓度条件下，IC50和MIC值略有增加(约2倍)，但不影响药敏检测结果。
图7.为采用4小时的终点法使用EZMTT作为检测指示剂检测临床分离鉴定过的大肠杆菌的氨苄西林的耐药性的比对，已知耐药性的样品(从左到右，从上到下顺次排列)：(1.临床鉴定为耐药)使用EZMTT作为检测试剂混合物检测也显示耐药；(2.临床鉴定为耐药)使用EZMTT作为检测试剂混合物检测也显示耐药；(3.临床鉴定为敏感)使用EZMTT作为检测试剂混合物检测也显示敏感IC50＝13μg/ml；(4.临床鉴定为敏感)使用EZMTT作为检测试剂混合物检测也显示敏感IC50＝14μg/ml，(5.临床鉴定为敏感)但EZMTT法作为检测试剂混合物检测显示并非完全抑制,属于部分抑制状态(R耐药:其细胞生长率是不给药细胞的20％以上，S敏感:其细胞生长率是不给药细胞的2％以下,PR部分耐药 (或HR隐藏的耐药):其细胞生长率是不给药细胞的2-20％)。
图8-1、8-2为大肠杆菌细胞生长曲线的结果对比:使用EZMTT作为检测指示剂检测(图8-1)和使用传统浊度法(24小时)检测同样样品(图8-2)，其中在相同细胞量的条件下,图8-1的OD450nm信号达4，敏感性高，但图8-2的 OD600nm信号只有达0.4敏感性不够，因此可解释浊度法无法检测到部分抑制细胞生长的原因。细胞生长曲线表明，EZMTT法的灵敏度是浊度法的10倍。
图9-1、9-2、9-3为比较使用EZMTT或其它可溶性四氮唑盐(WST8/CCK8) 作为检测指示剂，其中，两种试剂对完全耐药或完全敏感的细菌都可以检测，但是对部分耐药的菌，WST8具有一定毒性，无法检测细菌E的耐药性。
图10为使用EZMTT作为检测指示剂检测结核杆菌的耐药性.在不同生长条件下(不同细胞量(10或40倍稀释),加不加营养成分(OADC),加不加药 (S,I,R,E),不同时间检测的时间效应),用EZMTT法每天检测一次以跟踪细胞生长,共计跟踪4-7天后。柱状图显示增加细胞量(10倍稀释)和添加营养成分 OADC可以增加信号；同时EZMTT可以定量分析,并检测细胞生长的时间效应。柱状图为终点法检测,曲线为速率法检测
图11革兰氏阳性菌体外活细胞的耐药性检测:金黄色葡萄球菌(0.5MCF的新鲜菌液40倍稀释)4小时药敏试验结果，其中，A为给予氨苄西林药物处理后的IC50＝129ng/ml；B为给予卡那霉素药物处理后的IC50＝872ng/ml；C为给予头孢唑啉药物处理后的IC50＝87ng/ml。
图12为革兰氏阴性菌体外活细胞的耐药性检测:铜绿假单胞菌(0.5MCF的新鲜菌液40倍稀释)4小时庆大霉素药敏试验(IC50＝0.17μg/ml)结果。
图13为真菌体外活细胞的耐药性检测:白色念珠菌(0.5MCF的新鲜菌液40 倍稀释)4小时药敏试验表明氨苄西林对白色念珠菌耐药。
图14-1、14-2、14-3为连续检测的速率法检测体外活细胞的耐药性:使用 EZMTT培养基检测肿瘤细胞的耐药和部分耐药性。5天药敏试验表明用本专利的新型EZMTT培养基和检测方法(加和不加药，细胞生长的剂量效应)，可以区分DOX可以完全抑制肿瘤(图14-2)和Paclitaxel部分抑制肿瘤(图14-3)；这解释了报道的Paclitaxel体内肿瘤耐药性，因此本发明为为早期预测肿瘤耐药性提供指导意义。
图15-1、15-2、15-3为连续检测的速率法检测体外活细胞的耐药性:使用新型EZMTT培养基检测慢病毒对肿瘤细胞HEK293t部分感染后的生长抑制，其中病毒感染对HEK293t细胞生长的影响:中间的图15-2是生长曲线。其中上面一条线是2000个HEK293t细胞生长。下面一条线是2000个HEK293t细胞转染病毒后的生长。图15-1是2000个HEK293t细胞.图15-2是2000个HEK293t 转染的细胞，荧光显示的是含病毒转染的细胞。
图16-1和16-2.EZMTT速率法对6种E.coli菌株(MG655是没有突变的野生型大肠杆菌；其它是临床分离的大肠杆菌)的体外活细胞的耐药性进行检测,并与传统浊度法比较,EZMTT(OD450 nm)能检测到浊度法(OD600 nm)检测不到的由于耐药造成的细胞生长(细节将发表在ACS Infecious Diseases,2019, Detection of“Hidden”Antimicrobial DrugResistance；通讯作者阮奔放Benfang Helen Ruan)。
图17.对检测到的部分耐药性(PR；给药后显示2-20％的细胞生长)进行验证,结果表明检测标记物的信号增加的确与细胞生长一致(细节将发表在ACS InfeciousDiseases,2019,Detection of“Hidden”Antimicrobial Drug Resistance；通讯作者阮奔放Benfang Helen Ruan)。
图18.EZMTT速率法对10种结核杆菌(H37Ra是没有突变的野生型结核杆菌；其它是临床分离的结核杆菌)的耐药性进行检测,并与传统固体法和液体法进行比较,EZMTT的成功率100％,明显耐药(R)的检测时间从30天减少到3-5天, 部分耐药(PR；2-20％的药物存在下的生长)检测时间从30天减少到5-7天,结果与传统固体法或液体法一致(细节将发表在ACS Infecious Diseases,2019, Detection of“Hidden”Antimicrobial DrugResistance；通讯作者阮奔放Benfang Helen Ruan)。
图19.用多种方法在24小时测12总药物对6种E.coli菌株(MG655是没有突变的野生型大肠杆菌；其它是临床分离的大肠杆菌)的体外活细胞的耐药性进行的检测结果.本发明的EZMTT法(OD450 nm跟踪检测)能检测到浊度法 (OD600 nm),MTT终点法,EZMTT终点法检测不到的由于部分耐药造成的细胞生长(2-20％的生长)(细节将发表在ACS InfeciousDiseases,2019,Detection of “Hidden”Antimicrobial Drug Resistance；通讯作者阮奔放Benfang Helen Ruan)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
使用终点法对E.coli进行药敏实验：配置氨苄西林药液(0-12.8mg/ml；两倍稀释的浓度梯度)待用。用排枪取2μl氨苄西林待用药液至96孔板中待用。将新鲜培养E.coli菌种用MH肉汤培养液调至浓度0.5MCF，再用含有EZMTT (EZMTT可以更换为各类四氮唑盐和PMS衍生物，包括甲基PMS)检测试剂混合物的MH肉汤进行20-640倍的稀释(优选的为40倍稀释)，取200μl至96 孔板中。设立对照孔，对照孔中将2ul氨苄西林待用药液用灭菌水代替，其余都与给药孔操作一致。将96孔板放入37℃培养箱培养，4h后的终点法检测OD450 及OD600值。
实施例2
使用速率法对结核分枝杆菌进行药敏(耐药性)实验：配置链霉素，异烟肼，利福平，乙胺丁药液待用。按常规药物检测浓度，取待用药液至螺口管中。将新鲜培养结核分枝杆菌用7H9培养液调至浓度0.5MCF，再用含有EZMTT(同样可以被替换为其它的四氮唑盐和PMS衍生物，包括甲基PMS，以下实施例同) 检测试剂混合物的7H9培养基进行4-40倍的稀释(优选的为20倍稀释)，4ml 加入含药管子。设立对照孔，对照孔中将待用药液用灭菌水代替，加菌的为阳性对照(信号)，不加菌的为阴性对照(背景)。管子放入37℃培养箱培养，5天后，每天检测OD450及OD600值。信号/背景>2倍时，计算抑制率，判断耐药性。再加一天后，信号/背景>4倍时，终止检测。
实施例3
使用终点法对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(0.5MCF的新鲜菌液40倍稀释) 进行药敏实验：配置庆大霉素药液(0-12.8mg/ml；两倍稀释的浓度梯度)待用。用排枪取2μl庆大霉素待用药液至96孔板中待用。将新鲜培养铜绿假单胞菌种用MH肉汤培养液调至浓度0.5MCF，再用含有EZMTT检测试剂混合物的MH 肉汤进行20-640倍的稀释(优选的为40倍稀释)，取200μl至96孔板中。设立对照孔，对照孔中将2ul庆大霉素待用药液用灭菌水代替，其余都与给药孔操作一致。将96孔板放入37℃培养箱培养，4h后检测OD450及OD600值。
实施例4
使用革兰氏阳性菌体外活细胞的耐药性检测:金黄色葡萄球菌(0.5MCF的新鲜菌液40倍稀释)进行药敏实验：配置氨苄西林、卡那霉素、头孢唑啉药物药液(0-12.8mg/ml；两倍稀释的浓度梯度)待用。用排枪取2μl待用药液至96孔板中待用。将新鲜培养金黄色葡萄球菌种用MH肉汤培养液调至浓度0.5MCF，再用含有EZMTT检测试剂混合物的MH肉汤进行20-640倍的稀释(优选的为 40倍稀释)，取200μl至96孔板中。设立对照孔，对照孔中将2ul待用药液用灭菌水代替，其余都与给药孔操作一致。将96孔板放入37℃培养箱培养，4h后检测OD450及OD600值。
实施例5
使用真菌白色念珠菌(0.5MCF的新鲜菌液40倍稀释)进行药敏实验：配置氨苄西林药液(0-12.8mg/ml；两倍稀释的浓度梯度)待用。用排枪取2μl氨苄西林待用药液至96孔板中待用。将新鲜培养E.coli菌种用MH肉汤培养液调至浓度0.5MCF，再用含有EZMTT检测试剂混合物的MH肉汤进行20-640倍的稀释(优选的为40倍稀释)，取200μl至96孔板中。设立对照孔，对照孔中将 2ul氨苄西林待用药液用灭菌水代替，其余都与给药孔操作一致。将96孔板放入37℃培养箱培养，4h后检测OD450及OD600值。
实施例6
使用速率法对肿瘤细胞HCT116(1000-8000)进行药敏实验：配置抗肿瘤药液(两倍稀释的浓度梯度；或联合用药)待用。用排枪取2μl药液至96孔板中待用。将新鲜培养HCT116用含有EZMTT检测试剂混合物的血清的RPMI等培养基进行稀释(1000每孔)，取200μl至96孔板中。设立对照孔，对照孔中将 2ul待用药液用灭菌水代替，其余都与给药孔操作一致。将96孔板放入37℃培养箱培养，4小时，1天，2天，3天，4,天，5天后检测OD450及OD600值。
实施例7
使用速率法对肿瘤细胞HEK293T(1000-8000)进行病毒感染实验：将新鲜培养HEK293T用含有EZMTT检测试剂混合物的血清的RPMI等培养基进行稀释(1000每孔)，取200μl至96孔板中。加入大量慢病毒，设立对照孔，对照孔中将病毒用灭菌水代替，其余操作一致。将96孔板放入37℃培养箱培养，4 小时，1天，2天，3天，4,天，5天后检测OD450及OD600值。
实施例8
在上述实施例1-6的基础上，还可以使用速率法对以下的化合物作为检测试剂混合物使用，用于替换实施例1中的EZMTT成分，本实施例中使用的检测试剂混合物可以使用和实施例1中的EZMTT相当的浓度，这里提出一个大致的浓度范围为0.1-50mM，本实施例使用的检测试剂混合物均为低毒、高效化合物，针对待检测的活体细胞要求低毒的特点，部分化合物相对活体细胞是无毒或者基本无毒。
关于附图的进一步说明
附图1-18来自于对于不同实验结果的结合，是在实施例1记载的实验步骤的基础上，通过将附图说明中记载的化合物和实验条件，用实施例1记载的相应内容进行替换后，进行实验得到的数据的比对。因此，附图中的重复数据对应于多个实验，该多个实验则是分别将实施例1记载的内容进行部分的替换得到。其中，如图10所示，使用EZMTT作为检测指示剂，使用实施例1记载的内容，分别对临床耐药菌耐药性进行检测的结果；为进一步和上述结果进行比对，采用传统液体荧光法作为参照，下表1是比较传统终点法(固体法液体荧光法)与 EZMTT的速率法对临床结核杆菌耐药菌进行检测的结果：下表2是比较临床在用的终点法(MIC和抑菌圈),浊度检测的速率法与EZMTT的速率法对临床大肠杆菌耐药菌进行检测的结果。
表1(细节将发表在ACS Infecious Diseases,2019,Detection of“Hidden”Antimicrobial Drug Resistance；通讯作者阮奔放Benfang Helen Ruan).图18的结果分析:结核杆菌耐药性检测；30-天固体培养基终点法,14-天液体氧气消耗终点法,3-7天EZMTT速率法快速、精准、定量)
c活细胞生长的速率
R:耐药,S:敏感:PR:部分耐药或“隐藏”的耐药
表2(细节将发表在ACS Infecious Diseases,2019,Detection of“Hidden”Antimicrobial Drug Resistance；通讯作者阮奔放Benfang Helen Ruan),图16的结果分析大肠杆菌耐药性检测结果比较:EZMTT速率法、浊度速率法、临床终点法检测(VITEK和KB法)
a S敏感(＜2％药物抑制下的生长),R耐药(>20％药物抑制下的生长),I部分耐药(HR隐藏耐药；2- 20％药物抑制下的生长)，其中，MNO为抑菌剂，CFP为杀菌剂。药物抑制下的生长是根据图19的结果计算得到的。
除了上述实施例1记载的检测试剂混合物以外，还可以使用本申请的技术方案中记载的A1-3、R1-3所记载的任意基团的组合；这里对一些较为重要的集团组合进行逐一的例举：
将上述的化合物CPD1-51使用实施例1记载的步骤作为检测试剂混合物使用，使用E.Coli进行药敏试验，其中待测化合物为使用氨苄西林；其余同实施例1；进行逐一实验后发现，其结果和图8浊度600nm检测结果类似，但检测时间均大为缩短，且灵敏度更高。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (14)
1.一种用于体外活细胞的耐药性检测的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：在对待检测的活体细胞进行检测前先对所述待检测的活体细胞进行孵育，于孵育后检测标志物的浓度实现上述检测；在孵育前加入能够被所述待检测的活体细胞利用的检测试剂混合物以及进行耐药性检测的待测化合物；所述孵育是指将待检测的活体细胞加入确定浓度的培养液培养；耐药性是指待测化合物不能完全抑制待检测的活体细胞的生长。
2.根据权利要求1所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法，其特征在于，于孵育后检测标志物的浓度的过程中，按照预定的时间间隔连续检测标志物的浓度。
3.根据权利要求1所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法，其特征在于，还包括以下步骤：在优化的条件下，检测试剂混合物可以用速率法跟踪给药后细胞的生长，检测细胞耐药性；速率法是指按照预定的时间间隔连续检测标志物的浓度信号随时间的变化；细胞耐药性包括用常规方法不能检测到的耐药性。
4.根据权利要求1所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法，其特征在于，还包括浓度调整步骤：在孵育前调整用于孵育的细胞培养液浓度令所述待检测的活体细胞大致达到更优的生长速度。
5.根据权利要求4所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法，其特征在于，在浓度调整步骤完成后，对细胞培养液的浓度进行稀释，稀释范围是麦氏0.5稀释2-4000倍；或者在所述体外活细胞为快生长菌的情况下，使用40倍稀释。
6.根据权利要求5所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法，其特征在于，检测试剂混合物为EZMTT和电子偶联剂。
7.根据权利要求1所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法，其特征在于，还包括抑制率检测步骤：在孵育所述待检测活体细胞同时，将等量的待检测活体细胞加入相同浓度的培养液中制成阳性对照组，并用相同浓度的培养液不加待检测活体细胞制成阴性对照组；进一步与阳性和阴性对照组孵育后检测标志物的浓度进行比对，得到所述待测化合物对所述待检测活体细胞的抑制率。
8.根据权利要求2所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法,其特征在于，还包括对细胞耐药性的鉴定步骤：具体包括检测给药后细胞生长速率变化，与相对应的野生型细胞的生长速率进行比较。
9.根据权利要求3所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法,其特征在于，通过连续检测标志物的浓度,检测抑菌化合物和杀菌化合物对细胞的抑制作用。
10.根据权利要求1所述的用于体外活细胞的耐药性检测的方法,其特征在于，所述活体细胞包括能产生NAD(P)H的真菌、细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、传染性生物体、各种耐药和不耐药细胞、及动物和人体细胞。
11.一种用于体外活细胞的耐药性检测的混合物，用于对待检测的活体细胞进行孵育，包括培养基以及检测试剂混合物；所述检测试剂混合物包括具有以下结构通式的化合物：
其中，
A1为和所述
相连接的芳香基或杂环基团；
A2为和所述
相连接的芳香基或杂环基团；
A3为和所述
相连接的苯基；
R1为H或者和所述A1相连接的至少一个R1取代基，所述R1取代基分别独立地选自-NO2、-SO3H、-SO2NH2、卤族元素、和所述A1稠合的杂环基团、烷基；
R2为H或者和所述A2相连接的至少一个R2取代基，所述R2取代基分别独立地选自NO2,甲氧基，烷基，通过叠氮基连接的苯基及其衍生物、卤素原子,磺酸基及其盐、和所述A2稠合的苯基或杂环基团；
R3为和所述A3相连接的R3取代基；所述R3取代基分别独立地选自磺酸基，羧酸基，取代磺酸基，取代羧酸基；
所述杂环基团包括1-2个杂原子，所述杂原子分别独立地选自Se，N、S或O。
12.根据权利要求11所述的用于体外活细胞的耐药性检测的混合物，其特征在于，所述检测试剂混合物的R3选自：
13.根据权利要求11所述的用于体外活细胞的耐药性检测的混合物，其特征在于，所述检测试剂混合物的芳香基或杂环基团各自独立地选自
14.根据权利要求11所述的用于体外活细胞的耐药性检测的混合物，其特征在于，还包括增敏剂；所述增敏剂包括PMS及其衍生物。
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