CN111304278A - 一种药敏试剂盒 - Google Patents

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CN111304278A CN202010113982.0A CN202010113982A CN111304278A CN 111304278 A CN111304278 A CN 111304278A CN 202010113982 A CN202010113982 A CN 202010113982A CN 111304278 A CN111304278 A CN 111304278A
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胡庆丰
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Abstract

本发明公开了一种药敏试剂盒，包括药板、检测试剂和细菌培养装置，所述检测试剂以EZMTT作为药敏指示剂，用于定量和定性分析细胞中的脱氢酶及NAD(P)H的含量来检测细菌的活力和数量。本发明首次通过EZMTT作为药敏指示剂定量分析细胞中的脱氢酶及NAD(P)H的含量来检测细菌的活力和数量,通过酶标仪检测吸光度来间接反应细菌存活情况的；可以快速检测細菌的MIC值和耐药性,同时灵敏检测到传统的浊度法检测不到的細菌异质性耐药的信息。

Description

一种药敏试剂盒
技术领域
本发明涉及一种药敏试剂盒。
背景技术
细菌感染是常见病症，不幸的是细菌的抗生素耐药性已成为了全世界严重的公共卫生问题。它延长了病人住院时间并大大增加了与传染病相关的死亡率。耐药机制包括外排泵的诱导，抗性生物的DNA转移和自发突变。即使自发突变估计为106-108细胞中的1个，这将导致异质性耐药性，长期药物治疗可促进这一小群耐药性细菌的生长,目前除了PCR-DNA测序外,没有现有活菌检测方法无法检测到微量的异质性耐药菌。因此，除了开发新药来治疗多药耐药性，我们还可以研发一种可靠地敏感方法检测“隐藏”耐药性。这对限制耐药细菌的未来发生，从而改善传染病的治疗效果。
传统抗生素敏感性试验(AST)基于细胞密度的方法，用于快速生长的细菌，如浊度法，纸片扩散法，肉汤稀释法，琼脂稀释或E-tests实验方法，最近自动化VITEK药物敏感性分析系统用于临床诊断[7]。浊度法简单，可以在各种条件下连续监测细胞生长，但是灵敏度低，临床上使用80％的生长抑制作为鉴定抗性细菌的截止值。间接阻抗法[8]测量生物电信号响应细胞数量的变化，但需要复杂的仪器。BactT/ALERT常规血培养瓶通过氧耗竭检测微生物生长，并且需要厌氧条件，因此细菌必须在密封的管或隔室中生长，这不利于高通量的基于板的AST测定。MTT测定是IC50测量的传统方法，但MTT法对细菌有毒性，只能用作终点测定。且研究表明终点IC50测量不够精确，不足以检测部分耐药性。
目前细菌耐药性已成为一个日益严重的全球性公共卫生问题，预计2050年,多重耐药菌造成的死亡率每年可达1000万,超过癌症死亡率。大量的耐药菌的出现也进一步说明了现有的检测方法不够精准灵敏.因此急待有新方法来解决这个问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种药敏试剂盒，首次通过EZMTT作为药敏指示剂定量分析细胞中的脱氢酶及NAD(P)H的含量来检测细菌的活力和数量,通过酶标仪检测吸光度来间接反应细菌存活情况的；可以快速检测細菌的MIC值和耐药性,同时灵敏检测到传统的浊度法检测不到的細菌异质性耐药的信息。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种药敏试剂盒，包括革兰氏阴性菌药板、检测试剂和细菌培养装置，其特征在于，所述检测试剂以可被氧化还原产生吸光度或荧光变化的四氮唑盐作为药敏指示剂，将指示剂与细菌和革兰氏阴性菌药板中的药物一次性混合共浴，用于连续定量分析细胞中的脱氢酶及NAD(P)H的含量来检测细菌的活力和数量。
进一步的，所述四氮唑盐为EZMTT。
进一步的，所述细菌培养装置为管子、96孔板或384孔板。
进一步的，所述革兰氏阴性菌药板如下：
Figure BDA0002390921150000021
Figure BDA0002390921150000031
Figure BDA0002390921150000041
进一步的，所述革兰氏阳性菌药板如下：
Figure BDA0002390921150000042
Figure BDA0002390921150000051
进一步的，所述药板的药物是所述药敏试剂盒的组分的任意组合，或添加新的抗菌素。
一种药敏试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
将菌株、培养基、检测试剂按比例混合后,加入含药管子、含药96孔板或含药384孔板；
于37℃恒温培养箱内反应，每小时目测,并检测OD450nm和OD600-750nm吸光度；
按照如下公式计算计算细胞活力：
活菌活力(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(不加药)-OD(空白)]×100
其中：OD(加药)：具有活菌、EZMTT溶液和药物的孔的OD450nm吸光度；
OD(空白)：具有培养基和EZMTT溶液而没有活菌的孔的OD450nm吸光度；
OD(不加药)：具有活菌、EZMTT溶液而没有药物的孔的OD450nm吸光度；
耐药性判断标准：根据EZMTT法测定的标准菌在药物浓度梯度的生长曲线和实测活菌量,获MIC值,并参照CLSI标准的对应MIC值,判定耐药与否；
进一步的，药板的药敏可以通过目测颜色变化来定性检测：根据EZMTT法测定的细菌在不同药物浓度条件下的颜色变化(浅黄色变为红棕色),获MIC值,并参照CLSI标准判定耐药与否。
进一步的，所述菌株包括革兰氏阴性和阳性菌株，也包括真菌，分支杆菌和结核杆菌。
更进一步的，所述菌株包括大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布式杆菌、流感副流感杆菌、卡他杆菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、绿脓杆菌、(副)百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、皮氏不动杆菌、奇异变形杆菌、洋葱假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、粪肠球菌、粘质沙雷氏菌、无乳链球菌、脑膜炎双球菌种。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果：
本发明的试剂盒首次通过EZMTT作为药敏指示剂定量检测细菌的活力和数量,通过酶标仪检测吸光度来间接反应细菌存活情况的；快速检测細菌的MIC值和耐药性,同时灵敏检测到传统的浊度法检测不到的“隐藏的”細菌异质性耐药的信息。基于EZMTT法的本医疗器械产品较现有产品或治疗手段在灵敏度、安全、有效、节约等方面发生根本性改进,具有显著临床应用价值。
一步加菌,封闭或不封闭培养,连续跟踪生长.生物操作更安全；能够同时筛选几十种抗菌素和各类革兰氏阴性或阳性菌，高通量药敏检测,价格便宜,时间短,实验成功率高,获得精准的药敏,用于防治多重耐药；24小时检测时间，能够可靠灵敏的检测到单细菌的生长,检测传统浊度法无法检测到的异质性耐药(大肠杆菌的“隐藏耐药”检出率约30％)。
附图说明
下面结合附图说明对本发明作进一步说明。
图1为大肠杆菌ATCC25922在含指示剂和24种药物的96孔板或384孔板上的生长情况示意图。
图2为临床分离的大肠杆菌用EZMTT法检测4小时获得的MIC值与传统浊度法法检测24小时获得的MIC值比较结果。
图3为临床分离的大肠杆菌用EZMTT法检测24小时获得的MIC值与传统浊度法法检测24小时获得的MIC值比较结果,其中EZMTT法可以检测到传统浊度法检测不到的异质性耐药(10-30％的耐药性)。
图4为大肠杆菌(ATCC25922)用EZMTT法检测24小时后的结果。
图5为临床分离的耐药大肠杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图6为临床分离的耐药肺炎克雷伯菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图7为临床分离的耐药不动杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图8为临床分离的鲍曼不动杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图9为临床分离的铜绿菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图10为临床分离的阴沟肠杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图11为临床分离的不动杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图12.为临床分离的奇异变形杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图13为临床分离的洋葱假单胞菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
图14为临床分离的嗜麦芽假单胞菌用EZMTT法检测24小时后的结果。
具体实施方式
1.MH肉汤液体培养基：称取21gMH肉汤粉末，用1000mL去离子水充分溶解，121℃高压灭菌15min。其它肉汤粉末或基础培养基也能用于定性药敏检测。
2.MH肉汤固体培养基：称取21gMH肉汤粉末，15g琼脂粉，用1000mL去离子水充分溶解，121℃高压灭菌15min。
3.药板配置方法
药物用水或有机溶剂溶解后,药物溶液过0.22μm膜灭菌，药物溶液根据药板浓度需要稀释加入,冷冻干燥,低温-20℃保存待用。
革兰氏阳性菌药板1
Figure BDA0002390921150000081
Figure BDA0002390921150000091
Figure BDA0002390921150000101
革兰氏阳性菌药板2
Figure BDA0002390921150000102
0.1NHCl溶液：量取0.9mL盐酸，在玻璃棒搅拌情况下，加入100mL去离子水。
0.9％氯化钠溶液：纯氯化钠9g，加入991mL双蒸水中，搅拌至充分溶解，高压灭菌锅灭菌30min。
4.菌株复苏：从-80℃冰箱取出细菌冻存管，置于冰上，使之溶解，用酒精灯灼烧后的接种环沾取少量菌液，在固体培养基上进行画线，37℃培养24h，直至生长出单一菌落。菌株包括大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布式杆菌、流感副流感杆菌、卡他杆菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、绿脓杆菌、(副)百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌及脑膜炎双球菌等。
5.扩大培养：无菌离心管中加入一定体积的液体培养基，挑取单菌落至液体培养基中，放入37℃恒温摇床，200rpm摇菌，直至生长至所需浓度。
6.将细菌株接种于固体培养基表面，37℃恒温培养24h，待生长出单一菌落，挑取单一菌落，用含1XEZMTT的MH肉汤液体培养基进行扩培，待生长至饱和，调节浓度至麦氏0.5，接种100μL于96孔板中，于37℃恒温培养箱内反应，每小时目测,并检测OD450nm和OD600-750nm吸光度。本实验所有EZMTT吸光度均为450nm。
7.浊度法：取MH肉汤培养基100μL加至含有菌液的孔中,将其置于37℃恒温培养箱内孵育，并每小时检测其OD600-750nm吸光度。
8.计算细胞活力(％)
活菌活力(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(不加药)-OD(空白)]×100
其中：OD(加药)：具有活菌、EZMTT溶液和药物的孔的吸光度
OD(空白)：具有培养基和EZMTT溶液而没有活菌的孔的吸光度
OD(不加药)：具有活菌、EZMTT溶液而没有药物的孔的吸光度
9.耐药性判断标准
根据EZMTT法测定的标准菌在药物浓度梯度的生长曲线和实测活菌量,并参照CLSI标准,对照MIC值,判定耐药与否。
10.药板的定性检测
根据EZMTT法测定的标准菌在药物浓度梯度的生长曲线和实测活菌量,并参照CLSI标准,本试剂盒的耐药性的定性判断标准制定如下:红色孔为耐药,淡黄色为药敏。
表1.EZMTT法和浊度法测得的粪肠ATCC29212菌的MIC值与CLSI标准一致(文件20191108ATCC标准菌)
Figure BDA0002390921150000121
表2.EZMTT法和浊度法测得的铜绿ATCC27853菌的MIC值与CLSI标准一致
Figure BDA0002390921150000122
表3.EZMTT法和浊度法测得的大肠ATCC25922菌的MIC值与CLSI标准一致
Figure BDA0002390921150000131
如图1所示:大肠杆菌ATCC25922在含指示剂和24种药物的96孔板或384孔板上的生长.(类似生长可以在各类肉汤培养基,LB,等细菌培养基中观察到；其它PMS衍生物和四氮唑盐也可以发生颜色变化；但是本试剂盒的MIC与CLSI《抗菌药物敏敏感性试验标准》一致)；深红色为耐药孔,黄色为部分耐药含异质性耐药(通常浊度法检测不到),非常浅的淡黄色为药敏孔。
如图2所示，临床菌的药板检测的结果比较显示4小时的EZMTT法结果与24小时的一致.N＝600,相关率差的为1.6％,这与药物的作用快慢有关,属于正常。
如图3所示，临床菌的药板检测的结果比较显示24小时的EZMTT法结可以发现很多传统浊度法不能发现的耐药(见粗框部分)。
表4.大肠杆菌药敏检测结果比较:EZMTT法(EZ),浊度法(TB)和临床药敏检测(CL；VITEK和KB法)
Figure BDA0002390921150000132
Figure BDA0002390921150000141
a基于EZMTT的生长曲线测量结果S代表对抗生素治疗敏感(<2％生长)，R代表抗性(>20％生长)，HR代表异源抗药性(2-20％生长；隐藏耐药)。
b浊度法的结果；
c基于临床诊断方法的鉴定：S代表对抗生素治疗敏感(<20％生长)，R代表抗性，I代表中间效力；
d临床使用MIC(VITEK)方法；
e临床使用的KB方法。
表5.肺炎克雷伯菌药敏检测结果比较:EZMTT法能检测到临床用(VITEK和KB法)和浊度法检测到的全部耐药
Figure BDA0002390921150000142
Figure BDA0002390921150000151
表6.粪肠球菌药敏检测结果比较:4小时EZMTT法能检测结果与临床用(VITEK和KB法)和浊度法检测结果一致；24小时EZMTT法能检测到隐藏耐药(左氧氟沙星&环丙沙星)
Figure BDA0002390921150000152
表7.铜绿假单胞菌药敏检测结果比较:4小时EZMTT法能检测结果与浊度法检测结果一致，与临床(VITEK和KB法)结果基本一致(除了亚胺培南是不稳定的化合物)；24小时EZMTT法能检测到隐藏耐药(复达欣)
Figure BDA0002390921150000153
如图4为大肠杆菌(ATCC25922)用EZMTT法检测24小时后的结果；其MIC值与CLSI标准一致
如图5为临床分离的耐药大肠杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明这是一种多重耐药菌，但是药物筛选很快获得多种最佳治疗药物。方便快速药效。
如图6为临床分离的耐药肺炎克雷伯菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合肺炎克雷伯菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选很快获得5种最佳治疗药物。方便快速药效。
如图7.为临床分离的耐药不动杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合不动杆菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得3种最佳治疗药物。方便快速药效。
如图8为临床分离的鲍曼不动杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合鲍曼不动杆菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得多种最佳治疗药物。方便快速药效。
如图9为临床分离的铜绿菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合铜绿菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得多种最佳治疗药物。方便快速药效。
如图10为临床分离的阴沟肠杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合阴沟肠杆菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得多种最佳治疗药物。方便快速药效。
如图11为临床分离的不动杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合不动杆菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得最佳治疗药物。方便快速药效。
如图12.为临床分离的奇异变形杆菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合奇异变形杆菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得5-6种最佳治疗药物。方便快速药效。
如图13为临床分离的洋葱假单胞菌用EZMTT法检测24小时后的结果；其结果表明，EZMTT法适合洋葱假单胞菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得最佳治疗药物。方便快速药效。
如图14为临床分离的嗜麦芽假单胞菌用EZMTT法检测24小时后的结果。其结果表明，EZMTT法适合嗜麦芽假单胞菌的耐药检测。并发现这是一种多重耐药菌，但是药物筛选可以很快获得最佳治疗药物。方便快速药效。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种药敏试剂盒，包括革兰氏阴性菌药板、检测试剂和细菌培养装置，其特征在于，所述检测试剂为可被氧化还原产生吸光度或荧光变化的药敏指示剂,将指示剂与细菌和药板中的药物一次性混合共浴，用于连续定量分析细胞中的脱氢酶及NAD(P)H的含量来检测细菌的活力和数量。
2.根据权利要求1所述的药敏试剂盒，其特征在于,所述药敏指示剂为四氮唑盐,优选的为EZMTT。
3.根据权利要求1所述的药敏试剂盒，其特征在于，所述细菌培养装置为管子、96孔板或384孔板。
4.根据权利要求1所述的药敏试剂盒，其特征在于，所述革兰氏阴性菌药板的药物如下：
Figure FDA0002390921140000011
Figure FDA0002390921140000021
Figure FDA0002390921140000031
5.根据权利要求4所述的药敏试剂盒，其特征在于，所述革兰氏阳性菌药板的药物如下：
抗菌素 浓度范围(μg/ml) 浓度点 *青霉素 0.03-64 0.06,0.12,0.25,4,8,16,32 利福平 0.5-16 1,4,8 呋喃妥因 16-128 32,128 氨苄西林 0.03-64 0.06,0.25,8,16,32 万古霉素 0.5-64 1,2,4,16,32 头孢西丁 3-24 6,12 苯唑西林 0.03-16 0.06,0.5,2,4,8 氯霉素 1-128 4,8,16,32,64 替加环素 0.2-8 0.5,2 红霉素 0.12-32 0.25,0.5,1,2,8,16 克林霉素 0.12-16 0.25,0.5,1,2,4,8 利奈唑胺 1-32 2,4,8,16 环丙沙星 1-16 1,4,8 左氧氟沙星 0.5-32 1,2,4,8,16 莫西沙星 0.25-16 0.5,1,2,4,8 四环素 0.5-64 1,2,4,8,16,32 链霉素(高水平)1000 1000 1000 头孢噻肟 0.025-16 0.05,0.5,1,2,4,8 庆大霉素 2-500 4,16,32,500 *达托霉素 0.5-16 1,4,8 阿奇霉素 0.25-16 0.5,2,4,8 甲氧苄啶磺胺甲噁唑 0.5/9.5-8/152 0.5/9.5,2/38,4/76
6.根据权利要求1所述的药敏试剂盒，其特征在于，所述药板的药物是权利要求4或5所述的药敏试剂盒的组分的任意组合，或添加新的抗菌素。
7.一种药敏试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
将菌株、培养基、检测试剂按比例混合后,加入含药管子、含药96孔板或含药384孔板；
于37℃恒温培养箱内反应，每小时目测,并检测OD450nm和OD600-750nm吸光度；
按照如下公式计算计算细胞活力：
活菌活力(％)＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(不加药)-OD(空白)]×100
其中：OD(加药)：具有活菌、EZMTT溶液和药物的孔的OD450nm吸光度；
OD(空白)：具有培养基和EZMTT溶液而没有活菌的孔的OD450nm吸光度；
OD(不加药)：具有活菌、EZMTT溶液而没有药物的孔的OD450nm吸光度；
耐药性判断标准：根据EZMTT法测定的标准菌在药物浓度梯度的生长曲线和实测活菌量,获MIC值,并参照CLSI标准的对应MIC值,判定耐药与否。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，药板的药敏可以通过目测颜色变化来定性检测：根据EZMTT法测定的细菌在不同药物浓度条件下的颜色变化(浅黄色变为红棕色),获MIC值,并参照CLSI标准判定耐药与否。
9.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述菌株包括革兰氏阴性和阳性菌株，也包括真菌、分支杆菌和结核杆菌。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述菌株包括大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布式杆菌、流感副流感杆菌、卡他杆菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、绿脓杆菌、(副)百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、皮氏不动杆菌、奇异变形杆菌、洋葱假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、粪肠球菌、粘质沙雷氏菌、无乳链球菌、脑膜炎双球菌种。
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