CN107365827A - 一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法 - Google Patents

一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107365827A
CN107365827A CN201610310459.0A CN201610310459A CN107365827A CN 107365827 A CN107365827 A CN 107365827A CN 201610310459 A CN201610310459 A CN 201610310459A CN 107365827 A CN107365827 A CN 107365827A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
sulfonic acid
detection
cell viability
single sulfonic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610310459.0A
Other languages
English (en)
Inventor
阮奔放
阮健昵福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Jian Fu In Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Hangzhou Jian Fu In Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Jian Fu In Biological Technology Co Ltd filed Critical Hangzhou Jian Fu In Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201610310459.0A priority Critical patent/CN107365827A/zh
Publication of CN107365827A publication Critical patent/CN107365827A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及医学生物检测技术领域，利用新型单磺酸四氮唑盐试剂的颜色变化实时监测细胞活力，提供了一种细胞活力的检测方法。测试剂选用单磺酸四氮唑盐检测体系，在NAD(P)H水平及活细胞数量上呈现良好的线性剂量关系；测试剂通过单磺酸四氮唑盐反应物在450nm的吸光度值，得到EC50曲线，进行细胞活力评价。本发明的检测方法是一种基于细胞高度灵敏的检测方法。单磺酸四氮唑盐细胞毒性小，适用于活细胞基础试验；单磺酸四氮唑盐试剂温和且检测后的细胞可经漂洗进一步用于后续实验；单磺酸四氮唑盐试剂不易与还原性物质反应，干扰小；该试剂适用范围广，包括环境微生物富集后的检测，藻类、真菌及动植物细胞活力的检测，细胞及组织病变的检测。

Description

一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，尤其涉及将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法。
背景技术
NAD(P)+/NAD(P)H是一类重要的辅酶因子，存在于所有生物体中，包括细菌、放线菌、蓝藻、酵母菌、霉菌、真菌，一般动植物，其作为反应介质参与多种生命过程，包括能量代谢，线粒体功能，钙稳态，氧化应激，基因调节，免疫功能，老化和细胞死亡等。因此，一种基于细胞水平、灵敏低毒的检测方法来测定NAD(P)H或与其相关酶反应的变化，在科研、环境保持、医疗诊断等应用中具有关键的作用。
已报道有多种不同类型的四氮唑盐可测定细胞活力，例如TTC、MTT、WST-8。TTC(2,3,5-三苯基四氮唑)为脂溶性光敏感复合物，剧毒，高温会被严重破坏。MTT(3(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2 5-苯基-2-四氮唑)是一种接受氢离子的染料，它与TTC在检测细胞活性试验中生成的甲臜水溶性极差，需加有机试剂(如DMSO)进行溶解，易发生溶解不完全进而影响实验准确性，且吸取上清液操作时易带走部分细胞。另一方面，MTT除被线粒体脱氢酶类还原外，还可被多种其他物质还原，如血清白蛋白，L-抗坏血酸，β-巯基乙醇，谷胱甘肽s-转移酶等，而目前市面上最常用的试剂CCK8(WST-8)经实验证实也会被β-巯基乙醇、EGCG等抗氧化剂还原，导致检测细胞活力试验中出现假阳性。
专利CN201510757078.2-一类具有单磺酸苯基四氮唑结构的化合物及其应用提供了单磺酸四氮唑化合物的合成方法，简言之，在65℃下将4-硝基苯肼(0.958g)溶解于甲醇(22ml)中，在50℃下用2-甲酰基苯磺酸钠(1.188g)处理2小时。经处理后，得到橙红色固体肼，产率87％。在第二步中，将所得的肼(0.614g)溶于20ml甲醇中，与新鲜制备的2-甲氧基-4-硝基苯重氮盐(0.36g)和1mol/L氢氧化钠(0.9ml)在0℃下反应2小时，然后升温至25℃反应2hrs。后处理后，得到甲臜，产率85％。在第三步中，在0℃将甲臜(0.522g)溶于甲醇(18ml)，加入37％的HCl(2g)，用过氧化氢(2.27ml，20mM)氧化2hrs，然后在25℃过夜反应。后处理和硅胶柱纯化后，得到了四氮唑盐EZMTT，产率99％，纯度45％。
发明内容
单磺酸四氮唑盐作为一种新型的单磺酸四氮唑化合物，实验原理与WST-8类似：在电子耦合试剂1-methoxy PMS存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，通过酶标仪测定450nm波长OD值。活细胞数量越多，则吸光度越高。单磺酸四氮唑盐相应的甲臜产物高度水溶、细胞毒性低、灵敏度高、具有抗氧化性药物筛选不产生假阳性，因此在药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等应用上具有广阔的前景。
利用新型单磺酸四氮唑盐试剂的颜色变化实时监测细胞活力，提供了一种细胞活力的检测方法。测试剂选用单磺酸四氮唑盐检测体系，在NAD(P)H水平及活细胞数量上呈现良好的线性剂量关系；测试剂通过单磺酸四氮唑盐反应物在450nm的吸光度值，得到EC50曲线，进行细胞活力评价。
本发明的检测方法是一种基于细胞高度灵敏的检测方法。本发明方法中提供的单磺酸四氮唑盐细胞毒性小，适用于活细胞基础试验；单磺酸四氮唑盐试剂温和且检测后的细胞可经漂洗进一步用于后续实验；单磺酸四氮唑盐试剂不易与还原性物质反应，干扰小；该试剂适用范围广，包括环境微生物富集后的检测，藻类、真菌及动植物细胞活力的检测，细胞及组织病变的检测。
本发明针对现有技术的缺点，提供了一种细胞活力检测方法；包括如下内容：
一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途，其特征在于：所述的单磺酸四氮唑盐化学式为：
一种细胞活力的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：
步骤一、在培育好的含待测细胞的培养基中加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，培育1小时以上；
步骤二、在450±20nm处测定其吸光度，得到标准曲线；通过观察待测细胞的剂量响应对细胞活力进行评价。
所述的单磺酸四氮唑盐检测试剂包括单磺酸四氮唑盐或含有培养基的单磺酸四氮唑盐与1-methoxy PMS。
优选地，所述的一种细胞活力的检测方法中的单磺酸四氮唑盐的浓度为0.1～10mM，1-methoxy PMS的浓度为5～25μM。
优选地，所述的一种细胞活力的检测方法，用于对哺乳动物细胞活力的检测，所述的哺乳动物细胞包括精子、卵母细胞、胚胎细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、红细胞、血小板、免疫细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞、内分泌细胞；
包括如下步骤：
步骤一、将哺乳动物细胞接种于盛有RPMI 1640培养基的透明板，一般选用96孔板，每100ul的培养基中培养104个细胞，放入培养箱培育3～5小时，根据需要设定温度；
步骤二、培育完成后，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时以上，测定450nm的吸光度，得到标准曲线，观察细胞数目的剂量响应；
优选地，所述的细胞活力的检测方法，用于对化合物对细胞毒性的检测，包括如下步骤：
步骤一、将待测细胞接种于盛有RPMI 1640培养基的透明板，一般选用96孔板，每100ul的培养基中培养104个细胞，放入培养箱培育3～5小时，根据需要设定温度；
步骤二、培育完成后，加入一定浓度的待测化合物，孕育2～5天，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时以上，测定450nm的吸光度，得到EC50值，通过生长抑制或细胞毒性进行细胞活力评价。
优选地，一种细胞活力的检测方法，用于环境微生物检测，包括如下步骤：
步骤一、采集不同环境中样品5～1000ml，高速离心富集，灭菌水稀释1～5倍；
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育0.5～4小时，测定450nm的吸光度，得到EC50值。
优选地，一种细胞活力的检测方法，用于细菌、真菌、生物放线菌细胞活力检测，所述的细菌包括乳酸菌、硝化细菌、大肠杆菌、肺炎双球菌；各类细胞结构生物放线菌；蓝藻包括颤藻、篮球藻、念珠藻；绝大多数单细胞藻类包括 衣藻、绿藻；真菌包括食用菌、酵母菌、霉菌；大肠杆菌，
包括如下步骤：
步骤一、将上述细胞接种于盛有培养基的透明板，一般选用96孔板，双蒸水依次2倍稀释，
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育0.5～4小时，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
优选地，一种细胞活力的检测方法，用于动物组织标本细胞活力的检测，包括如下步骤：
步骤一、将动物组织用机械或消化酶处理，过筛，用无菌缓冲液释稀，得到单个存在的动物细胞；接种于盛有培养基的透明板，一般选用96孔板，每100ul的培养基中培养104个细胞，放入培养箱培育3～5小时，根据需要设定温度，培育2～5天；
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时，测定450nm的吸光度，得到EC50值，进行细胞活力评价。
优选地，一种细胞活力的检测方法，用于植物组织标本细胞活力的检测，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、将植物组织用果胶酶来处理，破坏植物间的胞间层，这样就能获得单个植物细胞；或用纤维素酶和果胶酶来处理，获得植物细胞的原生质体，再培养出细胞壁，从而得到单个植物细胞；接种于盛有培养基的透明板，一般选用96孔板，每100ul的MS培养基或B5培养基中培养104个细胞，小通气量培养，放入培养箱培育3～5小时，根据需要设定温度，培育2～5天；
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时，测定450nm的吸光度，得到EC50值，进行细胞活力评价。
优选地，一种细胞活力的检测方法，用于对病变细胞的NADH和NADPH含量变化的检测。
具体地，细胞活力检测方法，根据不同的细胞包括如下不同的步骤：
1.大肠杆菌培养于细菌液体培养基中，37℃、220～250rpm摇床培养，接种于盛有培养基的96孔板，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
细菌液体培养基可用LB培养基为(1.0％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1.0％NaCl，pH 7.4)
2.酿酒酵母菌在液体培养基30℃、220～250rpm摇床中培养，接种于盛有培养基的96孔板，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
酵母菌培养基：12.0％葡萄糖、2.0％红砂糖、3.0％蛋白胨、1.0％酵母粉、0.1％KH2PO4、1.0％K2HPO4、0.1％MgSO4·7H2O、0.1％NaCl，pH 6.0
3.链霉菌于发酵培养基中，28℃、220～250rpm摇床培养，接种于盛有培养基的96孔板，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
链霉菌发酵培养基：3.0％可溶性淀粉，1.0％蔗糖，0.5％葡萄糖、0.8％麦芽糖、1.2％黄豆饼粉、0.4％蛋白胨、1.2％鱼粉、0.6％酵母粉、0.2％(NH4)2S04、0.35％MgSO4，0.02％KH2P04、0.4％CaC03、0.075％NaN03，pH 7.0
4.种子用出糙机剥壳，30℃清水中浸泡2～5小时，双面刀片通过胚部纵切，置于试管内。加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，试管加塞，在35℃条件下反应1小时以上。测定溶液450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
5.采集不同环境中样品5～1000ml，高速离心富集，加入含培养剂的单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时以上，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
6.细胞接种于盛有培养基的96孔板，每100ul的培养基中培养104个细胞，放入培养箱培育，根据需要设定温度。培育完成后，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育1小时以上，测定450nm的吸光度，得到标准曲线，观察细胞数目的剂量响应。
7.细胞接种于盛有培养基的96孔板，每100ul的培养基中培养104个细胞，放入培养箱培育3～5小时，根据需要设定温度。培育完成后，加化合物，放入培养箱中培养2～5天；吸净培养基，加入含新鲜培养基的单磺酸四氮唑盐检测试剂，培育1～5小时，测定450nm的吸光度，得到EC50曲线，进行细胞活力评价。
8.测试剂为单磺酸四氮唑盐检测试剂和1-methoxy PMS，(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐)含有检测试剂的培养基中，单磺酸四氮唑盐检测试剂的浓度为0.1～1mM，1-methoxy PMS的浓度为5～25uM；
实验原理
在电子耦合试剂1-methoxy PMS存在的情况下，单磺酸四氮唑盐检测试剂可 以被NAD(P)H体系或细胞线粒体中脱氢酶还原，生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，在450nm处有紫外吸收。
本发明的检测方法是一种基于细胞的高度灵敏的检测方法。本发明方法中用到了单磺酸四氮唑盐检测试剂，适用于NAD(P)H体系及活细胞的基础试验，可用于检测细胞活力。
目前，CCK-8(或WST-8)、MTT、XTT或MTS测定试剂盒已被开发应用于细胞增殖和细胞毒性的测定。其中，CCK-8(或WST-8)应用最为广泛，则单磺酸四氮唑盐检测试剂以WST-8来进行比较。
(1)本发明方法中，化合物毒性检测发现WST-8的IC50为0.65mM，而单磺酸四氮唑盐检测试剂的EC50为1.25mM。当检测剂终浓度为0.5mM时，WST-8有毒性其抑制率大约40％，而单磺酸四氮唑盐检测试剂基本无毒无抑制，这表明本发明选用的单磺酸四氮唑盐检测试剂试剂更温和且检测后的细胞可经漂洗用于后续进一步实验。
(2)本发明方法(即单磺酸四氮唑盐检测试剂测定法)的重现性是利用z因子来进行评估，A549细胞(每孔20000个细胞)作为阳性对照值和不含细胞的培养基作为阴性对照值。阴性对照组表明背景峰为0.127±0.014Abs，而阳性对照组数值为1.021±0.104Abs，因此，单磺酸四氮唑盐检测试剂的z因子值为0.7；表明本发明测定法重复性更好；具体效果见图1。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是利用z因子评估单磺酸四氮唑盐检测试剂检测细胞活力的重现性效果示意图。
图2是实施例1中大肠杆菌细胞数量线性剂量反应检测图。
图3是实施例2中酿酒酵母细胞数量线性剂量反应检测图。
图4是实施例3中链霉菌细胞数量线性剂量反应检测图。
图5是实施例5中细胞数量线性剂量反应检测图。
图6是实施例6中细胞生长的细胞毒性试验检测图；实线为选用单磺酸四氮 唑盐检测试剂时的曲线，虚线为选用WST-8时的曲线。
图7是实施例7中不同细胞活力测试结果示意图。
图8是实施例8中不同化合物通过生长抑制或细胞毒性进行细胞活力评价效果示意图，化合物包括HJ 7、HJ 8、HJ 14、HJ 15、HJ 47。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1
大肠杆菌细胞活力检测方法，包括以下步骤
大肠杆菌接种于LB固体培养基，37℃恒温恒湿箱培养过夜；1:10～1:20比例扩培于LB液体培养基，37℃，220rpm，摇床中培养16～22小时；到时间后，测得OD600为3～5，接种于盛有培养基的96孔板，依次两倍稀释。再加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育0～1小时，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
实施例2
酿酒酵母细胞活力检测方法，包括以下步骤
酿酒酵母菌接种于酵母菌培养基，30℃，220rpm，摇床中培养18～22小时；到时间后，测得OD600为3～5，接种于盛有培养基的96孔板，依次两倍稀释。再加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育0～1小时，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
实施例3
链霉菌细胞活力检测方法，包括以下步骤
链霉菌接种于链霉菌培养基，28℃，250rpm，摇床中培养18～22小时；到时间后，测得OD600为3～5，接种于盛有培养基的96孔板，依次两倍稀释。再加入单磺酸四氮唑盐检测试剂培育0～1小时，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
实施例4
种子活力检测方法，包括以下步骤
不同批次种子，用出糙机剥壳，30℃清水中浸泡2～5小时，双面刀片通过胚部纵切，置于试管内。加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，试管加塞，在35℃条件下反应1小时以上。测定溶液450nm的吸光度，进行种子活力评价。
不同水稻品种活力测定见下表：
实施例5
人源细胞接种于盛有100ul培养基的96孔板，每孔0～105个细胞，放入培养箱培育2～5小时，培育过程中根据需要设定温度。培育完成后，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，继续培育1小时后测定450nm的吸光度，得到标准曲线，观察细胞数目的剂量响应；
实施例6
人源细胞接种于盛有100ul培养基的96孔板，每孔104个细胞，放入培养箱培育2～5小时，培育过程中根据需要设定温度。培育完成后，加入0～10mM化合物单磺酸四氮唑盐检测试剂和WST-8，继续培育2～5天。加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，1小时后测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
实施例7
不同来源细胞接种于盛有100ul培养基的96孔板，每孔104个细胞，放入培养箱培育2～5天。加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，1小时后测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
实施例8
人源细胞接种于盛有RPMI 1640培养基的96孔板，每100ul的RPMI 1640 培养基中培养104个细胞，放入CO2培养箱培育2～5小时，培育过程中培养箱温度控制在37℃，培育完成后，取100ul含化合物的RPMI 1640培养基加入细胞中，化合物的浓度0～10μM，放入CO2培养箱中培养3～5天；然后加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，1小时后，测定450nm的吸光度，得到EC50曲线，通过生长抑制或细胞毒性进行细胞活力评价；
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其化合物所取名称等可以不同，凡依本发明专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途，其特征在于：所述的单磺酸四氮唑盐化学式为：
2.一种细胞活力的检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括如下步骤：
步骤一、在培育好的含待测细胞的培养基中加入单磺酸四氮唑盐检测试剂，培育1小时以上；
步骤二、在450±20nm处测定其吸光度，得到标准曲线；通过观察待测细胞的剂量响应对细胞活力进行评价。
所述的单磺酸四氮唑盐检测试剂包括单磺酸四氮唑盐或含有培养基的单磺酸四氮唑盐与1-methoxy PMS。
3.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，其特征在于：所述的单磺酸四氮唑盐的浓度为0.1～10mM，1-methoxy PMS的浓度为5～25μM。
4.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，用于对哺乳动物细胞活力的检测，其特征在于所述的哺乳动物细胞包括精子、卵母细胞、胚胎细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、红细胞、血小板、免疫细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞、内分泌细胞；
包括如下步骤：
步骤一、将哺乳动物细胞接种于盛有细胞培养基的透明板，接种细胞104至105个每ml，放入培养箱培育3～5小时；
步骤二、培育完成后，加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时以上，测定450nm的吸光度，得到标准曲线，观察细胞数目的剂量响应。
5.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，用于对化合物对细胞毒性的检测，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、将待测细胞接种于盛有细胞培养基的透明板，接种细胞，放入培养箱培育3～5小时；
步骤二、培育完成后，加入一定浓度的待测化合物，孕育2～5天，加入单 磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时以上，测定450nm的吸光度，得到EC50值，通过生长抑制或细胞毒性进行细胞活力评价。
6.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，用于对环境微生物检测，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、采集不同环境中样品5～1000ml，高速离心富集，灭菌水稀释1～5倍；
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育0.5～4小时，测定450nm的吸光度，得到EC50值。
7.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，用于非哺乳类动物细胞活力检测，其特征在于所述的细菌包括乳酸菌、硝化细菌、大肠杆菌、肺炎双球菌，各类细胞结构生物放线菌，蓝藻包括颤藻、篮球藻、念珠藻，绝大多数单细胞藻类包括衣藻、绿藻，真菌包括食用菌、酵母菌、霉菌；
包括如下步骤：
步骤一、将上述细胞接种于盛有培养基的透明板，双蒸水依次2倍稀释，
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育0.5～4小时，测定450nm的吸光度，进行细胞活力评价。
8.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，用于动物组织标本细胞活力的检测，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、将动物组织用机械或消化酶处理，过筛，用无菌缓冲液释稀，得到单个存在的动物细胞；接种于培养基中，放入培养箱培育3～5小时，根据需要设定温度，培育2～5天；
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时，测定450nm的吸光度，得到EC50值，进行细胞活力评价。
9.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，用于植物组织标本细胞活力的检测，其特征在于包括如下步骤：
步骤一、将植物组织用果胶酶来处理，破坏植物间的胞间层，这样就能获得单个植物细胞；或用纤维素酶和果胶酶来处理，获得植物细胞的原生质体，再 培养出细胞壁，从而得到单个植物细胞；接种于盛有培养基，放入培养箱培育；
步骤二、加入单磺酸四氮唑盐检测试剂孕育1小时，测定450nm的吸光度，得到EC50值，进行细胞活力评价。
10.根据权利要求2所述的一种细胞活力的检测方法，用于对病变细胞的NADH和NADPH含量变化的检测。
CN201610310459.0A 2016-05-11 2016-05-11 一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法 Pending CN107365827A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610310459.0A CN107365827A (zh) 2016-05-11 2016-05-11 一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610310459.0A CN107365827A (zh) 2016-05-11 2016-05-11 一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107365827A true CN107365827A (zh) 2017-11-21

Family

ID=60304643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610310459.0A Pending CN107365827A (zh) 2016-05-11 2016-05-11 一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107365827A (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110286097A (zh) * 2019-07-31 2019-09-27 昆山迪安医学检验实验室有限公司 一种肿瘤细胞活力的四唑盐诊断试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法
CN110296969A (zh) * 2019-07-31 2019-10-01 昆山迪安医学检验实验室有限公司 一种水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法
CN110714050A (zh) * 2018-07-13 2020-01-21 永州职业技术学院 一种基于多种微生物的急性毒性试验方法及其试剂盒
CN110967230A (zh) * 2019-11-22 2020-04-07 珠海高瑞特医疗科技有限公司 一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒
CN111286525A (zh) * 2018-06-28 2020-06-16 安吉汉菁生物科技有限公司 用于体外活细胞的耐药性检测的方法及培养液
CN111304278A (zh) * 2020-02-24 2020-06-19 杭州伽玛生物科技有限公司 一种药敏试剂盒
CN111500670A (zh) * 2020-04-20 2020-08-07 杭州伽玛生物科技有限公司 一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用
CN111758032A (zh) * 2018-02-23 2020-10-09 希森美康株式会社 尿中酮体检测用试验片
CN113125689A (zh) * 2021-03-29 2021-07-16 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种新型mtt细胞活力检测试剂盒及其应用
CN113122607A (zh) * 2021-03-29 2021-07-16 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种新型cck8细胞活力检测试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101551382A (zh) * 2009-05-12 2009-10-07 镇江旋光生化有限公司 细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用
CN103808678A (zh) * 2014-02-25 2014-05-21 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种测定细胞活力的方法、试剂盒及其应用
CN105418526A (zh) * 2015-11-09 2016-03-23 杭州伽玛生物科技有限公司 一类具有单磺酸苯基四氮唑结构的化合物及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101551382A (zh) * 2009-05-12 2009-10-07 镇江旋光生化有限公司 细胞活力检测试剂盒及其制备方法、应用
CN103808678A (zh) * 2014-02-25 2014-05-21 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种测定细胞活力的方法、试剂盒及其应用
CN105418526A (zh) * 2015-11-09 2016-03-23 杭州伽玛生物科技有限公司 一类具有单磺酸苯基四氮唑结构的化合物及其应用

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111758032A (zh) * 2018-02-23 2020-10-09 希森美康株式会社 尿中酮体检测用试验片
CN111286525A (zh) * 2018-06-28 2020-06-16 安吉汉菁生物科技有限公司 用于体外活细胞的耐药性检测的方法及培养液
CN110714050A (zh) * 2018-07-13 2020-01-21 永州职业技术学院 一种基于多种微生物的急性毒性试验方法及其试剂盒
CN110296969A (zh) * 2019-07-31 2019-10-01 昆山迪安医学检验实验室有限公司 一种水溶性生化四氮唑盐荧光检测试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法
CN110286097A (zh) * 2019-07-31 2019-09-27 昆山迪安医学检验实验室有限公司 一种肿瘤细胞活力的四唑盐诊断试剂的制备方法及其肿瘤细胞活力的检测方法
CN110967230B (zh) * 2019-11-22 2022-05-31 珠海高瑞特医疗科技有限公司 一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒
CN110967230A (zh) * 2019-11-22 2020-04-07 珠海高瑞特医疗科技有限公司 一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒
CN111304278A (zh) * 2020-02-24 2020-06-19 杭州伽玛生物科技有限公司 一种药敏试剂盒
CN111500670A (zh) * 2020-04-20 2020-08-07 杭州伽玛生物科技有限公司 一种高通量药敏检测试剂盒及其使用方法和应用
CN113122607A (zh) * 2021-03-29 2021-07-16 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种新型cck8细胞活力检测试剂盒及其应用
CN113122607B (zh) * 2021-03-29 2022-01-04 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种新型cck8细胞活力检测试剂盒及其应用
CN113125689B (zh) * 2021-03-29 2022-02-22 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种新型mtt细胞活力检测试剂盒及其应用
CN113125689A (zh) * 2021-03-29 2021-07-16 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种新型mtt细胞活力检测试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107365827A (zh) 一种将单磺酸四氮唑盐用于检测细胞活力的用途及方法
Kludze et al. Aerenchyma formation and methane and oxygen exchange in rice
Zhang et al. Effects of erythromycin and sulfamethoxazole on Microcystis aeruginosa: cytotoxic endpoints, production and release of microcystin-LR
Oberholster et al. Microcystis aeruginosa: source of toxic microcystins in drinking water
Fu et al. Antifungal metabolites from Phomopsis sp. By254, an endophytic fungus in Gossypium hirsutum
Logrieco et al. Beauvericin: chemistry, biology and significance
Galhano et al. Changes in fatty acid profile and antioxidant systems in a Nostoc muscorum strain exposed to the herbicide bentazon
Li et al. Applicability of the MTT assay for measuring viability of cyanobacteria and algae, specifically for Microcystis aeruginosa (Chroococcales, Cyanobacteria)
CN107189986A (zh) 一种基于内质网应激的报告基因细胞株构建方法及其应用
Al-Ouqaili Depending on HPLC and PCR, detection of aflatoxin B1 extracted from Aspergillus flavus strains and it’ s cytotoxic effect on AFB treated-hematopoietic stem cells obtained from human umbilical cord
Sun et al. Effects of Pb and Ni stress on oxidative stress parameters in three moss species
CN104342472B (zh) 一种小球藻抑菌肽的制备方法
CN102875551A (zh) 一种氯代生物碱类化合物及其制备和应用
WO2000031292A1 (fr) Procede de comptage de cellules vivantes
Daroodi et al. Function of the endophytic fungus Acrophialophora jodhpurensis, methionine, and nitric oxide in wheat resistance induction against Fusarium graminearum via interplay of reactive oxygen species and iron
Shabana et al. Effect of pendimethalin on growth and photosynthetic activity of Protosiphon botryoides in different nutrient states
EP1700919A1 (en) Biosensor having soil microorganism housed therein and use thereof
Harirchi et al. Sampling, preservation, and growth monitoring of filamentous fungi
Singh et al. Physiological interactions in Azolla-Anabaena system adapting to the salt stress
Jaiswal et al. Characterization of the biocidal spectrum of extracellular filtrates of Microcystis aeruginosa
Al-Ouqaili et al. Detection of Aflatoxigenic and Non-Aflatoxigenic Isolates of Aspergillus flavus Isolated From Some Clinical and Environmental Sources by HPLC and PCR Techniques
DH et al. Antibiofilm activity of Streptomyces toxytricini Fz94 against Candida albicans ATCC 10231
CN110283748A (zh) 蜡样芽孢杆菌发酵培养基和提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法
CN1966714B (zh) 一种对稻曲病菌进行药剂抑菌活性的快速测定方法
Rathna Kala et al. Microbial production of antibiotics from mangrove ecosystem

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination