CN111440777A

CN111440777A - L-氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN111440777A
Application number: CN202010520656.1A
Authority: CN
Inventors: 洪浩; 詹姆斯·盖吉; 肖毅; 赵军旗; 张娜; 焦学成; 王姝玉; 张燕清; 孟翔宇
Original assignee: Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Current assignee: Tianjin Kainuo Pharmaceutical Technology Development Co.,Ltd.; Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN111440777B

Abstract

本发明公开了一种L‑氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用。该L‑氨基酸连接酶Slal的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的L‑氨基酸连接酶Slal具有广泛的底物谱，可以用于合成同型和异型功能二肽。

Description

L-氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及工业生物技术领域，具体而言，涉及一种L-氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用。

背景技术

二肽作为最简单的肽形式，其功能可以从两个方面评价，一是作为氨基酸的衍生物改良氨基酸特性，比如热稳定性（Gln热不稳定，而Aln-Gln 热稳定），溶解度（Tyr很难溶，而Ala-Tyr易溶），这两种二肽进入人体可以很快被降解，从而可以替代氨基酸的生理功能；二是二肽自身具有一些新的生物学功能，比如肌肽（Carnosine，β-alanyl-His）和鹅肌肽(anserine，β-alanyl-N-methyl-His)具有抗氧化、维持细胞内pH的作用；甜味剂（阿斯巴甜，Asp-Phe methyl ester），咸味增强剂（Pro-Gly，Met-Gly），降压肽（Ile-Tyr，Lys-Trp，Val-Tyr，Ile-Trp），镇痛作用的Arg-Trp，Lys-Glu具有抗肿瘤活性，Ala-Gln作为病人输液试剂等。虽然越来越多的功能二肽被发现，但是目前只有阿斯巴甜和Ala-Gln实现了商业化生产。此外在多肽的化学法合成过程中，由于连续加入相同氨基酸会造成合成难度增加，尤其是当连续2个以上的Gly，Lys，Glu或Pro存在时，因此找到合适高效的二肽合成方法一直是一个热点问题。

目前二肽合成主要是化学合成，该过程涉及到保护和去保护相关操作的过程，且产物会发生消旋，而且合成成本较高，甚至需要有毒试剂等问题。而采用生物法合成则具有很好的立体选择性，不产生消旋产物。 L-氨基酸连接酶可以在ATP参与下将两个游离氨基酸连接合成二肽，L-氨基酸连接酶已被成功应用于合成肌苷，Ala-Gln等功能异型二肽，和部分同型二肽。开发具有广泛底物谱的L-氨基酸连接酶有着非常重要的意义。

发明内容

本发明旨在提供一种L-氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用，以提供一种具有广泛底物谱的L-氨基酸连接酶。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种L-氨基酸连接酶Slal。该L-氨基酸连接酶Slal的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

根据本发明的另一个方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述L-氨基酸连接酶Slal。

进一步地，DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

根据本发明的再一个方面，提供了一种重组载体。该重组载体含有上述任一种DNA分子。

进一步地，重组载体为pET-28a(+)-slal或pPIC9K-slal。

根据本发明的又一个方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。

进一步地，宿主细胞为大肠杆菌重组菌株或毕赤酵母重组菌株。

根据本发明的再一个方面，提供了上述任一种L-氨基酸连接酶Slal的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，用包含编码上述L-氨基酸连接酶slal的基因的重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）或毕赤酵母GS115，得到重组菌株；S2，培养重组菌株，诱导L-氨基酸连接酶Slal表达；S3，分离纯化获得的L-氨基酸连接酶Slal。

根据本发明的又一个方面，提供了一种上述L-氨基酸连接酶Slal在合成二肽中的应用。

进一步地，二肽是由选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸和酪氨酸组成的一种或两种氨基酸合成。

本发明的L-氨基酸连接酶Slal具有广泛的底物谱，可以用于合成同型和异型功能二肽。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实施例1的大肠杆菌中L-氨基酸连接酶表达（泳道1~4）和实施例3纯化的SDS-PAGE图（泳道5），其中，泳道1：L-氨基酸连接酶大肠杆菌菌株表达细胞破碎液上清，泳道2：亲和层析未结合蛋白，M：蛋白marker，泳道3：洗脱未结合蛋白，泳道4：60 mM 咪唑洗脱杂质蛋白，泳道5：300 mM 咪唑洗脱目标蛋白；

图2示出了实施例2的毕赤酵母表达L-氨基酸连接酶甲醇培养基诱导上清SDS-PAGE图，其中，泳道1-6 示出了不同转化子表达L-氨基酸连接酶的情况，M：蛋白marker；

图3示出了实施例4的纯化的L-氨基酸连接酶针对不同氨基酸的底物特异性；

图4示出了实施例5中L-氨基酸连接酶Slal合成同型二肽Met-Met marfey衍生后HPLC结果；

图5示出了实施例5中Met-Met marfey衍生后的一级质谱分析结果；

图6示出了实施例5中L-氨基酸连接酶Slal合成同型二肽Leu-Leu marfey衍生后HPLC结果；

图7示出了实施例5中Leu-Leu marfey衍生后的一级质谱分析结果；

图8示出了实施例6的Leu-Ser二肽的 LC-MS/MS 分析结果；

图9示出了实施例6中Arg-Phe二肽的 LC-MS/MS分析结果；

图10示出了实施例6中Met-Tyr 二肽的LC-MS/MS分析结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明的发明人发现一种来源于Streptomyces sp. NRRL S-118的L-氨基酸连接酶Slal，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

L-氨基酸连接酶Slal氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示：MTMTSRKVLVVVDGYSSGSQLPRVMAERGWDCVHVSALEDIPDYYRETFDRDAYLDHFAHGGDTAGLVRDLAAYRPSAVVPGTESGVIVASLLADALGLPGNDPARSNAHRDKYEMHNRLREAGLRSMDHYLAHDAAGLLAWADEGSWPVVLKPRASAGTDSVTFCPDRAALEEAFHRLHGAVNRIGERNDAVLAQRFLSGQEYFINGVSADGRHLVTEIWRTDKISVPGAGAIYDRSVLLDPTTPATKEITGYVHDVLDALGIRWGAHHTELMVGDDGPTLIECAARLSGGLNRDAARHAVGTSMLDLLADLVTEGPASVHRLREAQRPHRFPLWQVQFISDRAGVVKESFYAELLASLSSTTWLQKAPSPGDAVSVTTDLFSSPGIVFMTHADPAVLQRDYETVRAWEREQRLFTLA。

其中，该酶基因编码419个氨基酸和一个终止密码子，没有信号肽，因此，成熟的L-氨基酸连接酶Slal的理论分子量为45.86 kDa，氨基酸序列同SEQ ID NO. 1所示。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种编码上述L-氨基酸连接酶Slal的基因，该基因的基因组序列如 SEQ ID NO.2所示：

ATGACCATGACCAGCCGTAAAGTGCTGGTGGTGGTTGACGGTTACAGCAGTGGTAGCCAGCTGCCGCGCGTTATGGCCGAACGCGGTTGGGATTGCGTTCATGTGAGCGCGCTGGAAGATATCCCGGACTATTACCGCGAGACCTTCGATCGCGACGCCTATCTGGATCACTTCGCCCACGGTGGTGATACGGCGGGTCTGGTTCGTGATCTGGCGGCGTATCGCCCGAGTGCGGTGGTTCCGGGCACGGAAAGCGGTGTTATTGTGGCGAGTCTGCTGGCGGATGCGCTGGGTCTCCCGGGCAATGATCCAGCGCGCAGCAACGCGCATCGCGATAAGTACGAGATGCACAACCGTCTGCGTGAAGCCGGTCTGCGCAGCATGGACCATTACCTCGCGCATGATGCCGCCGGTCTGCTGGCGTGGGCGGACGAAGGTAGTTGGCCGGTTGTTCTCAAACCACGCGCCAGCGCCGGTACGGATAGCGTTACCTTCTGCCCAGATCGTGCCGCGCTGGAAGAAGCCTTTCACCGTCTGCATGGTGCGGTTAACCGCATCGGCGAACGCAACGATGCGGTGCTGGCGCAACGTTTCCTCAGCGGCCAAGAATACTTCATTAACGGCGTTAGCGCCGATGGCCGCCATCTGGTTACGGAGATCTGGCGCACGGATAAAATCAGCGTTCCGGGTGCCGGTGCGATCTATGACCGCAGCGTTCTGCTGGATCCAACCACCCCAGCCACCAAGGAAATTACCGGCTACGTGCACGATGTGCTGGACGCGCTGGGCATTCGTTGGGGTGCGCATCACACCGAACTGATGGTTGGCGATGATGGTCCAACGCTGATTGAGTGTGCCGCGCGTCTGAGCGGTGGTCTGAATCGCGATGCGGCGCGCCATGCGGTTGGTACCAGTATGCTGGATCTGCTGGCCGATCTGGTTACCGAAGGCCCAGCCAGCGTGCATCGTCTCCGTGAAGCGCAGCGCCCGCATCGCTTTCCACTGTGGCAAGTTCAGTTTATCAGCGATCGTGCGGGCGTGGTTAAAGAGAGCTTCTACGCGGAACTCCTCGCGAGTCTGAGTAGCACCACGTGGCTCCAAAAAGCGCCGAGTCCGGGCGACGCCGTGAGTGTTACCACCGATCTCTTCAGCAGTCCGGGCATCGTTTTCATGACCCATGCGGATCCAGCGGTTCTCCAACGCGATTACGAAACCGTTCGCGCGTGGGAACGTGAGCAACGCCTCTTTACGCTGGCCTAA。

本发明通过PCR的方法克隆了L-氨基酸连接酶slal基因，DNA全序列分析结果表明，L-氨基酸连接酶Slal结构基因全长1257 bp，该基因的基因组序列如 SEQ ID NO.3所示：

ATGACCATGACCAGCCGTAAAGTGCTGGTGGTGGTTGACGGTTACAGCAGTGGTAGCCAGCTGCCGCGCGTTATGGCCGAACGCGGTTGGGATTGCGTTCATGTGAGCGCGCTGGAAGATATCCCGGACTATTACCGCGAGACCTTCGATCGCGACGCCTATCTGGATCACTTCGCCCACGGTGGTGATACGGCGGGTCTGGTTCGTGATCTGGCGGCGTATCGCCCGAGTGCGGTGGTTCCGGGCACGGAAAGCGGTGTTATTGTGGCGAGTCTGCTGGCGGATGCGCTGGGTCTCCCGGGCAATGATCCAGCGCGCAGCAACGCGCATCGCGATAAGTACGAGATGCACAACCGTCTGCGTGAAGCCGGTCTGCGCAGCATGGACCATTACCTCGCGCATGATGCCGCCGGTCTGCTGGCGTGGGCGGACGAAGGTAGTTGGCCGGTTGTTCTCAAACCACGCGCCAGCGCCGGTACGGATAGCGTTACCTTCTGCCCAGATCGTGCCGCGCTGGAAGAAGCCTTTCACCGTCTGCATGGTGCGGTTAACCGCATCGGCGAACGCAACGATGCGGTGCTGGCGCAACGTTTCCTCAGCGGCCAAGAATACTTCATTAACGGCGTTAGCGCCGATGGCCGCCATCTGGTTACGGAGATCTGGCGCACGGATAAAATCAGCGTTCCGGGTGCCGGTGCGATCTATGACCGCAGCGTTCTGCTGGATCCAACCACCCCAGCCACCAAGGAAATTACCGGCTACGTGCACGATGTGCTGGACGCGCTGGGCATTCGTTGGGGTGCGCATCACACCGAACTGATGGTTGGCGATGATGGTCCAACGCTGATTGAGTGTGCCGCGCGTCTGAGCGGTGGTCTGAATCGCGATGCGGCGCGCCATGCGGTTGGTACCAGTATGCTGGATCTGCTGGCCGATCTGGTTACCGAAGGCCCAGCCAGCGTGCATCGTCTCCGTGAAGCGCAGCGCCCGCATCGCTTTCCACTGTGGCAAGTTCAGTTTATCAGCGATCGTGCGGGCGTGGTTAAAGAGAGCTTCTACGCGGAACTCCTCGCGAGTCTGAGTAGCACCACGTGGCTCCAAAAAGCGCCGAGTCCGGGCGACGCCGTGAGTGTTACCACCGATCTCTTCAGCAGTCCGGGCATCGTTTTCATGACCCATGCGGATCCAGCGGTTCTCCAACGCGATTACGAAACCGTTCGCGCGTGGGAACGTGAGCAACGCCTCTTTACGCTGGCC。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述L-氨基酸连接酶Slal。

本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组载体。该重组载体含有上述任一种DNA分子。上述重组载体中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。

虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。

本发明中所使用的术语“载体”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达载体，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，在某些实施方案中，重组载体为pET-28a(+)-slal或pPIC9K-slal。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞，优选宿主细胞为大肠杆菌重组菌株或毕赤酵母重组菌株。

在本发明一实施例中，提供了包含上述L-氨基酸连接酶Slal的大肠杆菌重组载体，将优选重组载体命名为pET-28a(+)-slal。将本发明的L-氨基酸连接酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的L-氨基酸连接酶基因插入到质粒pET-28a(+)上的NcoI和Xhol限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET-28a(+)-slal。本发明还提供了包含上述L-氨基酸连接酶的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌。

在本发明一实施例中，本发明还提供了包含上述L-氨基酸连接酶Slal的毕赤酵母重组载体，将优选重组载体命名为pPIC9K-slal。将本发明的L-氨基酸连接酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的L-氨基酸连接酶基因插入到质粒pPIC9K上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组毕赤表达质粒pPIC9K-slal。本发明还提供了包含上述L-氨基酸连接酶的重组菌株，优选所述菌株为毕赤酵母。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种L-氨基酸连接酶Slal的制备方法。该制备方法包括以下步骤：S1，用包含编码L-氨基酸连接酶slal的基因的重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）或毕赤酵母GS115，得到重组菌株；S2，培养重组菌株，诱导L-氨基酸连接酶Slal表达；S3，分离纯化获得的L-氨基酸连接酶Slal。

本发明的L-氨基酸连接酶Slal具有广泛的底物谱，可以用于合成同型和异型功能二肽，其中，二肽是由选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸和酪氨酸组成的一种或两种氨基酸合成。

反应式如下：

R1代表N-端底物氨基酸的残基

R2代表C-端底物氨基酸的残基

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

以下实施例中所用的试验材料和试剂描述如下：

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET-28a(+)及菌株BL21（DE3），毕赤酵母表达载体pPIC9K及菌株GS115。

2、培养基：

大肠杆菌培养基LB（10 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，pH7.0）。

毕赤酵母培养基MD（20 g/L葡萄糖，20 g/L琼脂，13.4 g/L酵母无氨基酸氮源YNB，4×10^-5 g/L生物素），YNB和生物素分别配制为10×和500×，0.22 μm无菌器过滤后，用之前加入。

毕赤酵母培养基BMGY（10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，10 ml/L甘油，13.4 g/L酵母无氨基酸氮源YNB，4×10^-5 g/L生物素），YNB和生物素分别配制为10×和500×，0.22 μm无菌器过滤后，用之前加入。

毕赤酵母培养基BMMY（10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，10 ml/L甲醇，13.4 g/L酵母无氨基酸氮源YNB，4×10^-5 g/L生物素），YNB和生物素分别配制为10×和500×，0.22 μm无菌器过滤后，用之前加入。

实施例1

L-氨基酸连接酶Slal基因的大肠杆菌表达

利用人工化学合成的方法获得来源于Streptomyces sp. NRRL S-118的含有ATP结合结构域的假使L-氨基酸连接酶slal基因片段，并在5’端引入内切酶位点NcoI和侧翼序列GC（防止移码）和3’端引入内切酶位点XhoI，基因合成于pUC19，获得pUC19-slal。将表达载体pET-28a(+)进行双酶切（NcoI+XhoI），同时将编码成熟的L-氨基酸连接酶的基因slal从pUC19-slal双酶切（NcoI+XhoI），切出编码L-氨基酸连接酶slal的基因片段与表达载体pET-28a(+)连接，获得含有L-氨基酸连接酶Slal的大肠杆菌重组质粒pET-28a(+)-slal，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/Slal，委托金唯智进行基因测序验证。

取含有重组质粒的BL21(DE3)菌株4 ml，接种于含400 mL LB培养基的2 L三角瓶，37℃ 200 rpm振荡培养2-3 h后，OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.06 mM IPTG，25℃诱导20 h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，镍柱纯化后，12%分离胶SDS-PAGE结果表明，重组L-氨基酸连接酶在大肠杆菌中得到了表达，如图1所示。

实施例2

L-氨基酸连接酶Slal基因的毕赤酵母表达

以9K-lal-F（SEQ ID NO.4，GGGGAATTCATGACCATGACCAGCCGTAAAGTGC，5’端引入EcoRI）和9K-lal-R（SEQ ID NO.5，GGGGCGGCCGCTTAGGCCAGCGTAAAGAGGCGTT GC，5’端引入NotI）为引物，以质粒pET-28a（+）-slal为模板，PCR扩增L-氨基酸连接酶基因，PCR产物和表达载体pPIC9K分别经过EcoRI和NotI酶切，纯化、然后连接获得含有L-氨基酸连接酶Slal的毕赤酵母重组质粒pPIC9K-slal，金唯智测序确证正确的质粒采用SalI线性化后，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化体系在MD培养基上30℃生长2-3天，获得His⁺转化子。

随机挑选His+转化子接种于96孔深孔板（含有600 μL BMGY），孔板摇床中700rpm，30℃培养36 h，离心弃去培养基上清，然后加入600 μL BMMY，25℃诱导，每24 h加入终浓度为1%的甲醇。诱导96 h，离心获取培养上清，SDS-PAGE分析，结果表明，L-氨基酸连接酶在毕赤酵母中成功进行了分泌表达，且表达的目标的蛋白单一，如图2所示。

实施例3

大肠杆菌表达Slal蛋白的纯化

将表达的氨基酸连接酶菌泥以10%菌浓重悬，超声破碎（5 s超声，6 s间隔，35%功率），离心，过0.45 μm滤膜后采用亲和层析进行纯化（AKTA系统装配5 ml HisTrap HP）。具体流程是：滤膜过滤样品以4 ml/min流速上样，然后采用结合缓冲液（20 mM Tris-Hcl，500 mMNaCl，pH 8.0）冲洗直至未结合蛋白完全洗脱，接着采用线性梯度咪唑洗脱杂蛋白4个柱体积（咪唑浓度由0 mM提高到60 mM），然后在300 mM洗脱目标蛋白，如图1泳道5所示；亲和纯化的蛋白进一步采用脱盐柱HiTrap Desalting 5 ml去除咪唑和盐，加入终浓度为20%的甘油，放-20℃备用。蛋白浓度采用Bradford方法测定。

实施例4

L-氨基酸连接酶的底物特异性测定

依据反应机理，反应过程伴随着ATP水解为ADP和无机磷酸的释放，无机磷酸可以采用钼蓝法进行测定。反应过程中释放的无机磷酸采用利德曼公司的试剂盒进行测定。

以一种或两种氨基酸（如图3，20种氨基酸随机两两组合）作为底物，反应发生伴随着无机磷酸的释放，酶活测定反应体系包括10 mM ATP，25 mM MgSO4，100 mM Tris-HCl pH8.5，酶50 mg/L，底物氨基酸25 mM，总体系600 μL，96孔板，37℃，700 rpm 反应16 h。

反应结束后取反应体系20 μL，加入200 μL 磷测定试剂盒显色液，37℃放置5min，340 nm测定，以试剂盒中标准磷做出标准曲线，反应释放的磷通过标曲计算，以加入酶不加氨基酸和加入氨基酸不加酶的反应体系作阴性对照，结果如图3所示（图3中数据代表所选底物通过酶催化反应产生的无机磷酸的量（mM）），说明本发明的L-氨基酸连接酶Slal具有广泛的底物谱，可以用于合成同型和异型功能二肽。

实施例5

合成同型二肽

反应体系包括10 mM ATP，25 mM MgSO4，100 mM Tris-HCl pH 8.5，酶50 mg/L，甲硫氨酸或亮氨酸25 mM，总体系600 μL，96孔板，37℃，700 rpm 反应16 h （以不加酶的反应体系作阴性对照），结束反应后反应样品采用Marfey试剂（Na-（2, 4-二硝基-5-氟苯基-L-丙胺酰胺）进行衍生。具体方法是：取400 μL反应体系，加入100 μL乙腈，100 μL 1 M NaHCO₃，混匀后，12000 rpm离心3 min，吸出上清加入200 μL 5 mg/ml Marfey试剂（Na-（2，4-二硝基-5-氟苯基-L-丙胺酰胺）， 50℃反应2 h离心取上清，然后HPLC检测，采用Eclipse plus C184.6×100 mm 3.5 μm，所用缓冲液为缓冲液A（H₂O+0.1% H₃PO₄），缓冲液B 乙腈，采用梯度洗脱方式：0 min 10% B，9 min 95%B，12 min 100% B，12.1 min 10% B，15 min 10% B，紫外检测器210 nm，流速1.5 ml/min，结果如图4和6所示：进一步LC-MS检测，结果如图所示5和7所示。

其中，图4 是以甲硫氨酸为底物，反应体系经Marfey衍生后，HPLC分析结果，通过和阴性对照反应相比，发现5.268 min的峰是新出现的峰，进一步通过LC-MS分析，质荷比符合Marfey-Met-Met（图5），说明合成了二肽Met-Met。图6是以亮氨酸为底物，反应体系经Marfey衍生后，HPLC分析结果，通过和阴性对照反应相比，发现6.148 min的峰是新出现的峰，进一步通过LC-MS分析，质荷比符合Marfey-Leu-Leu（图7），说明合成了二肽Leu-Leu。

实施例6

合成异型二肽

反应体系包括10 mM ATP，25 mM MgSO4，100 mM Tris-HCl pH 8.5，酶50 mg/L，不同氨基酸25 mM（Leu和Ser用于合成Leu-Ser，咸味剂；Arg和Phe用于合成Arg-Phe，降血压；Met和Tyr用于合成Met-Tyr，降血压），总体系600 μL，96孔板，37℃，700 rpm 反应16 h。反应结束后，反应体系采用LC-MS/MS分析和成的二肽，以确定其N-端和C-端氨基酸偏好性。

HPLC所用柱子：Waters Atlantis HILIC Silica Column 3 µm，缓冲液A：10 mM乙酸氨水溶液，缓冲液B: 乙腈，采用梯度洗脱方式：0 min 5%A，10 min 50%A，10.1 min 5%A，13 min 5%A，柱温25℃，紫外检测器210 nm，流速1 ml/min，经过HPLC分离后的组分采用AB SCIEX API3200三重四级杆质谱仪进行结构鉴定，采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测，喷雾电压4.50 kV，离子源温度400℃，干燥气（N₂）流速50.0 psi，一级全扫描范围50.000~500.000 Da，碰撞电压15.000~45.000 volts。与质谱联用的为Agilent HPLC高效液相色谱仪，色谱柱及色谱条件同上，通过Analyst软件采集和处理质谱数据。结果如图8-10所示。

其中，图8，以Leu和Ser为底物，合成产物经过二级质谱鉴定，如图8所示，根据 a,b, c, x, y, z 离子的质荷比推算出产物中有Leu-Ser合成（图8，其中，intensity为强度），同理以Arg和Phe为底物可以合成Arg-Phe（图9，其中，intensity为强度），以Met和Tyr为底物可以合成Met-Tyr (图10，其中，intensity为强度)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司

<120> L-氨基酸连接酶Slal、其制备方法及应用

<130> PN129621KLY

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. NRRL S-118(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

Met Thr Met Thr Ser Arg Lys Val Leu Val Val Val Asp Gly Tyr Ser

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gln Leu Pro Arg Val Met Ala Glu Arg Gly Trp Asp Cys

20 25 30

Val His Val Ser Ala Leu Glu Asp Ile Pro Asp Tyr Tyr Arg Glu Thr

35 40 45

Phe Asp Arg Asp Ala Tyr Leu Asp His Phe Ala His Gly Gly Asp Thr

50 55 60

Ala Gly Leu Val Arg Asp Leu Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Ala Val Val

65 70 75 80

Pro Gly Thr Glu Ser Gly Val Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala Asp Ala

85 90 95

Leu Gly Leu Pro Gly Asn Asp Pro Ala Arg Ser Asn Ala His Arg Asp

100 105 110

Lys Tyr Glu Met His Asn Arg Leu Arg Glu Ala Gly Leu Arg Ser Met

115 120 125

Asp His Tyr Leu Ala His Asp Ala Ala Gly Leu Leu Ala Trp Ala Asp

130 135 140

Glu Gly Ser Trp Pro Val Val Leu Lys Pro Arg Ala Ser Ala Gly Thr

145 150 155 160

Asp Ser Val Thr Phe Cys Pro Asp Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ala Phe

165 170 175

His Arg Leu His Gly Ala Val Asn Arg Ile Gly Glu Arg Asn Asp Ala

180 185 190

Val Leu Ala Gln Arg Phe Leu Ser Gly Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Gly

195 200 205

Val Ser Ala Asp Gly Arg His Leu Val Thr Glu Ile Trp Arg Thr Asp

210 215 220

Lys Ile Ser Val Pro Gly Ala Gly Ala Ile Tyr Asp Arg Ser Val Leu

225 230 235 240

Leu Asp Pro Thr Thr Pro Ala Thr Lys Glu Ile Thr Gly Tyr Val His

245 250 255

Asp Val Leu Asp Ala Leu Gly Ile Arg Trp Gly Ala His His Thr Glu

260 265 270

Leu Met Val Gly Asp Asp Gly Pro Thr Leu Ile Glu Cys Ala Ala Arg

275 280 285

Leu Ser Gly Gly Leu Asn Arg Asp Ala Ala Arg His Ala Val Gly Thr

290 295 300

Ser Met Leu Asp Leu Leu Ala Asp Leu Val Thr Glu Gly Pro Ala Ser

305 310 315 320

Val His Arg Leu Arg Glu Ala Gln Arg Pro His Arg Phe Pro Leu Trp

325 330 335

Gln Val Gln Phe Ile Ser Asp Arg Ala Gly Val Val Lys Glu Ser Phe

340 345 350

Tyr Ala Glu Leu Leu Ala Ser Leu Ser Ser Thr Thr Trp Leu Gln Lys

355 360 365

Ala Pro Ser Pro Gly Asp Ala Val Ser Val Thr Thr Asp Leu Phe Ser

370 375 380

Ser Pro Gly Ile Val Phe Met Thr His Ala Asp Pro Ala Val Leu Gln

385 390 395 400

Arg Asp Tyr Glu Thr Val Arg Ala Trp Glu Arg Glu Gln Arg Leu Phe

405 410 415

Thr Leu Ala

<210> 2

<211> 1260

<212> DNA

<400> 2

atgaccatga ccagccgtaa agtgctggtg gtggttgacg gttacagcag tggtagccag 60

ctgccgcgcg ttatggccga acgcggttgg gattgcgttc atgtgagcgc gctggaagat 120

atcccggact attaccgcga gaccttcgat cgcgacgcct atctggatca cttcgcccac 180

ggtggtgata cggcgggtct ggttcgtgat ctggcggcgt atcgcccgag tgcggtggtt 240

ccgggcacgg aaagcggtgt tattgtggcg agtctgctgg cggatgcgct gggtctcccg 300

ggcaatgatc cagcgcgcag caacgcgcat cgcgataagt acgagatgca caaccgtctg 360

cgtgaagccg gtctgcgcag catggaccat tacctcgcgc atgatgccgc cggtctgctg 420

gcgtgggcgg acgaaggtag ttggccggtt gttctcaaac cacgcgccag cgccggtacg 480

gatagcgtta ccttctgccc agatcgtgcc gcgctggaag aagcctttca ccgtctgcat 540

ggtgcggtta accgcatcgg cgaacgcaac gatgcggtgc tggcgcaacg tttcctcagc 600

ggccaagaat acttcattaa cggcgttagc gccgatggcc gccatctggt tacggagatc 660

tggcgcacgg ataaaatcag cgttccgggt gccggtgcga tctatgaccg cagcgttctg 720

ctggatccaa ccaccccagc caccaaggaa attaccggct acgtgcacga tgtgctggac 780

gcgctgggca ttcgttgggg tgcgcatcac accgaactga tggttggcga tgatggtcca 840

acgctgattg agtgtgccgc gcgtctgagc ggtggtctga atcgcgatgc ggcgcgccat 900

gcggttggta ccagtatgct ggatctgctg gccgatctgg ttaccgaagg cccagccagc 960

gtgcatcgtc tccgtgaagc gcagcgcccg catcgctttc cactgtggca agttcagttt 1020

atcagcgatc gtgcgggcgt ggttaaagag agcttctacg cggaactcct cgcgagtctg 1080

agtagcacca cgtggctcca aaaagcgccg agtccgggcg acgccgtgag tgttaccacc 1140

gatctcttca gcagtccggg catcgttttc atgacccatg cggatccagc ggttctccaa 1200

cgcgattacg aaaccgttcg cgcgtgggaa cgtgagcaac gcctctttac gctggcctaa 1260

<210> 3

<211> 1257

<212> DNA

<400> 3

atgaccatga ccagccgtaa agtgctggtg gtggttgacg gttacagcag tggtagccag 60

ctgccgcgcg ttatggccga acgcggttgg gattgcgttc atgtgagcgc gctggaagat 120

atcccggact attaccgcga gaccttcgat cgcgacgcct atctggatca cttcgcccac 180

ggtggtgata cggcgggtct ggttcgtgat ctggcggcgt atcgcccgag tgcggtggtt 240

ccgggcacgg aaagcggtgt tattgtggcg agtctgctgg cggatgcgct gggtctcccg 300

ggcaatgatc cagcgcgcag caacgcgcat cgcgataagt acgagatgca caaccgtctg 360

cgtgaagccg gtctgcgcag catggaccat tacctcgcgc atgatgccgc cggtctgctg 420

gcgtgggcgg acgaaggtag ttggccggtt gttctcaaac cacgcgccag cgccggtacg 480

gatagcgtta ccttctgccc agatcgtgcc gcgctggaag aagcctttca ccgtctgcat 540

ggtgcggtta accgcatcgg cgaacgcaac gatgcggtgc tggcgcaacg tttcctcagc 600

ggccaagaat acttcattaa cggcgttagc gccgatggcc gccatctggt tacggagatc 660

tggcgcacgg ataaaatcag cgttccgggt gccggtgcga tctatgaccg cagcgttctg 720

ctggatccaa ccaccccagc caccaaggaa attaccggct acgtgcacga tgtgctggac 780

gcgctgggca ttcgttgggg tgcgcatcac accgaactga tggttggcga tgatggtcca 840

acgctgattg agtgtgccgc gcgtctgagc ggtggtctga atcgcgatgc ggcgcgccat 900

gcggttggta ccagtatgct ggatctgctg gccgatctgg ttaccgaagg cccagccagc 960

gtgcatcgtc tccgtgaagc gcagcgcccg catcgctttc cactgtggca agttcagttt 1020

atcagcgatc gtgcgggcgt ggttaaagag agcttctacg cggaactcct cgcgagtctg 1080

agtagcacca cgtggctcca aaaagcgccg agtccgggcg acgccgtgag tgttaccacc 1140

gatctcttca gcagtccggg catcgttttc atgacccatg cggatccagc ggttctccaa 1200

cgcgattacg aaaccgttcg cgcgtgggaa cgtgagcaac gcctctttac gctggcc 1257

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<223> 引物

<400> 4

ggggaattca tgaccatgac cagccgtaaa gtgc 34

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(36)

<223> 引物

<400> 5

ggggcggccg cttaggccag cgtaaagagg cgttgc 36

Claims

1.一种二肽的合成方法，其特征在于，包括采用L-氨基酸连接酶Slal合成二肽的步骤，其中，所述L-氨基酸连接酶Slal的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述二肽是由选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸和酪氨酸组成的一种或两种氨基酸合成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述L-氨基酸连接酶Slal的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA分子连接在载体pET-28a(+)-slal或pPIC9K-slal内形成重组载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组载体的宿主细胞为大肠杆菌重组菌株或毕赤酵母重组菌株。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-氨基酸连接酶Slal通过以下步骤制备得到：

S1，用包含编码如SEQ ID NO. 1所示的所述L-氨基酸连接酶slal的基因的重组载体转化大肠杆菌BL21或毕赤酵母GS115，得到重组菌株；

S2，培养所述重组菌株，诱导L-氨基酸连接酶Slal表达；

S3，分离纯化获得的所述L-氨基酸连接酶Slal。