KR101278910B1 - 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법 - Google Patents

셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101278910B1
KR101278910B1 KR1020110071557A KR20110071557A KR101278910B1 KR 101278910 B1 KR101278910 B1 KR 101278910B1 KR 1020110071557 A KR1020110071557 A KR 1020110071557A KR 20110071557 A KR20110071557 A KR 20110071557A KR 101278910 B1 KR101278910 B1 KR 101278910B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
promoter
cellobiose
operon
xylose
inactive
Prior art date
Application number
KR1020110071557A
Other languages
English (en)
Inventor
이성국
비누셀비 파리수탐
Original Assignee
국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 filed Critical 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단
Priority to CN201280007996.8A priority Critical patent/CN103370410B/zh
Priority to PCT/KR2012/001059 priority patent/WO2012108740A2/en
Priority to US13/981,661 priority patent/US8871480B2/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101278910B1 publication Critical patent/KR101278910B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 chb 오페론 또는 asc 오페론의 불활성 프로모터가 활성 프로모터로 치환된 변이미생물의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 미생물 및 이를 이용한 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질, 화학산업 기반 화학물질 등의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변이미생물은 야생형 미생물과는 달리 셀로바이오스를 이용할 수 있으므로, 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 효소당화공정에 효소를 사용하지 않을 수 있으며, 동시당화발효과정(SSF)에서 셀로바이오스 축적에 따른 수율 저하를 막을 수 있다.

Description

셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법 {METHOD FOR PREPARING MUTANT MICROORGANISM CAPABLE OF SIMULTANEOUSLY UTILIZING CELLOBIOSE AND XYLOSE}
본 발명은 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전공학적 방법 및 진화적 적응으로 야생형 미생물을 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있도록 변이시키는 방법, 상기 방법에 따라 변이된 미생물을 및 이를 이용하여 바이오매스로부터 생산된 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질에 관한 것이다.
석유 화학 연료가 고갈됨에 따라 세계 각국에서는 대체 에너지에 상당한 관심을 쏟고 있다. 이러한 대체 에너지로서의 연료용 에탄올은 섬유소계(cellulose) 바이오매스로부터 전환될 수 있는데, 이 섬유소계는 광합성을 통해 고정되어 매년 방대한 양이 얻어질 수 있고 재생가능하다는 점에서 기능적으로나 경제적으로 매우 유리한 물질이다. 현재 섬유소계 바이오매스 중 많이 이용되고 있는 물질로는 목질계(lignocellulose) 바이오매스가 있으며, 이에 포함된 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 리그닌을 효율적으로 분해시키는 방법과 새로운 균주의 탐색 및 당화발효 공정에 많은 연구가 집중되어 있다.
섬유소계 연료 생산에 있어 주요 단계는 i) 적어도 3가지 효소(엔도글루카나아제, 엑소글루카나아제 및 β-글루카나아제)를 이용한 바이오매스의 효소 당화 공정과 ii) 얻어진 당류의 미생물 발효 공정으로 나눌 수 있다. 최근에는 효소 당화 공정과 발효 공정을 한 반응기에서 동시에 수행하여 시설 비용과 효소의 억제 작용을 감소시켜 에탄올 생산 효율을 증가시킨 동시당화발효(simultaneous saccharification and fermentation, SSF) 방법이 많이 연구되고 있다. 또한, 위 과정 중 효소적 당화 과정이 가장 비용이 많이 들기 때문에 당화에 사용되는 상기 효소의 기능을 향상시키거나 이의 사용을 절감하기 위하여 이를 생산하는 발효 균주의 개발을 모색하고 있다. 특히 최근 유전 공학 기술을 이용하여 당화 관련 효소의 유전자를 발효균주에 도입하여 이를 생산하게 함으로써 당화와 발효를 동시에 수행할 수 있는 균주를 개발하고 있다. 하지만, 당화 관련 유전자와 같은 외래 유전자의 발현 효율이 매우 낮으며 또한 과발현시 세포 성장과 대사에 부정적인 영향을 미치는 문제가 있다. 따라서, 외래 유전자를 도입하는 것보다 발효 균주 내의 내생 경로의 조절을 변형시키는 것에 관심이 옮겨지고 있다.
대장균을 포함하는 미생물은 목질계 연료 생산을 위한 효율적인 수단으로 받아들여지고 있는데, 그 이유는 바이오매스의 가수분해산물 내에 존재하는 모든 당을 이용할 수 있기 때문이다. 하지만, 가수분해산물 내에 선호되는 당류(예: 글루코스)가 존재하는 경우 그 외의 탄소원을 이용하는데 요구되는 효소의 생합성이 억제되는 현상인, 탄소원 이화물 억제(carbon catabolite repression, CCR)로 인해 미생물의 잠재성이 제한된다. 가수분해산물 내에 존재하는 자일로스와 아라비노오스와 같은 당류는 글루코스가 완전히 고갈될 때까지 대사될 수 없다. 이 글루코스 선호 이용은 발효 공정을 방해하여 효율을 감소시키고 이용되지 않은 탄소원의 축적으로 인해 하위 공정에 영향을 미친다. 목질계 가수분해산물로부터 얻어지는 당 혼합물의 조성은 매우 가변적이며, 주된 당은 글루코스와 자일로스이다. 따라서, 섬유소계 연료 생산의 비용, 효율 및 용이성을 개선하기 위해서는, 상기 당을 동시에 이용할 수 있는 변이미생물의 개발이 요구된다.
글루코스와 자일로스의 동시 이용은 이화물 활성화된(catabolite derepressed) 몇 가지 대장균 균주를 이용하여 종래에 입증되어 왔다. 많은 연구들은 CCR의 글로벌 전사조절자로 알려진 cAMP 수용체 단백질(cAMP receptor protein, CRP)에 초점을 맞추고 있다. 몇 가지 변이 CRP(CRP*)를 갖는 대장균 균주들이 부분적으로 CCR을 벗어난 것으로 규명되었다(Karimova, G., et al ., Research in Microbiology, 2004, 155(2): 76-79; Nair, N. U., et al ., Metabolic Engineering, 2010, 12(5): 462-468; Kimata, K., et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America, 1997, 94(24): 12914-12919; Inada, T., et al., Genes Cells, 1996, 1(3): 293-301). 또한, 글루코스 포스포트랜스퍼라아제 시스템(PTS)이 결여된 대장균 균주 역시 부분적으로 CCR이 제거되었으며, 메틸글리옥살 합성효소 유전자(methylglyoxal synthase gene)의 결실은 당 이용능 패턴을 조절하는데 도움을 주었다. 하지만, 상기 방법으로는 섬유소계 바이오연료를 생산하는데 충분할 정도로 CCR을 제거하지 못하므로, 여전히 새로운 방법이 요구된다.
야생형(wild-type) 대장균은 셀로바이오스를 이용할 수 없지만 셀로바이오스를 단일 탄소원으로 하는 최소 셀로바이오스 배지에서 일정기간 동안 배양하는 경우 셀로바이오스 이용 표현형(phenotype)을 획득하는 것으로 보고되었다(Kachroo AH et al ., Molecular Microbiology , 66(6), 1382-1395, 2007). 셀로바이오스 이용 표현형은 두 가지 잠재적 오페론인 chb 또는 asc의 변이와 연관된 것으로 밝혀졌다.
chb 오페론은 포스포에놀피루베이트 의존성 전달체(ChbABC), 가수분해효소(chbF), 이중 활성인자/조절인자(chbR) 및 기능이 알려져 있지 않은 단백질(chbG)을 암호화한다. 이 오페론은 세 가지 단백질인 ChbR, NagC, 및 이화물 활성인자 단백질(CAP)에 의해 조절된다. ChbR은 AraC 계열의 조절인자로서 chb 오페론의 이중 활성인자 및 억제인자로 작용한다. NagC는 chb 프로모터 내의 두 부위에 결합하여 RNA 폴리머라아제가 프로모터에 접근하는 것을 방해함으로써 억제인자로 작용한다. CAP는 RNA 폴리머라아제가 프로모터에 결합하는 것을 촉진시키는 활성인자로서 작용한다. 상기 chb 오페론은 키토바이오스를 이용하는데 작동될 수 있지만, 셀로바이오스를 이용하는데는 아직 잠재적이다(Kachroo AH et al ., Molecular Microbiology, 66(6), 1382-1395, 2007; Plumbridge J, Pellegrini O, Molecular Microbiology, 52:437-449, 2004). 이는 셀로바이오스가 전사 활성인자인 ChbR 및 NagC를 통해 프로모터를 유도할 수 없기 때문이다. ChbR은 셀로바이오스를 인식할 수 없기 때문에, NagC 억제를 제거하거나 프로모터를 유도할 수 없다.
한편, 또 다른 잠재적 오페론인 asc는 포스포-β-글루코시다아제(AscB) 및 전달자 단백질(AscF)을 암호화한다. 상기 잠재적 asc 오페론은 IS 삽입에 의해 입증된 바와 같이, 조절 유전자(ascG)의 불활성화를 통해 활성화될 수 있다(Hall BG and Xu L, Mol . Biol . Evol ., 9:688-706; Hall BG, Genetica, 107:181-187).
본 발명자들은 상기 미생물의 잠재적 오페론에 대해 연구하던 중, 야생형 미생물의 chb 오페론의 불활성 프로모터(inactive promoter) 및 asc 오페론의 불활성프로모터를 활성 프로모터(active promoter)로 치환하고, 셀룰로오스 최소 배지에서 적응시켜 얻은 변이미생물이 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 변이된 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이미생물을 이용하여 바이오매스로부터 생산된 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 야생형 미생물의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성 프로모터를 각각 활성 프로모터로 치환하는 단계; 및 (2) 상기 미생물을 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양시키는 단계를 포함하는, 야생형 미생물로부터 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 미생물의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성 프로모터가 활성 프로모터로 치환되고, 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양된 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이미생물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 미생물의 chb 오페론 불활성 프로모터 및 asc 오페론 불활성 프로모터가 활성 프로모터로 치환되고, 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양된 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이미생물을 이용하여, 바이오매스로부터 생산된 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질을 제공한다.
본 발명에 따른 변이미생물은 야생형 미생물과는 달리 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있으므로, 바이오매스로부터 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질, 화학산업 기반 화학물질 등을 생산하는 효소당화공정에 효소를 사용하지 않고 셀룰로오스와 자일로스를 동시에 발효시킬 수 있으므로, 비용, 효율, 및 용이성을 개선시킬 수 있다. 또한, 상기 변이미생물은 바이오매스로부터 생리활성기능물질, 의약용 물질, 아미노산, 바이오 폴리머, 바이오 알콜, 재조합 단백질, 화학산업 기반 화학물질 등을 생산하는 데에 적용될 수 있다.
도 1은 chb 오페론의 불활성 프로모터를 활성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 2는 asc 오페론의 불활성 프로모터를 활성 프로모터로 치환하는 과정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은 CP12CHBASC 균주를 상이한 배지(LB, M9-글루코스 및 M9-셀로바이오스)에서 배양한 후, β-글루코시다아제 활성(U/mL)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 CP12CHBASC (A) 및 CP12CHBASC CRP* (B) 균주를 셀로바이오스 및 자일로스를 함유하는 배지에서 배양한 후, 남아 있는 셀로바이오스(◆) 및 자일로스(■)의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 CP12CHBASC 균주(■) 및 CP12CHBASC30 균주(●)의 자일로스 이용률(A) 및 셀로바이오스 이용률(B)을 나타낸 그래프로서, A는 자일로스를 함유한 배지에서 배양한 후 남아 있는 자일로스의 농도를 나타낸 것이고, B는 셀로바이오스를 함유한 배지에서 배양한 후 남아 있는 셀로바이오스의 농도를 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 배지(A: 2g 셀로바이오스 + 2g 자일로스; B: 3g 셀로바이오스 + 2g 자일로스; C: 1g 셀로바이오스 + 1g 자일로스)에서 CP12CHBASC30 균주를 배양한 후, 남아 있는 셀로바이오스(◆) 및 자일로스(■)의 농도를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 '오페론'이란 단일 조절신호 또는 프로모터의 조절하에 있는 유전자 집단을 함유하는 게놈 물질의 기능 단위를 지칭한다. 본 발명에서 'chb 오페론' 및 'asc 오페론'은 각각의 구조와 기능이 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명에서 '프로모터'는 특정 유전자의 전사를 돕는 DNA 영역을 지칭한다. 또한, '불활성 프로모터'는 다양한 원인에 의해 전사 관련 기능을 수행하지 못하는 프로모터를 지칭하는 반면, '활성 프로모터'는 치환되는 경우 전사 관련 기능을 수행할 수 있는 프로모터를 지칭하며, 그 예로 '유도성 프로모터(inducible promoter)' 및 '항시성 프로모터(constitutive promoter)'를 포함한다. 본 발명의 활성 프로모터의 일종인 상기 '유도성 프로모터(inducible promoter)'는 특정 인자의 존재 또는 부재에 의해 프로모터의 활성이 유도되는 프로모터를 지칭한다. 나아가, 본 발명의 활성 프로모터의 일종인 상기 '항시성 프로모터(constitutive promoter)'는 관련 유전자가 지속적으로 전사되게 하는 조절되지 않은 프로모터를 지칭하며, '항시적 프로모터' 또는 '항시발현용 프로모터'와 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에서 chb 오페론의 불활성 프로모터와 asc 오페론의 불활성 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 (1) 야생형 미생물의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성 프로모터를 각각 활성 프로모터로 치환하는 단계; 및 (2) 상기 미생물을 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양시키는 단계를 포함하는, 야생형 미생물로부터 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
야생형 대장균을 포함하는 일반적인 야생형 미생물은 셀로바이오스를 이용하지 못하며, 종래 알려진 변이미생물의 경우에도 탄소원 이화물 억제(carbon catabolite repression; CCR)로 인하여 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 없어 바이오매스로부터 여러 가지 화학물질, 예컨대, 아미노산, 바이오 연료, 바이오 폴리머, 바이오 알콜, 재조합 단백질 등을 생산하는데 사용하기 곤란한 문제가 있다. 이에 반해, 본 발명의 변이미생물은 목질계 바이오매스의 주된 당인 셀로바이오스와 자일로스를 동시에 이용할 수 있으므로, 상기 화학물질을 생산하는데 있어서 발효 효율, 수율을 높일 수 있고, 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다.
이러한 특징은 미생물의 염색체 상의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성 프로모터를 활성 프로모터로 치환하는 유전공학적 방법 및 상기 균주를 셀로바이오스 최소 배지에서 일정 기간 배양하는 진화적 적응(evolutionary adaptation)에 의해 달성된다.
본 발명의 방법에서, 단계 1은 야생형 미생물의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성 프로모터를 각각 활성 프로모터로 치환하는 단계이다.
상기 단계에서, 야생형 미생물은 대장균일 수 있으며, 바람직하게는 에세리키아(Escherichia) 속에 속하는 대장균일 수 있다. 또한, 대장균의 게놈 유전자와 70% 이상의 상동성을 가진 미생물, 예를 들어 살모넬라(salmonella) 등도 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계에서, chb 오페론의 불활성 프로모터를 공지된 활성 프로모터로 치환하는 과정은 도 1에 나타낸 바와 같이, λ-Red 재조합 시스템을 이용한 스플라이스 오버랩 확장(Splice Overlap Extension; SOE) PCR에 의해 수행될 수 있으나, 당업계에 알려진 대안적인 방법에 의해 수행될 수도 있다. 상기 chb 오페론의 불활성 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, 본 발명에 사용되는 활성 프로모터는 당업계에 특정 유전자를 유도성으로 또는 항시적으로 전사시키는 것으로 알려진 프로모터라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프로모터를 사용할 수 있다. 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프로모터는, CP12 프로모터로서 Jensen 등(Jensen PR et al ., Appl . Environ . Microbiol . 64(1), 82-87, 1998)에 개시되어 있으며, 대장균에서 101 밀러 유닛(miller unit)의 β-갈락토시다아제 활성을 가진 것으로 보고되어 있다.
또한, 상기 단계에서, asc 오페론의 불활성 프로모터를 공지된 활성 프로모터로 치환하는 과정은 도 2에 나타낸 바와 같이, λ-Red 재조합 시스템을 이용한 스플라이스 오버랩 확장(SOE) PCR에 의해 수행될 수 있으나, 당업계에 알려진 대안적인 방법에 의해 수행될 수도 있다. 상기 asc 오페론의 불활성 프로모터는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, 본 발명에 사용된 활성 프로모터로는 당업계에 특정 유전자를 유도성으로 또는 항시적으로 전사시키는 것으로 알려진 프로모터라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 chb 오페론의 불활성 프로모터를 치환하는데 사용한 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 야생형 미생물의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성 프로모터가 활성 프로모터의 일종인 항시성 프로모터로 치환된다.
상기 변이방법으로 얻어지는 미생물은 활성 프로모터의 작용으로 인해 chb 오페론 또는 asc 오페론의 잠재적 유전자(cryptic gene)가 활성화되어 셀로바이오스를 이용할 수 있는 표현형을 획득하게 된다.
본 발명의 방법에서 상기 단계 2는, 단계 1에서 변이된 미생물을 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양시켜 진화적 적응(evolutionary adaptation)시키는 단계이다. 상기 셀로바이오스 최소 배지란 셀로바이오스를 유일한 탄소원으로 하는 배지를 지칭한다. 바람직하게는 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2 및 1 g/L의 셀로바이오스가 첨가된 M9 최소 배지가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 배양 기간은 자일로스 및 셀로바이오스 이용률에 영향을 미칠 수 있는 최소 기한으로서, 30일 이상, 바람직하게는 30일 내지 90일간 배양 또는 적응시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법 중 단계 1만을 거친 변이미생물의 경우에는 자일로스와 셀로바이오스 존재시 자일로스는 이용가능하나, 셀로바이오스는 이용하지 못한다(도 4A). 이에 반해, 상기 방법의 단계 1 및 2를 모두 거친 변이미생물의 경우 자일로스와 셀로바이오스를 동시에 이용가능하다(도 6).
본 발명은 또한 야생형 미생물의 chb 오페론 불활성 프로모터 및 asc 오페론 불활성 프로모터가 활성 프로모터로 치환되고, 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양된 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이미생물을 제공한다.
본 발명의 미생물의 제조에 이용되는 미생물 및 활성 프로모터는 상기에서 제조방법과 관련하여 상술한 바와 같다.
한편, 본 발명은 본 발명에 따른 변이미생물을 이용하여, 바이오매스로부터 생산된 바이오연료, 생리활성기능물질, 의약용 물질 또는 화학산업 기반 화학물질. 을 제공한다. 상기 바이오매스는 바람직하게는 섬유소계 바이오매스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 목질계 바이오매스일 수 있다. 바이오매스로부터 바이오연료를 생산하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 본 발명은 효소 당화 공정과 발효 공정에서 본 발명에 따른 변이미생물을 이용하는 것을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에 있어서, 당화 공정에 효소 대신에 본 발명에 따른 변이미생물을 사용하여 수행하거나 효소 일부를 사용하지 않고 본 발명에 따른 변이미생물을 사용하여 당화 공정을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 발효 공정을 본 발명에 따른 변이미생물을 이용하여 수행할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 변이미생물은 당화공정과 발효공정을 한 반응기에서 동시에 수행하는 동시당화발효(SSF)에 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 변이미생물은 바이오매스로부터 아미노산, 바이오 연료, 바이오 폴리머, 바이오 알콜, 재조합 단백질 등과 같은 화학 물질을 생산하는 데에 적용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: chb 오페론 불활성 프로모터 및 asc 오페론 불활성 프로모터가 활성 프로모터로 치환된 변이대장균의 제조
하기의 방식에 따라 대장균의 chb 오페론과 asc 오페론 내의 불활성 프로모터를 활성 프로모터의 일종인 항시적으로 발현되는 항시성 프로모터로 치환하여 변이대장균을 제조하고, 이를 "CP12CHBASC"이라 명명하였다.
<1-1> chb 오페론 프로모터의 항시성 프로모터로의 치환
Datsenko 등(Datsenko KA et al ., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 97(12), 6640-6645, 2000)에 개시되어 있는 λ-Red 재조합 시스템을 이용하여, 대장균 MG1655의 염색체 상의 chb 오페론에 존재하는 유일한 잠재적 불활성 프로모터(서열번호 1)를 합성된 항시성 프로모터인 CP12 프로모터(서열번호 2)로 치환하였다. 상기 CP12 프로모터는 Jensen 등(Jensen PR et al ., Appl . Environ . Microbiol . 64(1), 82-87, 1998)에 개시되어 있으며, 대장균에서 101 밀러 유닛(miller unit)의 β-갈락토시다아제 활성을 가진 것으로 보고되어 있다.
구체적으로, 상기 Datsenko 등의 문헌을 참조하여, 프로모터 치환를 위해, 두 개의 오버래핑 단편을 SOE(Splice Overlap Extension) PCR을 통해 증폭하여 CP12 프로모터를 카나마이신 카세트에 연결하였다. 단편 1은 표 1에 기재된 세 개의 SOEing CP12 프로모터(서열번호 4 내지 6)를 사용하여 chb 오페론 프로모터의 하부 영역에 항시성 프로모터인 CP12를 붙이며, CP12 프로모터 앞쪽에는 단편 2와 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 단편 2는 chb 오페론 프로모터의 상부 영역에 상동인 오버행(overhang) 서열과 pKD13으로부터 유래한 카나마이신 카세트가 연결되어 있으며, 카나마이신 카세트 뒤쪽에는 단편 1과 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 상기 SOE PCR은 1단계 98℃ 3분, 2단계 95℃ 30초, 3단계 50~60℃ 30초 및 4단계 72℃ 2분으로 수행하였고, 상기 2단계에서 4단계를 30회 반복하였다. 상기 제조과정을 도 1에 개략적으로 나타내었고, 사용된 SOEing CP12 프로모터 및 플라스미드를 표 1에 나타내었다.
프로모터 및
플라스미드		 특성 참고
SOEing CP12 프로모터 5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTGAACAGTACTCAGGTATTATATCATTTTG-3' 서열번호 4
5'-TCAGGTATTATATCATTTTGGCCGACTAGTGTCAAGAATAAACTTG-3' 서열번호 5
5'-TAGTGTCAAGAATAAACTTGTATATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3' 서열번호 6
pKD46 λ-Red 재조합효소(recombinase) 발현 플라스미드; 온도 민감성 복제 Datsenko and Wanner 2000
pKD13 유전자 파괴(gene disruption)용 주형 플라스미드. 내성 유전자가 FRT 부위의 측면에 있음. pir+ E.coli를 필요로 하는 oriR6K-gamma origin. Datsenko and Wanner 2000
<1-2> asc 오페론 프로모터의 항시성 프로모터로의 치환
상기 실시예 1-1과 동일한 방식으로, 대장균 MG1655의 염색체 상의 asc 오페론에 존재하는 유일한 잠재적 불활성 프로모터(서열번호 3)를 합성 항시성 프로모터인 CP12 프로모터로 치환하였다.
구체적으로, 상기 Datsenko 등의 문헌을 참조하여, 프로모터 치환를 위해, 두 개의 오버래핑 단편을 SOE(Splice Overlap Extension) PCR을 통해 증폭하여 CP12 프로모터를 카나마이신 카세트에 연결하였다. 단편 1은 표 1에 기재된 세 개의 SOEing CP12 프로모터(서열번호 4 내지 6)를 사용하여 asc 오페론 프로모터의 하부 영역에 항시성 프로모터인 CP12를 붙이며, CP12 프로모터 앞쪽에는 단편 2와 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 단편 2는 asc 오페론 프로모터의 상부 영역에 상동인 오버행(overhang) 서열과 pKD13으로부터 유래한 카나마이신 카세트가 연결되어 있으며, 카나마이신 카세트 뒤쪽에는 단편 1과 연결시킬 수 있는 상동 서열을 가지고 있다. 상기 SOE PCR은 1단계 98℃ 3분, 2단계 95℃ 30초, 3단계 50~60℃ 30초 및 4단계 72℃ 2분으로 수행하였고, 상기 2단계에서 4단계를 30회 반복하였다. 상기 제조과정을 도 2에 개략적으로 나타내었고, 사용된 SOEing CP12 프로모터 및 플라스미드를 표 1에 나타내었다.
<1-3> 항시성 프로모터 치환 균주의 제작
araBAD 프로모터 하에 λ-Red system(pKD46)을 갖는 세포를 10 mM 아라비노스로 유도하여 전기충격용 대장균 세포(electrocompetent cell)를 만들고, 전기천공법으로 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 수득한 PCR 산물을 형질전환시켰다. 카나마이신 저항성 콜로니를 선별하고, PCR, 서열분석 및 기능 분석을 수행하여 부위 특이적 삽입 및 결실을 확인하였다. 상기 과정으로 얻어진 균주를 "CP12CHBASC"로 명명하였다.
비교예 1: 변이 cAMP 수용체 단백질( CRP *)로 치환된 변이대장균의 제조
crp 유전자가 변형된 변이 CRP*를 함유하는 균주를 구축하기 위하여, 상기 실시예 <1-3>에서 얻은 "CP12CHBASC" 균주의 crp 유전자를 Datsenko 등의 문헌을 참조하여 제거하고, SOE-PCR 방법을 이용하여 crp* 변이 유전자(대장균 W3110 균주의 crp 유전자 중 127번째 아미노산인 T가 I로 바뀐 변형 유전자)를 제작하였다. 이후, 실시예 <1-2> 또는 <1-3>의 프로모터 치환 과정과 동일한 방식으로 crp*를 crp 유전자가 제거된 부위에 삽입하였다. crp 유전자가 제거된 균주는 낮은 성장을 보이는데 반해, crp*가 삽입된 변이 균주는 높은 성장을 보이므로, 이에 기초하여 crp*가 치환된 균주를 분리하고, 상기 균주를 게놈 DNA의 PCR-증폭 및 서열 분석을 통하여 확인하였다. 상기 CRP*가 확인된 균주를 "CP12CHBASC CRP*"로 명명하였다.
실시예 2: 변이대장균의 항시성 발현의 확인
실시예 <1-3>에서 제조된 변이대장균 "CP12CHBASC"에서 chb 오페론과 asc 오페론의 불활성 프로모터가 합성 항시성 프로모터로 치환됨에 따른 항시 발현 특성을 살펴보기 위하여, 상기 균주를 대상으로 β-글루코시다아제 분석을 수행하였다.
CP12CHBASC 균주를 LB 배지, 글루코스가 함유된 M9 배지 및 셀로바이오스가 첨가된 M9 배지에서 37℃로 하룻밤동안 배양한 다음, 2 mL의 배양액을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 200 μL에서 용해 및 현탁시켰다. 그리고 나서, 상기 조 세포추출물 100 μL를 400 μL의 10 mM p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(PNPG)와 함께 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 1 mL의 1M Na2CO3를 첨가하여 반응을 중지시키고, 유리된 p-니트로페놀의 흡광도를 410 nm에서 측정하였다. 효소 활성 1 유닛은 분당 1 μmol의 PNPG의 전환에 촉매작용을 하는 효소의 양으로 정의하였다. 흡광도는 바이오크롬 리브라(Biochrom Libra) S22 분광계로 측정하였다. 3회 측정 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 다양한 배지에서 배양한 결과, 배지에 관계없이 항시성 프로모터에 의해 β-글루코시다아제가 항시적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 변이대장균의 셀로바이오스 및 자일로스 이용 여부 확인
실시예 <1-3>에서 수득한 변이대장균 "CP12CHBASC"와 비교예 1에서 수득한 변이대장균 "CP12CHBASC CRP*"의 셀로바이오스 및 자일로스 이용률을 비교하였다. 상기 균주를 각각 1g/L의 셀로바이오스 및 자일로스를 함유하는 50 mL의 M9-최소 배지에 접종하였다. 일정한 시간마다 배양 배지를 회수하여, 배양 배지 중의 셀로바이오스와 자일로스의 잔류 농도를, HPC-87P 컬럼(Bio-Rad) 및 굴절율 검출기(Shimadzu)가 장착된 시마주(Shimadzu) HPLC 스테이션(station)을 이용하여 측정하였다. HPLC-등급의 깨끗한 물을 0.6 mL/분의 유속으로, 이동상으로 사용하였다. 오븐 온도는 80℃로 유지하였다. 다양한 농도의 자일로스 및 셀로바이오스를 이용하여 표준 곡선을 결정하였다.
측정된 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4A는 CP12CHBASC 균주를 이용한 실험결과를, 도 4B는 CP12CHBASC CRP* 균주를 이용한 결과를 나타내며, 각 도에서 마름모(◆)는 셀로바이오스의 잔류 농도를, 사각형(■)은 자일로스의 잔류 농도를 가리킨다.
상기 도 4A에서 보는 바와 같이, CP12CHBASC 균주는 자일로스의 존재하에 셀로바이오스를 이용할 수 없었으며, 이는 chb 및 asc 오페론의 항시 발현에도 불구하고 여전히 탄소원 이화물 억제(CCR)가 유지되고 있음을 보여준다. 한편, 도 4B의 결과에서 보는 바와 같이, 균주 CP12CHBASC에서 야생형 CRP가 변이 CRP(CRP*)로 치환되는 경우, 자일로스 이용률이 감소하였고, 자일로스 이용의 지연으로 인해 셀로바이오스가 선호하는 탄소원이 되었다.
상기 결과는 chb 및 asc 오페론의 항시 발현이나 CRP 유전자의 변이가 CCR을 완전히 벗어나는데 충분히 않음을 보여준다.
실시예 4: 변이대장균의 셀로바이오스 및 자일로스 이용 여부 확인
상기 실시예 <1-3>에서 제작된 균주를 최소 셀로바이오스 배지에서 200 rpm으로 교반하면서 37℃에서 30일간 배양하였다. 배양 중 배양액이 1.0의 OD600에 도달하면 세포를 새로운 배지로 옮겨 배양하였다. 상기 배양으로 얻어진 균주를 "CP12CHBASC30"으로 명명하였다.
실시예 5: 변이대장균의 자일로스 및 셀로바이오스 이용률 확인
실시예 <1-3>에서 제작된 "CP12CHBASC" 균주 및 실시예 4에서 제작된 "CP12CHBASC30" 균주의 자일로스 및 셀로바이오스 이용률을 비교하였다. 세포내 대사산물의 이론 수율과 일치하도록, 자일로스는 10 g/L의 농도로 사용한 반면, 셀로바이오스는 4 g/L의 농도로 사용하였다. 실험 방법은 실시예 3과 동일한 방식으로 배양 시간에 따른 자일로스 및 셀로바이오스의 잔류 농도를 측정하였다.
측정 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 A는 자일로스 이용률을, B는 셀로바이오스 이용률을 나타내고, 각 도의 사각형(■)은 CP12CHBASC 균주의 결과를, 원(●)은 CP12CHBASC30 균주의 결과를 나타낸다.
도 5에서 보는 바와 같이, 양 균주는 자일로스 이용률이 유사하였다. 하지만, 셀로바이오스 이용률의 경우 CP12CHBASC30 균주가 CP12CHBASC 균주에 비해 현저하게 높았다. 상기 결과는 실시예 4의 진화적 적응을 통해 대장균의 셀로바이오스 이용률을 높일 수 있음을 보여준다.
실시예 6: 변이대장균의 자일로스 및 셀로바이오스 이용률 확인
실시예 4에서 수득한 CP12CHBASC30 균주가 자일로스와 셀로바이오스를 동시에 이용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 농도의 셀로바이오스와 자일로스를 함유하는 배지에서 본 발명의 균주를 배양한 후, 자일로스와 셀로바이오스의 이용률을 측정하였다. 상기 실험에 하기 3종의 배지를 사용하였다: A) 2 g/L의 셀로바이오스 및 2 g/L의 자일로스 첨가; B) 3 g/L의 셀로바이오스 및 2 g/L의 자일로스 첨가; 및 C) 1 g/L의 셀로바이오스 및 1 g/L의 자일로스 첨가.
실험 방법은 실시예 3과 동일한 방식으로 배양 시간에 따른 자일로스 및 셀로바이오스의 잔류 농도를 측정하였다.
측정 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 A는 2 g/L의 셀로바이오스 및 2 g/L의 자일로스 첨가한 배지에서의 결과를, 도 6의 B는 3 g/L의 셀로바이오스 및 2 g/L의 자일로스 첨가한 배지에서의 결과를, 그리고, 도 6의 C는 1 g/L의 셀로바이오스 및 1 g/L의 자일로스 첨가한 배지에서의 결과를 나타내며, 각 도의 사각형(■)은 자일로스를, 마름모(◆)는 셀로바이오스를 가리킨다.
도 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 CP12CHBASC30 균주는 자일로스 및 셀로바이오스의 농도에 관계없이 자일로스와 셀로바이오스를 동시에 이용할 수 있는 것으로 나타났다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. (1) 야생형 대장균의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성프로모터를 각각 활성 프로모터로 치환하는 단계; 및
    (2) 상기 대장균을 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양시키는 단계
    를 포함하는, 야생형 대장균으로부터 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 chb 오페론의 불활성 프로모터가 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖고, 상기 asc 오페론의 불활성 프로모터가 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 활성 프로모터가 유도성 프로모터 또는 항시성 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 활성 프로모터가 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 셀로바이오스 최소 배지가 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2 및 1 g/L의 셀로바이오스가 첨가된 M9 최소 배지(M9 minimal medium)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 야생형 대장균의 chb 오페론의 불활성 프로모터 및 asc 오페론의 불활성 프로모터가 활성 프로모터로 치환되고, 셀로바이오스 최소 배지에서 30일 이상 배양된 것을 특징으로 하는, 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 chb 오페론의 불활성 프로모터가 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖고, 상기 asc 오페론의 불활성 프로모터가 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이대장균.
  11. 제8항에 있어서, 상기 활성 프로모터가 유도성 프로모터 또는 항시성 프로모터인 것을 특징으로 하는 변이대장균.
  12. 제8항에 있어서, 상기 활성 프로모터가 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 변이대장균.
  13. 삭제
KR1020110071557A 2011-02-11 2011-07-19 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법 KR101278910B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280007996.8A CN103370410B (zh) 2011-02-11 2012-02-13 具有增强的糖类利用的突变微生物体及其制备方法
PCT/KR2012/001059 WO2012108740A2 (en) 2011-02-11 2012-02-13 Mutant microorganism with enhanced sugar utilization and methods for preparing the same
US13/981,661 US8871480B2 (en) 2011-02-11 2012-02-13 Mutant microorganism with enhanced sugar utilization and methods for preparing the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161499683P 2011-06-21 2011-06-21
US61/499,683 2011-06-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101278910B1 true KR101278910B1 (ko) 2013-06-26

Family

ID=48867715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110071557A KR101278910B1 (ko) 2011-02-11 2011-07-19 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101278910B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101488362B1 (ko) 2013-08-14 2015-02-02 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균의 제조방법
KR101736067B1 (ko) 2015-06-10 2017-05-17 한국과학기술연구원 자일로스의 이용 능력이 개선된 아세토인 생산 균주 및 그 제조 방법

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.92, pp.125-132 (29 June 2011) *
Enzyme and Microbial Technology, Vol.50, pp.1-4 (17 October 2011) *
Molecular Biology and Evolution, Vol.9, No.4, pp.688-706 (1992) *
Molecular Microbiology, Vol.66, No.6, pp.1382-1395 (19 November 2007) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101488362B1 (ko) 2013-08-14 2015-02-02 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균의 제조방법
KR101736067B1 (ko) 2015-06-10 2017-05-17 한국과학기술연구원 자일로스의 이용 능력이 개선된 아세토인 생산 균주 및 그 제조 방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ren et al. Identification and inactivation of pleiotropic regulator CcpA to eliminate glucose repression of xylose utilization in Clostridium acetobutylicum
Du et al. Exploring the photosynthetic production capacity of sucrose by cyanobacteria
CN105121637B (zh) 酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径
KR102390716B1 (ko) 코리스메이트-유도된 산물의 생산을 위한 유전적으로 조작된 미생물들
KR102079275B1 (ko) 재조합 미생물 및 그에 대한 용도
Schilling et al. Engineering of the 2, 3-butanediol pathway of Paenibacillus polymyxa DSM 365
Soma et al. Direct isopropanol production from cellobiose by engineered Escherichia coli using a synthetic pathway and a cell surface display system
BRPI0813710B1 (pt) método de identificar um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-coa no citosol de uma célula de levedura, vetor para a expressão de polipeptídeos heterólogos em levedura, célula de levedura recombinante e método de produzir um produto de fermentação
EA016303B1 (ru) Метаболическая инженерия сбраживающих арабинозу дрожжевых клеток
KR101488362B1 (ko) 글루코스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 변이대장균의 제조방법
Yu et al. Metabolic engineering of Clostridium tyrobutyricum for n-butanol production from maltose and soluble starch by overexpressing α-glucosidase
KR20130101030A (ko) 변형된 미생물을 사용한 개선된 글리콜산 발효 생산
US20140342421A1 (en) Biocatalysts with enhanced inhibitor tolerance
Guo et al. Transporter mining and metabolic engineering of Escherichia coli for high‐level D‐allulose production from D‐fructose by thermo‐swing fermentation
KR101278910B1 (ko) 셀로바이오스 및 자일로스를 동시에 이용할 수 있는 미생물의 제조방법
Tao et al. Target integration of an exogenous β-glucosidase enhances cellulose degradation and ethanol production in Clostridium cellulolyticum
US9309542B2 (en) Recombinant Caldicellulosiruptor bescii and methods of use
US8871480B2 (en) Mutant microorganism with enhanced sugar utilization and methods for preparing the same
BR112015007234B1 (pt) Levedura transformada e método para a produção de etanol
Borne et al. Engineering of a new Escherichia coli strain efficiently metabolizing cellobiose with promising perspectives for plant biomass-based application design
KR20160111947A (ko) 재조합 미생물의 생산 방법
Chiang et al. Pathway engineering of Escherichia coli for the glycerol-based production of recombinant endoglucanase
KR101462894B1 (ko) 셀로바이오스를 이용하는 변이대장균의 제조방법
KR101327322B1 (ko) ＹｅｂＫ 유전자의 돌연변이에 의해 셀로바이오스의 이용률이 증가되고 셀로바이오스 및 기타 당을 동시에 이용할 수 있는 변이대장균을 제조하는 방법
Joseph et al. Metabolic engineering and the synthetic biology toolbox for Clostridium

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160610

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170330

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180409

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190401

Year of fee payment: 7